UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA ACURÁCIA DIAGNÓSTICA DE MEIO CROMOGÊNICO PARA DETECÇÃO DE INFECÇÃO INTRAMAMÁRIA CAUSADA POR STREPTOCOCCUS AGALACTIAE LÁRA CRISTINA BASTOS JULIANO Botucatu – SP Dezembro, 2022 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA ACURÁCIA DIAGNÓSTICA DE MEIO CROMOGÊNICO PARA DETECÇÃO DE INFECÇÃO INTRAMAMÁRIA CAUSADA POR STREPTOCOCCUS AGALACTIAE LÁRA CRISTINA BASTOS JULIANO Dissertação apresentada junto ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária para obtenção do título de Mestre Orientador: Prof. Ass. Dr. José Carlos de Figueiredo Pantoja i ii Nome do Autor: Lára Cristina Bastos Juliano Título: ACURÁCIA DIAGNÓSTICA DE MEIO CROMOGÊNICO PARA DETECÇÃO DE INFECÇÃO INTRAMAMÁRIA CAUSADA POR STREPTOCOCCUS AGALACTIAE COMISSÃO EXAMINADORA Prof. Ass. Dr. José Carlos de Figueiredo Pantoja Presidente e Orientador Departamento de Produção Animal e Medicina Veterinária Preventiva FMVZ – UNESP – Botucatu Prof. Titular Márcio Garcia Ribeiro Membro Departamento de Produção Animal e Medicina Veterinária Preventiva FMVZ – UNESP – Botucatu Profa. Dra. Marcella Zampoli de Assis Membro Laboratório de Microbiologia Veterinária Instituto Federal Catarinense - Concórdia 20 de dezembro de 2022 iii DEDICATÓRIA Dedico esta dissertação à minha mãe Ana Cristina, por me dar forças para continuar seguindo os meus sonhos. iv AGRADECIMENTOS Agradeço primeiramente aos meus pais Ana Cristina e Evandro, por todo apoio, incentivo e por sempre acreditarem em mim. Ao meu irmão, Evandro Filho, por acrescentar tanto amor e luz ao meu caminho desde os seus primeiros passos. Às minhas avós, por todo amor, cuidado, proteção e ensinamentos. Aos meus “pais” Dirce e Ricardo e Maria Cristina e Ruy, por todo amor, carinho e por sempre estarem ao meu lado. Às minhas amigas Bárbara e Thaline, por trazerem para a minha vida momentos incríveis, cheios de amor e apoio e por me mostrarem a força de uma amizade verdadeira. À Jéssica e ao Artur, por sempre terem acreditado no meu potencial e por terem deixado marcas profundas de amor e força na minha vida. A todos os meus amigos de Guaxupé, Poços de Caldas e meus amigos e colegas pós-graduandos, por todo apoio, ajuda e carinho. À toda família da inspeção veterinária, pelo acolhimento e zelo desde o primeiro dia em que cheguei. Agradeço ao meu orientador José Carlos de Figueiredo Pantoja, pela oportunidade, pelos ensinamentos profissionais e pessoais, por acreditar no meu potencial e, junto de sua esposa Alessandra, terem se tornado pessoas extremamente especiais em minha vida. À Ana Lúcia e Fausto por me receberem com carinho e zelo em sua residência durante a realização das atividades práticas do meu projeto de mestrado. À professora Miriam da Universidade Vale do Rio Verde (UNINCOR) pela concessão do uso do Laboratório de Microbiologia para realização das análises e por toda ajuda durante o processo. À instituição FMVZ-UNESP Botucatu pela oportunidade de crescimento profissional e à CAPES pela concessão da bolsa que possibilitou meus estudos e desenvolvimento do meu projeto de mestrado. v LISTA DE TABELAS Capítulo 2 Tabela 1. Diagnóstico microbiológico pelo método referência, Espectrometria de Massas de Tempo de Voo de Ionização por Dessorção a Laser Assistida por Matriz (MALDI- TOF MS) dos 100 isolados diagnosticados fenotipicamente como cocos catalase- negativa............................................................................................................................45 Tabela 2. Tabulação cruzada dos resultados do teste índice (meio cromogênico) e o método referência (Espectrometria de Massas de Tempo de Voo de Ionização por Dessorção a Laser Assistida por Matriz - MALDI-TOF MS) por ponto de corte e tipo de amostra (amostra de leite de quarto e composta) .........................................................................................................................................46 Tabela 3. Acurácia diagnóstica do teste de índice (meio cromogênico) para detecção de infecção intramamária por Streptococcus agalactiae por ponto de corte e tipo de amostra (amostra de leite de quarto e composta). O método referência foi a Espectrometria de Massas de Tempo de Voo de Ionização por Dessorção a Laser Assistida por Matriz (MALDI-TOF MS) .........................................................................................................47 Tabela 4. Prevalência e parâmetros de acurácia diagnóstica do meio cromogênico (teste índice) por fazenda para detecção de infecção intramamária causada por Streptococcus agalactiae em amostras de leite de quarto .........................................................................................................................................48 vi Tabela 5. Associação entre as cores das colônias observadas no meio cromogênico (teste índice) e os resultados da Espectrometria de Massas de Tempo de Voo de Ionização por Dessorção a Laser Assistida por Matriz (MALDI-TOF MS – método referência) em amostras de leite de quarto e compostas........................................................................................................................49 Tabela 6. Mudança nas cores das colônias entre as leituras de 24 e 48 horas após cultura do leite no teste índice (meio cromogênico) .........................................................................................................................................50 vii LISTA DE FIGURAS Capítulo 2 Figura 1. Cores das colônias consideradas para definir os pontos de corte utilizados para definir infecção intramamária causada por Streptococcus agalactiae. A: rosa; B: lilás; C: roxo e D: azul. Ponto de corte 1: isolamento de ≥1 colônia rosa na placa (instrução do fabricante); Ponto de corte 2: isolamento de ≥1 colônias nas cores rosa ou lilás na placa; Ponto de corte 3: isolamento de ≥1 colônias nas cores rosa, lilás ou roxo na placa. Colônias azuis foram consideradas negativas para S. agalactiae e positivas para Streptococcus uberis, Lactococcus spp. ou Enterococcus spp. …………………………51 Figura 2. Completude do conjunto de dados usado para avaliar a acurácia diagnóstica do meio cromogênico para detecção de infecção intramamária causada por Streptococcus agalactiae. O método referência utilizado foi Espectrometria de Massas de Tempo de Voo de Ionização por Dessorção a Laser Assistida por Matriz (MALDI-TOF MS) ... .........................................................................................................................................52 viii LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS 16S rRNA = RNA ribossomal 16S Bca = Aminoácido de cadeia ramificada CAMP = Christie, Atkins, Munch-Petersen CCS = Contagem de células somáticas CMT = Californian Mastitis Test CspA = Serina protease Ct = Cycle Threshold DNA = Ácido desoxirribonucleico ES = Especificidade FbsA = Proteína de ligação ao fibrinogênio A FbsB = Proteína de ligação ao fibrinogênio B FN = Falso-negativo FP = Falso-positivo GP = “Gram-positive” IIM = Infecção intramamária IM = Intramuscular IMM = Intramamário Lmb = Proteína de ligação a laminina MALDI-TOF MS = Espectrometria de Massas de Tempo de Voo de Ionização por Dessorção a Laser Assistida por Matriz MC = Mastite clínica MSC = Mastite subclínica PCR = Reação em cadeia da polimerase PC1 = Ponto de corte 1 PC2 = Ponto de corte 2 PC3 = Ponto de corte 3 qPCR = Reação em cadeia da polimerase em tempo real SE = Sensibilidade UFC = Unidade formadora de colônia VPN = Valor preditivo negativo VPP = Valor preditivo positivo ix α = Alfa β = Beta γ = Gama x SUMÁRIO CAPÍTULO 1 .................................................................................................................. 13 1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 13 2. REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................... 14 CAPÍTULO 2 – Trabalho científico ............................................................................... 25 ABSTRACT ................................................................................................................ 27 CAPÍTULO 3 .................................................................................................................. 54 DISCUSSÃO GERAL ................................................................................................ 54 CONCLUSÃO GERAL .............................................................................................. 56 REFERÊNCIAS .............................................................................................................. 57 ANEXO I – Normas de publicação da revista Preventive Veterinary Medicine ............ 65 xi JULIANO, L. C. B. Acurácia diagnóstica de meio cromogênico para detecção de infecção intramamária causada por Streptococcus agalactiae. Botucatu, 2022. 67p. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista. RESUMO O objetivo do presente estudo foi avaliar a acurácia de um meio cromogênico experimental (OnFarm, Piracicaba, SP, Brasil) para a detecção de infecção intramamária (IIM) causada por Streptococcus agalactiae utilizando amostras de leite de quarto e compostas. Quatro rebanhos em MG foram visitados uma única vez para colher amostras de leite de quartos mamários de todas as vacas em lactação (N = 117). Amostras de quarto e compostas (produzidas no laboratório) foram cultivadas no meio cromogênico. Simultaneamente, as amostras de quarto foram semeadas em ágar sangue e os isolados cocos catalase-negativa foram enviados para identificação por Espectrometria de Massas de Tempo de Voo de Ionização/dessorção a laser assistida por matriz (MALDI-TOF MS). Foram utilizados três pontos de corte para estimar os parâmetros de acurácia diagnóstica do meio cromogênico: PC1) isolamento de ≥ 1 colônia rosa, PC2) ≥ 1 colônia rosa ou lilás e PC3) ≥ 1 colônia rosa, lilás ou roxa. Considerando os três pontos de corte estudados, a acurácia diagnóstica utilizando amostras de quarto foi: sensibilidade (SE): 44,35-95,08%; especificidade (ES): 97,81-96,30%; valor preditivo positivo (VPP): 80,68-83,60% e valor preditivo negativo (VPN): 87,62-98,87%. Para as amostras compostas, a acurácia foi: SE: 54,05-89,19%; VPP: 90,90-94,29%; VPN: 82,11-95,12%. A ES (97,50%) se manteve a mesma nos três pontos de corte. O ponto de corte indicado pelo fabricante (PC1) resultou em baixa SE e alta proporção de resultados falso-negativos (FN). No entanto houve melhora da acurácia quando PC2 e PC3 foram utilizados. Palavras-chave: mastite contagiosa, placa cromogênica, cultura na fazenda, estreptococos, epidemiologia. xii JULIANO, L. C. B. Diagnostic accuracy of chromogenic medium for detection of intramammary infection caused by Streptococcus agalactiae. Botucatu, 2022. 67p. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista. ABSTRACT The objective was to evaluate the accuracy of an experimental chromogenic medium (OnFarm, Piracicaba, SP, Brazil) for the detection of intramammary infection (IMI) caused by Streptococcus agalactiae using quarter and composite milk samples. Four herds in MG were visited once to collect milk samples from the mammary quarters of all lactating cows (N = 117). Quarter and composite samples (produced in the laboratory) were plated on the chromogenic medium. Simultaneously, quarter samples were plated on blood agar and the catalase-negative cocci isolates were subjected for identification by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS). Three thresholds were used to estimate the diagnostic accuracy parameters of the chromogenic medium: T1) growth of ≥ 1 pink colony, T2) ≥ 1 pink or lilac colony, and T3) ≥ 1 pink, lilac, or purple colony. Considering the three thresholds studied, the diagnostic accuracy using quarter samples was: sensitivity (SE): 44.35- 95.08%; specificity (SP): 97.81-96.30%; positive predictive value (PPV): 80.68-83.60% and negative predictive value (NPV): 87.62-98.87%. For composite samples, the accuracy was: SE: 54.05-89.19%; PPV: 90.90-94.29%; NPV: 82.11-95.12%. The SP (97.50%) remained the same at the three thresholds. The threshold indicated by the manufacturer (T1) resulted in a low SE and a high proportion of false-negative (FN) results. However, there was an improvement in accuracy when T2 and T3 were used. Keywords: contagious mastitis, chromogenic plate, on farm culture, streptococci, epidemiology. 13 CAPÍTULO 1 1 2 1. INTRODUÇÃO 3 Streptococcus agalactiae é um patógeno contagioso da mastite que ainda é 4 prevalente em muitas regiões leiteiras do mundo. Estudos regionais relataram prevalência 5 em nível de rebanho variando de 6,8% na Itália (TAMBA et al., 2022), 29% na Alemanha 6 (TENHAGEN et al., 2006), 33,3% na Noruega (JØRGENSEN et al., 2016), 47% na 7 Colômbia (COBO-ÁNGEL et al., 2018) e 40%-60% no Brasil (BRITO et al., 1999; 8 ELIAS et al., 2012). 9 Os quartos mamários infectados subclinicamente com S. agalactiae produzem leite 10 com alta contagem de células somáticas (CCS) (857 x 103 células/mL; DJABRI et al., 11 2002) e podem disseminar 107 bactérias/mL (GUTERBOCK; BLACKMER, 1984), 12 negativamente impactando a qualidade do leite e produtos lácteos (MA et al., 2000). 13 Vacas infectadas também apresentam diminuição da produção de leite (1,24 kg/vaca/dia 14 dentro de três meses após o diagnóstico), em comparação com vacas saudáveis 15 (HOLMØY et al., 2019). 16 Embora S. agalactiae possa se espalhar rapidamente dentro do rebanho, um 17 programa eficiente de diagnóstico e tratamento permite a erradicação do patógeno, 18 quando são adotadas práticas de manejo, como higiene adequada na ordenha e remoção 19 de vacas infectadas cronicamente (MAHMMOD et al., 2015). A blitz terapia consiste na 20 identificação e tratamento simultâneo de todas as vacas infectadas por S. agalactiae no 21 rebanho, até que a erradicação seja alcançada. 22 Nos programas de blitz terapia, a cultura do leite em ágar sangue tem sido o método 23 de referência para diagnosticar a infecção intramamária (IIM) causada por S. agalactiae 24 para triagem do rebanho e avaliação da cura bacteriológica pós-tratamento. A 25 sensibilidade (SE) e a especificidade (ES) de uma única cultura foram relatadas como 26 95,6% e 99,5% para amostras de leite compostas (ROSSI et al., 2018) e 98,8% e 100% 27 para amostras de leite de quarto (DINSMORE et al., 1991), respectivamente. No entanto, 28 a cultura tradicional requer profissionais qualificados, o envio das amostras para o 29 laboratório (2-3 dias) e 2-3 dias adicionais até o diagnóstico final (HOGAN et al., 1999; 30 RUEGG, 2003). 31 Como alternativa para agilizar e simplificar o processo diagnóstico, a cultura de 32 leite na própria fazenda com meios cromogênicos tem sido cada vez mais utilizada em 33 todo o mundo. Sensibilidade e ES de 89,1% e 96,3% foram relatadas para detecção de 34 14 Streptococcus spp. com o uso de meio cromogênico na fazenda, embora a diferenciação 35 de S. agalactiae de outros estreptococos não tenha sido possível (GARCIA et al., 2021). 36 O desenvolvimento de novos meios que possam identificar S. agalactiae com alta SE (≥ 37 90%) e baixo percentual de resultados falso-negativos (FN) são cruciais para uma 38 erradicação mais eficiente do patógeno de rebanhos leiteiros (LAGO et al., 2011). 39 Assim, os objetivos do presente estudo foram: 1) Avaliar a acurácia diagnóstica de 40 um meio cromogênico experimental para detecção de IIM causada por S. agalactiae 41 usando amostras de leite de quarto e compostas, e 2) Avaliar a concordância entre 42 observadores para interpretar os resultados da cultura. 43 44 2. REVISÃO DE LITERATURA 45 46 2.1. Mastite por Streptococcus agalactiae 47 48 2.1.1. Etiologia 49 Streptococcus agalactiae é um estreptococo do grupo B de Lancefield 50 caracterizado como patógeno contagioso da mastite (FALLON, 1974), capaz de colonizar 51 a pele do teto e invadir a glândula mamária de forma ascendente. A capacidade de viver 52 na superfície epitelial dos tecidos da cisterna e dos ductos permite que S. agalactiae cause 53 danos celulares através da produção de ácido lático e consequente inflamação 54 (EDMONDSON, 1989; NMC, 2015). 55 Na glândula mamária, S. agalactiae possui capacidade de formar biofilme e causa 56 primariamente MSC. Há 10 sorotipos conhecidos (Ia, Ib, II, III, IV, V, VI, VII, VIII e IX) 57 com patogenicidade variável. O patógeno é relevante para humanos, uma vez que é capaz 58 de causar meningite em neonatos. Ademais, as cepas ST-23 e ST-61 isoladas de humanos 59 pertencentes aos sorotipos Ia e II têm sido relacionadas geneticamente às cepas ST-23 e 60 ST-17 de bovinos (PANG et al., 2017; KABELITZ et al., 2021). 61 Streptococcus agalactiae possui dois fatores de virulência denominados Bca e 62 Lmb, que possibilitam a invasão nas células do hospedeiro. Para que a evasão imune 63 ocorra, há produção de proteínas como FbsA e FbsB envolvidas na ligação do 64 fibrinogênio que, consequentemente, diminui o risco de opsonização pelas células 65 fagocíticas. Além disso, a síntese de CspA por S. agalactiae induz a clivagem com 66 quimiocinas responsáveis pelo recrutamento de neutrófilos (KABELITZ et al., 2021). 67 15 2.1.2. Epidemiologia 68 Considerando que S. agalactiae ainda é prevalente no Brasil e em outras regiões 69 do mundo, estudos epidemiológicos são importantes para o diagnóstico situacional e 70 implementação de programas de erradicação do patógeno (RUEGG, 2017). 71 No Brasil, Brito et al. (1999) reportaram no estado de Minas Gerais prevalência 72 de S. agalactiae de 60% (29/48) em nível de rebanho, dentre os quais, 24 possuíam, em 73 média, 2,7% de quartos infectados. No mesmo estado, Elias et al. (2012) reportaram 74 prevalência de 39,7% (98/247) deste patógeno em amostras de leite de tanques de 75 refrigeração no mesmo estado. Rossi et al. (2018) descreveram, em um estudo realizado 76 em sete fazendas nos estados de Minas Gerais e São Paulo, valores de prevalência de S. 77 agalactiae de 13% (184/1164) e 25,6% (83/291) em nível de quarto e vaca, 78 respectivamente. Recentemente, Dalanezi et al. (2020) desenvolveram estudo no estado 79 de São Paulo em cinco rebanhos com CCS do leite do tanque < 400 x 103 células/mL e 80 observaram no grupo de vacas diagnosticadas com patógenos primários, prevalência de 81 S. agalactiae de 25,5% (94/369). 82 Assim como no Brasil, a ocorrência e as características das mastites causadas por 83 S. agalactiae vêm sendo reportadas em outros países. Em estudo recente realizado por 84 Tamba et al. (2022) na região de Emilia-Romagna, Itália, investigou-se a eficiência de 85 um programa de controle de S. agalactiae em uma população de 2.831 rebanhos, dos 86 quais 6,8% eram positivos para o patógeno. O número básico de reprodução (R0 = 1,4) 87 reportado indicava uma dispersão ativa deste patógeno nos rebanhos, representando 88 quantos animais saudáveis um animal positivo é capaz de infectar dentro dos rebanhos. 89 Cobo-Ángel et al. (2018) realizaram estudo longitudinal na Colômbia incluindo 90 152 rebanhos, dos quais, S. agalactiae foi isolado de 47% (72/152). Subsequentemente, 91 os mesmos autores conduziram estudo transversal em 25 rebanhos selecionados do estudo 92 longitudinal, onde foram colhidas amostras compostas de leite de todas as vacas, amostras 93 de swabs retais e amostras ambientais (paredes, comedouros e cocho de água). Dentre 94 todas as amostras colhidas, a prevalência de S. agalactiae foi de 13% (207/1712) nas 95 amostras de leite, 2% (32/1545) nas amostras de swabs retais e 2% (3/181) nas amostras 96 ambientais (COBO-ÁNGEL et al., 2018). 97 Na Alemanha, em estudo com 80 rebanhos de CCS média no leite do tanque de 98 372 x 103 células/mL, foram colhidas amostras de animais clinicamente saudáveis e em 99 diferentes estágios de lactação. Os autores encontraram prevalência de 0,7% (70/9910) 100 de S. agalactiae em amostras de leite de quarto mamário. Além disso, a prevalência em 101 16 nível de quarto foi maior em vacas mais velhas (paridade ≥ 2), das quais 1,1% (27/2474) 102 e 0,9% (22/2475) em começo e final de lactação, respectivamente (TENHAGEN et al., 103 2006). 104 Demil et al. (2022), em estudo transversal desenvolvido na Etiópia com 419 105 quartos mamários positivos ao California Mastitis Test (CMT) de 81 rebanhos, a 106 prevalência de S. agalactiae foi de 9,3%. Na Espanha, Azevedo et al. (2016) colheram 107 amostras de tanque de refrigeração de 92 rebanhos com histórico de alta CCS individual 108 dos animais. Dentre as amostras de leite de tanque, a prevalência de S. agalactiae foi de 109 32,6%. 110 Em estudo conduzido por Bi et al. (2016) na China, foram colhidas amostras de 111 leite do tanque de refrigeração de 894 rebanhos, das quais S. agalactiae foi isolado de 112 92,2%. No subconjunto de 583 rebanhos que possuíam dados de CCS do leite do tanque, 113 S. agalactiae estava presente em 97,9% dos rebanhos e a média geométrica da CCS foi 114 650 x 103 células/mL. Os autores observaram práticas de manejo que poderiam contribuir 115 com a alta prevalência reportada, tais como a mistura de vacas sadias e infectadas na 116 ordenha e movimentação de animais entre as propriedades. 117 Leelahapongsathon et al. (2016) estudaram surtos de mastite por S. agalactiae 118 em dois rebanhos na Tailândia e estimaram parâmetros epidemiológicos até então nunca 119 reportados. A prevalência de IIM por S. agalactiae no início do estudo era de 63% (N = 120 16) e 36% (N = 63) em nível de vaca e quarto, respectivamente. Por meio de amostragem 121 longitudinal, os autores observaram duração média das IIM de 270,84 dias. O R0 (1,86 122 animal/rebanho) e a taxa de transmissão (β = 0,0068 quarto/dia) reportados indicavam a 123 dispersão deste patógeno no rebanho, representando quantos animais saudáveis um 124 animal positivo pôde infectar e quantos quartos foram infectados por dia a partir de um 125 indivíduo infectado, respectivamente. A taxa de cura espontânea entre os nove momentos 126 de amostragem variou entre 0 e 14,3%, sugerindo a necessidade de tratamento com 127 antimicrobianos. A taxa de incidência (0,09) de IIM demonstrou que, na presença de 128 vacas infectadas, 9% dos quartos saudáveis desenvolveram uma nova infecção por S. 129 agalactiae dentro de 30 dias (ROSSI et al., 2018). Os autores associaram o surto de S. 130 agalactiae à má implementação de medidas de controle de mastite, tais quais o uso de 131 pano comum para limpar e secar os tetos, ausência de pós-dipping, ausência de tratamento 132 de vaca seca, não segregação de animais infectados e não remoção de animais crônicos 133 do rebanho. 134 17 Deng et al. (2021) desenvolveram na Holanda estudo longitudinal, no qual foram 135 colhidas 317 amostras de leite de quarto de 81 vacas em lactação que eram ordenhadas 136 em sistema automatizado. A duração média das infecções por S. agalactiae demonstrada 137 neste estudo foi de 86 dias. O valor reportado de β (0,007 quarto/dia) foi similar àquele 138 demonstrado por Leelahapongsathon et al. (2016), o que sugere que S. agalactiae 139 consegue se disseminar facilmente no rebanho, mesmo em sistemas de ordenha 140 automatizada. 141 Na Noruega, Jørgensen et al. (2016) conduziram estudo longitudinal em quatro 142 fazendas com histórico de S. agalactiae. Foram colhidas amostras de leite de tanque de 143 refrigeração, swabs retais e amostras ambientais, nas quais a prevalência do patógeno foi 144 de 33,3% (5/15), 5% (43/860) e 18,5% (87/470), respectivamente. Adicionalmente, os 145 mesmos autores conduziram estudo transversal em 37 fazendas, das quais 15 possuíam 146 histórico de S. agalactiae. Foram colhidas amostras ambientais de diferentes pontos da 147 sala de ordenha e a prevalência de S. agalactiae foi de 25,5% (51/200) (JØRGENSEN et 148 al., 2016). 149 Na Noruega (JØRGENSEN et al., 2016), assim como na Colômbia (COBO-150 ÁNGEL et al., 2018) foi demonstrado que S. agalactiae não é considerado patógeno IMM 151 obrigatório, pois este pode estar presente no trato gastrintestinal dos bovinos. Estes 152 resultados reforçam que a transmissão oro-fecal de S. agalactiae deve ser considerada em 153 rebanhos leiteiros. Dessa forma, são propostos dois ciclos de transmissão de S. agalactiae 154 a serem considerados para o manejo adequado: 1) ciclo contagioso entre os animais, via 155 ordenha, e 2) ciclo oro-fecal, via ambiente e água (JØRGENSEN et al., 2016). 156 No mesmo rebanho foram encontradas mais de um tipo de cepa (ST356, ST1 e 157 ST718), o que foi significantemente associado à frequente introdução de novos animais 158 (compra) (COBO-ÁNGEL et al., 2018). Na Noruega, no estudo mencionado previamente 159 (JØRGENSEN et al., 2016), as cepas ST1 e ST130 foram isoladas de swabs retais e 160 vaginais de vacas, e de swabs de garganta de bezerros e amostras ambientais, 161 respectivamente. 162 É importante salientar o potencial zoonótico de S. agalactiae, uma vez que Zadoks 163 et al. (2011) já haviam descrito similaridade de genes de virulência entre isolados obtidos 164 de humanos e animais. Ademais, a reemergência do patógeno em algumas fazendas pode 165 estar relacionada a vias de transmissão partindo de humanos para animais, como peixes 166 e bovinos (CRESTANI et al., 2021). Em humanos, o patógeno é capaz de colonizar os 167 sistemas gastrintestinal e genital feminino, e comprometer a gestação, causando 168 18 meningite em neonatos e nascimento de prematuros (SEALE et al., 2017). Em estudo 169 com isolados de S. agalactiae provenientes de amostras de leite de vacas com mastite, e 170 de swabs vaginais ou retais de mulheres grávidas, todos os isolados (N = 144) 171 demonstraram 58% de similaridade genética (MARTINEZ et al., 2000). 172 173 2.1.3. Impacto econômico 174 A ocorrência da mastite clínica (MC) e MSC no rebanho acarreta perdas 175 econômicas importantes, associadas principalmente à diminuição na produção leiteira e 176 ao descarte dos animais cronicamente infectados (HALASA et al., 2007; PAL; REGASA; 177 GIZAW, 2019). Hogeveen et al. (2011) estimaram a perda econômica anual devido à MC 178 variando entre €61 e €97, além de perdas adicionais devido à MSC de €13 em média por 179 vaca. 180 Contagem de células somáticas no leite do tanque > 1000 x 103 células/mL são 181 comuns em propriedades nas quais S. agalactiae está presente (KEEFE, 2012). Djabri et 182 al. (2002) reportaram, em uma meta-análise, média geométrica de CCS de quartos 183 infectados por S. agalactiae de 857 x 103 células/mL. 184 Tamba et al. (2022) observaram que houve adição de 77 x 103 células/mL na CCS 185 do tanque de refrigeração em rebanhos positivos para S. agalactiae, em relação a rebanhos 186 negativos para o patógeno, correspondendo a perda de leite de 0,4 Kg/vaca/dia. 187 Holmøy et al. (2019) constataram que vacas positivas para S. agalactiae 188 produziram 0,13 Kg e 1,24 Kg de leite/dia a menos do que vacas saudáveis no período 189 imediato e de dois a três meses após o diagnóstico, respectivamente. Neste mesmo estudo, 190 foram identificadas as cepas de S. agalactiae ST1 e ST103, que foram associadas a perdas 191 de 3,0 e 1,5 Kg de leite/vaca/dia, respectivamente. Em vacas infectadas pela cepa ST1, a 192 maior perda leiteira ocorreu entre o primeiro e segundo mês a partir do diagnóstico. Após 193 este período, os animais recuperaram moderadamente a produção. No entanto, nas vacas 194 infectadas pela cepa ST103, a diminuição na produção leiteira persistiu pelo período 195 restante da investigação. As cepas ST103 e ST1 foram associadas a valores de CCS de 196 330 x 103 células/mL e 371 x 103 células/mL, respectivamente. 197 198 199 200 201 202 19 2.2. Diagnóstico da mastite 203 204 2.2.1. Tipos de amostras 205 A maioria dos programas de controle de mastite incluem inicialmente análise 206 microbiológica de amostras de quarto ou amostras compostas para determinar qual é a 207 distribuição de patógenos presentes no rebanho. Para tanto, as amostras compostas são 208 utilizadas frequentemente com o intuito de reduzir os custos com laboratório e mão-de-209 obra (RUEGG, 2003). 210 Dinsmore et al. (1991) avaliaram parâmetros de acurácia de diferentes métodos 211 de amostragem e cultura do leite para detectar IIM por S. agalactiae. Para as amostras de 212 quarto, os valores de SE e ES variaram entre 97,7- 98,8% e 98,8-100%, respectivamente. 213 Enquanto nas amostras compostas, foram observados valores de SE e ES entre 95,3- 214 98,8% e 97,5-100%, respectivamente. 215 Com o intuito de aprimorar o isolamento de S. agalactiae, foi demonstrado que o 216 volume de leite (0,01 ou 0,05 mL) cultivado na placa não influenciou a SE da cultura 217 microbiológica (DINSMORE et al., 1991), pois S. agalactiae é um microrganismo que é 218 eliminado em alta concentração no leite (107 bactérias/mL), facilitando o isolamento na 219 meio de ágar sangue (GUTERBOCK; BLACKMER, 1984). 220 Rossi et al. (2018) avaliaram parâmetros de acurácia de amostras de leite 221 compostas utilizando amostras de quarto como método referência. Os valores de SE e ES 222 para detecção de S. agalactiae obtidos foram de 95,6% e 99,5%, respectivamente. 223 É interessante ressaltar que, mesmo que os valores de SE para amostras compostas 224 sejam usualmente menores do que de amostras de quarto, Rossi et al. (2018) obtiveram o 225 coeficiente de concordância Kappa de 0,90 entre os dois tipos de amostra. Este resultado 226 sugere que as amostras compostas podem ser adequadas para o diagnóstico de mastite 227 causada por S. agalactiae, reduzindo as despesas e mão-de-obra. 228 229 2.2.2. Métodos laboratoriais fenotípicos 230 O método de diagnóstico padrão de mastite é a cultura microbiológica utilizando 231 amostras de quarto ou compostas (RUEGG, 2003). A identificação fenotípica de S. 232 agalactiae se inicia pela observação em ágar sangue de colônias pequenas e translúcidas 233 com 24 horas de incubação, além da produção de hemólise nos padrões alfa (α), beta (β) 234 ou gama (γ). Streptococcus agalactiae são cocos gram-positivos, catalase-negativa, e 235 negativos à hidrólise de esculina e bile-esculina. O patógeno produz a reação de Christie, 236 20 Atkins, Munch-Petersen (CAMP) sinergicamente à β-hemolisina produzida por 237 Staphylococcus aureus, produzindo hemólise com aspecto de seta no ágar sangue 238 (DINSMORE et al., 1991; MARKEY et al., 2013). 239 240 2.2.3. Métodos moleculares 241 Outras formas de diagnosticar os patógenos da mastite são os métodos 242 moleculares, tais como a reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR) e o 243 MALDI-TOF MS (DUARTE; FREITAS; BEXIGA, 2015). 244 A técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR) consiste na amplificação de 245 um fragmento do DNA (ácido desoxirribonucleico) de uma bactéria viva, inibida ou 246 morta. A síntese de DNA de forma exponencial ocorre após a ligação de um primer às 247 extremidades da fita e ao final de 30 a 40 ciclos é gerado um produto da PCR que será 248 lido em eletroforese em gel. A qPCR possui a capacidade de detectar e quantificar os 249 produtos da técnica durante a amplificação do DNA, utilizando sondas fluorescentes, 250 tornando-a mais rápida (CAI et al., 2003). 251 Mahmmod (2013) utilizou análise de classe latente para estimar parâmetros de 252 acurácia entre as técnicas de qPCR PathoProof Mastitis™ (Thermo Scientific Finnzymes 253 Diagnostic Products and Services, Espoo, Finlândia) e cultura microbiológica. A SE e a 254 ES estimadas para detecção de S. agalactiae entre os pontos de corte ≤ 32 e ≤ 39 de cycle 255 threshold (Ct) foram de 73,9% a 96,2% e 97,22% a 96,8 % para o PathoProofTM e de 256 72,1% a 25,7% e 98,9% a 99,7% para a cultura microbiológica, respectivamente. 257 A técnica de MALDI-TOF MS vem sendo utilizada para diagnosticar os 258 patógenos da mastite e requer cultura prévia em ágar sangue do isolado a ser identificado. 259 Posteriormente, o isolado é fixado em uma placa onde será feita a extração das proteínas 260 e fixação em matriz orgânica, a qual sofre a incidência de um raio laser passando por 261 vaporização e ionização das biomoléculas. Estes íons se separam e a razão massa/carga é 262 medida com base no tempo de vôo pelo tubo de vácuo do equipamento, gerando um 263 gráfico de espectros dos isolados que é comparado aos espectros do banco de dados. Os 264 escores em log de 0 a 3 são calculados pelo equipamento, interpretados como: < 1,7: não 265 identificação, 1,7 ≥ x < 2,0: identificação em nível de gênero e ≥ 2: identificação em nível 266 de espécie (SINGHAL et al., 2015; NONNEMANN et al., 2019). 267 O método MALDI-TOF MS não é capaz de identificar amostras com mais de uma 268 espécie bacteriana e por isso é necessária a cultura prévia do isolado (DUARTE; 269 FREITAS; BEXIGA, 2015; NONNEMANN et al., 2019). Entretanto, Barreiro et al. 270 21 (2017) demonstraram que, em concentração ≥ 108 de unidades formadoras de colônia 271 (UFC)/mL no leite, S. agalactiae pode ser detectado diretamente da amostra. 272 273 2.2.4. Métodos diagnósticos utilizados na fazenda 274 Apesar de a cultura microbiológica ainda ser considerada um dos métodos de 275 referência para o diagnóstico da mastite, o tempo entre a colheita do leite na fazenda, 276 envio ao laboratório e término do exame laboratorial (48 – 72h) pode dificultar programas 277 de erradicação de S. agalactiae que dependem do diagnóstico rápido para o manejo dos 278 animais. Dessa forma, a cultura na fazenda em meios cromogênicos tem sido proposta 279 para diminuir o tempo de diagnóstico e manter níveis de acurácia não inferiores à cultura 280 microbiológica convencional, bem como nortear a tomada de decisões de tratamento, 281 favorecendo o uso racional de fármacos (LAGO et al., 2011; KABELITZ et al., 2021) 282 Os casos de MSC são desafiadores, pois não há alterações visíveis no leite. A 283 forma tradicional e efetiva de detecção dos casos de MSC é a partir de testes de CCS e 284 cultivo microbiológico (BENIĆ et al., 2018). A CCS do leite do tanque pode ser 285 considerada um dos pontos de referência na identificação primária de problemas com 286 mastite (RUEGG, 2003), uma vez que existem registros de CCS de tanque de expansão 287 > 700 x 103 células/mL em rebanhos acometidos por S. agalactiae 288 (ERSKINE;EBERHART, 1990). 289 O teste de CMT é um indicador qualitativo da CCS do leite e pode ser útil para 290 detecção de alta CCS em nível de vaca no momento da ordenha. Este teste é feito com a 291 utilização de reagente que causa a ruptura da membrana celular de qualquer célula 292 presente na amostra de leite, resultando em aumento da viscosidade da mistura leite-293 reagente (PAL;REGASA;GIZAW, 2019; KABELITZ et al., 2021). Rossi et al. (2018) 294 demonstraram parâmetros de acurácia para os diferentes pontos de corte do teste de CMT 295 (suspeito, 1, 2 e 3) em sete rebanhos. Os valores de SE e ES variaram entre 91,9% e 81,2% 296 e 82,7% e 94,7%, respectivamente, 297 Dois estudos realizados simultaneamente por Ganda et al. (2016) nos Estados 298 Unidos, tiveram o objetivo de identificar patógenos em amostras de leite de quartos com 299 MC por meio da cultura no meio cromogênico Accumast (FERA Animal Health LCC, 300 Ithaca, NY). No primeiro estudo, foi utilizada a cultura microbiológica do leite como 301 método referência para obtenção dos parâmetros de acurácia (SE, ES, valor preditivo 302 positivo [VPP] e valor preditivo negativo [VPN]) (N = 538) da placa cromogênica. No 303 segundo estudo, o sequenciamento 16S rRNA foi utilizado como referência para a 304 22 obtenção do VPP (N = 214). Os valores de acurácia obtidos no primeiro estudo para 305 detecção de Streptococcus spp. foram: SE = 90,0%, ES = 92,9%, VPP = 91,8% e VPN = 306 91,2%. O VPP obtido no segundo estudo em relação à detecção de Streptococcus spp. 307 pelo meio cromogênico foi de 95,0%, além do valor do coeficiente Kappa (0,89), que 308 sugere concordância quase perfeita (DOHOO et al., 2003) entre o meio e o 309 sequenciamento. 310 Os parâmetros de acurácia do meio cromogênico Gram-positive (GP) para 311 detecção de S. agalactiae/S. dysgalactiae (não é possível a diferenciação entre os 312 patógenos) em amostras de leite de casos de MSC foram: SE = 89,1%, ES = 96,3%, VPP 313 = 70,7% e VPN = 98,9%. Neste caso, o MALDI-TOF MS foi utilizado como método 314 referência e o coeficiente Kappa calculado (0,76) demonstrou concordância substancial 315 entre os métodos (GARCIA et al., 2021). 316 Como descrito nos estudos revisados, a SE de diferentes meios cromogênicos para 317 detecção de Streptococcus spp. e S. agalactiae varia entre 89,1% e 90,0%. Contudo, ao 318 considerar S. agalactiae e sua dinâmica no rebanho, valores de SE e ES acima de 90,0% 319 são essenciais, visto que a prioridade do programa de testagem é reduzir a proporção de 320 resultados FN. Vacas infectadas e não identificadas pela cultura atuam como reservatórios 321 do patógeno no rebanho (LAGO et al., 2011). Devido à disponibilidade comercial de 322 novos meios cromogênicos específicos para S. agalactiae, há necessidade de realização 323 de estudos para testar a acurácia diagnóstica de tais métodos em situações de campo e, 324 dessa forma, contribuir para melhoria da eficácia de programas de erradicação. 325 326 2.3. Tratamento 327 A abordagem utilizada para tratamento e erradicação de S. agalactiae é 328 denominada blitz terapia, que consiste na identificação e tratamento de todos os animais 329 positivos do rebanho (EDMONDSON, 2011). 330 A primeira etapa da blitz terapia é baseada na identificação dos animais positivos 331 para S. agalactiae por meio da cultura microbiológica do leite de amostras de quarto ou 332 compostas. Subsequentemente, estes animais devem ser separados dos animais saudáveis 333 e o tratamento deverá ser instituído com o antimicrobiano de escolha por dois a três dias 334 consecutivos, em intervalos de 12 a 24 horas (FARNSWORTH; STEWART; REID, 335 2003). Após 14 e 21 dias do primeiro tratamento, a cultura microbiológica do leite de 336 todos os animais do rebanho deverá ser repetida para posterior tratamento dos animais 337 23 remanescentes infectados, até que se obtenha a cura bacteriológica de todas as vacas 338 (FARNSWORTH; STEWART; REID, 2003). 339 Reyes et al. (2015), em estudo desenvolvido na Colômbia com 17 rebanhos, 340 investigaram as taxas de cura de dois antimicrobianos administrados por duas vias 341 diferentes como tratamento de S. agalactiae pela abordagem da blitz terapia. As 248 vacas 342 incluídas foram alocadas aleatoriamente em um grupo tratado com ampicilina e 343 cloxacilina, pela via IMM, e a outro grupo tratado com hidroiodeto de penetamato, pela 344 via intramuscular (IM); as taxas de cura obtidas foram de 82,4% e 65,8%, 345 respectivamente. 346 Em estudo clínico randomizado realizado em nove rebanhos no Brasil (Rossi et al., 347 2019) comparou-se a eficácia de três tratamentos a um grupo controle negativo em vacas 348 infectadas com S. agalactiae. As taxas de cura obtidas após 14 dias do tratamento em 349 cada grupo foram: cloxacilina e ampicilina IMM = 86,02%; cefquinoma IMM = 97,89%; 350 cefquinoma IM = 54,84% e grupo controle negativo = 25,00%. 351 Yamagata et al. (1987) avaliaram o custo da blitz terapia em rebanho de 627 vacas 352 em lactação na Califórnia. O tratamento foi instituído com penicilina e novobiocina IMM 353 em 99 animais e a taxa de cura obtida foi de 98%. O custo total por vaca tratada foi de 354 $77. Os autores reportaram benefícios de $396 e $237/vaca para animais tratados no 355 início e meio de lactação, respectivamente. Por outro lado, houve prejuízo de $55/vaca 356 para animais tratados no final de lactação. 357 Edmondson (1989) reportou benefício geral de £1109 atribuído a aplicação da 358 blitz terapia em um rebanho de 240 vacas em lactação, além de aumento na porcentagem 359 de gordura e menor perda na concentração de proteínas no leite. O antimicrobiano de 360 escolha foi a eritromicina aplicada via IMM. 361 Erskine e Eberhart (1990) instituíram a blitz terapia e utilizaram os 362 antimicrobianos novobiocina e penicilina G procaína como tratamento em vacas de 12 363 rebanhos na Pensilvânia, EUA. A eficácia observada foi de 92,6% (N = 305) para quartos 364 mamários e de 88,3% (N = 113) para as vacas. Além disso, os autores reportaram custo 365 médio de $30,87 por animal tratado. 366 367 2.4. Controle 368 Além do tratamento com antimicrobianos, os fatores de risco associados à 369 infecção por S. agalactiae devem ser cuidadosamente monitorados (FARNSWORTH; 370 STEWART; REID, 2003). Visto como base dos programas de erradicação de patógenos 371 24 contagiosos causadores de mastite, o “programa de cinco pontos” proposto em 1960 372 (NEAVE et al.,1969) propõe métodos essenciais no programa de erradicação de S. 373 agalactiae. Ações como a realização correta do pós-dipping, segregação de animais 374 infectados e cultura microbiológica do leite de todos os animais recém-introduzidos no 375 rebanho, ou que apresentem aumento de CCS, são essenciais para o bom desempenho da 376 blitz terapia (FARNSWORTH; STEWART; REID, 2003; EDMONDSON, 2011). A 377 secagem antecipada de animais infectados, acompanhada da terapia da vaca seca e o 378 monitoramento epidemiológico por meio da cultura do leite de animais recém paridos, 379 que apresentam mastite clínica e com alta CCS (> 200.000 células/mL), são relevantes 380 para confirmar a erradicação do patógeno do rebanho. 381 Mweu et al. (2012) associaram a reemergência de S. agalactiae entre os anos 2000 382 e 2009 na Dinamarca com o possível surgimento de uma nova e adaptada cepa do 383 patógeno, devido à negligência na implementação das medidas de controle da mastite. 384 Ademais, Churakov et al. (2021) relataram que a compra de animais esteve associada ao 385 risco de transmissão do patógeno, especialmente para cepas ST103. 386 25 CAPÍTULO 2 – Trabalho científico 1 2 Artigo a ser enviado para a revista Preventive Veterinary Medicine 3 (Normas de publicação – ANEXO I) 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 Diagnostic accuracy of chromogenic medium for detection of Streptococcus 26 agalactiae intramammary infection 27 28 Lára Cristina Bastos Julianoa, Fausto Ribeiro Fonsecaa, Miriam de Andrade Pereirab, 29 José Carlos de Figueiredo Pantojaa 30 aAnimal Production and Preventive Veterinary Medicine Department, College of 31 Veterinary Medicine and Animal Science, Sao Paulo State University (UNESP), 32 Botucatu, Sao Paulo, Brazil, 18618-681. 33 lara.bastos@unesp.br, fausto.fonseca@unesp.br, jose.pantoja@unesp.br. 34 bVale do Rio Verde University Center (UNINCOR), Três Corações, Minas Gerais, 35 Brazil, 37417-150. 36 map_vet@hotmail.com. 37 38 ¹Corresponding author: jose.pantoja@unesp.br 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 mailto:lara.bastos@unesp.br mailto:fausto.fonseca@unesp.br mailto:jose.pantoja@unesp.br mailto:map_vet@hotmail.com mailto:jose.pantoja@unesp.br 27 ABSTRACT 51 52 The objectives of this study were to evaluate the accuracy of a chromogenic medium 53 (OnFarm, Piracicaba, SP, Brazil) for detection of intramammary infection (IMI) caused 54 by Streptococcus agalactiae using quarter and composite milk samples and to calculate 55 the Kappa’s coefficient of concordance between readers (final diagnosis and color 56 reading). Four herds in MG were visited once to collect milk samples from mammary 57 quarters of all lactating cows (N = 117). Quarter and composite samples (produced in 58 the laboratory) were plated on the chromogenic medium. Simultaneously, quarter 59 samples were plated on blood agar and the catalase-negative cocci isolates were sent for 60 identification by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass 61 Spectrometry (MALDI-TOF MS). Three thresholds were used to estimate the diagnostic 62 accuracy parameters of the chromogenic medium: T1) growth of ≥ 1 pink colonies, T2) 63 ≥ 1 pink or lilac colonies, and T3) ≥ 1 pink, lilac, or purple colonies. The Kappa’s 64 coefficient for the final diagnosis (Kappa = 0.71) and for the color reading (Kappa = 65 0.88) were considered as a substantial and almost perfect agreement, respectively. The 66 diagnostic accuracy using quarter milk samples based on the three thresholds studied 67 was: T1) sensitivity (SE): 44.35%; specificity (SP): 97.81%; positive predictive value 68 (PPV): 80.68%, negative predictive value (NPV): 87.62%; T2) SE: 81.05%, SP: 69 96.73%, PPV: 83.69%, NPV: 94.62%; T3) SE: 95.08%, SP: 96.30, PPV: 83.60%, NPV: 70 98.87%. For composite samples, the accuracy was: T1) SE: 54.05%; PPV: 90.90%; 71 NPV: 82.11%; T2) SE: 75.68%, PPV: 93.33%, NPV: 89.65%; T3) SE: 89.19%, PPV: 72 94.29%, NPV: 95.12%. The SP (97.50%) remained the same at the three thresholds for 73 composite samples. The SE and SP varied among farms: T1) SE: 12.50% - 100.00%, 74 SP: 96.47% - 100.00%, T2) SE: 61.54% - 100.00%, SP: 93.55% - 98.99%, T3) SE: 75 28 86.67% - 100.00%, SP: 94.71% - 98.99%. The threshold indicated by the manufacturer 76 (T1) resulted in low SE and high proportion of false-negative (FN) results (quarter 77 samples = 55.65%; composite samples = 45.95%), which could increase the 78 dissemination of S. agalactiae within the herd. However, there was an improvement in 79 accuracy when T2 and T3 were used. 80 81 Keywords: contagious mastitis, chromogenic plates, streptococci, on-farm milk 82 culturing. 83 84 Abbreviations: CFU: Colonies forming units; CI: Confidence interval; FN: False-85 negative; FP: False-positive; IMI: Intramammary infection; MALDI-TOF MS: Matrix-86 Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry; NPV: 87 Negative predictive value; PPV: Positive predictive value; SCC: Somatic cell count; SE: 88 Sensitivity; SP: Specificity; T1: Threshold 1; T2: Threshold 2; T3: Threshold 3. 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 29 Introduction 101 Streptococcus agalactiae is a contagious mastitis pathogen that is still prevalent 102 in many dairy regions of the world. Regional studies have reported herd-level 103 prevalence ranging from 6.8% in Italy (Tamba et al., 2022), 29% in Germany 104 (Tenhagen et al., 2006), 33.3% in Norway (Jørgensen et al., 2016), 47% in Colombia 105 (Cobo-Ángel et al., 2018), to 40%-60% in Brazil (Brito et al., 1999; Elias et al., 2012). 106 Mammary quarters subclinically infected with S. agalactiae produce milk with 107 high somatic cell count (SCC) (857 x 103 cells/mL; Djabri et al., 2002), and can shed 108 107 bacteria/mL (Guterbock and Blackmer, 1984), negatively impacting the quality of 109 milk and dairy products (Ma et al., 2000). Infected cows also experience decreased milk 110 production (1.24 kg/cow/day within three months after diagnosis), as compared to 111 healthy cows (Holmøy et al., 2019). 112 Although S. agalactiae can spread quickly within the herd, an efficient diagnosis 113 and treatment program allows eradication of the pathogen, when supported by adoption 114 of management practices, such as proper milking hygiene and removal of chronically 115 infected cows (Mahmmod et al., 2015). Blitz therapy consists in identification and 116 simultaneous treatment of all S. agalactiae infected cows in the herd, until eradication is 117 achieved. 118 In Blitz therapy programs, milk culturing on blood agar has been the reference 119 method to diagnose S. agalactiae intramammary infection (IMI) for herd screening and 120 evaluation of post-treatment bacteriological cure. The sensitivity (SE) and specificity 121 (SP) of a single culture have been reported as 95.6% and 99.5% for composite milk 122 samples (Rossi et al., 2018), and 98.8% and 100% for quarter milk samples (Dinsmore 123 et al., 1991), respectively. However, traditional culturing requires skilled professionals, 124 30 shipping of samples to a laboratory (2-3 days), and additional 2-3 days until final 125 diagnosis (Hogan et al., 1999; Ruegg, 2003). 126 As an alternative to speed and simplify the diagnostic process, on-farm milk 127 culturing with chromogenic media has been increasingly used worldwide. Sensitivity 128 and SP of 89.1% and 96.3% have been reported for detection of Streptococcus spp. 129 using an on-farm chromogenic medium, although differentiation of S. agalactiae from 130 other streptococci was not possible (Garcia et al., 2021). Development of new media 131 that can identify S. agalactiae with high SE (≥ 90%) and low percentage of false-132 negative (FN) results are crucial for more efficient eradication of the pathogen from 133 dairy herds (Lago et al., 2011). 134 Thus, the objectives of this study were: 1) to evaluate the diagnostic accuracy of 135 an experimental chromogenic medium for detection of S. agalactiae IMI using quarter 136 and composite milk samples, and 2) to evaluate the agreement between observers to 137 interpret culture results. 138 139 Materials and methods 140 141 Study design 142 We conducted a cross-sectional study, designed and reported according to the 143 Standards for Reporting Diagnostic Accuracy Studies (STARD) (Cohen et al., 2016). 144 145 Participants and eligibility criteria 146 A convenience sample of four herds with a history of S. agalactiae, located in 147 Três Corações, Minas Gerais state, Brazil, was used for the study. Lactating cows were 148 31 eligible for enrollment if they were clinically healthy, had no teat lesions, and had not 149 received any antimicrobial treatment within 14 days prior to enrollment. 150 151 Sample collection 152 Each herd was visited once for sample collection, between August and 153 December 2021. After the milking technicians performed the pre-milking hygienic 154 procedures, the teat end was scrubbed with a cotton pad soaked with 70% alcohol, and 155 the three first milk streams were discarded. Then, quarter milk samples (15 mL) were 156 aseptically collected in sterile plastic vials. Milk samples were kept refrigerated in 157 coolers and transported within two hours to the Vale do Rio Verde University´s 158 laboratory, where they were processed within two hours of collection. 159 160 Test methods 161 Composite samples were produced in the laboratory by adding 1 mL of each 162 quarter milk sample into a sterile vial. Following the manufacturer´s instructions, the 163 plates containing the experimental chromogenic medium (OnFarm, Piracibaba, Brazil) 164 were divided into six equal areas, on which milk was spread with a sterile cotton swab. 165 Plates were incubated at 36°C and readings were performed at 24 and 48 h. The same 166 procedure was used to plate quarter and composite milk samples. 167 Simultaneously, quarter milk samples were plated on blood agar according to the 168 National Mastitis Council´s procedures (Hogan et al., 1999). Blood agar plates were 169 divided into four quadrants and milk was plated with a sterile swab. Plates were 170 incubated at 36°C for 48 h. 171 Quarter samples were considered positive for bacterial growth on blood agar 172 when there was growth of ≥ 3 similar colonies. A sample was considered contaminated 173 when there was growth of ≥ 3 colony types on the plate. All catalase-negative cocci 174 32 isolates were replated onto blood agar and incubated at 36°C for 24 h. Subsequently, 175 these isolates were transported by the authors to the QualiLeite laboratory (University 176 of São Paulo, Pirassununga, SP, Brazil) and subjected to MALDI-TOF MS (reference 177 test) (Barcelos et al., 2019) for further speciation. When catalase-negative cocci with 178 different hemolysis patterns were isolated from the same milk sample, both isolates 179 were subjected to MALDI-TOF MS. 180 For the chromogenic medium, a sample was considered positive for bacterial 181 growth when there was ≥ 1 similar colony on the plate. The diagnosis was performed at 182 24 h and, if there was questionable identification, the diagnosis was confirmed at 48 h. 183 The sample was considered contaminated when ≥ 3 colony types grew on the plate. 184 According to the manufacturer’s definition, a S. agalactiae positive sample was 185 considered when there was growth of ≥ 1 pink colony (Threshold 1 [T1]). Growth of 186 blue colonies was considered as Streptococcus uberis, Enterococcus spp. or 187 Lactococcus spp. 188 Because there was growth of colonies with other colors than pink and blue 189 (Figure 1), two additional thresholds were defined to improve SE and decrease the 190 percentage of FN results: growth of ≥ 1 pink or lilac colonies (Threshold 2 [T2]), and 191 growth of ≥ 1 pink, lilac, or purple colonies on the plate (Threshold 3 [T3]). 192 To evaluate the agreement between observers to diagnose S. agalactiae IMI (yes 193 or no), and to determine the colony´s color, two researchers (LCBJ and FRF) read the 194 plates independently and were both masked to MALDI-TOF MS results. 195 196 Statistical analysis 197 Initially, contingency tables (PROC FREQ; SAS Institute, Cary, NC, USA) were 198 constructed to calculate unadjusted accuracy parameters (SE, SP, positive predictive 199 33 value [PPV], negative predictive value [NPV]) and present the respective sample sizes. 200 The accuracy parameters (SE, SP, PPV, NPV) were estimated from logistic regression 201 models (PROC GENMOD; SAS Institute, Cary, NC, USA). The generalized estimating 202 equations method with a compound symmetry covariance structure was used to account 203 for the clustering of quarters within cows (Dohoo et al., 2003). 204 The Kappa coefficient was used to estimate the agreement between the two 205 observers for diagnosing S. agalactiae (yes or no, considering T1), and determining the 206 colony’s color (24 h). The analysis was performed at a significance level of 0.05. 207 208 Sample size calculation 209 The sample size was calculated to estimate the SE and SP of the chromogenic 210 medium, as compared to the reference method (MALDI-TOF MS) (Hajian-Tilaki, 211 2014). The following assumptions were made for the calculations: expected SE and SP 212 of the chromogenic medium = 0.90; margin of error = ± 0.07; and prevalence of S. 213 agalactiae infected quarters = 15%. Thus, 470 mammary quarters (118 cows) from 214 herds confirmed as positive for S. agalactiae were required for the study. 215 216 Results 217 218 Herd characteristics 219 The breeds of the 117 included cows were Holstein (63.25%), crossbred 220 (Holstein x Gir; 35.90%) and Jersey (0.85%). Cows were kept in semi-confinement (N 221 = 2), compost barn (N = 1), or pasture (N = 1) systems. Cows were milked in flat barns 222 (N = 3) and pit parlors (N = 1). Herds had a minimum of 15 and a maximum of 215 223 lactation cows. The herds’ total milk production ranged between 50 and 7,000 kg/day. 224 34 Bulk tank milk SCC and total bacteria count were available for three herds and ranged 225 from 500 x 103 to 920 x 103 cells/mL, and 24 x 103 to 90 x 103 cfu/mL, respectively. The 226 cows’ median parity, milk production, and days in milk were 3 lactations, 16 kg/day, 227 and 183 days, respectively. 228 229 Completeness of the dataset 230 The flow of missing data is presented in Figure 2. For the final analysis, there 231 were 461 quarter milk samples and 117 composite milk samples for the index test, and 232 445 quarter milk samples for the reference test (Figure 2). 233 234 Agreement between observers for reading culture results (chromogenic medium) 235 The agreement between observers was substantial for the final diagnosis of S. 236 agalactiae (yes or no) (Kappa = 0.71; 95% CI: 0.59 - 0.83), and almost perfect for 237 determining the colony colors (Kappa = 0.88; 95% CI: 0.84 - 0.93). 238 239 Distribution of MALDI-TOF MS (reference method) results 240 The quarter- and cow-level prevalence of S. agalactiae was 18.43% (82/445) 241 and 31.62% (37/117), respectively. Of the 100 isolates that were phenotypically 242 diagnosed as catalase-negative cocci from blood agar plates, 82 were confirmed as S. 243 agalactiae by MALDI-TOF MS (Table 1). Four samples couldn’t be identified because 244 there were not within the MALDI-TOF MS database. Catalase-negative cocci other than 245 S. agalactiae were: Streptococcus uberis (3/100), Streptococcus dysgalactiae (2/100), 246 and Lactococcus lactis (2/100) (Table 1). 247 248 249 35 Time interval between index test and reference standard 250 The final diagnostic for both the index (chromogenic medium) and the reference 251 standard (blood agar) was performed at 48 hs. 252 253 Test accuracy 254 The cross tabulations between the index and reference standard including the 255 sample size used to estimate the accuracy parameters studied are presented in Table 2. 256 The chromogenic medium´s accuracy parameters (SE, SP, PPV, PNV, false-positive 257 (FP), and FN) for quarter and composite samples are presented in Table 3. 258 The quarter-level apparent prevalence of S. agalactiae based on the three 259 thresholds studied were: T1 = 18.87% (87/461); T2 = 25.81% (119/461) and T3 = 260 29.72% (137/461). The cow-level (composite samples) apparent prevalence of S. 261 agalactiae based on the three thresholds studied were: T1 = 18.80% (22/117); T2 = 262 25.64% (30/117) and T3 = 29.91% (35/117). 263 264 Diagnostic accuracy of the chromogenic medium (index test) at the quarter level 265 Despite the high SP of 97.81%, adoption of T1 (manufacturer`s threshold) 266 resulted in low SE (44.35%) and high percentage of FN results (55.65%) (Table 3). 267 Based on T2, the SP was 96.73% and the SE increased to 81.05%, resulting in 18.95% 268 of FN results (Table 3). Use of T3 maximized SE (95.08%) and minimized the 269 percentage of FN results (4.92%), as compared to the other thresholds. The SP in T3 270 remained high (96.30%) (Table 3). Among all thresholds, PPV and NPV ranged 271 between 80.68% - 83.69% and 87.62% - 98.87%, respectively (Table 3). 272 273 274 36 Diagnostic accuracy of the chromogenic medium (index test) at the cow level 275 For the composite milk samples, adoption of the manufacturer’s definition (T1) 276 resulted in low SE (54.05%) and high proportion of FN results (45.95%) (Table 3). At 277 T2 and T3, the SE increased to 75.68% and 89.19%, respectively (Table 3). The SP 278 remained the same for all thresholds (97.50%) and the PPV and NPV ranged between 279 90.90% - 94.29%, and 82.11 - 95.12%, respectively (Table 3). 280 281 Prevalence and accuracy parameters by farm 282 The prevalence of S. agalactiae by farm was: A) 8.11%, B) 5.97%, C) 19.51%, 283 and D) 55.71% (Table 4). Based on T1, there was substantial variation in SE among the 284 farms (12.5% on Farm C to 100% on Farm B). However, for T2 and T3, SE was higher 285 and more consistent among the farms (Table 4). 286 287 Distribution of colony colors on the chromogenic medium, for Streptococcus 288 agalactiae-positive isolates 289 Of the 82 isolates identified as S. agalactiae by the reference standard, most 290 (40.24%) corresponded to pink colonies on the chromogenic medium, although 37.80% 291 and 17.07% were lilac and purple, respectively (Table 5). Of the 18 catalase-negative 292 that were confirmed as species different than S. agalactiae, 72,22% corresponded to 293 growth of blue colonies on the chromogenic medium. 294 We observed a considerable number of colonies that changed color from 24 to 295 48 h. Of the 39 samples that had pink colonies at 24 h, only 28 remained pink at 48 h 296 (Table 6). 297 298 299 37 Discussion 300 The main objective of this study was to evaluate the accuracy of an 301 experimental, chromogenic medium, to detect SCM caused by S. agalactiae. The 302 participant farms were close to the research laboratory because we aimed to use 303 refrigerated milk samples, to simulate on-farm culture conditions. Performing milk 304 cultures on the farms would probably increase the risk of contamination (mostly for 305 blood agar cultures), due to lack of proper facilities and environment. 306 Because we sampled the whole herds (except for herd E), the prevalence of S. 307 agalactiae in the study sample agrees with previous studies (Rossi et al., 2018; Dalanezi 308 et al., 2020) and likely reflects the prevalence of most infected herds in Brazil. Thus, the 309 prevalence-dependent estimates, such as PPV and NPV, could be extrapolated to a large 310 population of herds. We observed practices that could contribute to the high prevalence 311 of S. agalactiae, such as lack of pre-dipping and pos-dipping of teats, and use of a 312 shared cloth towels to dry the teats before milking. 313 The “substantial” and “almost perfect” agreement between the two observers to 314 diagnose S. agalactiae IMI (yes or no), or to determine the colony color, respectively, 315 indicates that the plates were easy to read, despite the range of colony colors that were 316 observed. Nonetheless, it is important to note that both researchers had previous 317 experience in microbiology, which may not apply to most farm personnel. 318 The results of this study provide information that can be used in the field to 319 improve the usage of the chromogenic medium. The accuracy parameters were 320 estimated based on a reference standard (culture on blood agar followed by MALDI-321 TOF MS) that has been used worldwide to detect S. agalactiae and other mastitis 322 pathogens (Barreiro et al., 2017; Nonnemann et al., 2019). 323 38 Results of our analysis indicate important limitations of the chromogenic 324 medium that need to be addressed to improve its application in screening and blitz 325 therapy programs. Use of the manufacturer’s threshold (growth of pink colonies on the 326 medium) to define a S. agalactiae IIM resulted in insufficient SE. The low SE could be 327 partly explained by the percentage of S. agalactiae MALDI-TOF MS-positive isolates 328 that corresponded to growth of colonies with colors other than pink. Furthermore, some 329 colonies changed their colors from 24 to 48 h, which could further complicate the 330 diagnosis. We suggest that, if pink colonies are observed at 24 h, the diagnostic should 331 be confirmed as S. agalactiae, regardless of the color at 48 h. 332 Other factor that might have contributed to the low SE of the medium is the 333 plating area. Although the milk volume was the same for plating on both media 334 (chromogenic medium and on blood agar), we use one-sixth and one-fourth of the 335 plate´s surface, respectively. This strategy was used to decrease culture costs, as 336 suggested by the manufacturer. Further studies could test other alternatives to increase 337 SE, such as increasing milk volume and plating area. 338 To increase SE and minimize the probability of FN results, other thresholds (T2 339 and T3) were studied. Cows with FN results are S. agalactiae reservoirs in the herd who 340 have the potential to quickly transmit IMI to healthy cows (Leelahapongsathon et al., 341 2016; Tamba et al., 2022). Infected cows will continue to experiment milk production 342 losses and increased SCC (Djabri et al., 2002; Holmøy et al., 2019). For both quarter 343 and composite milk samples, there was a considerable increase in SE by using T3, 344 which agree with previous studies in which chromogenic media were used to detect 345 Streptococcus spp (SE = 90.0%, SP = 92.9%; Ganda et al., 2016) and the Gram-positive 346 (GP) media to detect S. agalactiae/S. dysgalactiae (SE = 89.1%, SP = 96.3%; Garcia et 347 al., 2021). 348 39 Although it wasn’t expected, we did observe substantial variation in the 349 chromogenic medium´s SE among farms. We hypothesize that such finding may have 350 occurred due to lack of accuracy of some estimates, due to a reduced sample size within 351 farm, and, possibly, due to genetic differences among herd-specific S. agalactiae 352 isolates, such as serotype. Because this finding might have relevant consequences in the 353 medium´s applicability in the field, we suggest it be further investigated. 354 The little difference in accuracy observed between quarter and composite milk 355 samples (e.g., SE and SP for quarter and composite samples on T3: 95.08% and 356 96.30%; 89.19% and 97.50%, respectively) suggests that milk culturing to detect S. 357 agalactiae can be performed with the chromogenic medium from composite milk 358 samples, which could be an alternative to decrease costs and labor. This finding agrees 359 with previous research (Dinsmore et al., 1991; Rossi et al., 2018) and can be explained 360 by the high concentration of bacteria in the milk of infected cows (Guterbock and 361 Blackmer, 1984). 362 363 Study limitations 364 The mainly limitation of this study was that isolates that grew on the 365 chromogenic medium were not subjected to MALDI-TOF MS identification. However, 366 the objective of this study was not to validate the chromogenic medium itself, but to test 367 its accuracy in field conditions. For this purpose, the study was planned to evaluate the 368 agreement between the results of the index and the reference tests. 369 370 371 372 373 40 Conclusion 374 There was substantial and almost perfect agreement between observers to 375 diagnose S. agalactiae IMI (yes or no) or determine colony colors from the 376 chromogenic medium cultures. 377 The threshold recommended by manufacturer (T1) resulted in low SE and high 378 probability of FN results, which could compromise the eradication of S. agalactiae. 379 Changing the threshold to T3 increased SE to acceptable levels, and minimized the 380 probability of FN results, without compromising SP. 381 The use of composite milk samples (T3) did not result in accuracy loss as 382 compared to using quarter milk samples and could be recommended in herd screening 383 and blitz therapy programs. 384 385 Ethics approval 386 This study was approved by the Sao Paulo State University (UNESP) Ethics 387 Committee for Animal Use (Protocol 0101/2021). 388 389 Funding 390 This study was conducted with funds from the Mastitis Research and Diagnostic 391 Laboratory, São Paulo State University (project FUNDUNESP 2258/2014). This study 392 was financed in part by the Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível 393 Superior - Brasil (CAPES) - Finance Code 001. 394 395 Declarations of interests 396 None. OnFarm did not have any participation of influence in the design and 397 execution of this study. 398 41 Acknowledgments 399 We thank OnFarm (Piracicaba, SP, Brazil) for donating the plates used in this 400 study. We also thank the farmers who collaborated with the study and allowed us to use 401 their animals for this research. 402 403 References 404 Barcelos, M.M., Martins, L., Grenfell, R.C., Juliano, L., Anderson, K.L., Dos Santos, 405 M.V., Gonçalves, J.L., 2019. Comparison of standard and on-plate extraction 406 protocols for identification of mastitis-causing bacteria by MALDI-TOF MS. Braz. 407 J. Microbiol. 50, 849-857. https://doi.org/10.1007/s42770-019-00110-5. 408 Barreiro, J.R., Gonçalves, J.L., Braga, P.A.C., Dibbern, A.G., Eberlin, M.N., Santos, 409 M.V., 2017. 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Microbiological diagnosis by the reference standard, Matrix-Assisted Laser 523 Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) of the 100 524 isolates diagnosed phenotypically identified as catalase-negative cocci. 525 526 MALDI-TOF MS identification n (%) Brevibacillus agri 1 (1.0) Enterococcus faecium 1 (1.0) Lactococcus lactis 2 (2.0) Serratia marcescens 1 (1.0) Streptococcus agalactiae 82 (82.0) Streptococcus canis 1(1.0) Streptococcus dysgalactiae 2 (2.0) Streptococcus lutetiensis 1 (1.0) Streptococcus pluranimaliu 1 (1.0) Streptococcus uberis 3 (3.0) Trueperella pyogenes 1 (1.0) No identification1 4 (4.0) 1 Isolates that were not identified based on the MALDI-TOF MS’s database. 527 528 529 530 531 532 533 534 535 536 537 538 539 540 541 47 Table 2. Cross tabulation between the index test results (chromogenic medium) and the 542 reference standard (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass 543 Spectrometry - MALDI-TOF MS), by threshold and sample type (quarter or composite 544 milk sample). 545 546 MALDI-TOF MS Chromogenic medium Positive Negative Total Quarter – Threshold 11 Positive 34 8 42 Negative 48 355 403 Total 82 363 445 Quarter – Threshold 22 Positive 64 12 76 Negative 18 351 369 Total 82 363 445 Quarter – Threshold 33 Positive 78 13 91 Negative 4 350 354 Total 82 363 445 Composite – Threshold 1 Positive 20 2 22 Negative 17 78 95 Total 37 80 117 Composite – Threshold 2 Positive 28 2 30 Negative 9 78 87 Total 37 80 117 Composite – Threshold 3 Positive 33 2 35 Negative 4 78 82 Total 37 80 117 1 Streptococcus agalactiae intrammary infection defined as growth of ≥1 pink colony on 547 the plate (manufacturer’s definition). 548 2 Streptococcus agalactiae intrammary infection defined as growth of ≥1 pink or lilac 549 colonies on the plate). 550 3 Streptococcus agalactiae intrammary infection defined as growth of ≥1 pink, lilac, or 551 purple colonies on the plate). 552 553 554 555 48 Table 3. Diagnostic accuracy of the index test (chromogenic medium) to detect 556 Streptococcus agalactiae intramammary infection, by threshold and sample type 557 (quarter or composite milk sample). The reference standard was Matrix-Assisted Laser 558 Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS). 559 560 Quarter milk samples (N = 461) Threshold 11 Threshold 22 Threshold 33 % CI4 95% % CI 95% % CI 95% Sensitivity 44.35 30.85 - 58.74 81.05 67.58 - 89.77 95.08 87.54 - 98.15 Specificity 97.81 95.73 - 98.89 96.73 94.39 - 98.12 96.30 93.55 - 97.91 False-negative 55.65 41.26 - 69.15 18.95 10.23 - 32.42 4.92 1.85 - 12.46 False-positive 2.19 1.11 - 4.28 3.27 1.89 - 5.61 3.70 2.09 - 6.45 Positive predictive value 80.68 65.68 - 90.11 83.69 73.17 - 90.61 83.60 72.67 - 90.71 Negative predictive value 87.62 81.60 - 91.86 94.62 89.39 - 97.35 98.87 97.04 - 99.58 Composite milk samples (N = 117) Threshold 1 Threshold 2 Threshold 3 % 95% CI % 95% CI % 95% CI Sensitivity 54.05 38.13 - 69.19 75.68 59.48 - 86.83 89.19 74.51 - 95.88 Specificity 97.50 90.55 - 99.37 97.50 90.55 - 99.37 97.50 90.55 - 99.37 False-negative 45.95 30.81 - 61.87 24.32 13.17 - 40.52 10.81 4.12 - 25.49 False-positive 2.50 0.63 - 9.45 2.50 0.63 - 9.45 2.50 0.63 - 9.45 Positive predictive value 90.90 70.04 - 97.72 93.33 76.93 - 98.33 94.29 79.84 - 98.57 Negative predictive value 82.11 73.08 - 88.58 89.65 81.30 - 94.53 95.12 87.71 - 98.16 1 Streptococcus agalactiae intrammary infection defined as growth of ≥1 pink colony on 561 the plate (manufacturer’s definition). 562 2 Streptococcus agalactiae intrammary infection defined as growth of ≥1 pink or lilac 563 colonies on the plate). 564 3 Streptococcus agalactiae intrammary infection defined as growth of ≥1 pink, lilac, or 565 purple colonies on the plate). 566 4 95% confidence interval. 567 568 569 570 571 572 573 574 575 49 Table 4. Prevalence and diagnostic accuracy parameters of the chromogenic medium 576 (index test) to detect Streptococcus agalactiae intramammary infection from quarter 577 milk samples, by farm. 578 579 Threshold 11 Threshold 22 Threshold 33 Farm Prevalence SE4 (%) SP5 (%) SE (%) SP (%) SE (%) SP (%) A 55.71% (39/70) 35.90 100.00 61.54 93.55 97.44 93.55 B 5.97% (4/67) 100.00 98.41 100.00 98.41 100.00 98.41 C 19.51% (24/123) 12.50 98.99 95.83 98.99 95.83 98.99 D 8.11% (15/185) 86.67 96.47 86.67 95.29 86.67 94.71 1 Streptococcus agalactiae intrammary infection defined as growth of ≥1 pink colony on 580 the plate (manufacturer’s definition). 581 2 Streptococcus agalactiae intrammary infection defined as growth of ≥1 pink or lilac 582 colonies on the plate). 583 3 Streptococcus agalactiae intrammary infection defined as growth of ≥1 pink, lilac, or 584 purple colonies on the plate). 585 4Sensitivity. 586 5Specificity. 587 588 589 590 591 592 593 594 595 596 597 598 599 600 601 602 50 Table 5. Association between the observed colony colors on the chromogenic medium 603 (index test) and the results of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time of 604 Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS - reference standard) in quarter and 605 composite milk samples. 606 607 Quarter milk samples Composite milk samples Colony color MALDI-TOF positive1 MALDI-TOF negative2 Total MALDI-TOF positive MALDI-TOF negative Total Blue 1 (1.22%)3 13 (3.58%) 14 3 (8.11%) 2 (2.50%) 5 Lilac 31 (37.80%) 2 (0.55%) 33 8 (21.62%) 0 (0.00%) 8 Pink 33 (40.24%) 3 (0.83%) 36 19 (51.35%) 1 (1.25%) 20 Purple 14 (17.07%) 0 (0.00%) 14 5 (13.51%) 0 (0.00%) 5 Negative 3 (3.66%) 345 (95.04%) 348 2 (5.41%) 77 (96.25%) 79 Total 82 (100.00%) 363 (100.00%) 445 37 (100.00%) 80 (100.00%) 117 1 Streptococcus agalactiae MALDI-TOF MS positive isolates. 608 2 Streptococcus agalactiae MALDI-TOF MS negative isolates. 609 3 Percentage of the column’s total. 610 611 612 613 614 615 616 617 618 619 620 621 622 623 624 625 51 Table 6. Changes in colony color between 24 and 48 h after milk culturing on the index 626 test (chromogenic medium). 627 628 Quarter milk samples Composite milk samples Color 24 h 48 h 24 h 48 h Blue 14 (3.04%)1 61 (13.23%) 5 (4.27%) 16 (13.68%) Lilac 33 (7.16%) 4 (0.87%) 8 (6.84%) 2 (1.71%) Pink 39 (8.46%) 28 (6.07%) 20 (17.09%) 12 (10.26%) Purple 14 (3.04%) 28 (6.07%) 5 (4.27%) 10 (8.55) Contaminated - 2 (0.43%) - - Other - 7 (1.53%) - - Negative 361 (78.31%) 331 (71.80%) 79 (67.52%) 77 (65.81%) Total 461 (100.00%) 461 (100.00%) 117 (100.00%) 117 (100.00%) 1 Percentage of the column’s total. 629 630 631 632 633 634 635 636 637 638 639 640 641 642 643 644 645 52 646 Figure 1. Colony colors considered to define the thresholds used to define a 647 Streptococcus agalactiae intramammary infection. A: pink; B: lilac, C: purple, and D: 648 blue colonies. Threshold 1: growth of ≥1 pink colony on the plate (manufacturer’s 649 definition); Threshold 2: growth of ≥1 pink or lilac colonies on the plate; Threshold 3: 650 growth of ≥1 pink, lilac, or purple colonies on the plate. Blue colonies were considered 651 as negative for S. agalactiae and positive for Streptococcus uberis, Lactococcus spp., or 652 Enterococcus spp. 653 654 655 656 657 658 659 660 661 662 663 664 665 53 666 667 Figure 2. Completeness of the dataset used to evaluate the diagnostic accuracy of the 668 chromogenic medium, to detect Streptococcus agalactiae intramammary infection. The 669 reference standard was Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight 670 Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS). 671 672 673 674 675 676 54 CAPÍTULO 3 677 678 DISCUSSÃO GERAL 679 O principal objetivo deste estudo foi avaliar a acurácia de um meio cromogênico 680 experimental para detecção de IIM causada por S. agalactiae. As fazendas participantes 681 ficavam próximas ao laboratório de pesquisa pois nosso objetivo era usar amostras de 682 leite refrigerado, simulando as condições de cultivo na fazenda. A realização de culturas 683 de leite nas fazendas provavelmente aumentaria o risco de contaminação (principalmente 684 para culturas de ágar sangue), devido à falta de instalações e ambiente adequados. 685 Como amostramos todos os rebanhos (exceto o rebanho E), a prevalência de S. 686 agalactiae na amostra do estudo concorda com estudos anteriores (ROSSI et al., 2018; 687 DALANEZI et al., 2020) e provavelmente reflete a prevalência da maioria dos rebanhos 688 infectados no Brasil. Assim, as estimativas dependentes da prevalência (VPP e VPN) 689 podem ser extrapoladas para uma grande população de rebanhos. 690 A concordância “substancial” e “quase perfeita” entre os dois observadores para 691 diagnosticar IIM por S. agalactiae (sim ou não), ou para determinar a cor da colônia, 692 respectivamente, indica que as placas eram fáceis de ler, apesar da variedade de cores das 693 colônias que foram observadas. 694 Os resultados deste estudo fornecem informações que podem ser usadas a campo 695 para melhorar o uso do meio cromogênico. Os parâmetros de acurácia foram estimados 696 com base em um método de referência (cultura em ágar sangue seguido de MALDI-TOF 697 MS) que tem sido amplamente utilizado para detectar S. agalactiae e outros patógenos da 698 mastite (BARREIRO et al., 2017; NONNEMANN et al., 2019). 699 Os resultados de nossa análise indicam limitações importantes do meio 700 cromogênico que precisam ser abordadas para melhorar sua aplicação em programas de 701 triagem e blitz terapia. O uso recomendado pelo fabricante (crescimento de colônias rosa 702 no meio) para definir uma IIM por S. agalactiae resultou em SE insuficiente. O que pode 703 ser parcialmente explicado pela porcentagem de isolados positivos de S. agalactiae no 704 MALDI-TOF MS que corresponderam ao crescimento de colônias com cores diferentes 705 do rosa. Além disso, algumas colônias mudaram de cor entre 24 e 48 horas, o que pode 706 comprometer ainda mais o diagnóstico. 707 Outro fator que pode ter contribuído para a baixa SE do meio é a área de 708 plaqueamento. Embora o volume de leite tenha sido o mesmo para o plaqueamento em 709 ambos os meios (meio cromogênico e ágar sangue), utilizamos um sexto e um quarto da 710 55 superfície da placa, respectivamente. Essa estratégia foi utilizada para diminuir os custos 711 da cultura, conforme sugerido pelo fabricante. 712 Para aumentar a SE e minimizar a proporção de resultados de FN, outros pontos 713 de corte (PC2 e PC3) foram estudados. Vacas FN são reservatórios de S. agalactiae no 714 rebanho e têm o potencial de transmitir rapidamente para vacas saudáveis 715 (LEELAHAPONGSATHON et al., 2016; TAMBA et al., 2022). As vacas infectadas 716 continuarão experimentando perdas na produção de leite e aumento da CCS (DJABRI et 717 al., 2002; HOLMØY et al., 2019). Para as amostras de leite compostas e de um quarto, 718 houve um aumento considerável na SE usando PC3, o que concorda com estudos 719 anteriores nos quais um meio cromogênico foi utilizado para detectar Streptococcus spp 720 (SE = 90,0%, SP = 92,9%; GANDA et al., 2016) e o meio Gram-positive (GP) para 721 detectar S. agalactiae/S. dysgalactiae (SE = 89,1%, SP = 96,3%; GARCIA et al., 2021). 722 Embora não fosse esperado, observamos variação substancial na SE do meio 723 cromogênico entre as fazendas. Nossa hipótese é que a falta de precisão de algumas 724 estimativas ocorreu devido a um tamanho amostral reduzido dentro da fazenda e, 725 possivelmente, devido a diferenças genéticas entre isolados de S. agalactiae específicos 726 do rebanho, como o sorotipo. 727 A pequena diferença na precisão observada entre amostras de leite de um quarto 728 e compostas (por exemplo, SE e ES para amostras de quarto e compostas em PC3: 95,08% 729 e 96,30%; 89,19% e 97,50%, respectivamente) sugere que a cultura do leite para detectar 730 S. agalactiae pode ser realizada no meio cromogênico com amostras compostas de leite, 731 o que pode ser uma alternativa para diminuir custos e mão de obra. Esse achado concorda 732 com pesquisas anteriores (DINSMORE et al., 1991; ROSSI et al., 2018) e pode ser 733 explicado pela alta concentração de bactérias no leite de vacas infectadas 734 (GUTERBOCK; BLACKMER, 1984). 735 A principal limitação deste estudo foi que os isolados que cresceram no meio 736 cromogênico não foram submetidos à identificação por MALDI-TOF MS. No entanto, o 737 objetivo deste estudo não foi validar o meio cromogênico em si, mas testar sua precisão 738 em condições de campo. Para tanto, planejou-se o estudo para avaliar a concordância 739 entre os resultados do teste índice e do teste de referência. 740 741 56 CONCLUSÃO GERAL 742 Houve concordância substancial e quase perfeita entre os observadores para 743 diagnosticar IIM causada por S. agalactiae (sim ou não) ou determinar as cores das 744 colônias das culturas no meio cromogênico. 745 O ponto de corte recomendado pelo fabricante (PC1) resultou em baixa SE e alta 746 proporção de resultados FN, o que poderia comprometer a erradicação de S. agalactiae. 747 Mudar o ponto de corte para PC3 aumentou a SE para níveis aceitáveis e minimizou a 748 probabilidade de resultados FN, sem comprometer a ES. 749 O uso de amostras compostas de leite (PC3) não resultou em perda de acurácia em 750 comparação com o uso de amostras de leite de quarto e pode ser recomendado em 751 programas de triagem de rebanho e blitz terapia. 752 753 754 755 756 757 758 759 760 761 762 763 764 765 766 767 768 769 770 771 772 773 774 57 REFERÊNCIAS 775 776 AZEVEDO, C.; PACHECO, D.; SOARES, L.; MOITOSO, M.; MALDONADO, J.; 777 GUIX, R.; SIMÕES, J. 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