RESSALVA
Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto
completo desta dissertação será
disponibilizado somente a partir de
29/08/2025.
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE
MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE MEDICINA
PALOMA VITÓRIA LIMA PEIXOTO
DISFUNÇÃO MITOCONDRIAL, MUTAGENICIDADE E
GENOTOXICIDADE COMO POSSÍVEIS MECANISMOS DE
AÇÃO DO DIURON E SEUS METABÓLITOS (DCA E DCPMU)
EM ZEBRAFISH
Dissertação apresentada à Faculdade
de Medicina, Universidade Estadual
Paulista “Júlio de Mesquita Filho”,
Campus de Botucatu, para obtenção
do título de Mestra em Patologia.
Orientadora: Profa. Dra. Lilian Cristina Pereira
Coorientador: Prof. Dr. João Lauro Viana de Camargo
Botucatu
2023
Paloma Vitória Lima Peixoto
Disfunção mitocondrial, mutagenicidade e
genotoxicidade como possíveis mecanismos de
ação do Diuron e seus metabólitos (DCA e
DCPMU) em Zebrafish
Dissertação apresentada à
Faculdade de Medicina,
Universidade Estadual Paulista
“Júlio de Mesquita Filho”,
Campus de Botucatu, para
obtenção do título de Mestra em
Patologia.
Orientadora: Profa. Dra. Lilian Cristina Pereira
Coorientadora: Prof. Dr. João Lauro Viana de Camargo
Botucatu
2023
Palavras-chave: Diuron; Genotoxicidade; Mitotoxicidade;
Mutagenicidade; Zebrafish.
Peixoto, Paloma Vitória Lima.
Disfunção mitocondrial, mutagenicidade e genotoxicidade
como possíveis mecanismos de ação do Diuron e seus
metabólitos (DCA e DCPMU) em Zebrafish / Paloma Vitória
Lima Peixoto. - Botucatu, 2023
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista
"Júlio de Mesquita Filho", Faculdade de Medicina de
Botucatu
Orientador: Lilian Cristina Pereira
Coorientador: João Lauro Viana de Camargo
Capes: 21007004
1. Diuron. 2. Toxicologia genética. 3. Testes de
mutagenicidade. 4. Zebrafish.
DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CÂMPUS DE BOTUCATU - UNESP
BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: MARIA CAROLINA A. CRUZ E SANTOS-CRB 8/10188
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORM.
IMPACTO POTENCIAL DESTA PESQUISA
Título da Dissertação: Disfunção mitocondrial, mutagenicidade e genotoxicidade
como possíveis mecanismos de ação do Diuron e seus metabólitos (DCA e
DCPMU) em Zebrafish
Impacto científico esperado: Esclarecimento e incorporação de novos dados sobre
a toxicidade do herbicida Diuron e seus metabólitos (DCA e DCPMU) utilizando o
Zebrafish como modelo experimental, com o enfoque nos possíveis danos causados
ao material genético e à mitocôndria.
Impacto social: O melhor entendimento da toxicidade do Diuron e seus metabólitos
auxilia na tomada de decisão das agências regulatórias com relação ao uso seguro
do herbicida. Dessa forma, evitando que ocorra a exposição dos seres humanos e a
contaminação do meio ambiente que pode gerar problemas à saúde humana e
ambiental. Essa contribuição se insere nos Objetivos do Desenvolvimento
Sustentável (ODS) relacionadas à vida terrestre (ODS 15), à vida aquática (ODS
14) e à saúde e bem-estar humano (ODS 3).
POTENTIAL IMPACT OF THIS RESEARCH
Dissertation Title: Mitochondrial dysfunction, mutagenicity, and genotoxicity as
potential mechanisms of action of Diuron and its metabolites (DCA and DCPMU)
in Zebrafish
Expected scientific impact: Clarification and integration of new data on the
toxicity of the herbicide Diuron and its metabolites (DCA and DCPMU) using the
Zebrafish as an experimental model, with a focus on potential damages to genetic
material and mitochondria.
Social impact: A better understanding of the toxicity of Diuron and its metabolites
assists regulatory agencies in making informed decisions regarding the safe use of
the herbicide. By doing so, it helps prevent human exposure and environmental
contamination that could lead to health issues for both humans and the environment.
This contribution aligns with the Sustainable Development Goals (SDGs) related to
life on land (SDG 15), life below water (SDG 14), and human health and well-being
(SDG 3).
AGRADECIMENTOS
Agradeço a todos que fizeram parte dessa jornada, pois cada um de vocês
contribuiu significativamente para a conclusão deste importante capítulo em minha vida.
Primeiramente, quero expressar minha profunda gratidão a Deus, que me concedeu
a força e proteção necessárias para superar os desafios ao longo dessa trajetória acadêmica.
A Nossa Senhora Virgem de Guadalupe, que é minha intercessora a quem por diversas
vezes pedi que passasse na frente das adversidades junto ao seu filho, Jesus.
À minha amada família, meus pais, Francisca e Antonio Peixoto, eu devo tudo.
Sem o amor, incentivo e suporte incondicional de vocês, eu não estaria aqui hoje,
celebrando esta conquista. Meu irmão, Ryan Lima Peixoto, você trouxe alegria e inspiração
à minha vida, e por isso, sou grata por tê-lo como parte da minha história.
À minha orientadora, Profa. Dra. Lilian Cristina Pereira, minha gratidão é imensa.
Desde a iniciação científica, você tem sido essencial, guiando-me com sabedoria,
compartilhando conhecimento e oferecendo apoio e suporte. Nossa parceria continuará, e
sou grata por ter alguém tão excepcional me orientando nessa jornada.
Aos colegas de biotério de Zebrafish, Bianca Sales Penteado, Cristina Viriato,
Luiza Aggio, Italo Bertoni e Emanuelle, agradeço pela colaboração, apoio técnico e teórico,
amizade e união durante todo o trabalho. Especialmente a Cristina e Luiza, que se tornaram
verdadeiras amigas, apoiando-me tanto profissionalmente quanto pessoalmente.
Ao laboratório TOXICAM, considero-o minha segunda casa e meu lar da ciência,
e agradeço a todos os seus membros por tornarem esse ambiente acolhedor e inspirador.
Ao meu namorado, Erick Bianchini Gimenez, agradeço por estar ao meu lado em
todos os momentos, por me sustentar quando fraquejei e por ser meu porto seguro e o colo
em que posso descansar.
Às minhas melhores amigas, Ana Laura Casella, Larissa Akemi Rodrigues e
Victoria Quintas, mesmo distantes, vocês sempre estiveram presentes, apoiando-me com
carinho e compreensão. Sou grata pela nossa amizade.
À minha família, em especial às minhas avós e meus tios, o Américo Neto Alves e
Rafael Alves, agradeço por todo o amor e incentivo que recebi ao longo de minha vida.
Vocês sempre foram fonte de inspiração.
À Profa. Dra. Alicia Kowaltski do Laboratório de Metabolismo Energético do
Instituto de Química da USP e, principalmente, à técnica Camille Caldeira, meu sincero
agradecimento por disponibilizar o Oroboros Oxígrafo para os testes e por me apoiar
tecnicamente e teoricamente na padronização desse importante experimento.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela
bolsa de mestrado e pelo fomento.
A todos os que de alguma forma contribuíram, acreditem que suas ações não foram
em vão. Meu coração transborda de gratidão por cada um de vocês. Essa conquista é nossa,
e deixo aqui o meu eterno agradecimento por fazerem parte da minha jornada de
crescimento e aprendizado.
“Nada na vida deve ser temido, é apenas para ser
entendido. Agora é a hora de entender mais, para que
possamos ter menos medo.”
- Marie Curie
SUMÁRIO
RESUMO .............................................................................................................. iii
ABSTRACT .......................................................................................................... iv
LISTA DE FIGURAS ............................................................................................ v
LISTA DE TABELAS.............................................................................................vi
Capítulo 1 - Revisão da Literatura
1. PRAGUICIDAS ............................................................................................ 14
2. DIURON E SEUS METÁBOLITOS ............................................................ 16
2.1 Toxicidade do Diuron e seus metabólitos .................................................. 22
3. Zebrafish como modelo alternativo em toxicologia ...................................... 28
3.1 Disfunção Mitocondrial – Ensaio de Consumo Mitocondrial de Oxigênio34
3.2 Genotoxicidade – Teste do Cometa. .......................................................... 39
3.3 Mutagenicidade – Teste do Micronúcleo e de Anormalidades Nucleares em
Eritrócitos .......................................................................................................... 43
2. JUSTIFICATIVA .......................................................................................... 49
4. OBJETIVOS .................................................................................................. 50
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................. 51
Capítulo 2 - Manuscrito
RESUMO GRÁFICO ............................................................................................ 66
RESUMO............................................................................................................... 66
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................. 67
2. MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................... 71
2.1 Químicos .................................................................................................... 71
2.2 Ensaio de Consumo Mitocondrial de Oxigênio ......................................... 73
2.2.1 Organismo-teste: Criação, Manutenção e aquisição dos embriões .... 73
2.2.2 Ensaio de Consumo de Oxigênio Mitocondrial – Respirometria de Alta
Resolução....................................................................................................... 74
2.3 Ensaio de genotoxicidade em estágio embrio-larval ................................. 75
2.3.1 Ensaio de eletroforese de célula única – Teste do Cometa ................. 76
2.4 Ensaio de mutagenicidade em estágio adulto ............................................ 77
2.4.1 Organismo-teste: manutenção e exposição do Zebrafish ................... 77
2.4.2 Teste do Micronúcleo e Anormalidades Nucleares ............................ 78
2.5 Análises Estatísticas ................................................................................... 79
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................... 79
3.1 Exposição Aguda de Zebrafish adulto – Mortalidade ............................... 79
3.2 Análise da Taxa de Consumo de Oxigênio ................................................ 80
3.3 Ensaio do Cometa ...................................................................................... 83
3.4 Teste do Micronúcleo ................................................................................ 87
3.5 Teste de Anormalidades Nucleares............................................................ 89
3.6 Possíveis mecanismos de ação do Diuron, DCA e DCPMU ..................... 94
4. CONSIDERAÇÕES FINAIS ........................................................................ 96
MATERIAL COMPLEMENTAR ........................................................................ 98
REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS .................................................................. 99
ANEXO 1 ............................................................................................................ 107
ANEXO 2 ............................................................................................................ 108
RESUMO
A aplicação de praguicidas na agricultura tem sido associada a
contaminações ambientais e riscos para a saúde humana. Nesse contexto, o
herbicida Diuron (3-(3,4-Diclorofenil)-1,1-dimetilureia) é o quinto mais utilizado
no Brasil e tem gerado preocupação devido à sua persistência em águas e solos, bem
como sua degradação, que resulta em metabólitos potencialmente tóxicos, como a
3-(3,4-diclorofenil)-1-metilureia (DCPMU) e a 3,4-dicloroanilina (DCA). A
avaliação toxicológica utilizando o organismo-modelo Zebrafish (Danio rerio) é
relevante devido à semelhança e conservação do metabolismo de xenobióticos e do
material genético, sendo aproximadamente 70% similar ao dos humanos. O objetivo
deste estudo foi analisar as alterações na função mitocondrial e os potenciais efeitos
mutagênicos e genotóxicos do Diuron, DCA e DCPMU em Zebrafish em
concentrações ambientalmente relevantes (0,5-100 µmol/L) . O ensaio de Consumo
Mitocondrial de Oxigênio (OCR) em embriões (24 hpf) utilizando o Respirômetro
de Alta Resolução permitiu compreender a toxicidade mitocondrial in vivo. Por
outro lado, o potencial genotóxico foi avaliado no estágio embrio-larval (96 hpf)
por meio do Ensaio do Cometa, enquanto a determinação da mutagenicidade em
peixes adultos foi realizada utilizando o Teste do Micronúcleo (MN) e a avaliação
de Anormalidades Nucleares (AN) em eritrócitos. Os resultados demonstraram que
a exposição imediata aos compostos não causou alterações no OCR. O Diuron
causou danos primários ao DNA em todas as concentrações testadas e AN a partir
de 10,0 µmol/L. O DCA apresentou genotoxicidade (0,5-5,0 µmol/L) e causou
pleomorfismo nuclear (AN) (5,0-10,0 µmol/L). O DCPMU causou danos ao DNA
em todas as concentrações testadas e AN em 1,0-10,0 µmol/L. Este estudo
evidenciou que os compostos são genotóxicos, mas não mutagênicos em exposições
agudas, uma vez que não foi identificado aumento na frequência de MN. Espera-se
que esses resultados possam contribuir para a compreensão dos mecanismos de ação
do herbicida e seus metabólitos, subsidiando a elaboração de regulamentações que
promovam o uso seguro do Diuron.
Palavras-chave: Diuron e seus metabólitos. Zebrafish. Mitotoxicidade.
Mutagenicidade. Genotoxicidade.
9
ABSTRACT
The application of pesticides in agriculture has been associated with
environmental contamination and risks to human health. In this context, the
herbicide Diuron (3-(3,4-Dichlorophenyl)-1,1-dimethylurea) is the fifth most
widely used herbicide in Brazil and has raised concerns due to its persistence in
water and soil, as well as its degradation into potentially toxic metabolites, such as
3-(3,4-dichlorophenyl)-1-methylurea (DCPMU) and 3,4-dichloroaniline (DCA).
The toxicological assessment using the model organism Zebrafish (Danio rerio) is
relevant because of the similarity and conservation of xenobiotic metabolism and
genetic material, being approximately 70% similar to that of humans. The objective
of this study was to analyze changes in mitochondrial function and the potential
mutagenic and genotoxic effects of Diuron, DCA, and DCPMU in Zebrafish at
environmentally relevant concentrations (0.5-100 µmol/L). The Mitochondrial
Oxygen Consumption Rate (OCR) assay in embryos (24 hpf) using High-
Resolution Respirometry allowed the understanding of in vivo mitochondrial
toxicity. On the other hand, the genotoxic potential was evaluated in the embryo-
larval stage (96 hpf) through the Comet Assay, while the determination of
mutagenicity in adult fish was performed using the Micronucleus Test (MN) and
the assessment of Nuclear Abnormalities (NA) in erythrocytes. The results
demonstrated that immediate exposure to the compounds did not cause alterations
in OCR. Diuron caused primary DNA damage at all tested concentrations and AN
from 10.0 µmol/L. DCA showed genotoxicity (0.5-5.0 µmol/L) and caused nuclear
pleomorphism (AN) (5.0-10.0 µmol/L). DCPMU caused DNA damage at all tested
concentrations and AN at 1.0-10.0 µmol/L. This study revealed that the compounds
are genotoxic but not mutagenic under acute exposures, as there was no increase in
the frequency of MN. It is expected that these results may contribute to
understanding the mechanisms of action of the herbicide and its metabolites,
providing support for the development of regulations that promote the safe use of
Diuron.
Keywords: Diuron and its metabolites. Zebrafish. Mitotoxicity. Mutagenicity.
Genotoxicity.
10
LISTA DE FIGURAS
Capítulo 1 - Revisão da Literatura
Figura 1 – Estrutura química do Diuron. .............................................................. 17
Figura 2 – Estrutura química do DCA e DCPMU ................................................ 21
Figura 3 – Fases do desenvolvimento do Zebrafish (Danio rerio). ..................... 29
Figura 4 – Os modelos e suas vantagens. ............................................................. 31
Figura 5 – Vantagens do Zebrafish aplicado à toxicologia .................................. 33
Figura 6 – Micrografia eletrônica da mitocôndria e suas estruturas. ................... 35
Figura 7 – Cadeia transportadora de elétrons. ...................................................... 36
Figura 8 – Concentração de O2 e fluxo de O2 em células vivas com um curto
protocolo de controle de acoplamento com FCCP. ............................................... 39
Figura 9 – Mecanismos diretos e indiretos de genotoxicidade em Zebrafish. ..... 41
Figura 10 – Ensaio do cometa- Imagem da cauda do cometa e parâmetros de
análise. ................................................................................................................... 43
Figura 11 – Formação de micronúcleos (MN) e outras anomalias nucleares (AN)
em Zebrafish. ......................................................................................................... 45
Figura 12 – Anomalias nucleares (AN) em Zebrafish induzidas por poluentes
tradicionais e emergentes....................................................................................... 47
Capítulo 2 – Manuscrito
Figura 1 – Endpoints toxicológicos, ensaios utilizados e aplicação do Zebrafish. O
esquema resume a importância de cada endpoints, o ensaio escolhido para análise e
a fase do Zebrafish a ser aplicada e suas vantagens. ............................................. 71
Figura 2 - Gráficos representativos da taxa de consumo de oxigênio (OCR) para as
respirações mitocondriais a partir da adição de moduladores mitocondriais em
11
análises de embriões de Zebrafish (24 hpf) expostos à diferentes concentrações de
Diuron, DCA e DCPMU. ...................................................................................... 81
Figura 3 - Gráfico representativo da intensidade da cauda do cometa (%) em
análises de pool de células de larvas expostas (96 hpf) à diferentes concentrações
de Diuron, DCA e DCPMU. .................................................................................. 84
Figura 4 – Microfotografias representativas dos graus de danos ao DNA observados
em pool de larvas expostas por 96 hpf ao Diuron, DCA e DCPMU. .................... 85
Figura 5 – Gráfico representativo da frequência de micronúcleos obtidas em
eritrócitos de Zebrafish adultos expostos em sistema semi-estático à Diuron, DCA
e DCPMU por 96 horas. ........................................................................................ 88
Figura 6 – Gráfico representativo do total de anormalidades nucleares obtidas em
eritrócitos de Zebrafish adultos expostos em sistema semi-estático à Diuron, DCA
e DCPMU por 96 horas. ........................................................................................ 93
12
LISTA DE TABELAS
Capítulo 1 - Revisão da Literatura
Tabela 1– Concentração máxima permitida de Diuron na água potável de acordo
com diferentes legislações. .................................................................................... 18
Tabela 2– Levantamento bibliográfico de estudos com detecção do herbicida
Diuron em corpos d’água. ..................................................................................... 19
Tabela 3– Levantamento bibliográfico da toxicidade do Diuron, DCA e DCPMU
............................................................................................................................... 25
Capítulo 2 – Manuscrito
Tabela 1 - Mortalidade para Diuron, DCA e DCPMU em exposição semi-estática
de Zebrafish adultos nos tempos de exposição até 96 horas. .............................. 800
Tabela 2 – Tabela de resultados das Anormalidades Nucleares (AN) em análises de
eritrócitos de Zebrafish adulto expostos à diferentes concentrações de Diuron, DCA
e DCPMU. ........................................................................................................... 900
96
4. CONSIDERAÇÕES FINAIS
O presente estudo evidenciou a genotoxicidade do herbicida Diuron e seus
metabólitos (DCA e DCPMU), manifestando-se por danos ao DNA em larvas
de Zebrafish (96 h) e AN nos eritrócitos de adultos. Ademais, observou-se que
os metabólitos apresentaram maior toxicidade em comparação com a
molécula parental, especialmente em Zebrafish adultos (Mortalidade – DCPMU
> DCA > Diuron). Embora não tenham sido identificadas disfunções
mitocondriais imediatas, os resultados sugerem uma tendência de ação
desacopladora dessas substâncias, o que instiga a investigação da possível
relação entre exposição prolongada e disfunção mitocondrial.
Os achados deste estudo contradizem a classificação do Diuron como não
genotóxico realizada por agências reguladoras EFSA e US EPA, porém corrobora
com outros estudos e destaca a importância de análises com organismo-alvo e não-
alvo para compor o peso da prova em vistas da saúde ambiental e humana. Além
disso, contribuem para o avanço do conhecimento ao empregar embriões
de Zebrafish em análises de disfunções mitocondriais com o respirômetro de
alta resolução (Oroboros O2k).
Em termos práticos, os resultados ressaltam a importância da avaliação
toxicológica dos metabólitos de praguicidas, levando em consideração
sua persistência no meio ambiente. Adicionalmente, essas descobertas são
relevantes no âmbito regulatório e podem contribuir para a reavaliação e
regulamentação do Diuron pelas agências competentes. Por fim, este estudo
enfatiza a crescente relevância do Zebrafish como organismo-modelo na área da
toxicologia ambiental.
97
Espera-se que esta pesquisa contribua para a compreensão dos possíveis
efeitos adversos e dos mecanismos de ação do Diuron e seus metabólitos,
fornecendo informações importantes para a subsidiar a proposição do uso seguro do
herbicida Diuron.
99
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