Caroline Measso do Bonfim Prevalência de vírus respiratórios em crianças de creche com sintomas de infecções respiratórias agudas São José do Rio Preto 2010 CAROLINE MEASSO DO BONFIM Prevalência de vírus respiratórios em crianças de creche com sintomas de infecções respiratórias agudas Orientador: Profª. Drª. Fátima Pereira de Souza São José do Rio Preto 2010 Dissertação apresentada para obtenção do título de Mestre em Microbiologia, área de Virologia junto ao Programa de Pós-Graduação em Microbiologia do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto. Bonfim, Caroline Measso do. Prevalência de vírus respiratório em crianças de creche com sintomas de infeções respiratórias agudas / Caroline Measso do Bonfim. - São José do Rio Preto : [s.n.], 2010. 86 f. : il. ; 30 cm. Orientadora: Fátima Pereira de Souza Dissertação (mestrado) -Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas. 1. Virologia. 2. Vírus respiratório. 3, Infecção por vírus - Epidemiologia. 4. Infecção respiratória aguda - Epidemiologia. 5. Crianças de creche. I. Souza, Fátima Pereira de. II. Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas. III. Título. CDU - 578 Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca do IBILCE Campus de São José do Rio Preto - UNESP CAROLINE MEASSO DO BONFIM Prevalência de vírus respiratórios em crianças de creche com sintomas de infecções respiratórias agudas BANCA EXAMINADORA Profª. Drª. Fátima Pereira de Souza Professor Assistente Doutor UNESP – São José do Rio Preto Orientador Dr. José Luiz Proença Módena Professor Doutor USP – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto Profª. Drª. Maria Elisabete Jorge Amaral Professor Assistente Doutor UNESP – São José do Rio Preto São José do Rio Preto, 05 de Abril de 2010 Dissertação apresentada para obtenção do título de Mestre em Microbiologia, área de Virologia junto ao Programa de Pós-Graduação em Microbiologia do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto. AGRADECIMENTOS Agradecimentos Agradeço a Deus por guiar meu caminho todos os dias. À UNESP-IBILCE pela oportunidade e aprendizado. À Profª Drª Fátima Pereira de Souza pela orientação deste trabalho. À Profª Drª Paula Rahal pela disponibilização do laboratório onde foi realizado este trabalho. À Prof. Dr. José Antônio Cordeiro pela colaboração. À CAPES e FAPESP pelo apoio financeiro. Aos integrantes do LEGO: Lenira, Jucimara, Paola, Marília, Érica, Marina Lílian Pires, Carol Jardim, Cíntia, Paulo, Lílian (Miuki), Valéria, André, Natália, Ana Cláudia, Renata e Plínio, por toda ajuda, compreensão, apoio e amizade. Às minhas amigas Maísa, Lilica, Suelen, Thaís, Aline, Priscila e Lí pelo companheirismo nas horas boas e ruins. Ao meu namorado Hilário por ter me suportado, tentando sempre me acalmar nos momentos de dificuldades. E agradeço também, é claro, ao meu pai, minha mãe, minhas irmãs e minha avó por ter me incentivado e ter me dado carinho sempre. Agradeço a Deus pela família perfeita que somos. Amo muito. RESUMO Resumo RESUMO As infecções do trato respiratório estão associadas com mortalidade significativa no mundo inteiro e afetam principalmente crianças menores de cinco anos de idade. A maioria das infecções respiratórias é causada por agentes virais como: Vírus Sincicial Respiratório (RSV), Influenzavírus tipo A e B (FLUA e FLUB), Parainfluenza tipo 1, 2 and 3 (PIV-1, PIV-2 e PIV-3), Rhinovirus (HRV) e Metapneumovirus Humano (hMPV). O conhecimento da epidemiologia e prevalência desses vírus é importante para que metodologias terapêuticas possam ser aplicadas apropriadamente e saber como esses vírus estão circulando. O objetivo deste trabalho foi investigar a incidência de 8 tipos de vírus respiratórios em 279 amostras de aspirado nasofaríngeo obtidas de Julho/2004 a Setembro de 2005 de 120 crianças (73 do sexo masculino e 47 do sexo feminino) com idade entre 0 a 6 anos com sintomas de infecção respiratória aguda. A análise foi realizada pela técnica de RT-PCR e seqüenciamento direto. Nossos resultados mostraram que 27,2% (76/279) das amostras foram positivas para pelo um dos vírus respiratórios, sendo 84,2% (64/76) de Picornavírus, 76,3% (58/76) de Rhinovírus e 7,9% de Enterovírus (6/76), 7,9% (6/76) de RSV, 1,3% (1/76) de hMPV, 2,6% (2/76) de FLUA, 2,6% (2/76) de PIV-1 e 1,3% (1/76) de PIV-2. As infecções repetidas acometeram 29% (22/76) das crianças com infecção respiratória. A maioria das re-infecções, 82% (18/22), foram pelo gênero Rhinovírus. Os sintomas mais freqüentes foram coriza diagnosticada em 89,5% dos casos (68/76) seguido de tosse em 67,1% (51/76). Os Rhinovírus foram detectados em todo o período de estudo, com picos de infecção nos meses de inverno e outono, porém não houve associação significativa entre a presença viral e a sazonalidade. Neste estudo houve prevalência de infecção e re-infecção por Rhinovírus. Portanto, este estudo proporcionou melhor entendimento da circulação de vírus respiratórios em população de creche na região de São José do Rio Preto, o que permitirá planejamentos futuros de recursos necessários para o desenvolvimento de programas de prevenção. Palavras-chave: Infecção respiratória aguda, vírus respiratórios, crianças de creche, Rhinovírus, sazonalidade. ABSTRACT Abstract ABSTRACT Respiratory tract infections are associated with significant mortality worldwide and affect mostly children under five years of age. Most respiratory infections are caused by viral agents such as: Respiratory Syncytial Virus (RSV), the viruses of Influenza type A and B (FLUA and FLUB), Parainfluenza type 1, 2 and 3 (PIV-1, PIV-2 and PIV-3), Rhinovirus (HRV) and Human Metapneumovirus (hMPV). Knowledge of the epidemiology and prevalence of these viruses is important for therapeutic methods can be applied as appropriate and to know how these viruses are circulating. The aim of this work was to investigate the incidence of 8 types of respiratory viruses in 279 samples of nasopharyngeal aspirated obtained from July/2004 to September/2005 of 120 children (73 male and 47 female) with age between 0 to 6 years with symptoms of acute respiratory infection. The analysis was performed by RT-PCR and direct sequencing. Our results showed that 27,2% (76/279) of samples were positive at least for a type of the respiratory viruses, with 84,2% (64/76) of Picornaviruses, with 76,3% (58/76) of Rhinovírus e 7,9% of Enterovírus (6/76), 7,9% (6/76) of RSV, 1,3% (1/76) of hMPV, 2,6% (2/76) of FLUA, 2,6% (2/76) of PIV-1 and 1,3% (1/76) of PIV-2. The recurrent infections affect 29% (22/76) of children with respiratory infection. Most re-infections, 82% (18/22), were by Rhinovírus genus. The most frequent symptoms were runny nose diagnosed in 89.5% (68/76) followed by cough in 67.1% (51/76). Rhinovírus were detected throughout the study period, with peaks of infection during the winter and autumn, but there was no significant association between viral presence and seasonality. In this study there was prevalence of infection and re-infection by Rhinovírus. Therefore, this study provided better understanding of the circulation of respiratory viruses in a population of day care in the region of São José do Rio Preto, which will allow future planning of resources needed for the development of prevention programs. Key words: Acute respiratory infection, respiratory virus, daycare children, Rhinovírus, seasonality. SUMÁRIO Sumário SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................2 1.1 Caracterização e Morfologia dos vírus..............................................................2 1.1.1 Família Paramyxoviridae...........................................................................2 1.1.2 Família Orthomyxoviridae........................................................................5 1.1.3 Família Picornaviridae..............................................................................7 1.2 Epidemiologia e Sazonalidade............................................................................9 1.3 Fatores de Risco e Transmissão........................................................................13 1.4 Sintomatologia....................................................................................................15 1.5 Diagnóstico, Tratamento e Prevenção.............................................................17 2. OBJETIVOS............................................................................................................22 3. MATERIAIS E MÉTODOS..................................................................................24 3.1 Casuística...........................................................................................................24 3.2 Critérios de inclusão e exclusão.......................................................................24 3.3 Aprovação Institucional e Questionários........................................................25 3.4 Colheita e processamento das amostras de secreção nasofaringe................25 3.5 Extração de RNA.............................................................................................26 3.6 Transcrição Reversa (RT-PCR).....................................................................27 3.7 Amplificação.....................................................................................................27 3.8 Tipagem dos Picornavírus para detecção de Rhinovírus ou Enterovírus por de seqüenciamento direto..........................................................................................29 3.8.1 Purificação dos amplicons.....................................................................30 3.8.2 Reação de Marcação Fluorescente com BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit.......................................................................................31 3.8.3 Precipitação............................................................................................31 3.8.4 Sequenciamento.....................................................................................32 3.9 Tipagem............................................................................................................32 3.10 Análise estatística...........................................................................................33 4. RESULTADOS.....................................................................................................36 4.1 Características da população de estudo........................................................36 4.2 Sintomas diagnosticados.................................................................................42 4.3 Sazonalidade dos vírus respiratórios estudados...........................................46 5. DISCUSSÃO..........................................................................................................51 6. CONCLUSÕES.....................................................................................................63 Referências Bibliográficas........................................................................................66 Anexos........................................................................................................................79 Anexo I – Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa..........................................80 Anexo II – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido................................81 Anexo III – Quadro geral do paciente................................................................82 Anexo IV – Quadro atual do paciente................................................................84 LISTAS DE FIGURAS Lista de figuras Figura 1: Representação esquemática de um Pneumovírus.............................................3 Figura 2: Representação esquemática da organização genômica do RNA do RSV.......4 Figura 3: Representação esquemática da organização genômica do RNA do PIV-1.... 5 Figura 4: Representação esquemática da estrutura do Vírus Influenza A........................6 Figura 5: Representação esquemática de um Influenzavírus...........................................7 Figura 6: Representação esquemática da estrutura do capsídeo dos Picornavírus..........8 Figura 7: Representação esquemática do genoma dos Picornavírus...............................9 Figura 8: Eletroferograma de uma sequência do genoma de Rhinovírus......................33 Figura 9: Resultados da PCR em Gel de Agarose.........................................................37 Figura 10: Positividade dos vírus respiratório de amostras de aspirados da nasofaringe .........................................................................................................................................38 Figura 11: Relação da positividade total das amostras com a faixa etária das crianças infectadas com vírus respiratórios.................................................................................. 40 Figura 12: Relação de cada vírus respiratório com a distribuição etária das crianças.......................................................................................................................... 41 Figura 13: Gráfico ilustrando a renda familiar das crianças com infecções respiratórias.....................................................................................................................42 Figura 14: Número total de infecções repetidas e infecções repetidas por Rhinovírus.......................................................................................................................46 Figura 15: Distribuição sazonal de infecções respiratórias virais em crianças de creche no período de junho de 2004 a setembro de 2005..........................................................47 Figura 16: Distribuição mensal das amostras positivas de Rhinovírus durante os meses de Junho de 2004 a Setembro de 2005............................................................................48 Figura 17: Distribuição sazonal das amostras positivas de Rhinovirus......................... 49 ABREVIAÇÕES Abreviações RSV: Vírus Sincicial Respiratório hMPV: Metapneumovírus Humano FLU: Vírus Influenza FLUA: Vírus Influenza A FLUB: Vírus Influenza B HRV: Rhinovírus Humano Pic: Picornavírus HEV: Enterovírus Humano PIV: Vírus Parainfluenza PVI-1: Vírus Parainfluenza Tipo 1 PIV-2: Vírus Parainfluenza Tipo 2 PIV-3: Vírus Parainfluenza Tipo 3 N: Proteína do nucleocapsídeo P: Fosfoproteína L: Subunidade grande da Polimerase F: Proteína de Fusão G: Proteína de Ligação SH: Proteína Hidrofóbica NS1: Proteína Não-Estrutural 1 NS2: Proteína Não-Estrutural 2 M: Proteína de Matriz Interna M2-1: Proteína de Matriz M2-2:Proteína de Matriz H/N: Hemaglutinina/Neuraminidase APVC: Pneumovirus Aviário Do Tipo C NP: Nucleoproteína HA: Hemaglutinina NA:Neuraminidase P/C: Proteína associada ao nucleocapsídeo viral VP1: Proteína do capsídeo viral VP4: Proteína do capsídeo viral Vpg: Virion Protein Genome Linked (Proteína do vírion ligada ao genoma) IRES: Internal Ribossome Entry Site (Sítio interno de entrada do ribossomo) IRA: Infecção Respiratória Aguda PCR: Reação em Cadeia da Polimerase (Polimerase Chain Reaction) RT-PCR: Transcrição Reversa da Reação em Cadeia da Polimerase IFI: Imunofluorescência Indireta PBS: Phosphate Buffered Saline dNTP: Desoxirribonucleotídeo trifosfatado 5’UTR: Região não traduzida (Untranslated Region) 1 INTRODUÇÃO 2 Introdução 1. INTRODUÇÃO As infecções respiratórias têm um significativo impacto na área da saúde no mundo inteiro, sendo predominantemente de origem viral. Essas infecções do trato respiratório constituem a principal causa de consultas aos serviços de saúde e perda de dias do trabalho e da escola nos EUA (HUESTON, 1999). No Brasil, essas infecções apresentam morbidade e mortalidade significativa e conseqüentemente alta demanda por serviços de saúde nas mais diversas instâncias de assistência (VASQUEZ & MOSQUERA, 1999). Os principais vírus que primariamente infectam o trato respiratório são: Influenza do tipo A e B (FLUA e FLUB), Parainfluenza do tipo 1, 2, e 3 (PIV-1, 2 e 3), Vírus Sincicial Respiratório (RSV), Rhinovírus Humano (HRV), Metapneumovírus Humano (hMPV), Adenovírus (HAdV) e Bocavírus Humano (HBoV) (CHERRY, 2004; FOUCHIER et al., 2005; FOULONGNE et al., 2006) 1.1 - Caracterização e Morfologia dos vírus 1.1.1 Família Paramyxoviridae Esta família de vírus inclui alguns dos mais bem sucedidos patógenos que causam epidemias de importância médica, dentre eles: o Vírus Sincicial Respiratório (RSV), Metapneumovírus Humano (hMPV) e Parainfluenza Vírus (PIV). Possuem genoma de fita simples de RNA (ácido ribonucléico), sense negativa, não-segmentada. Esses vírus carregam em suas partículas virais uma enzima denominada RNA polimerase, pois o RNA viral que entra na célula, não pode ser tradu- 3 Introdução zido nem copiado pela maquinaria celular. A RNA polimerase do vírus transcreve o genoma de polaridade negativa. O Vírus Sincicial Respiratório pertence ao gênero Pneumovirus e apresenta tamanho médio de 120 a 300nm, simetria helicoidal e morfologia esférica, contendo um envelope composto de uma bicamada derivada de membrana plasmática, como pode ser visto na Figura 1. O RSV apresenta dois subtipos, A e B, que são distinguidos pelas diferenças na proteína de ligação (G) ou na proteína nuclear (N) (PERET et al., 1998). Figura 1 – Representação esquemática de um Pneumovírus. Destacam-se no esquema a bicamada lipídica, o complexo ribonucleoprotéico (RNP) e as proteínas de ligação G, de fusão F e de matriz M, (Fonte: http://template.bio.warwick.ac.uk/staff/easton/IMAGES/Diagrams/3dvírus.jpg). O genoma do RSV codifica 10 RNAs mensageiros (mRNA), os quais são traduzidos em 11 proteínas: quatro proteínas do nucleocapsídeo – proteína do nucleocapsídeo (N), fosfoproteína (P), subunidade grande da polimerase (L), fator de Ligação • Adsorção viral 4 Introdução elongação da transcrição (M2-1); três glicoproteínas transmembrânicas – proteínas de fusão (F), proteína de ligação (G) e uma pequena proteína hidrofóbica (SH); duas proteínas não estruturais NS1 e NS2; uma proteína de matriz (M); e um fator de regulação de RNA (M2-2), observado na figura 2 (OGRA, 2004). Figura 2 – Representação esquemática da organização genômica do RNA do RSV, evidenciando-se as regiões gênicas de todas as proteínas virais. NS1 e NS2: regiões gênicas de proteínas não estruturais; N, P e L: regiões gênicas de proteínas associadas ao nucleocapsídeo viral; M, M2.1 e M2.2: regiões gênicas de proteínas de matriz; F, G e SH: regiões gênicas das proteínas transmembrânicas de superfície responsáveis pela fusão, ligação e adsorção viral à célula hospedeira (baseado em Ogra, 2004). O Metapneumovírus Humano é membro da subfamília Pneumovirinae, sendo o primeiro patógeno humano do gênero Metapneumovirus. Essa subfamília inclui também o RSV, que compartilha muitas características clínicas e epidemiológicas com o hMPV. A alta heterogeneidade dentro desse genoma pode causar uma imunidade incompleta e infecções recorrentes são comuns com esse vírus (BOIVIN et al., 2002 ; CHAN et al., 2003). Estudos de soro prevalência têm mostrado que o hMPV circula entre a população humana por volta de 50 anos e virtualmente todas as crianças com mais de 5 anos mostram evidência sorológica de infecção passada (FALSEY et al., 2003). As análises das sequências identificaram 2 genótipos principais do hMPV, A e B, com subtipos A1, A2, B1 e B2 (ISHIGURO et al., 2004) e uma alta identidade com a 5 Introdução sequência do Pneumovírus Aviário do sorotipo C (APVC), que é agente etiológico de doenças respiratórias em aves (HOOGEN et al., 2002). O mapa genético dos PIV é similar ao do RSV e, codifica três proteínas associadas ao genoma incluindo a proteína do nucleocapsídeo (N), a fosfoproteína (P) e a subunidade grande da polimerase (L); três proteínas associadas ao envelope, incluindo a proteína de matriz interna (M), as glicoproteínas transmembrânicas de superfície de fusão (F) e hemaglutinina-neuraminidase (HN), como pode ser visto na figura 3 (NEWMAN et al., 2002). Além destas, são codificadas proteínas acessórias que diferem entre os diferentes sorotipos do Parainfluenza Vírus, que são PIV-1, PIV-2, PIV-3, PIV- 4a e PIV-L4b (MAKIE, 2003). Figura 3 – Representação esquemática da organização genômica do RNA do PIV-1, evidenciando-se as regiões gênicas de todas as proteínas virais. N, P/C e L: regiões gênicas de proteínas associadas ao nucleocapsídeo viral; M, F e HN: regiões gênicas das proteínas associadas ao envelope, responsáveis pela fusão, ligação e adsorção viral à célula hospedeira (baseado em Newman et al., 2002 ). 1.1.2 Família Orthomyxoviridae Esta família inclui três gêneros: Influenzavírus A, B e C. São vírus envelopados, de RNA de fita simples sense negativa, circundado por um capsídeo helicoidal e contendo 8 segmentos de RNA, os quais codificam 10 proteínas, como evidencia a figura 4 (NELSON & HOLMES, 2007). 6 Introdução Figura 4 – Representação esquemática da estrutura do Vírus Influenza A, mostrando a disposição das proteínas virais e RNA fragmentado em oito segmentos, na partícula viral (Fonte: Nelson & Holmes, 2007). Os vírus Influenza A e B são morfologicamente muito semelhantes. Podem ser partículas esféricas de 80 a 120 nm de diâmetro ou filamentosas. O RNA é protegido por uma nucleoproteína (NP). Esta proteína é um antígeno tipo-específico e é antigenicamente distinto entre os três gêneros, o que promove a base para a classificação do Influenzavírus A, B e C. (MAKIE, 2003; GE et al., 2004). A característica mais marcante da estrutura destes vírus são as projeções radiais de espículas, que se observam em toda a sua superfície. Estas espículas correspondem as glicoproteínas hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA) e podem ser observadas na figura 5. Três segmentos do RNA genômico codificam os três componentes do complexo RNA transcriptase RNA-dependente: PA, PB1 e PB2. RNA de polaridade negativa 7 Introdução Figura 5 – Representação esquemática de um Influenzavírus, evidenciando a simetria helicoidal do nucleocapsídeo viral, disposição das proteínas de matriz e glicoproteínas de superfície (Fonte: http://www.rkm.com.au/VÍRUS/Influenza/FLU-images/VÍRUS-FLU-structure-L-500.jpg) 1.1.3 Família Picornaviridae A família dos Picornavírus é um grupo de diversos patógenos humanos, incluindo os Enterovírus Humano (HEV) e os Rhinovírus Humano (HRV) que juntos constituem a causa mais comum de infecções virais em humanos no mundo (MAKIE, 2003). O Rhinovírus é o responsável por cerca de 60% dos resfriados comuns e apresenta três espécies: HRV-A, HRV-B e mais recentemente o HRV-C. Vírus pertencentes à espécie do Rhinovírus Humano C são distintos dos HRV-A e HRV-B. Estes vírus tem sido chamados de HRV-A2 (ARDEN et al., 2006; MCERLEAN et al., 2007) devido a sua estreita relação com HRV-A em algumas análises, enquanto outros autores tem chamado de HRV-C (LAMSON et al., 2006; LAU et al., 2007; LEE et al., Hemaglutinina Neuraminidase Proteína de Matriz M1 8 Introdução 2007; MCERLEAN et al., 2008) ou HRV-X (KISTLER et al., 2007). Os Enterovírus são detectados com menos freqüência (http://www.asmabronquica.com.br/). A família Picornaviridae recebe este nome devido ao seu ínfimo tamanho (aproximadamente 15-30 nm de diâmetro). O seu genoma é constituído de RNA de fita simples e apresenta simetria icosaédrica (poliedro com 20 lados, mostrado na figura 6 de DRESCHERS et al., 2007) e orientações positivas, sendo composto por 30% de RNA e 70% de proteína. O vírion consiste em um capsídeo de 60 subunidades, cada qual com quatro proteínas (VP1 a VP4). Este vírus possui mais de 100 sorotipos diferentes, os quais apresentam pequenas diferenças na seqüência genética e estrutura antigênica. Figura 6 – Representação esquemática da estrutura do capsídeo dos Picornavírus, mostrando a disposição dos protômeros VP1, VP2 e VP3 (Fonte: Dreschers et al., 2007). A organização genômica é similar em todos os gêneros de picornavírus. Uma proteína denominada Vpg é unida à extremidade 5’ do RNA, o que é um pré-requisito para a síntese de fitas de RNA negativo como molde para replicação. A extremidade 5’ 9 Introdução também contém a seqüência do sítio interno de entrada ribossomal (IRES) e permite a ligação às subunidades ribossomais da maquinaria de tradução do hospedeiro. Seguindo a IRES, localiza-se a unidade P1, que contém informação para a formação do capsídeo, e depois unidades que codificam proteínas não estruturais (proteases e RNA-polimerase dependente de RNA) denominadas P2/P3. O genoma é completado por uma região não- traduzida e uma cauda poli A na extremidade 3’ (Figura 7) (DRESCHERS et al., 2007). Figura 7 – Representação esquemática do genoma dos Picornavírus, demonstrando a disposição do IRES, que permite a ligação do material genômico à subunidades ribossomais da maquinaria de tradução do hospedeiro. Evidencia as unidades da poliproteína inicial P1, que contém informações para a formação do capsídeo, P2 e P3 que codificam proteínas não estruturais. (baseada em DRESCHER et al., 2007). 1.2- Epidemiologia e Sazonalidade As infecções respiratórias agudas (IRAs) são as maiores causas de morbidade e mortalidade por todo o mundo particularmente nos países em desenvolvimento (SELWYN, 1990). Essas infecções são as principais responsáveis por patologias do trato respiratório, acometendo indivíduos de todas as idades, especialmente crianças e pessoas imunocomprometidas (KESSON, 2007). Ainda que a morbidade relacionada a estas infecções tenha sido descrita inicialmente em crianças, quadros graves em idosos e em portadores de doenças crônicas têm sido registrados (YANG & RUBIN, 1995; NICHOLSON et al., 1997; FALSEY et al., 2005). 10 Introdução Algumas características do hospedeiro, como idade, têm sido mostradas relevantes para o aumento na incidência e ou gravidade das infecções respiratórias causadas por vírus tanto em crianças como em pessoas idosas (ZAMORANO et al., 2003). Em indivíduos idosos ou em pacientes imunocomprometidos, há também significativa relevância na ocorrência de pneumonia (FALSEY et al., 2006). Há um pre- domínio de crianças do sexo masculino com infecções respiratórias virais. Essa preponderância do sexo masculino quanto à morbidade por doenças do trato respiratório é relatada na literatura (KOCH et al., 2003; IWANE et al., 2004). Fatores relacionados ao menor calibre da via aérea entre os meninos são os prováveis responsáveis por esse fenômeno (POST et al., 1992; IWANE et al., 2004). Crianças na pré-escola e creches, devido ao contato com outras crianças diariamente, apresentam alta freqüência de infecções respiratórias (QUACH et al., 2003) especialmente infecções ocasionadas por vírus Influenza (FLEMING & CROSS, 1993). Entre os portadores de doenças crônicas, imunodeprimidos e idosos, a infecção respiratória viral e suas complicações têm se mostrado mais graves, o que reforça a necessidade de vigilância virológica, medidas profiláticas e, no caso do Influenza, indicação da vacina específica contra os sorotipos circulantes (CDC, 2004). Vírus respiratórios ocasionam surtos e epidemias anuais em todos os continentes, com um padrão sazonal, na sua maioria, fortemente associado ao clima (SHEK & LEE, 2003). Em países de clima temperado são mais incidentes durante o outono e inverno, entretanto em zonas tropicais são muito escassos os dados registrados na literatura 11 Introdução (OMER et al., 2008). Na região amazônica, por exemplo, existem relatos de que os surtos de infecções respiratórias possam ser associados à estação chuvosa, entretanto estudos de sazonalidade merecem ser implementados para um melhor controle epidemiológico dos diferentes agentes virais (http://www.iec.pa.gov.br/pibic/res2006- 25.htm). O RSV exibe um padrão sazonal evidente em muitos países, com grande varia- ção de uma região para outra. Estações do ano e o clima parecem influenciar a epidemiologia das infecções por este vírus (STENSBALLE et al., 2003). Epidemias anuais de RSV ocorrem durante o inverno em climas temperados, enquanto dados epidemiológicos de regiões tropicais têm mostrado uma associação entre surtos de RSV e estações chuvosas (LOSCERTALES et al., 2002). Estudos de Thomazelli et al. (2007) realizados na cidade de São Paulo mostraram que as epidemias de RSV começam no final do outono ou começo do inverno, com picos em maio e duração de 5 meses. Tem sido observado que o comportamento social humano pode aumentar o contato entre as pessoas e isto pode ter uma participação na sazonalidade das epidemias de RSV. Multidões, grandes famílias, múltiplos nascimentos e residências super- populadas são conhecidos como fatores de risco de infecção por RSV (BULKOW et al., 2002). O Metapneumovírus Humano também parece ter uma distribuição sazonal, com picos durante a estação mais fria do ano e primavera, similarmente aos vírus da Influenza e o RSV (HOOGEN et al., 2003; ESTRADA et al., 2007). O hPMV em países de clima temperado, geralmente apresenta uma distribuição sazonal que se sobrepõe à do RSV e FLU e com base nisto, postula-se que co-infecções entre o hMPV e outros ví- 12 Introdução rus respiratórios possam levar a um aumento da gravidade da doença (WOLF et al., 2006). Já em regiões de clima subtropical, como Hong Kong, o pico da epidemia foi observado ocorrer durante os meses de primavera e início do verão, no mesmo período em que o RSV ocorre nesta região (PEIRIS et al., 2003). No Brasil, a presença do vírus foi verificada no Estado do Sergipe, região nordeste do país, caracterizada pelo clima tropical durante todo o ano (CUEVAS et al., 2003). Porém, estudos distribuídos ao longo do ano ainda não foram realizados para es- clarecer a época de maior transmissibilidade do vírus (MEJIAS et al., 2004). Com o Influenza, a incidência da doença apresenta padrão sazonal em áreas de clima temperado, com picos bem demarcados durante o inverno. Alonso et al. (2007), fizeram uma análise quantitativa dos padrões sazonais de pneumonia e dados de mortalidade por Influenza nos estados brasileiros e revelaram nesse estudo que existe uma “onda'' anual de Influenza viajando pelo sul do Brasil durante um período de aproximadamente 3 meses, começando em abril no norte de regiões equatoriais e atingindo regiões temperadas do sul em julho (ALONSO et al., 2007). Entretanto, a razão para sazonalidade do Influenza ainda não é bem compreendida. Alguns autores sugerem que o clima pode ter uma influência direta na sobrevida do vírus, na eficiência da transmissão, na susceptibilidade do hospedeiro, além de que o clima frio proporciona a aglomeração da população e maior disseminação viral (KAMPS et al., 2006; ALONSO et al., 2007). Nos países de clima tropical, a epidemiologia do vírus Influenza é diferente, podendo ocorrer em qualquer época do ano, porém as epidemias apresentam tendência 13 Introdução de acontecer após mudanças nos padrões climáticos, como, por exemplo, relacionadas à estação de chuvas (KAMPS et al., 2006; ALONSO et al., 2007). No Brasil a epidemiologia do Influenza é atualmente bem conhecida nas regiões Sul e Sudeste onde a sazonalidade está bem caracterizada ocorrendo nos meses de outono e inverno (ALONSO et al., 2007). O vírus Parainfluenza também apresenta uma ocorrência sazonal e é considerado um importante causador de doenças respiratórias, particularmente entre crianças menores de dois anos de idade (MONTO, 2002). As epidemias de Parainfluenza do tipo 1 ocorre geralmente durante o outono em anos alternados, Parainfluenza do tipo 2 ocorre esporadicamente e Parainfluenza do tipo 3 tende a causar epidemias anuais no inverno em climas temperados (THOMAZELLI et al., 2007). 1.3 - Fatores de risco e Transmissão Diversas características, tanto do vírus quanto do hospedeiro, são fatores que podem aumentar o risco das crianças contraírem infecções respiratórias graves. Dentre os fatores de risco relacionados ao hospedeiro estão: faixa etária, baixo peso ao nascer, não-aleitamento materno e desnutrição. Os fatores ambientais incluem a exposição passiva ao fumo, a aglomeração familiar, usuários de creche e a moradia em áreas urbanas com elevados índices de poluição atmosférica. São considerados fatores socioeconômicos: más condições de habitação e sanitárias, dificuldade de acesso ao serviço de saúde, cobertura vacinal insuficiente, baixa renda per capita e a baixa 14 Introdução escolaridade dos pais (FRANCA et al., 2001; NASCIMENTO-CARVALHO et al., 2002; MACEDO et al., 2007). A escolaridade materna parece ter um papel importante na saúde da criança (CARDOZO et al., 2007). A maior escolaridade propiciaria um conjunto de ações relacionadas ao cuidado mais adequado da criança e ao conhecimento de medidas preventivas de saúde, as quais reduzem a morbidade por doença respiratória (PRIETSCH et al., 2002). A transmissão ocorre tanto pelo contato direto quanto por meio da secreção de indivíduos contaminados. Os vírus respiratórios são não-móveis, porém podem ser transmitidos através de partículas aéreas que são produzidas quando a pessoa infectada espirra ou tosse. Esta secreção é impulsionada a distâncias de aproximadamente 1 metro pelo ar, mas não permanecem suspensas no mesmo (BRANKSTON et al., 2007). A infecção ocorre quando estas partículas são inaladas por outra pessoa e deposita-se nas mucosas nasal, faringiana ou do trato respiratório inferior. O contágio viral pode ocorrer por contato pessoa a pessoa através do toque interpessoal das superfícies das mãos que tiveram contato com secreções nasais infectadas, sendo que a maioria dos vírus respiratórios permanece viável nas superfícies por várias horas (http://www.asmabronquica.com.br/medical/tipos_de_asma_infeccao_viral.html). Os vírus respiratórios são responsáveis também por infecções hospitalares em berçários e enfermarias pediátricas. A transmissão também ocorre através do contato direto com secreções de pessoas infectadas pelo ato da tosse, por secreções das narinas ou por objetos contaminados (BACHEGA et. al., 1999). 15 Introdução 1.4 - Sintomatologia Nas infecções virais do trato respiratório, primeiramente observam-se sintomas de infecção das vias aéreas superiores apresentando sintomas como um simples resfriado caracterizado por febre, tosse e coriza, porém devido à afinidade viral por órgãos respiratórios inferiores, estas infecções evoluem para o trato respiratório inferior, apresentando quadros clínicos mais severos como bronquite, bronquiolite, broncopneumonia, insuficiência respiratória aguda e pneumonia (COELHO et al., 2007). Em crianças menores de cinco anos de idade, e indivíduos idosos ou com doenças crônicas, a infecção respiratória pode induzir uma doença severa (PELTOLA & RUUSKANEN, 2008). O vírus RSV é um dos patógenos mais comuns detectados em crianças que apresentam desde infecção leve até uma infecção mais severa do trato respiratório (DAMLE et al., 2008). Estudos epidemiológicos têm mostrado que o RSV representa a causa mais importante de doenças sérias do trato respiratório inferior, especialmente bronquiolite e pneumonia em crianças. RSV pode causar pneumonia severa e morte em pessoas com deficiência na imunidade (KESSON, 2007). Crowcroft et al. (2007) realizaram, na Inglaterra, um estudo durante o período de 1 ano com crianças admitidas em um hospital pediátrico que apresentavam infecção por RSV e constataram a presença de tosse em 85% das crianças, coriza em 64% e 44% de cianose e febre. No Brasil, D’Elia et al. (2005) identificaram a presença 35,5% de ciano- 16 Introdução se, 5% de apnéia e 53,5% de febre em crianças hospitalizadas com infecção do trato respiratório inferior pelo Vírus Sincicial Respiratório. As características clínicas do hMPV relembram as do RSV incluindo congestão nasal, mialgia, tosse e febre, e nos casos mais graves chiado, dificuldade na respiração, bronquiolite, pneumonia e falha respiratória. A co-infecção pelo RSV pode aumentar a gravidade da doença, e complicações como a asma pode aparecer (CROWE et al., 2004; WILLIAMS, 2005; MAZZONCINI et al., 2008). Com o vírus Influenza os primeiros sintomas tais como a febre, calafrios, prostração, tosse, espirros, coriza, diarréia e vômitos, costumam aparecer cerca de 24 horas depois do contágio. No Paraná, estudos realizados por meio da técnica de imunofluorescência indireta, com pacientes pediátricos hospitalizados que mostraram manifestações clínicas de doenças respiratórias, apontaram o Influenza como o vírus responsável por complicações clínicas em 62.2% dos pacientes, como traqueobronquiolite aguda (37.1%) e broncopneumonia (34.3%). Em 26.6% dos pacientes ocorreu desenvolvimento de falhas respiratórias agudas (COELHO et al., 2007). O vírus Parainfluenza 1-3 são as principais causas de tosse em crianças em fase de amamentação e menores de 5 anos de idade. Parainfluenza do tipo 3 também pode causar pneumonia viral e bronquiolite em crianças pequenas. Infecção primária com PIV proporciona um certo grau de imunidade, mas esta imunidade não é completa e re- infecções ocorrem frequentemente, mas raramente são tão graves como observada na infecção primária (KESSON, 2007). 17 Introdução Os Rhinovírus, membros da família Picornaviridae, são os principais agentes causadores do resfriado comum tanto em adultos como em crianças (BROWNLEE & TURNER, 2008). Este vírus foi previamente identificado em crianças com infecções do trato respiratório superior, porém, em um estudo realizado na França ele foi recentemente apontado como sendo o maior agente etiológico de bronquiolite e pneumonia na infância (JACQUES et al., 2006). Estudos têm mostrado que esse agente viral é o mais comum patógeno associado com exacerbação de asma em adultos e crianças (REGAMEY & KAISER, 2008). Em um estudo realizado na Finlândia por Jartti et al. (2008) com 285 crianças que apresentavam maior risco de desenvolver asma, o Rhinovírus foi o vírus mais comumente detectado não somente no período de doenças, mas também durante visitas assintomáticas (foram detectados em 35% dos casos). Além disso, novos subtipos de Rhinovírus têm sido recentemente identificados (LAMSON et al., 2006; MCERLEAN et al., 2008), evidenciando a diversidade desses vírus e a habilidade de escapar da resposta imune pré-existente. Portanto, as altas taxas de infecções respiratórias causadas por Rhinovírus enfatizam a atenção que deve ser dispensada e a necessidade de mais estudos específicos para essas novas espécies de HRV. 1.5 – Diagnóstico, Tratamento e Prevenção No diagnóstico dos vírus respiratórios pode-se adotar métodos diretos, como os que são capazes de recuperar o vírus mediante seu crescimento em cultivo celular e ainda aqueles que permitem detectar o vírus nas secreções respiratórias do paciente (de- 18 Introdução (tecção de antígenos e de ácidos nucléicos) (BELSHE et al., 1996). A detecção de antígenos e ácidos nucléicos permite a realização de um diagnóstico rápido, que ajuda a tomar decisões terapêuticas. Por outro lado, o crescimento em cultivo celular é um diagnóstico lento e tardio, porém de extraordinária importância na caracterização epidemiológica, antigênica e filogenética destes vírus. As técnicas de reação em cadeia da polimerase após transcrição reversa (RT- PCR) e o ensaio de imunofluorescência indireta (IFI) são considerados ferramentas importantes na detecção de vírus respiratórios, por apresentarem alta sensibilidade e especificidade e rapidez. Com relação ao tratamento das infecções respiratórias causadas por vírus respiratórios, para o RSV, tem sido utilizado o Palivizumab que é um anticorpo monoclonal humano dirigido contra um local específico da superfície do RSV. Esse medicamento possui atividade neutralizante eficaz por inibir a fusão do RSV a membrana celular. Entretanto, a administração do Palivizumab, devido às suas reações adversas, é restrita a casos excepcionais com crianças acima de dois anos de idade (BONFANTI & ROYMANS, 2009). A Ribavirina também tem sido utilizada como um tratamento antiviral específico em infecções por RSV (WALSH & GRAHAM, 1999). Porém, o tratamento com essa droga é questionado pela eficácia limitada e teratogenicidade da mesma. Além disso, o alto custo da Ribavirina compromete o uso pela população. Para o hMPV, a Ribavirina tem mostrado atividade antiviral in vitro similar ao RSV (WYDE et al., 2003). O vírus atenuado também tem sido testado eficazmente 19 Introdução como vacina em modelos animais, mas nenhuma vacina foi usada em humanos (TANG et al., 2003). Outro vírus, o Rhinovírus, tem mais de 100 sorotipos, e o desenvolvimento de uma vacina não é considerado possível no momento. Um grande número de agentes experimentais foi testado para suas atividades anti-picornavírus, com resultados pouco animadores, porém alguns têm sido submetidos à fase inicial de testes clínicos (SMITH et al., 1986; DE PALMA et al., 2008). O Pleconaril é um desses agentes mais estudados. Ele se liga à parte hidrofóbica do capsídeo viral VP1 inibindo, assim, a ligação, a entrada e o desnudamento do vírus (SMITH et al., 1986). In vitro, a maioria dos HRV é inibida pelo Pleconaril, mas pelo menos sete sorotipos são resistentes a ele (LEDFORD et al., 2004). Somente o vírus Influenza é passível de tratamento preventivo, através de vacina que é considerada eficaz. Mas, apesar de existir uma vacina de prevenção contra esse vírus e muitas infecções causadas por ele poderem ser prevenidas com um programa de vacinação efetivo, uma pequena variação no antígeno pode fazer com que a vacina atual não seja mais eficaz, sendo assim necessária uma constante vigilância epidemiológica (COELHO et al., 2007). Portanto, não há terapêutica eficaz para os vírus respiratórios, mas algumas medidas como o encaminhamento de casos graves para seu tratamento adequado e oportuno, a prevenção desses casos graves, profilaxia, aumento do acesso e utilização do serviço de saúde pela população e atenção oportuna e adequada a todas as crianças menores de cinco anos podem ser fundamentais na busca do tratamento eficaz. 20 Introdução Atualmente, a única forma de prevenir infecções respiratórias virais é compreender a sua transmissão (PELTOLA et al., 2008; CROWCROFT et al., 2007), e tentar evitar a transmissão por meio de medidas de higiene. Isto tem sido demonstrado ser possível, em creches da Finlândia (UHARI et al., 1999). Com base em todos os relatos referenciados acima, estudos que permitam aprimorar o conhecimento dos fatores clínicos e epidemiológicos das infecções respiratórias em crianças são essenciais e de grande relevância para a saúde pública. Apesar da importância econômica e do impacto médico dos vírus respiratórios, poucos dados são fornecidos e maiores investigações são necessárias. Determinar a diversidade viral, suas funções e suas características devem ser de interesse da população para que medidas de controle e prevenção sejam implantadas e obtenham sucesso. O presente estudo teve como meta avaliar os sintomas clínicos em crianças de creche e determinar a prevalência dessas infecções comparando com os diferentes tipos virais. 21 OBJETIVOS 22 Objetivos 2. OBJETIVOS O objetivo geral deste trabalho foi detectar o genoma de vírus respiratórios em crianças de 0 à 6 anos de idade que freqüentavam a creche “Maria Inês Arnal”, em São José do Rio Preto e que apresentavam sintomas de infecção respiratória aguda. Os objetivos específicos deste trabalho consistiram em: 1. Detectar e caracterizar, por meio da técnica de RT-PCR, porção do genoma de vírus respiratórios em amostras coletadas de crianças de 0 a 6 anos com infecção nas vias aéreas superiores (IVAS), procedentes da Creche Municipal Maria Inês Arnal na cidade de São José do Rio Preto. 2. Classificar em Rhinovirus ou Enterovirus as possíveis amostras que forem positivas para Família Picornaviridae por meio de sequenciamento direto. 3. Associar os dados clínicos e epidemiológicos da doença como: coriza, tosse, chiado, obstrução nasal, chiado recorrente, febre, idade da criança e sexo, com os vírus respiratórios identificados. 4. Associar os agentes virais detectados com a sazonalidade. 23 MATERIAIS E MÉTODOS 24 Materiais e Métodos 3. MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 - Casuística O estudo foi realizado com amostras de aspirados nasofaríngeo obtidas de crianças de 0 a 6 anos com sintomas de infecções respiratórias agudas (espirros, coriza, febre, tosse e falta de ar) que freqüentavam a Creche Municipal “Maria Inês Arnal” em São José do Rio Preto no período de junho de 2004 a setembro de 2005. Todas as 279 amostras clínicas que foram analisadas no presente trabalho encontravam-se armazenadas em Trizol-LS a temperatura de -80°C disponíveis no Banco de Amostras existente no laboratório onde os experimentos foram realizados. 3.2 – Critérios de inclusão e exclusão Crianças que foram hospitalizadas devido à infecção respiratória foram excluídas do estudo, pois outro estudo do nosso grupo de pesquisa era responsável pelas amostras das crianças admitidas no hospital, enquanto que o presente estudo incluiu apenas amostras provenientes de crianças da creche com sintomas moderados de infecção respiratória. No momento da colheita das amostras, para assegurar que o material genético encontrado fosse característico desta infecção respiratória e não de infecções respiratórias anteriores, somente foi considerado um novo episódio de infecção respiratória após o intervalo de 7 dias ou mais entre o final e o reinício dos sintomas. 25 Materiais e Métodos 3.3 – Aprovação Institucional e Questionários O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa pelo Parecer nº 062/2001 no dia 11 de Junho de 2001 na cidade de São José do Rio Preto (Anexo I). Um termo de consentimento para colheita das amostras foi obtido de todos os responsáveis pelas crianças incluídas no estudo (Anexo II). Além deste, foram utilizados dois questionários na pesquisa: - um para coletar dados gerais de identificação da criança, idade e sexo; antecedentes pessoais e familiares; história da infecção respiratória como presença e caracterização de chiado e se ocorreram internações anteriores (Anexo III); - outro de dados clínicos atuais como dados da história atual; dados do exame físico atual; dados da medicação em uso; dados complementares como internação atual e uso de O2 (Anexo IV). 3.4 - Colheita e processamento das amostras de secreção de nasofaringe A colheita do material da secreção de nasofaringe foi realizada por um único enfermeiro. A secreção nasal foi fluidificada com 1 mL de Ringer-Lactato (Sanobiol – Brasil), e posteriormente colhida com swab e sonda de aspiração neonatal estéril. Os aspirados foram armazenados em frascos identificados com nome e número de protocolo da criança, contendo 3 mL de Ringer-Lactato (Sanobiol – Brasil). Depois de colhidos, os aspirados nasais foram acondicionados em caixa térmica com gelo e encaminhados ao laboratório para processamento. 26 Materiais e Métodos Os aspirados nasais recém colhidos foram diluídos em PBS pH 7,2 (Phosphate Buffered Saline – NaCl, Na2HPO4, NaH2PO4). Em seguida, estas amostras foram divididas em alíquotas de 250�L e tratadas com antibiótico (10mg/mL de penicilina/estreptomicina, Cultilab – Brasil) e antifúngico (50mg/mL de sulfato de gentamicina, Cultilab – Brasil). Após um período de incubação de 1h, foram adicionados 750�L de Trizol-LS (Life Technologies, Grand Island, NY, USA) e o material foi estocado em freezer –80ºC para posterior extração de RNA. 3.5 - Extração de RNA Às alíquotas de cada amostra contendo Trizol-LS foram adicionados 200�L de clorofórmio (Merck, Germany), homogeneizado em vórtex durante 15 segundos e incubado no gelo por 5 minutos. O material foi então centrifugado a 11.300g por 15 minutos a 4°C. A seguir, foi alicotado 400�L de isopropanol (Sigma - USA) gelado em tubos eppendorfs de 2mL e o sobrenadante da amostra centrifugada anteriormente foi transferido para este novo tubo contendo o isopropanol, o qual foi homogeneizado e incubado por 15 minutos em gelo e seguindo-se de uma centrifugação a 11.300g por 15 minutos a 4°C. O sobrenadante foi desprezado e foram adicionados 800�L de etanol 75% (Merck, Germany) ao pellet, que foi seguido de uma centrifugação a 5.010g, por 8 minutos a 4°C. O sobrenadante foi desprezado e o tubo contendo o pellet foi deixado invertido sobre papel toalha por alguns minutos para secagem. O pellet foi ressuspendido em 50�L de água MiliQ tratada com DEPC (Dietilpirocarbonato – Sigma - USA) contendo 80U de inibidor 27 Materiais e Métodos RNAse (RNAse OUT – Invitrogen – USA- 40U/�L) por amostra e transferido para novos tubos eppendorfs de 0.2mL. 3.6 - Transcrição Reversa (RT-PCR) A transcrição reversa foi realizada com o High Capacity cDNA Archive Kit – Applied Biosystems (USA), conforme instruções do fabricante. O cDNA foi transcrito a partir dos 50�L de RNA obtido na extração, no qual foi adicionado 10�L de 10X RT Random Primers; 10�L de 10X RT Buffer, 4�L de 25X dNTP mixture (100mM), 5�L de Multiscribe (Transcriptase Reversa – 50U/�L) e 21,0�L de água MiliQ tratada com DEPC (Dietilpirocarbonato – Sigma - USA), com uma reação de volume final de 100�L. A mistura foi submetida ao GeneAmp® PCR System 9700 Termocycler (Applied Biosystems) a 25ºC por 10 minutos para ação da Transcriptase Reversa, 37ºC por 120 minutos, mantido a 4ºC por 10 minutos e estocado em freezer –20ºC. 3.7 - Amplificação Para amplificação das amostras e detecção de oito tipos diferentes de vírus respiratórios (Metapneumovírus Humano (hMPV), Vírus Sincicial Respiratório (RSV), Influenza Vírus A e B (FLUA e FLUB), Parainfluenza Vírus Humano 1, 2 e 3 (PIV-1, PIV- 2 e PIV-3) e Picornavírus (Pic)), foi utilizado o método de PCR. Foram utilizados primers específicos (Quadro I) para a detecção de cada vírus. Os primers utilizados nas reações de 28 Materiais e Métodos PCR para a detecção do RSV foram primers complementares a uma região conservada do gene da proteína F, e para o hMPV os primers utilizados amplificaram uma região do gene F, que também codifica a proteína de fusão. Já para a detecção dos vírus FLUA e FLUB foi amplificada uma região do segmento 8, que codifica as proteínas não-estruturais NS1 e NS2. Na amplificação de fragmentos dos PIV-1, 2 e 3, os primers amplificaram uma região do gene HN, que codifica a glicoproteína hemaglutinnina-neuraminidase. O primer específico do Picornavírus amplifica a região 5’ UTR. Cada reação do PCR consistia em 2,5�L de tampão 10X (75mM Tris-HCl (pH 9.0), 50mM KCl, 20mM (NH4)2SO4) contendo 0.2mM MgCl2), 0,5�L de dNTP (10mM), 1,25�L de cada um dos 8 primers (sense e anti-sense – 10 pmol/�l), 0,5�l (2 unidades) de Taq polimerase (Biotools, Espanha) e 16,0�L de água MiliQ. Uma alíquota de 3�L de cDNA foi adicionada, resultando em um volume final da reação de 25,0�L. As reações foram submetidas ao GeneAmp® PCR System 9700 Termocycler (Applied Biosystems) à 95ºC por 3 minutos, seguida de 35 ciclos de 94ºC por 45 segundos, 54ºC por 45 segundos, 72ºC por 45 segundos e um passo de extensão de 72ºC por 7 minutos. Após término, foram mantidas a 4ºC e depois estocadas em freezer -20ºC. Os produtos amplificados foram analisados através de eletroforese em gel de agarose 1,0% (GIBCO-BRL, NY, USA) contendo 0,5�g/�L de Brometo de etídio em tampão Tris-Borato-EDTA 1x (90mM de Tris, 90mM de ácido Bórico e 2mM de EDTA pH 8,0) e visualizados em trans-iluminador com luz ultravioleta (UV). 29 Materiais e Métodos Em todas as reações foram utilizados controles positivos, proveniente de amostra de RSV purificado em cultura celular Hep-2, para o qual foram utilizados primers específicos, que amplificaram uma região do gene F (Quadro I). Um controle negativo também foi utili- zado, o qual consistiu dos mesmos reagentes usados na reação de PCR e ausência de material genético. Quadro I – Seqüência de primers que foram utilizadas para investigar a presença de vírus respiratório na creche. (*) pb= Tamanho esperado do produto de PCR em pares de base. 3.8 – Tipagem dos Picornavírus para detecção de Rhinovírus ou Enterovírus por meio de Sequenciamento direto A detecção de Rhinovírus Humano (HRV) e/ou Enterovírus Humano (HEV) iniciou-se com uma reação de PCR que consistiu em 5�L tampão 10X (75mM Tris-HCl (pH 9.0), 50mM KCl, 20mM (NH4)2SO4), 4,8�L de MgCl2 25mM, 2,4�L de dNTP 10mM, 2�L dos primers OL26 e OL27 a 20 pmol (Tabela 1), 1,5�L de High Fidelity PCR Enzyme Vírus Primer Seqüência pb (*) Ref. RSV F1 sense (+) 5’- AAC AGT TTA ACA TTA CCA AGT GA -3’ 357 Mazzulli et al., 1999 R1 anti-sense (-) 5’- TCA TTG ACT TGA GAT ATT GAT CG -3’ HMPV F1 sense (+) 5’- GAG CCA ATT GAA AAT CCC AGA CA -’ 343 Falsey et al., 2003 R1 anti-sense (-) 5’- GAA AAC TGC CGC ACA ACA TTT AG-3 FLUA F1 sense (+) 5’- CTA AGG GCT TTC ACC GAA GA –3’ 191 Claas et al., 1992 R1 anti-sense (-) 5’- CCC ATT CTC ATT ACT GCT TC-3’, FLUB F1 sense (+) 5’- ATG GCC ATC GGA TCC TCA AC -3’ 240 Claas et al., 1992 R1 anti-sense (-) 5’- TGT CAG CTA TTA TGG AGC TC-3’ PIV-1 F1 sense (+) 5’-CCG GTA ATT TCT CAT ACC TAT G -3’ 317 Echevarria et al., 1998 R1 anti-sense (-) 5’- CCT TGC AGC GGA GTT GTT AAG -3’ PIV -2 F1 sense (+) 5’- CCA TTT ACC TAA GTG ATG GAA T -3’ 204 Echevarria et al., 1998 R1 anti-sense (-) 5’- GCC CTG TTG TAT TTG GAA GAG A -3’ PIV -3 F1 sense (+) 5’- ACT CCC AAA GTT GAT GAA AGA T-3’ 102 Echevarria et al., 1998 R1 anti-sense (-) 5’- TAA ATC TTG TTG TTG AGA TTG A -3’ PIC F3 sense (+) 5’- GGC CCC TGA ATG YGG CTA A -3’ 114 Arruda et al., 1993 R3 anti-sense (-) 5’- GAA ACA CGG ACA CCC AAA GTA -3’ 30 Materiais e Métodos Mix (Fermentas Life Sciences), água mili-Q q.s.p e 8�L de cDNA para um volume final de 40�L. Amostras de Rhinovírus positivas foram utilizadas como controles positivos e os controles negativos foram compostos de todos os reagentes da reação de PCR exceto material genético. A ciclagem utilizada nesta reação foi de 95°C por 3 minutos, seguidos de 35 ciclos de 95°C por 1’ 30”, 48°C por 1’ 30”, 72°C por 1 minuto, uma extensão a 72°C por 10 minutos. Após término, foram mantidas a 4ºC. Os produtos amplificados foram analisados através de eletroforese em gel de agarose 1,0% (GIBCO-BRL) contendo 0,5�g/�L de Brometo de etídio em tampão Tris- Borato-EDTA 1x (90mM de Tris, 90mM de ácido Bórico e 2mM de EDTA pH 8,0) e visualizados em trans-iluminador com luz ultravioleta (UV). Tabela 1 – Primers utilizados nas reações de PCR para a detecção de HRV e/ou HEV Primers Região Gênica Sequência Referência Primer OL26 Poliproteína inicial 5’- GCA CTT CTG TTT CCC C –3’ Arruda et al., 1993 Primer OL27 Poliproteína inicial 5’- CGG ACA CCC AAA GTA –3’ Arruda et al., 1993 3.8.1 – Purificação dos amplicons Os produtos de PCR foram purificados em coluna com o QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Hilden, Germany) conforme instruções do fabricante. 31 Materiais e Métodos Um gel de agarose 1,0% (GIBCO-BRL) contendo 0,5�g/�L de Brometo de etídio em tampão Tris-Borato-EDTA 1x (90mM de Tris, 90mM de ácido Bórico, 2mM de EDTA pH 8,0) foi feito para confirmar se não houve perda da amostra durante a purificação. 3.8.2 – Reação de Marcação Fluorescente com BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit. Na reação de marcação fluorescente foram utilizados 2,0�L de 5X Sequencing Buffer (Save Money), 2,0�L de Big Dye, 0,4�l de cada primer (OL26 e OL27 – 20 pmol) e completou-se com 5,6�L do produto de PCR purificado, para um volume final de 10,0�L. A ciclagem foi realizada em GeneAmp® PCR System 9700 Termocycler (Applied Biosystems) e as condições de termociclagem foram de 96°C por 1 minuto, seguido de 25 ciclos de 96°C por 15 segundos, 50°C por 15 segundos, 60°C por 4 minutos e mantidos a 4°C após término. 3.8.3 – Precipitação Para a precipitação foi adicionado 60�L de isopropanol 100% (Merck – Germany) e 30�L de água ultrapura em cada amostra (10�L), homogeneizando em vortex brevemente e deixou-se 15 minutos a temperatura ambiente ao abrigo da luz. Em seguida, a placa foi centrifugada a 1.300g a 20°C por 30 minutos (Centrifuge 5804R – Eppendorf). O sobrenadante foi descartado e deixou-se secando com a placa invertida ao abrigo da luz á temperatura ambiente por 10 minutos. Após esse tempo, a placa foi centrifugada invertida a 19.6g a temperatura de 20°C por 1 minuto e em seguida, adicionou-se 150�L de 32 Materiais e Métodos etanol 75% (Merck – Germany). A placa foi então centrifugada por 30 minutos a 1.300g a temperatura de 20°C. O sobrenadante foi novamente descartado e a placa foi invertida em papel absorvente a temperatura ambiente por 10 minutos e em seguida foi centrifugada invertida a 19.6g a temperatura de 20°C por 1 minuto. Após terminar a centrifugação, a placa foi armazenada a -20°C ao abrigo da luz. 3.8.4 – Sequenciamento Após a precipitação, foram adicionados em cada amostra 10�L de Formamida Hi- Di (Applied Biosystems- USA) seguido de uma precipitação de 1 minuto em velocidade máxima à temperatura ambiente. Em seguida, as amostras foram desnaturadas por 5 minutos a 95ºC e posteriormente mantidas em gelo por 2 minutos e prontas então para serem seqüenciadas. As amostras foram seqüenciadas em um seqüenciador 3130xl Genetic Analyser (Applied Biosystems). 3.9 – Tipagem Todos os resultados moleculares foram analisados juntamente com informações obtidas de um questionário que os responsáveis pelas crianças responderam (anexo IV). Todas as seqüências das amostras de Rhinovírus e ou Enterovírus foram analisadas quanto à homologia com a sequência correspondente à região 5’ não traduzida do genoma dos respectivos vírus através do programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) NCBI (National Center of Biotechnology Information – www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). 33 Materiais e Métodos A qualidade das seqüências foi verificada pelo software Eletropherogram Quality Analysis disponível on-line em http://www.biomol.unb.br/phph. A figura 8 ilustra em eletroferograma gerado com o sequenciamento de um fragmento do genoma de um Rhinovírus. Figura 8: Eletroferograma do seqüenciamento de uma amostra positiva de Rhinovírus. 3.10 - Análise estatística A análise estatística foi realizada usando o Software Minitab Statistical do Windows, versão 12.22, e as diferenças foram consideradas significantes p<0.05. Foi utilizado o Teste de Fischer. 34 Materiais e Métodos Uma análise dependente entre a presença de doença e o patógeno também foi considerada e analisada. Estas análises foram realizadas pelo professor Dr. José Antônio Cordeiro da Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto. 35 RESULTADOS 36 Resultados 4. RESULTADOS 4.1 – Características da população de estudo A creche municipal “Maria Inês Arnal” comporta, em média, 180 crianças, mas a população de estudo foi apenas de crianças que apresentavam algum dos sintomas característicos de uma infecção respiratória. Assim, a população de estudo foi composta por 120 crianças e um total de 279 amostras, já que a maioria das crianças teve mais de uma coleta (Tabela 2). Destas crianças, 73 eram do sexo masculino e 47 do sexo feminino, e apresentavam idade mínima de 3 meses e máxima de 69 meses. Tabela 2 – Relação do número de crianças que apresentavam sintomas de infecções respiratórias que freqüentavam a Creche Municipal “Maria Inês Arnal” em São José do Rio Preto, e idade apresentada na data da primeira coleta das amostras. Idade das crianças (Meses) Número de crianças com sintoma de infecção respiratória 1 – 12 11 13 – 24 34 25 – 36 21 37 – 48 28 49 – 60 19 > 60 7 Total 120 Todas as amostras coletadas foram analisadas pelo uso da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). Os produtos amplificados foram visualizados em gel de agarose. A figura 9 ilustra um exemplo de gel que amplificou fragmentos correspondentes ao Picornavírus. Os produtos amplificados pelos primers específicos utilizados na PCR pa- 37 Resultados ra detecção dos oito vírus respiratórios foram de 343pb para o hMPV, 191pb para o FLUA, 240pb para o FLUB, 317pb para PIV-1, 204pb para o PIV-2, 102pb para o PIV-3 e 114pb para o PIC. Na detecção do RSV, o produto amplificado nas reações de PCR foram de 650 pb. Figura 9: Resultados da PCR em gel de agarose. (PM): Marcador de peso molecular 100 pares de base; (C+): Controle positivo da reação; (Pic): Picornavirus 38 Resultados Das 279 amostras, 27,2% (76/279) foram positivas para pelo menos um dos vírus respiratórios analisados. Dentre essas amostras positivas, encontrou-se 84,2% (64/76) de Picornavírus, sendo 76,3% (58/76) de Rhinovírus e 7,9% de Enterovírus (6/76), 7,9% (6/76) de RSV, 1,3% (1/76) de hMPV, 2,6% (2/76) de FLUA, 2,6% (2/76) de PIV-1 e 1,3% (1/76) de PIV-2, conforme ilustrado na figura 10. Os vírus FLUB e PIV-3 não foram detectados em nenhuma das nossas amostras. Figura 10 – Prevalência dos vírus respiratórios de amostras de aspirados da nasofaringe colhidas de crianças que freqüentavam a Creche Municipal “Maria Inês Arnal” em São José do Rio Preto no período entre Junho de 2004 a Setembro de 2005 39 Resultados Nem todos os indivíduos que apresentavam sintomas de infecção respiratória foram positivos para algum vírus, sendo que apenas 48,3% (58/120) foram realmente acometidas por alguma infecção respiratória viral. Os meninos foram infectados em 74,1% (43/58) dos casos e as meninas em 41,3% (24/58). Esses dados não apresentaram resultados estatisticamente significantes. Tiveram casos em que a mesma criança foi acometida mais de uma vez por um vírus em diferentes coletas. O vírus mais prevalente para ambos os sexos foi o Rhinovírus, sendo o RSV mais prevalente em crianças do sexo feminino e Enterovírus em crianças do sexo masculino, porém, não houve uma associação significativa entre a presença do vírus e sexo. Esses resultados estão evidenciados na tabela 3. Tabela 3: Distribuição das infecções respiratórias virais em crianças de creche no período de junho de 2004 a setembro de 2005 de acordo com o sexo das crianças. RSV: Vírus Sincicial Respiratório; hMPV: Metapneumovirus Humano; FLUA: Influenzavirus do tipo A; PIV1 e PIV2: Parainfluenzavirus do tipo 1 e 2; HRV: Rhinovírus; HEV: Enterovírus. Quanto à distribuição etária das crianças que apresentavam infecção respiratória, podemos observar (figura 11) que crianças que tinham entre 1 e 3 anos de idade foram Tipo Viral Masculino Feminino RSV 1 5 hMPV 0 1 FLUA 1 1 PIV-1 2 0 PIV-2 1 0 HRV 33 17 HEV 5 0 Total 43 24 40 Resultados mais acometidas por vírus respiratórios. Porém, para esta faixa etária não houve uma associação significativa com a presença viral. Figura 11 – Relação da positividade total das amostras com a faixa etária das crianças infectadas com vírus respiratórios. Foi analisada também a distribuição etária das crianças da creche de acordo com cada um dos oito tipos virais. A figura 12 ilustra esta distribuição. 41 Figura 12 - Relação de cada vírus respiratório com a distribuição etária das crianças. Idade em meses. RSV: Vírus Sincicial Respiratório; hMPV: Metapneumovirus Humano; FLUA: Influenzavirus Tipo A; PIV-1 e PIV-2: Parainfluenzavirus Tipo 1 e Tipo 2; HRV: Rhinovírus Humano; HEV: Enterovírus Humano. Como pode ser visto na figura 12, dentre as crianças que apresentaram infecção respiratória por Rhinovírus, pode-se observar que as mais acometidas tinham entre 1-4 anos e esses casos positivos foram diminuindo de acordo com o aumento da idade da criança. A média de idade das crianças positivas para Rhinovírus no primeiro episódio foi de 31 meses, porém não foi encontrada nenhuma evidência de associação estatisticamente significativa de idade com infecção (p=0,379). Quando foi analisado o consumo de tabaco pelos responsáveis das crianças verificou-se que aproximadamente 50% (38/76) das crianças infectadas por vírus conviviam com fumantes nos seus lares e que em 63% (48/76) dos casos as crianças fizeram inalação em postos de saúde. No histórico médico das crianças observou-se ainda que 22,3% (17/76) já tiveram internação em enfermarias. 42 Resultados A análise da situação sócio-econômica das famílias mostrou que a renda familiar da maioria das crianças, em 88% (67/76), variou de 1 a 3 salários mínimos, 7,9% (6/76) com renda menor que 1 salário mínimo e 4% (3/76) apresentavam renda que variava de 3 a 10 salários mínimos, como mostra a figura 13. Várias crianças do nosso estudo, 41,3% (24/58), conviviam com mais de 5 pessoas em casa, além de 17,2% (10/58) ter mais de 3 irmãos. Figura 13 – Gráfico ilustrando a renda familiar das crianças com infecções respiratórias que freqüentavam a creche municipal “Maria Inês Arnal” em São José do Rio Preto. 4.2 – Sintomas diagnosticados Os resultados das análises quanto à relação dos sintomas com a presença de vírus, mostra a ausência de sintomas graves, e geralmente a não necessidade de internação durante o período da infecção respiratória. 43 Resultados Os sintomas mais freqüentes na população de estudo foram a coriza, que foi diagnosticada em 89,5% (68/76) das amostras positivas, seguida pela tosse em 67,1% (51/76), chiado em 5,2% (4/76), obstrução nasal também em 4% (3/76) e febre em 2,6% (2/76). Alguns sintomas como falta de ar e sibilo, considerados comuns em infecções respiratórias agudas, não foram observados na nossa população de estudo (Tabela 4). Tabela 4 – Distribuição dos vírus respiratórios detectados e os sintomas apresentados pelas crianças que freqüentavam a Creche Municipal “Maria Inês Arnal”. RSV: Vírus Sincicial Respiratório; hMPV: Metapneumovirus Humano; FLUA: Influenzavirus do tipo A; PIV-1 e PIV-2: Parainfluenzavirus do tipo 1 e 2; HRV: Rhinovírus; HEV: Enterovírus. Os sintomas mais prevalentes em cada episódio de infecção também foram analisados para ver se a cada re-infecção ocorreria uma queda desses sintomas. Os sintomas prevalentes foram: tosse, que foi reportado acima de 30% em todos os episódios, coriza encontrada em mais de 80% das crianças em cada episódio e chiado recorrente que Vírus Sintomas Amostras Positivas RSV hMPV FLUA PIV-1 PIV-2 HRV HEV Coriza 68 (89,5%) 5 (6,5%) 1 (1,3%) 2 (2,6%) 2 (2,6%) 1 (1,3%) 52 (68,4%) 5 (6,5%) Tosse 51 (67,1%) 4 (5,2%) 0 2 (2,6%) 2 (2,6%) 1 (1,3%) 37 (48,6%) 5 (6,5%) Chiado 4 (5,2%) 0 0 0 2 (2,6%) 1 (1,3%) 2 (2,6%) 0 Obstrução Nasal 3 (4%) 0 0 0 1 (1,3%) 1 (1,3%) 2 (2,6%) 0 Febre 2 (2,6%) 1 (1,3%) 0 0 0 0 0 1(1,3%) 44 Resultados também foi encontrado acima de 50% das crianças em todas as re-infecções. Podemos ob- servar que a cada episódio o número de crianças acometidas vai diminuindo e que a duração média desses sintomas também. Porém, a partir do quinto episódio a duração dos sintomas volta a aumentar, apesar de uma diminuição brusca no número de indivíduos acometidos a partir deste episódio. Porém, esses dados não apresentaram associação quando foi realizada a análise estatística. Esses resultados podem ser analisados na tabela 5. Tabela 5: Distribuição de cada episódio com os sintomas reportados nas crianças que freqüentavam a creche municipal “Maria Inês Arnal” em São José do Rio Preto. Episódios Sintomas Episódio 1 (n=120) Episódio 2 (n=81) Episódio 3 (n=46) Episódio 4 (n=21) Episódio 5 (n=8) Episódio 6 (n=3) Tosse 88 (73,3%) 52 (64,2%) 20 (43,5%) 7 (33,3%) 5 (62,5%) 1 (33,3%) Coriza 110 (91,6%) 73 (90,1%) 46 (100%) 19 (90,5%) 7 (87,5%) 3 (100%) Chiado 4 (3,3%) 3 (3,70%) 1 (2,17%) 0 0 0 Febre 1 (0,83%) 1 (1,23%) 1 (2,17%) 0 0 0 Chiado recorrente 68 (56,6%) 43 (53,1%) 24 (52,2%) 16 (76,2%) 5 (62,5%) 3 (100%) Duração sintomas (média/dias) 25,11 23,33 20,27 15,58 23,41 26,28 Os Rhinovírus foram os vírus mais prevalentes na população de estudo. O número de crianças que sofrem infecções repetidas vai diminuindo a cada novo episódio como pode ser visto no quadro II. Os sintomas prevalentes foram tosse, coriza e chiado recorren- 45 Resultados te. A febre não foi reportada em nenhum caso de infecção por Rhinovírus, evidenciando que este sintoma não é uma característica desse agente viral. Também pode-se notar a duração dos sintomas que teve mínimo de 5 dias e máximo de 74 dias. Quadro II: Distribuição de cada episódio com os sintomas reportados nas crianças positivas para Rhinovírus que freqüentavam a creche municipal “Maria Inês Arnal” em São José do Rio Preto. Além dos sintomas mais freqüentes, alguns diagnósticos clínicos também foram observados neste estudo. Das amostras positivas para algum patógeno viral, 97,3% (74/76) delas tiveram resfriado diagnosticado e 69,7% (53/76) apresentaram resfriado recorrente. Durante nosso estudo, foram observados também vários casos de recidiva de infecção, 29% (22/76) das amostras tiveram casos de infecções repetidas, por HRV, HEV, FLUA, PIV-2 ou RSV, ou seja, um novo episódio de infecção respiratória, respeitando o Rhinovírus Sintomas Prevalentes Episódio 1 (n=29) Episódio 2 (n=14) Episódio 3 (n=10) Episódio 4 (n=3) Episódio 5 (n=2) Tosse Coriza Chiado Febre Chiado Recorrente Duração sintomas (dias) (mínimo/máximo) 20 (69%) 26 (89,6%) 2 (7%) 0 19 (65,5%) 5-74 10 (71,4%) 11 (78,5%) 0 0 4 (28,5%) 10-66 5 (50%) 10 (100%) 1 (10%) 0 6 (60%) 9-43 1 (33,3%) 3 (100%) 0 0 1 (33,3%) 7-18 1 (50%) 2 (100%) 0 0 1 (50%) 12-41 46 Resultados intervalo de 7 dias ou mais entre o final e o reinício dos sintomas, sendo essas crianças acometidas pelo mesmo patógeno ou não. A maioria das re-infecções, 82% (18/22), foram de Rhinovírus. A figura 14 evidencia esses dados. Figura 14 – Número total de infecções repetidas e infecções repetidas por Rhinovírus das crianças que freqüentavam a creche municipal “Maria Inês Arnal” em São José do Rio Preto. 4.3 – Sazonalidade dos vírus respiratórios estudados Com relação à distribuição sazonal das infecções respiratórias virais nas crianças da creche, notou-se que em 2004 as infecções compreenderam o período de junho a novembro, com pico em agosto e novembro. Em junho, Rhinovírus e Enterovírus foram detectados. Em julho, HRV e RSV foram observados e em agosto um pico de HRV foi observado, seguido de HEV e PIV-2. No mês de setembro, apenas PIV-1 foi detectado e em outubro novamente HRV e HEV. Em novembro, ocorreu novamente outro pico de HRV e em dezembro apenas RSV foi detectado (figura 15). 47 Resultados Em 2005, as infecções ocorreram entre os meses de fevereiro e setembro, com pico de HRV em maio (figura 15). Em fevereiro apenas HRV foi encontrado e em março apenas RSV. Em abril, FLUA e HRV; em maio um pico de HRV foi observado e alguns casos de HEV, além de RSV e hMPV. Do mês de junho até setembro foram detectados apenas casos de HRV. Figura 15: Distribuição sazonal de infecções respiratórias virais em crianças de creche no período de junho de 2004 a setembro de 2005. RSV: Vírus Sincicial Respiratório; hMPV: Metapneumovirus Humano; FLUA: Influenzavirus do tipo A; PIV-1 e PIV-2: Parainfluenzavirus do tipo 1 e 2; HRV: Rhinovírus Humano; HEV: Enterovírus Humano. Como o Rhinovírus foi o agente viral predominante em nossa população de estudo, observamos a distribuição sazonal deste vírus durante os meses dos anos de 2004 e 2005 podemos notar que em 2004 ocorreu pico de infecção em agosto, outubro e novembro. Nenhum caso positivo foi encontrado nos meses de setembro e dezembro. Já em 2005, pico 48 Resultados de infecção foi em maio, com redução gradativa dos casos positivos nos meses seguintes, como mostra a figura 16. Figura 16– Distribuição mensal das amostras positivas de Rhinovírus durante os meses de Junho de 2004 a Setembro de 2005 . A sazonalidade do Rhinovírus também foi analisada de acordo com as estações do ano e pode-se notar que em 2004 infecções respiratórias de HRV ocorreram na primavera e no inverno e no ano de 2005 no outono e no inverno. A detecção de Rhinovirus diminui drasticamente apenas no verão (figura 17). Esses dados foram analisados estatisticamente pelo teste exato de Fisher (p=0,81), porém não houve evidência de efeito da sazonalidade. 49 Resultados Figura 17 – Distribuição sazonal das amostras positivas de Rhinovírus das crianças que frequentavam a creche municipal “Maria Inês Arnal” em São José do Rio Preto no período de Junho de 2004 a Setembro de 2005. 50 DISCUSSÃO 51 Discussão 5. DISCUSSÃO No presente estudo, um total de 279 amostras foi coletado de crianças que freqüentavam uma creche em São José do Rio Preto. Dessas amostras, 27,2% apresentou etiologia de origem viral, o que está de acordo com resultados encontrados na literatura. Se compararmos com populações de um estudo realizado com crianças admitidas na Santa Casa de São Paulo, foram detectados agentes virais em 30.2% das amostras (Pecchini et al., 2008). Ordás et al (2006), pesquisou na Espanha crianças atendidas em um hospital pediátrico e que apresentavam sintomas de infecções do trato respiratório inferior e superior e nas amostras coletadas por ele 49,8% eram positivas para pelo menos um agente viral, dentre eles o RSV e Influenza A. Na Índia, Yeolekar et al (2008), encontrou em amostras de aspirado nasofaríngeo de crianças admitidas em um hospital pediátrico que apresentavam infecções do trato respiratório, 37,1% de positividade de vírus respiratório. Estes relatos confirmam a faixa de positividade da nossa população uma vez que se trata de populações hospitalizadas, e a nossa de população de creche, que não apresentou casos de internação. No nosso estudo, os Rhinovírus foram predominantemente os vírus mais encontrados nas amostras estudadas com 76,3% de detecção, seguido de outro vírus da família dos Picornaviridae, os Enterovírus com 7,9% de positividade. Alguns membros da família Picornaviridae como Rhinovírus e Enterovírus são os mais comuns agentes causadores de infecções respiratórias em países desenvolvidos (Ruohola et al., 2000). As infecções respiratórias das quais apenas Rhinovírus é detectado, 52 Discussão ou seja, sem estar associado com outro patógeno, são 13 vezes mais comuns que infecções causadas pelo Vírus Sincicial Respiratório (van der Zalm et al., 2009), mas poucos dados são disponibilizados sobre o papel desses picornavírus nas infecções do trato respiratório (Peltola & Ruuskanen, 2008). Em um estudo realizado em Salvador com crianças de creche, das 264 amostras disponíveis para teste por RT-PCR e hibridização, 86 (33%) foram positivas para um picornavírus; 67 (78%) foram Rhinovírus positivos, e 19 (22%) foram Enterovírus positivos (Souza et al., 2003). No estudo de Bueno Campaña et al (2008), o grupo dos Rhinovírus (41,1%) também resultou ser a principal causa de infecções respiratórias em crianças menores de 6 meses de idade em ambiente extra hospitalar. Em outro estudo realizado em Uberlândia, com crianças atendidas no hospital das clínicas com doença respiratória aguda, os Rhinovírus foram encontrados em 26,9% das 379 amostras estudadas e responsável também por 25% dos casos de bronquiolite (Costa, 2006). Apesar da alta positividade que os Rhinovírus apresentam, existem poucos dados no Brasil sobre as características e função desse tipo viral nas infecções respiratórias, dificultando assim o seu diagnóstico e evidenciando a necessidade de outros estudos para obtenção de novas informações. Os nossos resultados para Enterovírus estão de acordo com estudos prévios, por exemplo, de Parody et al (2007) que detectou 5% de positividade para esse vírus em amostras de 130 pacientes que apresentavam sintomas de infecções respiratórias. 53 Discussão Além destes, foram detectados em nossas amostras 7,9% de RSV. Essa porcentagem é bastante baixa quando comparada com estudos prévios que encontraram acima de 30% de positividade para RSV (Pecchini et al., 2008; Fabbiani et al., 2009). Porém, em estudo realizado em Salvador com crianças de creche, o vírus RSV também foi detectado, por meio da técnica de imunofluorescência, em apenas 5 amostras de um total de 271 amostras (Souza et al., 2003). Em Fortaleza, outro estudo também encontrou poucos casos de RSV positivos (Arruda et al., 1991). A nossa sugestão é que esta baixa freqüência seja devido à característica da população, que tem um convívio e um contato diário com tipos virais que possivelmente o sistema imunológico já teve experiência prévia. A positividade encontrada no nosso estudo para hMPV foi de 1,3%. No Brasil, um outro estudo realizado em Uberlândia encontrou 2,8% de positividade de hMPV. No estudo de Reina et al (2008) a porcentagem encontrada também foi baixa, de 1,7% de positividade para hMPV. Porém, estudos anteriores de Garcia et al (2004) e Vicente et al (2003) detectaram 9% e 4,1% de positividade para hMPV, respectivamente. O Influenza A foi encontrado em 2,6% das nossas amostras, porém, nenhuma amostra foi positiva para FLUB. A ausência de FLUB está de acordo com a literatura, onde Thomazelli et al (2007) também não encontrou positividade para esse vírus. Alguns resultados semelhantes podem ser observados em pesquisa realizada por indianos que detectaram 3.63% de FLUA, porém eles também encontraram 1,81% de amostras positivas para FLUB (Yeolekar, 2008). 54 Discussão Em um estudo realizado em Uberlândia, Brasil, Costa et al (2006) encontrou um maior número de infecções por Influenza. Os vírus FLUA e FLUB foram responsáveis por 9,5% das infecções respiratórias nesse trabalho. Ainda no Brasil, um estudo no Rio de Janeiro de Nascimento et al (1991), também mostrou uma baixa freqüência de Influenza A e B, ficando assim em terceiro lugar entre os vírus frequentemente isolados. O Vírus Parainfluenza foi detectado em apenas 3 amostras, sendo 2 casos (2,6%) de PIV-1 e 1 caso (1,3%) de PIV-2. Em um estudo na Itália (Fabbiani et al, 2009), das 237 amostras analisadas, nenhuma foi positiva para Parainfluenza, ao contrário de outro estudo realizado no Brasil, onde foi detectado 6,3% de positividade de PIV 1, 2 e 3. Na nossa pesquisa, nenhuma amostra positiva de PIV-3 foi detectada, porém na literatura, o tipo 3 é o mais freqüente entre os Parainfluenza e o tipo 1 e 2 não são detectados ou detectados em poucas amostras (Gröndahl et al, 1999). Em nosso estudo, quando analisamos a positividade viral para algum dos oito vírus em relação ao sexo, observa-se uma porcentagem maior de infecções em crianças do sexo masculino (74,1%) em comparação com crianças do sexo feminino (41,3%). Vários estudos já relataram esta susceptibilidade elevada das crianças do sexo masculino às infecções respiratórias, dentre eles um estudo realizado na Amazônia que também observou que crianças do sexo masculino foram mais freqüentemente internadas por doenças respiratórias que aquelas do sexo feminino (Rosa et al., 2008). Outro relato da literatura mostra que indivíduos do sexo masculino apresentam risco 1,5 vezes maior de internação por doenças respiratórias quando comparados aos do sexo feminino (Souza et al., 2009). Entre outros fa- 55 Discussão tores, diferenças anatômicas entre os meninos como, por exemplo, o menor calibre da via aérea pode ser a causa dessa preponderância do sexo masculino quanto às infecções respiratórias (Post et al., 1992; Iwane et al., 2004). De acordo Fiterman et al (2001) a idade representa um fator de risco na mortalidade por doenças respiratórias. As infecções respiratórias agudas são comuns em crianças e o risco dessas infecções diminui com o aumento da idade, o que está de acordo com nosso estudo que evidenciou que crianças menores de 3 anos foram mais acometidas por vírus respiratórios do que aquelas acima desta idade. Em um estudo realizado em Taiwan, das 523 crianças infectadas por algum vírus, 32.5% eram menores de 1 ano de idade, 37,7% tinham idade entre 1-3 anos e 17,2% entre 3-6 anos (Tsai et al., 2001). Crianças acometidas por HRV normalmente apresentam idade superior do que àquelas acometidas por outros vírus, como o RSV, por exemplo, que normalmente é detectado em crianças menores de um ano (Manoha et al., 2007; Fabbiani et al., 2009). Porém, no nosso estudo a maioria dos RSV positivos apresentava idade entre 25 – 36 meses. Esse resultado pode ser explicado pelo fato de que a maioria das crianças da nossa população de estudo apresentavam idade superior a 1 ano de idade. Com relação ao HRV, a média de idade que encontramos foi alta, de 31 meses, o que está de acordo com a literatura (Fabbiani et al., 2009). Entretanto, ainda pouco se sabe sobre epidemiologia de Rhinovírus. Quando observamos o fator fumo, quase metade das crianças convivia com fumantes. Em um estudo realizado para ver o impacto da convivência de fumantes com be- 56 Discussão bês, foi observado que crianças que conviviam com fumantes em casa aumentavam em 50% o risco de ter uma infecção respiratória do que as crianças que não conviviam com pessoas que fumavam e este risco ainda aumentava com o número de cigarros fumados por dia (Blizzard et al., 2003). Essa exposição ao tabagismo também tem sido associada com novos casos de asma na infância e aumento da gravidade dos sintomas em crianças asmáticas (Charlton, 1994; Jinot & Bayard, 1994). No nosso estudo observa-se que 88% das crianças tinham renda familiar que variava de 1 a 3 salários mínimos, além de 41,3% conviverem com mais de 5 pessoas em casa e 17,2% ter mais de 3 irmãos. Em estudo realizado por Macedo et al. (2007), 38,6% das crianças estudadas por ele apresentavam renda menor do que 1 salário mínimo e 37,4% tinham renda entre 1 e 3 salários. O nível sócio-econômico há tempos é apontado como sendo um fator agravante no desenvolvimento de infecções respiratórias (Victora et al., 1994). Geralmente, em famílias menos privilegiadas economicamente, a taxa de natalidade é quase sempre muito elevada e as condições de moradia não são adequadas (Victora, 1996). Há evidências de que o número de moradores e o número de crianças menores de cinco anos no domicílio aumentam as chances de desenvolvimento de doenças respiratórias (Victora et al., 1988). Os sintomas clínicos predominantes em nossa pesquisa foram coriza (89,5%) e tosse (67,1%). Esses resultados estão de acordo com estudos realizados por Thomazelli et al 57 Discussão (2007) onde um dos sintomas mais comuns encontrado foi tosse em 86% dos casos de infecção respiratória. Pecchini et al (2008) também encontrou como sintoma mais comum a tosse (92,3%) e a coriza (64,7%). Porém, nesse estudo e em outro realizado na Índia (Yeolekar et al., 2008), a febre também foi um sintoma comum encontrado em altas porcentagens, diferente dos nossos resultados. A nossa população de estudo apresentou apenas sintomas mais moderados, e isso pode ocorrer devido ao fato dessas crianças conviverem diariamente em creche e ter contato próximo com outras crianças, e estarem sendo expostas diariamente a cepas de diferentes tipos virais, dando à elas imunidade, sem apresentarem sintomas severos de infecção respiratória. Outros sintomas como chiados, obstrução nasal e febre foram menos freqüentes. O chiado recorrente foi encontrado com alta porcentagem em nossa pesquisa, acima de 60% dos casos. Lemanske et al (2005) afirma que é comum o Rhinovírus predominar no terceiro ano de vida levando a chiado recorrente. Alguns estudos afirmam que vários episódios de infecções respiratórias podem ser a causa de chiados recorrentes, já que essas infecções repetidas, devido ao processo inflamatório causado pelas mesmas, lesam a mucosa respiratória (Folkerts & Nijkamp, 1995; Fonseca et al; 2003). Nossos achados confirmaram a importância do vírus em associação com episódios de chiado em crianças, anteriormente relatado por muitos autores (Johnston, 1999; Douglas et al., 2000; Souza et al., 2003). 58 Discussão No Brasil, um estudo investigou infecções virais como fator de risco para chiado agudo em crianças com idade entre 0-12 anos e reportou que o HRV não estava associado com chiado agudo e exacerbações de asma. Os pesquisadores acreditam que esses resultados talvez estejam atribuídos a diferentes respostas imunológicas para HRV na população asmática brasileira comparada com outras populações estudadas. Eles sugerem ainda que os sorotipos de HRV que está circulando em países tropicais possam ser diferentes daqueles de clima temperados (Camara et al., 2004). O HRV tem mostrado ser o maior grupo de vírus causadores de infecções respiratórias leves, por exemplo, o resfriado comum (Brownlee & Turner, 2008). Apesar da importância econômica e médica do HRV, pouco é conhecido sobre a circulação e o relativo impacto de cada um dos sorotipos. A duração dos sintomas de infecções respiratórias em geral no nosso estudo foi longa, sendo a média mínima de 15,58 e máxima de 26,28 (média/dias). Quando observamos a duração dos sintomas para Rhinovírus, variou de 5 a 74 dias. Miller et al (2007), realizaram um estudo por um período de um ano com crianças hospitalizadas e observaram que em crianças com casos confirmados de infecção por Rhinovírus, a média de duração dos sintomas foram 3 dias (variando de 1-22 dias), e a mesma para os outros ví- rus estudados (variando de 1-71 dias). Em outro estudo, que teve duração de 3 anos e acompanhou crianças durante o seu primeiro ano de vida, a duração média dos sintomas durante uma infecção foi de 9.5 dias (van der Zalm et al., 2009). A pesquisa realizada por Hayden et al (2003) afirmou que a média de duração dos sintomas de HRV em sua pesqui- 59 Discussão sa foi de 7 dias, entretanto, em alguns pacientes, pode chegar a 2 semanas. O estudo de van der Zalm et al. (2009), mostrou que apesar do RSV ser considerado um vírus mais agressivo que o HRV, geralmente causando sintomas mais severos nas suas infecções, quando foi comparada a duração desses sintomas com a duração dos sintomas causados por Rhinovírus ficou evidente que a duração dos sintomas de RSV foi bem menor, sendo essa diferença estatisticamente significante (p<0.03). Durante o período de estudo, observamos vários casos de infecções repetidas (29%). Dessas amostras 82% foram re-infecções de Rhinovírus. Estes resultados estão de acordo com Jartti et al (2008) que diz que infecções recorrentes de Rhinovírus são comuns e que não são resultado de uma infecção crônica ou persistente, mas sim de re-infecções com diferentes sorotipos. Pelo fato de ser caracterizado mais de 100 sorotipos e a maioria deles estar circulando na comunidade, re-infecções são esperadas ocorrer por toda vida. Como pode ser observada, a recorrência de infecções respiratórias foi elevada, indicando a importância da realização de controles epidemiológicos em ambientes fechados como escolas e creches. Com relação às tendências sazonais da ocorrência de infecções respiratórias virais nas crianças da creche, notou-se que em 2004 as infecções compreenderam o período de junho a novembro, com picos em agosto e novembro de HRV. Em 2005, as infecções ocorreram entre os meses de fevereiro e setembro, com pico em maio de HRV. Nos meses do dezembro e fevereiro (Janeiro não foi coletado amostra), as infecções reduziram pelo fato de ser período de férias nas creches da cidade, ocorrendo assim um menor contato entre as 60 Discussão crianças e possivelmente uma redução da transmissão dos patógenos, o que pode ter influenciado na redução de vírus respiratórios nesses 2 meses. Vale ressaltar que a região de São José do Rio Preto, possui um clima subtropical, caracterizado por baixa umidade do ar com temperaturas moderadamente baixas e verões chuvosos. Além disso, é conhecido que a circulação de vírus respiratórios mostra padrões diferentes, de acordo com cada região (Costa et al., 2006). Em um estudo realizado na Amazônia, foi observado que as internações por doenças respiratórias apresentam redução nos meses de dezembro, janeiro e fevereiro, o que está de acordo com nossos resultados. Há aumento dos casos de internação por doenças respiratórias no mês de março e nos meses de seca extrema (julho, agosto e setembro) (Rosa et al., 2008). Existem evidências de que a prática da queima da cana no período da seca aumenta as concentrações de gases e partículas de aerossol na atmosfera. Estudo realizado em Cuiabá, capital do estado de Mato Grosso, mostrou maior proporção de internações por doenças respiratórias no período da seca, quando há maior número de queimadas naquela região (Souza et al., 2009). É importante ressaltar que a região de São José do Rio Preto é rica em plantações de cana-de-açúcar e a queima dessa cana pode ser um fator agravante para o aumento de infecções respiratórias nesse período de seca intensa na região. Observando a sazonalidade dos vírus respiratórios analisados em nosso estudo, fica claro que o Rhinovírus foi detectado durante todo o período de estudo, o que está de acordo com Van Der Zalm et al. (2009), que também encontrou infecções por HRV durante todo o ano. 61 Discussão Em Salvador, Souza et al. (2003) detectou Rhinovírus com maior freqüência durante os meses de outono, mas ocorreram em todo o período de estudo, indicando uma menor freqüência apenas em novembro e dezembro. Analisamos ainda a distribuição das infecções de Rhinovírus por estações do ano, e observamos a presença de HRV no outono, inverno e primavera. No verão, foi observado apenas um caso de infecção de Rhinovírus. Porém, nenhuma associação significativa foi estabelecida (p=0.81). Em um estudo indiano, o Rhinovírus também não apresentou associação com nenhuma estação em particular (p=0.867) (Matthew et al., 2009). 62 CONCLUSÕES 63 Conclusões 6 – CONCLUSÕES Nossos resultados indicam que: 1. Os vírus respiratórios que circulam na creche “Maria Inês Arnal” em São José do Rio Preto são: Vírus Sincicial Respiratório (7,9%), Influenza A (2,6%), Vírus Parainfluenza do tipo 1 (2,6%) e Vírus Parainfluenza do tipo 2 (1,3%), Metapneumovírus Humano (1,3%), Enterovírus Humano (7,9%) e Rhinovirus Humano (76,3%). 2. De todos os vírus detectados em nosso estudo, o Rhinovírus Humano foi o vírus respiratório predominante nas infecções respiratórias da população de creche (76,3%). 3. As infecções respiratórias foram mais freqüentes em crianças que apresentavam idade entre 1 e 3 anos, e esses casos foram diminuindo de acordo com o aumento da idade. Além disso, crianças do sexo masculino foram mais acometidas por vírus respiratórios do que crianças do sexo feminino. 4. Os sintomas apresentados pelas crianças foram moderados, sendo coriza e tosse os mais comuns manifestados por elas. 64 5. O Rhinovírus foi pouco detectado no verão, porém na primavera, outono e inverno esse vírus foi o mais encontrado nas amostras de crianças com infecção respiratória aguda freqüentadoras da creche “Maria Inês Arnal” em São José do Rio Preto, SP. 65 REFERÊNCIAS 66 Referências ALONSO, W. J. et al. Seasonality of influenza in Brazil: a traveling wave from the Amazon to the subtropics. American Journal of Epidemiology, Baltimore, v. 165, n. 12, p. 1434-1442, 2007. ARDEN, K. E. et al. Frequent detection of human rhinoviruses, paramyxoviruses, coronaviruses, and bocavirus during acute respiratory tract infections. Journal of Medical Virology, New York, v. 78, n. 9, p. 1232-1240, 2006. ARRUDA, E. et al. Acute respiratory viral infections in ambulatory children of urban northeast Brazil. Journal of Infectious Diseases, Chicago, v. 164, n. 2, p. 252-258, 1991. ______; HAYDEN, F. G. Detection of human rhinovirus RNA in nasal washings by PCR. Molecular and Cellular Probes, London, v. 7, n. 5, p. 373-379, 1993. BACHEGA, M. I.; ZULIANI, A. Estudo retrospectivo das infecções das vias aéreas superiores em crianças de 4 a 12 meses que freqüentaram o berçário e maternal “Leite & Amor”, USP, Bauru. Pediatria Moderna, São Paulo, v. 35, n. 12, p. 948-958, 1999. BELSHE, R. B.; MURPHY, B. R.; WESTER, R. G. Orthomyxoviruses. In: FIELDS, B. N.; KNIPPE, D. M.; HOWLEY, P. M. (Ed.). Virology. 3. ed. New York: Lippincott-Raven, 1996. p. 1397-1445. BLIZZARD, L. et al. Parental smoking and infant respiratory infection: how important is not smoking in the same room with the baby? American Journal of Public Health, Washington, v. 93, n. 3, p. 482-488, 2003. BOIVIN, G. et al. Virological features and clinical manifestations associated with human metapneumovirus: a new paramyxovirus responsible for acute respiratory-tract infections in all age groups. Journal of Infectious Diseases, Chicago, v. 186, n. 9, p. 1330-1440, 2002. BONFANTI, J. F.; ROYMANS, D. Prospects for the development of fusion inhibitors to treat human r