ROSICLÉIA DA SILVA IDENTIFICAÇÃO E PREVALÊNCIA DE FUNGOS ASSOCIADOS À CULTURA DA MACADÂMIA Botucatu 2022 ROSICLÉIA DA SILVA IDENTIFICAÇÃO E PREVALÊNCIA DE FUNGOS ASSOCIADOS À CULTURA DA MACADÂMIA Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Agronômicas da Unesp Campus de Botucatu, para a obtenção do título mestre em Agronomia (Proteção de Plantas). Orientador: Prof. Dr. Bernardo de Almeida Halfeld Vieira Botucatu 2022 Sistema de geração automática de fichas catalográficas da Unesp. Biblioteca da Faculdade de Ciências Agronômicas, Botucatu. Dados fornecidos pelo autor(a). Essa ficha não pode ser modificada. S586i Silva, Rosicleia da Identificação e prevalência de fungos associados à cultura da macadâmia / Rosicleia da Silva. -- Botucatu, 2022 80 p. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista (Unesp), Faculdade de Ciências Agronômicas, Botucatu Orientador: Bernardo de Almeida Halfeld Vieira 1. Microrganismos fitopatogênicos. 2. Macadamia integrifolia. 3. Cladosporium xanthochromaticum. 4. Colletotrichum siamense. 5. Lasiodiplodia pseudotheobromae. I. Título. À minha mãe Antonia, às minhas irmãsVilanir e Rosana e aos meus sobrinhos Camila, Arthur, Denison Filho e Paula, Dedico. AGRADECIMENTOS A Deus por sempre me iluminar e manter minha fé, mesmo nos momentos mais difíceis. À minha mãe Antonia Valderina e às minhas irmãs Vilanir e Rosana por todo o amor e por sempre acreditarem no meu potencial. Aos meus sobrinhos Camila, Arthur, Denison Filho e Paula por tornarem a minha vida mais leve. À minha avó Josefa (in memorian) e ao meu pai Ronaldo (in memorian) por terem sido exemplo de força. À Faculdade de Ciências Agronômicas da Unesp (FCA), campus de Botucatu, especialmente ao Programa de Pós-Graduação em Agronomia (Proteção de Plantas) e aos docentes por todo o conhecimento compartilhado. Às amigas Mariane, Naiara, Jennifer, Larissa, Pamela, Rafa e Letícia por todos os momentos divertidos durante essa caminhada. À banca avaliadora pela disponibilidade e pelas correções sugeridas para a melhoria desta dissertação. Ao meu orientador, prof. Bernardo de Almeida Halfeld Vieira, pela orientação, por todo o profissionalismo, paciência, incentivo e confiança em realizar este trabalho. À prof.ª Kátia de Lima Nechet pela disponibilidade, atenção, sugestões e auxílio. À Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária - Embrapa Meio Ambiente por toda a infraestrutura disponibilizada. Às técnicas do Laboratório de Microbiologia Ambiental (LMA) Rosely, Neusa, Elke e Ana Carolina pela dedicação e carinho. Ao técnico Paulo e equipe pelo apoio na casa de vegetação do setor Campos Experimentais. À dona Rose e toda a equipe de auxiliares de limpeza. A todos os amigos do LMA pelas conversas e gargalhadas. Ao Valdeir pela amizade e ajuda em todas as etapas deste trabalho. À Gabriela pelo apoio e carinho. Ao estagiário do projeto, Murilo, pelo suporte na condução dos ensaios realizados. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001, e com o apoio da empresa QueenNut Macadamia pelo suporte técnico e financeiro por meio do projeto tipo III, SEG: 30.19.90.012.00.00, contrato FAPED/CNPMA/QUEENNUT, SAIC 21300.19/0072-1. RESUMO A macadâmia é uma noz originária das florestas tropicais e subtropicais da Austrália, e vem ganhando destaque devido a sua importância no setor alimentício e de cosméticos. A produção mundial é liderada pela África do Sul e Austrália. No Brasil, o estado de São Paulo é o maior produtor. Dada a importância dessa cultura em expansão e à escassez de informações referentes a problemas fitossanitários no Brasil, o presente trabalho teve como objetivos identificar os microrganismos associados e os fitopatogênicos à cultura da macadâmia, bem como definir as suas épocas de ocorrência, temperatura ideal de crescimento e sensibilidade a fungicidas. Os órgãos da planta com sintomas de doenças e/ou sinais de colonização fúngica foram coletados mensalmente, por três anos consecutivos (2019, 2020 e 2021) em áreas de cultivo de macadâmia, predominantemente, em Dois Córregos, SP. Isolados representativos com patogenicidade confirmada foram identificados por caracterização morfológica e molecular. Ensaios do efeito da temperatura no crescimento micelial de Cladosporium sp., utilizando as temperaturas 20-30 °C, e dos isolados Lasiodiplodia sp. e Colletotrichum sp. com as temperaturas 23-30 °C foram realizados bem como a sensibilidade desses isolados a seis fungicidas distintos. As principais doenças, seus agentes causais e época de prevalência foram: cancro do caule, causado por Lasiodiplodia pseudotheobromae (novembro a abril); seca do rácemo causada por Cladosporium xanthochromaticum (março a agosto) e podridão do fruto causada por Colletotrichum siamense (abril de 2021). Os fungos C. xanthochromaticum e C. siamense apresentaram melhor desenvolvimento a 23 °C e L. pseudotheobromae a 30 °C. Quanto aos fungicidas, hidróxido de cobre inibiu a germinação de C. xanthochromaticum; epoxiconazol + piraclostrobina, clorotalonil, azoxistrobina + ciproconazol e fluxapiroxade + piraclostrobina inibiram tanto C. xanthochromaticum, L. pseudotheobromae e C. siamense; e procimidona inibiu somente o crescimento de L. pseudotheobromae. Os três fungos associados às doenças na macadâmia são relatados pela primeira vez no Brasil, sendo o primeiro relato de C. xanthochromaticum e C. siamense como agentes causais da seca do rácemo e podridão do fruto em macadâmia, respectivamente. Palavras-chave: Macadamia integrifolia; Lasiodiplodia pseudotheobromae; Cladosporium xanthochromaticum; Colletotrichum siamense; epidemiologia. ABSTRACT Macadamia is a nut tree native to the tropical and subtropical forests of Australia and has been rising in prominence due to its importance in the food and cosmetics markets. South Africa and Australia are the world´s greatest producers of this nut, and in Brazil, São Paulo is the state with the largest national production. Given the importance of this expanding culture and the scarcity of information regarding phytosanitary problems in Brazil, the present work had the objectives of identifying the microorganisms associated and phytopathogenic to the macadamia culture, as well as defining their seasons of occurrence, the ideal temperature of growth and sensitivity to fungicides. Plant organs with disease symptoms and/or signs of fungal colonization were collected monthly, for three consecutive years (2019, 2020, and 2021) in macadamia growing areas, predominantly, in Dois Córregos, SP. Representative isolates with confirmed pathogenicity were identified by morphological and molecular characterization. Tests of the effect of temperature on mycelial growth of Cladosporium sp. using temperatures 20-30 °C, and of Lasiodiplodia sp. and Colletotrichum sp. isolates using temperatures 23-30 °C were performed as well as the sensitivity of these isolates to six different fungicides. The main diseases, their causal agents, and season of prevalence were stem canker, caused by Lasiodiplodia pseudotheobromae (November to April), raceme blight caused by Cladosporium xanthochromaticum (March to August), and husk rot caused by Colletotrichum siamense (April 2021). The fungi C. xanthochromaticum and C. siamense showed better development at 23 °C and L. pseudotheobromae at 30 °C. As for the fungicides, copper hydroxide inhibited the germination of C. xanthochromaticum, epoxiconazole + pyraclostrobin, chlorothalonil, azoxystrobin + cyproconazole, and fluxapyroxad + pyraclostrobin inhibited both C. xanthochromaticum, L. pseudotheobromae, and C. siamense, and procymidone inhibited only the growth of L. pseudotheobromae. The three fungi associated with diseases in macadamia are reported for the first time in Brazil, with the first report of C. xanthochromaticum and C. siamense as causal agents of raceme blight and husk rot in macadamia, respectively. Keywords: Macadamia integrifolia; Lasiodiplodia pseudotheobromae; Cladosporium xanthochromaticum; Colletotrichum siamense; epidemiology. SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 15 2 REVISÃO DE LITERATURA .............................................................................. 18 2.1 Macadâmia: origem e características botânicas ........................................ 18 2.2 Importância econômica ..................................................................................... 19 2.3 Principais doenças na macadâmia ................................................................ 21 2.3.1 Mancha da fruto ................................................................................................... 22 2.3.2 Podridão do fruto causada por Phomopsis sp. .......................................... 23 2.3.3 Podridão do fruto causada por Colletotrichum sp. ................................... 24 2.3.4 Seca do rácemo ................................................................................................... 25 2.3.5 Seca do rácemo causada por Cladosporium sp. ....................................... 26 2.3.6 Cancro do caule causado por Phytophthora sp. ........................................ 27 2.3.7 Cancro do caule causado por Lasiodiplodia sp. ........................................ 28 3 MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................... 29 3.1 Local de obtenção dos isolados ..................................................................... 29 3.2 Isolamento dos possíveis fitopatógenos associados .............................. 29 3.3 Obtenção de culturas monospóricas ............................................................ 30 3.4 Caracterização cultural e morfológica .......................................................... 31 3.5 Testes de patogenicidade ................................................................................. 32 3.5.1 Em rácemos destacados em laboratório ...................................................... 32 3.5.2 Em rácemos em campo ..................................................................................... 33 3.5.3 Em folhas .............................................................................................................. 35 3.5.4 Em caule ................................................................................................................ 35 3.5.5 Em fruto ................................................................................................................. 36 3.6 Identificação molecular ..................................................................................... 37 3.6.1 Obtenção de massa micelial ............................................................................ 37 3.6.2 Extração de DNA ................................................................................................. 38 3.6.3 Reação em Cadeia da Polimerase - PCR ...................................................... 38 3.6.4 Análise filogenética ............................................................................................ 40 3.7 Ensaio de sensibilidade a fungicidas ............................................................ 40 3.8 Determinação da temperatura ideal de crescimento ................................ 41 4 RESULTADOS ...................................................................................................... 43 4.1 Isolados obtidos e suas épocas de ocorrência .......................................... 43 4.2 Teste de patogenicidade ................................................................................... 46 4.2.1 Em rácemos destacados em laboratório ...................................................... 46 4.2.2 Em rácemos em campo ..................................................................................... 47 4.2.3 Em folhas ............................................................................................................... 49 4.2.4 Em caule................................................................................................................. 49 4.2.5 Em frutos ............................................................................................................... 50 4.3 Caracterização cultural e morfológica ........................................................... 51 4.4 Análise filogenética............................................................................................. 53 4.5 Sensibilidade de isolados a fungicidas ......................................................... 59 4.6 Temperatura ideal de crescimento ................................................................. 61 5 DISCUSSÃO .......................................................................................................... 63 6 CONCLUSÕES ...................................................................................................... 70 REFERÊNCIAS ..................................................................................................... 71 15 1 INTRODUÇÃO Espécies de macadâmia (Macadamia integrifolia, M. tetraphylla e híbridos) são nativas da Austrália, e cultivadas em regiões tropicais e subtropicais pelo mundo, devido às suas nozes comestíveis, com alto teor de óleo (TRUEMAN, 2013). É uma planta perene cuja produção média de frutos, quando adulta, é de 8 kg a 13 kg e possui vários usos, como: noz inteira, noz triturada como ingrediente alimentar (biscoito, bolo ou sorvete, etc.) e óleo vegetal de cozinha (AZAD et al., 2017). A produção mundial é liderada pela África do Sul e Austrália que contabilizaram 29% e 22% da participação mundial em 2019, respectivamente. Acompanhando o ritmo de crescimento observado nos últimos 10 anos, safras de 2019 foram aumentando em comparação com a temporada anterior na maioria dos países produtores, tais como: Guatemala, Vietnã, Brasil, Malawi, China e Quênia (INC, 2020). No Brasil, a macadâmia encontrou condições favoráveis para seu cultivo nos estados de São Paulo, Rio de Janeiro, sul de Minas Gerais, Espírito Santo, Bahia, leste do Mato Grosso do Sul e oeste do Paraná (SCHNEIDER et al., 2012). O estado de São Paulo é o maior produtor nacional cuja maioria dos produtores de noz macadâmia pertence à Associação Brasileira de Noz Macadâmia (ABM) fundada no ano de 1991. Grande parte da produção do estado é vendida para a beneficiadora QueenNut Macadamia, localizada no município de Dois Córregos-SP (SOBIERAJSKI et al., 2006; PENONI, 2011). Os pomares de macadâmia no Brasil são considerados jovens. Os primeiros plantios comerciais surgiram em Limeira-SP entre 1976 e 1980 (TOLEDO PIZA; PIZA; ALMEIDA NETO, 2019). Em virtude disso, nas condições edafoclimáticas brasileiras, ainda são escassas as informações sobre ocorrência de doenças na cultura. Um dos poucos materiais a respeito é o informativo de Pesquisa & Tecnologia da APTA Regional, em que se menciona a incidência de antracnose causada pelo fungo Colletotrichum gloeosporioides, podridão radicular causada principalmente por Phytophthora cinnamomi, seca de flores em que se atribui associação com o fungo 16 Botrytis cinerea e mancha do fruto causada pelo fungo Pseudocercospora macadamiae (FISCHER; PERDONÁ; CRUZ, 2014). Apesar da ocorrência de alguns desses patógenos ser reportada em diversas culturas, não há comprovação formal da ocorrência desses organismos como agentes causais de doenças em plantas de macadâmia no país. Os únicos agentes etiológicos associados a essa nogueira no Brasil, reportados em veículo de comunicação científica, são os fungos Lasiodiplodia theobromae (Pat.) Griff. & Maubl, causando cancro no caule (FISCHER et al., 2017) e Neopestalotiopsis clavispora (G. F. Atkinson) Maharachch, K. D. Hyde & Crous, agente da mancha foliar (SANTOS et al., 2019). Essas doenças interferem não somente no desenvolvimento das plantas e redução da produção da macadâmia, como também na qualidade das nozes (FORTUNATO; DEBONA; RIOS, 2019). Por essa razão, são importantes estudos que caracterizem os agentes etiológicos que ocorrem na cultura no país, bem como medidas de manejo para tais, pois os agricultores que investem no cultivo dessa nogueira contam com poucos produtos registrados para a cultura. No Agrofit (2022), há somente quatro produtos registrados para a cultura da macadâmia – acibenzolar-S-metílico, fluxapiroxade + piraclostrobina, hidróxido de cobre e azoxistrobina + difenoconazol – indicados para o controle da antracnose (Colletotrichum gloesporioides) que, no Brasil, não tem comprovação formal de ocasionar doença à cultura. Assim, devido à escassez de trabalhos publicados sobre a etiologia de doenças em macadâmia no país, objetivou-se identificar os principais patógenos na cultura e suas épocas de ocorrência em plantios de macadâmia em Dois Córregos- SP e entorno, além de fornecer subsídios básicos para adoção de medidas de controle. Os seguintes objetivos específicos foram propostos: (i) identificar a diversidade de patógenos fúngicos e oomicetos associados às amostras de órgãos sintomáticos de macadâmia, por meio de informações de sintomatologia, patogenicidade, caracterização morfocultural e análise filogenética; (ii) obter uma coleção de fitopatógenos associados aos órgãos vegetais de macadâmia; (iii) relacionar a ocorrência do agente causal ao período sazonal; (iv) avaliar a 17 sensibilidade dos agentes etiológicos a fungicidas e; (v) estudar o efeito de diferentes temperaturas sobre o desenvolvimento dos fitopatógenos. 18 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Macadâmia: origem e características botânicas Abrangendo de 75 a 80 gêneros, e cerca de 1700 espécies, a família Proteaceae consiste de arbustos e árvores que podem ser encontradas em regiões tropicais e subtropicais, especialmente Austrália e África do Sul (SIMPSON, 2010). A família Proteaceae inclui, aproximadamente, 10 espécies do gênero Macadamia, duas das quais produzem nozes comestíveis são a Macadamia integrifolia e M. tetraphylla ou híbridos destas. A principal espécie comercializada é a M. integrifolia (HOKMABADI; SEDAGHATI, 2014). As árvores M. integrifolia e M. tetraphylla têm origem na Austrália. As árvores são cultivadas nos Estados Unidos, principalmente no Havaí e na Califórnia, desde o final de 1800 e, no Brasil, as primeiras macadâmias foram plantadas na década de 1940 (GWALTNEY-BRANT, 2012; SOBIERAJSKI et al., 2006). A nogueira-macadâmia é uma árvore perene de crescimento rápido e tamanho médio com folhagem verde escura e densa. Suas folhas que são pontiagudas, oblongas e medem 30 centímetros ou mais, se desenvolvem em espirais de dois, três ou quatro, mas raramente são solitárias. As flores de macadâmia são pequenas, esbranquiçadas e crescem em pontas compridas. O fruto da macadâmia é identificado como um folículo, e possui pericarpo verde escuro (AGMRC, 2021; SUSILOWATI; KUSUMA; KHOLIBRINA, 2019). No Brasil, o intumescimento das gemas florais ocorre em maio, com ápice da floração no mês de junho (SACRAMENTO; PEREIRA, 2003). A caracterização dos períodos de florescimento e de frutificação é classificada em: gemas intumescidas, crescimento do rácemo, formação dos botões florais, flores em pré-antese, flores abertas, flores senescentes, flores fecundadas; frutificação efetiva, crescimento dos frutos, final do período de crescimento dos frutos; frutos maduros e queda natural dos frutos (SOBIERAJSKI et al., 2007). Na Austrália, a caracterização dos períodos de florescimento e de frutificação podem ser descritos como: pré-floração; floração precoce, pico de floração, conjunto de nozes, nozes do tamanho de uma ervilha e pericarpo formado (BRIGHT, 2018). Quando cultivada em condições adequadas, a macadâmia produz nozes após 19 4 ou 5 anos e alcança sua produção total em 12 a 15 anos, podendo continuar por mais de 100 anos, havendo registros de pomares com plantas de 60 anos em plena produção comercial (WOOD; GARG, 2011; TOLEDO PIZA; MORIYA, 2014). Apesar da origem Australiana, a Hawaii Agricultural Experiment Station (HAES) é o local onde se desenvolveram as principais variedades e clones plantados no mundo (PIMENTEL, 2007), entre elas: HAES 788, HAES 344, HAES 246, HAES 741, HAES 333, HAES 508, HAES 660, HAES 800, HAES 224 e HAES 816 (PEACE et al., 2005). As variedades de macadâmia mais utilizadas no Brasil são as do Instituto Agronômico de Campinas (IAC) e do Hawaii Agricultural Experiment Station (HAES), e entre as disponíveis para o plantio se encontram HAES 741, HAES 816, HAES 246 e IAC 4-12B (PERDONÁ et al., 2010; ABM, 2019a). A seleção de cultivares é de fundamental importância para a formação de um pomar produtivo. Ela deve ser feita de acordo com o clima, solo, densidade, topografia, e forma de manejo (PIO; ENTELMAN, 2019). 2.2 Importância econômica A noz de macadâmia é um ingrediente utilizado na preparação de pratos doces e salgados, como acompanhamento de carnes, na fabricação de sorvetes, na indústria de chocolate, entre outros. Além disso, é utilizada na indústria de cosméticos devido ao seu óleo ser rico nos ácidos linoleico e linolênico, que são insaturados. Esse óleo também é comestível (BEUCHAT; WORTHINGTON, 2007). Essa noz pode, também, ser empregada na produção da farinha de macadâmia, para atender o mercado de produtos isentos de glúten; o isolamento da proteína, como constituinte de suplementos alimentares e para uso na indústria farmacêutica, na forma de cápsulas de óleo para o tratamento de doenças cardiovasculares (NAVARRO; RODRIGUES, 2016). Além da produção de nozes, outra medida importante para comercialização da macadâmia é a denominada taxa de recuperação ( 𝑇𝑅 = 𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑎 𝑎𝑚ê𝑛𝑑𝑜𝑎 𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑎 𝑛𝑜𝑧 × 100 ) que representa a porcentagem de amêndoas obtida após o beneficiamento, um indicador da eficácia dos controles de pragas e doenças e dos procedimentos de 20 colheita e pós-colheita (SOBIERAJSKI et al., 2006; TOLEDO PIZA; PIZA; ALMEIDA NETO, 2019). Em virtude de suas aplicações, a produção global de macadâmia está aumentando, com regiões de cultivo estabelecidas expandindo seus plantios e regiões emergentes, particularmente a China, com expectativa de participação significativa na produção global futura (AMS, 2019). O consumo mundial de macadâmia vem crescendo a um ritmo superior a 8% ao ano, sendo, portanto, a noz que tem o consumo em maior expansão (ABM, 2019b; INC, 2018). Seguindo a tendência dos dez anos anteriores, a produção global de macadâmia continuou a aumentar, com a safra de 2020 atingindo mais de 62 mil toneladas de amêndoas, um aumento de 4% em relação à temporada anterior e 45% maior do que a média nos 10 anos anteriores. Austrália e África do Sul são os fornecedores líderes mundiais, respondendo, cada um, por 25% da produção global (INC, 2021). O Brasil tem aproximadamente 6.000 hectares plantados, distribuídos nos Estados de São Paulo (38%), Espírito Santo (32%), Minas Gerais (10%), Bahia (10%), Rio de Janeiro (6%), Paraná (2%), Mato Grosso do Sul (1%) e Goiás (1%) (TOLEDO PIZA; PIZA; ALMEIDA NETO, 2019). Há alguns anos, grande parte da macadâmia produzida no país tinha como destino a exportação, porém esta tendência vem sendo revertida. Os principais motivos são o aumento da produção nacional, a implantação de pequenas processadoras para atendimento ao mercado interno e o lançamento de produtos contendo macadâmia, por grandes indústrias das áreas de panificação, chocolates, sorvetes e drageados (TOLEDO PIZA, MORIYA, 2014). No Brasil, existem 3 beneficiadoras exportadoras de macadâmia de médio porte que, juntas, processaram 79% da safra brasileira em 2012; QueenNut Macadamia (33%, São Paulo), Coopemac (21%, Espírito Santo) e Tribeca (15%, Rio de Janeiro) e outras 20 pequenas (31%) completam o panorama da indústria brasileira (TOLEDO PIZA; MORIYA, 2014). 21 2.3 Principais doenças na macadâmia Perdas econômicas significativas devido a ocorrência de doenças, reduzindo a produtividade dos pomares de macadâmia são uma grande preocupação para os produtores. Os potenciais aumentos recentes de produção de plantações estão ameaçados por patógenos endêmicos e emergentes (BRIGHT, 2018). Na macadâmia, as doenças causadas por Phytophthora e fungos são as que mais ameaçam a produtividade agrícola. A disseminação potencial e o impacto econômico dessas doenças para a macadâmia são classificados como altos (AKINSANMI, 2015). A diagnose correta das doenças de plantas pode auxiliar produtores e profissionais da área agrícola a evitar possíveis equívocos no manejo e a consequente recomendação inadequada de medidas de controle, principalmente no uso de agrotóxicos (NORONHA; ATHAYDE SOBRINHO, 2008). A detecção de patógenos também tem importância para impedir a introdução de patógenos exóticos numa determinada área (MICHEREFF; BARROS, 2001). As principais doenças registradas no mundo são: mancha do fruto (Pseudocercospora macadamiae Beilharz, Mayers & Pascoe), podridão do fruto (Phomopsis sp., Diaporthe sp. e Colletotrichum sp.), seca do rácemo (Botrytis sp., Pestalotiopsis sp., Neopestalotiopsis sp. e Cladosporium sp.), cancro do caule (Phytophthora sp. e Lasiodiplodia sp.) e mancha foliar (Colletotrichum sp. e Pestalotiopsis sp.) (DRENTH; AKINSANMI; MILES, 2009; AKINSANMI, 2015). Dado ao recente cultivo comercial de macadâmia no Brasil, com início entre 1976 e 1980 (TOLEDO PIZA; PIZA; ALMEIDA NETO, 2019), poucos são os estudos de danos causados por doenças no país. Há relatos de patógenos associados à macadâmia no Brasil, porém, até o momento, a patogenicidade comprovada foi para os fungos Lasiodiplodia theobromae (Pat.) Griff. & Maubl (FISCHER et al., 2017) e Neopestalotiopsis clavispora (G. F. Atkinson) Maharachch, K. D. Hyde & Crous (SANTOS et al., 2019). O fungo L. theobromae já foi relatado causando exsudações de goma que culminaram em galhos secos em plantas de macadâmia provenientes de um pomar de 8 anos no Brasil, no qual, pelo menos, 10 plantas estavam sintomáticas (FISCHER et al., 2017). 22 Em 2015, foram observadas manchas irregulares de cor marrom claro nas folhas de macadâmia em Vitória da Conquista, Bahia. A doença é causada pelo fungo N. clavispora, e seus sintomas iniciais são caracterizados por pequenas manchas medindo de 6 a 12 mm, que aumentam e coalescem cobrindo uma extensa área foliar cuja severidade da doença foi estimada em cerca de 25% (SANTOS et al., 2019). 2.3.1 Mancha do fruto Pseudocercospora pertencente à família Mycosphaerellaceae, é um gênero cosmopolita que abrange diversas espécies fitopatogênicas, comumente associadas a manchas em folhas e frutos, em uma ampla gama de hospedeiros vegetais. Ocorrem tanto em ambientes áridos como úmidos e em uma ampla variedade de climas, incluindo regiões temperadas, subtropicais e tropicais (CROUS et al., 2013). Esse fungo apresenta micélio intercelular de coloração marrom-claro; conidióforos pálidos a castanho-amarelados, frequentemente, curvos; e conídios isolados, filiformes, marrom-oliva-claro, curvos, estriados ou retos com ponta obtusa (C; MAYERS; PASCOE, 2003). A mancha do fruto da macadâmia, causada por Pseudocercospora macadamiae, é uma doença severa que afeta a cultura na Austrália (BEILHARZ; MAYERS; PASCOE, 2003). A colonização de P. macadamiae no pericarpo foi observada como sendo intercelular, sem produção de estruturas como haustórios (MILES et al., 2009). A depender das condições para o seu desenvolvimento, o período latente ou quiescente, varia de 39 a 68 dias, após o qual manchas cloróticas aparecem, expandem-se e se tornam necróticas e de coloração marrom (AKINSANMI; DRENTH, 2010). Pseudocercospora macadamiae se disseminou a partir de Maleny em Queensland, onde foi relatado pela primeira vez em 1981 (BEILHARZ; MAYERS; PASCOE, 2003), para todas as áreas de produção no sudeste da Austrália. Como o patógeno só infecta os frutos da macadâmia e as árvores só começam a dar frutos a partir dos 4 anos de idade, a disseminação não ocorre na fase de estabelecimento do pomar (AKINSANMI; DRENTH, 2010). Observações em campo indicam que as perdas de rendimento de até 90% ocorrem em pomares onde a mancha do fruto não é controlada. Quando frutos 23 imaturos doentes são colhidos e misturados com frutos maduros, os lotes são, geralmente, rebaixados na fase de processamento, resultando em perdas financeiras (AKINSANMI; MILES; DRENTH, 2008). Outro aspecto do impacto econômico causado pela doença é a abscisão prematura dos frutos, quando ainda imaturos e com baixo teor de óleo, tornando-os inadequados para o processamento e consumo (AKINSANMI; MILES; DRENTH, 2007). 2.3.2 Podridão do fruto causada por Phomopsis sp. O gênero Phomopsis (teleomorfo: Diaporthe) compreende fungos fitopatogênicos importantes em diversos hospedeiros, com distribuição mundial e impacto relevante em diversas culturas como: citros, videira e girassol (GUARNACCIA; CROUS, 2017; THOMPSON et al., 2011; UDAYANGA et al., 2011; VAN NIEKERK et al., 2005). Phomopsis é caracterizado por produzir micélio imerso, ramificado, marrom- pálido e conidióforos hialinos, ramificados, ocasionalmente, septados e filiformes. Os conídios são de dois tipos para a maioria das espécies: alfa e beta. Os alfa-conídios são hialinos, elipsóides ou fusiformes, retos, asseptados e bigutulados comuns. Os betaconídios são hialinos, filiformes, asseptados, retos ou curvos e agutulados (CRISTESCU, 2003). A podridão causada por Phomopsis é uma grande ameaça à produção de macadâmia na Austrália e na África do Sul, causando queda prematura de frutos em várias cultivares (AKINSANMI; DRENTH, 2017). Os sintomas dessa doença são caracterizados pela formação rápida e esporádica de lesões macias, esponjosas e pretas com cerca de 5-10 mm de diâmetro que contrastam com o pericarpo verde de frutos saudáveis (AKINSANMI; DRENTH, 2017). As nozes de macadâmia nos estágios iniciais de desenvolvimento, como tamanho de ervilha, são mais suscetíveis à infecção natural do que os frutos maduros (FABI, 2015). 24 2.3.3 Podridão do fruto causada por Colletotrichum sp. O gênero Colletotrichum inclui uma série de fitopatógenos de importância econômica, causando doenças em uma grande variedade de plantas lenhosas e herbáceas. Incide principalmente em regiões tropicais e subtropicais, ocasionando doença em diversas culturas de importância econômica como a antracnose do feijão, algodão, curcubitáceas, cebola, pimenta, tomate, morango, etc. (AGRIOS, 2005; CANNON et al., 2012). O gênero já foi considerado o oitavo grupo mais importante de fungos fitopatogênicos do mundo, com base na percepção de importância científica e econômica (DEAN et al., 2012). Colletotrichum é a forma anamórfica de Glomerella, pertencente à divisão Ascomycota. Sua forma assexuada é caracterizada por produzir acérvulos, os quais dão origem a conídios unicelulares hialinos, produzidos a partir de monofiálides, também hialinas ou levemente pigmentadas (CANNON et al., 2012; PEREIRA; SOARES, 2012). Durante o processo de infecção, o patógeno entra em estágios consecutivos da fase biotrófica, na qual as células e tecidos internos são infectados, mas não apresentam os sintomas. A infecção, então, inicia a fase necrótica, na qual o patógeno coloniza as células e os tecidos levando à morte das células vegetais e, portanto, às lesões necróticas que podem ser observadas externamente (LIAO et al., 2012). Em 2018, na Austrália, uma mancha foliar exibindo lesões irregulares de coloração marrom-escura foram observadas em mudas e árvores de macadâmia no campo e, mais tarde, essa mancha foi distinguida como mancha foliar de Colletotrichum causada por C. siamense cujo relato é o primeiro na Austrália (PRASANNATH; GALEA; AKINSANMI, 2020). Na Austrália, a podridão do fruto é às vezes referida como "podridão de Antracnose" quando anéis concêntricos de picnídios de Colletotrichum gloeosporioides sensu lato ocorrem nas lesões escuras (AKINSANMI; DRENTH, 2017). Os fungos da podridão do fruto podem se desenvolver rapidamente causando descoloração total da superfície do fruto. A podridão de C. gloeosporioides é diferente da causada por Phomopsis, pela presença de anéis concêntricos na lesão, 25 que, por sua vez, é diferente da mancha causada por Pseudocercospora macadamiae, cujas lesões, quando pressionadas, são duras enquanto as lesões de Colletotrichum e Phomopsis são macias (BRIGHT, 2021). 2.3.4 Seca do rácemo Diversos agentes fitopatogênicos são relatados como sendo capazes de causar doença em rácemos. Os sintomas específicos da mancha de flores são denominados conforme o agente causal: mancha de Botrytis (mofo cinzento) quando causados por Botrytis cinerea Pers, mancha de Cladosporium (mofo verde) por Cladosporium cladosporioides (Fresen.) G. A. de Vries, mancha de Pestalotiopsis (flor seca) por P. macadamiae e Neopestalotiopsis macadamiae R. G. Shivas & Akinsanmi, e mancha de Phytophthora (mofo úmido) quando causado por Phytophthora capcisi Leonian e P. palmivora (E. J. Butler) E. J. Butler (PRASANNATH; GALEA; AKINSANMI, 2021; AKINSANMI et al., 2017; HUNTER; ROHRBACH; KUNIMOTO, 1972). O mofo cinzento, causado pelo fungo B. cinerea, ocorre principalmente em flores maduras. As flores doentes aparecem na cor marrom-escuro e se agrupam na ráquis, e os filamentos miceliais ficam recobertos por esporos acinzentados, daí a aparência de mofo cinzento (BRIGHT, 2018). Já os sintomas de seca do rácemo causados por C. cladosporioides são caracterizados por pequenas lesões encharcadas na flor que mais tarde se tornam necróticas, com os rácemos doentes cobertos por uma massa de coloração cinza- oliva constituída por micélio e conídios (AKINSANMI et al., 2017). A doença seca das flores, causada por P. macadamiae e N. macadamiae, é caracterizada por proporcionar aspecto seco ao rácemo. Os sintomas de necrose aparecem em flores infectadas e ocasionalmente na ráquis, desde o início da floração até a antese completa. Botões ou flores imaturas podem se tornar manchadas em poucos dias, passando de marrom a marrom-escuro, e permanecem presos às ráquis ainda de coloração verde (AKINSANMI et al., 2017). Outro agente causal de doenças em inflorescências é P. capsici. Este patógeno causa manchas nas flores em macadâmia e já foi relatado no Havaí, onde a doença foi caracterizada por lesões necróticas escuras extensas e irregulares nas 26 partes da planta afetadas, incluindo todo o rácemo, folha, brotos jovens e frutos imaturos (KUNIMOTO; ARAGAKI; HUNTER; KO, 1976). A seca do rácemo é uma doença severa da macadâmia em todo o mundo, podendo resultar em redução da frutificação, com perda de produção de mais de 80% (AKINSANMI, 2015). A incidência dessa doença varia entre as estações, dependendo da cultivar de macadâmia e das condições climáticas prevalecentes no período de floração (AKINSANMI, 2015). 2.3.5 Seca do rácemo causada por Cladosporium sp. Cladosporium é um dos gêneros mais comuns de fungos que ocorrem em vários substratos e inclui espécies que habitam os mais diversos nichos (BENSCH et al., 2012). Esse gênero é um dos que mais diversos e heterogêneos dentre os fungos, compreendendo mais de 772 nomes, e incluindo espécies endofíticas, patogênicas a humanos, fitopatogênicas e saprófitas (DUGAN; SCHUBERT; BRAUN, 2004; BENSCH et al., 2012). O gênero Cladosporium pertence à divisão Ascomycota e à família Cladosporiaceae; as colônias, em sua maioria, apresentam coloração marrom- olivácea a marrom-escura ou com aparência cinza-olivácea e aveludada; hifas superficiais ramificadas e septadas; e conídios solitários ou catenados, em cadeia não ramificadas ou ramificadas, forma e septo variável, limoniformes a cilíndricos, sub-hialinos a pigmentados e lisos (ELLIS, 1971; SCHUBERT; BRAUN, 2005). Com seus pequenos conídios, geralmente, formados em cadeias ramificadas, são bem adaptados para se disseminarem facilmente em grandes números por longas distâncias (BENSCH et al., 2012). Uma epidemia severa de seca do rácemo, causada por C. cladosporioides, foi relatada na África do Sul, os primeiros sinais foram pontas necróticas da ráquis, que muitas vezes, curvavam-se para um lado com a necrose se espalhando para cima, resultando na chamada “cauda de rato” (VAN DEN BERG et al., 2008). Os outros sintomas são caracterizados por pequenas anasarcas na flor que mais tarde se tornam necróticas, com os rácemos doentes cobertos por micélio de cor cinza-oliváceo (VAN DEN BERG et al., 2008). 27 Enquanto uma epidemia de seca do rácemo foi relatada na África do Sul, na Austrália, essa seca causada por Cladosporium sp. está se tornando um problema comum (BRIGHT, 2021). 2.3.6 Cancro do caule causado por Phytophthora sp. As espécies pertencentes à divisão Oomycota e ao gênero Phytophthora contêm um grande número de patógenos vegetais significativos em ecossistemas naturais e agrícolas, infectando mais de 5.000 espécies de plantas diferentes (HARDHAM; BLACKMAN, 2018). Globalmente, cinco espécies de Phytophthora foram relatadas como causadoras de doenças em pomares comerciais de macadâmia. Dentre essas, P. cinnamomi e P. palmivora são as mais comumente relatadas como agentes causais da podridão da raiz de Phytophthora e do cancro do caule na macadâmia em todo o mundo (JEFF-EGO et al., 2020). Frequentemente, Phytophthora aparece na parte inferior das encostas propícias ao acúmulo de água, bem como nas linhas de drenagem e no topo das encostas onde o solo sofreu erosão (BRIGHT, 2018). P. cinnamomi infecta caules de macadâmia causando cancro ou lesões necróticas e gomose do tronco (MBAKA et al., 2009). Os ramos podem ser diretamente infectados pelo patógeno ou através da infecção do caule principal ou raízes, com sintomas de exsudação de goma e posterior morte (JEFF-EGO et al., 2018). Além disso, com o tempo, a casca acumula camadas de cortiça, ficando profundamente sulcada, podendo ser facilmente descascada, revelando um lenho de cor avermelhada (BRIGHT, 2021). Na Austrália, há relatos de morte de milhares de árvores de macadâmia devido ao P. cinnamomi, e a perda econômica causada por este patógeno para a indústria de macadâmia australiana é estimada em mais de 20 milhões de dólares, anualmente (AKINSANMI; DRENTH, 2013). 28 2.3.7 Cancro do caule causado por Lasiodiplodia spp. O gênero Lasiodiodiplodia, anamorfo de Brotryosphaeria, é um ascomiceto pertencente à família Botryosphaeriaceae. Esta família inclui espécies que são patógenos de plantas lenhosas que incidem em uma ampla gama de culturas hortícolas, porém variam em virulência e em suas habilidades de infectar seus hospedeiros a partir de diferentes partes da planta, como flores, brotos verdes, galhos lenhosos, etc. (SCHOCH et al., 2020; GARCIA, 2021). Os membros dessa família são caracterizados por produzirem ascósporos grandes, ovoides a oblongos, tipicamente hialinos, asseptados, que podem se tornar marrons e septados com a idade (PHILLIPS et al., 2005). Os patógenos podem causar morte descendente, podridões de frutos e cancros em vários hospedeiros lenhosos e, em alguns casos, o estresse hídrico pode induzir sintomas graves em diferentes plantas hospedeiras infectadas por eles, embora, por vezes, aparentemente inócuos (SMITH et al., 1994). A infecção ocorre por meio de ferimentos em tecidos jovens e lenhosos ou por aberturas naturais em flores, frutos, folhas e brotos. Os patógenos produzem enzimas e/ou toxinas que matam células e tecidos dos vários órgãos da planta que atacam (GARCIA et al., 2021a). Uma grande preocupação para a indústria da macadâmia é a morte crescente de árvores associada à morte de ramos por Botryosphaeria. Várias espécies de fungos pertencentes à família Botryosphaeriaceae foram obtidas de diferentes tecidos de macadâmia (JEFF-EGO; AKINSANMI, 2018; LIDDLE; AKINSANMI; GALEA, 2019). Seis espécies de Botryosphaeriaceae já foram confirmadas, causando lesões necróticas e morte da planta de macadâmia, tais como: Lasiodiplodia pseudotheobromae, que foi a espécie mais prevalente; seguida por Neofusiccocum parvum; L. iraniensis; N. luteum; L. theobromae e N. australe (JEFF-EGO; AKINSANMI, 2018). Em agosto de 2013, L. theobromae foi isolado de amostras de galhos e cascas de tronco de um pomar comercial de macadâmia no Brasil que apresentaram sintomas de cancro no caule, enquanto outras plantas apresentaram exsudação de goma, culminando em ramos terminais secos (FISCHER et al., 2017). 29 3 MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Local de obtenção dos isolados Os isolados foram obtidos mensalmente, a partir de mudas e partes de plantas adultas de macadâmia (rácemos, segmentos do caule, ramos, folhas e frutos) com sintomas e/ou sinais de fitopatógenos, identificados pelos técnicos, nas áreas de produção da empresa QueenNut Macadamia. Os órgãos e mudas de 145 amostras, devidamente armazenados e identificados foram encaminhados para o Laboratório de Microbiologia Ambiental - LMA da Embrapa Meio Ambiente, localizado no município de Jaguariúna, São Paulo. Cada amostra foi catalogada em um banco de dados, no qual foram anotados o gênero fúngico associado, por meio de identificação morfológica, o código da amostra, a origem geográfica, o órgão da planta que foi observada a sua associação e a data de coleta. A partir do banco de dados estruturado e de dados de temperatura média e umidade média de Dois Córregos-SP coletados da estação automática mais próxima e em funcionamento, Barra Bonita (A741), do Instituto Nacional de Meteorologia – INMET (https://tempo.inmet.gov.br/), as épocas de ocorrência de cada fungo foram determinadas. 3.2 Isolamento dos fitopatógenos associados Para isolamentos indiretos, as amostras foram lavadas e secas cuidadosamente e, em seguida, a área de transição entre a área sadia e a área lesionada e/ou com sinal de fitopatógeno das amostras foi fragmentada em pequenos segmentos para posterior desinfestação em álcool 70% por 30 segundos; hipoclorito de sódio (NaClO2) 10% por 1 min, seguido de duas lavagens consecutivas em água destilada esterilizada (ADE). Para isolamentos diretos, as estruturas do patógenos foram transferidas, com o auxílio de uma alça de repicagem, diretamente para o meio de cultura. O método para obtenção do isolado, a preparação do inóculo e o tipo de meio de cultura adotado variou de acordo com o tipo de microrganismo associado aos sintomas no órgão vegetal. Para isolamento e preparação dos inóculos de 30 organismos fúngicos, utilizou-se as metodologias descritas por Alfenas et al. (2016) conforme o órgão afetado. Os fitopatógenos foram cultivados em meio de cultura Batata-Dextrose-Ágar – BDA (39g/L de BDA, AD e 2,5 ml/L de ácido láctico 85%) ou meio suco V8-ágar (200 ml/L de suco V8, 3g/L de CaCO3, 20g/L de ágar e AD). Para isolamento de Phytophthora, utilizou-se o método de isca segundo Erwin; Ribeiro (1996). Em um recipiente de plástico, foi adicionado, cobrindo-o com gaze, depois acoplado a outro recipiente com um furo embaixo, completando com água destilada e, na superfície, alguns fragmentos de folhas sadias de macadâmia higienizadas (álcool 70%, NaClO2 5% e ADE) foram depositadas. Após 48 h, esses fragmentos foram transferidos para placas contendo meio de cultura Ágar Água - AA (39 g/L de ágar e AD) e meio Corn Meal Agar (40 g/L de fubá de milho; 1 L de ADE e 15 g/L de ágar) contendo antibióticos e fungicidas (0,025 g/L de ampicilina; 0,01 g/L de benomyl; 0,02 g/L de cloranfenicol e 0,1 g/L de PCNB). Uma identificação inicial para determinar os possíveis gêneros dos fitopatógenos associados foi realizada, com o auxílio de literatura específica, através de observações, em lâminas temporárias, das estruturas dos microrganismos, utilizando microscópio óptico e estereoscópico. Esses fitopatógenos foram armazenados e mantidos na coleção de trabalho do Laboratório de Microbiologia Ambiental da Embrapa Meio Ambiente (LMA), ressaltando que, somente os isolados mais representativos foram submetidos aos outros ensaios realizados. 3.3 Obtenção de culturas monospóricas Para a obtenção de culturas monospóricas, os isolados foram repicados para placas de Petri contendo meio BDA acidificado ou meio suco V8-ágar e mantidos em incubadora do tipo BOD (± 25 ºC) sob regime alternado de luz/escuro (12/12 h) durante 7 dias para induzir a produção de conídios. Para cada isolado, preparou-se uma suspensão de esporos com a adição de 20 ml de água destilada na placa e, com uma alça de Drigalski, foram realizados movimentos delicados sobre a colônia para a liberação dos conídios dos conidióforos na suspensão. Em seguida, foram feitas diluições seriadas até 105 conídios ml-1 da concentração inicial, com o intuito de garantir a uniformidade genética para fins de identificação. 31 Uma alíquota de 100 µl, 200 µl e 500 µl de suspensão de inóculo de cada isolado foram depositadas em placas de Petri contendo meio AA e espalhada na superfície com uma alça de Drigalski, seguida de incubação em BOD (± 25 ºC) sob regime alternado de luz (12/12 h). Esporos recém-germinados foram transferidos para o meio BDA em placas de Petri. As culturas foram mantidas, por repicagens periódicas, em tubos com BDA inclinado, em Castellani e, por criopreservação a -80 °C (GONÇALVES; ALFENAS; MAFIA, 2016) para serem utilizadas quando necessário. 3.4 Caracterização cultural e morfológica A caracterização foi realizada somente para os isolados mais representativos, segundo as doenças que mais ocorreram no campo. As avaliações de coloração e textura das colônias ocorreu no intervalo de 10 a 20 dias de crescimento das culturas, observando ambos os lados da placa, frente e verso. Para observações e obtenção de imagens de estruturas fúngicas, foi realizada a metodologia de microcultura segundo Mafia; Alfenas (2016). Discos de BDA foram colocados sobre a lâmina esterilizada e, em seguida, fragmentos de micélio foram transferidos para o centro de cada face lateral do disco, os quais foram cobertos pela lamínula esterilizada. Essa lâmina foi suportada por dois palitos de madeira dentro de uma câmara úmida formada por placa de Petri, contendo papel filtro umedecido. Depois de 7 dias, a lamínula foi retirada, cuidadosamente, com vestígios de crescimento e a observação das estruturas decorreu com o uso de ADE e com glicerina 50%. Foram avaliados formas e tamanhos de 10 conídios imaturos e maduros, conidióforos, formação de apressórios e presença de clamidósporos dos isolados representativos. Foram tomadas medições das estruturas e de imagens utilizando microscópio Leica DM 5000 e software LAS v.4.1. 32 3.5 Testes de patogenicidade 3.5.1 Em rácemos destacados em laboratório Os isolados foram repicados em meio de cultura BDA acidificado, incubados a 25 °C em incubadora do tipo BOD sob regime alternado de luz/escuro de 12h/12h. As suspensões de conídios foram preparadas com a adição de 20 ml de ADE às placas de Petri. Os conídios foram extraídos da superfície da cultura por raspagem com auxílio de uma alça de Drigalski. As suspensões de conídios foram filtradas em camada dupla de gaze, em seguida calibradas para a concentração de 105 conídios ml-1 em câmara de Neubauer. O teste de patogenicidade nas inflorescências de macadâmia da variedade IAC 4-12 B foi realizado em rácemos nos estádios de pré-antese e flor fecundada, conforme a classificação de Sobierajski et al. (2007). Os rácemos não passaram por assepsia a fim de evitar o desprendimento das flores da raquis. A partir disso, foram utilizados 5 isolados para cada estádio de desenvolvimento e 5 repetições mais a testemunha. Os isolados utilizados foram MAC42 (Pestalotiopsis sp.), MAC45 (Fusarium sp.), MAC60 (Cladosporium sp.), MAC63 (Cladosporium sp.) e MAC69 (Cladosporium sp.). Os rácemos foram organizados em caixas gerbox, contendo papel tolha umedecido com ADE, formando uma câmara úmida (figura1-A). A avaliação focou no aparecimento de sinais e sintomas e durou três dias. Com o fim de verificar se a condição de alta umidade influenciaria na incidência da doença, rácemos de macadâmia (5 isolados para cada estádio de desenvolvimento e 5 repetições mais a testemunha) foram dispostos com a base da ráquis imersa em ADE, dentro de frascos tubulares transparentes de 100 ml (figura1- C). A inoculação foi realizada por meio de pulverizadores manuais. Os isolados utilizados foram os mesmos do ensaio em caixas gerbox ajustados na concentração de 105 conídios ml-1. A avaliação desse ensaio também frisou no aparecimento de sinais e sintomas e durou quatro dias. Das amostras que não apresentaram sintomas ou sinais, no ensaio realizado em frascos tubulares, foram retiradas 5 flores de cada rácemo por tratamento [por exemplo: 5 flores de cada repetição (5 repetições) do MAC63 pré-antese] e postos em câmara úmida formada por caixas gerbox (2 repetições) e substrato de papel de filtro (Blotter test) umedecido com ADE sob luz e temperatura ambiente, para induzir 33 o possível crescimento dos fungos inoculados (figura1-B). Esse ensaio teve como avaliação aparecimento de sinais e sintomas e durou cinco dias. Figura 1- Teste de patogenicidade em rácemos destacados (A) teste em caixas gerbox, (B) Blotter test, (C) teste em frascos tubulares. 3.5.2 Em rácemos em campo Os ensaios de campo foram realizados na área de produção da empresa QueenNut Macadamia, na cidade de Dois Córregos-SP, em dois anos consecutivos, 2020 e 2021. Em 2020, o ensaio ocorreu na área georreferenciada com as coordenadas 22°19'9,6"S e 48°22'9,0"W, e a variedade representativa na qual os isolados foram inoculados, foi a A38. Os testes de patogenicidade compreenderam 4 isolados, MAC63 (Cladosporium sp.); MAC60 (Cladosporium sp.); MAC45 (Fusarium sp.) e MAC42 (Pestalotiopsis sp.) mais a testemunha (ADE), com 5 repetições cada. As concentrações dos isolados foram ajustadas para 105 conídios ml-1 na câmara de Neubauer. Os isolados foram aplicados com pulverizadores em cada 2 a 3 estádios de desenvolvimento de rácemos distintos (figura 2) - pré-antese, flor aberta e flor fecundada (SOBIERAJSKI et al., 2007) - independente da árvore. Os rácemos foram mantidos em câmara úmida, por 24 h, formada por um saco plástico umedecido com ADE e fechados com o auxílio de um fio de barbante. 34 Após esse período, os sacos plásticos foram retirados e substituídos por sacos de porosos. No 9o dia após a inoculação (DAI), os rácemos foram destacados e transportados para o LMA a fim de serem avaliados quanto à incidência da doença. No ano de 2021, em localidade com as coordenadas 22º19'10"S e 48º20'31"W, rácemos da variedade IAC 4-12 B foram inoculados com os isolados MAC99 (Pestalotiopsis sp.); MAC63 (Cladosporium sp.) e MAC103 (Phomopsis sp.). Nessa etapa, foram utilizados os 3 isolados mais a testemunha (ADE), com 3 repetições cada. As concentrações dos isolados foram ajustadas, com auxílio de uma câmara de Neubauer, para 105 conídios ml-1. Os isolados foram aplicados com pulverizadores manuais nos 3 estádios em diferentes fases de desenvolvimento dos rácemos já citados, independentemente da árvore. Os rácemos foram mantidos em câmara úmida, formada por um saco plástico umedecido com ADE e fechados com o auxílio de um fio de barbante por 0, 24, 48 e 72 h a fim de avaliar a influência da umidade na patogenicidade dos isolados. No 10º DAI, os rácemos foram destacados, organizados e transportados para o LMA para avaliação da incidência da doença. Figura 2- Estádios de desenvolvimento das flores em macadâmia Variedade de macadâmia IAC 4-12 B: (A) flor fecundada, (B) flor aberta, (C) flor em pré-antese. 35 3.5.3 Em folhas Para os testes de patogenicidade em folhas, estas foram destacadas das mudas de macadâmia mantidas em casa de vegetação da Embrapa Meio Ambiente e submetidas a assepsia em NaClO2 5% por 5 minutos e duas lavagens em água destilada. A inoculação do isolado fúngico de Rhizoctonia sp. (MAC80) associado à queima-de-fio foi realizada por meio de discos da cultura postos entre a inserção do pecíolo e o limbo foliar, utilizando-se 4 repetições mais a testemunha (apenas discos de BDA). Essas amostras permaneceram em caixas gerbox, em câmara úmida, por 14 dias, quando se avaliou o aparecimento de sinal e/ou sintoma. O isolado MAC103 (Phomopsis sp.) foi submetido ao teste de patogenicidade em folhas destacadas. Foram utilizados o isolado mais a testemunha (ADE). A suspensão de esporos foi ajustada para 10-5 conídios ml-1, na câmara de Neubauer, e a inoculação ocorreu por meio da pulverização da suspensão, nas folhas, até o ponto de gotejamento. Essas amostras permaneceram em caixas gerbox, em câmara úmida, por 12 dias, avaliando-se o aparecimento de sintomas e/ou sinais. Os isolados de Cladosporium sp. - MAC60, MAC63 e MAC69 - foram inoculados em folhas, nas mudas de macadâmia, porque se observou presença de Cladosporium sp. em folhas de mudas de macadâmia quando submetidas à câmara úmida. A suspensão de esporos foi preparada, ajustada na câmara de Neubauer para 105 conídio ml-1, e pulverizada nas folhas até o ponto de gotejamento. Para esse teste, utilizou-se cinco folhas para cada isolado que permaneceram por 24 h em câmara úmida, constituída por saco plástico umedecido, e em observação por 10 dias, avaliando-se o aparecimento de sintomas e/ou sinais. 3.5.4 Em caule A inoculação dos isolados MAC1, MAC84 e MAC87, associados à Lasiodiplodia sp., consistiu na disposição de três discos da cultura crescida em meio suco V8-ágar, em ferimentos previamente realizados, com o auxílio de lâminas de corte esterilizadas, em caules de mudas de macadâmia, de 10 meses de idade, ambientados no setor de casa de vegetação da Embrapa Meio Ambiente. A área 36 inoculada foi recoberta por um filme de PVC contendo um chumaço de algodão umedecido a 2-3 cm abaixo do ponto de inoculação, com a finalidade de manter a umidade (figura 3). Na testemunha se utilizou apenas discos de meio suco V8-ágar. A avaliação seguiu com o aparecimento de sinal do patógeno e/ou ocorrência de lesões. Figura 3-Teste de patogenicidade em mudas na casa de vegetação Mudas com bandagem plástica, formando câmara úmida, para teste de isolados associados à Lasiodiplodia sp. 3.5.5 Em fruto O isolado MAC29 (Fusarium sp.), obtido de fruto com lesão necrótica, foi inoculado em frutos sadios de macadâmia, na fase de endurecimento do carpelo (shell hardening) ou seguindo a escala fenológica elaborada por Sobierajski et al. (2007), no estádio de crescimento do fruto ao estádio final de crescimento do fruto. Os frutos foram submetidos a assepsia em NaClO2 5% por 5 minutos e lavados duas vezes em água destilada. Foram utilizadas três repetições para este isolado mais a testemunha. 37 A inoculação foi realizada em frutos com e sem ferimentos. Nos frutos com ferimentos, 4 lesões superficiais equidistantes foram feitas, com uma agulha histológica, no carpelo e sobre cada ferimento 20 µl da suspensão, ajustada para 105 conídios ml-1 na câmara de Neubauer, foi depositada. Na testemunha, utilizou-se somente ADE. Nos frutos sem ferimentos, as suspensões e tratamento controle utilizados foram os mesmos, porém, depositou-se uma alíquota de 20 µl da suspensão em um único local sobre o carpelo. Os frutos foram mantidos em câmara úmida, em caixas gerbox, e foram avaliados segundo o aparecimento de sinais do patógeno e/ou sintomas. O isolado MAC121 (Colletotrichum sp.) foi inoculado em frutos sadios de macadâmia - na fase de endurecimento do carpelo (shell hardening) ou seguindo a escala fenológica elaborada por Sobierajski et al. (2007), no estádio de crescimento do fruto ao estádio final de crescimento do fruto - através da deposição de disco da cultura. Os frutos passaram pelo mesmo processo de assepsia dos frutos inoculados com MAC29. Foram utilizadas 4 repetições, utilizando frutos com e sem ferimentos. Na testemunha, apenas discos de BDA foram postos. As amostras foram dispostas em caixas gerbox e permaneceram em câmara úmida, constituída por papel toalha umedecido com ADE. A avaliação do ensaio seguiu com o aparecimento de sinais do isolado inoculado e/ou a ocorrência de lesões. 3.6 Identificação molecular 3.6.1 Obtenção de massa micelial A produção da massa micelial foi realizada com a transferência de 1 disco da cultura para Erlenmeyers contendo 100 ml de meio de cultura líquido estéril (3,0 g/L de extrato de malte; 0,5 g/L de KH2PO4; 2 g/L de extrato de levedura e 0,5 g/L de MgSO4.7H2O). Os recipientes foram mantidos em incubadora do tipo BOD a 25 °C por 7 dias. Após 7 dias, realizou-se a filtragem da massa micelial, utilizando um funil de Büchner, contendo papel filtro esterilizado, acoplado a um Kitassato por meio de um alongador, e este a uma bomba de vácuo. A amostra (micélio em meio líquido) foi lavada três vezes com ADE, e após seco, o micélio foi depositado em envelope de papel alumínio e armazenado a - 40 °C. 38 3.6.2 Extração de DNA As massas miceliais foram transferidas para um tubo de 1,5 ml, pesadas (180 a 250 mg) e maceradas com o auxílio de um bastão de vidro. Em seguida, 500 µl de CTAB (2%) foi adicionado e a extração seguiu a metodologia descrita por Brandão et al. (2019). A quantificação e a qualidade do DNA genômico dos isolados foram estimadas no espectofotômetro NanoDrop 2000, e verificadas em gel de agarose 1,2% (1,2 g de agarose e 100 ml de TAE 1X) pela intensidade da banda. 3.6.3 Reação em Cadeia da Polimerase - PCR As reações foram realizadas em alíquota de 25 µl, composta por uma mistura de água ultrapura do tipo I, produzida pelo sistema de purificação Milli-Q, tampão (5X, Ludwig-Biotec), MgCl2 (25 mM, Invitrogen), dNTPs (10 mM), primers forward e reverse (10 mM, Genone, quadro 1), Taq polimerase (5U, Invitrogen) e DNA molde (quadro 1). As amplificações de PCR foram realizadas no termociclador Applied Biosystems VeritiPro (Thermo Fisher Scientific). Quadro 1- Regiões e primers utilizados na identificação dos isolados Isolado* Região Primer MAC11 Espaçador Interno Transcrito (ITS) ITS5 e ITS4 MAC841 Espaçador Interno Transcrito (ITS) Fator de Alongamento de Tradução 1-alfa (EF1α) ITS5 e ITS4 EF1-688F e EF1-1251R MAC871 Espaçador Interno Transcrito (ITS) Fator de Alongamento de Tradução 1-alfa (EF1α) ITS5 e ITS4 EF1-688F e EF1-1251R MAC632 Espaçador Interno Transcrito (ITS) Fator de Alongamento de Tradução 1-alfa (EF1α) Actina (ACT) ITS5 e ITS4 EF1-728F e EF1-986R ACT-512F e ACT-783R MAC1213 Espaçador Interno Transcrito (ITS) Histona (H3) Actina (ACT) β-tubulina (β-TUB) ITS5 e ITS4 CYLH3F e CYLH3R ACT-512F e ACT-783R BT2A e BT2B *Código de trabalho dos isolados. 1- MAC1, MAC84 e MAC87 (Lasiodiplodia sp.), 2- MAC63 (Cladosporium sp.), 3- MAC121 (Colletotrichum sp.). Isolados representativos em negrito. 39 Os primers ITS5 (5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’) e ITS4 (5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’) foram organizados em programação descrita por White et al. (1990) com alterações, utilizando desnaturação de 94 °C por 4 minutos, 35 ciclos de 94 °C por 30 segundos, seguido do anelamento de 54 °C por 45 segundos, extensão por 72 °C por 40 segundos e final de extensão de 72 °C por 5 minutos. Os primers EF1-728F (5’-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3’) e EF1-986R (5'- TACTTGAAGGAACCCTTACC-3’) e o par ACT-512F (5′- ATGTGCAAGGCCGGTTTCGC-3′) e ACT-783R (5′-TACGAGTCCTTCTGGCCCAT- 3′) seguiram o protocolo de Carbone; Kohn (1999) com modificações nas quais a desnaturação foi de 95 °C por 8 minutos, 35 ciclos de 95 °C por 15 segundos, anelamento de 56 °C por 20 segundos, extensão de 72 °C por 60 segundos e extensão final de 72 °C por 5 minutos. Os primers EF1-688F (5’-CGGTCACTTGATCTACAAGTGC-3’) e EF1-1251R (5’-CCTCGAACTCACCAGTACCG-3’) seguiram o mesmo protocolo descrito por Carbone; Kohn (1999), mas com temperatura de anelamento de 52 °C para o isolado MAC84 (Lasiodiplodia sp.) e 56 °C para o isolado MAC87 (Lasiodiplodia sp.). A programação do par de primers BT2A (5’-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC- 3’) e BT2B (5’-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3’), primers ACT-512F e ACT- 783R e ITS4 e ITS5 para o MAC121 (Colletotrichum sp.) foi disposta segundo Prasannath; Galea; Akinsanmi (2020), com desnaturação inicial de 95 °C por 2 minutos, 35 ciclos de desnaturação de 95 °C for 30 segundos, anelamento de 58 °C por 30 segundos e extensão de 72 °C for 1 min, com final de extensão de 72 °C por 5 minutos. Os primers CYLH3F (5′-GCAACATCTCGTCCGCTCT-3′) e CYLH3R (5′- TGAAGTGGGGAGAAGGGAA-3′) seguiram a programação realizada conforme Mahmodi et al. (2014) com modificações, utilizando desnaturação inicial de 94 °C por 4 minutos, seguida de 35 ciclos de desnaturação de 94 °C por 40 segundos, anelamento de 60 °C por 30 segundos, extensão de 72 °C por 1 minuto e final de extensão de 72 °C por 7 minutos. Os produtos da PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 1,2%, corado com GelRed (Biotium), com posterior visualização em fotodocumentador (L-Pix EX, Loccus) e quantificado no fluorômetro (Qubit, Thermo Fisher Scientific). 40 Os fragmentos amplificados foram purificados utilizando o kit de purificação de DNA (Wizard Genomic Kit, Promega). Os fragmentos gênicos foram sequenciados nas direções senso e antisenso, pela empresa ACTgene. 3.6.4 Análise filogenética Os eletroferogramas gerados foram analisados visualmente por meio do programa Bioedit 7.7.1 (HALL, T., https://thalljiscience.github.io/) e a região de consenso do DNA foi montada manualmente no mesmo programa. As sequências editadas foram comparadas com a base de dados GenBank do National Center for Biotechnology Information - NCBI usando o procedimento Basic Local Alignment Search Tool - BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). A fim de prover consistência e qualidade das sequências, essas foram verificadas e alinhadas usando o software MEGA X (KUMAR; STECHER; TAMURA, 2016) e a exclusão de ambiguidades no alinhamento múltiplo foi realizada por meio do Gblock server 0.91b/2002 (CASTRESANA, J., http://molevol.cmima.csic.es/castresana/Gblocks_server.html). Para cada conjunto de sequências de nucleotídeos, a identidade de cada isolado foi determinada por comparação com isolados disponíveis no banco de dados do GenBank do NCBI usando o procedimento BLAST. A construção da árvore foi realizada pelo método Máxima Verossimilhança com o software MEGA X e editada no software Inkscape 1.1.1. 3.7 Ensaio de sensibilidade a fungicidas Para esse ensaio, utilizou-se os isolados MAC63 (Cladosporium sp.), MAC84 (Lasiodiplodia sp.) e MAC121 (Colletotrichum sp.) cultivados em meio BDA e mantidos em incubadora BOD a 25 ºC, em fotoperíodo de 12 h, por 9 dias para o MAC63 e por 7 dias para os demais isolados. O delineamento utilizado foi inteiramente casualizado com 6 tratamentos mais a testemunha e 3 repetições para o MAC63 e 5 repetições para os demais isolados. Na testemunha, utilizou-se ADE no ensaio com o MAC63 e BDA inócuo no ensaio com os isolados MAC84 e MAC121 e, para os fungicidas, a concentração foi mantida segundo a dose recomendada pelo fabricante de cada produto. Os https://thalljiscience.github.io/ 41 ingredientes ativos e suas respectivas concentrações utilizados foram: T1- procimidona (500 g/L); T2- hidróxido de cobre (538 g/Kg); T3- epoxiconazol + piraclostrobina (160 g/L + 260 g/L); T4- clorotalonil (720 g/L); T5- azoxistrobina + ciproconazol (200 g/L + 80 g/L) e T6- fluxapiroxade + piraclostrobina (167 g/L + 333 g/L). A avaliação da germinação utilizando o isolado MAC63 aconteceu em virtude do crescimento do Cladosporium sp. formar várias colônias no meio de cultura, inviabilizando uma medição precisa se o ensaio avaliasse o crescimento micelial. A suspensão do MAC63 foi preparada adicionando-se ADE sobre a cultura e a liberação dos conídios ocorreu com o auxílio de uma alça de Drigalski. O ensaio foi disposto em microplaca de poliestireno do tipo ELISA, na qual se misturou 100 µl da suspensão concentrada de esporos e 100 µl da solução do tratamento adaptada segundo a dose recomendada pelo fabricante. A microplaca foi envolvida por um plástico filme para evitar evaporação e contaminação e permaneceu por 24 h em BOD a 25 ºC, com fotoperíodo de 12 h. Após esse período, a determinação da percentagem de conídios germinados foi determinada por meio de contagem em uma câmara de Neubauer com o auxílio de um microscópio de luz. Para os demais isolados analisados, o ensaio foi disposto em placas de Petri. Discos de micélio de 5 mm de diâmetro foram depositados no centro de placas contendo meio BDA + fungicida. Para cada tratamento, retirou-se da suspensão estoque de cada fungicida a quantidade proporcional à quantidade de BDA utilizada, mantendo a concentração recomendada na bula. A placas foram mantidas em luz e temperatura ambiente, que variou de 22 a 31 °C. O crescimento micelial foi medido, ortogonalmente, diariamente, com auxílio de um paquímetro, até que os isolados da testemunha cobrissem a placa. A comparação das médias foi realizada por meio do teste Tukey a 5% de significância, utilizando o software Minitab 17.1.0. 3.8 Determinação da temperatura ideal de crescimento O isolado MAC63 (Cladosporium sp.) foi cultivado em BDA acidificado e mantido em incubadora a 25 ºC, com fotoperíodo de 12 h, avaliando-se o desenvolvimento até os 9 dias após o semeio. O MAC84 (Lasiodiplodia sp.) e o 42 MAC121 (Colletotrichum sp.) foram cultivados sob as mesmas condições, mas cresceram por 7 dias. Após esse período, discos de micélio de 5 mm de diâmetro foram depositados no centro de placas contendo meio BDA e incubados nas temperaturas 20, 25, 28 e 30 ºC, com fotoperíodo de 12 h para o MAC63. No segundo ensaio, para os isolados MAC84 e MAC121, testou-se em um dos tratamentos o crescimento micelial em temperatura ambiente que foi 23,5 °C (média da temperatura ambiente medida em dezembro de 2021 no LMA) e se avaliou, também, as temperaturas 23, 25 e 30 °C. O crescimento da colônia foi medido, ortogonalmente, a cada dois dias durante 15 dias, com auxílio de um paquímetro, até que os isolados em um dos tratamentos cobrissem toda a superfície do meio de cultura na placa. O delineamento do experimento foi inteiramente casualizado com 3 repetições para o MAC63 e 5 repetições para os isolados MAC84 e MAC121, sendo cada repetição uma placa de Petri. Os dados foram ajustados a diferentes modelos de regressão por meio do software Minitab 17.1.0. 43 4 RESULTADOS 4.1 Isolados obtidos e suas épocas de ocorrência Os isolados de microrganismos obtidos a partir de material vegetal de pomares de macadâmia da área de produção da empresa QueenNut Macadamia, predominantemente em Dois Córregos-SP, com sintomas de doença e, ocasionalmente com sinais de algum microrganismo, pertencem ao Reino Fungi e foram adquiridos no período de dezembro de 2019 a setembro de 2021 (quadro 2). Oomicetos não foram observados associados ou recuperados em nenhuma das amostras. Quadro 2- Isolados fúngicos associados às amostras de macadâmia Gênero associado Isolado* Origem geográfica Órgão coletado Data Lasiodiplodia MAC1 22º19'08"S 48º22'01"W Seção do tronco Dez/2019 Phoma MAC2 22º19'08"S 48º22'01"W Folha Dez/2019 Phomopsis MAC8 22º19'08"S 48º22'01"W Folha Mar/2020 Cladosporium MAC22 22º19'11"S 48º22'04"W Rácemo Abr/2020 Fusarium MAC29 22º19'03"S 48º20'34"W Fruto Abr/2020 Phoma MAC30 22º19'8,3"S 48º20'02"W Folha Mai/2020 Cladosporium MAC39 22º17'1"S 48º01'47"W Rácemo Jun/2020 Fusarium e Cladosporium MAC40 22º17'1"S 48º01'47"W Rácemo Jun/2020 Fusarium MAC41 22º17'1"S 48º01'47"W Rácemo Jun/2020 Cladosporium e Pestalotiopsis MAC42 22º17'1"S 48º01'47"W Rácemo Jun/2020 Fusarium e Cladosporium MAC43 22º17'1"S 48º01'47"W Rácemo Jun/2020 Phoma MAC44 22º17'1"S 48º01'47"W Folha Jun/2020 Cladosporium e Fusarium MAC45 22º17'1"S 48º01'47"W Rácemo Jun/2020 Cladosporium MAC47 22º17'1"S 48º01'47"W Rácemo Jun/2020 Cladosporium MAC49 22º17'1"S 48º01'47"W Rácemo Jun/2020 Cladosporium MAC50 22º17'1"S 48º01'47"W Rácemo Jun/2020 Cladosporium MAC51 22º17'1"S 48º01'47"W Rácemo Jun/2020 Cladosporium MAC60 22º19'12"S 48º22'02"W Rácemo Jul/2020 Cladosporium MAC61 22º19'12"S 48º22'02"W Rácemo Jul/2020 Cladosporium MAC62 22º19'12"S 48º22'02"W Rácemo Jul/2020 Cladosporium MAC63 22º19'12"S 48º22'02"W Rácemo Jul/2020 Cladosporium MAC68 22º19'12"S 48º22'02"W Rácemo Jul/2020 Cladosporium MAC69 22º19'12"S 48º22'02"W Rácemo Jul/2020 Cladosporium MAC72 22º19'08"S 48º22'04"W Rácemo Mar/2020 Cladosporium MAC73 22º19'08"S 48º22'04"W Rácemo Mar/2020 44 Cladosporium MAC74 22º19'08"S 48º22'04"W Rácemo Mar/2020 Cladosporium MAC75 22º19'08"S 48º22'04"W Rácemo Ago/2020 Cladosporium MAC76 22º19'08"S 48º22'04"W Rácemo Ago/2020 Cladosporium MAC77 22º19'08"S 48º22'04"W Rácemo Ago/2020 Rhizoctonia MAC80 17º21'00"S 39º35'06"W Ramo Set/2020 Lasiodiplodia MAC84 22º19'14"S 48º22'20"W Seção de tronco Nov/2020 Lasiodiplodia MAC87 22º19'05"S 48º22'00"W Seção de tronco Nov/2020 Lasiodiplodia MAC92 22º18'45"S 48º22'47"W Fruto Fev/2021 Lasiodiplodia MAC93 22º19'08"S 48º22'01"W Seção do tronco Fev/2021 Lasiodiplodia MAC94 22º18'41"S 48º22'16"W Seção do tronco Fev/2021 Lasiodiplodia MAC95 22º18'56"S 48º22'00"W Seção do tronco Fev/2021 Lasiodiplodia MAC96 22º18'45"S 48º22'47"W Seção do tronco Fev/2021 Pestalotiopsis MAC97 22º18'41"S 48º22'16"W Ramo Fev/2021 Pestalotiopsis MAC98 22º18'08"S 48º22'01"W Fruto Fev/2021 Pestalotiopsis MAC99 22º18'03"S 48º22'11"W Folha Fev/2021 Lasiodiplodia MAC101 22º18'50"S 48º22'02"W Seção de tronco Fev/2021 Phomopsis MAC103 22º18'50"S 48º22'02"W Folha Fev/2021 Lasiodiplodia MAC108 22º18'50"S 48º22'02"W Seção de tronco Fev/2021 Lasiodiplodia MAC110 22°22'02"S 48°27'22"W Seção de tronco Abr/2021 Lasiodiplodia MAC111 22°22'02"S 48°27'22"W Seção de tronco Abr/2021 Lasiodiplodia MAC112 22°22'02"S 48°27'22"W Seção de tronco Abr/2021 Lasiodiplodia MAC113 22°22'02"S 48°27'22"W Seção de tronco Abr/2021 Lasiodiplodia MAC114 22°22'02"S 48°27'22"W Seção de tronco Abr/2021 Lasiodiplodia MAC115 22°22'02"S 48°27'22"W Seção de tronco Abr/2021 Pestalotiopsis MAC116 22°22'02"S 48°27'22"W Seção de tronco Abr/2021 Lasiodiplodia MAC117 22°22'02"S 48°27'22"W Seção de tronco Abr/2021 Pestalotiopsis MAC118 22°22'02"S 48°27'22"W Seção de tronco Abr/2021 Pestalotiopsis MAC119 22°22'02"S 48°27'22"W Seção de tronco Abr/2021 Pestalotiopsis MAC120 22°22'02"S 48°27'22"W Seção de tronco Abr/2021 Colletotrichum MAC121 22°18'52"S 48°22'12"W Fruto Abr/2021 Colletotrichum MAC122 22°18'52"S 48°22'12"W Fruto Abr/2021 Lasiodiplodia MAC124.2 22°19'17"S 48°22'26"W Seção de tronco Abr/2021 Lasiodiplodia MAC125.2 22°19'21"S 48°22'25"W Seção de tronco Abr/2021 Lasiodiplodia MAC126.1 22°19'21"S 48°22'25"W Folha Abr/2021 Lasiodiplodia MAC126.2 22°19'21"S 48°22'25"W Seção de tronco Abr/2021 Lasiodiplodia MAC129.1 22°19'02"S 48°22'26"W Folha Abr/2021 Lasiodiplodia MAC131.2 22°19'01"S 48°22'24"W Seção de tronco Abr/2021 Lasiodiplodia MAC134.2 22°19'53"S 48°21'58"W Seção de tronco Abr/2021 Lasiodiplodia MAC135.1 22°18'52"S 48°22'12"W Folha Abr/2021 Lasiodiplodia MAC137.2 22°18'44"S 48°22'28"W Seção de tronco Abr/2021 Colletotrichum MAC143 17°10'15"S 39°34'34"W Folha Set/2021 Pestalotiopsis MAC144 17°10'15"S 39°34'34"W Folha Set/2021 *Código de trabalho dos isolados. Isolados representativos em negrito. Os isolamentos realizados de amostras de secção de tronco, apresentando sintoma aparentemente causado por Phytophthora, indicaram que tais sintomas não foram associados a esse microrganismo. 45 Em dezembro de 2019, os fungos Lasiodiplodia e Phoma foram isolados de amostras recebidas com sintoma de mancha tronco e mancha na folha, respectivamente (quadro 2). No ano de 2020, nas amostras analisadas, observou-se associação dos fungos Cladosporium (rácemo), Fusarium (rácemo e fruto), Pestalotiopsis (rácemo), Phoma (folha) e Phomopsis (folha) aos sintomas de doenças e sinais nos materiais vegetais nos órgãos coletados. Em 2021, as amostras analisadas foram, em sua maioria, associadas à Lasiodiplodia tanto em folhas como em seções de troncos e, em algumas amostras os sintomas em folhas e frutos foram associados aos fungos Colletotrichum (fruto e folha), Phomopsis (folha) e Pestalotiopsis (folha, fruto, ramo e seção de tronco). No período da coleta, segundo dados do Instituto Nacional de Meteorologia- INMET, a temperatura média foi de 19 a 28 °C e a umidade de 42 a 85%, de acordo com os meses de registro (figura 4). Figura 4- Dados mensais meteorológicos de 2019, 2020 e 2021 Dados compilados a partir do gráfico anual da estação automática Barra Bonita (A741) do Instituto Nacional de Meteorologia - INMET (https://tempo.inmet.gov.br/). T-média (temperatura média) e U-média (umidade média). Cladosporium (rácemo) foi o patógeno prevalente na área e ocorreu de março a agosto de 2020, que é a época de franca floração da macadâmia e quando a temperatura ficou em torno dos 23 °C e a umidade em 59% em Dois Córregos-SP. 0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 80,00 90,00 DEZ MAR ABR MAI JUN JUL AGO SET NOV FEV ABR SET 2019 2020 2020 2020 2020 2020 2020 2020 2020 2021 2021 2021 T- média (°C) U- média (%) https://tempo.inmet.gov.br/ 46 4.2 Teste de patogenicidade 4.2.1 Em rácemos destacados em laboratório Os dados do ensaio em caixas gerbox, com manutenção de alta umidade em todo o rácemo, indicaram que quanto mais avançado o estádio de desenvolvimento do rácemo, maior foi a prevalência de sintomas (anasarcas que, depois, tornam-se necróticas na ráquis) e sinais (rácemo envolvido por micélio de cor verde-oliváceo) dos isolados de Cladosporium sp. (MAC60, MAC63 e MAC69). Para os tratamentos com flores fecundadas, em que houve a inoculação dos isolados citados, observou- se 100 % de incidência dos isolados três DAI, visto que sinais do fungo e secamento dos rácemos foram observados (figura 5-A), enquanto o tratamento com flores em pré-antese não apresentou sintomas ou sinais dos isolados inoculados. O isolado Pestalotiopsis sp. (MAC42), no tratamento com flores fecundadas, apresentou crescimento micelial, em 100% dos rácemos três DAI, mas não foi possível confirmar se era o isolado inoculado, pois não produziu conídios ou manifestou sintomas; o mesmo ocorreu com o isolado Fusarium sp. (MAC45). Para esses dois isolados, no tratamento em flores em pré-antese, não houve aparecimento de sintoma ou qualquer sinal. A testemunha, em flores fecundadas, apresentou crescimento micelial esbranquiçado, sem a produção de conídios; e a testemunha com flores em pré-antese continuou inócua. Em relação à condução em frascos tubulares contendo ADE, sem exposição constante das flores a alta umidade, como não houve aparecimento dos sinais dos fungos inoculados, um blotter test foi realizado (figura 5-B). Após dois dias de incubação, os isolados de Cladosporium sp., MAC60 em flores pré-antese, MAC60 em flores fecundadas, MAC63 em flores pré-antese, MAC63 flores fecundadas e MAC69 em flores fecundadas apresentaram 100% de incidência (sinal do patógeno: crescimento micelial) dos isolados inoculados enquanto o isolado MAC69 em flores em pré-antese apresentou 80% de incidência deste fungo. O isolado MAC45 em flores em pré-antese e em flores fecundadas apresentou 100% de incidência de sinais do isolado em questão e também sinais de Cladosporium, que poderiam estar aguardando condições favoráveis para o seu desenvolvimento. Os tratamentos MAC42 em flores fecundadas e MAC42 em flores 47 em pré-antese não apresentaram sinais do isolado em questão, mas exibiram sinais de Cladosporium em 100% das flores. A testemunha em flores fecundadas e em flores em pré-antese apresentaram 100% de incidência de Cladosporium. A não observação de sinais nos ensaios realizados nos frascos tubulares indica que, embora Cladosporium esteja presente nas amostras, a manutenção de alta umidade é importante para que possa esporular e completar o seu ciclo. Figura 5- Teste de patogenicidade, em laboratório, de rácemos destacados de macadâmia (A) Rácemo coberto por micélio do isolado MAC63 do tratamento em caixas gerbox; (B) blotter test com flores cobertas por micélio do MAC63 oriundo do tratamento em frascos tubulares. 4.2.2 Em rácemos em campo Os rácemos, do tratamento controle, não apresentaram sinais de crescimento fúngico ou sintomas de doença. Dos isolados de Cladosporium sp. inoculados, o único que apresentou sinais (micélio de cor verde-oliváceo) e sintomas (necrose na ráquis e pontas necróticas) foi o MAC63 em flores em pré-antese e flores abertas. Os sintomas foram os mesmos observados em condições naturais de ocorrência da doença (Figura 6). Comparando com os resultados do ensaio, em laboratório, com rácemos destacados, em que as condições experimentais em câmara úmida de longo prazo favoreceram o crescimento de fungos saprofíticos não capazes de incitar doença quando em condições de campo; neste ensaio em campo, somente o MAC63 apresentou consistência em reproduzir os sintomas, originalmente, observados nas amostras recebidas do campo. 48 Os resultados também indicam que há diferença de agressividade entre os isolados deste fungo. Cabe ressaltar que os experimentos em campo foram realizados quando a temperatura média foi de 25,4 °C e umidade média de 55%. O isolado MAC63 foi capaz de manter capacidade em reproduzir os sintomas e sinais consistentemente, tanto em laboratório, com condição de temperatura e umidade controlados, quanto em campo. Figura 6- Sintomas causados por Cladosporium sp. (MAC63) observados em rácemos de macadâmia provenientes do ensaio de campo realizado em 2020 (A) Micélio verde-oliváceo do MAC63 em rácemo (flor fecundada); (B) necrose na ráquis do rácemo causada pelo MAC63; (C) micélio verde-oliváceo do MAC63 em rácemo (flor fecundada). No ensaio realizado em 2021, o MAC63 foi o único isolado capaz de causar sintomas (necrose na ponta da ráquis, as vezes curvando-a, formando a “cauda de rato”) em rácemos de macadâmia (figura 7). Desse modo, constatou-se que o isolado em questão conseguiu colonizar os rácemos, 10 DAI, em todos os períodos de câmara úmida, mas, no estádio de flores em pré-antese, submetidas a 48 e 72 horas de umidade, houve apenas o aparecimento de necrose na ráquis, principalmente na ponta, sem sinal do isolado MAC63 ou conídios. Os isolados MAC99 e MAC103 não apresentaram sintomas ou sinais dos isolados inoculados em nenhum estádio de desenvolvimento ou período de câmara úmida. A testemunha também estava sem nenhuma alteração no período em que os tratamentos com MAC63 foram analisados. 49 Figura 7- Sintomas causados por Cladosporium sp. (MAC63) observados em rácemos provenientes do ensaio de campo realizado em 2021 Rácemos inoculados com MAC63 submetidos a 24 h de câmara úmida: (A) rácemo em estádio de flor fecundada apresentando necrose inicial na extremidade da ráquis; (B) rácemo em estádio de flor aberta apresentando necrose na extremidade da ráquis; (C) rácemo em estádio de flor fecundada com necrose e encurvamento da extremidade da ráquis, formando a “cauda de rato”. 4.2.3 Em folhas Algumas amostras de folhas com queima de bordos demonstraram a presença de fungos morfologicamente semelhantes a Phoma/Phomopsis, associados ao tecido necrosado. Desse modo, o isolado representativo MAC103 foi inoculado em folhas sadias destacadas de macadâmia, mas não induziu nenhum sintoma ou sinal. Em relação ao isolado de Rhizoctonia sp. (MAC80), nenhum sintoma foi observado, visto que o sintoma esperado seria queima, iniciando pelo pecíolo. Os isolados de Cladosporium sp. (MAC60, MAC63 e MAC69) inoculados em mudas, não foram capazes de incitar nenhum sintoma ou promover a visualização de sinais dos fungos inoculados. 4.2.4 Em caule Os isolados de Lasiodiplodia sp. (MAC1, MAC84 e MAC87) foram capazes de colonizar o tecido das mudas de macadâmia e causar doença. Os primeiros sinais foram notados aos 30 DAI. Esses isolados foram capazes de necrosar o tecido, por 50 vezes com presença de exsudação de goma, resultando em cancro no caule, conforme os sintomas visualizados em condições de campo (figura 8). O isolado MAC84 foi escolhido como isolado representativo. Figura 8- Sintomas causados pelo isolado MAC84 de Lasiodiplodia sp. em caule de macadâmia (A) Sintomas associados à Lasiodiplodia sp. no campo (foto: Leonardo Moriya), (B) sintomas causados pelo MAC84, em casa de vegetação. 4.2.5 Em frutos O isolado de Fusarium sp. (MAC29), obtido de fruto com associação com fungo causando lesão necrótica, foi inoculado em frutos sadios de macadâmia, mas não se observou sintomas de doença em frutos com e sem ferimentos. Aos 15 dias após a inoculação do isolado Colletotrichum sp. (MAC121), os frutos com e sem ferimentos apresentaram sinais do isolado (mucilagem de cor laranja) e lesões, que quando pressionadas promoviam facilmente afundamento do carpelo e posterior lesão do endocarpo, reproduzindo os sintomas observados originalmente na amostra recebida (figura 9). 51 Figura 9- Sintomas e sinais causados pelo isolado MAC121 de Colletotrichum sp. no fruto de macadâmia (A) Sintomas e sinais observados em campo (foto: Leonardo Moriya), (B) sintomas e sinais observados em laboratório após a inoculação do MAC121, (C) podridão causada pelo isolado MAC121 na noz. 4.3 Caracterização cultural e morfológica A caracterização cultural foi realizada nos isolados comprovadamente patogênicos. O isolado de Cladosporium sp. (MAC63) caracterizou-se por apresentar um crescimento formando sulcos no meio, eventualmente, com o centro da colônia proeminente e por exibir colônias de coloração cinza a verde-oliváceo com aspecto pulverulento ou aveludado (figura 10-A); e no verso, a coloração variou de verde escuro a preto-oliváceo, por vezes difundindo pigmento amarelado ou alaranjado no meio de cultura (figura 10-B). O isolado produziu conidióforos macronematosos ou micronematosos, retos ou levemente flexuosos (figura 10-C); ramoconídios cilíndricos-oblongos, septados, medindo de 14,4 a 31,3 µm de comprimento e 2,6 a 3,7 µm de largura (figura 4-D); e numerosos conídios, ocasionalmente em cadeia, hialinos, limoniformes a elipsoides, medindo de 5,8 a 7,6 µm de comprimento e 2,8 a 3,5 µm de largura (figura 10-C). 52 Figura 10- Caracterização do isolado MAC63 de Cladosporium sp. (A) Frente da colônia; (B) verso da colônia; (C) conidióforo - CF e conídio - C, Bars= 10 µm; (D) ramoconídio - RM, Bars= 10 µm. O crescimento do isolado de Lasiodiplodia sp. (MAC84) teve como característica colônia com micélio aéreo e posterior formação de conidiomas. A coloração da colônia foi branca, no início do crescimento, e após alguns dias se tornou cinza-claro a escuro, com textura cotonosa (figura 11-A). No verso, a colônia possuiu coloração branca, no início do crescimento e, após alguns dias, também se tornou cinza-claro a escuro, sendo possível visualizar a presença de picnídios no meio de cultura (figura 6-B). Os conídios imaturos se apresentaram hialinos, elipsoidais e asseptados e os conídios maduros castanho-escuros, elipsoidais e arredondados nas extremidades, com o septo transversal centralizado, medindo de 21,2 a 29 µm de comprimento e 14,3 a 17 µm de largura. Não foi visualizada a formação de paráfises (figura 11-C). Figura 11- Caracterização do isolado Lasiodiplodia sp. (MAC84) (A) Frente da colônia; (B) verso da colônia; (C) conídios maduros, Bars= 10 µm. O isolado de Colletotrichum sp. (MAC121) teve crescimento radial e micélio aéreo denso. A colônia, inicialmente, apresenta coloração branca, tornando-se marrom-clara a acinzentada com bordas de cor branca, produz mucilagem 53 alaranjada (massa de conídios) no centro, e textura algodonosa (figura 12-A). No verso, a colônia, inicialmente, apresenta coloração branca, tornando-se marrom- clara a acinzentada com bordas de cor branca, com presença de picnídios, e a mucilagem é aparente no ponto do cultivo (figura 12-B). Os conídios se apresentaram unicelulares, hialinos, fusiformes com extremidades levemente arredondadas, às vezes oblongo, medindo de 11,5 a 17,3 µm de comprimento e 4,3 a 5,6 µm de largura. Os apressórios foram produzidos apenas por meio de microculturas, possuindo formato alongado, as vezes com forma de bastão. Não foi visualizado em material vegetal, cultura comum ou microcultura, a presença de setas (figura 12-C). Figura 12- Caracterização do isolado de Colletotrichum sp. (MAC121) (A) Frente da colônia; (B) verso da colônia; (C) apressório - AP e conídio - C, Bars= 10 µm. 4.4 Análise filogenética A identificação de Cladosporium sp. (MAC63) foi confirmada por meio da análise da região ITS, EF1α e ACT. A análise foi gerada através do alinhamento do MAC63 com isolados contendo os mesmos genes com acesso no GenBank (tabela 1). A árvore filogenética resultou em agrupar isolados similares geneticamente (figura 13), agrupando MAC63 ao acesso do GenBank para Cladosporium xanthochromaticum (UTHSC DI-13-211), indicando alta similaridade genética entre esses isolados. Ao ser confirmada a espécie do isolado, o isolado foi depositado na Coleção de Microrganismos de Importância Agrícola e Ambiental (CMAA) com o código CMAA1835. 54 Tabela 1- Espécies e isolados de Cladosporium usados na análise filogenética com números de acesso do GenBank *Espécie tipo. ITS - Espaçador Interno Transcrito, EF1α - Fator de Alongamento de Tradução 1-alfa e ACT - Actina. A espécie deste estudo está em fonte negrito e o isolado Cercospora beticola CBS 116456 foi utilizado como outgroup. Espécie Isolado N° de acesso no GenBank ITS EF1α ACT Cladosporium sp. CMAA1835 ---------------- --------------- --------------- Cladosporium angulosum UTHSC DI-13-235* LN834425 LN834521 LN834609 C. angustisporum CBS 125983* HM147995 HM148236 HM148482 C. asperulatum CBS 126340* HM147998 HM148239 HM148485 C. chalastosporioides CBS 125985* HM148001 HM148242 HM148488 C. cladosporioides CBS 113738 HM148004 HM148245 HM148491 C. cladosporioides CBS 112388* HM148003 HM148244 HM148490 C. exasperatum CBS 125986* HM148090 HM148334 HM148579 C. halotolerans CBS 119416* DQ780364 JN906989 EF101397 C. iranicum CBS 126346* HM148110 HM148354 HM148599 C. myrtacearum CBS 126350* HM148117 HM148361 HM148606 C. myrtacearum CBS 126349 HM148116 HM148360 HM148605 C. perangustum CPC 14911 HM148148 HM148392 HM148637 C. perangustum CPC 12793 HM148137 HM148381 HM148626 C. phaenocomae CBS 128769* JF499837 JF499875 JF499881 C. pseudocladosporioides CBS 667.80 HM148165 HM148409 HM148654 C. pseudocladosporioides CBS 125993* HM148158 HM148402 HM148647 C. scabrellum CBS 126358* HM148195 HM148440 HM148685 C. subuliforme CBS 126500* HM148196 HM148441 HM148686 C. tenuissimum CBS 126359 HM148198 HM148443 HM148688 C. tenuissimum CBS 125995* HM148197 HM148442 HM148687 C. verrucocladosporioides CBS 126363 HM148226 HM148472 HM148717 C. vicinum CPC:22316 MF473311 MF473734 MF474161 C. westerdijkiae CBS 113746 HM148061 HM148303 HM148548 C. xanthochromaticum UTHSC DI-13-211* LN834415 LN834511 LN834599 Cercospora beticola CBS 116456 NR_121315 AY840494 AY840458 55 Figura 13- Topologia de árvore de Máxima Verossimilhança de Cladosporium baseada em um alinhamento multilocus Árvore inferida pelo método Máxima Verossimilhança, usando o modelo de evolução Tn93 G+I (Tamura-Nei), obtida a partir das sequências combinadas ITS, TEF1α e ACT de isolados de espécies de Cladosporium. A(s) árvore(s) inicial(is) para a busca heurística foi(m) obtida(s) automaticamente aplicando os algoritmos Neighbor-Join e BioNJ a uma matriz de distâncias pareadas estimadas usando o modelo Tamura-Nei e, em seguida, selecionando a topologia com valor de probabilidade logarítmico superior. A árvore possui como outgroup o fungo Cercospora beticola CBS 116456. Os números nos ramos representam valores de suporte de bootstrap a partir de 70%. A identificação do isolado de Lasiodiplodia sp. (MAC84) foi confirmada por meio da análise da região ITS e TEF1α. A topologia gerada a partir do alinhamento do MAC84 com outros isolados (tabela 2) evidenciou que esse isolado, obtido do cancro no tronco de macadâmia, agrupou com os isolados de Lasiodiplodia pseudotheobromae - CBS116459 e IBL201 - com 99% de bootstrap (figura 14). Ao ser confirmada a espécie do isolado, ele foi depositado na Coleção de CBS 125983 CBS 12 500 CBS 12 359 CBS 125995 CBS 113738 CBS 112388 CBS 1287 9 CBS 12 3 3 CBS 7.80 CBS 125993 C C 2231 CBS 11374 CBS 12 340 CBS 12 350 CBS 12 349 CBS 12598 CBS 12 358 CBS 125985 CBS 11941 CBS 12 34 THSC DI 13 235 1 THSC DI 13 211 C C 14911 m C C 12793 CBS 11 45 94 97 99 100 100 99 99 97 80 79 79 74 90 0.20 94 97 99 100 100 99 99 97 80 79 79 74 90 0.20 56 Microrganismos de Importância Agrícola e Ambiental (CMAA) com o código CMAA1834. Tabela 2- Espécies e isolados de Lasiodiplodia usados na análise filogenética com números de acesso do GenBank Espécie Isolado N° de acesso no GenBank ITS EF1α Lasiodiplodia sp. CMAA1834 -------------- -------------- Lasiodiplodia brasiliense CMM2184 KC484801 KC481531 L. brasiliense CMM2188 KC484807 KC481537 L. caatinguensis CMM1325 KT154760 KT008006 L. caatinguensis IBL352* KT154759 KT154753 L. citricola CBS124707* GU945354 GU945340 L. citricola IRAN 1521C GU945353 GU945339 L. crassispora CMW 13448 DQ103552 DQ103559 L. crassispora CMW 14691* DQ103550 DQ103557 L. egyptiacae BOT 29 JN814401 JN814428 L. egyptiacae CBS 130992 JN814397 JN814424 L. gilaniensis CBS 124704 GU945351 GU945342 L. gilaniensis IRAN 1501C GU945352 GU945341 L. gonubiensis CBS 115812* DQ458892 DQ458860 L. gonubiensis CMW 14078 AY639594 DQ103567 L. hormozganensis CBS 124709* GU945355 GU945340 L. hormozganensis CMM 2214 KC484837 KC481561 L. iraniensis CBS 124710* GU945348 GU945336 L. iraniensis IRAN 1502C GU945347 GU945335 L. mediterranea ALG36 KJ638314 KJ638333 L. mediterranea CBS137783* KJ638312 KJ638331 L. marypalme CMM 2173 KC484839 KC481563 L. marypalme CMM 2172 KC484842 KC481566 L. pseudotheobromae CBS116459* EF622077 EF622057 L. pseudotheobromae IBL201 KT247478 KT247482 L. rubropurpurea WAC 12535* DQ103553 DQ103571 L. rubropurpurea WAC 12536 DQ103554 DQ103572 L. theobromae CBS 164.96* AY640255 AY640258 L. theobromae IBL340 KT247466 KT247472 Diplodia scrobiculata CBS 109944 AY236952 AY236901 *Espécie tipo. ITS - Espaçador Interno Transcrito e EF1α - Fator de Alongamento de Tradução 1-alfa. A espécie deste estudo está em fonte negrito e o isolado Diplodia scrobiculata CBS 109944 foi utilizado como outgroup. 57 Figura 14- Topologia de árvore de Máxima Verossimilhança de Lasiodiplodia baseada em um alinhamento multilocus Árvore inferida pelo método Máxima Verossimilhança, usando o modelo de evolução K2+G (Kimura 2), obtida a partir das sequências combinadas ITS e tef1 de isolados de espécies de Lasiodiplodia. A(s) árvore(s) inicial(is) para a busca heurística foram obtidas automaticamente aplicando os algoritmos Neighbor-Join e BioNJ a uma matriz de distâncias pareadas estimadas usando a abordagem Maximum Composite Likelihood (MCL) e, em seguida, selecionando a topologia com valor de probabilidade logarítmica superior. A árvore possui como outgroup o fungo Diplodia scrobiculata CBS 109944. Os números nos ramos representam valores de suporte de bootstrap a partir de 70%. A relação filogenética do isolado de Colletotrichum sp. (MAC121), utilizando sequências das regiões ITS, ACT, β-TUB e H3 (tabela 3) permitiram demonstrar que esse patógeno agrupou com o isolado de Colletotrichum siamense OCAC8 com CBS11 459 IBL201 1 ALG3 BL1 C 2214 C 2173 C 2272 IRAN1522C IRAN1521C BOT29 BOT10 IRAN1523C IRAN1501C IRAN1520C IRAN1502C C 21 8 IBL340 C 2184 C 2188 Lasiodiplodia brasiliense IBL3 IBL352 C 13488 AC12533 CBS115812 C 14078 AC12535 AC1253 CBS109944 99 99 99 99 98 98 99 95 9 91 88 92 70 0,050 99 99 99 99 98 98 99 95 9 91 88 92 70 0,050 58 bootstrap de 73% (figura 15). Ao ser confirmada a espécie do isolado, ele foi depositado na Coleção de Microrganismos de Importância Agrícola e Ambiental (CMAA) com o código CMAA1842. Tabela 3- Espécies e isolados de Colletotrichum usados na análise filogenética com números de acesso do GenBank Espécie Isolado Nº de acesso no GenBank ITS ACT β-TUB H3 Colletotrichum sp. CMAA1842 -------------- -------------- -------------- -------------- C. aenigma C12 KY986880 KY986883 KY986882 KY986886 C. alienum CBS 111982 KC297069 KC296932 KC297091 KC297034 C. alienum CBS 133930 KC297076 KC296938 KC297096 KC297038 C. aotearoa CBS 111962 KC297061 KC296926 KC297084 KC297050 C. aotearoa CBS 114139 KC297063 KC296927 KC297087 KC297055 C. fructicola CMTJ9 MH092006 MH113861 MH113908 MH113873 C. fructicola CMTJ18 MH092008 MH113863 MH113910 MH113874 C. gloesporioides CGM45 JX669445 JX827425 JX827449 JX827443 C. gloesporioides CBS 112999 JQ005152 JQ005500 JQ005587 KY856316 C. grevilleae CBS 132879 KC297078 KC296941 KC297102 KC297056 C. hystricis CPC 28154 KY856451 KY856024 KY856533 KY856366 C. hystricis CPC 28153 KY856450 KY856023 KY856532 KY856365 C. kahawae subsp. ciggaro CBS 111861 KC297057 KC296922 KC297080 KC297046 C. kahawae subsp. ciggaro CBS 114499 KC297058 KC296919 KC297081 KC297047 C. musae CBS:116870 JQ005777 JQ005840 JQ005861 JQ005819 C. proteae CBS 132882 KC297079 KC296940 KC297101 KC297045 C. proteae CBS 134301 KC842385 KC842373 KC842387 KC842383 C. siamense OCAC8 KJ813608 KJ813458 KJ813483 KJ813533 C. viniferum HTTJ6 MH092013 MH113868 MH113915 MH113875 C. boninense CBS 128526 JQ005162 JQ005510 JQ005596 JQ005423 ITS - Espaçador Interno Transcrito, ACT - Actina, β-TUB - β-Tubulina e H3 - Histona. A espécie deste estudo está em fonte negrito e o isolado Colletotrichum boninense CBS128526 foi utilizado como outgroup. 59 Figura 15- Topologia de árvore de Máxima Verossimilhança de Colletotrichum baseada em um alinhamento multilocus Árvore inferida pelo método Máxima Verossimilhança, usando o modelo de evolução Tn93+G (Tamura-Nei), obtida a partir das sequências combinadas ITS, ACT, β-TUB e H3 de isolados de espécies de Colletotrichum. A(s) árvore(s) inicial(is) para a pesquisa heurística foram obtidas automaticamente através da aplicação dos algoritmos Neighbor-Join e BioNJ a uma matriz de distâncias estimadas em pares usando o modelo Tamura-Nei, e depois selecionando a topologia com valor de probabilidade logarítima superior. A árvore possui como outgroup o fungo Colletotrichum boninense CBS128526. Os números nos ramos representam valores de suporte de bootstrap a partir de 70%. 4.5 Sensibilidade de isolados a fungicidas A sensibilidade do isolados CMAA1835 (Cladosporium xanthochromaticum) a diferentes fungicidas está apresentada na tabela 4. T2 (hidróxido de cobre), T3 (epoxiconazol+ piraclostrobina), T4 (clorotalonil), T5 (azoxistrobina + ciproconazol) e CBS 111982 CBS 133930 C C 28154 C C 28153 C12 C T 9 C T 18 1 OCA