WESLEI DIEGO PAVINI Determinação de compostos orgânicos voláteis gerados em processos biológicos de produção de hidrogênio usando LLME-GC-FID Dissertação apresentada ao Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Química Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Sequinel Co-orientador: Prof. Dr. Danilo Luiz Flumignan Araraquara 2017 DADOS CURRICULARES IDENTIFICAÇÃO Nome: Weslei Diego Pavini Nome em citações bibliográficas: Pavini, Weslei Diego; Pavini, Weslei D.; Pavini, W. D. ENDEREÇO PROFISSIONAL Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP, Campus de Araraquara, Instituto de Química de Araraquara: Rua Prof. Francisco Degni, n. 55, Bairro Quitandinha, CEP: 14800-060 Araraquara/SP, Brasil. FORMAÇÃO ACADÊMICA/TITULAÇÃO 2015-2017: Mestrado em Química Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP, Araraquara/SP, Brasil. Título: Desenvolvimento de método analítico por LLME-GC-FID para determinação de álcoois e compostos orgânicos voláteis obtidos como produtos intermediários em processos biológicos para produção de hidrogênio. Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Sequinel. Co-orientador: Prof. Dr. Danilo Luiz Flumignan Bolsista da Coordenação de aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Grande área: Química 2014-2015: Pós-Graduação Lato Sensu em Álcool e Açúcar: das matérias primas a produção e análise de qualidade Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia de São Paulo – IFSP, Matão/SP, Brasil. Título: Compostagem orgânica: elaboração, aplicações, e tendências atuais Orientador: Prof. Dr. Christiann Davis Tosta Grande área: Ciências Agrárias, Exatas e da Terra. 2007-2011: Graduação em Licenciatura Plena em Química. Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP, Araraquara/SP, Brasil. Grande área: Química 2004-2005: Curso Técnico em Química Escola Municipal Adelino Bordignon, Matão/SP, Brasil. Grande área: Química FORMAÇÃO COMPLEMENTAR 2017-2017: Curso de operação GC-MS/MS. Thermo Fisher Scientific. Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia, Matão - SP, Brasil. 22h 2017-2017: Curso de operação LC-MS/MS. Thermo Fisher Scientific. Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia, Matão - SP, Brasil. 32h 2017-2017: MATLAB – Curso de verão. SynBio. Universidade Estadual Paulista, Araraquara - SP, Brasil. 20h 2015-2015: Seminário técnico de cromatografia. Allcrom, Araraquara - SP, Brasil. 08h 2015-2015: Green Belt - Six Sigma. RL & Associados. Araraquara - SP, Brasil. 40h 2013-2013: Lean Six Sigma - BMGI Open Access (online). 80h 2011-2011: Curso teórico de GC/MS – Universidade Estadual Paulista, Araraquara - SP, Brasil. 30h 2010-2010: Curso teórico de HPLC – Universidade Estadual Paulista, Araraquara - SP, Brasil. 60h 2010-2010: Estatística – Universidade Estadual Paulista, Araraquara - SP, Brasil. 90h ATUAÇÃO PROFISSIONAL 2012-2013: CITROSUCO S/A AGROINDUSTRIA Rua João Pessoa, 305 – Matão/SP, Brasil. CNPJ: 33.010.786/0001-87 Analista laboratório Central 2005-2012: CITROVITA AGROINDUSTRIAL LTDA Rod. Carl Fischer, 6000 – Conjunto B, Zona Rural – Matão/SP, Brasil. CNPJ: 33.010.786/0115-45 Analista de laboratório I IDIOMAS Inglês em nível intermediário (escrita, leitura e conversação) Espanhol em nível básico (escrita, leitura e conversação) PRODUÇÃO BIBLIOGRÁFICA Apresentação de trabalho / Participação em congresso Participação e apresentação de painel intitulado “Desenvolvimento de método analítico por LLME-GC-FID para determinação de compostos orgânicos voláteis obtidos como produtos intermediários em processos biológicos para produção de hidrogênio” no 18º Encontro Nacional de Química Analítica, realizado no período de 18 a 21 de setembro de 2016 em Florianópolis - Santa Catarina, Brasil. Participação e apresentação oral intitulada “Desenvolvimento de método analítico por LLME- GC-FID para determinação de compostos orgânicos voláteis obtidos como produtos intermediários em processos biológicos para produção de hidrogênio” no 7º Congresso de Inovação, Ciência e Tecnologia do IFSP, realizado no período de 30 de novembro a 02 de dezembro de 2016 em Matão - São Paulo, Brasil. Participação e apresentação de painel intitulado “Método analítico de LLME-GC-FID para análise de VOCs em biorreatores de produção de hidrogênio” no I Simpósio Paranaense de Hidrogênio, realizado no período de 26 a 28 de abril de 2017 na Universidade Federal do Paraná, Palotina - Paraná, Brasil. Dedico este trabalho a todos os interessados em fazer uso do método proposto, desejoso de que este possa ser compartilhado e agregue valor às atividades profissionais, ao meio ambiente e a sociedade. AGRADECIMENTOS À Deus, pelo dom da vida, pela saúde e perseverança; que suas benções e sabedoria recaiam sobre nós. À minha família pelo apoio em mais uma etapa da vida. À UNESP, docentes, orientador, co-orientador e amigos, pela convivência harmoniosa e aprendizado compartilhado. À CAPES, pela bolsa de estudo que viabilizou o desenvolvimento deste trabalho. Ao CEMPEQC e a todos os colaboradores e estagiários pelo acolhimento, investimento e sobretudo pela amizade proporcionada. Quisera termos sabedoria para aplicar todo o conhecimento adquirido desde sua concepção, que todo conhecimento não fosse em vão, que a consciência e responsabilidade fossem nossa motivação. Quão sábia e justa seria a sociedade, quão equilibrado e desenvolvido seria nosso mundo. (PAVINI; SILVA, 2015) Fonte: Mayhew; Simmon; NASA, 1994 RESUMO Biorreatores têm sido estudados para obtenção de H2, um produto de alto valor agregado usado na indústria química e afim e na produção de energia. Neste trabalho foi desenvolvido um método para análise de compostos orgânicos voláteis (VOCs) produzidos em biorreatores para auxiliar na pesquisa e no controle operacional da produção de H2. Com base nos compostos de interesse foi otimizado um procedimento de microextração líquido-líquido (LLME) para recuperação destes do meio aquoso. Para isto foi usado 400 µL de 1-octanol, um solvente lipofílico e biodegradável, sulfato de sódio e 1,2 mL de amostra. Em seguida foi desenvolvido um método de separação e detecção por cromatografia em fase gasosa acoplada a um detector de ionização em chama (GC-FID). A separação foi feita usando coluna de polietilenoglicol de 30 m de comprimento e hélio como gás de arraste. O tempo de análise total foi de 16 min. Através deste método foi possível extrair, separar e quantificar 12 compostos: acetona, metanol, etanol, 1-propanol, 1-butanol, ácido acético, ácido propiônico, ácido butírico, ácido isovalérico, ácido valérico, ácido capróico e ácido láctico. Todas as curvas analíticas foram validadas usando a análise de variância (ANOVA). Além disso, foram calculadas algumas figuras de mérito, como o limite de detecção, o intervalo de quantificação, a exatidão e a precisão. Foram realizados testes de efeito matriz e estabilidade da amostra. Algumas amostras provenientes dos biorreatores de produção de H2 foram analisadas através do método proposto. O método desenvolvido mostrou-se preciso, exato e tem vasta gama de aplicação. Palavras-chave: Ácido lático. Ácidos orgânicos. Cromatografia a gás. Biorreatores. Álcool octílico. ABSTRACT Bioreactors have been studied to obtain H2, a high value-added product used in the chemical and allied industry and in energy production. In this work a method was developed for the analysis of volatile organic compounds (VOCs) produced in bioreactors to assist in the research and operational control of H2 production. Based on the compounds of interest, a liquid-liquid micro extraction procedure (LLME) was optimized for recovery of these from the aqueous medium. 400 μl of 1-octanol, a lipophilic and biodegradable solvent, sodium sulfate and 1.2 mL of sample were used for this. Next, a separation and detection method was developed by gas chromatography coupled to a flame ionization detector (GC-FID). The separation was done using 30 m polyethylene glycol column and helium as carrier gas. The total analysis time was 16 min. This method was used to extract, separate and quantify 12 compounds: acetone, methanol, ethanol, 1-propanol, 1-butanol, acetic acid, propionic acid, butyric acid, isovaleric acid, valeric acid, caproic acid and lactic acid. All analytical curves were validated using analysis of variance (ANOVA). In addition, some figures of merit were calculated, such as limit of detection, interval of quantification, accuracy and precision. The matrix effect and stability of the samples were also performed. Some samples from the H2 production bioreactors were analyzed using the proposed method. The method developed proved accurate, precise and has a wide range of application. Keywords: Lactic acid. Organic acids. Gas chromatography. Bioreactors. Octyl alcohol. LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1- Rota metabólica da fermentação do glicerol. ............................................. 26 Figura 2 - Esquema representativo do planejamento do projeto. .............................. 30 Figura 3 - Cromatógrafo de fase gasosa Trace GC Ultra. ......................................... 31 Figura 4 - Avaliação da coluna DB-5MS, após condicionamento e várias injeções de 1 µL de metanol puro. .......................................................................... 36 Figura 5 - Avaliação da coluna HP-1, após condicionamento e várias injeções consecutivas de 1 µL de solução de propanol e butanol em metanol, 1000 mg L-1. ...................................................................................................... 36 Figura 6 - Avaliação da coluna ZB-WAX, após condicionamento e injeção de 1 µL de octanol. ................................................................................................ 37 Figura 7 - Comparação entre as técnicas a) cold needle, b) air plug e c) solvent flush. ......................................................................................................... 39 Figura 8 - Cromatograma ilustrando a simetria do ácido butírico na técnica cold needle (traço em preto) e air plug (traço em azul) nas mesmas condições de separação, utilizando uma amostra de 1000 mg L-1. ........................... 42 Figura 9 - Cromatogramas da região do a) ácido propiônico, b) ácido butírico e c) ácido valérico nas vazões estudadas. ...................................................... 46 Figura 10 - Cromatogramas da região do a) ácido propiônico, b) ácido butírico e c) ácido valérico com vazão e volume otimizados. ....................................... 47 Figura 11 - Cromatograma da separação dos analitos de interesse e padrões internos em octanol. ................................................................................. 49 Figura 12 - Gráfico da concentração do composto(s) desconhecido em função do tempo. ...................................................................................................... 64 Figura 13 - Carta de controle estatístico de processo do álcool isobutírico e ácido crotônico em solução aquosa. .................................................................. 69 Figura 14 - Carta de controle estatístico de processo do álcool isobutírico e ácido crotônico em solução de octanol. ............................................................. 69 Figura 15 - Correlação entre a área de cada padrão interno a) na solução aquosa e b) na solução de octanol. ...................................................................... 70 Figura 16 - Ilustração do programa de aquecimento versus a separação dos analitos (1000 mg L-1). Da esquerda para direita: acetona, metanol, etanol, 1- propanol, álcool isobutírico (PI), 1-butanol, ácido acético, ácido propiônico, ácido butírico, ácido isovalérico, ácido valérico, ácido crotônico (PI), ácido capróico e ácido láctico. .................................................................. 73 Figura 17 - Cromatograma de separação da curva analítica (1000 mg L-1). ............. 75 Figura 18 - Comparativo entre extração de amostra de biorreatores a) sem correção de pH e b) com correção de pH................................................................ 78 Figura 19 - Comparação entre os testes de efeito matriz para o ácido láctico. ......... 81 Figura 20 - Cromatograma dos padrões e solvente na concentração de 50 g L-1. .... 85 Figura 21 - Espectro de massas para o ácido láctico. ............................................... 86 Figura 22 - Espectro de massas na região do tR do ácido láctico. ............................ 87 Figura 23 - Espectro de massas do 1,3-butanodiol. .................................................. 88 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Relação dos padrões adquiridos para execução do projeto. ...................... 33 Tabela 2 - Condições cromatográficas iniciais. ........................................................... 34 Tabela 3 - Relação dos ajustes realizados no sistema de amostragem. ..................... 38 Tabela 4 - Avaliação comparativa do desvio padrão relativo das áreas das bandas cromatográficas, entre as técnicas de injeção, cold needle, air plug e solvent flush. ............................................................................................ 40 Tabela 5 - Resultado da análise comparativa entre a técnica cold neddle e air plug. . 41 Tabela 6 - Resultado comparativo entre a injeção com e sem o uso da lã de vidro. ... 43 Tabela 7 - Relação da área relativa em função da velocidade de injeção, DPR total (entre as médias de 20 a 50 µLs-1), parcial (entre as médias de 20 a 40 µLs-1) e teste t de Student. ....................................................................... 44 Tabela 8 - Resultados de Resolução, Encaudamento, Assimetria e Altura (USP). ..... 45 Tabela 9 - Resultados de Resolução, Encaudamento, Assimetria e Altura com vazão e volume otimizados. ................................................................................ 47 Tabela 10 - Resultados das análises de injeção em diferentes temperaturas do injetor. ....................................................................................................... 47 Tabela 11 - Avaliação do desvio padrão relativo (DPR) proveniente das análises com o uso e sem o uso de padrão interno. .............................................. 48 Tabela 12 - Teste de efeito de memória em amostras de alta concentração. ............. 50 Tabela 13 - Teste de efeito de memória em amostras de baixa concentração. .......... 51 Tabela 14 - Método para análise dos compostos por calibração interna em octanol. . 52 Tabela 15 - Intervalo de quantificação, equação da curva analítica e exatidão do modelo. ..................................................................................................... 53 Tabela 16 - Planejamento da variável sal no teste de extração. ................................. 56 Tabela 17 - Relação da recuperação dos analitos em função de diferentes sais e do branco. ..................................................................................................... 57 Tabela 18 - Planejamento da variável pH na extração. ............................................... 58 Tabela 19 - Relação da recuperação dos analitos em função de diferentes pH e do branco. ..................................................................................................... 59 Tabela 20 - Condições e resultados da recuperação encontrados usando diferentes concentrações de HCl. A melhor condição para cada analito está destacada em negrito. .............................................................................. 60 Tabela 21 - Descrição e codificação das variáveis usadas no planejamento experimental 24. ........................................................................................ 61 Tabela 22 - Matriz do planejamento fatorial 24, decodificada. ..................................... 61 Tabela 23 - Resultados dos experimentos do planejamento 24. ................................. 62 Tabela 24 - Resultado do planejamento experimental 24. ........................................... 63 Tabela 25 - Incremento da área dos analitos em função da razão (R) entre amostra e solvente. ................................................................................................ 66 Tabela 26 - Resultado dos experimentos de otimização das condições de extração. 67 Tabela 27 - Método final de análise............................................................................. 72 Tabela 28 - Relação das curvas analíticas, intervalo de quantificação e exatidão das substâncias de interesse. ......................................................................... 74 Tabela 29 - Principais figuras de mérito relativas ao método final de análise. ............ 75 Tabela 30 - Análise de quatro amostras de biorreatores de produção de H2. ............. 79 Tabela 31 - Recuperação obtida para os analitos no teste de efeito matriz. ............... 80 Tabela 32 - Resultado do teste de estabilidade da amostra do biorreator armazenada em laboratório, geladeira e freezer. .......................................................... 83 Tabela 33 - Síntese do teste de estabilidade considerando maior tolerância para o DPR dos resultados. ................................................................................. 84 Tabela 34 - Relação dos nomes triviais e IUPAC dos analitos utilizados no projeto. .. 93 LISTA DE EQUAÇÕES Equação 1 - Conversão da xilose em H2 através da rota I) acética e II) butírica e a conversão do glicerol através da rota III) acética, IV) butírica, V) etanoica e VI) do butanol. ....................................................................................... 25 Equação 2 - Desvio padrão relativo .......................................................................... 39 Equação 3 - Equação de equilíbrio do ácido láctico .................................................. 58 Equação 4 - Determinação do Limite de Detecção ................................................... 75 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS A/API Área da amostra dividida pela área do Padrão Interno DPR Desvio padrão relativo FID Flame ionization detector (detector por ionização de chama) GC Gas chromatography (cromatografia em fase gasosa) GC-MS Gas chromatography with mass spectrometer (cromatografia em fase gasosa com espectrômetro de massa) IAHE International Association for Hydrogen Energy (Associação Internacional para a Energia do Hidrogênio) IJHE International Journal of Hydrogen Energy (Jornal Internacional para Energia do Hidrogênio) IPHE The International Partnership for Hydrogen and Fuel Cells in the Economy (Parceria Internacional para o Hidrogênio e Células à Combustível na Economia) IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry (União Internacional de Química Pura e aplicada) LD Limite de detecção LIQ Limite inferior de quantificação LLME Liquid-liquid microextraction (microextração líquido-líquido) LSQ Limite superior de quantificação PI Padrão Interno s Desvio padrão VOC Volatile organic compounds (Compostos orgânicos voláteis) TIC Total Ion Chromatogram (Cromatograma de íons totais) LISTA DE SÍMBOLOS CH4 Gás metano CO2 Dióxido de carbono, gás carbônico H2 Gás hidrogênio H2SO4 Ácido sulfúrico H3PO4 Ácido fosfórico HCl Cloreto de hidrogênio; quando em solução aquosa, ácido clorídrico HNO3 Ácido nítrico K2S2O8 Persulfato de potássio MgCl2 Cloreto de magnésio Na2S2O3 Tiossulfato de sódio Na2SO4 Sulfato de sódio NaCl Cloreto de sódio NaF Fluoreto de sódio NaH2PO4 Bifosfato de sódio NaNO3 Nitrato de sódio tR Tempo de retenção SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ............................................................................................. 21 2 OBJETIVOS ................................................................................................. 29 3 PLANEJAMENTO ........................................................................................ 30 3.1 Planejamento do projeto ............................................................................ 30 3.2 Materiais e equipamentos .......................................................................... 30 3.3 Pesquisa na literatura ................................................................................ 32 3.4 Condições iniciais ...................................................................................... 33 4 DESENVOLVIMENTO, RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................. 36 4.1 Otimização da separação cromatográfica ................................................ 36 4.1.1 Sistema de amostragem e injeção................................................................ 37 4.1.2 Técnica de injeção ........................................................................................ 38 4.1.3 Uso da lã de vidro ......................................................................................... 42 4.1.4 Velocidade de injeção ................................................................................... 43 4.1.5 Vazão do gás de arraste ............................................................................... 44 4.1.6 Temperatura do injetor ................................................................................. 47 4.1.7 Padrão interno .............................................................................................. 48 4.1.8 Efeito de memória (carryover) ...................................................................... 49 4.1.9 Método de separação otimizado ................................................................... 51 4.1.10 Curva analítica preparada no solvente 1-octanol ......................................... 53 4.2 Estudo e otimização da microextração líquido-líquido ........................... 54 4.2.1 Etapa 1: análise individual das variáveis ...................................................... 55 4.2.2 Etapa 2: análise quimiométrica ..................................................................... 60 4.2.3 Etapa 3: Otimização das condições de extração .......................................... 64 4.2.3.1 Preparo e estabilidade do padrão interno ..................................................... 68 4.2 Curva analítica ............................................................................................ 71 4.3 Validação ..................................................................................................... 73 4.4 Análise de amostras de biorreatores ........................................................ 76 4.4.1 Avaliação do efeito matriz ............................................................................. 79 4.4.2 Avaliação da estabilidade das amostras dos reatores biológicos ................. 81 4.4.3 Análises por GC-MS ..................................................................................... 84 5 CONCLUSÃO............................................................................................... 89 REFERÊNCIAS ............................................................................................ 90 APÊNDICE A – Nomenclatura trivial e IUPAC dos analitos utilizados ... 93 APÊNDICE B – Tabela ANOVA .................................................................. 94 APÊNDICE C – Espectro de massas dos analitos analisados por GC-MS .................................................................................................................... 100 ANEXO A – Cálculo de pratos teóricos, assimetria, fator de encaudamento e resolução (USP) ........................................................... 107 ANEXO B – Tabela Periódica dos Elementos ........................................ 108 21 1 INTRODUÇÃO Desde que as questões ambientais vieram à tona, mostrando que a qualidade de vida e sobrevivência da nossa espécie está atrelada a conservação do meio ambiente, têm-se procurado alternativas ao atual modelo econômico-energético que é baseado em grande parte no consumo de combustíveis fósseis (GHIMIRE et al., 2015; MARENGO, 2006). O uso de combustíveis não renováveis na geração de energia ocasiona emissão de dióxido de carbono (CO2) além da capacidade de absorção através da fotossíntese, ocasionando descontrole do efeito estufa e consequente aquecimento global, dentre outras implicações na fauna e flora (MARENGO, 2006). Em virtude disto, se têm buscado meios para redução da emissão de CO2 em âmbito global. A emissão relacionada ao consumo de energia cresceu apenas 0,1% em 2015 quando comparado com o ano anterior, a menor taxa de aumento anual desde 1992. EUA, Rússia, Japão, Canada, Brasil tiveram diminuição significativa nas taxas de emissão de CO2 e a China, outro grande consumidor mundial de energia, apresentou redução de 0,1% nas emissões de CO2. A União Europeia teve um pequeno aumento, influenciada principalmente por Espanha e Itália. As reduções são uma consequência das políticas e pactos mundiais, como o acordo de Paris assinado durante a 21ª Conferência das Nações Unidas sobre Mudanças Climáticas, em 2015. No entanto, o crescente avanço da ciência e tecnologia nos últimos tempos, que nos tem proporcionado uma melhoria expressiva na qualidade de vida, é baseado em um modelo econômico-energético dispendioso. Assim, a manutenção deste estilo de vida e avanço da tecnologia também apresenta obstáculos e desafios, dentre eles destacam-se os impactos ambientais e o aumento da demanda energética. A manutenção da qualidade de vida requer fornecimento crescente de energia, para acompanhar o crescimento populacional e tecnológico, e ao mesmo tempo cuidados para com o meio ambiente. De acordo com relatório de projeção da população mundial, realizado pelas Nações Unidas, estima-se que em 2015 a população mundial atingiu a marco de 7,3 bilhões de indivíduos. A projeção é de que o crescimento alcance até 8,5 bilhões de 22 indivíduos em 2030, 9,7 bilhões em 2050 e 11,2 bilhões em 2100 (UNITED NATIONS, 2015). Um dos principais desafios é crescer de maneira sustentável, ou seja, crescer mantendo a qualidade de vida e sem prejudicar no atendimento das necessidades das gerações futuras (UNITED NATIONS ECONOMIC COMISSION FOR EUROPE, 2004). Para isso, é preciso monitorar os impactos ambientais, corrigir o desequilíbrio e procurar fontes alternativas de energia que atendam a demanda atual. As metas de redução de emissões de CO2 impactam diretamente a cadeia energética mundial, na qual as fontes não renováveis de energia apresentam desequilíbrio entre a quantidade de CO2 produzida e consumida, causando impacto direto na mudança climática global. Segundo relatório Statistical Review of World Energy 2016, publicado em julho de 2016, cerca de 90% da energia primária consumida no ano de 2015 teve origem em fontes não renováveis, destas 95% é constituída por petróleo, gás natural e carvão mineral (BRITSH PETROLEUM, 2016). A busca por fontes renováveis vem crescendo, entretanto, ainda há um vasto mercado a ser explorado. O gás hidrogênio (H2) é apresentado como uma das fontes promissoras de energia, capaz de atender a demanda energética sem causar impactos indesejáveis ao meio ambiente, sobretudo pela redução das emissões de gás carbônico (HIGH LEVEL GROUP, 2003). Devido as importantes aplicações e ao potencial uso do H2 como forte vetor energético originou-se o termo “Economia do Hidrogênio” (MARBÁN; VALDÉS-SOLÍS, 2007). A economia do hidrogênio é um paradigma econômico fundamentado no uso do H2 para geração de energia elétrica, mecânica e térmica, através das células a combustível, motor de combustão interna e queimadores, respectivamente. Além de outras aplicações, como na indústria química e petroquímica, de fertilizantes, de alimentos, siderúrgicas e de semicondutores. Dentre os benefícios do modelo proposto também é possível mencionar a descentralização da fonte de energia que proporciona mais segurança no fornecimento de energia, melhor eficiência de conversão e a proteção ambiental (GHIMIRE et al., 2015; HIGH LEVEL GROUP, 2003; MARBÁN; VALDÉS-SOLÍS, 2007; THE LINDE GROUP, 2016). 23 Esforços intergovernamentais têm sido feitos para acelerar a implantação deste modelo energético mais limpo e eficiente, como por exemplo, a criação da International Association for Hydrogen Energy1 em 1974 e à International Partnership for Hydrogen and Fuel Cells in the Economy2, em 2003, dentre muitas outras. O Brasil é um dos 18 países parceiros da IPHE que através de programas multinacionais de pesquisa, desenvolvimento e implantação, buscam acelerar a introdução de tecnologias de hidrogênio e células a combustível em uma escala global. No Brasil, o Ministério da Ciência, Tecnologia, Inovação e Comunicação tem estudado fazer a produção através de matérias-primas renováveis (CENTRO DE GESTÃO E ESTUDOS ESTRATÉGICOS, 2010). Além disso, tem-se um forte engajamento da comunidade científica internacional, através da pesquisa, conferências e divulgação de avanços no setor, como o International Journal of Hydrogen Energy3. Contudo, apesar do grande potencial, esse novo modelo precisa romper vários obstáculos técnicos de maneira a torna-se economicamente viável e sustentável. Dentre os desafios destacam-se se a produção de quantidades significativas de H2, armazenamento, transmissão e distribuição. H2 é um gás altamente inflamável, perigoso em ambientes confinados e tem baixa densidade energética por volume, o que requer alta compressão (consumo energético) e tanques resistentes a custos acessíveis. Ainda, é preciso desenvolver toda a cadeia de produção e distribuição (MARBÁN; VALDÉS-SOLÍS, 2007). Um dos gargalos desta nova tecnologia remete-se justamente a produção sustentável de H2. Dados de 2010 mostram que a demanda de hidrogênio no mercado global, cerca de 40 milhões de ton/ano, é suprida sobretudo por fontes fósseis. O mercado brasileiro consome cerca de 920 mil ton/ano, distribuído entre diversos setores, como a indústria química e petroquímica, de fertilizantes, de alimentos, siderúrgicas, de semicondutores, dentre outras. Apenas 5% da demanda nacional é suprida por fontes renováveis. Embora quase não se use o hidrogênio na produção de energia, em função da baixa competitividade econômica e da tecnologia globalmente disponível, o Brasil tem potencial para superar essas 1 IAHE. http://www.iahe.org/history.asp 2 IPHE. http://www.iphe.net/ 3 IJHE. http://www.journals.elsevier.com/international-journal-of-hydrogen-energy 24 dificuldades, assim como foi feito com o etanol e está sendo feito com biodiesel (CENTRO DE GESTÃO E ESTUDOS ESTRATÉGICOS, 2010). Atualmente, quase 95% da produção mundial de H2 é suprida por processos termoquímicos, utilizando matérias-primas de origem fóssil, como o CH4 (ALVES et al., 2013). Porém, é preciso obter H2 a partir de fontes renováveis, tornando o sistema sustentável (MARBÁN; VALDÉS-SOLÍS, 2007; THE LINDE GROUP, 2016). No Brasil, algumas formas de obtenção têm sido priorizadas pelo Ministério da Ciência, Tecnologia, Inovação e Comunicação: reforma do etanol, gaseificação da biomassa, eletrólise da água e reforma do gás natural (CENTRO DE GESTÃO E ESTUDOS ESTRATÉGICOS, 2010; JÚDICE, 2005). Neste contexto inclui-se também a produção de H2 através de processos biológicos, que é muito atrativa em função do menor quantidade de energia empregada e devido à vasta disponibilidade de matérias-primas e resíduos que podem ser empregados no processo (GHIMIRE et al., 2015). O uso de biorreatores fermentativos na produção de hidrogênio está sendo largamente estudado, sobretudo em experimentos de bancada, e visam conhecer as variáveis do sistema que levam a obtenção de rendimentos e taxas de produção que tornem a tecnologia viável. Com isso surge um grande número de variáveis que precisa ser estudada, como os diferentes substratos e microrganismos produtores, o tratamento da matéria-prima e inócuo, o controle de pH, de temperatura, o tipo e as configurações dos reatores e as rotas metabólicas envolvidas (GHIMIRE et al., 2015; HALLENBECK; BENEMANN, 2002; LI; FANG, 2007; MAINTINGUER et al., 2015). Contudo, um estudo realizado com mais de 160 trabalhos publicados na literatura concluiu que há uma grande divergência na interpretação dos resultados. À parte das variáveis físicas, como as configurações dos reatores, onde as conclusões geralmente convergem, os resultados obtidos usando diferentes substratos e microrganismos são, de longe, os que mais variam, onde se observam diferentes resultados para condições de operação semelhantes ou idênticas (LI; FANG, 2007). Estudo de sistemas biológicos envolve muitas variáveis, tornando-o complexo, o que requer constante monitoramento do meio reacional para correlação com as condições experimentais estudadas (AHRING; SANDBERG; ANGELIDAKI, 1995). Assim, é importante o desenvolvimento de métodos analíticos para análise destes reatores biológicos, visando auxiliar na elucidação das rotas metabólicas e nas 25 condições operacionais, e consequentemente, melhorar a eficiência na produção de H2. Bactérias acidogênicas do género Clostridium, por exemplo, têm sido estudadas devido ao seu potencial de produção de gás hidrogênio (MAINTINGUER et al., 2011). As sacarolíticas, como a Clostridium butyricum, fermentam carboidratos, produzindo ácido butírico, ácido acético, CO2 e H2. No entanto, diversos outros compostos podem ser formados, como etanol e metanol, dependendo do substrato, condições reacionais e demais microrganismos presentes no meio reacional (REIS et al., 2015). Consórcios contendo Clostridium arcticum também produzem ácido propiônico, e com Clostridium barkeri produzem ácido láctico (KHANAL et al., 2004). Enquanto a proporção de alguns ácidos é considerada bom indicador de produção de hidrogênio, a presença de outros ácidos, como o isobutírico e isovalérico podem indicar desequilíbrio no processo (AHRING; SANDBERG; ANGELIDAKI, 1995). A Equação 1 exemplifica as principais reações que ocorrem nesses reatores. Equação 1 - Conversão da xilose em H2 através da rota I) acética e II) butírica e a conversão do glicerol através da rota III) acética, IV) butírica, V) etanoica e VI) do butanol. → I → ⁄ II → III → IV → V → VI Fonte: I e II - Maintinguer et al. (2015), III a VI - Sarma et. al (2012) apud Rodrigues (2016). A Figura 1 ilustra alguns dos produtos finais obtidos a partir da fermentação do glicerol por diferentes microrganismos. 26 Figura 1- Rota metabólica da fermentação do glicerol. Fonte: Drożdżyńska et al. (2011) apud Rodrigues (2016). Os métodos propostos na literatura para análise de alguns ácidos orgânicos apresentam desvantagens como baixa reprodutibilidade, morosidade e uso de grande quantidade de solvente e amostra, limitando a aplicação no monitoramento da produção de H2 em biorreatores (LOMBORG et al., 2009). Algumas técnicas disponíveis na literatura para análise de biorreatores são titulação potenciométrica, espectrofotometria, espectroscopia de infravermelho próximo, cromatografia líquida e cromatografia em fase gasosa. As técnicas titulométricas não são seletivas e fornecem apenas a concentração total dos ácidos ou álcoois presentes nas amostras. A espectrofotometria requer análise específica a espécie química de interesse, demandando muito tempo e maior volume de amostra (RAPOSO et al., 2015). A técnica de espectroscopia de infravermelho próximo, embora promissora, é de difícil reprodução, requer tratamento e modelos estatísticos complexos, apresenta altos limites de quantificação e pode incorrer em variações 27 nos resultados de acordo com a complexidade da matriz, inviabilizando sua aplicação (ZHANG et al., 2009). Neste sentido, as técnicas cromatográficas têm muito a contribuir nas análises de biorreatores, pois são seletivas, rápidas e de fácil aplicação. Escassa informação pode ser encontrada na literatura sobre o emprego da cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE/HPLC) em análise de biorreatores de H2 (SÁ et al., 2011). Contudo é sabido que esta técnica pode ser empregada na determinação de álcoois, ácidos orgânicos e carboidratos presentes em águas residuais e de outras matrizes complexas, embora não seja possível determinar todos os grupos de interesse em uma única análise. Além disto, esta técnica requer grandes volumes de solvente, tem maiores limites de quantificação e longo tempo de análise comparada à cromatografia em fase gasosa. Neste sentido, configura-se uma técnica muito interessante para análise de compostos não voláteis e termicamente instáveis, como os carboidratos, e compostos muito polares, como álcoois secundários e terciários. Assim, visando à aplicação específica para álcoois e ácidos orgânicos voláteis, a cromatografia líquida pode ser considerada uma técnica complementar a cromatografia em fase gasosa. A cromatografia em fase gasosa (GC) é uma técnica comumente aplicada na análise de compostos orgânicos voláteis, tal como álcoois, acetona e ácidos orgânicos de cadeia curta, desta forma, a técnica apresenta grande potencial de aplicação no monitoramento destes compostos em reatores biológicos. Porém, devido à complexidade da matriz a ser analisada, faz-se necessário um preparo prévio da amostra a fim de evitar problemas de repetitividade e diminuição do tempo de vida útil da coluna cromatográfica. A técnica de amostragem e injeção por headspace acoplado a GC (HS-GC) tem sido empregada (ADORNO; HIRASAWA; VARESCHE, 2014) com o intuito de contornar problemas relacionados à complexidade da matriz, contudo, embora prática e não fazer uso de solvente, a técnica apresenta alguns inconvenientes, como: a formação de ésteres durante a incubação, cristalização no êmbolo da seringa e baixa precisão quando comparado à injeção líquida. É observado experimentalmente que o uso de ácidos inorgânicos, na presença de álcoois e ácidos orgânicos presentes nas amostras e alta temperatura de incubação, leva a formação de ésteres e diminui a precisão. O uso de ácidos inorgânicos também leva 28 a formação de precipitados no êmbolo da seringa ocasionado grave efeito de memória. Porém, sem o uso de ácidos inorgânicos, a resposta analítica para os ácidos orgânicos diminui significativamente, mesmo prolongando consideravelmente o tempo de incubação, impactando nos limites de detecção e quantificação. Assim, têm-se buscado alternativas às técnicas de HPLC e HS-GC, de maneira a reduzir o tempo de análise, a quantidade de amostra e solvente, obtenção de resultados rápidos e de maneira prática, com a determinação de todos os compostos de interesse em uma única análise. Neste sentido, as técnicas clássicas de preparo de amostra, como a extração líquido-líquido (LLE), tem sido miniaturizadas (LLME), empregando menor volume de amostra e solvente, reduzindo o custo e tempo de análise e melhorando a confiabilidade dos resultados (MARTINS et al., 2012). Além disto, têm se buscado alternativas aos solventes extratores convencionais que podem impactar negativamente na saúde e no meio ambiente. Alguns trabalhos na literatura têm empregado com sucesso o uso de 1-octanol em extração de compostos orgânicos em matrizes aquosas e análise por GC (SARAJI, 2005). O octanol é um álcool lipofílico, biodegradável e de baixa periculosidade, o que confere potencial aplicação no emprego deste em amostras aquosas provenientes de biorreatores de produção de H2, para monitoramento de álcoois e compostos orgânicos voláteis. 29 2 OBJETIVOS O objetivo geral deste trabalho consistiu no desenvolvimento e otimização de um método analítico por LLME-GC-FID para a determinação de compostos orgânicos voláteis gerados em processos biológicos de produção de hidrogênio. Para alcançar o objetivo proposto, as seguintes etapas foram definidas:  Desenvolvimento e otimização de um método por GC-FID capaz de promover a separação cromatográfica dos analitos de interesse: acetona, metanol, etanol, 1-propanol, 1-butanol, ácido acético, ácido propiônico, ácido butírico, ácido isobutírico, ácido isovalérico, ácido valérico, 1,3 propanodiol, ácido capróico, ácido lático e glicerol.  Construção de uma curva analítica em octanol, usando padronização interna, para análise da eficiência da recuperação dos analitos na solução aquosa.  Estudo da recuperação de cada analito usando pequena quantidade de amostra e solvente.  Determinação experimental do melhor processo de microextração dos analitos de interesse em fase líquida utilizando o 1-octanol como solvente extrator.  Otimização e desenvolvimento de uma curva analítica considerando a extração dos analitos da fração aquosa.  Validação do método desenvolvido utilizando a ANOVA e cálculo das figuras de mérito (Limite de detecção, limite inferior de quantificação, limite superior de quantificação, precisão, exatidão do modelo, resolução, encaldamento e assimetria).  Aplicação do método de análise proposto na determinação dos compostos gerados e suas respectivas concentrações em amostras provenientes de reatores biológicos. 30 3 PLANEJAMENTO 3.1 Planejamento do projeto O projeto foi desenvolvido segundo esquema apresentado na Figura 2. Figura 2 - Esquema representativo do planejamento do projeto. Fonte: o autor 3.2 Materiais e equipamentos O trabalho foi desenvolvido nos laboratórios do CEMPEQC4. Nos ensaios cromatográficos foi utilizado um equipamento de cromatografia em fase gasosa da Thermo Electron Corporation (Thermo Scientific), modelo Trace GC Ultra (Figura 3), acoplado com sistema de amostragem automática TriPlus AS (Thermo Scientific) e seringa para líquidos com capacidade para 10 µL, da SGE Analytical Science. Foi usado injetor split/splitless, detector de ionização de chama (FID) e hélio (He) como gás de arraste. O equipamento foi operado através de um computador, por meio do software ChromQuest versão 5.0. 4 Centro de Monitoramento e Pesquisa da Qualidade em Combustíveis, Biocombustíveis, Petróleo e Derivados. Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Instituto de Química, Araraquara/SP, Brasil. CEP 14800-060 31 Figura 3 - Cromatógrafo de fase gasosa Trace GC Ultra. Fonte: CEMPEQC Foram avaliadas três colunas para verificar o desempenho da separação dos analitos: a DB-5MS (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm, J&W Scientific), a HP-1 (100 m x 0,25 mm x 0,50 µm, J&W Scientific), e a coluna ZB-WAX (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm, Phenomenex). No desenvolvimento do processo de extração foi utilizado um agitador de tubos Phoenix, modelo AP 56 e frascos do tipo eppendorf de 1,5 mL e 2,0 mL. Como solvente extrator foi utilizado o 1-octanol (C8H17OH, Merck, L:S6874131)5, que é um álcool lipofílico, insolúvel em água, de baixa periculosidade e de rápida biodegradabilidade. Durante a otimização das condições de extração dos analitos da 5 Conforme FISPQ do produto (cod. 472328), disponível em 32 amostra aquosa foram avaliados outros reagentes, grau analítico, como: persulfato de potássio (K2S2O8, Synth, L:121436), cloreto de sódio (NaCl, Synth L:186538), cloreto de magnésio (MgCl2, Synth L:175373), bifosfato de sódio (NaH2PO4 Synth L:103821), nitrato de sódio (NaNO3, Synth L: 183927), fluoreto de sódio (NaF, Synth L:15435) e tiossulfato de sódio (Na2S2O3, Synth:162058). Além destes foram usadas soluções diluídas de ácido clorídrico (HCl, Vetec L:1100970), ácido sulfúrico (H2SO4, Sigma Aldrich L:SZBD1080V), ácido fosfórico (H3PO4, Chemco L:21506) e ácido nítrico (HNO3, LS Chemicals L:27575). Ao trabalhar com as amostras dos biorreatores foi necessário o uso de centrífuga (Centribio, 80-2B). Considerando os principais compostos formados nos reatores biológicos durante a produção de hidrogênio, foi preparada uma solução de octanol contendo todos os analitos em uma concentração aproximada de 1000 mg L-1. A solução foi empregada nos testes de separação usando as diferentes colunas disponíveis. Foram preparadas soluções individuais de cada analito na concentração de 2100 mg L-1 para determinação do tempo de retenção de cada analito. Os experimentos foram executados em capela com sistema de exaustão, fazendo uso de outros materiais de uso rotineiro e equipamentos de proteção individual e coletivos disponíveis nos laboratórios. 3.3 Pesquisa na literatura Antes do desenvolvimento de uma proposta para as condições de separação foi realizada uma busca na literatura dos principais compostos produzidos por esses tipos de reatores biológicos de produção de hidrogênio. Em seguida, foram adquiridos os padrões analíticos referentes aos compostos de interesse do sistema, bem como o solvente de extração e os padrões internos. A pesquisa também levou em consideração a experiência prévia de professores e alunas do grupo de pesquisa em controlar reatores biológicos. A Tabela 1 relaciona as substâncias adquiridas para desenvolvimento do projeto e suas características físico-químicas mais relevantes para uso no projeto proposto. 33 Tabela 1 - Relação dos padrões adquiridos para execução do projeto. Fonte: http://www.chemspider.com/, Certificado de Análise. Vide Apêndice A para relação dos nomes triviais e IUPAC. 3.4 Condições iniciais No início da pesquisa foi proposta uma configuração preliminar de operação do cromatógrafo conforme características dos analitos de interesse. Durante os ensaios preliminares foram feitos ajustes no método com o objetivo de aperfeiçoar a separação dos analitos, proporcionando uma maior resolução cromatográfica e considerando as características das colunas. A Tabela 2 mostra as condições iniciais, os demais foram mantidos conforme o padrão (default) do equipamento. Analito/Solvente Fórmula PM (µ) Temp. fusão (°C) Temp. ebulição (°C) Densidade (gmL-1) Solub. água Coef. partição água-octanol Pureza % Marca Lote 1,3 Propanodiol C3H8O2 76,094 -26,7 214,0 1,053 Miscível 0,09 99,40 Sigma Aldrich WXBB5811V 1-Butanol C4H10O 74,122 -89,8 117,7 0,81 Miscível 7,59 100,00 Sigma Aldrich SHBC8167V 1-Octanol C8H18O 130,228 -15,5 195,0 0,825 Miscível 1000,00 99,40 Merck 6874131 1-Propanol C3H8O 60,095 -127,0 97,0 0,804 Miscível 1,78 99,90 Sigma Aldrich SZBC304MV Acetona C3H6O 58,079 -94,8 56,0 0,791 Miscível 0,58 99,50 Química Moderna 2740 Ácido acético C2H4O2 60,052 16,6 118,1 1,049 Miscível 0,68 99,90 Sigma Aldrich SZBC1790V Ácido butírico C4H8O2 88,105 -7,0 163,5 0,964 Miscível 6,17 99,80 Sigma Aldrich STBC7233V Ácido capróico C6H12O2 116,158 -4,0 202,0 0,929 Miscível 83,18 99,64 Sigma Aldrich MKBL3618V Ácido crotônico C4H6O2 86,089 72,0 180,0 1,027 Miscível 5,25 99,70 Sigma Aldrich STBD4264V Ácido isobutírico C4H8O2 88,105 -46,0 154,0 0,948 Miscível 8,71 99,50 Fluka 58360 Ácido isovalérico C5H10O2 102,132 -33,0 175,0 0,937 Miscível 14,45 99,70 Sigma Aldrich MKBN5865V Ácido láctico C3H6O3 90,078 16,8 122,0 1,209 Miscível 0,19 88,70 Sigma Aldrich MKBR6268V Ácido propiônico C3H6O2 74,078 -20,8 141,1 0,992 Miscível 2,14 99,91 Sigma Aldrich SHBC0723V Ácido valérico C5H10O2 102,132 -34,0 185,0 0,938 Miscível 24,55 99,50 Sigma Aldrich MKBM7442V Álcool isobutírico C4H10O 74,122 -108,0 108,0 0,802 Miscível 5,75 99,90 Sigma Aldrich MKBJ5918V Etanol C2H6O 46,068 -114,0 78,0 0,789 Miscível 0,49 99,90 Merck K45251683 Etilenoglicol C2H6O2 62,068 -13,0 197,0 1,113 Miscível 0,04 99,90 Sigma Aldrich SZBA2720V Glicerol C3H8O3 92,094 18,0 290,0 1,26 Miscível 0,02 99,90 Sigma Aldrich BCBK0214V Metanol CH4O 32,042 -98,0 64,7 0,791 Miscível 0,17 99,99 Sigma Aldrich SHBC0287V 34 Tabela 2 - Condições cromatográficas iniciais. Fonte: o autor As condições iniciais foram modificadas à medida que os testes de separação dos analitos em octanol foram realizados. Dentre os ajustes realizados destacam-se o velocidade e o modo de amostragem e o programa de aquecimento do forno. Após separação satisfatória, foi construída uma curva analítica através da diluição de uma amostra de octanol contendo todos os analitos de interesse e levando em consideração as concentrações reportadas na literatura. A partir desta etapa foi iniciado o uso de padrão interno. Esta curva analítica foi utilizada nos testes de extração dos analitos da fração aquosa O desenvolvimento e otimização da técnica de LLME foi realizado em seguida. Alguns sais, ácidos inorgânicos, materiais e equipamentos foram inicialmente testados tendo como objetivo obter as melhores condições de extrações de cada analito da fração aquosa. Após os testes de extração iniciais, foi feito um planejamento fatorial simples (24) tendo como variável o tipo de sal, a adição de ácido inorgânico, o tempo de mistura e a razão entre amostra e solvente. Os resultados foram analisados e otimizados experimentalmente. Posteriormente, o método de separação foi ajustado à luz dos resultados obtidos na etapa anterior. Outros parâmetros cromatográficos foram testados e ajustados e em seguida, houve a necessidade de construir uma nova curva analítica. A curva foi construída considerando a recuperação dos analitos presentes em soluções aquosas empregando a técnica de LLME. Então, a curva foi validada Parâmetro Gás de arraste Vazão do gás de arraste Modo de injeção Tipo de injeção Temperatura do injetor Volume de injeção Razão de injeção (split) (i) Linear t inicial 50 °C t final 250 °C taxa 10 °C/min Detector Temperatura do detector Vazão do gás de make up (N2) Vazão de hidrogênio Vazão de ar 250°C Hélio 3,0 mL/min 30 mL/min 35 mL/min 350 mL/min Condições Injetor Coluna Forno ZB-WAX (Phenomenex) 30m x 0,25mm x 0,25µm Detector FID 250°C 1µL 20 automático split 35 utilizando a análise de variância (ANOVA) e as figuras de mérito foram calculadas. A resposta do modelo (exatidão) foi avaliada comparando-se a concentração teórica obtida através da diluição do padrão analítico e o resultado obtido experimentalmente a partir da curva de calibração. O método foi desenvolvido pensando na aplicação em pesquisas de reatores anaeróbios, embora possa ser aplicado para outros fins. Sendo assim, algumas amostras desses reatores foram obtidas e analisadas com o intuito de validar e exemplificar sua aplicação. As amostras estudadas neste trabalho haviam sido previamente centrifugadas e congeladas e foram provenientes de alguns biorreatores que utilizaram glicerol bruto e esgoto municipal como substrato (SANTANA, 2017). 36 4 DESENVOLVIMENTO, RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1 Otimização da separação cromatográfica Os ensaios preliminares com a DB-5MS e HP-1 mostraram desprendimento de fase estacionária bem como uma linha de base instável, conforme apresentado na Figura 4 e Figura 5. A coluna HP-1 também apresentou como inconveniente o tempo de análise, pois se tratava de uma coluna de grande comprimento (100 m). Desta forma, optou-se pela descontinuação do uso destas colunas. Devido a essas limitações, a coluna ZB-WAX Zebron (polietilenoglicol) passou a ser usada. Figura 4 - Avaliação da coluna DB-5MS, após condicionamento e várias injeções de 1 µL de metanol puro. Fonte: o autor Figura 5 - Avaliação da coluna HP-1, após condicionamento e várias injeções consecutivas de 1 µL de solução de propanol e butanol em metanol, 1000 mg L-1. Fonte: o autor Minutes 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M ill iv o lt s 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 M ill iv o lt s 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 TRACE GC-Channel 1 Metanol_005 Retention Time Name Area Minutes 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 M ill iv o lt s -250 0 250 500 750 1000 1250 1500 1750 2000 2250 2500 M ill iv o lt s -250 0 250 500 750 1000 1250 1500 1750 2000 2250 2500 TRACE GC-Channel 1 PW4_005 Retention Time Name Area 37 Figura 6 - Avaliação da coluna ZB-WAX, após condicionamento e injeção de 1 µL de octanol. Fonte: o autor 4.1.1 Sistema de amostragem e injeção O sistema de amostragem utilizado foi o de injeção automática, utilizando o amostrador TriPlus AS. Durante as primeiras injeções foi possível observar que o sistema de amostragem padrão (default) não era eficaz, pois havia formação de bolhas na seringa durante a amostragem realizada no vial. A formação era perceptível visualmente e ocorreu em função da característica do solvente, que é visivelmente mais viscoso do que outros solvente orgânicos, como o metanol, por exemplo. Deste modo, foi feito ajuste no modo de amostragem, de padrão para viscoso. Contudo o problema persistiu. Por fim, o modo de injeção foi customizado variando-se a velocidade de amostragem (sample pull up speed, µL/s) gradativamente até o desaparecimento das bolhas, bem como a determinação do atraso da viscosidade (viscosity delay, s) e o modo de ambientação da seringa (plunger strokes), os quais foram removidos. Os ajustes realizados são mostrados na Tabela 3. Minutes 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 M ill iv o lt s 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 M ill iv o lt s 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000TRACE GC-Channel 1 Planej_Fator_Oc_004 38 Tabela 3 - Relação dos ajustes realizados no sistema de amostragem. Fonte: o autor 4.1.2 Técnica de injeção Na avaliação e escolha da técnica de injeção foi usada uma solução de etanol, propanol e butanol em metanol na concentração de 0,001% (v/v). Segundo o fabricante do equipamento, essa condição permitiria obter repetitividade menor ou igual a 2%, certificando que o sistema de amostragem estava eficiente e em atendimento as informações técnicas do equipamento. Procedeu-se então com a análise das técnicas de injeção. Para isto três técnicas foram avaliadas: cold needle, air plug e solvent flush. Abaixo segue a descrição de cada técnica: a. Técnica cold needle (basic): nesta técnica é feita a amostragem seguida de um preenchimento pré-determinado de ar. A amostra é injetada rapidamente assim que entra no injetor. b. Técnica air plug (basic + pre-injection dwell time): similar à técnica anterior, porém, após amostragem e preenchimento de ar é determinado um tempo de permanência da agulha dentro do injetor antes da injeção. Geralmente entre 2 e 4s. c. Técnica solvente flush (solvente flush post): nesta técnica a seringa é previamente preenchida com uma determinada quantidade de solvente e ar. Em seguida é feita a amostragem seguida de preenchimento de ar. A amostra é injetada rapidamente assim que entra no injetor. A Figura 7 ilustra cada uma das técnicas testadas e detalha os parâmetros definidos durante o teste. Sample vol (µL) 1,0 Plunger strokes 0 Sample type Custom Sample pull up speed (µL/s) 0,3 Viscosity delay 2,0 Sample viscosity Sampling 39 Figura 7 - Comparação entre as técnicas a) cold needle, b) air plug e c) solvent flush. Fonte: o autor, adaptado do software ChromQuest 5.0 Durante a avaliação, o volume de amostra injetada foi de 1 µL. A técnica Air plug foi a que apresentou menor desvio padrão relativo e consistiu de amostragem com preenchimento com 3 µL de ar, aquecimento da agulha da seringa no injetor por 3s e injeção rápida. A comparação entre as técnicas pode ser observada na Tabela 4, sendo o Desvio Padrão Relativo (DPR) a razão entre o desvio padrão pela média das análises, em porcentagem (INSTITUTO NACIONAL DE METROLOGIA, TECNOLOGIA E QUALIDADE, 2011). Equação 2 - Desvio padrão relativo ̅ 40 Tabela 4 - Avaliação comparativa do desvio padrão relativo das áreas das bandas cromatográficas, entre as técnicas de injeção, cold needle, air plug e solvent flush. Fonte: o autor Como os resultados da técnica air plug mostraram a melhor repetitividade (menor DPR) dentre as técnicas avaliadas, ela foi definida para uso na curva de calibração em octanol. Posteriormente, após realização da curva analítica, foram realizados testes usando o solvente extrator 1-octanol, ao invés de etanol, propanol e butanol em metanol, para análise da eficácia do modo de amostragem escolhido. Os resultados desta nova avaliação favoreceram a técnica cold needle. As análises foram feitas em triplicata, usando uma solução de 1000 mg L-1, e o teste t de Student foi utilizado para análise dos resultados, com nível de confiança de 95%, da área relativa média. A área relativa consistiu na divisão da área do analito pela área do padrão interno adicionado a amostra. O padrão interno (PI) é uma substância cujas características físico-químicas e funcionais assemelham-se a substância de interesse presente na amostra. O PI escolhido não deve estar presente na amostra e t retenção (min) Área t retenção (min) Área t retenção (min) Área 2,36 50.674.615 3,21 68.044.326 4,47 75.225.243 2,35 48.879.976 3,21 65.170.403 4,47 71.830.837 2,37 53.116.281 3,21 74.589.458 4,47 80.499.802 2,35 49.739.474 3,21 69.041.672 4,46 73.915.890 2,35 50.337.152 3,21 67.464.169 4,46 74.516.860 Rep. 3,14 Rep. 5,09 Rep. 4,29 t retenção (min) Área t retenção (min) Área t retenção (min) Área 2,36 49.060.586 3,22 66.487.447 4,48 72.990.158 2,36 49.379.008 3,22 67.103.865 4,48 73.717.298 2,35 48.897.208 3,21 66.323.772 4,48 72.837.448 2,35 47.663.508 3,21 64.522.509 4,47 70.753.410 2,35 48.486.757 3,21 65.645.131 4,47 71.983.253 Rep. 1,36 Rep. 1,49 Rep. 1,57 t retenção (min) Área t retenção (min) Área t retenção (min) Área 2,34 28.516.161 3,20 39.246.596 4,47 43.340.596 2,34 27.884.357 3,20 36.938.048 4,47 40.366.029 2,34 28.775.107 3,20 38.160.878 4,47 41.832.411 2,33 27.989.217 3,20 37.231.344 4,46 40.884.594 2,35 27.775.659 3,21 38.187.936 4,47 42.106.459 Rep. 1,54 Rep. 2,40 Rep. 2,76 Solvent flush technique Etanol Propanol Butanol Cold needle Etanol Propanol Butanol Air plug technique Etanol Propanol Butanol 41 deve ser adicionada à amostra sempre na mesma concentração e na mesma etapa de preparo da amostra. Desta maneira é possível corrigir desvios de injeção tendo como referência a variação da área do PI. Pressupõem-se que a variação da injeção impacta todas as substâncias proporcionalmente e, como a concentração do PI é constante, a variação é corrigida dividindo-se a área da substância presente na amostra pela área do PI. Essa abordagem é justificada no tópico 4.1.7. Os benefícios da técnica cold needle sobre a técnica air plug foram: menor desvio padrão médio, maior sinal analítico e melhor simetria do ácido butírico, além de menor desvio padrão relativo para o ácido propiônico. A Tabela 5 apresenta os dados obtidos. Tabela 5 - Resultado da análise comparativa entre a técnica cold neddle e air plug. Fonte: o autor A Figura 8 ilustra o cromatograma comparando a simetria do ácido butírico nas duas técnicas avaliadas. tR Média A/API s A/API DPR (%) tR Média A/API s A/API DPR (%) Acetona 1,12 0,358 0,00097 0,2701 1,12 0,360 0,00037 0,1025 µ Cold needle = µ Air Plug Metanol 1,28 0,109 0,00179 1,6369 1,29 0,109 0,00020 0,1862 µ Cold needle = µ Air Plug Etanol 1,38 0,667 0,00075 0,1127 1,38 0,663 0,00067 0,1009 µ Cold needle > µ Air Plug 1-Propanol 1,67 1,598 0,00090 0,0563 1,67 1,596 0,00102 0,0639 µ Cold needle = µ Air Plug 1-Butanol 1,99 2,171 0,00115 0,0529 2,00 2,188 0,00169 0,0772 µ Cold needle < µ Air Plug Ácido acético 3,49 0,344 0,00134 0,3888 3,48 0,315 0,00435 1,3803 µ Cold needle > µ Air Plug Ácido propiônico 4,31 1,417 0,01928 1,3602 4,30 1,343 0,05251 3,9109 µ Cold needle > µ Air Plug Ácido butírico 5,65 2,449 0,00718 0,2932 5,69 2,428 0,01363 0,5614 µ Cold needle = µ Air Plug Ácido isovalérico 6,17 2,977 0,01383 0,4645 6,24 2,855 0,01378 0,4826 µ Cold needle > µ Air Plug Ácido valérico 6,97 2,921 0,01197 0,4096 7,01 2,844 0,01401 0,4926 µ Cold needle > µ Air Plug Ácido capróico 7,86 3,007 0,01303 0,4333 7,87 3,000 0,00622 0,2074 µ Cold needle = µ Air Plug Ácido láctico 10,20 0,371 0,00116 0,3135 10,20 0,346 0,00037 0,1061 µ Cold needle > µ Air Plug Média 0,00524 0,41372 0,00777 0,54800 s A/API = desvio padrão da área normatizada; DPR (%) = desvio padrão relativo em porcentagem Composto Cold needle technique Air plug technique Teste t de Student 42 Figura 8 - Cromatograma ilustrando a simetria do ácido butírico na técnica cold needle (traço em preto) e air plug (traço em azul) nas mesmas condições de separação, utilizando uma amostra de 1000 mg L-1. Fonte: o autor 4.1.3 Uso da lã de vidro No sistema de injeção foi realizado um teste comparativo entre o uso do liner convencional (sem lã de vidro) e o liner com lã de vidro. O uso da lã visa melhorar a vaporização e homogeneização da amostra no injetor o que confere maior resposta analítica, melhor repetitividade e menor discriminação das substâncias em função da diferença da massa molar. Adicionalmente a lã de vidro retém possíveis compostos não voláteis que poderiam precipitar na coluna cromatográfica, diminuindo seu tempo de vida útil e contaminando o sistema. O teste comparativo foi realizado fazendo 5 injeções de uma mistura padrão de 1000 mg L-1 no liner sem lã de vidro, seguido de 5 injeções usando o mesmo liner, porém com lã de vidro. As condições analíticas foram as mesmas em ambos os experimentos. Na análise dos resultados a média da área relativa foi comparada usando o teste t de Student com 95% de confiança. A Tabela 6 mostra os resultados comparativos entre as técnicas. 43 Tabela 6 - Resultado comparativo entre a injeção com e sem o uso da lã de vidro. Fonte: o autor Com o uso da lã de vidro pôde-se obter áreas maiores para a maioria dos analitos, embora a área relativa mostre uma redução na área dos álcoois e um incremento na área dos ácidos. Esse fator também contribuiu para detecção e separação do ácido propiônico, que elui muito próximo da banda do solvente. A média do desvio padrão também favoreceu as análises com emprego da lã de vidro, onde se observou menor desvio. 4.1.4 Velocidade de injeção Durante os ensaios preliminares foi necessário fazer ajuste na velocidade de amostragem, devido à formação de bolhas, desta forma também foi realizado uma avaliação do impacto da velocidade de injeção na resposta de cada analito. Foi utilizada uma solução de 1000 mg L-1 nesta avaliação e quatro velocidades foram testadas em duplicata. As médias obtidas foram comparadas usando o teste t de Student, com 95% de confiança, também considerando o desvio padrão relativo (%). Os dados obtidos são mostrados na Tabela 7. tR Área A/API s A/API tR Área A/API s A/API Acetona 1,113 14.386.055 0,34131 0,0091 1,128 15.037.533 0,30692 0,0029 µ Sem lã > µ Com lã Metanol 1,288 4.690.244 0,11128 0,0035 1,295 4.655.085 0,09501 0,0011 µ Sem lã > µ Com lã Etanol 1,381 23.120.744 0,54854 0,0150 1,387 24.050.176 0,49088 0,0029 µ Sem lã > µ Com lã 1-Propanol 1,677 45.363.054 1,07624 0,0116 1,679 50.023.210 1,02100 0,0035 µ Sem lã > µ Com lã 1-Butanol 1,998 54.769.502 1,29941 0,0198 2,000 64.149.690 1,30933 0,0011 µ Sem lã < µ Com lã Ácido acético 3,517 6.602.120 0,31674 0,0420 3,514 7.365.466 0,27827 0,0132 µ Sem lã > µ Com lã Ácido propiônico - - - - 4,352 16.356.176 0,61794 0,0382 NA Ácido butírico 5,796 27.125.058 1,30133 0,0276 5,678 37.275.266 1,40826 0,0564 µ Sem lã < µ Com lã Ácido isovalérico 6,158 30.833.806 1,47925 0,0159 6,233 48.872.270 1,84640 0,0337 µ Sem lã < µ Com lã Ácido valérico 6,972 35.788.298 1,71695 0,0447 7,017 50.933.273 1,92427 0,0290 µ Sem lã < µ Com lã Ácido capróico 8,092 27.093.820 1,29983 0,0498 8,102 46.926.066 1,77287 0,0474 µ Sem lã < µ Com lã Ácido láctico 8,552 1.690.585 0,08111 0,0145 8,555 2.666.751 0,10075 0,0038 µ Sem lã < µ Com lã Média 0,8702 0,0230 0,9310 0,0194 NA = Não aplicável Composto Sem lã de vidro Com lã de vidro Teste t de Student 44 Tabela 7 - Relação da área relativa em função da velocidade de injeção, DPR total (entre as médias de 20 a 50 µLs-1), parcial (entre as médias de 20 a 40 µLs-1) e teste t de Student. Fonte: o autor Através dos resultados apresentados é possível afirmar que não há diferença significativa no teste t aplicado, entre as velocidades de injeção 20 e 30 µLs-1 e entre 20 e 40 µLs-1. O desvio padrão relativo médio obtido empregando a velocidade 20, 30 e 40 µL-1 também são inferiores a 2%. Assim, a velocidade de injeção determinada foi de 40 µL-1, ainda, este parâmetro é próximo a velocidade de injeção padrão (default) do equipamento (50 µL-1). 4.1.5 Vazão do gás de arraste O equipamento foi operado usando vazão constante do gás de arraste. Esta vazão foi estudada em quatro níveis para determinação da melhor condição e consequente obtenção de bandas cromatográficas com melhor resolução, simetria e com menores fatores de encaudamento. Os cálculos foram realizados automaticamente pelo software do equipamento (ChromQuest 5.0), utilizando as definições da USP (United States Pharmacopeia), que podem ser consultados no ANEXO A. Estas características cromatográficas são importantes porque impactam nos limites de detecção e quantificação do modelo analítico. Uma das principais figuras de estudo da separação cromatográfica é a resolução, onde é desejável que a separação dos analitos tenha resolução (R) igual ou superior a 1,5, mostrando que não há coeluição entre picos vizinhos. Além disto, é desejável que os picos cromatográficos sejam simétricos, ou seja, assemelham-se a uma curva gaussiana. 20 30 40 50 Acetona 0,358 0,355 0,352 0,356 0,68 µ20 = µ30, µ40, µ50 0,67 Metanol 0,110 0,109 0,107 0,108 1,38 µ20 = µ30, µ40, µ50 1,37 Etanol 0,658 0,656 0,651 0,658 0,52 µ20 = µ30, µ40, µ50 0,47 1-Propanol 1,586 1,587 1,581 1,590 0,26 µ20 = µ30, µ40, µ50 0,19 1-Butanol 2,186 2,183 2,181 2,185 0,10 µ20 = µ30, µ40, µ50 0,09 Ácido acético 0,324 0,322 0,316 0,303 3,00 µ20 = µ30, µ40, µ50 1,02 Ácido propiônico 1,224 1,222 1,233 1,270 1,83 µ20 = µ30, µ40, µ50 0,39 Ácido butírico 2,264 2,282 2,270 2,209 1,43 µ20 = µ30, µ40, µ50 0,33 Ácido isovalérico 2,760 2,799 2,767 2,652 2,33 µ20 = µ30, µ40, µ50 0,62 Ácido valérico 2,815 2,872 2,805 2,654 3,34 µ20 = µ30, µ40 1,04 Ácido capróico 2,942 2,964 2,912 2,727 3,75 µ20 = µ30, µ40, µ50 0,73 Composto A/API | Velocidade de injeção (µLs -1 ) Desvio padrão relativo Total (%) Teste t de Student Desvio padrão relativo Parcial (%) 45 Curvas simétricas (T aproximadamente igual a 1) quase não possuem encaudamento, mostrando que há um equilíbrio de partição muito bom entre a vazão do gás de arraste e a fase estacionária. Por fim, analitos que apresentem banda de com boa resolução, simetria e altura elevada e base estreita, permitem boa integração e consequentemente, apresentam melhores limites de detecção e quantificação. A Tabela 8 mostra os resultados obtidos injetando-se 1 µL de solução 1000 mg L-1 nas quatro vazões estudadas, mantendo as demais condições constantes. Tabela 8 - Resultados de Resolução, Encaudamento, Assimetria e Altura (USP). Fonte: o autor Foi observado resultados semelhantes em todas as condições de vazão estudadas. A assimetria variou de 0,67 a 4,37, enquanto o fator de encaudamento variou de 0,67 a 4,76. Esta variação já era esperada uma vez que todos os analitos são polares e interagem com a fase estacionária que também é polar. A resolução calculada foi satisfatória para todos os analitos, contudo, visualmente a melhor resolução foi obtida na condição de 2,5 mL min-1. A Figura 9 mostra os cromatogramas na região da eluição do solvente, considerada a mais crítica, em cada uma das vazões avaliadas. tR Área A/APi Altura Resolução Encaud. Assimetria tR Área A/APi Altura Resolução Encaud. Assimetria Acetona 1,32 16.545.169 0,3568 15.775.649 1,61 1,55 1,21 24.930.822 0,3526 16.778.885 1,44 1,40 Metanol 1,49 4.941.616 0,1066 3.518.034 5,56 1,77 1,70 1,38 7.597.338 0,1074 4.228.822 3,91 1,43 1,38 Etanol 1,58 30.192.136 0,6511 22.242.199 2,75 2,06 1,82 1,47 45.939.629 0,6497 26.949.660 2,01 1,77 1,59 1-Propanol 1,88 73.666.492 1,5886 45.623.004 8,09 1,66 1,54 1,77 112.081.930 1,5850 64.175.681 6,71 1,31 1,21 Álcool Isobutírico 2,05 46.371.711 1,0000 58.382.545 5,47 1,60 1,42 1,94 70.714.262 1,0000 87.715.737 4,99 1,11 0,98 1-Butanol 2,22 101.463.616 2,1880 88.695.233 7,68 1,80 1,65 2,10 154.254.746 2,1814 142.811.315 7,12 1,61 1,47 Ácido acético 3,95 9.001.700 0,2930 5.137.311 48,95 3,32 2,66 3,68 13.751.909 0,3177 7.375.992 46,23 4,76 4,32 Ácido propiônico 4,92 39.502.290 1,2857 13.832.413 17,21 3,64 3,54 4,57 44.006.193 1,0168 13.618.820 15,31 4,38 4,37 Ácido butírico 6,31 69.247.271 2,2538 12.895.568 13,51 1,31 1,39 6,08 41.721.388 0,9640 9.990.446 19,47 1,49 1,47 Ácido isovalérico 6,82 84.042.354 2,7354 39.060.974 5,56 0,74 0,73 6,58 121.922.995 2,8171 57.457.033 7,44 0,67 0,67 Ácido valérico 7,50 85.661.670 2,7881 78.982.111 17,93 1,08 1,10 7,30 126.523.147 2,9234 99.125.243 17,64 0,91 1,04 Ácido crotônico 7,77 30.724.316 1,0000 30.366.463 10,29 1,37 1,39 7,60 43.279.579 1,0000 35.307.791 10,23 0,94 0,93 Ácido capróico 8,16 89.723.699 2,9203 118.804.314 17,24 1,14 1,10 8,01 128.311.646 2,9647 142.814.203 17,36 0,86 0,83 Ácido láctico 10,53 5.929.145 0,1930 5.040.837 92,32 1,08 1,07 10,34 10.113.366 0,2337 8.327.913 91,20 0,85 0,89 Média 49.072.370,1 1,38288 38.454.046,6 18,038 1,727 1,618 67.510.639,0 1,29382 51.191.252,6 17,830 1,680 1,611 tR Área A/APi Altura Resolução Encaud. Assimetria tR Área A/APi Altura Resolução Encaud. Assimetria Acetona 1,12 20.298.714 0,3519 16.003.129 1,78 1,70 1,05 28.844.121 0,3570 23.154.063 1,23 1,18 Metanol 1,29 6.155.857 0,1067 3.925.150 4,63 1,77 1,70 1,22 8.910.932 0,1103 5.758.604 4,51 1,48 1,43 Etanol 1,38 37.541.320 0,6509 24.942.144 2,31 2,11 1,91 1,31 53.615.206 0,6635 37.112.762 2,42 1,70 1,50 1-Propanol 1,68 91.162.979 1,5805 53.634.150 7,19 1,52 1,40 1,60 128.855.740 1,5946 81.959.185 7,98 1,45 1,31 Álcool Isobutírico 1,84 57.679.480 1,0000 88.746.450 5,37 1,36 1,15 1,77 80.806.196 1,0000 108.778.681 5,72 1,14 0,98 1-Butanol 2,00 125.823.748 2,1814 130.258.178 8,32 1,83 1,67 1,93 171.193.158 2,1186 143.093.721 7,63 1,42 1,27 Ácido acético 3,48 11.660.915 0,3162 7.523.451 49,90 3,48 3,06 3,32 15.341.746 0,3489 9.651.834 44,94 3,79 3,43 Ácido propiônico 4,30 45.457.659 1,2326 15.313.969 15,07 3,92 3,83 4,09 59.542.929 1,3539 21.146.659 14,38 4,32 4,19 Ácido butírico 5,72 83.787.881 2,2720 11.954.814 11,28 1,91 1,93 5,55 85.801.432 1,9510 12.376.856 3,45 1,13 1,10 Ácido isovalérico 6,26 102.034.251 2,7668 41.661.413 4,60 0,68 0,67 6,06 141.397.778 3,2152 52.313.904 10,33 0,68 0,67 Ácido valérico 7,02 103.438.832 2,8049 61.124.973 15,48 1,02 1,06 6,82 136.660.707 3,1075 79.032.855 13,89 0,93 1,01 Ácido crotônico 7,40 36.878.257 1,0000 26.802.353 10,20 1,12 1,10 7,25 43.977.582 1,0000 22.953.262 9,76 0,97 0,95 Ácido capróico 7,87 107.380.980 2,9118 131.866.456 16,54 0,97 0,94 7,76 139.760.617 3,1780 142.904.236 15,08 0,97 0,94 Ácido láctico 10,20 3.351.177 0,0909 2.854.036 88,24 1,04 1,03 10,09 17.471.991 0,3973 14.866.264 85,19 0,92 0,92 Média 59.475.146,1 1,37619 44.043.618,9 17,081 1,751 1,653 79.441.437,9 1,45684 53.935.920,2 16,092 1,579 1,492 Vazão do gás de arraste 3,0mL/min Analito Vazão do gás de arraste 3,5mL/min Vazão do gás de arraste 4,0mL/min Analito Vazão do gás de arraste 2,5mL/min 46 Figura 9 - Cromatogramas da região do a) ácido propiônico, b) ácido butírico e c) ácido valérico nas vazões estudadas. Fonte: o autor Salienta-se que, esses experimentos foram realizados nas condições do método com modo de injeção air plug, injetando 1 µL de amostra. Posteriormente percebeu-se que o volume de amostra estava impactando negativamente na resolução do ácido butírico em função da proximidade com a banda do solvente. Então esse volume foi reduzido para 0,8 µL. Ao repetir o experimento utilizando a técnica de injeção cold needle buscou-se obter uma relação de compromisso entre resolução do ácido butírico, um dos principais compostos presentes nos reatores biológicos, e a área dos analitos. A melhor condição obtida foi de 3,5 mL min-1, os valores e resolução podem ser observados na Tabela 9 e Figura 10. Minutes 5,0 5,2 5,4 5,6 5,8 6,0 6,2 6,4 6,6 6,8 7,0 M ill iv o lt s 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 M ill iv o lt s 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4 ,9 2 3 Á c id o p ro p iô n ic o 6 ,3 0 0 Á c id o b u tí ri c o 6 ,8 0 7 Á c id o i s o v a lé ri c o TRACE GC-Channel 1 2,5_001 Retention Time Name Minutes 4,6 4,8 5,0 5,2 5,4 5,6 5,8 6,0 6,2 6,4 6,6 6,8 M ill iv o lt s 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 M ill iv o lt s 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 4 ,5 6 8 Á c id o p ro p iô n ic o 6 ,0 8 0 Á c id o b u tí ri c o 6 ,5 7 7 Á c id o i s o v a lé ri c o TRACE GC-Channel 1 3,0_001 Retention Time Name Minutes 4,4 4,6 4,8 5,0 5,2 5,4 5,6 5,8 6,0 6,2 6,4 M ill iv o lt s -500 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 M ill iv o lt s -500 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 4 ,3 0 3 Á c id o p ro p iô n ic o 5 ,7 3 2 Á c id o b u tí ri c o 6 ,2 4 8 Á c id o i s o v a lé ri c o TRACE GC-Channel 1 40uL_006 Retention Time Name Minutes 4,2 4,4 4,6 4,8 5,0 5,2 5,4 5,6 5,8 6,0 6,2 6,4 M ill iv o lt s 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 5500 M ill iv o lt s 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 5500 4 ,0 9 2 Á c id o p ro p iô n ic o 5 ,5 4 0 Á c id o b u tí ri c o 6 ,0 6 0 Á c id o i s o v a lé ri c o TRACE GC-Channel 1 4,0_001 Retention Time Name a) a) b) b) 2,5 mLmin - 1 3,5 mLmin - 1 4,0 mLmin - 1 a) a) b) b) 3,0 mLmin - 1 c) c) c) c) 47 Tabela 9 - Resultados de Resolução, Encaudamento, Assimetria e Altura com vazão e volume otimizados. Fonte: o autor Figura 10 - Cromatogramas da região do a) ácido propiônico, b) ácido butírico e c) ácido valérico com vazão e volume otimizados. Fonte: o autor 4.1.6 Temperatura do injetor A temperatura do injetor foi testada levando em consideração a temperatura máxima permitida pela coluna (250°C). Três condições foram testadas: 220°C, 230°C e 240°C. As análises foram realizadas em triplicatas usando solução de 1000 mg L-1. Os resultados obtidos são mostrados na Tabela 10: Tabela 10 - Resultados das análises de injeção em diferentes temperaturas do injetor. Fonte: o autor Não foi observado tendência de aumento da área em função da temperatura do injetor, provavelmente em função do uso da lã de vidro que auxilia na vaporização dos analitos. Como a temperatura de trabalho da coluna é de até 250 °C optou-se por trabalhar com o injetor a 230 °C. Nesta temperatura também se obteve o menor desvio padrão médio. Esta temperatura é 35 °C maior que a temperatura de ebulição tR Área média A/APi Altura média Resolução Encaud. Assimetria Acetona 1,16 6.902.197 0,2284 7.056.332 1,548 1,407 Metanol 1,32 8.150.330 0,2696 7.683.025 6,185 1,910 1,715 Etanol 1,41 22.638.503 0,7488 23.209.960 3,635 1,762 1,530 1-Propanol 1,70 10.227.581 0,3383 8.579.905 10,725 1,805 1,687 Álcool Isobutírico 1,86 30.238.656 1,0000 62.449.008 7,567 1,240 1,075 1-Butanol 2,01 12.595.063 0,4166 16.810.418 10,319 1,915 1,669 Ácido acético 3,47 11.437.661 0,5909 8.500.588 54,230 2,592 2,434 Ácido propiônico 4,27 42.787.673 2,2109 21.758.514 18,339 2,814 2,624 Ácido butírico 5,54 59.659.618 3,0816 20.242.286 12,939 2,065 2,070 Ácido isovalérico 6,07 48.079.531 2,4832 20.462.940 7,377 1,185 1,171 Ácido valérico 6,90 20.183.141 1,0424 10.323.168 14,902 0,948 0,933 Ácido crotônico 7,32 19.360.903 1,0000 10.393.559 13,920 1,642 1,551 Ácido capróico 7,84 10.982.105 0,5671 12.781.577 14,807 1,143 1,112 Ácido láctico 9,09 697.468 0,0361 1.203.346 65,754 1,005 0,986 Média 21.710.031 1,001 16.532.473 18,515 1,684 1,569 Vazão do gás de arraste 3,5mL/min Composto tR Média A/API s tR Média A/API s tR Média A/API s Acetona 1,118 0,366 0,00036 1,118 0,352 0,00180 1,118 0,366 0,00004 Metanol 1,284 0,111 0,00013 1,285 0,107 0,00027 1,284 0,111 0,00027 Etanol 1,376 0,666 0,00141 1,377 0,651 0,00225 1,376 0,664 0,00034 1-Propanol 1,673 1,598 0,00063 1,675 1,581 0,00138 1,673 1,594 0,00029 1-Butanol 1,994 2,185 0,00190 1,995 2,181 0,00202 1,995 2,185 0,00226 Ácido acético 3,478 0,332 0,01430 3,483 0,316 0,00020 3,477 0,322 0,00279 Ácido propiônico 4,294 1,363 0,03885 4,304 1,234 0,04214 4,297 1,441 0,12560 Ácido butírico 5,691 2,436 0,08135 5,735 2,270 0,00391 5,715 2,394 0,03221 Ácido isovalérico 6,216 2,913 0,10393 6,257 2,767 0,00281 6,233 2,892 0,03988 Ácido valérico 6,989 2,912 0,11810 7,016 2,804 0,02344 7,001 2,917 0,02919 Ácido capróico 7,859 3,008 0,03928 7,868 2,911 0,01317 7,863 3,062 0,02580 Média 0,03639 0,00849 0,02351 Composto 220°C 230°C 240°C a) b) c) 48 do 1-octanol (solvente) e 28 °C acima da temperatura de ebulição do ácido capróico, composto com maior ponto de ebulição dentre as substâncias de interesse, portanto não impacta na volatização dos analitos. 4.1.7 Padrão interno Após os ensaios de otimização realizados no sistema de amostragem e injeção, os valores de repetitividade ainda estavam insatisfatórios (desvio padrão relativo médio de 4,47%) quando o solvente octanol era utilizado, o que é considerado alto na análise de cromatografia em fase gasosa e indica a necessidade do uso de padrão interno. Desta forma, três padrões internos com características diferentes foram implantados, em atendimento as características químicas dos analitos, a saber: a) o álcool isobutírico para os álcoois e cetona, b) o ácido crotônico para os ácidos, e c) o etilenoglicol para o 1,3-propanodiol e o glicerol. Com a aplicação de padrão interno, o desvio padrão relativo médio foi reduzido para 2,58%. A Tabela 11 mostra os valores de desvio padrão relativo encontrados para cada analito de interesse, com e sem adição de padrão interno diretamente adicionado no solvente octanol. Os ensaios foram realizados com solução de concentração 1000 mg L-1. Tabela 11 - Avaliação do desvio padrão relativo (DPR) proveniente das análises com o uso e sem o uso de padrão interno. Fonte: o autor Analito DPR (%) Analito DPR (%) Acetona 3,32 Acetona 0,99 Metanol 3,57 Metanol 0,97 Etanol 3,30 Etanol 0,98 1-Propanol 3,59 1-Propanol 0,81 1-Butanol 3,62 1-Butanol 1,06 Ácido acético 5,31 Ácido acético 2,96 Ácido propiônico 5,35 Ácido propiônico 4,18 Ácido butírico 4,83 Ácido butírico 3,67 Ácido isovalérico 5,42 Ácido isovalérico 2,66 Ácido valérico 5,17 Ácido valérico 2,87 1,3 propanodiol 3,59 1,3 propanodiol 3,57 Ácido capróico 5,45 Ácido capróico 2,37 Ácido láctico 7,02 Ácido láctico 5,09 Glicerol 3,08 Glicerol 3,93 Média 4,47 2,58 Teste de repetibilidade Sem padrão interno Com padrão interno 49 A Figura 11 mostra o cromatograma de separação dos analitos, na concentração de 1000 mg L-1 em octanol, após otimização dos parâmetros cromatográficos estudados e com a aplicação dos padrões internos. Figura 11 - Cromatograma da separação dos analitos de interesse e padrões internos em octanol. Fonte: o autor 4.1.8 Efeito de memória (carryover) O efeito de memória, ou carryover, ocorre quando a limpeza da seringa é ineficiente, deixando resíduo da injeção anterior no êmbolo da seringa. Este resíduo pode impactar no resultado da análise seguinte, indicando a presença de determinado analito quando na realidade este não está presente na amostra e sim na seringa. Além disso, pode ocasionar incremento de área entre injeções levando a resultados superestimados. Em contrapartida, o processo exaustivo de limpeza da seringa visando eliminar este efeito tem como consequência maior tempo entre análises, maior quantidade de reagente gasto na limpeza e, consequentemente, aumento do custo global da análise. Tendo em vista a característica de alta viscosidade do solvente foi proposto fazer 15 ciclos de limpeza após injeção. O efeito da limpeza da seringa após injeção foi avaliado segundo duas abordagens diferentes. Na primeira abordagem foi avaliada a possibilidade de aumento da área entre injeções consecutivas dos analitos em alta concentração e, 50 na segunda foi abordado o impacto de uma injeção em alta concentração sobre uma injeção subsequente de solvente. Na avaliação em alta concentração foram feitas onze injeções sequenciais usando a amostra do limite superior da curva analítica. Na segunda abordagem foram feitas três injeções de solvente, seguida de uma injeção contendo os analitos em alta concentração sucedida por outra injeção de solvente. Não foi observado efeito de memória nas injeções sequenciais, contudo, foi observado efeito de memória para alguns ácidos orgânicos entre injeções de solvente e analitos em alta concentração. Portanto, o processo de limpeza da seringa foi ajustado para 10 ciclos de 8 µL na pré-injeção e 15 ciclos de 8 µL na pós-injeção. Os resultado inicial e final foram comparados com o teste t de Student, com 95% de confiança. As Tabela 12 e Tabela 13 mostram os resultados dos testes de efeito memória nas amostras de alta e baixa concentração, respectivamente. Tabela 12 - Teste de efeito de memória em amostras de alta concentração. Fonte: o autor 11ª injeção Área média s Área Acetona 1,17 39.231.668 1.556.681 41.360.447 µ inicial = µ final Metanol 1,34 39.429.944 1.672.725 41.648.563 µ inicial = µ final Etanol 1,43 114.849.665 5.241.166 121.911.083 µ inicial = µ final 1-Propanol 1,73 101.827.614 4.676.824 107.972.500 µ inicial = µ final Álcool Isobutírico 1,90 27.086.800 1.321.115 28.630.530 µ inicial = µ final 1-Butanol 2,06 48.568.259 2.290.651 51.609.022 µ inicial = µ final Ácido acético 3,59 52.119.400 2.395.752 53.773.271 µ inicial = µ final Ácido propiônico 4,44 192.811.336 10.082.012 206.365.029 µ inicial = µ final Ácido butírico 5,74 266.819.837 15.524.347 284.105.732 µ inicial = µ final Ácido isovalérico 6,28 189.997.775 11.533.697 202.215.937 µ inicial = µ final Ácido valérico 7,10 97.116.412 6.199.270 103.366.911 µ inicial = µ final Ácido crotônico 7,48 20.511.549 1.377.903 21.653.076 µ inicial = µ final Ácido capróico 7,94 55.234.321 3.775.999 58.932.494 µ inicial = µ final Ácido láctico 9,14 2.118.110 127.902 2.223.212 µ inicial = µ final Triplicata inicial Teste t de Student Analito tR 51 Tabela 13 - Teste de efeito de memória em amostras de baixa concentração. Fonte: o autor 4.1.9 Método de separação otimizado Durante o processo de investigação das melhores condições de separação cromatográfica foram feitos otimizações no método inicialmente proposto, para obtenção da melhor separação cromatográfica possível dos compostos, com exceção do ácido isobutírico, cujo tempo de retenção é igual ao do solvente. A Tabela 14 mostra as configurações estabelecidas para este método. Branco final Área média s tR Área Área Acetona 1,13 34.819 33.976 1,17 37.705.087 26.279 µ final ≤ µ inicial Metanol 1,33 30.056 18.198 1,34 37.711.223 27.597 µ final ≤ µ inicial Etanol 1,43 36.128 25.756 1,44 109.828.112 12.215 µ final ≤ µ inicial 1-Propanol 1,73 68.372 62.300 1,73 97.673.559 8.384 µ final ≤ µ inicial Álcool Isobutírico 2,04 29.017.755 1.321.115 2,06 26.073.508 30.193.025 µ final ≤ µ inicial 1-Butanol 2,04 76.649 54.011 2,06 46.785.257 23.013 µ final ≤ µ inicial Ácido acético 3,60 207.009 168.869 3,59 49.858.525 191.303 µ final ≤ µ inicial Ácido propiônico 4,49 1.365.233 595.535 4,44 183.080.039 1.841.918 µ final ≤ µ inicial Ácido butírico 5,75 57.994 23.072 5,75 260.610.186 43.378 µ final ≤ µ inicial Ácido isovalérico 6,29 48.227 38.515 6,28 186.075.953 61.573 µ final ≤ µ inicial Ácido valérico 7,06 312.308 43.569 7,10 54.339.748 200.286 µ final ≤ µ inicial Ácido crotônico 7,94 19.160.014 1.377.903 7,95 20.103.833 20.020.012 µ final ≤ µ inicial Ácido capróico 7,94 100.215 3.061 7,95 54.339.748 108.286 µ final ≤ µ inicial Ácido láctico 8,77 70.200 949 9,15 2.066.578 18.440 µ final ≤ µ inicial Teste t de Student Amostra alta conc. Analito tR Branco inicial 52 Tabela 14 - Método para análise dos compostos por calibração interna em octanol. Fonte: o autor, adaptado do software ChromQuest 5.0 Rate (°C/min) Temp (°C) Hold time (minutes) Initial 35 0,00 Injection mode: Basic Ramp 1 10,0 40 0,00 Sample vol (µL): 1,0 Ramp 2 50,0 115 2,70 Plunger strokes: 0 Ramp 3 10,0 145 0,00 Air and Filling mode: Custom Ramp 4 50,0 250 1,20 Air volume (µL): 3,0 Acquisition Time (min): 11,00 Filling volume (µL): 2,0 Equilibration Time (min): 0,50 Sampling depth mode: Bottom Temperature (°C): 240 Split flow (mL/min): 70 Injection depth: Custom Split ratio: 20 Pre-injection dwell time (s): 3,0 Post-injection dwell time (s): 0,0 Gas: He Injection depth (mm): 40 Flow (mL/min): 3,5 Inj. Speed (µL/s): 30 Flow mode: Constant flow Sample type: Custom Base temperature (°C): 250 Sample pull up speed (µL/s): 0,3 Ignition Threshold (pA): 0,5 Delay after plung. Strokes (s): 0,0 Flow (mL/min) Viscosity delay (s): 2,0 Air 350 H2 35 Pre-injection N2 30 Rinses: 3 Signal: Range 1 Rinse volume (µL): 2,5 Post-injection Solvent: A Cycles: 15 Solvent volume (µL): 7,0 Wash solvent depth %: 80 Waste depth %: 20 Needle speed in vial (mm/s): 100 Solvent filling speed (µL/s): 1 Bubble elimin. Pullup (µL/s): 50 Delay between strokes (s): 0 Parâmetros avançados Configuração cromatógrafo Rampa Amostragem GC Liquid > General Profundidade no vial Injetor (split/splitless) Injeção Gás de arraste Viscosidade Detector (FID) Limpeza da seringa 53 4.1.10 Curva analítica preparada no solvente 1-octanol A curva analítica foi construída por padronização interna com os analitos preparados diretamente em 1-octanol, ou seja, sem considerar a microextração líquido-líquido (LLME). Foi preparada uma solução estoque contendo todos os analitos de interesse em octanol. Em seguida, a solução foi diluída e analisada em duplicata após adição de padrão interno (PI) na concentração aproximada de 1000 mg L-1. A área relativa (área do analito/área do padrão interno) foi plotada em função da concentração, resultando nas curvas analíticas e nos demais parâmetros analíticos, conforme é mostrado na Tabela 15. As bandas foram integradas pelo software do equipamento no modo “valley to valley”, ou seja, a linha de base foi ajustada automaticamente para integrar do início ao fim de cada banda. Tabela 15 - Intervalo de quantificação, equação da curva analítica e exatidão do modelo. Fonte: o autor a b R2 LIQ LSQ Acetona 42,19 à 3164 0,0006686 0,002407 0,9998 99,36 99,54 Metanol 64,09 à 3205 0,0005007 -0,003006 0,9999 95,54 100,2 Etanol 63,64 à 3182 0,0007368 0,000574 1,0000 88,64 99,97 1-Propanol 65,63 à 2188 0,0009591 -0,000136 0,9999 90,75 99,90 1-Butanol 65,40 à 1090 0,0010683 -0,001189 0,9998 93,52 99,45 71,63 à 1194 0,0005419 -0,016084 0,9998 105,5 100,1 1194 à 6685 0,0005528 -0,022084 0,9984 99,01 98,15 67,74 à 1129 0,0008522 -0,029564 0,9994 113,5 100,6 1129 à 6322 0,0009166 -0,130777 0,9996 103,3 99,56 65,07 à 2169 0,0010839 -0,028992 0,9998 108,7 100,3 2169 à 6073 0,0011463 -0,133376 0,9975 99,06 98,33 63,41 à 1057 0,0012884 -0,030597 0,9998 105,2 100,3 1057 à 5918 0,0013688 -0,145586 0,9997 102,4 99,57 64,68 à 1078 0,0012796 -0,004806 0,9998 104,4 100,2 1078 à 6036 0,0013498 -0,114183 0,9997 102,5 99,62 308,4 à 3559 0,0011305 -0,169278 0,9976 91,58 98,03 3559 à 6643 0,0006189 1,578561 0,9993 99,70 99,46 63,27 à 1055 0,0013817 -0,025104 0,9998 105,3 100,5 1055 à 5905 0,0013195 0,130491 0,9983 94,03 98,16 45,59 à 569,9 0,0000175 0,000097 0,9901 112,5 103,0 569,9 à 6383 0,0000728 -0,037577 0,9853 115,6 103,4 316,4 à 3651 0,0006752 -0,040770 0,9994 94,20 99,16 3651 à 6816 0,0004403 0,801368 0,9991 99,66 99,39 Glicerol Composto Intervalo (mg L-1) Equação da curva y = ax + b Exatidão do modelo (%) Ácido butírico Ácido propiônico Ácido acético Ácido láctico Ácido capróico 1,3 propanodiol Ácido valérico Ácido isovalérico 54 Para alguns analitos foi necessário estabelecer duas curvas analíticas, uma para baixa concentração e outra para concentrações maiores. Esse procedimento é comum e visa adequar a resposta linear do equipamento ao modelo analítico. A exatidão6 dos modelos variou de 88,64% a 115,7% no limite inferior de quantificação (LIQ) e de 98,03% a 103,4% no limite superior de quantificação (LSQ). Os maiores desvios foram observados para o ácido propiônico (113,5%) e para o ácido láctico (112,5% e 115,7%), ambos no LIQ. De maneira geral, estes valores de desvio foram considerados aceitáveis, uma vez que se referem ao LIQ. Além disso, o modelo foi desenvolvido para ser usado como ponto de referência nas etapas intermediárias do trabalho, como nos testes de recuperação, onde a faixa de trabalho estudada foi de aproximadamente 1000 mg L-1. 4.2 Estudo e otimização da microextração líquido-líquido Os reatores biológicos de produção de hidrogênio operam em fase aquosa, portanto, os álcoois, cetona e ácidos orgânicos produzidos pelos microrganismos durante o processo de transformação do substrato ficam dissolvidos no meio aquoso. Para realizar a análise quantitativa estes analitos tiveram que ser transferidos para uma fase orgânica, ou seja, neste método proposto, para o 1- octanol. A extração foi muito importante na eliminação de impurezas e interferentes da amostra, que poderiam vir a entupir a seringa, contaminar o injetor, precipitar na coluna e/ou sujar o detector. Outro benefício da extração foi a pré-concentração dos analitos quando se usa uma quantidade de amostra maior do que de solvente. Em muitos casos essa etapa é fundamental para obtenção de bons limites de quantificação. Para que o método seja eficaz na quantificação é preciso que ao menos uma fração dos compostos da fase aquosa migre para a fase orgânica. Geralmente quanto mais, melhor. Assim, foram estudadas quatro variáveis que influenciam na recuperação destes analitos. As variáveis estudadas foram: tipo de sal (efeito salting-out), pH, tempo de homogeneização e razão amostra/solvente. O estudo foi 6 Calculada tendo como base a resposta predita pelo modelo em função dos valores obtidos experimentalmente. 55 dividido em três etapas: uma etapa de triagem para estudar a aplicabilidade de alguns sais, ácidos e modos de homogeneização, uma etapa de planejamento fatorial e uma etapa de otimização das condições de extração. Durante cada etapa os experimentos foram planejados visando trabalhar com volumes reduzidos de amostra e de reagentes, pois os reatores biológicos de bancada são pequenos e não permitem a retirada de grandes volumes de amostra. Além disso, maiores volumes tornariam a aplicação mais morosa, com maior custo e com maior impacto ao meio ambiente. Em todos os experimentos da primeira e segunda etapa foram usados frascos tipo eppendorf com capacidade de 1,5 mL. 4.2.1 Etapa 1: análise individual das variáveis Na primeira etapa foi realizada uma avaliação dos reagentes disponíveis e cada variável foi avaliada em 2 níveis diferentes, conforme será detalhado nos tópicos seguintes. No entanto, antes da realização dos experimentos, foi feita uma análise do modo de homogeneização. Todos os ensaios da etapa 1 e etapa 2 foram realizados usando solução aquosa de 1000 mg L-1 e extração com octanol contendo padrão interno na mesma concentração. Na verificação dos testes de recuperação da extração foi usada como referência a curva analítica desenvolvida com os analitos em octanol. 4.2.1.1 Modo de homogeneização Inicialmente dois modos de homogeneização foram propostos: uso de agitador de tubos (vortex) ou utilização de um banho de ultrassom. Contudo, foi observado visualmente que o banho de ultrassom não proporcionava a mistura da amostra. Portanto, com esta avaliação qualitativa ficou definido o uso do agitador de tubos, onde a agitação é mais vigorosa. 56 4.2.1.2 Tempo de homogeneização O tempo de homogeneização foi mantido constante em todos os ensaios da primeira etapa (1 min), para diminuição do número de experimentos. Na segunda etapa, de planejamento fatorial, essa variável foi melhor investigada. 4.2.1.3 Razão entre volume de amostra e solvente Assim como no tempo de homogeneização esta variável também foi mantida constante e investigada no planejamento experimental. 4.2.1.4 Sais Os sais foram testados usando o princípio do efeito salting-out, onde a adição de um sal favorece a dessolvatação dos analitos melhorando sua transferência para a fase orgânica. Dois níveis de concentração foram avaliados (BARTH et al., 2015). Em um nível foi usada concentração suficiente para a saturação da amostra (nível alto) e o outro nível foi usada concentração equivalente a 50% do valor de saturação (nível baixo). As demais variáveis foram mantidas constantes, conforme Tabela 16. Tabela 16 - Planejamento da variável sal no teste de extração. Fonte: solubilidade chemspider.com. O autor Alguns sais foram reprovados após a observação de baixíssima solubilidade e turvação da amostra. O persulfato de potássio e o bifosfato de sódio foram avaliados no nível baixo, também em função da baixa solubilidade observada no nível alto. Baixo Alto Amostra Solvente Persulfato de potássio 620 0,28 0,55 1 min 900 500 - Cloreto de sódio 359 0,16 0,32 1 min 900 500 - Tiossulfato de sódio 701 0,32 0,63 1 min 900 500 - Cloreto de magnésio 543 0,24 0,48 1 min 900 500 - Bifosfato de sódio 850 0,38 0,76 1 min 900 500 - Nitrato de sódio 874 0,39 0,78 1 min 900 500 - Fluoreto de sódio 422 0,19 0,37 1 min 900 500 - Sal Nível (g) Razão Volume amostra/solvente (µL)Tempo homogeneização pH Solubilidade g L-1 57 Todas as amostras saturadas, incluindo o persulfato de potássio e o bifosfato de sódio no nível baixo, continham precipitado, indicando a saturação da amostra. Além do estudo da extração usando diferentes sais foi feito uma análise sem adição de sal (branco) para efeito de comparação. A recuperação de cada analito está relacionada na Tabela 17, onde destaca-se em negrito a melhor condição de extração para cada analito. Tabela 17 - Relação da recuperação dos analitos em função de diferentes sais e do branco. Fonte: o autor Os experimentos mostraram maior eficiência de extração quando as amostras estavam saturadas. Dentre os sais utilizados o nitrato de sódio (NaNO3) foi o que apresentou melhor resultado, seguido do cloreto de magnésio (MgCl2) e cloreto de sódio (NaCl). Usando o NaCl, em comparação com o NaNO3, foi observada pequena melhora no percentual de recuperação do ácido acético (31,4%) e ácido crotônico (92,3%). Já o MgCl2 proporcionou melhor recuperação do ácido láctico (70,6%). Os compostos que apresentaram menor recuperação foram o etilenoglicol (10,5%, padrão interno), o 1,3-propanodiol (1,7%) e o glicerol (0,1%), provavelmente devido a estabilidade proporcionada pelas hidroxilas presentes em sua estrutura, no meio aquoso. Portanto, o NaNO3 e o MgCl2 foram considerados os sais de maior potencial de recuperação dos compostos da fase aquosa e foram definidos para os ensaios da segunda etapa, ambos na concentração de saturação da amostra. Sat. 50% sat. Sat. 50% sat. Sat. 50% sat. Acetona 22,2 18,0 38,1 33,1 24,0 24,8 35,0 41,4 29,2 24,8 Metanol 9,2 8,4 12,8 11,5 7,3 8,4 15,0 15,9 11,9 9,3 Etanol 20,8 20,4 40,7 32,0 23,1 22,9 46,5 50,9 33,8 23,9 1-Propanol 45,5 44,2 68,7 60,5 55,2 52,6 73,4 90,3 62,0 51,7 Álcool Isobutírico 73,2 72,4 87,1 87,0 80,3 76,9 89,9 88,5 86,7 75,5 1-Butanol 73,7 69,7 81,0 79,8 84,9 82,5 86,5 107,0 80,2 78,5 Ácido acético 19,0 18,6 31,4 26,7 28,7 25,1 2,4 31,1 22,9 1,8 Ácido propiônico 49,2 50,9 74,2 65,3 71,3 64,5 3,3 94,4 65,1 17,3 Etilenoglicol 0 6,1 8,0 6,8 10,4 6,6 7,9 10,5 8,5 3,3 Ácido butírico 74,6 72,1 85,6 82,6 91,9 87,8 1,9 113,2 80,5 47,2 Ácido isovalérico 82,2 78,4 82,9 83,7 93,6 92,0 5,1 112,9 82,5 69,3 Ácido valérico 80,7 76,9 80,1 81,0 90,0 89,0 6,4 108,9 79,9 69,3 Ácido crotônico 74,3 76,5 92,3 91,6 88,5 82,6 1,3 88,7 87,0 30,5 1,3 propanodiol 0 0 0 0 0 0 1,7 0 0 0 Ácido capróico 88,3 79,5 77,8 82,1 90,2 91,5 14,6 107,8 81,1 78,3 Ácido láctico 9,8 6,5 19,2 9,5 70,6 40,0 2,9 30,9 11,9 2,5 Glicerol 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 % de recuperação Cloreto de sódio Cloreto de Magnésio Nitrato de sódioBifosfato de sódio Fluoreto de sódio Branco (sem sal) Persulfato de potássio Analito 58 4.2.1.5 pH A adição de ácido inorgânico a solução aquosa contendo ácidos orgânicos em equilíbrio foi estudada usando quatro ácidos: ácido clorídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico e ácido nítrico. Este estudo foi realizado porque a adição de ácido favorece o deslocamento de equilíbrio dos ácidos orgânicos no sentido da formação das espécies não ionizada, ou seja, o deslocamento de equilíbrio melhora a recuperação dos compostos de interesse pelo solvente orgânico. Os cálculos das concentrações usadas nesta avaliação foram feitos tendo como base a constante de acidez do ácido láctico (Ka = 0,000141), que é a mais elevada dentre os ácido