UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA DE BOTUCATU SÊMEN CONGELADO E INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL EM CÃES CARMEN CECILIA SICHERLE Botucatu, São Paulo Agosto 2016   2   UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA DE BOTUCATU SÊMEN CONGELADO E INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL EM CÃES Tese apresentada junto ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Animal da FMVZ – UNESP, Botucatu, para a obtenção do título de Doutor Orientadora: Profa. Dra. Maria Denise Lopes Botucatu 2016 CARMEN CECILIA SICHERLE     3   Palavras-chave: Criopreservação; cão; espermatozoide; fertilidade; viabilidade espermatica. Sicherle, Carmen Cecília. Semen congelado e inseminação artificial em cães / Carmen Cecília Sicherle. - Botucatu, 2016 Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia Orientador: Maria Denise Lopes Capes: 50504002 1. Cão - Reprodução. 2. Sêmen - Criopreservação. 3. Inseminação artificial. 3. Cão - Espermatozoides. 4. Fecundidade. 5. Reprodução animal. 6. Biotecnologia animal. DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CÂMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSANGELA APARECIDA LOBO-CRB 8/7500 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORM.   4   Nome do autor: Carmen Cecilia Sicherle Título: Sêmen congelado e inseminação artificial em cães COMISSÃO EXAMINADORA Profa. Maria Denise Lopes Presidente e Orientadora Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária FMVZ-UNESP- Botucatu- SP Profa. Fabiana Ferreira de Souza Membro Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária FMVZ-UNESP- Botucatu- SP Profa. Camila de Paula Freitas Dell’Aqua Membro Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária FMVZ-UNESP- Botucatu- SP Profa. Maria Izabel Melo Martins Membro Departamento de Clinica veterinária Centro de Ciências Agrarias - Universidade Estadual de Londrina Profa. Cristina Fátima Lucio Membro Docente na Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade de Guarulhos. Responsável pela disciplina de “Patologia e Clínica da Reprodução”. Data da defesa: 03 de Agosto de 2016. iii     5   Agradecimentos Agradeço a minha família pelo apoio e incentivo ao meu trabalho. Agradeço a Profa. Maria Denise Lopes que acreditou no meu trabalho e depositou toda confiança. Por toda a sua amizade, companheirismo, receptividade, muita paciência e incentivo. Pelas excelentes conversas e discussões que me proporcionaram excelentes ensinamentos, muito obrigada. Às professoras do Departamento de Reprodução Animal, Fabiana F. de Souza e Eunice Oba e aos professores Sony Dimas Bicudo, Frederico Ozanan Papa, Nereu Carlos Preste e Marco Antonio Alvarenga pelos ensinamentos. Aos amigos de laboratório Leandro, Lucas, Camila, Gabriele, Yamê, Camila, Carlos Renato, Viviane, Anne, Jorge, Laiza, Carol. Agradeço a todas as pessoas do laboratório de sorologia da Faculdade de Medicina de Botucatu, em especial a Sra. Salete, Nelmara, Marina e Talita, pela simpatia, rapidez e qualidade do trabalho. Ao curso de Biotecnologia Animal da Pós-Graduação da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia. Aos proprietários dos animais utilizados no experimento, muito obrigada pela compreensão e ajuda. A todos os funcionários da Pós-graduação da FMVZ-UNESP e do Departamento de Reprodução Animal por toda sua receptividade, prontidão e eficiência. À Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Estadual Paulista – Campus Botucatu. À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo pelo apoio financeiro (Bolsa de Doutorado: 2013/02050-5) que possibilitou a elaboração desta tese. iv   6   LISTA DE FIGURAS E TABELAS CAPÍTULO 1 FIGURA 1: Variações hormonais na cadela durante o proestro, estro e período ovulatório. P4: progesterona; E2: estrógeno...........................................................pag. 21 FIGURA 2: Anatomia da porção cranial da vagina da cadela e pontos de referência para realização da cateterização do óstio cervical...........................................................pag. 23 CAPÍTULO 2 TABELA 1: Mean ± standard error of the percentage of sperm cells for all parameters analyzed on fresh, cooled and frozen/thawed semen……………………………...pag. 39 CAPÍTULO 3 TABELA 1: Progesterone concentrations on the AI days sperm concentration and pregnancy results………………………………………………………………….pag. 59 TABELA 2: Mean ± standard error of the percentage of sperm cells for all parameters analyzed on fresh, cooled and frozen/thawed semen from all dogs………………pag. 60 TABELA 3: Mean ± standard error of the drop (frozen minus fresh data) in viable sperm cells percentage for the parameters of MT e MP e RAP sperm membrane fluidity (YP/M540), phosphatidyl serine translocation (AN/PI), membrane and acrosomal integrity (FITC PSA/PI), mitochondrial potential (HMP) and membrane lipoperoxidation (LPO) from each dog, analyzed on frozen/thawed semen. …….pag. 61 FIGURA 1: Average response of the animal and minimum and maximum limits (with 95% confidence interval) for the parameters of total motility (TM), progressive motility (PM) and rapid cells (RAP) from each dog, analyzed on frozen/thawed semen… pag. 61 FIGURA 2: Average response of the animal and minimum and maximum limits (with 95% confidence interval) for the parameters of sperm membrane fluidity (YP/M540), phosphatidyl serine translocation (AN/PI), membrane and acrosomal integrity (FITC v   7   PSA/PI), mitochondrial potential (HMP) and membrane lipoperoxidation (LPO) from each dog, analyzed on frozen/thawed semen…………………………………….. pag. 62 TABELA 4: Pregnancy rate according to sperm concentration…………………. pag. 62 vi   8   SUMÁRIO RESUMO .....................................................................................................................viii ABSTRACT ...................................................................................................................x CAPÍTULO 1 - INTRODUÇÃO ....................................................................................12 OBJETIVO GERAL........................................................................................................13 HIPÓTESES ...................................................................................................................13 REVISÃO DE LITERATURA ......................................................................................14 REFERÊNCIAS .............................................................................................................23 CAPÍTULO 2 .................................................................................................................30 CAPÍTULO 3 .................................................................................................................47 CONSIDERAÇÕES FINAIS .........................................................................................74 ANEXOS ........................................................................................................................75 vii   9   SICHERLE, C. C. Sêmen congelado e inseminação artificial em cães. Botucatu, 2016. Tese (doutorado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus Botucatu, Universidade Estadual Paulista, UNESP. RESUMO O objetivo deste estudo foi o de avaliar os efeitos da criopreservação sobre a qualidade e fertilidade do sêmen de cão. Para isso foram realizados dois experimentos. No primeiro experimento foram colhidos 4 ejaculados de 5 cães (n=20), os quais foram avaliados no sêmen fresco, resfriado e descongelado. A motilidade total (MT), progressiva (MP) e porcentagem de rápidos (RAP) por sistema computadorizado e por citometria de fluxo, a fluidez da membrana plasmática [Yo-Pro 1 (YP) e merocianina 540 (M540)], a translocação da fosfatilidil serina (FS) (anexina V e FITC-PSA), integridade da membrana plasmática e acrossomal (iodeto de propídeo (IP) combinado ao FITC-PSA), potencial da membrana mitocondrial (JC1), lipoperoxidação dos lipídeos de membrana (LPO, C11-BODIPY) e apoptose (CellEvent®). O sêmen do cão que apresentou melhores resultados numéricos em todas as análises foi escolhido para ser utilizado separadamente para as inseminações (cão 1) e o sêmen dos demais 4 cães foram utilizados em pool. Foram inseminadas 20 cadelas (2 IAs/cadela), por via transcervical (TCIA) sendo 10 delas com o cão 1 e 10 com o pool. Foram utilizadas 2 concentrações espermáticas (160 e 450 x 106 espermatozoides/TCIA). Houve diferença para os índices de motilidade (p < 0,01) entre o sêmen fresco e resfriado quando comparados ao descongelado para todos os índices avaliados, (MT = 87,00 ± 1,24; 88,15 ± 1,38; 72,55 ± 6,26); (MP = 69,95 ± 1,28 ; 71,75 ± 1,91; 56,30 ± 6,00) e (RAP = 83,15 ± 1,94; 81,55 ± 1,53; 64,30 ± 7,68). Em relação a fluidez da membrana espermática houve diferença na porcentagem da população de células íntegras (CI) e de células com aumento de fluidez de membrana (CIMF) (p < 0,01) entre o sêmen fresco e resfriado quando comparados ao descongelado, (CI = 78,29 ± 6,22; 75,76 ± 6,60; 23,02 ± 9,12); (CIMF = 18,33 ± 5,54; 22,55 ± 6,49; 71,78 ± 9,85). Sobre a identificação da translocação da FS houve diferença (p < 0,01) na porcentagem de células íntegras nos 3 momentos avaliados (CI = 79,90 ± 7,95; 63,50 ± 4,66; 27,19 ± 9,22). A porcentagem de células apresentado a membrana plasmática e acrossomal íntegras foi diferente (p < 0,01) também entre o sêmen fresco e resfriado quando comparados ao descongelado (MPAI = 85,71 ± 6,22; 70,37 ± 6,43; 30,87 ± 9,90). Quanto ao potencial da membrana mitocondrial houve diferença (p < 0,01) na porcentagem de células com alto potencial viii   10   mitocondrial nos 3 momentos avaliados (APM = 85,15 ± 2,76; 60,52 ± 3,31; 38,06 ± 6,40). A LPO da membrana plasmática foi diferente (p < 0,05) no sêmen congelado quando comprado ao resfriado mas não teve diferença entre o sêmen fresco e resfriado e do fresco ao congelado. Não foi observada qualquer diferença, nos momentos estudados, na atividade da caspase. O cão 1 foi significamente melhor para os índices de integridade de membrana plasmática e acrossomal e potencial mitocondrial. Pelo calculo da resposta média do animal e limites mínimos e máximos, apesar de não haver diferença, observamos que o animal 1 apresentou melhores valores pós descongelação para todas os testes realizados. O aumento na concentração espermática foi positivo e observamos 50% de prenhez no grupo inseminado com o pool de sêmen utilizando a concentração de 450 x 106. Nenhuma gestação foi observada nas TCIA com o sêmen do cão 1. Em conclusão a criopreservação leva a alterações estruturais e funcionais da célula espermática, o que explica a sua sobrevivência curta após a descongelação. As mudanças semelhantes a crio-capacitação podem estar relacionadas a outros fatores, como as proteínas do plasma seminal que ainda não são totalmente conhecidas nesta espécie. O processo de apoptose pode ser iniciado com a abertura dos poros mitocondriais durante o processo de congelação/descongelação, o que libera fatores pro-apoptóticos no citoplasma celular. O potencial mitocondrial não está relacionado com a motilidade dos espermatozoides, mas sim com a sobrevivência do espermatozoide. Melhores resultados de gestação puderam ser obtidos quando mais de 100 x 106 de espermatozoides móveis e morfologicamente íntegros for utilizados por TCIA. Não houve relação entre a qualidade seminal, avaliada pelas técnicas aqui descritas, e a fertilidade. Palavras-chave: cão, espermatozoide, criopreservação, viabilidade espermática, fertilidade. ix   11   SICHERLE, C. C. Sêmen congelado e inseminação artificial em cães. Botucatu, 2016. Thesis (PhD) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Botucatu, Universidade Estadual Paulista, UNESP. ABSTRACT The aims of the study were to assess individual characteristics and sperm concentration of cryopreserved semen characteristics using different structural and functional analysis and dog fertility. Twenty ejaculates were collected from 5 dogs and sperm were cryopreserved by one-step protocol. To better understand dog semen quality after thawing five healthy mature dogs were used to the one-step sperm cryopreservation protocol. Sperm analysis was performed at three time points: after collection, refrigeration, and after thawing, by computer sperm motility analysis (total [TM] and progressive motility [PM], and rapid sperm), membrane damage (membrane fluidity and viability - Yo-Pro 1 and merocianina 540, phosphatidyl serine translocation – annexin – V – propidium iodide - PI, acrosomal and membrane integrity FITC-­‐PSA  –   PI), mitochondrial potential (JC-1), membrane lipid peroxidation, LPO (BODIPY 581/591 C11) and apoptosis (kit CellEventTM Caspase-3/7- FITC Green Flow Cytometry), evaluated by flow cytometry. Twenty bitches were inseminated by transcervical intrauterine (TCAI), twice using 2 sperm concentration (160 and 450 x 106 spermatozoa/TCAI). A decrease on frozen/thawed semen comparing to fresh and cooled semen occurred for the parameters of total and progressive motility (TM 87.00 ± 1.24, 88.15 ± 1.38, 72.55 ± 6.26; PM 69.95 ± 1.28, 71.75 ± 1.91, 56.30 ± 6.00, fresh cooled and frozen/thawed respectively P < 0.01), percentage of rapids (83.15 ± 1.94, 81.55 ± 1.53, 64.30 ± 7.68 P < 0.01), membrane fluidity and cell viability (78.29 ± 6.22, 75.76 ± 6.60, 23.02 ± 9.12 P < 0.01) and acrosomal and membrane integrity (85.71 ± 6.22, 70.37 ± 6.43, 30.87 ± 9.90 P < 0.01). Sperm cells were affect for cooling and freezing process when analyzed for the translocation of phosphatidyl serine (79.90 ± 7.95, 63.50 ± 4.66, 27.19 ± 9.22 P < 0.01) and high mitochondrial potential (85.15 ± 2.76, 60.52 ± 3.31, 38.06 ± 6.40 P < 0.01). For LPO significant difference was observed in semen after thawing only comparing to cooled semen (16.57 ± 5.44, 16.22 ± 2.43, 23.00 ± 4.13 P < 0.05). No difference on caspase activity was observed. Dog 1 was significantly better for the parameters of plasma membrane and acrosome integrity and mitochondrial potential. By calculating the average of the animal response and minimum and maximum limits, although there is no difference, we observed that the semen from Dog x   12   1 displayed better post thaw values for all analyzes. The pregnancy rate was 0% for dog 1 and 50% for pool at concentration 450 x 106 spermatozoa. In conclusion, cryopreservation leads to structural and functional changes in sperm cell, which explains their short survival after thawing. The cryo-capacitation like changes can be related to others factors, as the seminal plasma proteins that are not know yet on this species. Apoptosis process can be initiated with the opening of mitochondrial pores during the freezing/thaw process, which releases pro-apoptotic factor on the cytoplasm. The mitochondrial potential is not related to sperm motility but sperm survival. Although the dog 1 displayed better sperm quality, no pregnancy was observed, which makes us to rethink the prediction of fertility of semen samples by commonly used parameters. The concentration dose used for AI procedures must consider motility and sperm viability to satisfactory pregnancy rates. Keywords: dog, sperm, cryopreservation, viability, fertility, intrauterine insemination. xi   13   Capítulo 1 SÊMEN CONGELADO E INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL EM CÃES   14   INTRODUÇÃO A procura por cães geneticamente superiores de diferentes linhagens é comum entre os criadores e pode trazer benefícios como a diminuição da consanguinidade dentro de um mesmo criatório, o que é interessante no caso de doenças geneticamente transmissíveis. Em programas de melhoramento genético, o uso de biotecnologias reprodutivas torna-se determinante pois propicia o uso de animais geneticamente superiores a distância e a qualquer momento. Neste contexto, a inseminação artificial é uma das ferramentas mais utilizadas por ser de fácil execução e não ter um custo elevado. Atualmente, a inseminação artificial com uso de sêmen refrigerado é bastante utilizada e difundida no meio da cinofilia. Porém, considerando longas distâncias torna- se inviável e o uso do sêmen congelado se faz necessário (1,2). O processo de criopreservação causa alterações morfológicas e funcionais na célula espermática o que diminui a sua sobrevivência bem como sua interação com o trato reprodutivo feminino. O espermatozoide canino frequentemente, apresenta baixos índices de concepção pós-descongelação e uma variabilidade individual muito grande (3). Muitos estudos têm sido conduzidos com o intuito de conhecer e de otimizar a criopreservação do sêmen de cães, como diferentes diluidores, crioprotetores e métodos de criopreservação (4–7). Contudo, as taxas de concepção com o uso de sêmen congelado ainda são muito variáveis. Atualmente, a identificação das diferentes populações espermáticas no sêmen de mamíferos tem se tornado um assunto de interesse para a avaliação da fertilidade de machos. O sêmen de diferentes espécies apresenta distintas populações e estas são afetadas pelo processo de criopreservação (4,8–10). Desta forma, torna-se determinante o aprofundamento do conhecimento dos efeitos da congelação do sêmen de cães e pelas análises de motilidade e integridade morfológica e funcional, predizer como um determinado indivíduo responderá a criopreservação e concepção. Hipótese A criorresistência espermática é uma característica individual e está relacionada a fertilidade de cães? Portanto os objetivos do presente trabalho foram: 1. Caracterizar as populações espermáticas no ejaculado de cães;   15   2. Identificar como a refrigeração e a congelação modificam as populações nos indivíduos; 3. Avaliar se os resultados individuais de criopreservação identificando indivíduos de menor e maior fertilidade, quando utiliza-se técnicas de reprodução assistida com sêmen congelado REVISÃO DE LITERATURA Atualmente, a globalização possibilitou uma maior interação entre os criadores de cães pelo mundo, de forma que a procura e o interesse pela inseminação artificial tornou-se importante, pois nem sempre é possível adquirir o reprodutor que se deseja utilizar e nem sempre este animal encontra-se a uma distância que possibilite a cobertura natural ou o uso do sêmen fresco ou refrigerado. O sêmen congelado apresenta vantagens práticas, pois, não há dependência do tempo e nem da distância, além de manter a genética de animais superiores por tempo indeterminado. Todavia, o sêmen congelado/descongelado apresenta um tempo de vida curto por sofrer perdas na integridade da célula espermática durante o processo de refrigeração, congelação e descongelação. Após a criopreservação ocorre um decréscimo significativo da motilidade espermática em relação ao sêmen fresco e ao refrigerado. A motilidade é de extrema importância pois o espermatozoide precisa chegar até o local da fertilização. Além disso, o fato da cadela ovular oócitos imaturos, que levam de 2 a 3 dias para estarem aptos para a fertilização cria dificuldades na determinação do momento ideal para a inseminação artificial, tornando ainda mais importante o tempo de vida funcional do espermatozoide após a descongelação (3,11– 13). Contudo, a viabilidade dos espermatozoides analisada pela motilidade é maior que sua capacidade real de fertilização em estudo realizado por Maxwell e Watson (14), devido as alterações causadas às membranas celulares durante o processo de criopreservação. De fato, além de móvel é necessário que as estruturas celulares importantes para a interação do espermatozoide com o oócito estejam funcionais. A relação entre as propriedades funcionais e fertilidade é muito mais complexa e pode ser afetada por fatores variados, originados na espermatogênese, na maturação no epidídimo, na   16   ejaculação e na interação com o trato reprodutivo feminino. Como não é possível a identificação de todas as características que garantam o sucesso da fertilização, torna-se mais viável, avaliar propriedades celulares funcionais e fundamentais pela identificação de células anormais, do que tentar identificar aquelas células consideradas normais (15). Membrana plasmática e acrossomal A estrutura celular mais afetada durante o processo de congelação e descongelação é a membrana plasmática. No sêmen de cães, Alhaider e Watson (3) observaram que após a descongelação houve uma diminuição significativa da integridade de membrana plasmática, de 81% no sêmen fresco para 35% no descongelado, utilizando o fluorocromo iodeto de propídeo (IP). No mesmo estudo os autores também observaram um aumento significativo da fluidez da membrana plasmática em células íntegras (de 11% para 90,5%) utilizando as sondas Yo-Pro1 e Merocianina 540 (M540). A sonda Yo-Pro1 penetra na célula quando ocorre a desestabilização da membrana plasmática pelo aumento da permeabilidade dos canais panexina, antes mesmo da perda total da integridade (4). A sonda merocianina 540 (M540) por sua vez detecta mudanças no arranjo de lipídeos contidos na membrana, uma modificação inicial do processo de capacitação, conforme aumenta a permeabilidade mais o corante consegue se ligar a membrana agindo como marcador da desestabilização (16,17). Steckler et al. (18) observaram que a combinação das sondas Yo-Pro1 e M540 é capaz de detectar alterações iniciais da membrana plasmática no sêmen fresco de cães após incubação em meio contendo ou não bicabornato como indutor da capacitação. A membrana plasmática relaciona-se a muitas das funções espermáticas, garantindo a capacidade da célula em manter a homeostase, manutenção da motilidade e a capacidade de interação com o meio, incluindo o epitélio do trato genital feminino e as células do complexo cumulus-oócito (8). A membrana plasmática recobre toda a célula espermática, mas não é uma peça única. É composta por compartimentos distintos, como o que envolve a parte externa da membrana acrossomal; o compartimento recobre a porção pós-acrossomal da cabeça do espermatozoide até o annulus e um compartimento cobrindo a peça principal e o restante da cauda. A combinação das sondas fluorescentes iodeto de propídeo (IP) e   17   diacetato de carboxifluoresceína (DIC) são utilizadas e há muito tempo para a avaliação quantitativa das células com membrana plasmática íntegra e lesada (19), porém, a análise pela citometria de fluxo necessita de uma terceira sonda capaz de marcar e identificar as células de debris, partículas da gema de ovo e outros artefatos (11). Neste contexto a sonda Hoechst 33342 pode ser associada ao IP e DIC completando a análise (20). Subpopulações espermáticas Apesar das diferentes técnicas já bem estabelecidas, capazes de identificar aspectos individuais da função celular, isso não implica necessariamente numa relação causal com a capacidade do espermatozoide em fertilizar o oócito (15). A despeito do ejaculado de mamíferos ser considerado uma mistura homogenia e bem constituída, na verdade trata-se de um composto heterogêneo que contém diferentes populações espermáticas que apresentam distintos padrões fisiológicos, químicos, cinéticos e morfológicos (21,22). A maioria dos estudos sobre subpopulações espermáticas têm sido realizados baseados na análise das características da cinética espermática, porém outros aspectos como a morfologia e integridade espermática também identificam e caracterizam as diferentes subpopulações (21–23). Em suínos nas diferentes frações do sêmen fresco e congelado/descongelado, observou-se a presença de quatro diferentes subpopulações espermáticas, onde pequenas diferenças morfológicas puderam ser identificadas pela análise computadorizada, utilizando a anexina-V conjugada ao isotiocionato de fluoresceína – FITC e o IP (24). Em estudo realizado em suínos onde o sêmen de dois ou mais cachaços foram misturados para a inseminação artificial, demonstrou-se que as ninhadas resultantes favoreceram um determinado macho (25). Entre as subpopulações espermáticas e entre machos a sensibilidade responsiva ao bicarbonato variou, e uma proteína específica presente nas tubas uterinas modulam esta resposta. Este mecanismo também selecionou a subpopulação que atingiu o oócito para a fertilização. Estes fatos conduzem a uma possível explicação para a baixa correlação entre a fertilidade e os testes para determinação espermática quando não se considera a estrutura das subpopulações espermáticas (8,9,22). Uma das funções das populações espermáticas estaria   18   relacionada a um mecanismo para auxiliar o espermatozoide fértil a evitar a resposta imune do trato reprodutivo feminino, onde apenas os mais imunoresistentes teriam prioridade na fertilização (21,22). As características seminais individuais são amplamente estudadas, para o entendimento da fertilidade e da infertilidade de machos. As secreções epiteliais do trato reprodutivo feminino também podem influenciar as mudanças que ocorrem no espermatozoide ao longo de seu trajeto, até o momento da fertilização indicando um diálogo entre o trato reprodutivo feminino e o espermatozoide, como demonstrado em estudo onde verificou-se a mudança nas secreções das tubas uterinas na presença do espermatozoide (26–28). Potencial mitocondrial, apoptose celular e translocação da fosfatidil serina Em humanos o uso de sonda fluorescente (mito tracker green) associado a citometria de fluxo permitiu concluir que o potencial da membrana mitocondrial apresenta uma correlação com outros padrões de análise espermática como a capacitação e a fragmentação do DNA. Ademais, a subpopulação com alto potencial mitocondrial foi a que caracterizou melhor a função espermática em humanos (21). A mitocôndria é responsável pela maior parte da energia celular, a qual ocorre por meio do processo de fosforilação oxidativa (FO). Também é responsável pela maior parte da produção endógena de espécies reativas ao oxigênio (ROS) como biometabólitos, sendo considerada a reguladora central da apoptose celular (29). A perda do potencial de membrana mitocondrial é um fenômeno detectado no estagio inicial da apoptose sendo um marcador importante no avanço das alterações semelhantes a apoptose causadas pela criopreservação (30). A apoptose, morte celular programada, delimita uma sequência de eventos que levam a destruição celular, também é parte importante do desenvolvimento e manutenção da saúde pela eliminação de células velhas ou doentes (31). Os espermatozoides com defeitos são eliminados nos túbulos seminíferos durante a espermatogênese pelo processo da apoptose, o qual é um evento fisiológico (30). As caspases são componentes sinalizadores da cascata apoptótica sendo que outros marcadores pró-apoptóticos como as Bax, citocromo c, fator indutor da apoptose e a caspase-9 também já foram identificados no ejaculado de diversas espécies (17,20,31). Sokolowska et al. (32) detectaram caspases ativas no sêmen   19   congelado/descongelado de cães utilizando o marcador in situ da caspase FITC-VAD- FMK, um peptídeo permeável inibidor da caspase conjugado ao FITC que se liga a caspase ativada. Todavia, apesar de presente na célula espermática, o fato das caspases estarem localizadas na peça intermediaria pode representar que, mesmo após a fase de maturação da espermatogênese, estas células demonstrando atividades das caspases, apresentem citoplasma remanescente ou que ainda estejam presentes no espermatozoide ejaculado por uma falha no processo da maturação espermática (33). Durante a ejaculação o espermatozoide é secretado juntamente com substâncias oriundas das glândulas acessórias masculina variando em quantidade e composição. O modo como as substâncias contidas nestas secreções modificam a fisiologia espermática ainda não foi totalmente elucidada, mas o fato é que nem todos os espermatozoides contidos em um ejaculado estão no mesma condição fisiológica (22). Um estudo sugere que espermatozoides que apresentam uma translocação da enzima fosfatidil serina são preferencialmente fagocitados aumentando a chance de outros espermatozoides alcançarem o oócito para a fertilização (34). Assim, acredita-se que apenas uma pequena porcentagem de espermatozoides são competentes para realização da fertilização (9,35). Quando a membrana plasmática é rompida os fosfolipídios, fosfatidil serina (FS), nela contidos se deslocam de dentro para fora da célula. Esta translocação da FS é um dano primário da membrana plasmática (36). A anexina V é uma sonda cálcio dependente utilizada para detectar a externalização da FS (31). Apesar da externalização da FS também ser um indicativo de apoptose, ainda não há evidências suficientes de que todos os componentes apoptóticos, como a caspase-3 e 8, são produzidos pelo espermatozoide ejaculado (20). Kim et al. (36) utilizaram a sonda fluorescente anexina V combinada ao IP e observaram que a criopreservação provoca uma translocação da FS no sêmen de cães. Peroxidação lipídica O plasma seminal contém uma série de antioxidantes enzimáticos ou não, os quais são importantes para a proteção da célula espermática contra os radicais produzidos pelo metabolismo do oxigênio (ROS). A atividade destes antioxidantes varia de acordo com a espécie e também com a fertilidade individual (37,38). As ROS apresentam também um papel fisiológico importante para a célula   20   espermática, porém quando produzidos em alta quantidade causam efeitos nocivos que aceleram a morte celular. Os lipídeos contidos na membrana celular são alvo principal das ROS, que quando produzidas em quantidade fisiológicas levam a capacitação espermática de forma que o espermatozoide esteja pronto para a fertilização do oócito. A oxidação dos lipídeos da membrana (lipoperoxidação) libera radicais livres peroxil e alkoxil que para se estabilizarem retiram um átomo de hidrogênio do lipídeo mais próximo criando um novo radical, que combinado ao dioxigênio cria um novo peróxido lipídico e assim torna-se um ciclo de produção de radicais oxidativos (39). Altos níveis de ROS são nocivos a célula espermática e podem ser a causa de infertilidade em 20 a 40% dos casos de infertilidade em humanos (40). Em cães, Kim et al. (36) notaram um aumento significativo na produção de peroxido de hidrogênio intracelular no sêmen congelado. Este fato também pode ser observado no sêmen congelado de equinos e bovinos (41,42). A sonda membrana fluorescente BODIPY-C11 foi utilizada recentemente para avaliar a peroxidação dos lipídeos de membrana no sêmen fresco e congelado de cães (6) onde percebeu-se que o aumento na lipoperoxidação esta relacionado a alguns indivíduos apenas. Muitos são os fatores que podem influenciar e até mesmo determinar o sucesso da célula espermática em realizar a fertilização reforçando o conceito que o sêmen é uma mistura complexa e que apenas uma avaliação ou um teste funcional são insuficientes para prever a fertilidades em machos. Inseminação artificial com sêmen congelado O primeiro relato de uso de sêmen congelado de cão foi a 46 anos atrás. Desde então, muitas inovações no processo de congelação de sêmen, entendimento do ciclo estral da cadela e técnicas de inseminação artificial foram desenvolvidos. Apesar de muitos estudos, as taxas de gestação ainda são bastante variáveis quando o sêmen congelado é usado para IA nesta espécie (43–46). A criopreservação causa alterações estruturais e funcionais no espermatozoide o que leva a diminuição do tempo de vida útil e capacidade fertilizante da célula (36,47). Desta forma, torna-se fundamental que a inseminação artificial com sêmen congelado seja feita no momento mais próximo a possiblidade de fertilização (45). Na cadela a determinação deste momento é mais complexa, pois além de ovular oócitos imaturos, a   21   determinação do momento ovulatório também requer conhecimento e acompanhamento adequado (48). Nesta espécie, os óvulos liberados são oócitos primários e requerem 24 a 72 horas de maturação antes que possam ser fertilizados. Uma vez maduros, a vida fértil de cada oócito pode durar de dois a quatro dias (49). Vários parâmetros são utilizados para determinação do período ovulatório, entre estes os aspectos clínicos e reprodutivos, citologia vaginal, endoscopia vaginal ou vaginoscopia, dosagens hormonais e, mais recentemente, a ultrassonografia ovariana (12,50,51). Parâmetros clínicos como a data de início do edema de vulva, quantidade e aspecto da secreção vulvar, lateralização da cauda ou aceitação da monta, não são suficientemente precisos para detectar a ocorrência e o período da ovulação, pois o aparecimento dessas alterações varia muito entre as cadelas, (50–52). A mudança para o comportamento receptivo característico do estro também não é confiável para detectar a ovulação, pois essa mudança comportamental normalmente ocorre um dia após o pico de LH, mas pode ocorrer desde três dias antes, até cinco dias depois do pico, ou ainda pode não ocorrer (50). A vaginoscopia para o manejo reprodutivo consiste na observação das mudanças da mucosa vaginal durante proestro e estro. No início do proestro, as pregas vaginais encontram-se edemaciadas e túrgidas, e a mucosa rósea sob o efeito do estrógeno. Com a progressão para o estro, as pregas vaginais perdem a turgidez, tornando-se “enrugadas” e anguladas, enquanto a mucosa torna-se pálida e menos rósea. Esse fenômeno é chamado de crenulação das pregas vaginais (50,53–55). Contudo, apesar das mudanças observadas no aspecto da mucosa vaginal serem progressivas, as mesmas não ocorrem em um momento determinado do proestro e do estro e portanto não determina o dia exato da ovulação, podendo ainda variar entre os animais (50). Macedo (56) não encontrou correlação entre a crenulação vaginal e a dosagem de progesterona (P4). A data da ovulação pode ser determinada pela dosagem hormonal de LH ou da P4, sendo que a ovulação ocorrerá após 36 a 50 horas após o pico de LH (49). Apesar da dosagem de LH ser mais determinante para avaliação do momento ovulatório, não é comumente utilizada pois além do alto custo necessita de dosagem diária. De forma que a dosagem da P4 é o método mais utilizado para determinação do pico de LH que de forma geral se apresenta ao redor de 2,0 ng/mL neste período (48) a depender do método de análise utilizado. Os métodos mais comuns para dosagem desse hormônio são radioimunoensaio (57) e quimioluminescência (58). Existem também os testes semi- quantitativos como o ELISA, que apesar de rápidos apresentam acurácia reduzida   22   (48,57). A concentração plasmática de progesterona começa a aumentar rapidamente, além dos níveis basais, aproximadamente dois dias antes da ovulação, durante o pico de LH (Figura 1), por isso a realização de dosagens seriadas permite a antecipação da ovulação em um ou dois dias e, se continuada, permite a confirmação da ovulação e retrospectiva detecção do período ovulatório (50,59). A concentração plasmática de progesterona no dia do pico de LH varia de acordo com os autores, encontrando-se em torno de 2 e 4 ng/ml (12,60). E durante o período ovulatório, 4,7 e 6,2 ng/ml (43), 4 a 7 ng/mL (1) e 4 a 10 ng/mL (48). Estas diferenças entre os autores se deve provavelmente ao método utilizado para quantificação da P4. Recomenda-se a realização de dosagens diárias de progesterona ou em dias alternados até que um valor indique a ocorrência da ovulação (12,57). Como o período ótimo para fertilização ocorre entre 2 a 4 dias após a ovulação, quando os oócitos estão completamente maduros e ainda não sofreram degeneração (12,51), considera-se que o período fértil da cadela seja do 40 ao 70 dia após o pico de LH (61). FIGURA 1: Variações hormonais na cadela durante o proestro, estro e período ovulatório P4: progesterona; E2: estrogeno. Fonte: Macedo, 2009. Além do momento ideal para que a IA com sêmen congelado seja bem sucedida outros fatores devem ser levados em consideração, como a técnica de inseminação e a concentração espermática inseminada. Em cadelas, melhores taxas de gestação foram observadas quando mais de 100 x 106 de espermatozoides morfologicamente normais e 20 fértil é aquele em que a monta natural ou a inseminação pode resultar em prenhez. Esse período inclui não apenas o período de fertilização, mas também os três dias que o precedem, uma vez que o espermatozóide canino pode permanecer fértil por pelo menos cinco a seis dias no interior do trato reprodutivo da cadela (Jeffcoate e Lindsay, 1989; England e Concannon, 2002). Figura 3: Variações hormonais na cadela durante o proestro, estro e período ovulatório. P4: progesterona; E2: estrógeno. Adaptado de http://www.hilltopanimalhospital.com/. O acompanhamento adequado do proestro e estro da cadela baseia-se em alguns critérios essenciais: observação das mudanças no trato genital e comportamentais (Jeffcoate e Lindsay, 1989; Johnston et al., 2001; England e Concannon, 2002; Silva et al., 2003; Feldman e Nelson, 2004), na monitoração com citologia vaginal (Jeffcoate e Lindsay, 1989; Johnston et al., 2001; England e Concannon, 2002; Silva et al., 2003; Feldman e Nelson, 2004), na vaginoscopia para observação das alterações da mucosa vaginal (índice de crenulação) (Jeffcoate e Lindsay, 1989; Brearley et al., 1991; Johnston et al., 2001; England e Concannon, 2002; Silva et al., 2003; Feldman e Nelson, 2004) e nas dosagens plasmáticas ou séricas de progesterona (Jeffcoate e Lindsay, 1989; Farstad e Andersen-Berg, 1989; Johnston et al., 2001; England e Concannon, 2002; Silva et al., 2003; Feldman e Nelson, 2004). A detecção acurada do período ovulatório é considerada pela maioria dos autores como um dos fatores mais importantes para determinar quando a cadela deve ser inseminada (Lévy e Fontbonne, 2007). A fase ovulatória na fêmea canina inicia aproximadamente dois dias após o pico do hormônio luteinizante (LH), quando os níveis séricos de progesterona estão entre 2 e 4 ng/ml, e pode durar de 24 a 96 horas, com liberação de 75% dos folículos em até 72 horas. Os óvulos liberados são oócitos primários e requerem 24 a 72 horas de maturação antes que possam ser fertilizados.   23   móveis foram utilizados (46,62). Baixas concentrações espermáticas foram correlacionadas com alta variação nos resultados de prenhes em vacas de leite (63). Uma menor taxa de gestação também foi observada em humanos, quando baixas concentrações espermáticas foram utilizadas em programas de reprodução assistida (64). Nizanski et al. (65) obtiveram 60% de gestação utilizando uma dose total de 500 x 106 / mL de espermatozoides para uma viabilidade espermática em torno de 60%. O método de IA com sêmen congelado em pequenos animais, utilizado há 25 anos, para deposição do sêmen dentro do útero foi a inseminação cirúrgica por laparotomia (43). As perdas sofridas pela célula espermática durante o processo de criopreservação faz necessária que a deposição do sêmen na IA seja feita dentro do útero (43,45,46). A cateterização cervical (TC) começa a ser possível quando pesquisadores escandinavos relataram a adaptação bem sucedida de um cateter rígido usado em raposas para cadelas (43,44). Atualmente a TC foi melhorada pela adaptação de endoscópios utilizados em humanos, para cães, o que permite uma manipulação do colo uterino e cateterismo mais rápido. A técnica de inseminação transcervical assistida por endoscopia foi desenvolvida na Nova Zelândia, tendo como grande vantagem a visualização direta do óstio cervical (59). Mas ainda sim requer prática e destreza do operador pois envolve a manipulação do endoscópio e do cateter simultaneamente. Além disso, algumas particularidades da anatomia da cadela que dificultam a cateterização da cérvix devem ser consideradas para a realização dessa técnica. O acesso ao orifício cervical é restrito pela prega mediana dorsal, pelo lúmen estreito da porção vaginal da paracérvix e o direcionamento ventral do óstio cervical externo (Figura 2) (46,59). A posição do clitóris no interior da comissura ventral da vulva e do óstio uretral ventralmente no vestíbulo devem ser evitados; e a presença das pregas vaginais pode dificultar a passagem do endoscópio. A prega mediana dorsal é uma prega mais firme localizada longitudinalmente na parede dorsal da vagina, reduzindo significativamente o lúmen vaginal até que se possa visualizar a cérvix (Figura 2). Um ponto de referência importante é o tubérculo cervical, que consiste na porção vaginal da cérvix, incluindo o óstio e o canal cervical (Figura 2). O tubérculo cervical está localizado na extremidade cranial da prega mediana dorsal e está separada da mesma por uma prega transversal evidente. A cérvix encontra-se diagonalmente na junção útero-vaginal com o óstio cervical posicionado ventralmente na direção do assoalho vaginal e o canal cervical direcionado crânio-dorsalmente da vagina para o útero (Figura 2) (66,67). O canal cervical apresenta cinco a dez milímetros de comprimento, e   24   nem sempre é reto, podendo ser sinuoso (68). FIGURA 2: Anatomia da porção cranial da vagina da cadela e pontos de referência para realização da cateterização do óstio cervical. Fonte: Feldman e Nelson (69). Uma vantagem da IA TC é a não necessidade de anestesia ou sedação do animal, devendo ser realizada com o animal em estação (1,70). O procedimento da TC está se tornando uma técnica de rotina para inseminação artificial em cães, pois proporciona uma melhor fertilidade, especialmente quando se utiliza sêmen congelado (70). REFERÊNCIAS 1. Pretzer SD, Lillich RK, Althouse GC. Single, transcervical insemination using frozen-thawed semen in the Greyhound: A case series study. Theriogenology. 2006;65(6):1029–36. 2. Macedo SP, Malm C, Henry MRJM, Telles LF, Figueiredo MS, Fukushima FB, et al. Endoscopic transcervical intrauterine artificial insemination in Labrador Retriever bitches. Res Vet Sci. 2012;92(3):494–500. 3. Alhaider AK, Watson PF. Cryopreservation of dog semen: The effects of Equex STM paste on plasma membrane fluidity and the control of intracellular free calcium. Anim Reprod Sci. 2009;110(1-2):147–61. 4. Pena FJ, Nunez-Martínez I, Moran JM. Semen technologies in dog breeding: An   25   update. Reprod Domest Anim. 2006;41(SUPPL. 2):21–9. 5. Koderle M, Aurich C, Schäfer-Somi S. 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Reprod Domest Anim. 2014;49(s4):56– 63.   31   Capítulo 2 Viability of cooled and frozen canine semen using combination of fluorescent probes by flow cytometry ARTIGO 1 Artigo enviado a revista Theriogenology de acordo com as normas da revista.   32   Title: Viability of cooled and frozen canine semen using combination of fluorescent 1   probes by flow cytometry 2   Author’s 3   4   Carmen Cecilia Sicherle1 – corresponding author 5   1 São Paulo State University Julio de Mesquita filho – UNESP, Botucatu – Department 6   of Reproduction and Veterinary Radiology. 7   Prof. Dr. Walter Mauricio Correa s/n - Caixa Postal 560, Unesp Campus de Botucatu 8   18618-681 - Botucatu, SP 9   Phone number: (+ 55 14) 3811-6000 10   e-mail: carmensicherle@terra.co.br 11   12   13   Maria Denise Lopes 14   1 São Paulo State University Julio de Mesquita filho – UNESP, Botucatu – Department 15   of Reproduction and Veterinary Radiology. 16   Prof. Dr. Walter Mauricio Correa s/n - Caixa Postal 560, Unesp Campus de Botucatu 17   18618-681 - Botucatu, SP 18   Phone number: (+ 55 14) 3811-6000 19   e-mail: denise@fmvz.unesp.br 20   21   22   Abstract 23   Sperm cryopreservation has become an indispensable tool in biology. However, 24   frozen/thawed semen has a short life span due to losses in the integrity of sperm cells 25   during the process of cooling, freezing and thawing. To better understand dog semen 26   quality after thawing five healthy mature dogs were used to the one-step sperm 27   cryopreservation protocol. Sperm analysis was performed at three time points: after 28   collection, refrigeration, and after thawing, by computer sperm motility analysis (total 29   [TM] and progressive motility [PM], and rapid sperm), membrane damage (membrane 30   fluidity and viability - Yo-Pro 1 and merocianina 540, phosphatidyl serine translocation 31   – annexin – V – propidium iodide - PI, acrosomal and membrane integrity FITC-­‐PSA  –  32   PI), mitochondrial potential (JC-1), membrane lipid peroxidation, LPO (BODIPY 33   581/591 C11) and apoptosis (kit CellEventTM Caspase-3/7- FITC Green Flow 34   Cytometry), evaluated by flow cytometry. A decrease on frozen/thawed semen 35   comparing to fresh and cooled semen occurred for the parameters of total and 36   progressive motility (TM 87.00 ± 1.24, 88.15 ± 1.38, 72.55 ± 6.26; PM 69.95 ± 1.28, 37     33   71.75 ± 1.91, 56.30 ± 6.00, fresh cooled and frozen/thawed respectively P < 0.01), 1   percentage of rapids (83.15 ± 1.94, 81.55 ± 1.53, 64.30 ± 7.68 P < 0.01), membrane 2   fluidity and cell viability (78.29 ± 6.22, 75.76 ± 6.60, 23.02 ± 9.12 P < 0.01) and 3   acrosomal and membrane integrity (85.71 ± 6.22, 70.37 ± 6.43, 30.87 ± 9.90 P < 0.01). 4   Sperm cells were affect for cooling and freezing process when analyzed for the 5   translocation of phosphatidyl serine (79.90 ± 7.95, 63.50 ± 4.66, 27.19 ± 9.22 P < 0.01) 6   and high mitochondrial potential (85.15 ± 2.76, 60.52 ± 3.31, 38.06 ± 6.40 P < 0.01). 7   For LPO significant difference was observed in semen after thawing only comparing to 8   cooled semen (16.57 ± 5.44, 16.22 ± 2.43, 23.00 ± 4.13 P < 0.05). No difference on 9   caspase activity was observed. In conclusion cryopreservation leads to structural and 10   functional changes in sperm cell, which explains their short survival after thawing. The 11   cryo-capacitation like changes can be related to others factors, as the seminal plasma 12   proteins that are not know yet on this species. Apoptosis process can be initiated with 13   the opening of mitochondrial pores during the freezing/thaw process, which releases 14   pro-apoptotic factor on the cytoplasm. The mitochondrial potential is not related to 15   sperm motility but sperm survival. 16   Keywords: dog, sperm, cryopreservation, viability. 17   1. Introduction 18   Currently, globalization made possible a greater interaction between dog breeders 19   around the world, so that the demand and interest in artificial insemination has become 20   important. It is not always that the male of interest is in a distance that allows the 21   natural mating or the use of fresh or cooled semen. 22   The frozen semen offers practical advantages because there is no dependence on the 23   time or the distance, and ensures genetics of higher animals indefinitely. However, 24   frozen/thawed semen has a short life span due to losses in the integrity of sperm cells 25   during the process of cooling, freezing and thawing. After cryopreservation a significant 26   decrease in sperm motility compared to fresh semen and refrigerated is noted [3]. 27   Motility is extremely important because the sperm needs to reach the site of 28   fertilization. Moreover, the fact that the bitch ovulate immature oocytes, which take 2 to 29   3 days to be read for fertilization, creates difficulties in determining the optimum time 30   for insemination, making it even more important long functional life of the sperm after 31   thawing [3–5]. However, the viability of sperm when analyzed by motility is greater 32   than its actual capacity of fertilization due to changes caused to the cell membranes 33     34   during the cryopreservation process. [6], In fact, besides motility it is necessary that 1   cellular structures important for the interaction of sperm and oocytes are functional. The 2   relationship between functional properties and fertility is much more complex and can 3   be affected by various factors, originating in spermatogenesis, maturation in the 4   epididymis, ejaculation and interaction with the female reproductive tract. As it is not 5   possible to identify all the characteristics that guarantee the success of fertilization, it 6   becomes more feasible to evaluate the functional and basic cellular properties and 7   identify the cells that don’t have those characteristics [7]. 8   In vitro fertilization (IVF), which is widely used in cattle as a way of assessing sperm 9   quality, is not used in dogs, due to factors related to oocyte maturation. Thus other 10   parameters may be used in an attempt to determine sperm viability in this species. 11   The most affected cell structure during freezing and thawing is the sperm plasma 12   membrane. Frozen/thawed canine sperm presents decreased plasma membrane integrity 13   and increased membrane fluidity [3]. Many different probes have been used to access 14   cell structures to check its viability and possible fertilizing potential of semen samples. 15   The fluorescent probe Yo-Pro1 (YP) penetrate the cell when there is destabilization of 16   the plasma membrane and a increase permeability of panexin-gated channels even 17   before the total loss of membrane integrity occurs [8]. The merocyanine 540 (M540) in 18   turn detects changes in lipid arrangement contained in the membrane, an initial 19   modification of the capacitation process, as the permeability increase more the stain can 20   bind to membrane acting as a marker for membrane destabilization [9,10]. 21   Steckler et al. [11] observed that the combination of YP and M540 probes can detect 22   early changes in the plasma membrane in fresh semen dogs after incubation in medium 23   containing or not bicarbonate as an capacitation inducer. Plasma membrane is related to 24   many of sperm function, ensuring the cell's ability to maintain homeostasis, motility and 25   the ability to interact with the environment including the female genital tract epithelium 26   and the cumulus-oocyte complex cells [12]. 27    28   When plasma membrane is ruptured the phospholipids, phosphatidyl serine (PS) move 29   from inside to outside the cell. This translocation of PS identifies a primary damage of 30   the plasma membrane [13]. The annexin V is a calcium-dependent probe used to detect 31   the externalization of PS [14]. Despite the translocation of PS be indicative of 32   apoptosis, there is no sufficient evidence that all apoptotic components, such as caspase-33     35   3 and 8, are produced by the ejaculated sperm [15]. Kim et al. [13] combined propidium 1   iodide (PI) to annexin V and observed that cryopreservation lead to PS translocation in 2   dogs. 3   4   Another event observed at the initial phase of apoptosis is the decrease of potential of 5   inner mitochondrial membrane (IMM) this alteration could be a marker for the 6   alternative pathway of apoptotic-like changes observed after cryopreservation [16]. 7   Different probes have been used to evaluate the mitochondrial activity as mitotracker 8   deep red, red, orange, green and JC-1 [10,17,18]. Unexpectedly, Volpe et al. [19] 9   observed that sperm with low motility had high IMM what suggest that mitochondrial 10   activity is not the only source of energy for sperm motility. In a recent study a positive 11   correlation among static cells and high IMM were found during cooling process of dog 12   semen [20]. 13   Caspases are signaling components in apoptosis cascade and others pro-apoptotic 14   factors as Bax, cytochrome c, apoptosis inducing factor and caspase 9 was found in 15   ejaculated spermatozoa [10,14,15]. Although detected on frozen/thawed dog semen 16   [21], activated caspases are locate on the intermediate piece and could represent a 17   remaining cytoplasm from maturation phase of spermatogenesis [7,22]. 18   Individual resistance to sperm cryopreservation was noted to occur on males of many 19   species [23–25]. In dogs Neagu et al. [26] observed that only some individuals shows 20   increased signs of sperm plasma membrane lipid peroxidation (LPO). The LPO is also a 21   physiological event, which radicals from oxygen metabolism (ROS – reactive oxygen 22   species) will react with membrane lipids in an oxidative process that prepares the 23   spermatozoa to be read for fertilization. However, high levels of ROS were claimed to 24   be the cause of 20 to 40% of infertility in mans [27]. 25   Cryopreservation causes different levels of damages to the spermatozoa of all species. 26   In dogs is still necessary the better understanding of cryo-damages aiming greater 27   fertility results. Thus, the aim of the present study was to access the effects of 28   cryopreservation on sperm motility, membrane damage, mitochondrial potential, LPO 29   and apoptosis evaluated by flow cytometry. 30   31   2. Materials and methods 32     36   2.1 Animals 1   Five adult dogs ranging from 3 to 5 years from different breed were used in this study. 2   All dogs were clinic and andrologically examined, and only health dogs with sperm 3   motility superior to 70% were used in the study. The ethical committee of the university 4   reviewed and approved the experimental design (number 133/2014-CEUA). 5   2.2 Reagents 6   All reagents used were from Sigma-Aldrich (São Paulo, Brazil) and Merck SA (São 7   Paulo, Brazil), unless otherwise cited. 8   2.3 Semen collection and processing 9   Semen was collected by digital manipulation in a pre-warmed graduated tube. No 10   female was present on any one of the collections. Four samples from each dog were 11   collected weekly (20 ejaculates). After collection an aliquot of sperm samples was 12   evaluated for sperm motility, concentration, morphology and all other flow cytometry 13   analysis. Thus, semen was centrifuged for 10 min at 800 Xg. The seminal plasma was 14   then removed and the sperm pellet re-suspended in one step in Tris-egg-yolk extender at 15   room temperature (200 mM Tris, 67 mM citric acid, 44.4 mM D-frutose v:v egg-yolk 16   glycerol 8% orvus WA paste [Proctor & Gamble], 0.02% amikacin sulfate and distilled 17   water qsp) ([28] modified by [29]), resulting in a concentration of 80 x 106 sperm per 18   mL. After dilution semen were loaded in 0.5 mL French straws and cooled to 5°C over 19   1 hour. Samples were frozen horizontally in racks, placed 6 cm above the surface of 20   liquid N2 in a closed Styrofoam box, for 20 min and then plunged directly in liquid N2. 21   At the moment of analysis straws were thawed in a water bath at 40°C for 20 s. All 22   experimental analysis were performed on fresh, cooled and thawed semen. 23   24   2.4 Motility analysis 25   26   Motility was measured on fresh, cooled and thawed semen using CASA system (HTMA 27   – IVOS 10, IMV, Beverly, MA, USA). The percentage of total motility (TM), 28   progressive motility (PM) and rapid cells (RAP) were evaluated. 29   30     37   2.5 Membrane fluidity and cell viability 1   Yo-Pro 1 (YP), merocianina 540 (M540) (Molecular Probes®, Invitrogen – Life 2   Technology Co, Carlsbad, CA, USA) were used in combination to determine cell 3   viability and changes in plasma membrane fluidity, respectively. The hoescht 33342 4   probe (H 33342, cod 14533, Sigma-Audrich Co., Saint Louis, Missouri, EUA) was also 5   used to distinguish sperm cells from others artifacts. These stain distinguish three sperm 6   subpopulations. The first subpopulation of unstained spermatozoa was considered live 7   and without membrane alteration (YP and M540 negative). A second subpopulation was 8   the Yo-Pro-1 negative and positive M540, the cells were considered in early stages of 9   increased membrane fluidity. And the third subpopulation of cryo-injury-induced 10   nonviable sperm with increased membrane fluidity (YP and M540 positive). 11   To each 191µL of diluted semen (at 5 x 106 sperm/mL), H 33342 (7 µM in distilled 12   water), M540 (7.5 nM in DMSO) was added and after incubation at 370 C in the dark 13   for 10 min, YP (25 nM in DMSO) and samples were then incubated for more 20 min. 14   15   2.6 Assessment of phosphatidyl serine translocation 16   17   Annexin V-FITC apoptosis detection kit I (550475, BD Pharmigen, San Diego, CA, 18   USA) was used according to the manufacturer’s instructions. To each 185 µL of semen 19   (2 x 106 sperm/mL) diluted in TALP–PVA (according to [30] modified by [31], 100 20   mM NaCl, 3.1 mM KCl, 25.0 mM NaHCO3, 0.3 mM NaH2PO4, 21.6 mM DL-sodium 21   lactate 60%, 2.0 mM CaCl2, 0.4 mM MgCl2, 10.0 mM Hepes acid free, 1.0 mM sodium 22   pyruvate, 1,0mg/mL polyvinyl alcohol - PVA and 25µg/mL gentamicin sulfate), H 23   33342 (7 µM in aqueous solution) and propidium iodide (PI) (1.5 µM in TALP-PVA, 24   P470 Sigma-Audrich Co., Saint Louis, Missouri, EUA) and 5 µL of annexin V-FITC 25   (according to manufactures instructions) was added. Samples were then incubated at 26   37ºC in the dark for 15 min. After incubation, an additional 200 µL of the binding 27   buffer (10 mM Hepes-NaOH pH 7.4, 140 mM NaCl and 2.5 mM CaCl2) was added for 28   flow cytometry analysis. These probe distinguish three sperm subpopulations. The first 29   subpopulation of unstained spermatozoa was considered live and in the absence of 30   membrane alteration (Anexin V-FITC and PI negative – AN-/PI-). A second 31     38   subpopulation was the viable cells but showing PS translocation (AN+/PI-). And third 1   population of non-viable and PS translocation cells (AN+/PI+). 2   3   2.7 Acrosomal and plasma-membrane integrity 4   5   Sperm acrosomal and plasma membrane integrity was assessed using the combination 6   of FITC-PSA (L-0770, Sigma-Audrich Co., Saint Louis, Missouri, EUA), PI and H 7   33342. To each 189.5 µL of semen diluted in TALP-PVA (2 x 106 sperm/mL), H 33342 8   diluted in distilled water (to achieve a final concentration of 7 µM/200 µL) and PI 9   diluted in TALP (to achieve a final concentration of 1.5 µM/200 µL) and FITC-PSA (2 10   ng/400 µL in DMSO, according to manufacture’s instructions). Samples were then 11   incubated at 37ºC in the dark for 15 min. After incubation, an additional 200 µL of 12   TALP-PVA buffer was added for flow cytometry analysis. Four different 13   subpopulations were found. The first subpopulation was of cells with intact acrosome 14   and plasma membrane (FITC-PSA-/PI-). Second population was the cells showing 15   intact acrosome but damage plasma membrane (FITC-PSA-/PI+). Third population of 16   damage acrosome and intact plasma membrane (FITC-PSA+/PI-) and forth population 17   of damage plasma membrane and acrosome ((FITC-PSA+/PI+) 18   19   2.8 Mitochondrial potential 20   For this analysis was used the lipophilic cationic compound, JC-1 (T3168, Molecular 21   Probes®, Invitrogen – Life Technology Co, Carlsbad, CA, USA). A 4 μL of JC-1 22   solution (50 µg/mL in DMSO) was added to a 500  μL of semen (10 x 106 sperms/mL), 23   and maintained for 40 min at 25ºC. After that 100 μL of this solution was diluted 1:5 in 24   TALP-PVA containing aqueous solution 2µM H 33342, and immediately evaluated by 25   flow cytometry [31]. Sperm population was divided on two, with high (HMP) and low 26   mitochondrial potential. 27   2.9 Lipid peroxidation 28   Membrane lipid peroxidation (LPO) was measured using the probe BODIPY 581/591 29   C11 (D-3861; Molecular Probes, Leiden, The Netherlands). To this test were used 489.5 30   μL containing 1 x 106 sperm cells/mL diluted in TALP-PVA and added PI (1.5  μM/200  31   μL  in  TALP-­‐PVA), H33342 (7 µM/200  μL in distilled water) and BODIPY (in a final 32     39   concentration of 1 µM in DMSO). The samples were then incubated at 370 C for 30 1   min. After incubation, to remove egg yolk, 2 consecutives washes by centrifugation 2   were performed, (300 Xg for 5 min) with TALP-PVA and the pellet re-suspended in 3   TALP-PVA. 4   2.10 Assessment of activated caspases 5   For the assessment of activated caspases, the caspase kit CellEventTM Caspase-3/7- 6   FITC Green Flow Cytometry (C10427, Molecular Probes®, Invitrogen – Life 7   Technology Co, Carlsbad, CA, USA) was used to detect active caspases 3 and 7 8   according to manufacturer instructions in association with H 33342 and PI. To 1 μL of 9   semen diluted in TALP-PVA (1 x 106 sperm cells/mL) were added 1 μL of CellEvent® 10   (diluted as manufacture’s instructions) and H 33342 (7 µM/200  μL in distilled water) 11   and incubated at 370 C for 25 min and after PI (1.5  μM/200  μL  in  TALP) was added 12   and incubated for more 5 min before analyses. Sperm population was divided on two, 13   displaying or not activated caspases. 14   2.11 Flow cytometry 15   Flow cytometry analysis were carried out on a BD LSR Fortessa (Becton Dickinson, 16   Mountain View, CA, USA) equipped with the lasers: blue performing 100 mW at 488 17   nm, red performing 40 mW at 640 nm, and violet performed in 100 mW at 405 nm. H 18   33342 was used in combination of all stains used for all flow cytometry analysis to 19   enable clear distinction of sperm cells from others artifacts as egg yolk particles. Data 20   were analyzed using FACSDivatm software V6.2 (Becton Dickinson, Mountain View, 21   CA, USA). For all analysis 10.000 sperm cells were evaluated. 22   2.12 Statistical analysis 23   The results were presented as mean ± standard error. Statistical analysis of data was 24   performed by variance analysis for repeated measures complemented followed by 25   multiple comparisons of Bonferroni [32]. 26   3. Results 27   As expected, a decrease on frozen/thawed semen comparing to fresh and cooled semen 28   occurred for the parameters of total and progressive motility, percentage of rapids, 29     40   membrane fluidity and cell viability and acrosomal and membrane integrity. Sperm 1   cells were affect for cooling and freezing process when analyzed for the translocation of 2   PS and mitochondrial potential. For LPO significant difference was observed on dog 3   semen after thawing only comparing to cooled semen. No difference on caspase activity 4   was observed (Table 1). 5   6   Table 1 7   Mean ± standard error of the percentage of sperm cells for all parameters analyzed on 8   fresh, cooled and frozen/thawed semen. 9   10   Parameter Moment Fresh Cooled Frozen/Thawed TM 87,00 ± 1,24a 88,15 ± 1,38a 72,55 ± 6,26b PM 69,95 ± 1,28 a 71,75 ± 1,91a 56,30 ± 6,00b RAP YP-/M540- YP-/M540+ AN-/PI- 83,15 ± 1,94a 78,29 ± 6,22a 18,33 ± 5,54a 81,55 ± 1,53a 75,76 ± 6,60a 22,55 ± 6,49a 64,30 ± 7,68b 23,02 ± 9,12b 71,78 ± 9,85b 79,90 ± 7,95a 63,50 ± 4,66b 27,19 ± 9,22c AN+/PI- 2,23 ± 2,06 6,88 ± 2,12 8,25 ± 10,16 FITC-­‐PSA-­‐/PI-­‐ 85,71 ± 6,22a 70,37 ± 6,43a 30,87 ± 9,90b HMP 85,15 ± 2,76a 60,52 ± 3,31b 38,06 ± 6,40c LPO 16,57 ± 5,44ab* 16,22 ± 2,43a* 23,00 ± 4,13b* CASP+ 3,15 ± 2,38 8,65 ± 4,13 10,25 ± 6,75 Within a column, values with different superscripts differ significantly: P < 0.01 * P < 11   0.05 (n = 20). 12   4. Discussion 13   14   In the present study we investigated the effects of cooling and cryopreservation on the 15     41   canine sperm subpopulation. As expected a decline in motility population occurred after 1   cryopreservation as well as of the membrane integrity [33,34](Kim et al., 2010; Rota et 2   al., 2010). However, besides motility the sperm membrane integrity is also extremely 3   important for the fertilization success [35]. Despite capacitation to be a physiological 4   event that able sperm to be ready to interact with the oocyte it should not happen 5   prematurely. Changes in temperature during the cryopreservation process shortens the 6   capacitation timing causing changes to the membrane lipid architecture and therefore on 7   membrane permeability reducing the enzymatic activity necessary for the extrusion of 8   calcium ions [10]. These alterations can also be explained by the presence of seminal 9   plasma proteins, which could be noted in other species as boars, stallions and rams [36]. 10   In bovine, the BSPs (bovine seminal proteins) are initially considered as a 11   decapacitation factor. However after the ejaculation and contact time and amount of 12   these macromolecules in the seminal plasma, the capacitation process can be started 13   with displacement of phospholipids and cholesterol of sperm membrane. These 14   alterations depend on the time of semen dilution, according to Bergeron & Manjunath 15   [37], the LDLs egg yolk, present in semen extenders, are capable of sequestering these 16   proteins and minimize the effects of cryo-capacitation induced like changes. However, 17   the technique used for the cryopreservation of canine semen involves a centrifugation 18   and subsequent dilution, which prolongs the contact time of the seminal plasma proteins 19   and sperm cells, as in the present study. Such effects are mentioned to occur in other 20   species besides bovines as boars, stallions and rams [36,38], which could also occur in 21   canines. These proteins are heparin-binding proteins, that have already been identified 22   in dogs [39], despite not having been identified in dogs similar proteins as the BSPs. 23   Cryopreservation process, including cooling, affects sperm cells in either lethal or sub-24   lethal aspect and sub-lethal alterations accelerates sperm function, which impair cell 25   life. Burgess et al. [40] observed that after the freeze/thaw the sperm lose the capacity 26   of adhesion on epithelial cell of the oviduct; the authors comment that this fact is 27   probably due to an increase in the number of sperm with capacitation like-changes and 28   acrosome reacted. 29   Therefore, subtle chances on membrane permeability, as detected by YP and M540 on 30   the present study, permits that the sperm still mobile but could make the cell more 31   readily to undergo to acrosome reaction and die [3]. As YP can penetrate in an early 32   stage damaged plasma membrane it is a useful indicator in predict cell death in dog 33   sperm making the combination of YP and M540 a sensitive indicator of cell viability 34     42   [11]. 1   Recently it has been shown that cryopreservation process also induces membrane PS 2   translocation on dog’s spermatozoa [13]. This fact was confirmed in the present study in 3   which there was significant decreasing in intact cells of cooled and frozen/thawed 4   semen. However, cryopreservation process didn’t influence the population of live sperm 5   showing PS translocation in our study and as showed in dog sperm before [13]. 6   Although it is a necrotic process, still controversial whether PS translocation is a marker 7   for apoptosis or not, thus anexin –V can be useful in detect the response of the sperm 8   cell in stress conditions [15] and could be one more tool in determine bad and good 9   freezers. These necrotic alterations caused by cryopreservation process could be 10   observed in the frozen/thawed semen in humans, boars, bulls and dogs [33,41–43] 11   indicating that the freezing process decrease cell viability and its fertilizing ability post-12   thaw. 13   Cryopreservation of spermatozoa also had an effect on sperm mitochondria. On the 14   present study a decreased mitochondrial activity potential occurred after cooling and 15   freezing/thawing. This fact we could think that would influence directly on sperm 16   motility but the ATPs from glycolysis instead of oxidative phosphorylation that is 17   essential for the motility hyper activation, tyrosine phosphorylation, binding to the zona 18   pellucida and acrosomal reaction [15]. On the other hand apoptosis lead to opening of 19   mitochondrial pores, which would cause a decreased mitochondrial activity by the 20   liberation of pro-apoptotic factors on the cytoplasm [10]. 21   About membrane lipid peroxidation in our study a significant change were observed 22   comparing cooled to frozen/thawed semen. The efficiency of BODIPY-C11 staining in 23   mark cells that undergone to membrane LPO was confirmed on human sperm after an 24   induced reaction with iron [44]. An individual difference on LPO were observed in dogs 25   on fresh semen by Neagu et al. [26] and the difference remained for one of the tested 26   dogs after semen cryopreservation, showing that analysis of LPO could be another 27   interesting tool to determine good and bad semen freezers. 28   Differences in caspase activity was not seen in our study on fresh, cooled or thawed 29   semen. Although previously reported in dog sperm [21] the activity of caspase was 30   noted on the intermediate piece and sperm tail and that could represent a remaining 31   cytoplasm from sperm maturation instead of a apoptosis like-changes [7,10,14,15,22]. 32   Based on our results we conclude that cryopreservation leads to structural and 33   functional changes in sperm cell, which explains their short survival after thawing. The 34     43   cryo-capacitation like changes can be related to others factors, as the seminal plasma 1   proteins that are not know yet on this specie. Apoptosis process can be initiated with the 2   opening of mitochondrial pores during the freezing/thaw process, which releases pre 3   apoptic factor on the cytoplasm. The mitochondrial potential is not related to sperm 4   motility but sperm survival. 5   6   Acknowledgments 7   This work was supported by FAPESP [grant number 2013/02050-5]. 8   9   References 10   [1] Pretzer SD, Lillich RK, Althouse GC. Single, transcervical insemination using 11   frozen-thawed semen in the Greyhound: A case series study. Theriogenology 12   2006;65:1029–36. doi:10.1016/j.theriogenology.2005.07.006. 13   [2] Macedo SP, Malm C, Henry MRJM, Telles LF, Figueiredo MS, Fukushima FB, 14   et al. Endoscopic transcervical intrauterine artificial insemination in Labrador 15   Retriever bitches. Res Vet Sci 2012;92:494–500. doi:10.1016/j.rvsc.2011.04.015. 16   [3] Alhaider AK, Watson PF. 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Title: Fertility and seminal quality in dogs 1   Author’s 2   3   Carmen Cecilia Sicherle1 – corresponding author 4   1 São Paulo State University Julio de Mesquita filho – UNESP, Botucatu – Department 5   of Reproduction and Veterinary Radiology. 6   Prof. Dr. Walter Mauricio Correa s/n - Caixa Postal 560, Unesp Campus de Botucatu 7   18618-681 - Botucatu, SP 8   Phone number: (+ 55 14) 3811-6000 9   e-mail: carmensicherle@terra.co.br 10   11   Maria Denise Lopes 12   1 São Paulo State University Julio de Mesquita filho – UNESP, Botucatu – Department 13   of Reproduction and Veterinary Radiology. 14   Prof. Dr. Walter Mauricio Correa s/n - Caixa Postal 560, Unesp Campus de Botucatu 15   18618-681 - Botucatu, SP 16   Phone number: (+ 55 14) 3811-6000 17   e-mail: denise@fmvz.unesp.br 18   19   Abstract 20   The aims of the study were to assess individual characteristics and sperm concentration 21   of cryopreserved semen using different structural and functional analysis and dog 22   fertility. Twenty ejaculates were collected from 5 dogs and sperm were cryopreserved 23   one-step protocol. Sperm analysis was performed in fresh, cooled and thawed semen, by 24   computer sperm motility analysis (total [TM] and progressive motility [PM], and rapid 25     50   sperm), membrane fluidity and viability, phosphatidyl serine translocation, acrosomal 1   and membrane integrity, mitochondrial potential and membrane lipid peroxidation 2   (LPO). The dog semen that displayed better numerical results in all analysis was chose 3   to inseminate separately (dog 1) and to compare with semen pool from others 4 dogs. 4   Twenty bitches were i