RESSALVA Atendendo solicitação da autora, o texto completo desta tese será disponibilizado somente a partir de 16/12/2023 Campus de São José do Rio Preto Nayara Sousa de Alcântara Contessoto Estudos biofísicos moleculares e celulares na presença do composto anticâncer (Piperlongumina) utilizando microscopia de força atômica e técnicas espectroscópicas Departamento de Física Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas (IBILCE) Universidade Estadual Paulista (UNESP) São José do Rio Preto - SP 2021 Nayara Sousa de Alcântara Contessoto Estudos biofísicos moleculares e celulares na presença do composto anticâncer (Piperlongumina) utilizando microscopia de força atômica e técnicas espectroscópicas Tese apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutora em Biofísica Molecular, junto ao Programa de Pós-Graduação em Biofísica Molecular, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", Campus de São José do Rio Preto. Financiadora: CNPq - Proc. 141714/2017-4 e 163893/2018-7 Orientador: Prof. Dr. Marinônio Lopes Cornélio Coorientadora: Profa. Dra. Ching-Hwa Kiang São José do Rio Preto - SP 2021 C761e Contessoto, Nayara Sousa de Alcântara Estudos biofísicos moleculares e celulares na presença do composto anticâncer (Piperlongumina) utilizando microscopia de força atômica e técnicas espectroscópicas / Nayara Sousa de Alcântara Contessoto. -- São José do Rio Preto, 2021 125 f. : il., tabs. Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista (Unesp), Instituto de Biociências Letras e Ciências Exatas, São José do Rio Preto Orientador: Marinônio Lopes Cornélio Coorientadora: Ching-Hwa Kiang 1. Microscopia de Força Atômica. 2. Células HeLa. 3. Piperlongumina. 4. Espectroscopia de Força. 5. Espectroscopia de Fluorescência. I. Título. Sistema de geração automática de fichas catalográficas da Unesp. Biblioteca do Instituto de Biociências Letras e Ciências Exatas, São José do Rio Preto. Dados fornecidos pelo autor(a). Essa ficha não pode ser modificada. Nayara Sousa de Alcântara Contessoto Estudos biofísicos moleculares e celulares na presença do composto anticâncer (Piperlongumina) utilizando microscopia de força atômica e técnicas espectroscópicas Tese apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutora em Biofísica Molecular, junto ao Programa de Pós-Graduação em Biofísica Molecular, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", Campus de São José do Rio Preto. Financiadora: CNPq - Proc. 141714/2017-4 e 163893/2018-7 BANCA EXAMINADORA Prof. Dr. Marinônio Lopes Cornélio UNESP – São José do Rio Preto - SP Orientador Profa. Dra. Natália Bueno Leite Slade UFTM – Uberaba - MG Prof. Dr. Marcelo Andrés Fossey UNESP – São José do Rio Preto - SP Prof. Dr. Bruno de Almeida Carlos de Carvalho Pontes UFRJ – Rio de Janeiro - RJ Prof. Dr. Luís Guilherme Mansor Basso UENF – Rio de Janeiro - RJ São José do Rio Preto - SP 16 de Dezembro de 2021 Dedico esta tese à minha família, em especial ao meu filho amado Enrico Alcântara Contessoto. Agradecimentos Agradeço primeiramente a Deus. Ao Prof. Dr. Marinônio Lopes Cornélio pela orientação e ensinamentos. To Prof. Dr. Ching-Hwa Kiang for having me in her group, being my co-advisor, and all knowledge. Aos integrantes da banca Profa. Dra. Natália Bueno Leite Slade, e Profs. Drs. Bruno de Almeida Carlos de Carvalho Pontes, Luís Guilherme Mansor Basso e Marcelo Andrés Fossey pela presença e contribuições. À todos pesquisadores colaboradores, em especial aos Drs. Daniel Pereira Bezerra e José Maria Barbosa Filho; e às Dras. Sonia Maria Oliani e Eloiza Helena Tajara pela coordenação da colaboração. To research collaborator Dr. Ian Lian. To Rice University friends, group members, and employees which helped me in so many different ways during my period in Houston. Aos colegas do departamento e à Unesp pelo acolhimento e infra-estrutura fornecida; ao programa de pós-graduação em Biofísica Molecular. Aos servidores e docentes do Departamento de Física pela atuação profissional. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (Cnpq) pela bolsa de doutorado. Aos meus familiares, em especial aos meus pais, Rosali e Amaurício, e irmãos, Felipe e Rafael, pelo incentivo, dedicação, educação e carinho. Ao meu esposo Vinícius, meu amor, pelo carinho, amizade, compreensão, paciência, incentivo e apoio. Ao meu filho Enrico, meu presente de Deus, pelo amor mais puro que eu conheci. A todos que, direta ou indiretamente, contribuíram com a realização deste trabalho. "Em todas as circunstâncias, dai graças..." (1 Tessalonicenses 5:18) Resumo Compostos naturais apresentam grande potencial na pesquisa anticâncer, pela inibição do crescimento do tumor, pelas propriedades anti-metastáticas e anti-inflamatórias. A piperlongumina (PL) é um dos compostos naturais que tem se destacado. PL apresenta informações físico-químicas propícias que sugerem a possibilidade de ser carreada até seu alvo, através do plasma sanguíneo pela proteína HSA (albumina do soro humano) [1]. No presente estudo, investigamos as influências biofísicas deste composto em dois níveis: molecular e celular. Nas análises de biofísica molecular, monitoramos a supressão do espectro de emissão de fluorescência do peptídeo Ac2−26 da proteína Anexina A1, a qual atua como um mediador endógeno anti-inflamatório, durante titulações com PL. Entender como os componentes envolvidas em processos inflamatórios atuam e se interagem, a fim de potencializar seus efeitos, é importante dado que a inflamação crônica contribui para um microambiente suscetível à tumorigênese, favorecendo o desenvolvimento e progressão do câncer [2,3]. Nesta parte do trabalho foram obtidas informações energéticas, as quais indicaram a interação espontânea entre o peptídeo Ac2−26 e PL, a qual é dirigida por forças não-específicas. Tal informação motivou a colaboração para investigar os efeitos na proliferação e migração celular (células HUVEC e HEp-2) e na expressão gênica de mediadores inflamatórios [2, 3]. Nas análises de biofísica celular, utilizando espectroscopia de força de célula única baseada em Microscopia de Força Atômica (AFM), caracterizamos as propriedades de células HeLa em tratamento com PL. Estudos anteriores mostraram efeitos anticâncer nas células HeLa por PL [4–6]. No entanto não se sabe dos efeitos mecânicos deste sistema (PL-HeLa). Utilizamos AFM e obtivemos as curvas força-distância que mostraram padrões graduais. Analisamos a força do passo (SF) e observamos que as células tratadas com PL apresentam um valor maior de SF em comparação com as células controle. Este aumento de SF também foi observado em experimentos realizados em substratos com rigidez crescente. Portanto, os efeitos de PL nas propriedades mecânicas das células HeLa podem ser refletidos no parâmetro mensurável SF. Tais fatores mecânicos podem estar relacionados à tensão e flexibilidade da membrana [7–9]. A compreensão da influência de fármacos nas propriedades mecânicas das células pode ajudar no rastreamento de drogas terapêuticas eficazes contra o câncer. Palavras-chave: Microscopia de Força Atômica, Células HeLa, Piperlongumina, Espec- troscopia de Força, Espectroscopia de Fluorescência, Força de Passo, AFM, Piplartina, Anexina A1 (Ac2−26). Abstract Natural compounds have great potential in anticancer research by inhibiting tumor growth, anti-metastatic and anti-inflammatory properties. Piperlongumine (PL) is one of the natural compounds that has attracted attention. PL presents favorable physicochemical information that suggests the possibility of being carried to its target through the blood plasma by the HSA protein (human serum albumin) [1]. In the present study, we investigate the biophysical influences of this compound at molecular and cellular levels. In molecular biophysical analyses, we monitored the suppression of the fluorescence emission spectrum of the Ac2−26 peptide of the Annexin A1 protein, which acts as an endogenous anti-inflammatory mediator, during titrations with PL. Understanding how the components involved in inflammatory processes act and interact in order to potentiate their effects is important since chronic inflammation contributes to a microenvironment susceptible to tumorigenesis, favoring the development and progression of cancer [2,3]. In this part of the work, energetic information was obtained, indicating the spontaneous interaction between the peptide Ac2−26 and PL, driven by non-specific forces. This information motivated the collaboration to investigate the effects on cell proliferation, migration (HUVEC and HEp-2 cells), and gene expression of inflammatory mediators [2,3]. In cellular biophysics analyzes using single-cell force spectroscopy based on Atomic Force Microscopy (AFM), we characterized the properties of HeLa cells under PL treatment. The anti-cancer effects on HeLa cells by PL have been previously described [4–6]. Notwiths- tanding, there is no knowledge about the mechanical properties of this system (PL-HeLa). We used AFM and obtained the force-distance curves that showed gradual patterns. We analyzed the step force (SF) and observed that cells treated with PL had higher SF values compared to control cells. This increase in SF was also observed in experiments performed on substrates with increasing stiffness. Therefore, the effects of PL on the mechanical properties of HeLa cells can be reflected in the measurable parameter SF. Such mechanical factors may be related to the tension and flexibility of the membrane [7–9]. Understanding the influence of drugs on the mechanical properties of cells can help in screening effective cancer therapeutics drugs. Keywords: Atomic Force Microscopy, HeLa Cells, Piperlongumine, Force Spectros- copy, Fluorescence Spectroscopy, Tether Force, Step Force, AFM, Piplartine, Annexin A1 (Ac2−26). Lista de Figuras 1 Câncer: Taxas mundiais de incidência e de mortalidade. . . . . . . . . . . . 23 2 Câncer: Taxas estimadas de mortalidade mundial (mulheres x homens). . . 24 3 Estrutura química da Piperlongumina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 4 Porcentagem da distribuição dos compostos isolados de diferentes espécies pertencentes ao gênero Piper. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 5 Estrutura representativa da proteína Anexina A1 (ANXA1) e ligação à membrana. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28 6 Estrutura de NMR do peptídeo Ac 2-26, derivado da proteína Anexina A1 (ANXA1). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 7 Absorção da luz monocromática ao atravessar uma amostra. . . . . . . . . 32 8 Variação da transmitância com relação ao comprimento de caminho óptico. 33 9 Comparação dos mecanismos de supressão dinâmico e estático. . . . . . . . 36 10 Espectro de emissão do peptídeo da ANXA1 na ausência e presença de piperlongumina. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44 11 Gráfico de Stern-Volmer. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45 12 Gráficos duplo-logarítmicos e análises de Van’t Hoff da interação entre a PL e Ac2−26 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46 13 Contribuição energética da interação entre Ac2−26 e piperlongumina. . . . . 48 14 Tecido epitelial com outras células e matrizes extracelulares. . . . . . . . . 51 15 Principais componentes da matriz extracelular de células animais. . . . . . 52 16 Estrutura do citoesqueleto e suas principais subdivisões. . . . . . . . . . . 54 17 Organização estrutural dos microtúbulos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55 18 Ciclo celular - organização estrutural dos microtúbulos (MTs). . . . . . . . 56 19 Imagens de células Hela por microscopia óptica. . . . . . . . . . . . . . . . 59 20 Ajuste Lorentziano para o cálculo da constante da mola. . . . . . . . . . . 65 21 Esboço da formação do nanotubo na membrana celular. . . . . . . . . . . . 67 22 Representação dos passos de descongelamento à preparação da amostra de cultura celular. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71 23 Ciclo esquemático da subcultura celular. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72 24 Ciclo esquemático da subcultura celular e preparação da amostra no substrato de cultura com rigidez específica para análises no AFM. . . . . . . . . . . . 74 25 Materiais utilizados na montagem dos substratos de cultura celular com rigidez específica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75 26 Equipamento do AFM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77 27 Força de passo (SF, step force), da coleta à análise de dados. . . . . . . . . 78 28 Curva força-distância gerada pelo ciclo de aproximação e retração entre a superfície celular e o cantilever. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79 29 Rigidezes dos tecidos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82 30 Gráficos das distribuições da força de passo de células HeLa em função do tempo de tratamento (grupos controle e PL). . . . . . . . . . . . . . . . . . 85 31 Força de passo média em função do tempo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86 32 Gráficos das distribuições da força de passo de células HeLa em dependência da concentração de PL. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87 33 Gráficos das distribuições da força de passo de células HeLa em dependência do substrato para os grupos controle e PL. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89 Lista de Tabelas 1 Constante de supressão de Stern-Volmer e de afinidade da interação entre Ac2−26 e PL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47 2 Parâmetros termodinâmicos da interação PL–Ac2−26 . . . . . . . . . . . . . 48 3 Parâmetros para análise das forças de passo no AFM. . . . . . . . . . . . . 77 Lista de Abreviaturas Ac2−26 Peptídeo da região N-terminal da proteína Anexina A1 AFM Atomic Force Microscopy (Microscopia de Força Atômica) ANXA1 Proteína Anexina A1 ASR Age-Standardised Rate (Taxa padronizada pela idade) BM Membrana basal, do inglês basement membrane C Controle CAS number Número do registro no banco de dados do Chemical Abstracts Service DMEM Dulbecco’s Modification of Eagle Medium DMSO Dimethylsulfoxide DO Densidade óptica DS Deflection Sensitivity ECM Matriz extracelular, do inglês extracellular matrix FBS Fetal Bovine Serum HeLa Henrietta Lacks – células cancerígenas HSA Albumina do soro humano (Human Serum Albumin) MB Membrana Basal MM Massa molecular MT Microtúbulo Pen-Strep Penicillin – Streptomycin PL Piperlongumina, do inglês piperlongumine PBS Phosphate Buffered Saline PDB Banco de dados de proteínas (Protein Data Bank) ROS Espécies reativas de oxigênio, do inglês reactive oxygen species SF Step Force Força de passo/degrau SPM Microscópio de varredura por sonda (Scanning Probe Microscopy) STM Microscópio de varredura por tunelamento (Scan. Tunneling Micr.) TBA Tubulin-Binding Agent (Agente de ligação à tubulina) UV Ultravioleta Vis Visível WHO World Health Organization (organização mundial da saúde) Lista de Símbolos µM Micromolar µm Micrômetro mm Milímetro m Metro pN PicoNewton nN NanoNewton kPa KiloPascal s Segundo min Minutos H Horas ml Mililitro µl Microlitro kDa kilodalton ∆F Step Force (Força de Passo/Degrau) ∆SF Variação do Step Force ∆G0 Variação da energia livre de Gibbs ∆H0 Variação da entalpia ∆S0 Variação da entropia T Temperatura K Kelvin ε Coeficiente de extinção molar λex Comprimento de onda de excitação K’ Constante de supressão de Stern-Volmer KS Constante de supressão de Stern-Volmer (mecanismo estático) KSV Constante de supressão de Stern-Volmer (mecanismo dinâmico) Kq Constante de supressão bimolecular Ka Constante de afinidade kB Constante de Boltzmann n Número de sítios de interação (número estequiométrico) R Constante universal dos gases ideais QF Concentração do supressor livre QT Concentração do supressor total PT Concentração total da proteína / peptídeo PF Concentração da proteína / peptídeo livre QnP Concentração do supressor-peptídeo na interação F Intensidade de fluorescência da HSA na presença de piperlongumina F0 Intensidade de fluorescência da HSA na ausência de piperlongumina I Intensidade de luz transmitida I0 Intensidade de luz incidente dc.o. Comprimento do caminho óptico [C] Concentração Itransmitancia Transmitância β Constante de Proporcionalidade Fcorr Intensidade de fluorescência corrigida Fobs Intensidade de fluorescência observada Abs Absorbância Aex Absorbância no comprimento de onda de excitação Aem Absorbância no comprimento de onda de emissão IF Intensidade de fluorescência nFE Número de fótons emitidos nFA Número de fótons absorvidos EF Energia do fóton ΦF Rendimento quântico de fluorescência τ Tempo de vida de fluorescência τo Tempo de vida do fluoróforo na ausência do supressor pH Potencial hidrogeniônico k Constante de mola m Massa ω0 Frequência angular ressonante Fc−m Força de associação entre o citoesqueleto e a membrana Fg−m Força de associação entre o glicocálice e a membrana Fm Força para puxar um nanotubo composto puramente de membrana celular ft Força estática f0 Força do nanotubo na situação de equilíbrio δz Deslocamento do cantilever z0 Amplitude de oscilação do cantilever ρ Pressão γc−m Adesão membrana-citoesqueleto σ Tensão superficial da membrana σAP Tensão aparente da membrana κ Constante de flexão r Raio do nanotubo L Comprimento do nanotubo SF∞ Força de passo extrapolada para infinito SF0 Força de passo extrapolada para zero SFm Força de passo) média ESubstrate Rigidez do substrato ECell Rigidez da célula Ef Energia livre do nanotubo Sumário 1 Organização da Tese 20 2 Introdução 22 2.1 Câncer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 2.2 Piperlongumina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 3 Biofísica Molecular 26 3.1 Introdução – Biofísica Molecular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 3.1.1 Processos Inflamatórios . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 3.1.2 Anexina A1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 3.1.3 Ac2-26 Anexina A1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 3.2 Motivação e Objetivos – Biofísica Molecular . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 3.3 Princípios Espectroscópicos de Fluorescência . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 3.3.1 Características Gerais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 3.3.2 Absorção de Luz e Lei de Beer-Lambert . . . . . . . . . . . . . . . 31 3.3.3 Filtragem Interna . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34 3.3.4 Supressão de Fluorescência . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 3.3.5 Termodinâmica da Interação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39 3.4 Materiais e Métodos – Biofísica Molecular . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41 3.4.1 Compostos e Soluções . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41 3.4.2 Espectroscopia de Absorção Molecular UV-Visível . . . . . . . . . . 41 3.4.3 Espectroscopia de Fluorescência . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41 3.5 Resultados e Discussões – Biofísica Molecular . . . . . . . . . . . . . . . . 43 3.5.1 Supressão de Fluorescência . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43 3.5.2 Constantes de Afinidade . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44 3.5.3 Análises Termodinâmicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45 3.6 Conclusões – Biofísica Molecular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49 4 Biofísica Celular 50 4.1 Introdução – Propriedades Mecânicas Celulares . . . . . . . . . . . . . . . 50 4.1.1 Células Cancerígenas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50 4.1.2 Organização Celular: Matriz extracelular . . . . . . . . . . . . . . . 51 4.1.3 Organização Celular: Citoesqueleto . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52 4.1.4 Mecânica Celular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56 4.1.5 Agentes de Ligação à Tubulina (TBA) . . . . . . . . . . . . . . . . 57 4.1.6 Células HeLa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58 4.2 Motivação e Objetivos – Biofísica Celular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60 4.3 Princípios de Microscopia de Força Atômica – Biofísica Celular . . . . . . . 62 4.3.1 Forças nos Sistemas Biológicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62 4.3.2 Microscópio de Força Atômica (AFM) . . . . . . . . . . . . . . . . 62 4.3.3 Teoria - AFM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63 4.3.4 Calibração da Constante da Mola . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64 4.3.5 Pulling : afastamento após contato na superfície celular . . . . . . . 66 4.4 Materiais e Metodologia – Biofísica Celular . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70 4.4.1 Materiais e Soluções . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70 4.4.2 Cultura Celular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70 4.4.3 Aparato - AFM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75 4.4.4 Medidas de Força utilizando AFM - Pulling . . . . . . . . . . . . . 77 4.4.5 Análise da Força obtida pelo AFM . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80 4.4.6 Design do Experimento HeLa–PL utilizando AFM . . . . . . . . . . 81 4.5 Resultados e Discussões – Biofísica Celular . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83 4.5.1 Método de Validação do Protocolo . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83 4.5.2 Influências da Concentração . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84 4.5.3 Influências do Ambiente Extracelular . . . . . . . . . . . . . . . . . 86 4.6 Conclusões – Biofísica Celular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90 5 Conclusões Gerais 91 Referências 92 6 Anexos 106 ANEXO I - Artigo submetido referente ao trabalho da seção 4 (Biofísica Celular) ANEXO II - Material suplementar do artigo submetido referente ao trabalho da seção 4 (Biofísica Celular) ANEXO III - Artigo publicado referente à vertente de Biofísica Molecular: PL x HSA ANEXO IV - Artigo publicado referente ao trabalho da seção 3 (Biofísica Molecular): PL x Ac2-26 (Anexina A1) 1 Organização da Tese Esta tese apresenta a investigação da influência de um composto natural, Piperlongumina (PL), nos níveis moleculares e celulares, na temática de biofísica. No nível de biofísica molecular, mapeou-se as interações de PL com macromoléculas (peptídeo e proteína) utilizando espectroscopia de fluorescência. Já no nível de biofísica celular foram analisadas células cancerígenas, utilizando microscopia de força atômica. No capítulo 2 encontra-se uma introdução da temática do câncer e do composto utilizado nos ensaios moleculares e celulares, a piperlongumina. PL vem se destacando diante suas atividades farmacológicas, dentre as quais exibe propriedades anti-inflamatória e antitumoral [10, 11]. O capítulo 3 é referente à vertente de biofísica molecular. Apresenta-se a pesquisa em colaboração com outros grupos, onde gerou-se o trabalho intitulado "Biological and physical approaches on the role of piplartine (piperlongumine) in cancer", o qual foi publicado na Scientific Reports (ANEXO IV - Artigo publicado referente ao trabalho da seção 3 (Biofísica Molecular): PL x Ac2-26 (Anexina A1)) [2] e coordenado pela Profa. Dra. Eloiza Helena Tajara. Neste capítulo procura-se entender e discutir a interação físico- química da piperlongumina com o peptídeo (Ac2−26) da Anexina A1 (ANXA1) através de análises da supressão dos espectros de fluorescência. No manuscrito encontra-se: uma parte introdutória que aborda as características do sistema molecular da ANXA1; metodologia e princípios bem detalhados, dirigidos aos objetivos utilizando espectroscopia de fluorescência; os resultados e discussões das análises têm foco nos parâmetros termodinâmicos da interação Ac2−26–PL. Já o capítulo 4 é referente à vertente de biofísica celular, o qual encontra-se mais detalhada nesta tese. Apresenta-se, nesta seção, a pesquisa desenvolvida durante o estágio de doutoramento na Rice University (Houston-TX, EUA), sob supervisão da Profa. Dra. Ching-Hwa Kiang. Tal projeto gerou o trabalho intitulado "Quantifying the Effect of Anti-cancer Compound Piperlongumine on Cancer Cells Using Single-Cell Force Spectroscopy", o qual foi submetido para publicação na Scientific Reports (ANEXO I - Artigo submetido referente ao trabalho da seção 4 (Biofísica Celular) e ANEXO II 20 - Material suplementar do artigo submetido referente ao trabalho da seção 4 (Biofísica Celular)) [12]. Neste capítulo procura-se entender e discutir o efeito da piperlongumina nas células HeLa através de análises de curvas força-distância. Os dados obtidos são gerados diretamente pelo microscópio de força atômica (AFM), o qual possui uma sensibilidade de forças na ordem de picoNewtons. No manuscrito encontra-se: uma parte introdutória que aborda as características do sistema celular com foco na parte mecânica; metodologia e princípios bem detalhados, dirigidos aos objetivos utilizando AFM; resultados e conclusões das análises, com foco nas propriedades mecânicas da célula, mensuradas através da força de desprendimento ou ruptura do nanotubo formado entre a célula e a sonda do AFM, durante o processo de "puxar"a superfície celular. Adicionalmente, foi finalizado o trabalho intitulado "An investigation into the interaction between piplartine (piperlongumine) and human serum albumin", o qual encontra-se publi- cado na Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy (ANEXO III - Artigo publicado referente à vertente de Biofísica Molecular: PL x HSA) [1] coordenado pelo Prof. Dr. Marinônio Lopes Cornélio. No trabalho, investigou-se a interação da PL com a proteína albumina do soro humano (HSA), a qual é presente no plasma sanguíneo e tem papel de carreadora de fármacos. Através da técnica de espectroscopia de fluorescência e análises da supressão, caracterizou-se os parâmetros da interação (termodinâmicos e região da interação através de análises de competição de sítios) [13]. 21 2 Introdução Apresenta-se nesta seção uma introdução geral do composto utilizado, piperlongumina, e uma breve motivação do estudo na temática do câncer, em contextos gerais. 2.1 Câncer A área de pesquisa do câncer, é ainda uma temática desafiadora e de interesse mundial. O câncer é uma das principais causas de morte, em 2020 foi responsável por quase 10 milhões de mortes no mundo (Figura 1) [14,15], as incidências mais comuns foram câncer de pulmão, seguido de colorretal, fígado, estômago e mama (Figura 2). As doenças cancerígenas têm duas preocupações principais: o crescimento celular e a migração celular [16]. A metástase, por ser a causa da maioria das mortalidades em pacientes com câncer, tem recebido cada vez mais atenção, tanto na pesquisa científica quanto na clínica [17]. O entendimento, nos níveis molecular e celular, do processo letal do câncer é de grande importância científica [17]. Neste trabalho apresenta-se abordagens biofísicas nos dois níveis: – Estudo da interação da macromolécula presente no processo da inflamação (Anexina A1) com o composto anticâncer (Piperlongumina), seção 3. – Estudo das propriedades mecânicas de células cancerígenas (HeLa) na presença do composto anticâncer (Piperlongumina), seção 4. Algumas características gerais da Piperlongumina estão apresentadas nesta seção. Já nas seções 3 e 4 há introduções específicas para os referidos sistemas. 2.2 Piperlongumina Compostos naturais tem se destacado perante o tratamento e prevenção de várias doenças [18]. Neste trabalho, um composto anticancerígeno foi escolhido, a piperlongu- 22 Figura 1: Câncer: taxas mundiais de incidência (acima) e de mortalidade (abaixo), padronizadas pela idade (ASR, age-standardised rate), estimadas pela WHO (organização mundial da saúde) em 2020. Figura adaptada de [15]. 23 Figura 2: Câncer: taxas estimadas de mortalidade mundial de mulheres (à esquerda) e de homens (à direita) em 2020, pela WHO (organização mundial da saúde). Figura adaptada de [15]. mina (PL, Figura 3), do inglês piperlongumine, ou como também conhecida, piplartina, cuja nomenclatura oficial é 5,6-dihidro-1-[(2E)-1-oxo-3-(3,4,5-trimetoxifenil)-2-propen-1- il]-2(1H)-piridinona. A piperlongumina possui massa molecular igual a 317.3g/mol, e é isolada a partir de cascas do caule e raízes de diferentes espécies de pimenta, como Piper tuberculatum L. (pimenta-d’arda), Piper longum L. (pimenta longa), entre outras [19–24]. Figura 3: Estrutura química da Piperlongumina (C17H19O5N) [20,25]. Das 112 espécies do gênero Piper, foram isolados 667 diferentes compostos, os quais são classificados nas seguintes categorias (Figura 4): alcalóides/amidas, kavapironas, chalconas/di-hidrochalconas, terpenos, flavonas, neolignanas, esteróides, lignanas, flavano- nas, propenilfenóis, piperolídeos, entre outros (alcanos, álcoois, ácidos, ésteres, etc.) [22,26]. 24 A piperlongumina, pertence ao grupo dos alcalóides/amidas. Figura 4: Porcentagem da distribuição dos compostos isolados de diferentes espécies pertencentes ao gênero Piper, organizados por famílias [22, 25,26]. (*) Demais compostos que não se enquadram nos grandes grupos comuns de metabólitos secundários [13]. O uso de piperlongumina é relatado há milhares de anos pela prática Ayurveda, uma medicina alternativa desenvolvida na Índia [22,23,27]. Estudos in vivo e in vitro apresentam várias propriedades farmacológicas promissoras da piperlongumina, como, por exemplo, genotóxica, citotóxica, antimetastática, antitumoral e anti-inflamatória [10, 11,20,25,28]. O alvo da PL pode ser alcançado através do plasma sanguíneo, conforme observado nos estudos in vitro e in vivo [1,10,20,28]. Recentemente, o trabalho de Meegan et al. apresentou PL como um agente desestabilizador de microtúbulos com efeitos antiproliferativos em células de câncer de mama [29]. Além disso, o estudo de Henrique et al. mostrou o efeito inibitório da PL na expressão de α-tubulina em células endoteliais [2]. Agentes que alvejam o microtúbulo, também conhecidos como agentes de ligação à tubulina (TBA), são potentes venenos mitóticos que inibem a proliferação de células eucarióticas, promovem a morte celular pela supressão da instabilidade dinâmica dos microtúbulos e interferem com o transporte intracelular [30–32]. PL apresenta diferentes mecanismos de ação e tem sido proposta como um potencial fármaco anticâncer e um composto interessante a ser investigado [4, 10,33]. 25 4.6 Conclusões – Biofísica Celular Compreender as propriedades biomecânicas nas células após o efeito do fármaco pode ajudar a elucidar o mecanismo das atividades dos compostos anticâncer. Nesse contexto, a Microscopia de Força Atômica (AFM) é uma técnica que pode ser utilizada para quantificar a resposta do fármaco na célula. Aqui, nós empregamos experimentos de AFM para investigar as propriedades biomecânicas das células cancerígenas sob influência de um composto anticâncer. As células HeLa foram exploradas em diferentes condições de tratamento utilizando o composto e alterando o substrato de cultura (rigidez). Os resultados indicaram que a força de passo (SF) é sensível ao tempo de ação do fármaco; a piperlongumina (PL) atua nas células HeLa nas primeiras 6 horas de tratamento. Além disso, SF é sensível à concentração do composto; os experimentos com células HeLa apresentam um aumento de SF entre 5 e 10 µM de tratamento com PL, uma variação em torno de 10 pN. Além do tempo de ação e da concentração do composto, o SF também é sensível às alterações do citoesqueleto. As células HeLa na presença de 10 µM de PL aumentaram a força de passo (∆SF10µM−C ≈ 10pN) em comparação com o controle, independentemente da rigidez do substrato. Recentemente, PL foi descrita na literatura como um agente desestabilizador de microtúbulos [29]. Neste estudo, observamos um aumento nos valores da força de passo de experimentos com células HeLa na presença da piperlongumina em diferentes ensaios (tempos de ação, concentrações do fármaco e substratos de cultura). Esse incremento do SF sugere que a PL atua de forma direcionada ao microtúbulo das células HeLa. O fluxograma de experimentos de AFM apresentados aqui mostram um procedimento eficaz para caracterizar as interações gerais entre fármacos anticâncer e linhagens de células cancerígenas. 90 5 Conclusões Gerais A interdisciplinaridade tem sido bastante benéfica em muitas áreas de pesquisa. Nesta tese busca-se compreender, a partir de conceitos e leis físicas de sistemas ma- cro/microscópicos, os fenômenos biológicos. Efeitos biofísicos do composto anticâncer (PL) foram observados em proteínas e células. Na seção de biofísica molecular, a interação de PL com macromoléculas foi caracterizada utilizando espectroscopia de fluorescência. Já na seção de biofísica celular, a qual, nesta tese, é dada mais enfoque, aplicamos microscopia de força atômica (AFM) para quantificar as influências da PL nas propriedades mecânicas das células HeLa. Observamos experimentalmente a orquestração do citoesqueleto em escala de força (SF) induzida pelo microambiente e pela ação do fármaco (PL). 91 Referências [1] Nayara Sousa Alcântara-Contessoto, Ícaro Putinhon Caruso, Daniel Pereira Bezerra, José Maria Barbosa Filho, and Marinônio Lopes Cornélio. An investigation into the interaction between piplartine (piperlongumine) and human serum albumin. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, May 2019. [2] Tiago Henrique, Caroline de F. Zanon, Ana P. Girol, Ana Carolina Buzzo Stefanini, Nayara S. de A. Contessoto, Nelson J. F. da Silveira, Daniel P. Bezerra, Edilberto R. Silveira, José M. Barbosa-Filho, Marinonio L. Cornélio, Sonia M. Oliani, and Eloiza H. Tajara. Biological and physical approaches on the role of piplartine (piperlongumine) in cancer. Scientific Reports, 10(1):22283, December 2020. [3] Caroline de Freitas Zanon de Carvalho. 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