RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta dissertação será disponibilizado somente a partir de 28/02/2021. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA – UNESP CAMPUS DE JABOTICABAL Análise in silico, expressão e purificação de uma nova lacase de Chitinophaga sp. CB10 Bárbara Bonfá Buzzo Bióloga 2019 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA – UNESP CAMPUS DE JABOTICABAL Análise in silico, expressão e purificação de uma nova lacase de Chitinophaga sp. CB10 Bárbara Bonfá Buzzo Orientadora: Profa. Dra. Eliana Gertrudes de Macedo Lemos Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Unesp, Câmpus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Microbiologia Agropecuária. 2019 DADOS CURRICULARES DO AUTOR Bárbara Bonfá Buzzo – nascida em Morro Agudo, estado de São Paulo, em 04 de junho de 1995. Ingressou no curso de Ciências Biológicas (Bacharelado – eixo de biotecnologia) em 2013 na Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho – Campus de Jaboticabal, obtendo o título de bióloga em 2016. Durante a graduação fez dois anos (2014 - 2016) de iniciação científica no Laboratório de Bioquímica de Microrganismos e Plantas, departamento de Tecnologia da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Unesp – Jaboticabal, com o projeto intitulado “Prospecção de microrganismos produtores de polihidroxialcanoatos (PHAs) com ênfase em estirpes mutantes de Bradyrhizobium elkanii e Rhizobium tropici” onde foi bolsista FAPESP. Ingressou no curso de mestrado em Microbiologia Agropecuária em março de 2017. “Transmita o que aprendeu. Força, maestria. Mas fraqueza, insensatez, fracasso também. Sim, fracasso acima de tudo. O maior professor, o fracasso é” Mestre Yoda AGRADECIMENTOS À Prof.ª Dr. ª Eliana Gertrudes de Macedo Lemos, pela orientação, apoio e incentivo durante todo o tempo de mestrado, com ensinamentos que levarei para o resto de minha vida pessoal e acadêmica. À Dr. ª Elisângela Soares Gomes-Pepe por todo o ensinamento e ajuda na bancada, e todas as conversas de apoio, sem ela o trabalho não teria sido feito. À Dr. ª Gabriela Cabral Fernandes pela coorientação e grande amizade, apoio, incentivo e confiança, que foram importantes e me colocaram para cima nos piores dias. À Dr. ª Érica Lopes E à Dr.ª Camila Cesário pela ajuda e conhecimentos repassados Às minhas amigas de laboratório e de vida, Natália, Bruna, Gabi, Micheli, Pâmela, Milena e Joana, que mesmo não estando todas presentes, me deram todo apoio e força durante toda a jornada, sou muito grata a vocês. A todos os pesquisadores que fazem parte do Laboratório de Bioquímica de Microrganismos e Plantas, que me auxiliaram nesta jornada. À minha família que me apoiou, incentivou e confiou no meu esforço e trabalho, e esteve comigo nas horas em que mais precisei. Às minhas amigas, Ana, Bia e Gabi e meu namorado, Alan, por sempre tentarem me entender e me apoiarem nos piores dias a continuar e não desistir, por me acolherem nas horas de desespero e por estarem comigo nos melhores momentos. Ao Programa do Pós-graduação em Microbiologia Agropecuária e a Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – FCAV/Unesp. À agência de fomento FAPESP pela bolsa concedida sob o processo 2017/09421-0 O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de financiamento 001 i SUMÁRIO RESUMO.................................................................................................................... iv ABSTRACT ................................................................................................................. v LISTA DE ABREVIATURAS ...................................................................................... vi 1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 1 2. REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................ 3 2.1. Chitinophaga sp. ............................................................................................... 3 2.2. Mineração em dados genômicos (GDM) ........................................................ 4 2.3. Multicopper Oxidases – MCOs ....................................................................... 5 2.4. A família Lacase: estrutura e classificação .................................................... 8 2.5. Lacases de fungos versus lacases bacterianas ......................................... 10 2.6. Corpúsculos de inclusão (IB, do inglês “inclusion body”) ............................. 12 2.7. Degradação de corantes e indústria têxtil .................................................... 14 2.8. Indústria de celulose e papel ........................................................................ 14 2.9. Degradação de poluentes hidrocarbonetos aromáticos policíclicos ............. 15 3. OBJETIVOS ....................................................................................................... 17 3.1. Objetivo geral ............................................................................................... 17 3.2. Objetivos específicos ...................................................................................... 17 4. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................... 18 4.1. Material de trabalho...................................................................................... 18 4.2. Triagem e seleção da sequência de trabalho ............................................... 18 4.3. Análises da sequência de trabalho e modelagem estrutural por homologia 19 ii 4.4. Desenho de primers e amplificação do gene codificador de lacase ............. 20 4.5. Restrição e Ligação ao vetor pET28a .......................................................... 22 4.6. Transformação em célula E. coli BL21 e confirmação da clonagem ............ 23 4.6.1. Sequenciamento dos DNAs plasmidiais ................................................ 24 4.7. Ensaios de expressão da proteína recombinante ........................................ 25 4.8. Extração da proteína recombinante ............................................................. 26 4.8.1. Extração da proteína em sua forma nativa ............................................ 26 4.8.2. Extração desnaturante ........................................................................... 26 4.9. Purificação e renaturação da proteína solúvel ............................................. 27 4.10. Testes de visualização colorimétrica ............................................................ 28 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................... 29 5.1. Análises in silico: evidência de homologia com CopA .................................. 29 5.2. Amplificação e clonagem da ORF codificadora de lacase ........................... 40 5.3. Expressão enzimática .................................................................................. 42 5.4. Extração da proteína recombinante ............................................................. 45 5.4.1. Extração nativa ...................................................................................... 45 5.4.2. Extração desnaturante ........................................................................... 46 5.5. Purificação e renaturação da proteína solúvel ............................................. 47 5.6. Testes de visualização colorimétricos para possível atividade de degradação de corantes da lacase purificada ........................................................................... 49 6. CONCLUSÃO ..................................................................................................... 51 7. PERSPECTIVAS .............................................................................................................51 iii 8. REFERÊNCIAS ................................................................................................. 52 iv Análise in silico, expressão e purificação de uma nova lacase de Chitinophaga sp. CB10 RESUMO – As enzimas são catalisadores biológicos que cada vez mais despertam o interesse da indústria em aplicá-las em seus processos. As lacases, uma classe de enzimas pertencente à família das “multicopper oxidases”, possuem alto potencial industrial pois atuam em diversos substratos, tendo assim, uma diversidade de aplicações. Dentre as lacases, as bacterianas são as de maior interesse para os processos industriais em comparação com as de fungos, uma vez que bactérias apresentam maior tolerância a ambientes extremos e apresentam um tempo de reprodução mais rápido. Diante disto, foi realizada a prospecção de uma lacase bacteriana no genoma de Chitinophaga sp. CB10 a partir do banco de dados genômico, pertencente ao Laboratório de Bioquímica de Microrganismos e Plantas (LBMP), com base em genes ortólogos e busca por HMM (“Hidden Markov Model”) seguida pela busca de lacases utilizando como sequência isca o padrão conversado L3 (HLHGH), que é uma assinatura específica de lacases. Esta prospecção revelou uma ORF CB10_180.4889 a qual foi clonada e submetida às análises de expressão, extração e purificação. A proteína se mostrou retida em corpúsculos de inclusão e só foi possível extraí-la em sua fração solúvel utilizando agentes desnaturantes, como ureia e guanidina. Após a extração, a proteína desnaturada foi submetida a uma purificação concomitantemente a renaturação, que se mostrou eficiente de acordo com os testes de visualização de degradação de corante. A partir das análises “in silico”, observou-se que a enzima CB10_180.4889 possui três domínios de cobre (cupredoxina) e pertence à classe das CopAs, classe em que se encontram somente proteínas bacterianas com maior resistência ao cobre. Considerando a possível aplicação biotecnológica, a enzima apresentou potencial para a degradação de corantes. Palavras-chave: multicopper oxidase, corpúsculos de inclusão, expressão v In silico analysis, expression and purification of a new laccase from Chitinophaga sp. CB10 ABSTRACT - Enzymes are biological catalysts that increasingly arouse industry interest in applying them in their processes. Among all the enzymes, laccases are a class of enzymes belonging to the family of Multicopper oxidases, with high industrial potential because they act on several substrates, thus having a diversity of applications. Between all laccases, bacterial are greater interest for industrial processes than fungi, once bacteria have a greater tolerance to extreme environments than these, besides presenting a time of reproduction and cloning faster. Therefore, a bacterial laccase was prospected in the genome of Chitinophaga sp. CB10 from the genomic database belonging to the Laboratory of Biochemistry of Microorganisms and Plants (LBMP), based on orthologous genes and search for HMM ("Hidden Markov Model") followed by the search for laccases using as motif the standard L3 (HLHGH which is a specific signature of laccases. This prospection revealed a ORF CB10_180.4889 which was cloned and subjected to expression, extraction and purification analyzes. The protein was included in inclusion bodies and it was only possible to extract it in its soluble fraction using denaturing agents, such as urea and guanidine. After extraction, the denatured protein was subjected to purification with concomitantly renaturation, which proved to be efficient according to the dye degradation screening tests. From the in silico analyzes, it was observed that the enzyme CB10_180.4889 has three domains of copper (cupredoxin) and belongs to the class of CopAs, characteristic only of bacterial laccases with greater resistance to copper. Considering the possible biotechnological application, the enzyme presents potential for the degradation of dye. Keywords: multicopper oxidases; inclusion bodies; expression vi LISTA DE ABREVIATURAS AA - Aminoácidos DNA - ácido desoxirribonucleico dNTP- desoxirribonucleotídeos fosfatados IPTG – isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo PCR- reação em cadeia da polimerase Tris- tris[hidroximetil]aminometano CV – Volume da coluna E.C. – Enzyme Comission GenBank – banco de sequências de genes e proteínas do NCBI kb – mil pares de base LB – Lúria Bertani MCOs- Multicopper oxidases NCBI – National Center for Biotechnology Information NGS – Sequenciamento de nova geração ORF – Open Reading Frame (região codificadora de proteína) pb – pares de bases PDB – Protein Data Bank pH – potencial hidrogeniônico log [H+] pI – ponto isoelétrico ppm – partes por milhão rpm – rotações por minuto SDS – dodecil sulfato de sódio SDS-PAGE – Eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de dodecil sulfato de sódio 1 1. INTRODUÇÃO Encontrar novas enzimas tem sido o objetivo de muitos grupos de pesquisa, visto seu crescente uso em vários setores industriais, como o segmento alimentício, farmacêutico, têxtil, papel e muitos outros (Choi et al., 2015). Consórcios bacterianos são formados por diferentes espécies de microrganismos que podem possuir diferentes vias metabólicas e que realizam a degradação de diversas moléculas, sendo, portanto, uma fonte importante de novas enzimas com possíveis aplicações biotecnológicas na indústria. Um dos processos que podem ser utilizados para a prospecção destas enzimas é a mineração de dados, uma técnica que permite a exploração de genomas, metagenomas e consórcios bacterianos já sequenciados e inexplorados depositados em bancos de dados. Esta metodologia utiliza padrões de sequências conservadas já conhecidas para a prospecção de enzimas inseridas nestes genomas, como, por exemplo, lacases, xilanases, redutases, endoglucanases e muitas outras (Bachmann et al., 2014). As “multicopper oxidases” (MCOs) formam um grupo de proteínas capazes de exercer variadas funções, como oxidação de metais, tais como cobre e ferro, e de substratos fenólicos e não fenólicos (Baldrian, 2006). Dentro deste grupo das MCOs se destacam as lacases, que apresentam alta especificidade por substratos, o que permite sua atuação em vários campos biotecnológicos, como biosensores para detecção de fenóis em águas residuais, indústria alimentícia, produção de etanol, branqueamento de papel, deslignificação, biorremediação e degradação de corantes (Fernández-fernández et al., 2013). As lacases [ (benzenodiol: oxigênio redutases (EC 1.10.3.2) ] são enzimas que possuem 4 átomos de cobre por monômero, essenciais para o correto desempenho catalítico da enzima. Estes átomos estão divididos em centros que diferem entre si por sinais de ressonância paramagnética, sendo chamados de centros de cobre tipo 1, ou cobre azul, centros de cobre tipo 2 ou cobre normal e centros de cobre tipo 3 ou binucleares acoplados (Bento et al., 2006). Esta enzima pode ser encontrada em plantas, fungos e bactérias (Diamantidis et al., 2000) e, mais recentemente, foi descoberta a presença de lacases em insetos, 2 envolvidas na formação da cutícula (Giardina et al., 2010). A maioria das lacases utilizadas na indústria são originárias de fungos, porém estes microrganismos possuem algumas desvantagens quando o assunto é aplicação biotecnológica, pois a maioria dos processos ocorrem em condições extremas, que acabam tornando-se desfavoráveis para a maioria dos fungos (Du et al., 2015 e Wang e Zhao, 2017). Já as bactérias são capazes de se adaptarem em ambientes extremos, além de produzirem as enzimas em um curto espaço de tempo (Christopher et al., 2014), o que torna interessante a busca por lacases bacterianas. Quando se leva em conta a aplicação industrial, há a necessidade de testes de expressão heteróloga, onde geralmente se utilizam células competentes de Escherichia coli como vetor. Porém, um problema comumente encontrado é a formação de corpúsculos de inclusão (IB, do inglês “inclusion body”), que são partículas entre 50 e 800 nm encontrados no citoplasma de células bacterianas recombinantes, formados durante a indução da expressão de genes clonados. Os IB são formados por reações de estresse das células, resultando em uma proteína precipitada e biologicamente inativa (Villaverde et al., 2015). Sabendo-se da importância das lacases na indústria e suas diversas aplicações, juntamente com a necessidade de maiores estudos em lacases bacterianas, o objetivo deste trabalho foi prospectar uma lacase do genoma da bactéria Chithinophaga sp. CB10, uma bactéria gram-negativa, não patogênica, filamentosa, mesófila, imóvel e não formadora de esporos (Kishi et al., 2017a), que foi isolada a partir de um consórcio bacteriano degradador de biomassa, e se mostrou uma interessante fonte para prospecção de lacase pois nenhuma outra enzima desta classe foi caracterizada neste gênero de bactéria. 51 6. CONCLUSÃO Neste trabalho foi possível identificar uma ORF codificadora de lacase bacteriana no genoma de Chitinophaga sp. CB10 e desenvolver a caracterização estrutural de uma nova lacase, denominada CB10_180.4889. As análises in silico realizadas permitiram identificar uma lacase de três domínios pertencente à classe das CopAs (enzimas bacterianas com maior resistência ao cobre), com um pI de 6,5 e 84 KDa de massa molecular, bem como detectar a presença de seus átomos de cobre, essenciais para o correto funcionamento catalítico da enzima. A metodologia de extração desnaturante foi a única que se mostrou eficiente e tornou possível a extração da enzima em sua fração solúvel, visto que esta estava retida em corpúsculos de inclusão, assim como sua renaturação concomitantemente com a purificação se mostrou eficaz, visto os resultados obtidos nos testes de atividade e degradação de corantes. A lacase se mostrou ativa quando em contato com o substrato ABTS e cobre, bem como modificou a coloração do corante quando testada com cobre. Para ambos os casos, quando não foi colocado o metal, não foi vista nenhuma alteração, o que indica que a lacase necessita do cobre como cofator para ter seu ótimo desempenho catalítico. 52 8. REFERÊNCIAS Arnold, k. et al. (2006) The swiss-model workspace: a web-based environment for protein structure homology modelling. Bioinformatics 22: 195–201 Ba, s.; Vinoth Kumar (2017) Recent developments in the use of tyrosinase and laccase in environmental applications. 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