Programa de Pós-graduação em Biologia Geral e Aplicada Distrito de Rubião Júnior s/n CEP 18618-000 Cx Postal 510 Botucatu-SP Brasil Tel (14) 3811-6148 Fax (14) 3811-6148 posgraduacao@ibb.unesp.br Campus de Botucatu Instituto de Biociências PG-BGA EFEITOS DO TRATAMENTO COM SIBUTRAMINA SOBRE A QUALIDADE ESPERMÁTICA DE RATOS MACHOS WISTAR CIBELE DOS SANTOS BORGES Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências, Câmpus de Botucatu, UNESP, para obtenção do título de Mestre no Programa de Pós- Graduação em Biologia Geral e Aplicada, Área de concentração Biologia Celular, Estrutural e Funcional. Profa. Dra. WILMA DE GRAVA KEMPINAS BOTUCATU – SP 2013 Programa de Pós-graduação em Biologia Geral e Aplicada Distrito de Rubião Júnior s/n CEP 18618-000 Cx Postal 510 Botucatu-SP Brasil Tel (14) 3811-6148 Fax (14) 3811-6148 posgraduacao@ibb.unesp.br Campus de Botucatu Instituto de Biociências PG-BGA UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Julio de Mesquita Filho” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU EFEITOS DO TRATAMENTO COM SIBUTRAMINA SOBRE A QUALIDADE ESPERMÁTICA DE RATOS MACHOS WISTAR CIBELE DOS SANTOS BORGES Dra. WILMA DE GRAVA KEMPINAS Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências, Campus de Botucatu, UNESP, para obtenção do título de Mestre no Programa de Pós-Graduação em Biologia Geral e Aplicada, Área de concentração Biologia Celular, Estrutural e Funcional. Profa. Dra. Wilma De Grava Kempinas BOTUCATU – SP 2013 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORM. DIVISÃO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE Borges, Cibele dos Santos. Efeitos do tratamento com sibutramina sobre a qualidade espermática de ratos machos Wistar / Cibele dos Santos Borges. – Botucatu : [s.n.], 2013 Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências de Botucatu Orientador: Wilma De Grava Kempinas Capes: 20600003 1. Obesidade - Tratamento. 2. Sêmen. 3. Fármacos - Uso terapêutico. 4. Fecundidade. 5. Rato como animal de laboratório. 6. Sibutramina - Uso terapêutico - Efeitos colaterais. Palavras-chave: Contratilidade; Fertilidade; Qualidade espermática; Ratos; Sibutramina. Dedicatória Este trabalho é dedicado à pessoa mais importante da minha vida, minha mãe, Tereza Cristina dos Santos, que sempre esteve presente me ajudando a superar cada dificuldade e desafio e se orgulhando por cada vitória conquistada. Agradecimentos Aos meus pais, Tereza Cristina e Leonilto, por acreditarem e me apoiarem em todos os meus sonhos, mesmo quando isso significava ficar muito longe deles. Ao meu namorado e cúmplice, Diogo Peres dos Santos, por transformar nosso namoro em algo mais, sendo tão amigo, companheiro e forte nos meus momentos mais difíceis assim como merecedor dos meus momentos felizes. À minha orientadora, Dra. Wilma De Grava Kempinas, pela confiança depositada, pelos ensinamentos, ajuda e incentivo durante todo o mestrado, e principalmente por despertar em mim a vontade de crescer como pesquisadora e sobretudo pessoa. À minha amiga, companheira de trabalho e dificuldades, iniciação científica e mais que isso, meu ponto de apoio durante toda a execução do projeto, Gabriela Missassi. À minha colega de laboratório, casa e vida, na qual eu puder contar sem hesitar, ela sempre estava ali, pronta para me defender, Raquel Frenedoso da Silva. Às minhas amigas de hoje e sempre, Bianca Damasceno e Kamila Kihara por tudo vivido até hoje. Aos meus familiares, principalmente a Angelina (minha vó), Aline, Beatriz, Adriana e Rafael, por toda a admiração depositada e esperança no meu crescimento pessoal e profissional. Aos meninos do Laboratório de Farmacologia, Luis Ricardo, pelo incentivo, idéias e questionamentos que me fizeram sempre melhorar, Enio Pacini, por toda a dedicação, força de vontade, inteligência e ânimo de pesquisar e descobrir mais e mais. À Patricia Vilela e Mariana Oliveira, pela ajuda, companhia e risadas no laboratório. À toda equipe do Laboratório REPROTOX, pelo auxílio durante a execução do projeto, pelos conhecimentos transferidos e pela paciência ao ajudar, principalmente a Marciana. Ao Prof. Dr. André Pupo, pela oportunidade de desvendar novos horizontes em colaboração com a nossa equipe. Ao técnico de Laboratório José Eduardo, pela ajuda no processamento dos materiais e por ser sempre tão prestativo. À Dona Terezinha, por ser esta senhora maravilhosa que me acolheu e me ajudou em muitos momentos. Aos alunos que fui monitora, que deixaram em mim a vontade de seguir por este caminho. Aos funcionários da Pós-Graduação e a secretária do Departamento Luciana, pela ajuda e atenção. A todos que de alguma forma estiveram presentes em minha vida e envolvidos no meu trabalho e que possibilitaram mais esta vitória. A Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo incentivo financeiro através do Processo nº 2010/13948-4. E a Deus, que diante de tudo sempre me proporcionou vencer, pois mesmo com inúmeros problemas, no final me concedia a luz no fim do túnel, a calmaria para vencer as inúmeras tormentas que vieram e que ainda virão. Muito obrigada! Epígrafe “È muito melhor lançar-se em busca de conquistas grandiosas, mesmo expondo-se ao fracasso, do que alinhar-se com os pobres de espírito, que nem gozam muito e nem sofrem muito, porque vivem numa penumbra cinzenta, onde não conhecem nem vitória, nem derrota.” (Theodore Roosevelt) Sumário Resumo ...................................................................................................................... 11 Abstract .................................................................................................................... 14 Introdução ................................................................................................................ 17 Sibutramina ..................................................................................................... 18 Obesidade e fármacos anorexígenos....................................................... 18 A sibutramina: mecanismo de ação ....................................................... 19 Efeitos da sibutramina ........................................................................... 19 Sistema genital masculino e a inervação simpática ......................................... 20 Testículo ................................................................................................ 21 Epidídimo .............................................................................................. 24 Ducto deferente ...................................................................................... 27 Glândulas sexuais acessórias: glândula seminal e próstata ................... 28 A sibutramina e os sistemas genitais masculino e feminino ............................ 31 Justificativa .............................................................................................................. 32 Objetivos ................................................................................................................... 34 Capítulo .................................................................................................................... 36 Abstract ............................................................................................................ 39 Introduction ...................................................................................................... 40 Material and Methods ...................................................................................... 41 Results .............................................................................................................. 46 Discussion ........................................................................................................ 48 Acknowledgements .......................................................................................... 51 Author comtributions ....................................................................................... 52 References ........................................................................................................ 53 Figure legends .................................................................................................. 55 Conclusões ................................................................................................................ 66 Referências bibliográficas ....................................................................................... 68 Apêndices .................................................................................................................. 77 Comissão de Ética .................................................................................................... 84 11 Resumo 12 A sibutramina é um inibidor seletivo da recaptação neuronal de noradrenalina e serotonina amplamente utilizada para o tratamento da obesidade. Investigações anteriores demonstraram o impacto da sibutramina nas reservas espermáticas e na contratilidade de órgãos relacionados a ejaculação. Portanto, o objetivo do presente trabalho foi avaliar os parâmetros espermáticos e a contratilidade da próstata ventral e do ducto epididimário distal isolado de ratos expostos in vivo e in vitro a sibutramina. No experimento 1, ratos machos Wistar (12-16 semanas /350-450 g) foram divididos em dois grupos: tratado oralmente com sibutramina (10 mg/kg/dia) e grupo controle, que recebeu apenas o veículo (dimetilsulfóxido e solução salina). Após 30 dias de tratamento, os animais foram pesados e eutanasiados por decapitação. Os testículos direitos, epidídimos, ductos deferentes, próstatas ventrais e glândulas seminais (sem a glândula coaguladora) foram removidos e os seus pesos foram determinados. Os testículos e epidídimos direitos foram utilizados para a determinação do número de espermatozoides e os esquerdos para análise histopatológica. Além disso, os espermatozoides da cauda do epididimo direito foram usados para inseminação artificial in utero e para análise da motilidade e morfologia espermática. Os níveis séricos de testosterona, hormônio folículo estimulante (FSH) e hormônio luteinizante (LH) também foram mensurados. No experimento 2, um outro lote de ratos, seguindo o mesmo desenho experimental, foi utilizado para a realização dos ensaios in vitro de reatividade farmacológica do ducto epididimário distal isolado. No experimento 3 ratos machos adultos foram utilizados para os ensaios in vitro de reatividade farmacológica do ducto epididimário distal isolado, com e sem a presença de sibutramina, e para ensaios in vivo da reatividade farmacológica da próstata ventral, com e sem aplicação intravenosa de sibutramina (5mg/kg). A administração oral de sibutramina reduziu significativamente o peso corporal, os pesos absolutos da próstata ventral, glândula seminal e do epidídimo, mas os pesos de outros órgãos reprodutores foram semelhantes entre os grupos. A produção espermática diária, a morfologia e motilidade dos espermatozoides foram semelhantes em ambos os grupos, assim como os níveis hormonais. No epidídimo, a análise dos parâmetros espermáticos demonstrou que houve uma redução significativa no número de espermatozoides na região da cauda e aceleração do tempo de trânsito espermático no grupo exposto à sibutramina. Nesse mesmo grupo, o procedimento de inseminação artificial in utero revelou diferença significativa no potencial de fertilidade. Os ductos epididimários isolados de ratos do grupo controle e tratados com sibutramina não apresentaram nenhuma atividade espontânea e as contrações induzidas por noradrenalina foram semelhantes. Entretanto, curvas dose-resposta à tiramina mostraram que as contrações máximas do grupo tratado com sibutramina apresentaram uma redução significativa. A 13 administração in vitro de sibutramina aumentou 8-16 vezes a sensibilidade do ducto epididimário à contração induzida por noradrenalina exógena, além de aumentar a atividade mecânica, mediada por canais de cálcio. Nos ensaios in vivo, a administração intravenosa de sibutramina aumentou significativamente a força contrátil da próstata ventral quando exposta a noradrenalina. Assim, a redução do peso da cauda do epidídimo, das reservas espermáticas e a aceleração do tempo de trânsito dos espermatozoides, bem como a redução do peso da próstata ventral podem estar associados a uma maior sensibilidade destes órgãos à noradrenalina, provocada pela sibutramina. As alterações observadas, associadas a redução do potencial de fertilidade neste modelo experimental, provavelmente estão relacionadas ao efeito simpaticomimético desta droga, alertando sobre o possível impacto da sibutramina na fertilidade masculina humana. 14 Abstract 15 Sibutramine is a neuronal noradrenaline and serotonin reuptake inhibitor largely used for the treatment of obesity. Previous investigations have shown the impact of sibutramine on ejaculation contractility related organs and sperm reserves. Therefore, the aim of the present work was to evaluate sperm parameters and the contractility of isolated distal cauda epididymidis duct and ventral prostate of rats exposed in vivo and in vitro to sibutramine. In experiment 1, Wistar male rats (12-16 weeks/350-450 g) were divided into two groups: treated orally with sibutramine (10 mg/kg/day) and control, which received only the vehicle (dimethyl sulfoxide and saline). After 30 days of treatment the animals were weighed and euthanized by decapitation. The right testis, epididymis, vas deferens, ventral prostate, and seminal vesicle (without the coagulating gland) were removed, and their weights were determined. The right testis and epididymis were used for enumeration of sperm numbers and the left organs for histopathological analysis. In addition, the right epididymal sperm were used for in utero artificial insemination and to analyse motility and sperm morphology. Serum testosterone, follicle-stimulating hormone (FSH) and luteinizing hormone (LH) were also measured. In experiment 2 another batch of rats, following the same design, were used for in vitro assays of pharmacological reactivity of the isolated distal epididymal duct. In experiment 3 adult male rats were used for in vitro assays of pharmacological reactivity of the isolated distal epididymal duct, with and without sibutramine, and for in vivo assays of pharmacological reactivity of the ventral prostate, with and without intravenous sibutramine (5mg/kg). Oral administration of sibutramine reduced significantly body, ventral prostate, seminal vesicle and epididymis weights, but the weights of other reproductive organs were similar between groups. Daily sperm production, sperm morphology and motility were similar in both groups. Hormone levels were also similar between groups. In the epidydimis, analysis of sperm parameters showed that there was a significant reduction in sperm number on the epididymal cauda and acceleration in sperm transit time. In utero artificial insemination showed significant decrease in fertility potential in the sibutramine-treated group. Epididymal duct isolated from vehicle and sibutramine-treated rats presented no spontaneous activity and the noradrenaline-induced contractions showed similar sensitivity and maximal contractions, however, a significant reduction of maximal contraction induced by endogenous norepinephrine was observed. In vitro, sibutramine administration increased by 8 – 16 fold the sensitivity of epididymal duct to noradrenaline-induced contraction, besides increasing the mechanical activity, mediated by calcium channels. In vivo, intravenous sibutramine significantly increased the contractile tension of the ventral prostate when exposed to norepinephrine. Thus, the reduction of epididymal cauda weight, sperm reverves 16 and acceleration of sperm transit time, as well as the reduction of ventral prostate weight may be associated with increased sensitivity of these organs to noradrenaline, induced by sibutramine. The alterations demonstrated in this experimental model, associated with reduced fertility potential, are probably related to the sympathomimetic effect of this drug, raising concerns about the possible impact of sibutramine on human male fertility. 17 Introdução 18 Sibutramina Obesidade e fármacos anorexígenos A cada ano aumenta progressivamente o percentual de indivíduos que sofrem de doenças metabólicas, sendo a mais comum a obesidade. Esta é resultado da associação de diversos fatores como má alimentação, falta de atividade física e fatores psicossomais (Van Gaal, 2002; Mancini & Halpen, 2006). Atualmente, a obesidade se tornou um dos maiores problemas de saúde pública mundial, sendo considerada uma doença crônica (Mertens & Van Gaal, 2000; Glandt & Raz, 2011). Por ser uma doença metabólica, a obesidade esta ligada diretamente a redução da expectativa de vida, sendo um agente fundamental para o desenvolvimento de hipertensão, dislipidemia, diabetes do tipo 2, doenças cardiovasculares, apnéia obstrutiva assim como câncer (Rajala & Scherer, 2003; Moore et al.,, 2005; Heal et al.,, 2009; Li & Cheung, 2011). Além disso, sabe-se que a obesidade é um fator predisponente para aumento na incidência de morbidade e mortalidade, devido principalmente ao desenvolvimento de problemas cardio e cerebrovasculares (Heal et al.,, 2009). Sabe-se que a obesidade é resultado de um desequilíbrio energético (Bray, 2010). Este desequilíbrio é devido ao aumento da ingestão calórica seguido de queda no gasto energético (Hofbauer et al.,, 2007). O tratamento da obesidade é indicado para melhorar a qualidade de vida do indivíduo (Carpenter et al.,, 2000; Erickson et al.,, 2000) na qual dieta e exercício físico são aconselhados tanto para prevenção quanto tratamento, entretanto, requer muita disciplina e são difíceis de serem mantidos (Glandt & Raz 2011), sendo então recomendado o uso de fármacos anorexígenos. O tratamento farmacológico é indicado para indivíduos com índice de massa corpórea (IMC) maior que 30kg/m 2 ou entre 27kg/m 2 e 30kg/m 2 com a presença de doenças associadas ao excesso de peso (Mancini & Halpern 2006; WHO, 2011). Drogas que induzem perda de peso podem atuar reduzindo o apetite ou aumentando a saciedade, reduzindo a absorção de nutrientes ou aumentando o gasto energético (Ioannides- Demos et al.,, 2011). Foi demonstrado que tal comportamento é devido ao seu papel sobre o sistema nervoso central, existindo três principais categorias: drogas que atuam por mecanismo catecolaminérgico (anfetaminas), por mecanismo serotoninérgico (fenfluramina) e as que combinam estes dois sistemas (sibutramina) (Bellaver et al.,, 2001). 19 A sibutramina: mecanismo de ação A sibutramina é um supressor de apetite administrado oralmente para tratamento da obesidade (Binsaleh, 2012), atuando sobre o sistema nervoso central como um inibidor seletivo da recapitação neuronal de noradrenalina e serotonina (Nisoli & Carruba, 2000; Choi et al.,, 2011) e em menor quantidade, dopamina (Jackson et al.,, 1997). Este fármaco exerce seus efeitos in vivo através de seus metabólitos ativos: aminas primárias e secundárias, que possuem mais estabilidade e maior meia vida (Nisoli & Carruba, 2000). A sibutramina está disponível em doses de 5mg, 10mg e 15mg/dia, sendo a dose de 10mg/dia a mais indicada para o tratamento da obesidade (Bray & Ryan, 2007; Bray & Ryan, 2011). Entretanto, aponta-se que 52% dos pacientes usam indevidamente a droga, seja pelo uso contínuo ou pelo uso com IMC igual ou abaixo de 27kg/m 2 (Dahlin & Beermann, 2007). Em modelos animais, a sibutramina atua sobre a ingestão de alimentos e gasto energético (Nisoli & Carruba, 2000). A queda da ingestão calórica é devida à resposta a saciedade pós-ingestão mediado pela serotonina e noradrenalina central, através do aumento da ativação dos receptores 5-HT2A/2C e β1. O alto gasto energético é decorrente do aumento da taxa metabólica mediado pela noradrenalina periférica, através do receptor α1 e β3 (Meridia, 2002). Entretanto, este efeito simpatomimético periférico induz elevação da freqüência cardíaca (Scheen, 2011). Efeitos da sibutramina Wesnes et al., (2000) avaliaram a ação da sibutramina concomitante com a ingestão de álcool. Pacientes que fizeram uso apenas do álcool apresentaram grande perda da função cognitiva, e os que se utilizaram de álcool associado com sibutramina apresentaram uma menor perda desta função. Estudos realizados com pacientes obesas portadoras da Síndrome do Ovário Policístico demonstraram que a sibutramina apresentou efeitos positivos sobre a hiperandrogenia (Sabuncu et al.,, 2003). Além disso, pacientes sobrepesos ou obesos, que foram submetidos a um tratamento inicial de quatro semanas com sibutramina na dose de 10mg/dia, apresentaram uma redução nos valores de LDL, VLDL, HDL e colesterol total (Weeke et al.,, 2010). Fujioka et al., (2000) observaram que a administração da sibutramina em pacientes com diabetes do tipo 2, associada com uma moderada restrição calórica foi benéfica, melhorando a qualidade de vida destes pacientes. Em 2010, Van Gaal et al. (2010) reafirmam estes resultados com pacientes diabéticos de alto risco. 20 De acordo com o Compêndio de Especialidades Farmacêuticas (Meridia, 2002), foram registradas irregularidades menstruais, elevação da pressão sanguínea e da freqüência cardíaca com o uso da sibutramina. Os efeitos adversos frequentemente encontrados numa taxa de 7 a 20% dos pacientes são: insônia, boca seca, paradoxal aumento de apetite, náuseas, dor estomacal, constipação, problemas para dormir, dor de cabeça, pressão alta, taquicardia, vasoconstrição e vasodilatação (Woolard et al.,, 2004; Rucker et al.,, 2007). Após realização do SCOUT (Sibutramine Cardiovascular Outcome Trial) foi observado que, a curto prazo, a sibutramina se mostrou segura a pacientes com doenças cardiovasculares preexistentes (Torp-Pedersen et al.,, 2007), e a longo prazo, a sibutramina aumentou em 16% o risco de infarto do miocárdio e derrame (James et al.,, 2010; Coutinho & James, 2011). A EMA (European Medicines Agency) recomendou a suspensão da comercialização da sibutramina e a FDA a retirou do mercado em outubro de 2010 (FDA, 2011), embora o consumo através de outras fontes ainda ocorra. No Brasil, a sibutramina esta sendo comercializada, mas com severas restrições. Sistema genital masculino e a inervação simpática O sistema genital masculino interno da maioria dos mamíferos é composto por um par de testículos (gônadas), de epidídimos e de ductos deferentes, além das glândulas sexuais acessórias (próstata e glândula seminal) (Figura 1). Sabe-se que este sistema é esteróide-dependente e que qualquer composto que atue sobre o controle do eixo hipotalâmico-hipofisário-gonadal pode interferir no desenvolvimento normal do trato genital masculino, assim como no seu crescimento e função (Luccio-Camelo & Prins, 2011). Além disso, o sistema genital masculino recebe inervação de fibras do sistema autônomo simpático (fibras adrenérgicas) e parassimpático (fibras colinérgicas), os quais exercem distintas funções de controle, baseadas na ativação de receptores específicos presentes nas membranas de cada órgão ou glândula (Falck et al.,, 1965; Sjostrand, 1965; Purves, 2001). Alterações nesta comunicação, seja inibindo ou excitando, podem acarretar em modificações na funcionalidade do sistema genital masculino. Assim, drogas cujo mecanismo de ação está relacionado com o aumento da liberação ou da disponibilidade de neurotransmissores catecolaminérgicos, como a noradrenalina, 21 podem interferir direta ou indiretamente sobre este controle nervoso que há no sistema genital masculino (Nojimoto et al.,, 2009; Jurkiewicz et al.,, 2012). Figura 1: Órgãos genitais de rato Wistar. Fonte: Laboratório de Toxicologia da Reprodução e do Desenvolvimento. Testículo O testículo é um órgão do sistema genital masculino que pode ser dividido estrutural e funcionalmente em duas partes: túbulos seminíferos e interstício, responsáveis pela produção de espermatozoides (espermatogênese) e de hormônios esteróides (esteroidogênese), respectivamente (Foley, 2001; Johnson, 2001) (Figura 2). Este órgão apresenta-se envolto por uma cápsula resistente de tecido fibroso denominada túnica albugínea, composta principalmente por fibroblastos e células musculares lisas que são responsivas a estímulos nervosos (Russell, 1990; Setchell, 2006). A espermatogênese é um processo cíclico e contínuo, no qual células germinativas unipotentes diploides se diferenciam, e posteriormente passam pelo processo de divisão celular meiótica, formando células especializadas haploides denominadas espermatozoides (Franca et al.,, 1993; Chu & Shakes, 2013). Os túbulos seminíferos ainda apresentam dois tipos de células somáticas: as células de Sertoli e células mioides ou peritubulares (Figura 2) (Johnson, 2001). As células de Sertoli têm um papel crucial na formação do testículo e no processo de espermatogênese, auxiliando 22 na progressão das células germinativas a espermatozoides, além de constituírem a barreira de células de Sertoli, que protege as células germinativas de uma possível reação autoimune e de muitas substâncias tóxicas que podem entrar em contato com a gônada via circulação (Russell, 1990; Griswold, 1998; Johnson, 2001). As células mioides ou células peritubulares, por sua vez, são células que participam do processo contráctil lento e rítmico dos túbulos seminíferos, auxiliando na movimentação dos espermatozoides e do fluido testicular (Russell, 1990). No interstício, localizado entre os túbulos seminíferos, encontra-se vasos sanguíneos, linfáticos, nervos, macrófagos e células de Leydig (Russell, 1990), como observado na Figura 2. Estas células são responsáveis pelo processo de esteroidogênese, sendo a maior fonte de andrógenos, principalmente testosterona, hormônio produzido a base de colesterol (Azhar, 2007). Figura 2: Desenho de um segmento do testículo, constituído por uma secção do túbulo seminífero e seus componentes, e por uma secção do interstício e seu principais componentes. (Junqueira & Carneiro, 2004). O testículo recebe inervação autônoma pelos nervos espermáticos superiores e inferiores, que chegam neste órgão alvo por dois caminhos distintos: os nervos espermáticos superiores se originam do gânglio mesentérico superior (rostral) chegando à gônada via artéria testicular; os nervos espermáticos inferiores se originam do gânglio mesentério inferior (caudal) que acompanha o ducto deferente e penetra no testículo pelo pólo inferior, como na Figura 3 (Sosa et al.,, 2009; Motoc et al.,, 2010). 23 O componente simpático do nervo espermático superior vem via nervos intermesentéricos, e do nervo espermático inferior via gânglio mesentérico superior (Mitchell, 1935; Hodson, 1965; Gerendai et al.,, 2005). Foi demonstrado que a inervação simpática exerce controle direto sobre: o fluxo sanguíneo testicular (Kempinas et al.,, 1988; Karaguzel et al.,, 1995), a espermatogênese (Hodson, 1965; Lamano-Carvalho et al.,, 1993; Gong et al.,, 2006), a manutenção e sobrevivência das células de Leydig (Gong et al.,, 2009), a secreção hormonal de testosterona pelas gonadas (Chiocchio et al.,, 1999; Gerendai et al.,, 2005) assim como a atividade contrátil desenvolvida pelas células peritubulares e células musculares lisas constituintes da túnica albugínea, responsáveis pelo transporte dos espermatozoides dos túbulos seminíferos à cabeça do epidídimo (Hargrove et al.,, 1977; Ellis et al.,, 1981; Banks et al.,, 2006). Figura 3: Modelo esquemático da inervação simpática testicular, representando os dois nervos que chegam ao testículo, o nervo espermático superior e o nervo espermático inferior. Portanto, a inervação autônoma do testículo corresponde a um eixo importante no controle do processo de espermatogênese e sobre no transporte dos espermatozoides para a cabeça do epidídimo, sendo crucial para a manutenção da estrutura e função da gônada masculina. 24 Epidídimo O epidídimo é um órgão do aparelho genital masculino presente na maioria dos mamíferos, formado por um único ducto altamente enovelado que liga os ductos eferentes ao ducto deferente (Hermo, 2002; Rodriguez, 2002; Robaire, 2006). Anatômica e funcionalmente, o epidídimo de rato pode ser dividido em segmento inicial, cabeça, corpo e cauda, como observado na figura 4, que proporcionam um microambiente específico para a passagem dos espermatozoides vindos do testículo (Franca et al.,, 2005; Sullivan et al.,, 2005). Figura 4: Desenho ilustrando as regiões que se dividem o ducto epididimário de acordo com as suas características morfofuncionais (Klinefelter, 1998). Constituído por um epitélio pseudo-estratificado, é composto por seis tipos celulares distintos: células estreitas, apicais, basais, halo, claras e principais, que juntas exercem inúmeras funções necessárias para o bom funcionamento do epidídimo (Hermo, 2002). O processo de maturação espermática ocorre ao longo da passagem dos espermatozoides pelo ducto epididimário. Vindos do testículo, estes espermatozoides morfologicamente formados, mas imóveis e inférteis, adquirem a capacidade de motilidade progressiva e de fertilizar o ovócito II. Além disso, o epidídimo desempenha um importante papel sobre o transporte, proteção, estoque e concentração espermática (Cuasnicú, 2002; Robaire, 2006; Fernandez et al.,, 2008; Kempinas & Klinefelter, 2010). Ao redor do epitélio epididimário existe uma camada de células musculares lisas, cuja contração auxilia no processo de trânsito espermático e expulsão dos espermatozoides da região da cauda para o ducto deferente (Bellentani et al.,, 2011). Esta camada, mais fina na região da cabeça e corpo e mais espessa na região da cauda, como pode ser observado na 25 figura 5, apresenta receptores de membranas específicos para a atuação de fibras adrenérgicas do sistema nervoso simpático que inervam este órgão, controlando este processo contrátil e conferindo tempo hábil para os espermatozoides se maturarem (Kempinas et al.,, 1998; Ricker, 1998; Setchell, 2002). Figura 5: Desenho ilustrando a espessura e distribuição da camada de células musculares lisas que envolvem o ducto epididimário desde o segmento inicial até a região da cauda distal (Azhar, 2007). O epidídimo recebe inervação simpática de vários plexos e gânglios do sistema nervoso autônomo (Figura 6). Esta inervação é derivada do gânglio mesentérico inferior ou caudal, localizado próximo à artéria mesentérica inferior (Ricker, 1998; Setchell, 2002; Setchell & Breed, 2006). Resumidamente, pode-se dizer que chegam ao ducto epididimário fibras simpáticas via nervo hipogástrico. Entretanto, sabe-se que o nervo hipogástrico, fornece fibras simpáticas ao nervo espermático mediano, que em muitas espécies estende-se pelo ducto deferente até o epidídimo (Setchell, 2002) e fornece fibras ao nervo espermático inferior através do plexo pélvico (plexo que fornece fibras parassimpáticas). Além disso, fibras simpáticas também inervam a cauda epididimária através dos nervos espermáticos inferiores (Kihara et al.,, 1998; Ricker, 1998). A função das fibras adrenérgicas, de modo geral, é excitar as células musculares que envolvem o ducto epididimário (Sjostrand, 1965; Setchell, 2002). Assim, foram localizados ambos receptores α e β-adrenérgicos na parede da musculatura lisa que envolve o epidídimo, demonstrando a importância da inervação adrenérgica sobre a contratilidade deste ducto (Ricker, 1998; Gerendai et al.,, 2001; Setchell & Breed, 2006; Bellentani et al.,, 2011). 26 Figura 6: Desenho esquemático sobre as diferentes rotas cuja inervação simpática leva para chegar ao ducto epididimário. Estudos demonstraram que a inervação simpática esta relacionada diretamente com o processo de absorção espermática (Ricker & Chang, 1996; Kempinas et al.,, 1998) e controle do trânsito dos espermatozoides pelo ducto. Com base nestes trabalhos prévios, recentemente foram observados que o uso de drogas simpatomiméticas, inversamente ao processo de desenervação, pode afetar as reservas espermáticas, pois promove a aceleração do tempo de trânsito de espermatozoides na cauda epididimária. Esta aceleração foi demonstrada em testes in vitro, nos quais estímulos noradrenérgicos promoveram aumento da atividade contrátil do tecido epididimário na presença de drogas agonistas α-adrenérgicas (Bellentani et al.,, 2011). Por outro lado, até o presente momento, são contraditórios os trabalhos que relacionam alterações na inervação simpática e qualidade espermática, como motilidade, morfologia e fertilidade dos espermatozoides (Hepp & Kreye, 1973; Hib et al.,, 1979; Billups et al.,, 1990; Ratnasooriya & Wadsworth, 1994; Ricker et al.,, 1997; Kempinas et al.,, 1998). Assim, pode-se concluir que a inervação epididimária, principalmente na região caudal, exerce papel fundamental para o processo de transporte, absorção, concentração e maturação espermática (Bellentani et al.,, 2011). Entretanto, a literatura contempla os efeitos da inibição dos estímulos nervosos sobre o epidídimo, sendo escassos os trabalhos relacionados a estimulação das células musculares e sua repercussão sobre a qualidade espermática. 27 Ducto deferente O ducto deferente é um ducto único contínuo à cauda do epidídimo, que o une à uretra prostática. Como um componente do cordão espermático, uma vez que se encontra associado aos vasos e nervos testiculares, este ducto atravessa o canal inguinal e penetra na cavidade abdominal. Antes de alcançar a próstata, sofre uma pequena expansão, denominada ampola, onde desemboca um pequeno ducto da glândula seminal, formando o ducto ejaculatório (Dixon et al., 1998). A principal função deste ducto é transportar os espermatozoides estocados na região caudal do epidídimo para o ducto ejaculatório, além de auxiliar no término do processo de maturação espermática (Dixon et al., 1998; Setchell, 2002). Este ducto é envolto por uma espessa camada de musculatura lisa (Setchell, 2002) e, para que o espermatozoide o atravesse durante o processo de ejaculação, são necessárias fortes contrações desta musculatura (Nojimoto et al., 2009). As contrações das células musculares lisas do ducto deferente são provocadas graças a uma rica inervação autônoma adrenérgica, na qual cada célula muscular lisa recebe estimulo via ativação de adrenoreceptores (Johnson, 2001; Setchell, 2002). A inervação simpática responsável por este controle vem pelos nervos hipogástricos que emanam do gânglio mesentérico inferior (caudal), além de algumas fibras vindas da cadeia simpática (Sjostrand, 1965). Estes nervos hipogástricos chegam à região pélvica e se unem com fibras parassimpáticas, formando um plexo nervoso denominado plexo pélvico (Figura 7) (Sjostrand, 1965; Kihara et al., 1998). Figura 7: Esquema da inervação simpática que chega ao ducto deferente. Observar que o nervo hipogástrico passa pelo plexo pélvico (plexo que trás o nervo pélvico – parassimpático). Foi demonstrado que, ao se realizar desenervação cirúrgica das fibras simpáticas ou simpatectomia química, ocorreu acumulo dos espermatozoides no ducto deferente por atrasar o trânsito e por impossibilitar o processo de reabsorção espermática (Hodson, 1964; Lamano- 28 Carvalho et al., 1993) ao passo que a utilização de drogas catecolaminérgicas (sibutramina, fenilefrina, anfetamina) e serotoninérgicas (fluoxetina) desempenharam sobre o ducto deferente aumento de sua atividade contrátil, sugerindo um trânsito mais acelerado por este canal, o que poderia ser insuficiente para o término da maturação espermática (Nojimoto et al., 2009; Gocmez et al., 2010; Jurkiewicz et al., 2012). Assim, pode-se concluir que a inervação simpática do ducto deferente é fundamental para o transporte e término da maturação espermática. Glândulas sexuais acessórias: glândula seminal e próstata A glândula seminal, órgão andrógeno-dependente (Kierszenbaum, 2008), consiste em um ducto único, dilatado e enovelado, revestido por um epitélio pseudoestratificado altamente pregueado (Figura 8) (Hayward et al., 1996; Risbridger, 2006). Além desta camada de células, a parede da glândula seminal apresenta uma camada de tecido conjuntivo frouxo denominado adventícia, uma camada de células musculares lisas divididas em duas laminas e uma folha externa de tecido conectivo (Narbaitz, 1974; Kierszenbaum, 2008). Esta camada muscular dividida em duas lâminas, uma interna de fibras circulares e outra externa de fibras longitudinais, é fundamental para eliminar a secreção vesicular durante a ejaculação (Hayward et al., 1996; Hayward et al., 1996; Risbridger, 2006). Esta glândula seminal produz uma secreção viscosa de pH predominantemente ácido que contribui com 70 a 80% do volume do ejaculado (Kierszenbaum, 2008), sendo composta por várias substâncias muito bem caracterizadas, como proteínas seminais coagulantes, prostaglandinas e frutose (Risbridger, 2006), que são importantes para a viabilidade espermática, principalmente motilidade. A frutose é a maior fonte de energia para o espermatozoide presente no ejaculado. Assim, a glândula seminal fornece, via ducto excretor, ao ducto ejaculatório o material que será o meio adequado para o transporte dos espermatozoides até o trato genital feminino (Kierszenbaum, 2008). Vale ressaltar que a glândula seminal é muito importante no processo de emissão do ejaculado, uma vez que é controlada pelo sistema nervoso autônomo (Hsieh et al., 1996). A próstata é a maior glândula sexual acessória masculina, localizada na pelve, inferiormente à bexiga (Kierszenbaum, 2008). Este órgão, em roedores, não se apresenta como uma glândula única, mas como um conjunto de glândulas que entram na uretra em diferentes pontos (Mcphaul, 1998). Assim, a região da uretra que entra em contato com a 29 próstata, desde a sua origem até a bexiga urinária, é denominada de uretra prostática (Johnson, 2001). Esta glândula é dividida em três regiões de acordo com o seu posicionamento em relação aos demais órgãos pélvicos: um par de lobos dorsolaterais, um par de lobos ventrais e um par de lobos anteriores ou glândula de coagulação, associadas às glândulas seminais, como pode ser observado na figura 8 (Abbott et al., 2003). O epitélio prostático é pseudo-estratificado, constituído de células secretórias e basais, havendo também a presença, mas em menor quantidade, de células neuroendócrinas (Hayward et al., 1996; Hayward et al., 1996; Roy-Burman et al., 2004). As secreções produzidas pelas células glandulares contêm citrato, fosfatase ácida, amilase e fibrinolisina. Esta fibrinolisina auxilia a dissolver o plug ejaculatório produzido pelos fluidos da glândula seminal, tornando o sêmen liquefeito por um período maior (Johnson, 2001). Estes compostos, embora não essenciais à fertilização, servem como meio para a otimização da motilidade e viabilidade espermática (Pennefather et al., 2000). Além disso, a próstata é envolta por tecido conectivo e por uma camada de células musculares lisas que se estendem até o septo fibromuscular do estroma (Johnson, 2001). Estas células musculares desempenham um papel no processo de emissão do conteúdo prostático, uma vez que respondem a estímulos nervosos contráteis (Vaalasti & Hervonen, 1979). Tais estímulos nervosos, vindos pelo sistema nervoso autônomo, além de contribuírem para a atividade secretora da próstata, auxiliam no crescimento e maturação deste órgão (Wang et al., 1991). Figura 8: Desenho do complexo glândula seminal e próstata de um roedor. Observar a constituição em lóbulos da próstata e a glândula seminal enovelada (Setchell & Breed, 2006). 30 De modo geral, as glândulas sexuais acessórias recebem inervação simpática, vindo através de fibras pós-ganglionares curtas (diferentemente dos demais órgãos pélvicos) que chegam dos corpos celulares nervosos localizados próximo ao órgão, através da extremidade periférica do nervo hipogástrico (Figura 9) (Sjostrand, 1965; Vaalasti & Hervonen, 1979; Setchell & Breed, 2006). O nervo hipogástrico, como já mencionado, emana do gânglio mesentérico inferior (caudal) e este gânglio recebe fibras da cadeia simpática vindas da região lombar da coluna vertebral. Além disso, algumas fibras simpáticas vêm diretamente da cadeia simpática (Sjostrand, 1965). As fibras simpáticas estão concentradas em contato com a camada de células musculares lisas que circundam os ductos e os alvéolos prostáticos e vesiculares, ou seja, presentes no estroma; entretanto são ausentes no epitélio glandular (Al-Zuhair et al., 1975; Lamano-Carvalho, 1990; Pennefather et al., 2000). Estas fibras adrenérgicas estão diretamente relacionadas ao aumento do tônus contrátil das células musculares lisas presentes no estroma, auxiliando no processo de secreção do fluido à uretra (Bruschini et al., 1978; Vaalasti & Hervonen, 1979; Dixon & Jen, 1995; Pennefather et al., 2000). Figura 9: Desenho esquemático das fibras simpáticas que inervam as glândulas sexuais acessórias, glândula seminal e próstata. Observar também inervação simpática vinda diretamente pela cadeia simpática. Estudos demonstraram que a inervação autônoma simpática pode estar envolvida no controle de receptores de LH, importantes durante o período pré-pubere do desenvolvimento, influenciando o crescimento da glândula seminal e próstata (Lamano-Carvalho et al., 1993; Rosa-e-Silva et al., 1995). Além disso, sabe-se que não apenas o controle do eixo hipotalâmico-hipofisário-gonadal, mas também a inervação simpática exercem papel fundamental na manutenção da integridade estrutural e funcional das glândulas sexuais acessórias (Lamano-Carvalho, 1990; Wang et al., 1991; Diaz et al., 2010), influenciando sobre a atividade secretora de ambas (Lamano-Carvalho, 1990; Lamano-Carvalho, 1995) e 31 sobre a atividade contrátil das células musculares responsáveis por eliminar os fluidos no ducto ejaculatório (Lamano-Carvalho, 1990). A utilização de drogas simpatomiméticas, tal como fenilefrina e sibutramina, promoveu aumento da sensibilidade contrátil das células musculares presentes na glândula seminal, aumentado a eliminação do fluido vesicular à uretra e diminuindo o peso final desta glândula (Hib et al., 1984; Nojimoto et al., 2009). Assim, pode-se inferir que as fibras adrenérgicas são de suma importância para as glândulas sexuais acessórias, quer seja para sua atividade secretora, quer seja para eliminação do fluido à uretra. A sibutramina e os sistemas genitais masculino e feminino Sobre órgãos do aparelho genital feminino foi demonstrado que o tratamento de ratas com a sibutramina promoveu redução do potencial fértil tanto das fêmeas obesas quanto não obesas, além de aumentar a incidência de perdas pós-implantação (Francia-Farje et al., 2010). Por outro lado, a ação da sibutramina sobre órgãos do aparelho genital masculino apresenta, até o presente momento, poucos relatos na literatura. Segundo Food and Drug Administration (FDA, 2011) há relatos de ejaculação anormal em ratos como efeito adverso da sibutramina. Nojimoto et al., 2009) demonstraram que a exposição a diferentes concentrações de sibutramina aumentaram a atividade contráctil do ducto deferente e da glândula seminal. (Bellentani et al., 2011) por sua vez, observaram que ocorreu redução da reserva espermática na cauda epididimária e aceleração do trânsito de espermatozoides nessa região, devido ao possível efeito simpatomimético da droga. 32 Justificativa 33 O sistema nervoso simpático desempenha importante papel sobre a manutenção estrutural e funcional dos órgãos que constituem o sistema genital masculino, principalmente dos órgãos relacionados com a qualidade espermática (Setchell & Breed, 2006) e a sibutramina, por sua vez, bloqueando a recaptura de noradrenalina, deixando-a disponível por mais tempo na fenda sináptica (Jackson et al.,1997; Scheen, 2012) promove um aumento do tônus simpático (Hirsch et al.,2000) o que pode interferir no controle funcional dos órgãos reprodutores (Nojimoto et al., 2009; Bellentani et al., 2011). Entretanto, são escassos os estudos relacionando os possíveis efeitos da sibutramina sobre a qualidade espermática. Neste sentido foi desenvolvido o presente trabalho, para demonstrar os possíveis efeitos do tratamento de ratos machos adultos com sibutramina sobre aspectos reprodutivos, com ênfase na qualidade espermática. 34 Objetivos 35 O objetivo fundamental do projeto foi analisar se a exposição à sibutramina pode alterar a qualidade espermática, em ratos. Os objetivos específicos foram:  Investigar os efeitos tóxicos da sibutramina de forma geral sobre o sistema genital masculino;  Investigar se há alterações sobre o processo de maturação espermática;  Investigar as possíveis alterações sobre a atividade contrátil dos órgãos reprodutores importantes para a qualidade espermática;  Investigar se há alterações sobre a fertilidade dos animais expostos à sibutramina. Para tanto, foram avaliados nos animais dos grupos experimentais os seguintes parâmetros: evolução do peso corpóreo, níveis séricos de hormônios sexuais (FSH, LH e testosterona), peso dos órgãos reprodutivos, histopatologia testicular e produção diária de espermatozoides, número e tempo de trânsito dos espermatozoides no epidídimo, histopatologia epididimária, parâmetros espermáticos (morfologia e motilidade dos espermatozoides), contratilidade, in vitro, da cauda distal do ducto epididimário, assim como contratilidade da próstata ventral. 36 Capítulo 37 Este trabalho deu origem ao artigo “SLIM OR FERTILE? PHARMACOLOGICAL MECHANISMS INVOLVED IN REDUCED SPERM QUALITY AND FERTILITY IN RATS EXPOSED TO THE ANOREXIGEN SIBUTRAMINE” que foi submetido para publicação no periódico “Plos One”. 38 SLIM OR FERTILE? PHARMACOLOGICAL MECHANISMS INVOLVED IN REDUCED SPERM QUALITY AND FERTILITY IN RATS EXPOSED TO THE ANOREXIGEN SIBUTRAMINE Cibele S. Borges 1 , Gabriela Missassi 1 ; Enio Setsuo Arakaki Pacini 2 , Luiz Ricardo de Almeida Kiguti 2 , Marciana Sanabria 1 , Raquel Frenedoso da Silva 1 , Thais Petrochelli Banzato 1 , Juliana Elaine Perobelli 1 , André Sampaio Pupo 2 , Wilma De Grava Kempinas 1 *. Departments of 1 Morphology and 2 Pharmacology, Institute of Biosciences, UNESP - Univ Estadual Paulista, Botucatu, São Paulo, Brazil * Wilma De Grava Kempinas, Departamento de Morfologia, Instituto de Biociências, UNESP, Caixa Postal 510, 18618-970 Botucatu, SP, Brazil. Tel.: +55 14 3880-0476 E-mail: kempinas@ibb.unesp.br 39 ABSTRACT 1 2 Sperm acquire motility and fertility capacity during epididymal transit, under the control of 3 androgens and sympathetic innervation. It is already known that the acceleration of sperm 4 transit time can lead to lower sperm quality. In a previous work we showed that rats exposed 5 to the anorexigen sibutramine, a non-selective serotonin-norepinephrine reuptake inhibitor, 6 presented increased in vitro epididymal duct contractility, faster sperm transit time and lower 7 epididymal sperm reserves. In the present work we aimed to further investigate 8 pharmacological mechanisms involved in these alterations and the impact on rat sperm 9 quality. For this, adult male Wistar rats were treated with sibutramine (10 mg/kg/day) or 10 vehicle for 30 days. Sibutramine decreased final body weight, seminal vesicle, ventral 11 prostate and epididymal weights, as well as sperm reserves and sperm transit time in the 12 cauda epididymis. On the contrary of the in vitro pharmacological assays, in which 13 sibutramine was added directly to the bath containing strips of distal cauda epididymis, the 14 ductal contractility was not altered after in vivo sub-chronic exposure to sibutramine. 15 However, there is pharmacological evidence that the endogenous epididymal norepinephrine 16 reserves were reduced in these animals. It was also shown that the decrease in prostate weight 17 is, at least in part, related to increased contractility of the gland, due to sibutramine 18 sympathomimetic effects. Our results confirmed absence of disruption in sperm morphology 19 after sibutramine treatment, but showed reduced sperm quality after in utero artificial 20 insemination, a more sensitive procedure to assess fertility in rodents. The epididymal 21 norepinephrine depletion exerted by sibutramine, associated with decreases in sperm transit 22 time, quantity and quality, leading to reduced fertility in this experimental model, reinforces 23 the concerns about the possible impact on fertility of man taking sibutramine as well as other 24 non-selective serotonin-norepinephrine reuptake inhibitors, especially considering the lower 25 reproductive efficiency of humans compared to other males. 26 27 28 Key Words. sibutramine; male rats; sperm quality; fertility; epididymis, sympathomimetic 29 drugs, anorexigens, non-specific serotonin-norepinephrine uptake inhibitors, prostate 30 contractility 31 32 40 INTRODUCTION 1 2 The epididymis is an organ of the male reproductive tract formed by highly 3 convoluted duct that connects the efferent ducts to the vas deferens and performs a variety of 4 functions, including sperm transport, maturation, protection, concentration and storage [1]. 5 This organ plays an important role in the acquisition of progressive sperm motility and fertile 6 ability. Alterations on the sperm transit time through the epididymis may compromise the 7 sperm maturation process, which is modulated by androgens and contractile activity of 8 epididymal smooth muscle layers [2,3,4]. The rat epididymis receives sympathetic and 9 parasympathetic autonomic innervations from hypogastric and pelvic nerves, respectively 10 [5,6]. The contractions of the epididymal cauda induced by norepinephrine (NE) released by 11 sympathetic nerve stimulation occur via activation of α1-AR [7]. 12 Another organ that receives sympathetic and parasympathetic autonomic innervation 13 is the prostate. This accessory organ of the male reproductive tract has as main function to 14 produce an alkaline secretion that composes the seminal fluid, improving sperm fertility 15 potential and motility. The sympathetic stimulation (noradrenergic), via activation of α1-AR, 16 contracts the prostatic smooth muscle cells releasing prostatic secretions into the urethra [8]. 17 Since the sympathetic innervation is necessary for the structural and functional 18 integrity of the epididymis and prostate, the exposure to drugs that acts on the nervous 19 system, with known effects on the peripheral nervous system, could impair the morpho-20 physiology of these reproductive organs [9,10,11,12]. 21 Sibutramine, an appetite suppressant administered orally for obesity treatment [13], 22 acts on the central nervous system as a non-selective serotonin-NE reuptake inhibitor, with 23 subsequent activation of adrenoceptors, especially α1-adrenoceptors (α1-ARs) [14,15,16]. The 24 anorexigenic activity of sibutramine promotes increase in energy expenditure and induction of 25 peripheral sympathomimetic effects [17,18], such as on the cardiovascular system [19] and on 26 male reproduction [20]. Abnormal ejaculation was observed in rats, as well as an increased 27 sensitivity to NE induced by the activation of the α1-ARs in tissues such as vas deferens and 28 seminal vesicles, resulting in an increased contractile activity [12]. In addition, sibutramine 29 promoted an acceleration of sperm transit time in epididymal cauda due to its 30 sympathomimetic effects [20]. 31 Therefore, the aim of the present work was to further evaluate sibutramine effects, a 32 serotonin-NE reuptake inhibitor, on the contractility of the epididymis and prostate, and its 33 impact on sperm quality and fertility of adult male rats. 34 41 MATERIAL AND METHODS 1 Animals 2 Male (110 days old/ 490-540 g) and female (70 days old/220-270 g) Wistar rats were 3 obtained from the Central Biotherium of UNESP – Univ Estadual Paulista, and maintained 4 under controlled conditions (25°C, 30% air humidity, 12/12-h light/dark cycle) with food and 5 water available ad libitum. 6 The male rats were randomly allocated into two groups: control, consisted of rats that 7 were treated by gavage with the vehicle solution (33.3% dimethylsulfoxide and 66.7% saline), 8 and treated, consisted of rats that were administered with sibutramine (10 mg/kg/day) in 9 vehicle solution by gavage for 30 days. 10 The experimental procedures were approved by the local Ethics Committee for the 11 Use of Experimental Animals (protocol number 248-CEEA) and are in accordance with the 12 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Institutes of Health). 13 14 Drugs and Solutions 15 Drugs were obtained from the following sources: sibutramine hydrochloride 16 monohydrate from Deg (Jiangyin Eas, China); methoxamine hydrochloride, nifedipine and 17 norepinephrine ((L)-(-)-NE bitartrate salt monohydrate) and dimethylsulphoxide (DMSO) 18 from Sigma (St. Louis, MO, USA). 19 Sibutramine was diluted in 33.3% dimethylsulfoxide and 66.7% saline and 20 administered once a day. This dose was chosen as the minimum anorectic dose in this 21 experimental model. The study was conducted in two steps, Experiment 1 and Experiment 2, 22 and described as follows. 23 24 Experiment 1: Reproductive organ weights, serum hormone levels, sperm parameters, 25 fertility assessment 26 Adult male rats (n=8) were treated with 10 mg/kg/day of sibutramine as described 27 previously. The respective control animals (n=8) received only vehicle. Additionally, 10 28 male rats (110 days old) and 28 female (70 days old) were used in the fertility procedures. 29 30 Body and reproductive organs weights 31 The animals were weighed and euthanized by decapitation on the day after the end of 32 treatment. The right testis, epididymis, vas deferens, ventral prostate, and seminal vesicle 33 (without the coagulating gland) were removed and their weights recorded. 34 42 Hormonal measurements 1 After decapitation, blood was collected (between 9:00 and 11:30 AM) and serum was 2 obtained by centrifugation (1236 × g, for 20 min at 4 °C). The concentrations of testosterone, 3 luteinizing hormone (LH) and follicle-stimulating hormone (FSH) were determined by the 4 technique of double antibody radioimmunoassay. Testosterone assay was performed using a 5 TESTOSTERONE MAIA ® kit (Biochem Immuno System). The LH and FSH assays were 6 done using specific kits supplied by the National Institute of Arthritis, Diabetes and Kidney 7 Diseases (NIADDK, USA). All samples were assayed in duplicate and in the same assay to 8 avoid inter-assay errors. The intra-assay error was 3.4% for LH, 2.8% for FSH and 4% for 9 testosterone. 10 11 Sperm counts, daily sperm production, and sperm transit time through the epididymis 12 Homogenization-resistant testicular spermatids (stage 19 of spermiogenesis) in the 13 testis were counted as described previously [21], with adaptations adopted by Fernandes et al. 14 [3]. Briefly, the testis, decapsulated and weighed soon after collection, was homogenized in 5 15 ml of NaCl 0.9% containing Triton X 100 0.5%, followed by sonication for 30 s. After a 10-16 fold dilution, one sample was transferred to Neubauer chambers (4 fields per animal), and 17 mature spermatids were counted. To calculate the daily sperm production (DSP), the number 18 of spermatids at stage 19 was divided by 6.1, which is the number of days of the seminiferous 19 cycle during which these spermatids are present in the seminiferous epithelium. In the same 20 manner, caput/corpus and cauda epididymidis were cut into small fragments with scissors and 21 homogenized, and sperm counted as described for the testis. The sperm transit time through 22 the epididymis was determined by dividing the number of sperm in each portion by DSP. 23 24 Fertility assessment 25 For this, in utero artificial insemination was used [22,23,24,25,26]. In brief, females in 26 LHRH-induced proestrus were paired with sexually experienced, vasectomized males for 1 27 hour. Receptive females were selected for the insemination procedure. Eight male rats per 28 group were used for sperm isolation as described elsewhere. Briefly, the sperm were released 29 from the proximal epididymal cauda, first site where fertile sperm is encountered in the rat, by 30 nicking the duct and collecting the sperm in 2 mL of modified human tubular fluid (HTF) 31 medium (Irvine Scientific). After a 10-fold dilution, sperm were counted and each uterine 32 horn was injected with a volume containing 5 x 10 6 sperm [27]. One female was inseminated 33 per male and when insemination was completed, the abdominal musculature was sutured. 34 43 Twenty days later, the females were euthanized by decapitation to enable fertility 1 evaluation. After collection of the uterus and ovaries the numbers of corpora lutea, implants 2 and reabsorptions were recorded and the following endpoints determined: fertility potential 3 (efficiency of implantation): implantation sites/corpora lutea × 100; rate of pre-implantation 4 loss: (number of corpora lutea−number of implantations/number of corpora lutea) ×100; rate 5 of post-implantation loss: (number of implantations – number of live fetuses)/number of 6 implantations ×100. 7 8 Sperm motility 9 Sperm motility was evaluated in the same sperm sample used for AI. For this, an 10 aliquot of 10μL of sperm suspensions was immediately transferred to a Makler chamber 11 maintained at 34 o C. Using a phase-contrast microscope (400 x magnification), 100 sperm 12 were counted and classified as Type A (mobile with progressive movement) Type B (mobile 13 without progressive movement) and Type C (immobile). 14 15 Sperm morphology 16 An aliquot of 100 µl from the same sample used for AI was added to 900 µl of formol 17 saline. To analyze sperm morphologically, smears were prepared on histological slides that 18 were left to dry for 90 min and 200 spermatozoa per animal were analyzed in a phase-contrast 19 microscope (400 × magnification). Morphological abnormalities were classified into two 20 general categories: head morphology (without curvature, without characteristic curvature, pin 21 head or isolated form, i.e., no tail attached) and tail morphology (broken or rolled into a 22 spiral) [28]. Sperm were also classified as to the presence or absence of the cytoplasmic 23 droplet. 24 25 Experiment 2: Pharmacological reactivity of the epididymal duct and prostate 26 In this experiment, 34 adult male Wistar rats (110 days old) were used. Twenty-two 27 rats were allocated into two experimental groups: Control and Sibutramine, following the 28 same experimental design described in Experiment 1 and used for the evaluation of isolated 29 distal cauda epididymis duct contractions after in vivo treatment. 30 Seven non-treated male rats were used for the evaluation of the effect of in vitro 31 sibutramine administration on the contraction of epididymal duct and 5 non-treated male rats 32 were used for the ventral prostate contraction in vivo. 33 34 44 Distal cauda epididymis isolation 1 The animals were killed by decapitation the whole epididymis was carefully excised 2 and strips from the distal cauda epididymis were dissected to record of isometric contractions 3 as previously described [20]. After a 30 minutes stabilization period, the tissues were 4 repeatedly challenged with 80 mM KCl to evaluate tissue viability and maximal response 5 stabilization. 6 7 Distal cauda epididymis contractions induced by sibutramine in vitro 8 After mounting and stabilization of the tissues a concentration-response curve to NE 9 was obtained by the cumulative addition of the agonist to the organ bath and this curve was 10 taken as control curve. New concentration-response curves to NE were obtained in the 11 presence of sibutramine (1, 3, and 7 µM) incubated for at least 30 minutes with the tissues and 12 the maximal tension developed (Emax, in millinewtons - mN) and the potency of NE in 13 inducing contractions of epididymal duct (expressed as pEC50, the –log of NE concentration 14 inducing 50% of maximal response) were evaluated. 15 The dependence of the effects of sibutramine on the cauda epididymis contraction on 16 the neuronal NE reuptake system was investigated. To this end, the effect of sibutramine (3 17 µM) on the concentration-response curves to methoxamine, a 1-ARs-selective agonist that is 18 a poor substrate for the neuronal NE reuptake system [29], was investigated. Contractions in 19 the presence of sibutramine were normalized to the maximal contractions of control curves. In 20 addition, as sibutramine per se induced contractions of cauda epididymal duct, contractions 21 induced by sibutramine were recorded in the presence of nifedipine (300nM) to investigate 22 the dependence on the extracellular calcium influx through L-type voltage-dependent calcium 23 channels. The sum of any phasic or tonic activity in 5 minutes (mN) was evaluated. 24 25 Ex vivo assay: In vitro contractions of the isolated distal cauda epididymal duct of animals 26 treated with sibutramine or vehicle in vivo 27 The animals were weighed and euthanized by decapitation 24 hours after the last 28 sibutramine administration. Strips from distal cauda epididymis from 8 animals/group were 29 prepared for the in vitro contraction recording as described above. After the stabilization 30 period and challenge with 80 mM KCl a cumulative concentration–response curve to NE was 31 obtained and the maximal contraction (Emax) and the potency of NE in inducing contractions 32 of epididymal duct (pEC50) were evaluated. Another new concentration-response curve to NE 33 45 was constructed in the presence of 6 µM cocaine to evaluate the functioning of neuronal NE 1 reuptake system. 2 In addition, strips of cauda epididymis from 3 rats/group were isolated and mounted as 3 described above. Concentration-response curves to tyramine, an amine that releases 4 intravesicular NE from the sympathetic nerve terminals [30,31], were evaluated. To ascertain 5 whether the endogenous NE pool in the cauda epididymis was different between vehicle and 6 sibutramine-treated rats the magnitude of antagonism of the 1-AR competitive antagonist 7 prazosin (10nM) was evaluated. 8 9 In vivo contraction of ventral prostate 10 The in vivo prostate contraction was evaluated as described by Kontani & Shiraoya 11 [32]. Adult male rats (120 days old, 500 g weight) were anesthetized with urethane (1.5 g/kg, 12 sc) and the prostate ventral lobes were tied with a cotton thread and attached to an isometric 13 force transducer under 9.8mN resting tension. The right jugular vein was catheterized with 14 poliethylene tubing (PE10 connected to PE50) to intravenous drug administration and the 15 body temperature was maintained by a heating lamp. After a 30 minutes stabilization period a 16 cumulative dose-response curve to NE (0.1-10 µg/kg) was constructed by intravenous 17 administration of NE and this curve was considered as a control curve as preliminary 18 experiments showed that at least three consecutive concentration–response curves are similar 19 in respect to sensitivity and maximal response. A new dose response curve to NE was 20 repeated 30 minutes after the control curve in the presence of sibutramine 5 mg/kg 21 intravenously administrated 15 minutes before the curve construction. The tension developed 22 (mN) were evaluated. 23 24 Statistical analysis 25 Data are presented as mean ± standard error of mean (SEM) or median and interquartil 26 range. Student’s t-test or ANOVA followed by Dunnet were used for comparison of 27 parametric variables. Nonparametric variables were compared by Mann-Whitney test or 28 Kruskal-Wallis followed by Dunn test. Spearman “r” coefficient was calculated to investigate 29 possible correlations between fertility potential and sperm motility. Differences were 30 considered significant when p < 0.05. The statistical analyses were performed by GraphPad 31 InStat (version 5). 32 33 46 RESULTS 1 2 Experiment 1: 3 At the end of the experiment sibutramine-treated rats showed significant reductions in 4 body weight, as well as reductions in the weights of the epididymis, ventral prostate and 5 seminal vesicle (Table 1). 6 There were no significant differences in serum levels of testosterone, LH, or FSH, nor 7 in the percentages of morphologically normal sperm between groups (data not shown). On the 8 other hand, sibutramine exposure lead to a significant reduction in sperm reserves and transit 9 time in the epididymal cauda (Table 2). 10 Fertility and sperm quality of proximal cauda epididymis sperm, assessed by in utero 11 insemination, was significantly reduced by sibutramine exposure as shown by the significant 12 reductions in fertility potential and pre-implantation loss rate (Table 3). Sperm motility and 13 fertility potential were positively correlated (p < 0.01) (Figure 1). 14 15 Experiment 2: 16 The tension developed (contractile activity sum) by the distal cauda epididymis duct 17 increased (p< 0.05) in the presence of different in vitro sibutramine concentrations (1, 3 and 7 18 µM) (Figure 2A). These contractions were abolished in the presence of nifedipine, a high 19 affinity L-type calcium channel blocker (Figure 2B). 20 In the absence of sibutramine, NE induced concentration-dependent contractions of 21 the distal cauda epididymis duct registered a potency of pEC50 = 5.697 + 0.041. Incubation 22 with sibutramine 1, 3, and 7 µM increased the sensitivity of the distal cauda epididymis to NE 23 by approximately 8 (pEC50 = 6.580 + 0.069), 15 (pEC50 = 6.862 + 0.069), and 16-fold (pEC50 24 = 6.898 + 0.091), respectively. This increased sensitivity (p < 0.05) is shown by a leftward 25 shift in the concentration-response curve to NE (Figure 3A). In addition, sibutramine 7 µM 26 reduced the maximal contractions induced by NE by approximately 29% (p < 0.001). 27 To examine whether the increase in NE-induced contractions of epididymal duct by in 28 vitro sibutramine would be ascribed to the blocking of neuronal NE reuptake system, the 29 effects of 3 µM sibutramine (effective contraction-dependent concentration by NE) were 30 investigated against contractions of epididymal duct induced by the 1-ARs agonist 31 methoxamine. No changes were observed on the maximal contractile response or in the 32 potency of methoxamine-induced contractions of epididymal duct (pEC50 control curve = 33 5.590 + 0.071; pEC50 sibutramine 3 µM= 5.802 + 0.086, p>0.05) (Figure 3B). 34 47 Cumulative intravenous administration of NE induced dose-dependent contractions in 1 the ventral prostate of rats. After administration of 5 mg/kg sibutramine the NE dose-response 2 curve was displaced leftward by approximately 3-fold due to increase in the contractions 3 induced by NE 1 and 3 µg/kg (Figure 4). 4 The concentration-response curve to NE from control group (pEC50 = 6.128 + 0.059) 5 was similar to in vivo sibutramine treated rats (pEC50 = 6.170 + 0.057) (Figure 5A). Curves to 6 NE obtained in the presence of 6 µM cocaine in tissues from rats from both groups were 7 similar showing that the functioning of the neuronal NE reuptake system was not modified 8 (Figura 5A). 9 There was no difference in the potency between the control (pEC50 = 4.520 + 0.107) 10 and the sibutramine-treated group (pEC50 = 4.577 + 0.282) (Figure 5B) in the concentration-11 dependent contractions induced by tyramine., However, the Emax decreased (p < 0.05) in the 12 treated group (Figure 5B). Interestingly, the maximal response induced by tyramine in the 13 cauda epididymis from sibutramine-treated rats, but not from control rats, was increased when 14 a new concentration-response curve to tyramine was repeated 30 minutes after a 15 concentration-response to NE. Consequently, the difference between the maximal response to 16 tyramine in the cauda epididymis from vehicle and sibutramine-treated rats was reduced 17 (Figure 5C). These results suggest that the endogenous NE reserve in the cauda epididymis 18 from sibutramine-treated rats is reduced. 19 Figure 6 shows that prazosin, a 1-ARs competitive antagonist, was approximately 3-20 fold more potent against NE-induced contractions in the epididymal cauda from sibutramine-21 treated rats than in the vehicle-treated rats. 22 23 48 DISCUSSION 1 Currently, there are some reports in the literature on the direct and indirect effects of 2 sympathomimetic drugs on reproductive organs [12,20,33,34,35,36], however there are no 3 extensive studies on the mechanisms involved. In this study, we report pharmacological 4 mechanisms by means sibutramine, a serotonin-NE reuptake inhibitor, promotes increased 5 sensitivity to NE in the rat epididymal duct and ventral prostate and promotes NE depletion in 6 the epididymis. These alterations were accompanied by reduced sperm quality and fertility. 7 Sibutramine inhibits the presynaptic reuptake of monoaminergic neurotransmitters in 8 the central nervous system and this inhibition promotes appetite suppression and weight loss 9 [18]. Thus, the reduction of body weight of the animals treated with sibutramine confirms the 10 efficiency of this anorexigenic drug. However, it is known that increasing anorexigenic 11 activity promotes increase in energy expenditure and induction of peripheral 12 sympathomimetic effects such as blood pressure increased and other effects on different 13 systems [18]. 14 The determination of absolute and relative weights of organs provides important 15 parameters for assessing the risk of toxicity on the male genital system [3,37]. In the present 16 study there was a reduction in the absolute and relative weights of the ventral prostate and the 17 absolute weight of seminal vesicle and epididymis. It is known that the autonomic nervous 18 system plays an important role in growth, maturation and secretory function of the prostate, 19 an androgen-dependent gland [38] and prostatic fluid release is modulated by the action of 20 sympathetic fibers through stimulation of α1-ARs [8,39,40]. As the testosterone levels of 21 sibutramine-treated rats were not changed, the reduction of ventral prostate weight of 22 sibutramine-treated animals may be due to the sympathomimetic effect of this drug 23 [16,41,42]. This hypothesis was supported by our results showing that the in vivo prostate 24 contractions induced by NE were increased by sibutramine. As the seminal vesicle also 25 receives a dense sympathetic innervations, it is very likely that the same mechanism was 26 responsible for the decrease in the weight of this organ. [12]. The reduction in epididymis 27 weight may be due to the observed reduction in sperm reserves provoked by sperm transit 28 time acceleration, as a result of the increased sensitivity of the epididymal duct as shown by 29 the results of the pharmacological assays, as described below. 30 Sperm transit time through the epididymis plays an important role in post-testicular 31 sperm maturation. The sympathetic innervation, mainly mediated by activation of α1-ARs, is 32 associated with smooth muscle layer of the epididymal cauda, whose contractions mediates 33 sperm passage through the epididymis [2,5,6]. Thus, drugs acting on the sympathetic system 34 49 or directly on the contractile activity of the epididymis, have an important impact on sperm 1 transit time [23,43,44]. The present study corroborates previous works showing that an 2 acceleration of sperm transit time in the cauda epididymis, as registered in sibutramine-treated 3 rats, reduces sperm quality and fertility [3,20,24,25]. 4 In the present work, sibutramine per se induced contraction of epididymal duct and 5 increased potency of the NE-induced contractions of this duct. The increase in the mechanical 6 activity of the distal cauda epididymis was abolished in the presence of nifedipine, a specific 7 L-type calcium channel blocker [45]. As previous studies showed that sibutramine blocks 8 voltage-dependent K+ channel [12,20,36,46,47] it is possible that the resulting membrane 9 depolarization opens L-type calcium channels, influx of extracellular calcium and contraction. 10 The increased sensitivity of epididymal duct to NE can be explained by neuronal 11 reuptake block promoted by sibutramine [19]. This hypothesis is substantiated by our results 12 showing that sibutramine increased the potency of contractions induced by NE, but not those 13 induced by methoxamine, a selective α1-adrenoceptor agonist that is not captured by the 14 neuronal uptake system [48]. Thus, NE reuptake inhibition by sibutramine is the main 15 mechanism that increases the sensitivity of the epididymal cauda duct to this neurotransmiter. 16 Interestingly, the contractions of epididymal duct isolated from sibutramine-treated 17 rats to exogenous noradrenaline were not changed. This could be due to the in vivo drug 18 metabolism, as the epididymal duct was isolated for the pharmacological reactivity 24 hours 19 after the last sibutramine administration. In addition, the nutrient solution changes during the 20 stabilization period in vitro may have removed all or part of the sibutramine in contact with 21 the epididymal duct. Despite of unaltered epididymal duct maximal tension, sibutramine sub-22 chronic treatment reduced epididymal cauda endogenous NE reserves, as shown by the 23 reduced contraction of epididymal duct to tyramine, an amine that induces the release of NE 24 stored in presynaptic vesicle [30,31,49]. This was reinforced by the recovery of tyramine-25 induced maximal contractions after the addition of exogenous NE. In addition, prazosin, a 26 competitive α1-AR antagonist, inhibited the contractions induced by tyramine [50]. 27 Altogether, the pharmacological assays showed that sibutramine, in this experimental 28 design, acts through independent mechanisms in the epididymal duct: inducing NE reserves 29 depletion in the epididymal pre-synaptic ends and increase smooth cells sensitivity to this 30 neurotransmitter. 31 In a previous work from our laboratory rat fertility, assessed by natural mating, did not 32 alter after sibutramine-treatment, despite a significant decrease in cauda epididymis reserves 33 [20]. Since rodents produce an excess of qualitatively normal sperm [26], it was necessary to 34 50 use a technique to increase the sensitivity of the fertility test and obtain information on sperm 1 quality. Moreover, this technique excludes the interference of factors such as changes altered 2 sexual behavior pattern and reduction in ejaculated sperm numbers [3,24,25]. In the present 3 work, fertility potential and the pre-implantation loss, complementary endpoints, were altered 4 after sibutramine-treatment, suggesting that the acceleration of sperm transit time impaired 5 sperm maturation in the epididymis, decreasing sperm quality and, consequently, fertility 6 [3,4]. Interestingly, the discrete decrease in sperm motility in the treated group was positively 7 correlated with fertility results, [51]. 8 In conclusion, our results confirm that adult rats subchronically exposed to 9 sibutramine present a significant reduction in epididymal sperm reserves, acceleration of 10 sperm transit time, and increased epididymal duct sensitivity to NE. In utero artificial 11 insemination revealed detrimental effects of sibutramine on fertility and sperm quality. A 12 plethora of pharmacological reactivity assays of cauda epididymis duct and ventral prostate, 13 detailed described and validated, showed that epididymal norepinephrine depletion exerted by 14 sibutramine, associated with decreases in sperm transit time, quantity and quality, leading to 15 reduced fertility, reinforces the concerns about the possible impact on fertility of man taking 16 sibutramine as well as other non-selective serotonin-norepinephrine reuptake inhibitors, 17 especially considering the lower reproductive efficiency of humans compared to other males. 18 Additional investigations on the epididymal duct contractility and fertility after longer 19 periods of sibutramine and the possible recovery after treatment withdrawn are encouraged. 20 21 51 ACKNOWLEDGEMENTS 1 We are grateful to Dr. Janete Anselmo-Franci and to Ruither de Oliveira Gomes 2 Carolino of the Department of Morphology, Stomatology and Physiology, Dental School of 3 Ribeirão Preto, University of São Paulo – USP, for the collaboration with the hormonal 4 assays, to Dr. Adriana Lúcia Mendes endocrinologist of the Department of Clinical Medicine, 5 Medicine School of Botucatu, São Paulo State University – UNESP, for the collaboration 6 with the sibutramine prescription, and to José Eduardo Bozano, assisting academic support, 7 of the Department of Morphology, Institute of Biosciences, São Paulo State University – 8 UNESP, for the collaboration and assistance throughout the project. We are also grateful to 9 FAPESP (Research Foundation of the State of São Paulo, (Process number 2010/13948-4) 10 and CNPq National Council for Scientific and Technological Development) for financial 11 support. 12 13 52 AUTHOR CONTRIBUTIONS 1 Conceived and designed the experiments: CSB, ESAP, LRAK, WGK. Performed the 2 experiments: CSB, GM, MS, RFS, TPB, ESAP, LRAK, JEP. Analyzed the data: CSB, GM, 3 ESAP, LRAK, WGK. Contributed with reagents/materials/analysis tools: WGK, ASP. Wrote 4 the paper: CSB, ESAP, LRAK, WGK. Pharmacological assays: CSB, GM, ESAP, LRAK. 5 6 53 REFERENCES 1 1. Robaire B HB, Orgebin-Crist MC. (2006) The epididymis. In: Elsevier, editor. Knobil and Neill's Physiology 2 of Reproduction: Neill JD. pp. 1071- 1148. 3 2. Sujarit S, Pholpramool C (1985) Enhancement of sperm transport through the rat epididymis after castration. J 4 Reprod Fertil 74: 497-502. 5 3. 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A: Tension developed in 5 min in the absence and presence of increasing concentrations 12 of sibutramine. The data are expressed as the mean + SEM. **p <0.01, *p<0.05 vs control 13 (ANOVA followed by Dunnett test). B: Tension developed in 5 min in the presence of 14 sibutramine 3 µM and nifedipine 300 nM. Data are expressed as the mean + SEM. **p<0.01 15 vs control (Student's t- test). 16 17 Figure 3 - In vitro sibutramine administration increases the potency of NE-induced 18 contractions of cauda epididymis duct. A: Concentration-response curves to NE in the 19 absence and presence of increasing concentrations of sibutramine in the cauda epididymis. B: 20 Concentration-response curves to methoxamine in the absence and presence of sibutramine 21 3µM in the cauda epididymis. A-B: The data are expressed as the mean + SEM. Values of 22 pEC50 were different between NE curves, but not methoxamine curves (ANOVA, followed by 23 Dunnett). 24 25 Figure 4 - In vivo prostate contraction to NE is increased by acute sibutramine 26 administration. Dose-response curves to NE in the ventral prostate before (open symbols) 27 and after (closed symbols) intravenous sibutramine 5 mg.kg -1 administration. The data are 28 expressed as the mean + SEM from 4 rats. * p < 0.05 versus contraction induced by the same 29 NE dose before sibutramine administration (Student's t- test). 30 31 32 33 56 Figure 5 - In vivo sibutramine administration decreases the tyramine-induced 1 contractions of epididymal cauda duct. A: Concentration-response curves to NE in control 2 and sibutramine-treated rats in the absence and in the presence of cocaine 6 µM. B: 3 Concentration-response curves to tyramine in control and sibutramine-treated rats. A-B: The 4 data are expressed as mean + SEM. Values of pEC50 were not different between curves 5 (Student's t- test). C: Maximal response (Emax) to tyramine before and after concentration-6 response curve to NE (nor.). The data are expressed as the mean + SEM. *p <> 0.05 7 (Student's t- test). 8 9 Figure 6 – In vivo sibutramine administration increases the potency of prazosin-induced 10 antagonism of epididymal contraction to tyramine. Concentration-reponse curves to 11 tyramine in the absence and presence of prazosin 10nM in the cauda epididymis from vehicle 12 (A) and sibutramine (B) treated rats. Numbers under the arrows indicate the reduction in the 13 potency of tyramine-induced contraction of epididymal segments evaluated at 37% of 14 maximal response of control curves of both groups. Data are mean±sem of tissues from 3 15 rats/group. 16 17 57 TABLE 1 1 Final body weight and absolute and relative reproductive organ weights. Parameters Control (n=8) Sibutramine (n=8) Final body weight (g) 486.55 + 14.59 423.34 + 11.50 * Testis (g) 1.99 + 0.05 1.88 + 0.04 Testis (g/100g) 0.41 + 0.02 0.45 + 0.02 Epididymis (mg) 573.49 + 15.81 511.06 + 11.81* Epididymis (mg/100g) 118.87 + 4.95 121.45 + 4.17 Ventral prostate (mg) 467.24 + 27.51 295.57 + 19.88 * Ventral prostate (mg/100g) 96.31 + 5.63 69.63 + 3.95 * Seminal vesicle (mg) 1050.60 + 57.93 868.16 + 56.08 * Seminal vesicle (mg/100g) 216.67 + 11.34 203.90 + 10.06 Values expressed as mean + SEM. * p<0.05 (Student's t- test). 2 58 TABLE 2 1 Sperm counts and transit time. Parameters Experimental groups Control (n=8) Sibutramine (n=8) Sperm count in the testis Mature spermatids number (x10 6 /testis) 259.39 + 12.74 260.68 + 13.76 Relative spermatids number (x10 6 /g/testis) 159.11 + 3.96 154.16 + 4.94 Daily sperm production (x10 6 /testis/day) 42.52 + 2.09 42.73 + 2.26 Relative daily sperm production (x10 6 /testis/g/day) 26.08 + 0.65 25.27 + 0.81 Sperm count in the epididymis Caput/ corpus Sperm number (x10 6 /organ) 113.83 + 11.02 119.42 + 10.49 Relative sperm number (x10 6 /g/organ) 400.85 + 24.59 401.57 + 30.83 Sperm transit time (days) 2.66 + 0.16 2.77 + 0.14 Cauda Sperm number (x10 6 /organ) 295.63 + 15.80 174.68 + 7.11* Relative sperm number (x10 6 /g/organ) 1196.9 + 61.00 1003.4 + 83.34 Sperm transit time (days) 7.04 + 0.48 4.16 + 0.26* Values are expressed as mean + SEM. * p< 0.05 (Student's t- test). 2 59 TABLE 3 1 Fertility assessment after in utero artificial insemination. Parameters Experimental groups Control (n=7) Sibutramine (n=7) Pregnancy rate (%) 72 72 1 Fertility potencial (%) 88.89 (65.91- 100.00) 40.00 (22.72 - 72.44) * 1 Pre-implantation loss (%) 11.11 (0.00 - 34.09) 60.00 (24.84 - 77.27) * 1 Post-implantation loss (%) 8.33 (0.00 - 68.75) 15.38 (7.00 - 62.50) 2 Body weight of dams (g) 320.32+23.88 338.38+22.20 2 Uterus weight with fetuses (g) 37.82+11.73 24.88+8.40 2 Corpora lutea number 9.85+1.59 11.60+0.87 2 Implantation number 8.81+1.93 5.80+2.03 2 Number of live fetuses 7.60+2.31 4.80+1.82 2 Fetus weight (g) 2.57+0.53 2.56+0.53 1 Values expressed as median and interquartile intervals. *p< 0.05 (Mann- Whitney test). 2 Values expressed as mean + SEM. (Student's t- test). 2 3 60 FIGURE 1 1 2 Control Sibutramine 0 20 40 60 80 100 62.0 (57.4 - 68.5) 53.0 (48.5 - 63.5) M o ti lit y ( % ) T y p e A Control Sibutramine 0 20 40 60 80 100 20.0 (17.0 - 23.5) 22.0 (17.0 - 24.5) M o ti lit y ( % ) T y p e B Control Sibutramine 0 20 40 60 80 100 17.0 (12.5 - 24.7) 24.0 (18.0 - 26.0) M o ti lit y ( % ) T y p e C 40 50 60 70 80 0 20 40 60 80 100 R2 = 0.7744 P = 0.0105 Motility (%) F e rt ili ty p o te n ti a l (% ) A B DC 61 FIGURE 2 1 2 0 1 3 7 0 25 50 75 100 ** * ** Sibutramine (M) T e n si o n d e v e lo p e d (m N .5 m in u te -1 ) A 0 3 3 0 100 200 300 ** (300 nM) + Nifedipine Sibutramine (M) T e n si o n d e v e lo p e d (m N .5 m in u te -1 ) B 62 FIGURE 3 1 2 -9 -8 -7 -6 -5 -4 0 25 50 75 100 0 (Control) 1 3 7 Sibutramine (M) Log [norepinephrine] M T e n si o n (% o f th e c o n tr o l) -8 -7 -6 -5 -4 -3 0 25 50 75 100 0 (Control) 3 Sibutramine (M) Log [methoxamine] M T e n si o n (% o f th e c o n tr o l) A B 63 FIGURE 4 1 2 -8 -7 -6 -5 -4 0 2 4 6 0 (Control) 5 Sibutramine (mg/kg, iv) * * Log [norepinephrine