RESSALVA Atendendo solicitação do autor, o texto completo desta dissertação será disponibilizado somente a partir de 28/07/2023. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS – RIO CLARO unesp PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS (BIOLOGIA CELULAR, MOLECULAR E MICROBIOLOGIA) EXPRESSÃO GÊNICA DIFERENCIAL DOS TRANSCRIPTOMAS DE TÚBULOS DE MALPIGHI DE Melipona scutellaris EXPOSTOS AO TIAMETOXAM LUCAS MIOTELO Rio Claro – SP 2022 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS – RIO CLARO unesp PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS (BIOLOGIA CELULAR, MOLECULAR E MICROBIOLOGIA) EXPRESSÃO GÊNICA DIFERENCIAL DOS TRANSCRIPTOMAS DE TÚBULOS DE MALPIGHI DE Melipona scutellaris EXPOSTOS AO TIAMETOXAM LUCAS MIOTELO Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências do Câmpus de Rio Claro, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Biologia Celular, Molecular e Microbiologia. Orientador: Prof. Dr. Osmar Malaspina Co-orientadora: Dra. Milene Ferro Rio Claro – SP 2022 M669e Miotelo, Lucas Expressão gênica diferencial dos transcriptomas de túbulos de Malpighi de Melipona scutellaris expostos ao tiametoxam / Lucas Miotelo. -- Rio Claro, 2022 82 p. : il., tabs., fotos Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista (Unesp), Instituto de Biociências, Rio Claro Orientador: Osmar Malaspina Coorientadora: Milene Ferro 1. Abelha sem ferrão. 2. Destoxificação. 3. Neonicotinóides. 4. Montagem de novo. 5. Sequenciamento. I. Título. Sistema de geração automática de fichas catalográficas da Unesp. Biblioteca do Instituto de Biociências, Rio Claro. Dados fornecidos pelo autor(a). Essa ficha não pode ser modificada. Agradecimentos À FAPESP (Fundação de Amparo à pesquisa do Estado de São Paulo), pela bolsa de mestrado concedida (Processo: nº 2020/03527-3) e pelo apoio financeiro ao projeto de pesquisa (Processos: nº. 2017/21097-3), que possibilitou a realização desse estudo. Ao Centro de Estudos de Insetos Sociais (CEIS) e ao Departamento de Biologia Geral e Aplicada da UNESP (campus Rio Claro) pelo apoio técnico fornecido. Ao Prof. Dr. Osmar Malaspina, por ter me convidado a conhecer seu grupo de pesquisa (LECA) na primeira semana de graduação. Obrigado por ter alimentado minha curiosidade sobre o fantástico mundo das abelhas através dos livros que me emprestou, pelo incentivo e pelas oportunidades que tive ao longo de todos esses anos (e já são 9 anos!). À Dra. Milene Ferro, minha coorientadora, por me guiar durante o desenvolvimento do projeto. Sou muito grato pelos ensinamentos, pela paciência e dedicação diante das minhas infinitas perguntas e pedidos, não consigo imaginar esses dois últimos anos sem toda a ajuda e suporte que recebi. À Necis Miranda de Lima, sempre disposta a ajudar resolver os problemas burocráticos e por me mostrar que geralmente não são um bicho de sete cabeças. Aos membros do Laboratório de Ecotoxicologia e Conservação de Abelhas (LECA) que já partiram e aos que ainda continuam nessa jornada, obrigado pelos anos de trabalho e convivência. Em especial a Pâmela Decio por ouvir meus desabafos, por ter mantido e fortificado nossa amizade nos últimos anos. Sem você, sem nossas reclamações e cumplicidade, tenho certeza que o fardo desses anos teria sido mais pesado. As minhas alunas de iniciação científica que extrapolaram as fronteiras entre orientador e orientandas, contribuindo também com meu aprendizado pessoal. À Geovana Maloni por sempre estar comigo, nos melhores e piores momentos, e por basicamente compartilhar esse mestrado. Obrigado pelo apoio e paciência, e saiba que muitas vezes em meio ao desanimo a sua motivação e empolgação com a pesquisa me mantinham disposto a ir à luta mais uma vez. À Fernanda Souza por ter proporcionado reflexões e revoluções internas, por ter me feito enxergar o lado B entre as relações no ambiente de trabalho e também por me instigar a mudar alguns aspectos entre essas relações. À Júlia Italiani por me fazer desacelerar e dedicar meu tempo de forma mais leve. Não posso deixar de mencionar a Adna Dorigo, Tatiane Grella e a Annelise Rosa-Fontana pelas colaborações, risadas e ajudas ao longo desses anos. Aos membros do CEIS (Beto, Carol, Fram e a Amanda) que muitas vezes me socorreram na falta de um material e que caridosamente me compreendiam e ajudavam durante minhas peregrinações em busca de algo. À Amanda de Oliveira que além de amiga foi uma grande salvadora em diferentes momentos, sempre paciente e disposta a ajudar. Ainda precisamos de uma batata no Santa pra comemorar as vitórias dessa vida, reclamar e rir (claro, não poderíamos deixar esses aspectos de lado). Ao meu irmão Marcelo Miotelo e a minha mãe Rosa Miotelo pelo apoio em relação as minhas escolhas. Aos meus amigos Mari, Malu, Ana Luiza, Lara e Giovane pela compreensão nos meus momentos de ausência, pelo suporte emocional e motivação quase que diária. Ao Igor Otero, que dentre todos, é a única pessoa que realmente enxerga meus momentos de desespero, de fúria e teimosias (Em outras palavras, que eu me permito ser visto dessa forma). Obrigado por suportar comigo, por aliviar o estresse e se manter firme ao meu lado. Sei que nossas transições entre momentos difíceis e amenos nem sempre batem e que as vezes temos que dar suporte um ao outro mesmo quando não temos essa força toda, mas seguimos juntos, pacientes e tentando melhorar todos os dias. Por fim, agradeço a todos que contribuíram direta ou indiretamente para a realização deste trabalho e não foram mencionados, mas que se considerem no direito de estarem aqui. RESUMO No Brasil o consumo de inseticidas neonicotinóides, como o tiametoxam (TMX), é uma prática comum em culturas agrícolas. O uso indiscriminado de TMX afeta insetos não alvo, como as abelhas. Melipona scutellaris é uma espécie de abelha sem ferrão que foi inserida em uma lista do IBAMA, juntamente com o TMX, para que sejam realizados estudos toxicológicos. O presente estudo realizou uma análise de expressão gênica diferencial dos túbulos de Malpighi (Mt) de M. scutellaris expostas à CL50/100 do TMX por meio da análise transcriptômica. Além disso, foi avaliada a imunomarcação das proteínas de choque térmico (HSP) 70 e 90, juntamente com a busca por HSPs expressas no transcriptoma e a aplicação do método de TUNEL para detectar morte celular. Após a montagem de novo do transcriptoma, foram identificados 237 genes diferencialmente expressos (DEGs) e agrupados em nove clusters. Foram encontrados DEGs envolvidos em processos de destoxificação, excreção, regeneração tecidual, respiração celular, estresse oxidativo, apoptose, sinalização celular e sistema imune. A imunomarcação de HSP70 aumentou em um dia e diminuiu em oito dias de exposição ao TMX. Enquanto a HSP90 diminuiu em um dia e aumentou em oito. Já o método de TUNEL detectou fragmentação de DNA apenas em oito dias. Além disso, não existem DEGs relacionados a HSPs e por meio da análise de TPM (trascrits per milion) foi identificada que uma isoforma de HSP70 foi a proteína de choque térmico mais expressa. Considerando os resultados do transcriptoma, o metabolismo celular em Mt foi afetado principalmente após oito dias de exposição. Nove genes foram selecionados de diferentes clusters e validados por RT-qPCR. De acordo com nossos resultados, o TMX promove vários tipos de danos nas células dos Mt à nível molecular. Portanto, a interferência em diferentes processos celulares pode afetar diretamente a saúde de M. scutellaris, comprometendo funções essenciais dos Mt. Já os dados obtidos pela imunomarcação e análise do transcriptoma são conflitantes uma vez que não há nenhum DEG e a imunomarcação evidencia diferenças entre os grupos controle e exposto. Essas diferenças podem ser resultantes da alta sensibilidade desses imunomarcadores. O presente estudo foi o primeiro a avaliar os efeitos de um neonicotinóide na expressão gênica de uma abelha sem ferrão e evidencia a importância de análises moleculares para estudos ecotoxicológicos. Palavras-chave: Abelha sem ferrão, destoxificação, neonicotinóides, montagem de novo, sequenciamento, HSP70, HSP90, TUNEL. ABSTRACT In Brazil, using neonicotinoid insecticides, such as thiamethoxam (TMX), is common in crops. The indiscriminate use of TMX affects non-target insects such as bees. For example, Melipona scutellaris is a species of stingless bee that was included in an IBAMA list, along with TMX, for toxicological studies to be carried out. The present study analyzed differential gene expression of Malpighian tubules (Mt) of foragers bees of M. scutellaris exposed to LC50/100 of TMX through transcriptomic analysis. In addition, the immunostaining of heat shock proteins (HSP) 70 and 90 were evaluated, searching for HSPs expressed in the transcriptome and applying the TUNEL method to detect cell death. After de novo assembly, 237 differentially expressed genes (DEGs) were identified and grouped into nine clusters. DEGs involved in detoxification, excretion, tissue regeneration, cellular respiration, oxidative stress, apoptosis, cell signaling, and the immune system were found. HSP70 immunostaining increased within one day and decreased within eight days of exposure to TMX. At the same time, HSP90 decreased by one day and increased by eight. The TUNEL method detected DNA fragmentation only in eight days. In addition, there are no DEGs related to HSPs, and through the analysis of TPM (transcripts per million), it was identified that HSP70 was the most expressed heat shock protein. Regarding the transcriptome results, cell metabolism in Mt was mainly affected after eight days of exposure. Nine genes were selected from different clusters and validated by RT- qPCR. According to our results, TMX promotes several types of damage in Mt cells at the molecular level. Therefore, interference in different cellular processes directly affects the health of M. scutellaris, compromising essential functions of Mt. The data obtained for HSPs (immunostaining and transcriptome analysis) are conflicting since there are no DEGs on the transcriptome. However, the immunostaining showed differences between the control and exposed groups. These differences may result from the high sensitivity of this immunomarkers. The present study was the first to evaluate the effects of a neonicotinoid on the gene expression of stingless bees and highlighted the importance of molecular analyzes for ecotoxicological studies. Keywords: De novo assembly, neonicotinoid, stingless bee, detoxification, sequencing, HSP70, HSP90, TUNEL. Sumário INTRODUÇÃO GERAL ........................................................................................................... 6 OBJETIVOS ............................................................................................................................. 12 Objetivo geral ........................................................................................................................... 12 Objetivos específicos ................................................................................................................ 12 Capítulo 1 ................................................................................................................................. 13 Capítulo 2 ................................................................................................................................. 52 CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................................................................... 74 Referências ............................................................................................................................... 74 6 INTRODUÇÃO GERAL Estima-se que existam cerca de 20.000 espécies de abelhas descritas no mundo (MICHENER, 2007); essa diversidade contribui para a realização de serviços ecossistêmicos, como a polinização, em diferentes ambientes (POTTS et al., 2016). No Brasil são descritas 244 espécies de abelhas sem ferrão (PEDRO, 2014) e segundo Roubik (2006), formam um grupo 50 vezes mais diverso do que o grupo das abelhas melíferas (e.x.: Apis mellifera africanizada Linnaeus, 1758). Dentre as abelhas sem ferrão, algumas espécies vêm sendo visadas para a exploração de mel (ALVES, 2013) ou para a inserção de colônias em sistemas agrícolas e/ou naturais a fim de utilizá-las como agentes polinizadores (CHAM et al., 2018). Em plantações agrícolas de interesse econômico, as abelhas sem ferrão podem efetivamente polinizar as seguintes culturas: morango, citrus, abacate, pêssego, girassol, açaí, dentre outras (KLEIN et al., 2020). Especificamente em culturas de tomate, urucum, berinjela e pimentão é necessário que o agente polinizador seja capaz de realizar a polinização por vibração (DE LUCA; VALLEJO-MARÍN, 2013). Ao contrário de A. mellifera, incapaz de efetuar esse tipo de polinização (DE LUCA; VALLEJO-MARÍN, 2013), as abelhas sem ferrão, como Melipona scutellaris Latreille, 1811, podem polinizar com sucesso plantas com deiscência poricida por meio da vibração da musculatura do tórax (KLEIN et al., 2020). M. scutellaris, pertencente ao gênero Melipona, é uma abelha sem ferrão nativa da região nordeste do Brasil, no entanto, é bem adaptada as condições ecológicas e climáticas do estado de São Paulo (PEDRO; CAMARGO, 1999). Além disso, é uma espécie de fácil manejo na qual a produção e comércio de alguns produtos de alto valor econômico, como o mel, própolis e o pólen vem sendo cada vez mais explorados (COSTA et al., 2015). Os meliponíneos, tribo a qual a espécie M. scutellaris pertence, polinizam cerca de 66% das 1.500 espécies cultivadas em áreas agrícolas no mundo (KREMEN; WILLIAMS; THORP, 2002). Mesmo não sendo o alvo dos agrotóxicos, as abelhas são expostas a essas moléculas por meio de diferentes rotas, como: néctar, pólen, lama/solo, cera, água, superfícies de plantas, dentre outras (BOYLE et al., 2019). Neste contexto, é necessário refletir como as mudanças antropogênicas afetam a saúde, a abundância e a diversidade das abelhas (BIESMEIJER et al., 2006; GOULSON et al., 2015; IMPERATRIZ-FONSECA; SARAIVA; JONG, 2006). Devido a expansão agrícola e o uso indiscriminado de agrotóxicos, estudos que visam entender como é a ação de agrotóxicos na vida destes organismos vêm sendo realizados pelo nosso grupo de 7 pesquisa e por grupos associados (COSTA et al., 2015; DOMINGUES et al., 2020; MIOTELO et al., 2021, 2022). No entanto, para M. scutellaris estudos ecotoxicológicos ainda são escassos. Tiametoxam - TMX (C8H10ClN5O3S) é um inseticida neonicotinóide derivado da nicotina, classificado como N-nitroguanidina (BASS; FIELD, 2018; TOMIZAWA; CASIDA, 2005); que age no sistema nervoso central como agonista nos receptores nicotínicos de acetilcolina. Em condições normais, a acetilcolina é facilmente hidrolisada pela enzima acetilcolinesterase (BASS; FIELD, 2018; FAIRBROTHER et al., 2014), no entanto, os neonicotinóides não são imediatamente degradados, promovendo a transmissão de impulsos nervosos de forma contínua e descontrolada, o que causa hiperexcitação do sistema nervoso central dos insetos, podendo resultar na morte do indivíduo (BASS; FIELD, 2018; EL HASSANI et al., 2008). Além disso, o tiametoxam apresenta características sistêmicas, portanto, mesmo quando usado no tratamento de sementes é possível encontrar resíduos no néctar e no pólen das plantas (FORD; CASIDA, 2008; GOULSON, 2013; THOMPSON et al., 2018). Como consequência da exposição a concentrações subletais do TMX, importantes funções para a sobrevivência das abelhas podem ser comprometidas, como: alimentação, forrageamento, mobilidade, orientação e aprendizado (DECOURTYE et al., 2009; FISCHER et al., 2014; GILL; RAMOS-RODRIGUEZ; RAINE, 2012; HENRY et al., 2012; LAYCOCK et al., 2012). Uma vez que o TMX é um inseticida neurotóxico, os estudos toxicológicos tendem a focar o cérebro como órgão alvo para análises. No entanto, quando as abelhas são expostas por via oral, o alimento contaminado percorre a rota de metabolização e excreção do composto no organismo, podendo atingir órgãos não alvo como o intestino e os túbulos de Malpighi (CRUZ- LANDIM, 2009; MIOTELO et al., 2022). Em abelhas, os túbulos de Malpighi são estruturas finas e alongadas responsáveis pela excreção; constituídos por uma faixa de células epiteliais que estão sobre uma lâmina basal. Liberam as excretas na região pilórica do tubo digestório e organizam-se livremente na cavidade abdominal (CRUZ-LANDIM, 2009). Este órgão entra em contato com o inseticida, com metabólitos do inseticida e com moléculas não metabolizadas, durante a rota de metabolização do composto. Além disso, segundo Miotelo e colaboradores (2022), baixas concentrações de TMX apresentam efeitos citotóxicos significativos para os túbulos de Malpighi de M. scutellaris. Os autores reportaram que a exposição subletal do TMX em um e oito dias causam os seguintes danos celulares: aumento de esferocristais, perca de microvilosidades na porção apical das células, desorganização do labirinto basal, perda de 8 material citoplasmático, núcleos com formato irregular e cromatina condensada. Esses danos podem comprometer processos essenciais para a sobrevivência de M. scutellaris, como a excreção e destoxificação. A função primária do sistema excretor está relacionada com a regulação da homeostase, consistindo em manter o meio interno de um organismo nas melhores condições possíveis para que ocorra um bom funcionamento celular (CRUZ-LANDIM, 2009). Para garantir a homeostase da célula é preciso manter constante os níveis de sais, água, pH, pressão osmótica e eliminar produtos potencialmente tóxicos (CRUZ-LANDIM, 2009). Por se tratar de um órgão pequeno e delicado, geralmente são realizados estudos para compreender como a morfologia das células é afetada quando expostas a algum agrotóxico. Em alguns casos os pesquisadores optam por análises utilizando microscopia de luz (FERREIRA et al., 2013; GRELLA et al., 2019; ROSSI et al., 2013) e/ou microscopia eletrônica de transmissão (CATAE et al., 2014; FERREIRA et al., 2013; FRIOL et al., 2017; MIOTELO et al., 2022). Em contraste com os efeitos morfológicos e fisiológicos, incluindo características relevantes sobre a população, pouco se sabe sobre os efeitos moleculares dos neonicotinóides em abelhas (CHRISTEN et al., 2018). Estudos que aplicam abordagens moleculares usam, quase que exclusivamente, a espécie modelo A. mellifera pois foi a primeira espécie de abelha a ter o genoma sequenciado (GROZINGER; ZAYED, 2020). Apesar disso, considerando o território nacional, ainda são escassos estudos moleculares até mesmo para A. mellifera. Por outro lado, existem estudos na Europa que elucidam os efeitos de concentrações ambientalmente relevantes de neonicotinóides, demonstrando que esses induzem efeitos transcricionais significativos em vários genes-chave associados à neurotoxicidade, formação de memória, respostas ao estresse, metabolismo e expectativa de vida, bem como a regulação do sistema imunológico em exposições de laboratório e de campo (CHRISTEN et al., 2018; CHRISTEN; BACHOFER; FENT, 2017; FENT et al., 2020; SHI et al., 2017). Os avanços nas tecnologias e ferramentas de sequenciamento de nova geração (NGS) superaram diversas limitações. As abordagens ômicas, como genômica populacional, transcriptômica e metagenômica, podem fornecer a resolução e a eficiência necessárias para compreender melhor o declínio nas populações de abelhas (GROZINGER; ZAYED, 2020). Os avanços das técnicas moleculares permitem identificar genes centrais, vias metabólicas e comunidades microbianas associadas a abelhas sob condições de estresse (GROZINGER; ZAYED, 2020). Estudos que visam analisar o transcriptoma (conjunto de transcritos expressos numa determinada condição) de um determinado organismo passaram a ser impulsionados a 9 partir da introdução do NGS (METZKER, 2009). Essa técnica permite avaliar sequencias de RNA convertidas em cDNA em larga escala, além de analisar fragmentos maiores de RNA com alto nível de precisão e sensibilidade (MARTIN; WANG, 2011; OZSOLAK; MILOS, 2010). A transcriptômica pode facilitar a compreensão das respostas moleculares, fisiológicas e comportamentais de abelhas sob condições de estresse, permitindo o desenvolvimento de abordagens que podem aumentar a resistência e resiliência dessas abelhas (GROZINGER; ZAYED, 2020). Estudos transcriptômicos utilizando NGS têm sido fundamentais na caracterização dos mecanismos moleculares e fisiológicos pelos quais as abelhas respondem a diversos estressores, além de fornecerem possíveis ferramentas para um diagnóstico rápido da saúde das abelhas (GROZINGER; ZAYED, 2020). Recentemente, os estudos que utilizaram análises de sequenciamento de RNA para avaliar mudanças nos padrões de expressão gênica foram conduzidos em abelhas parasitadas (ZANNI et al., 2017), infectadas com vírus (BRUTSCHER; DAUGHENBAUGH; FLENNIKEN, 2017), expostas a agrotóxicos (CHRISTEN; BACHOFER; FENT, 2017; FENT; SCHMID; CHRISTEN, 2020; SHI et al., 2017), induzidas a estresse nutricional (CORBY-HARRIS et al., 2014), expostas a múltiplos estressores (AZZOUZ-OLDEN; HUNT; DEGRANDI-HOFFMAN, 2018) e/ou submetidas a diferentes temperaturas (AMSALEM et al., 2015; DURANT et al., 2016; TORSON et al., 2017). No entanto, todos esses estudos foram realizados com diferentes subespécies de A. mellifera. Quando se trata da análise de organismos não-modelo é comum utilizar uma abordagem de montagem de novo do transcriptoma, uma vez que não há um genoma de referência para realizar a montagem das bibliotecas de transcritos (CHRISTEN et al., 2018). Dessa forma o método de novo configura uma boa estratégia para estudos de expressão gênica com a espécie de abelha M. scutellaris, uma vez que apenas o genoma mitocondrial da espécie está disponível (SILVERIO et al., 2014). A expressão gênica de um organismo pode variar com as condições ambientais, estado de desenvolvimento e tecido de origem (RUDD, 2003) e a avaliação da abundância dos diferentes transcritos pode estimar a expressão gênica de determinada célula ou tecido (BOUCK; VISION, 2007), permitindo a identificação de genes relacionados aos processos de intoxicação por neonicotinóides ou ainda reconhecer os genes relacionados aos processos de destoxificação em abelhas. Além disso, acessar os níveis de expressão de HSP e morte celular por apoptose nos túbulos de Malpighi de abelhas contaminadas a agrotóxicos e abelhas não contaminadas pode representar uma abordagem promissora para detectar e diagnosticar rapidamente insetos 10 contaminados com TMX (MALASPINA; SILVA-ZACARIN, 2006a). Quando as células são expostas à ambientes quentes, acima de suas temperaturas normais de crescimento, são produzidas chaperonas moleculares denominadas proteínas de choque térmico (HSP) (ALBERTS et al., 2015; CANDIDO, 2001). Essas proteínas foram descobertas em Drosophila melanogaster, porém, atualmente a síntese dessas proteínas é descrita como um fenômeno universal, uma vez que, ocorre em todas as espécies de animais e plantas estudadas (CANDIDO, 2001; ELEKONICH, 2009; ZHAO et al., 2010). São caracterizadas e nomeadas de acordo com seu peso molecular (SCHLESINGER, 1990) e, em insetos, são descritas quatro principais famílias de HSPs, sendo elas: HSP90, HSP70, HSP60 e as sHSPs de baixo peso molecular (16 – 27 kDa) (COLLIER; BENESCH, 2020; DUBREZ et al., 2020; FEDER; HOFMANN, 1999; KING; MACRAE, 2015). Também podem ser chamadas de proteínas de estresse pois células expostas a produtos químicos prejudiciais ou eventos que proporcionem estresse celular tendem a diminuir a síntese da maioria das proteínas, no entanto, a presença das HSPs aumenta (CANDIDO, 2001; KING; MACRAE, 2015). Este aumento pode ocorrer em resposta à estressores ambientais, infecções, luz UV, agrotóxicos, frio, calor, hipóxia, fome, dentre outros (DUBREZ et al., 2020; ZHANG; OHASHI; RIKIHISA, 1998). As HSPs são chaperonas dependentes de ATP, com exceção das sHSPs que são independentes e representam a primeira linha de defesa celular, prevenindo a desnaturação irreversível de proteínas enquanto as células estão submetidas a condições de estresse (BASHA; O’NEILL; VIERLING, 2012; KING; MACRAE, 2015). Neste contexto, sua principal função é manter as proteínas em um estado de conformação funcional, além de auxiliar no dobramento de novas proteínas sintetizadas (DUBREZ et al., 2020; KING; MACRAE, 2015). Embora as chaperonas dependentes de ATP também sejam capazes de redobrar e desagregar proteínas desnaturadas, algumas HSPs atuam como potentes proteínas antiapoptóticas. Após se associar e bloquear as principais proteínas apoptóticas, as HSPs mantem as células vivas durante eventos de estresse junto com processos de desenvolvimento e diferenciação (DUBREZ et al., 2020). A interação de HSPs com outras proteínas também pode influenciar processos essenciais como: síntese de proteínas, sinalização celular, transcrição e metabolismo (KING; MACRAE, 2015; SOTTILE; NADIN, 2018). Em resumo, as funções mais importantes atribuídas às HSPs são: transporte de proteínas para compartimentos celulares; dobramento de proteínas no citosol, mitocôndrias e retículo endoplasmático; prevenção de agregações de proteínas; controle de proteínas regulatórias; 11 degradação de proteínas instáveis; redobramento de proteínas mal dobradas e dissolução de complexos de proteínas (BUKAU; HORWICH, 1998). Dentre as principais famílias de HSPs, considerando a regulação da apoptose, HSP27 e HSP70 são denominadas antiapoptóticas (GARRIDO et al., 2001). A família da HSP70 é considerada o grupo mais conservado dentre todas as HSPs (BEERE; GREEN, 2001) e atuam em vários pontos nas rotas de sinalização de apoptose, sugerindo que sua ação determinará o destino das células sob estresse (BEERE et al., 2000; KURASHOVA; MADAEVA; KOLESNIKOVA, 2020; MOSSER et al., 2000; RAVAGNAN et al., 2001). Além disso, corrigem mudanças conformacionais em proteínas e contribuem com respostas primárias ao estresse oxidativo, protegendo proteínas e enzimas dos efeitos de EROs (KURASHOVA; MADAEVA; KOLESNIKOVA, 2020). Já as HSP90, embora também sejam produzidas durante eventos de estresse, ainda não existe um consenso se atuam de forma anti ou pró apoptose uma vez que respondem de maneiras diferentes à estresse (KING; MACRAE, 2015). Uma das técnicas amplamente utilizadas para avaliar a morte celular é o método TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling) (GAVRIELI; SHERMAN; BEN-SASSON, 1992). Quando as células estão em processo de morte as endonucleases clivam o DNA em muitos fragmentos, gerando várias extremidades livres de DNA (ALBERTS et al., 2015). Consequentemente, o método TUNEL é capaz de detectar o dano usando a capacidade da enzima desoxinucleotidil transferase terminal (TdT) que transfere cadeias de desoxinucleotídeo marcados (dUTP) para os terminais 3'-hidroxil (3'-OH) dos fragmentos (GAVRIELI; SHERMAN; BEN-SASSON, 1992). Assim, o método TUNEL aliado as HSPs podem ser utilizados para entender como as células estão enfrentando os danos moleculares causados por concentrações ambientalmente relevantes de agrotóxicos e avaliar seu nível de severidade para as abelhas, pois ambos representam uma ótima alternativa para diagnóstico biológico rápido (MALASPINA; SILVA-ZACARIN, 2006b). 74 CONSIDERAÇÕES FINAIS O TMX afeta os perfis de expressão gênica nos túbulos de Malpighi de M. scutellaris expostos a uma concentração subletal, ambientalmente relevante. Diferentes vias metabólicas, fundamentais para o bom funcionamento dos túbulos, são afetadas pelo TMX, levando ao comprometimento do órgão. Com maior prejuízo após o oitavo dia de exposição. Embora a imunomarcação indique que o TMX alterou o perfil de expressão de HSPs, a análise do transcriptoma não revelou nenhum gene de HSP diferencialmente expresso. Os dados obtidos para a imunomarcação de HSP70 e HSP90 são divergentes com os dados obtidos no transcriptoma. Evidenciando que os resultados de imunomarcação precisam ser avaliados com mais cuidado. Realizar apenas a técnica de imunomarcação para HSP70, HSP90 e TUNEL pode gerar resultados inconclusivos e/ou tendenciosos. Seja pela alta sensibilidade do imunomarcador, no caso das HSPs, ou pela indicação da morte celular baseado numa etapa muito restrita, como o TUNEL. Devido a importância ecossistêmica das abelhas sem ferrão, novos estudos que combinem diferentes formas de análise de toxicidade precisam ser realizados, visando não só expandir a área do conhecimento, mas também fornecer dados que subsidiem novas políticas públicas de regulamentação de agrotóxicos e a preservação de polinizadores. Referências ALBERTS, Bruce; JOHNSON, Alexander; LEWIS, Julian; MORGAN, David; RAFF, Martin; ROBERTS, Keith; WALTER, Peter. Molecular Biology of the cell. 6. ed. New York: Garland Science, Taylor & Francis Group, 2015. ALVES, Rogério Marcos de Oliveira. Production and Marketing of Pot-Honey. In: ROUBIK, David Ward; PEDRO, Silvia R. M.; VIT, Patricia (org.). Pot-Honey: A legacy of stingless bees. 1. ed. New York: Springer Science & Business Media, 2013. p. 541–556. DOI: 10.1007/978-1-4614-4960-7. AMSALEM, Etya; GALBRAITH, David A.; CNAANI, Jonathan; TEAL, Peter E. A.; GROZINGER, Christina M. 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