UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS, LETRAS E CIÊNCIAS EXATAS CAMPUS DE SÃO JOSÉ DO RIO PRETO DENISE SILVA DE OLIVEIRA APLICAÇÃO DE XILANASE E/OU CICLODEXTRINA GLICOSILTRANSFERASE (CGTASE) NA PRODUÇÃO DE PÃES São José do Rio Preto-SP 2010 DENISE SILVA DE OLIVEIRA APLICAÇÃO DE XILANASE E/OU CICLODEXTRINA GLICOSILTRANSFERASE (CGTASE) NA PRODUÇÃO DE PÃES São José do Rio Preto-SP 2010 Orientadora: Profa. Dra. Célia Maria Landi Franco Co-orientador: Dr. Roberto da Silva Tese apresentada para a obtenção do título de Doutor em Engenharia e Ciência de Alimentos, área de Ciência e Tecnologia de Alimentos junto ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia e Ciência de Alimentos do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade “Júlio de Mesquita Filho”, Campus São José do Rio Preto BANCA EXAMINADORA ___________________________________ Prof. Dra. Célia Maria Landi Franco Universidade Estadual Paulista - UNESP Orientadora ___________________________________ Prof. Dra. Myriam Salas Mellado Universidade Federal do Rio Grande - FURS Membro da Banca ____________________________________ Prof. Dra. Caroline Joy Steel Universidade Estadual de Campinas - UNICAMP Membro da Banca __________________________________ Prof. Dra. Eleni Gomes Universidade Estadual Paulista - UNESP Membro da Banca __________________________________ Prof. Dra. Mieko Kimura Universidade Estadual Paulista - UNESP Membro da Banca São José do Rio Preto - SP 2010 Dedico A minha mãe, Maria Aparecida A meu pai, Carlos Augusto Aos meus irmãos, Adriana, Junior (in memorian), Ana Beatriz Ao meu noivo, Adilson Ao meu cunhado André Ao meus sobrinhos, Maria Eduarda, João Guilherme A minha eterna orientadora, Fumie Suzuki Kemelmeier Dessas pessoas recebi apenas energias positivas, apoio, compreensão, orientação, e incentivo para eu buscar minha própria realização. Toda a minha gratidão, muito obrigada AGRADECIMENTOS A Prof. Dra. Célia Maria Landi Franco, pela oportunidade, amizade e dedicação na orientação desse trabalho. Ao Prof. Dr. Roberto da Silva, pela oportunidade, esclarecimentos e co-orientação desse trabalho. Aos colegas de trabalho do Laboratório de Bioquímica e Microbiologia Aplicada, Aline, Andréia, Carol, Ellen, Fabiana, Heloiza, Marcelo, Márcia, Natália, Rodrigo, que me receberam de braços abertos. As colegas de trabalho do Laboratório de Cereais, Raízes e Tubérculos, Suelen, Veren, e principalmente Thaís e Raquel pela amizade, paciência e co-orientação não oficial. As amigas, Analice, e Jupyracyara, pela amizade e apoio nos momentos difíceis. Aos técnicos do Departamento de Engenharia de Alimentos, Ginaldo, Luiz e Tânia. Ao colega Joel, pelo ajuda no manuseio do texturômetro. Ao Laboratório de Cereais da Universidade Estadual de Campinas, por ceder os equipamentos farinógrafo e extensógrafo. FAPESP – Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, pela concessão de bolsa de doutorado e apoio financeiro a pesquisa. SUMÁRIO GERAL RESUMO.............................................................................................................. i ABSTRACT ......................................................................................................... ii CAPÍTULO .1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA................................................................................1 CAPÍTULO .2. PRODUÇÃO E CARACTERÍZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DA XILANASE E PRODUÇÃO DE CICLODEXTRINA GLICOSILTRANSFERASE (CGTase)....37 CAPÍTULO .3. APLICAÇÃO DE XILANASE NA PRODUÇÃO DE PÃES ................................58 CAPÍTULO .4. APLICAÇÃO DE CICLODEXTRINA GLICOSILTRANSFERASE (CGTase) NA PRODUÇÃO DE PÃES...................................................................................100 CAPÍTULO .5. APLICAÇÃO DE XILANASE E CICLODEXTRINA GLICOSILTRANSFERASE (CGTase) NA PRODUÇÃO DE PÃES............................................................133 RELATÓRIO DE ATIVIDADES.......................................................................149 i RESUMO O desenvolvimento da tecnologia de pães é um fenômeno de grande impacto na indústria de alimentos. Ao longo dos anos vários aditivos foram incorporados à tecnologia de panificação, elevando a qualidade destes produtos e fazendo crescer a sua aceitação pela população em geral. O objetivo deste trabalho foi estudar os efeitos sobre a qualidade do pão e sobre o processo de envelhecimento, da adição de enzimas na massa. As enzimas usadas foram xilanase produzida pelo fungo Thermoascus aurantiacus CBMAI 756 nas concentrações de 20, 35 e 50U/100 g de farinha de trigo e/ou da ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase) produzida pela bactéria Bacillus clausii E16 nas concentrações de 15 e 30U/100 g de farinha de trigo, parcialmente purificadas. O mecanismo de ação dessas enzimas sobre os seus respectivos substratos arabinoxilana e amido, respectivamente, também foram avaliadas. Os pães adicionados de xilanase, CGTase e xilanase/CGTase foram produzidos em três etapas distintas. Para o estudo do envelhecimento os pães foram mantidos a temperatura de 4ºC durante 10 dias, e foram avaliados quanto à perda de água, a textura e a retrogradação da amilopectina. Os produtos obtidos pela ação da xilanase e CGTase sobre as arabinoxilanas e o amido, respectivamente, isolados da farinha de trigo, foram analisados por HPAEC-PAD e HPLC. O fungo T. aurantiacus exibiu uma variação no perfil enzimático de acordo com cada substrato usado no seu cultivo. O substrato que resultou no melhor perfil enzimático para o uso em panificação foi o sabugo de milho, porque esse extrato enzimático exibiu alta atividade xilanolítica e baixa atividade amilolítica e proteolítica. A adição de xilanase, CGTase e xilanase/CGTase aumentou o volume da massa e o volume específico dos pães. Quanto ao estudo do envelhecimento, as enzimas adicionadas separadamente ou em conjunto reduziram à retrogradação da amilopectina e a firmeza do miolo durante o armazenamento em relação aos pães livres de enzima. Com relação à análise de firmeza do miolo houve um efeito sinérgico das enzimas estudadas. O extrato enzimático produzido pelo T. aurantiacus mostrou haver xilanases que quebram as ligações glicosídicas β-1,4 da cadeia principal e também xilanases desramificadoras que liberam arabinose e glicose dos pontos de ramificação. O complexo xilanolítico mostrou ter afinidade pelas arabinoxilanas não extraída com água (WU- AX). Nas análises de suscetibilidade do amido frente à ação da CGTase observou-se claramente a realização de reações de acoplamento, desproporcionação e/ou uma atividade hidrolítica. A presença principalmente de β-ciclodextrina confirma que a CGTase estudada neste trabalho é uma β-CGTase. A presença de ciclodextrina no pão mostrou a preservação da atividade de ciclização da CGTase durante o processo de panificação. Palavras chave: Pão, xilanase, ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase), processo de envelhecimento. ii ABSTRACT The development of bread technology is a phenomenon of great impact on food industry. For years, many additives were used on bread technology, increasing the bread quality and improving the acceptance of general population. The aim of this work was to study the effects on the bread quality and on the staling process, by adding enzymes to the dough. The enzymes used were xylanase from the fungus Thermoascus aurantiacus CBMAI 756 in the concentrations 20, 35 and 50U/100 g wheat flour and/or cyclodextryn glycosiltransferase (CGTase) from the bacteria Bacillus clausii E16 in the concentration 15 and 30U/100 g wheat flour, partially purified. The action mechanisms of these enzymes under the substrates arabinoxylan and starch, respectively, were also evaluated. The breads added of xylanase, CGTase and xylanase/CGTase were produced in three distinct stages. For bread staling study, the breads were stored at 4ºC for 10 days, and they were analyzed regarding to the moisture content, texture and amylopectin retrogadation. The products obtained by the action of xylanase and CGTase on arabinoxylans and starch, respectively, isolated from wheat flour, were analyzed by using HPAEC-PAD and HPLC. The fungus T. aurantiacus exhibited a variation on the enzymatic profile according to each substrate used on its cultivation. The substrate which resulted in a better enzymatic profile for using on breadmaking was corncob, since this enzymatic extract exhibited high xylanolytic activity and low amylolytic and proteolytic activities. The addition of xylanase, CGTase and xylanase/CGTase increased the dough volume and the specific volume of the breads. Regarding to the staling study, the enzymes added separated or together reduced amylopectin retrogradation and firmness of the crumb during storage, when compared with breads without addition of enzymes. There was a synergistic effect of the enzymes regarding to the firmness of the crumb. The enzymatic extract produced by T. aurantiacus contained xylanase that cleaves on β-1,4 glycosil linkages of main chain and also contained debranching xylanase which release arabinose and glucose from the branched points. The xylanolytic complex showed affinity for water unextracted arabinoxylans (WU-AX). From the starch susceptibility to CGTase action, was clearly observed coupling reactions, disproportionation and/or hydrolytic action. The presence of β-cyclodextrin confirms that the CGTase used in this study is a β-CGTase. The presence of cyclodextrin in the bread showed the preservation of cyclization activity of CGTase during the breadmaking process. Keywords: Bread, xylanase, cyclodextrin glycosiltransferase (CGTase), staling process. 1 CAPÍTULO I REVISÃO BIBLIOGRÁFICA SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS ...........................................................................................................2 LISTA DE TABELAS ..........................................................................................................3 1.1. INTRODUÇÃO ....................................................................................................................4 1.2. REVISÃO DE LITERATURA .............................................................................................5 1.2.1. ENVELHECIMENTO DO PÃO.........................................................................................5 1.2.2. COMPONENTES DA FARINHA DE TRIGO..................................................................10 1.2.2.1. Amido .........................................................................................................................11 1.2.2.2. Proteínas....................................................................................................................13 1.2.2.3. Carboidratos não amiláceos....................................................................................14 1.2.3. XILANA...........................................................................................................................15 1.2.3.1. Enzimas xilanolíticas ................................................................................................18 1.2.3.2. Produção de xilanases termofílicas........................................................................22 1.2.3.3. Aplicação industrial das xilanases ........................................................................24 1.2.4. CICLODEXTRINA ..........................................................................................................25 1.2.4.1. Ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase) ...........................................................27 1.2.4.2. Produção e aplicação industrial da ciclodextrina .................................................28 1.3. REFERÊNCIAS.................................................................................................................31 2 LISTA DE FIGURAS Figura 1.1. Modelo proposto para o envelhecimento do miolo do pão, mostrando a estrutura molecular da massa, pão fresco e pão envelhecido e pão reaquecido ............................7 Figura 1.2. Modelo proposto para o envelhecimento do miolo do pão, mostrando as ligações entre o amido remanescente e o glúten............................................................................7 Figura 1.3. Estrutura da molécula de amilose e da amilopectina......................................................11 Figura 1.4. Esquema representando a ação das enzimas amilolíticas e pululíticas (desramificadoras) ...........................................................................................................12 Figura 1.5. Representação esquemática das gliadinas e gluteninas na rede glúten ........................14 Figura 1.6. Representação esquemática da degradação enzimática da arabinoxilana (AX) e o efeito das diferentes frações de AX sobre o volume do pão...........................................15 Figura 1.7. Composição da O-acetil-4-O-metilglicuronoxilana (xilana de madeira dura)..................16 Figura 1.8. Composição da arabino-4-O-metilglicuronoxilana. (madeira macia) ..............................17 Figura 1.9. Elementos estruturais da arabinoxilana ..........................................................................17 Figura 1.10. (A): Enzimas xilanolíticas envolvidas na degradação da xilana. (B): Hidrólise de xilooligossacarideo pela β-xilosidase ..............................................................................20 Figura 1.11. Mecanismo de reação das xilanases ..............................................................................22 Figura 1.12. Estrutura físico-química das α, β e γ-CDs.......................................................................26 Figura 1.13. Reações catalisada pela CGTase. ..................................................................................27 3 LISTA DE TABELAS Tabela 1.1. Classificação do trigo.......................................................................................................10 4 1.1 Introdução As xilanases são amplamente utilizadas como aditivo na indústria de panificação. O primeiro relato das xilanases na indústria de panificação foi na década de 70. As xilanases que são enzimas que hidrolisam os polissacarídeos não amiláceos, causam um efeito positivo sobre a massa e a qualidade do pão, causando uma maior flexibilidade, estabilidade e expansão da massa, bem como uma melhora na estrutura do miolo (MARTINEZ-ANAYA; JIMENEZ, 1997; COURTIN; DELCOUR, 2002; (COLLINS et al., 2006). As arabinoxilanas são pentosanas da parede celular dos cereais, constituídas de moléculas de D-xiloses unidas por ligações glicosídicas β-1,4, que apresentam como grupo substituinte moléculas de L-arabinose ligadas ao carbono C-2 e/ou C-3 da xilose por ligação glicosídica α-1,2 e/ou α-1,3 (KULKARNI; SHENDYE; RAO, 1999). O substituinte arabinose pode estar esterificado com grupos fenólicos como o ácido ferúlico e o ácido p-cumárico por meio de uma ligação éster (MÜLLER-HARVEY et al., 1986). O fungo termofílico Thermoascus aurantiacus é um bom produtor de xilanase termoestável (DA-SILVA et al., 2005). A maioria dos estudos mostra a ação de xilanases mesofílicas sobre a melhoria da qualidade de pães (LAURIKAINEN et al., 1998; PRABHASANKAR et al., 2004; SHAH; SHAH; MADAMWAR, 2006) e pouco se encontra com relação a xilanases termofílicas. A vantagem do uso de xilanase termoestável consiste de sua ação continuada mesmo após a temperatura de gelatinização do amido. Recentemente foi estudado o uso de endoxilanase termofílica recombinante em diferentes concentrações na produção de pães (JIANG et al., 2005; COLLINS et al., 2006; JIANG; BAIL; WU, 2007). O emprego de enzima nativa tem a vantagem de não receber a rejeição que produtos recombinantes ainda despertam nos consumidores. Outra enzima estudada para melhorar a qualidade de pães é a ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase). Esta enzima é a única capaz de hidrolisar o amido em uma série de dextrinas cíclicas não-redutoras, via reação de ciclização, além da produção de dextrinas de baixo peso molecular (JEMLI et al., 2007). As ciclodextrinas são capazes de formar complexos de encapsulação com substâncias voláteis (aromas) que permite a redução da volatilidade do aroma dos pães, aumentando o tempo de armazenamento e reduzindo as perdas, o que poderia afetar diretamente o processo de envelhecimento de pães (SZEJTLI, 1997). Em panificação estudos recentes foram realizados para investigar o efeito da CGTase sobre o processo de envelhecimento de pães adicionados desta enzima. Como a CGTase age sobre o amido vários pesquisadores como Lee et al., (2002); Gujral; Haros; Rosell, (2003) atribuem o efeito antienvelhecimento desta enzima à hidrólise da amilose e da amilopectina em frações menores, limitando a retrogradação dessas moléculas durante o armazenamento. 5 A indústria de panificação tem focado a atenção no desenvolvimento de tecnologias para produção de pães com melhores características tecnológicas como volume, maciez, envelhecimento lento, maior valor nutricional e visando reduzir os custos de produção. Ao longo dos anos vários coadjuvantes foram incorporados à tecnologia de panificação, levando a um grau elevado na qualidade destes produtos e fazendo crescer a sua aceitação pela população em geral. Ao mesmo tempo, criou-se um segmento de consumidor disposto a pagar mais por um produto de elevada qualidade. Neste contexto, muito tem sido feito no sentido de minimizar os efeitos negativos do processo de envelhecimento, visando diminuir as perdas causadas durante o armazenamento dos pães, mas os efeitos da xilanase termoestável e da CGTase na fabricação de pão é ainda não conclusivos, no que diz respeito ao melhoramento da qualidade da massa, ao processo de envelhecimento durante o armazenamento, e ao mecanismo de ação dessas enzimas. Com certeza, a aplicação de enzimas na produção de pães de qualidade, constitui hoje o estado da arte neste segmento da indústria de alimentos. 1.2. Revisão de literatura 1.2.1. Envelhecimento do pão O pão é definido como um produto perecível que resulta do cozimento de uma massa obtida pela mistura de farinha de trigo, sal comestível e água potável, fermentada por espécies de microrganismos próprios para a fermentação do pão. Outros ingredientes como gordura, enzimas exógenas, melhoradores, emulsificantes, leite e outros produtos lácteos, além de glúten também podem ser adicionados (HOSENEY, 1991). O processo de envelhecimento do pão inicia-se logo após o forneamento. A deteriorização do produto é facilmente reconhecida pelos consumidores, e está além da proliferação de microrganismos indesejáveis. Outras alterações estão relacionadas com o envelhecimento do pão, incluindo aumento da umidade da crosta (perda da crocância), cristalinidade do amido e firmeza do miolo; perda das propriedades organolépticas, do aroma do pão e da capacidade de hidratação do miolo (HOSENEY, 1984; GRAY; BEMILLER, 2003; RIBOTTA; BAIL, 2007). O desenvolvimento da firmeza do miolo está estritamente relacionado ao processo de envelhecimento do pão e no momento sua completa elucidação não foi alcançada Por muitos anos, a teoria de que a retrogradação da amilopectina dentro dos grânulos de amido resultava na maior firmeza do miolo foi aceita como fato (SCHOCH, FRENCH, 1947). O termo retrogradação é usado para descrever as mudanças que ocorrem durante o resfriamento e armazenamento do amido gelatinizado. A retrogradação resulta da formação de 6 agregados cristalinos ou reassociação das moléculas de amilose e amilopectina com a liberação de água num fenômeno denominado de sinérese (THOMAS; ATWELL, 1999). No pão a retrogradação da amilose ocorre nas primeiras horas após o forneamento. A retrogradação da amilopectina ocorre a longo prazo e parece ser um dos principais fenômenos responsável pela firmeza do miolo durante o armazenamento (RIBOTTA; BAIL, 2007). Outros fatores, além do período de armazenamento, influenciam o comportamento de retrogradação da amilopectina como: temperatura de armazenamento, estrutura desse polissacarídeo e outros componentes presentes (ELIASSON, 1986). Zobel e Kulp (1996) propuseram um modelo para o envelhecimento do pão, que enfatizava o papel do amido. Na massa, a amilopectina existe na sua forma cristalina dentro do grânulo. Durante o processo de panificação, mais especificamente durante a etapa de forneamento, a cristalinidade da amilopectina é perdida pela gelatinização do grânulo de amido. Com o intumescimento do grânulo de amido, as moléculas de amilopectina têm uma maior liberdade para expandir dentro do espaço intergranular. No pão fresco, as moléculas de amilose e algumas de amilopectina estão lixiviadas para o exterior do grânulo de amido e é neste momento que algumas amiloses formam complexos de inclusão com lipídios. Durante o envelhecimento do pão a amilopectina se reorganiza dentro de uma estrutura mais cristalina e esta reorganização (retrogradação) confere rigidez ao grânulo intumescido e ao material intergranular (Figura 1.1) (ZOBEL; KULP, 1996). No entanto, vários autores concordam que o envelhecimento do pão não é função apenas da retrogradação da amilopectina (MALEKI, HOSENEY, MATTERN (1980); HE, HOSENEY (1990); MARTIN, ZELEZNAK, HOSENEY (1991); MARTIN, HOSENEY (1991). Maleki, Hoseney, Mattern (1980) sugerem que o envelhecimento do pão está relacionado com a qualidade das proteínas da farinha. Martin, Zeleznak, Hoseney (1991) propuseram um modelo de envelhecimento, onde a firmeza do miolo tem causas nas interações entre as moléculas de amilose e amilopectina dos grânulos de amido remanescentes da gelatinização (fase descontinua) e o glúten (fase contínua) devido à diminuição da capacidade de hidratação do miolo (desidratação). De acordo com esse modelo, grânulos de amido menos intumescidos teriam uma área exposta menor, portanto, menos ligações ou ligações mais fracas ocorreriam com o glúten (fibrila de proteína). Esses pesquisadores sugerem que essas ligações entre o amido e o glúten conferem a firmeza do miolo, e, portanto o envelhecimento do pão (Figura 1.2). 7 Figura 1.1. Modelo proposto para o envelhecimento do miolo do pão, mostrando a estrutura molecular da massa, pão fresco e pão envelhecido e pão reaquecido. (ZOBEL; KULP, 1996). Figura 1.2. Modelo proposto para o envelhecimento do miolo do pão, mostrando as ligações entre o amido remanescente e o glúten (MARTIN, ZELEZNAK, HOSENEY, 1991). É conhecido que a prevenção da perda de água do miolo para a crosta pode retardar o envelhecimento, portanto, o papel da água é importante no processo de envelhecimento do pão. O amido e o glúten têm diferentes capacidades de reter a água, e a migração de água tem sido investigada, mas as teorias ainda são controversas. Um grupo de pesquisadores sugere que a migração da água ocorre do glúten para o amido (WILLHOFT (1971); LEUNG, MAGNUSON, BRUINSMA (1983). Eles sugerem que o amido passe do estado amorfo para o Amilopectina cristalina Amilopectina gelatinizada Gluten Envelhecimento Amilose amorfa Lipídeo polar Hélice de amilose Complexo amilose,”V” Amilose retrogradada Reaquecimento Pão envelhecido Pão fresco Estágio de 8 estado cristalino e que a água seria necessária para a cristalização do amido. A água é incorporada dentro da estrutura cristalina, tornando moléculas imóveis. Outro grupo de pesquisadores (Cluskey, Taylor, Senti (1959); Senti, Dimler (1969); Gray; Bemiller (2003) sugerem que a migração da água ocorre do amido para o glúten. Eles sugerem que a capacidade de reter a água reduz com o envelhecimento devido a retrogradação á amilopectina, mas que no glúten não há alteração. Por essa razão eles concluiram que o amido expele água para o glúten. O envelhecimento do pão tem sido estudado pela análise da retrogradação do amido usando o Calorímetro Diferencial de Varredura (Differential Scanning Calorimeter - DSC) que monitora a cristalização ou reorganização das moléculas de amilopectina durante o armazenamento do pão. O DSC informa a variação da entalpia de retrogradação (∆Hr) necessária para fundir a amilopectina cristalizada ou reorganizada durante o armazenamento sendo o valor da entalpia proporcional á retrogradação (THOMAS; ATWELL, 1999). Diversas pesquisas têm mostrado que as arabinoxilanas da farinha de trigo possuem uma capacidade significativa para afetar as propriedades da massa e do pão e que sua modificação pelas xilanases causa forte impacto na estrutura e funcionalidade das mesmas. Dependendo da concentração de xilanases e suas especificidades para os substratos WU-AX e WE-AX, essas enzimas exibem diferenças sobre a sua funcionalidade em panificação. É relatado que diversas xilanases apresentam um efeito antienvelhecimento sobre o pão convencional, detectado pelo Calorímero Diferencial de Varredura (DSC) (COURTIN; DELCOUR, 2002; HAROS; ROSELL; BENEDITO, 2002; GRAY; BEMILLER, 2003). Rouau; El-Hayek; Moreau (2001) sugeriram que o aumento dos níveis de arabinoxilanas (WE-AX), foi a provável causa para a melhora na qualidade dos pães após a adição de um preparado contendo endoxilanase. Esses autores sugeriram que a ação hidrolítica das xilanases quebrando as ligações glicosídicas, com conseqüente liberação de água e diminuição das arabinoxilanas (WU-AX), poderia explicar o efeito positivo nos pães frescos. O mecanismo de ação das endoxilanases na massa e no pão ainda não está de todo esclarecido, provavelmente porque as arabinoxilanas da farinha variam entre os diferentes tipos de trigo, assim como, a especificidade da enzima para diferentes substratos (COURTIN, DELCOUR, 2001). Existem várias hipóteses para explicar esse mecanismo: a) a degradação dos carboidratos não amiláceos como as arabinoxilanas, aumentaria sua capacidade de reter a água evitando ou diminuindo a desidratação do pão. No entanto, a simples adição de água na massa não tem o mesmo efeito positivo exercido pelas xilanases; b) as arabinoxilanas (WU- AX) teriam um efeito negativo sobre as propriedades de retenção de gás. A ação das xilanases tornaria as arabinoxilanas insolúveis em solúveis, melhorando a formação da rede de glúten e assim, melhorando a retenção de gás pela massa; c) a parede celular retarda a acessibilidade 9 da água ao endosperma, em particular as proteínas do glúten. A enzima desestabilizaria a parede celular melhorando a acessibilidade da água às proteínas que absorveriam água, e posteriormente interagiriam umas com as outras por meio de pontes de hidrogênio e pontes de dissulfeto, formando uma rede (glúten) que aprisionaria o gás liberado durante a fermentação (SLUIMER, 2005). Outra enzima estudada para melhorar a qualidade de pães é a ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase). Esta enzima é a única capaz de hidrolisar o amido em uma série de dextrinas cíclicas não-redutoras, via reação de ciclização, além da produção de dextrinas de baixo peso molecular e oligossacarídeos (JEMLI et al., 2007). Há trabalhos que relatam a ação catalítica de várias CGTases comerciais ou não sobre o amido da farinha de trigo com a produção de ciclodextrinas no miolo do pão, detectadas por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (High Performance Liquid Chromatography - HPLC), confirmando que há condições favoráveis no processo de panificação para a realização da reação de ciclização (LEE et al., 2002; GUJRAL et al., 2003; SHIM et al., 2007; JEMLI et al., 2007). A aplicação de CGTase comercial no pão de farinha de arroz reduziu em 53% a firmeza do miolo do pão. Segundo Gujral et al. (2003) esse efeito antienvelhecimento é explicado em função do aumento da formação de maltooligossacarídeos higroscópicos pela ação da CGTase. Os agentes aromatizantes ou flavorizantes são geralmente substâncias voláteis, normalmente hidrofóbicas e facilmente degradadas quando não protegidas. Os complexos de encapsulação formados permitem a redução da volatilidade do aroma dos pães, aumentando o tempo de armazenamento e reduzindo as perdas, o que poderia afetar diretamente o processo de envelhecimento de pães (SZEJTLI, 1997). Recentemente, estudos foram realizados para investigar o efeito da CGTase sobre o processo de envelhecimento de pães adicionados desta enzima. Segundo Jemli et al. (2007); Shim et al. (2007), trabalhando com CGTases isoladas de Paenibacillus pabuli US132 e Saccharomyces cerevisiae mutante, respectivamente, observaram que a CGTase apresentou um efeito antienvelhecimento pela redução da firmeza dos pães durante o armazenamento. Estes autores atribuem este efeito antienvelhecimento a uma hidrólise da amilose e amilopectina em frações menores, limitando a retrogradação dessas moléculas durante o armazenamento. As ciclodextrinas liberadas pela ação da CGTase podem formar complexos com lipídios nativos do grânulo de amido ou lipídios exógenos, diminuindo assim a retrogradação da amilose. Alternativamente, as dextrinas de baixo peso produzidas pela CGTase diminuem a taxa de retrogradação do pão pelo impedimento da interação amido-glúten interferindo no envelhecimento do pão (BOYLE; HEBEDA, 1990; MARTIN; HOSENEY, 1991). 10 Lee et al. (2002); Shim et al. (2007) também estudaram o envelhecimento de pães adicionados de CGTases isoladas de Bacillus stearothermophilus ET1 e Saccharomyces cerevisiae ambos mutantes, respectivamente. A variação da entalpia de retrogradação (∆Hr) detectada pelo DSC dos pães adicionados de CGTase foi menor após sete dias de armazenamento a uma temperatura de 4ºC. Há vários trabalhos sobre a aplicação de enzimas em pães, que avaliam o retardo do envelhecimento. Esses pesquisadores observaram um efeito positivo na qualidade dos pães e na redução da firmeza do miolo durante o armazenamento. No entanto, as causas desses efeitos positivos não são conhecidas e na grande maioria dos trabalhos, nem são investigados. Este trabalho propõe avaliar os efeitos das enzimas xilanase e CGTase na produção de pães e investigar as possíveis causas para os resultados encontrados. 1.2.2. Componentes da farinha de trigo O grão de trigo é constituído de três partes principais: o germe, o endosperma e as camadas externas protetoras. O germe é o tecido responsável pelo crescimento de uma nova planta e representa 3% do peso do grão. O endosperma é usado como gênero alimentício e representa 85% do peso do grão e as camadas protetoras denominadas de camada de aleurona e farelo são responsáveis pela proteção do grão e representam 12% do peso do grão. Em termos gerais a composição química do grão de trigo é de 14% umidade, 12% de proteína, 60% de amido, 10% carboidratos não amiláceos, 2% lipídios, 2% minerais (GOESAERT et al., 2005). A classificação do trigo é necessária para fins de padronização. A Portaria nº 91, de 25 de fevereiro de 2010, do Ministério da Agricultura, Abastecimento e Pecuária (MAPA), determina como requisitos de qualidade do trigo, a força do glúten, a estabilidade, o peso hectolitro, o número de queda. O trigo, de acordo com a força do glúten ou a estabilidade será classificado nas classes determinadas na Tabela 1.1. Tabela 1.1. Classificação do trigo Classes Valor mínimo da força do glúten (10 - 4 J) Valor mínimo de Estabilidade (Tempo em minutos) Trigo Melhorador 300 15,0 Trigo Pão 220 10,0 Trigo para uso doméstico 180 7,0 Trigo Padrão 160 5,0 Trigo para outros usos Abaixo de 160 Abaixo de 5,0 Fonte: Ministério MAPA 11 No Brasil, 75% do trigo são consumidos para a produção de farinha e o restante (25%) para farelo. Da farinha produzida, 50% é destinada ao setor de panificação, 15% para massas alimentícias, 15% para biscoitos, 10% para pães industrializados e 10% para produtos domésticos (Federação das Indústrias do Estado do Paraná – FIEP, 2006). 1.2.2.1. Amido O amido é o composto mais abundante na farinha de trigo e o mais importante polissacarídeo de reserva de muitas plantas, incluindo os cereais. O grão do trigo contém 60% de amido, que se apresenta na forma de grânulos semi-cristalinos, localizados no endosperma (GOESAERT et al., 2005). É um homopolissacarídeo neutro formado por duas frações: amilose e amilopectina. A primeira é composta de unidades de glicose ligadas entre si por ligações glicosídicas α-1,4 formando assim unidades de maltose e, a segunda, por unidades de glicose unidas em α-1,4 com cadeias de glicose ligadas em α-1,6 de modo que, além de unidades de maltose, tem-se em menor proporção isomaltose nos pontos de ramificação. Enquanto a amilose é uma molécula essencialmente linear, apresentando um pequeno número de ramificações (FRENCH, 1973; HIZUKURI; TAKEDA; YASUDA, 1981; BULÉON et al., 1998), a amilopectina é uma molécula altamente ramificada, apresentando 5 a 6% de ligações α-1,6 nos pontos de ramificação (FRENCH, 1984; LINEBACK, 1984) (Figura 1.3). Figura 1.3. Estrutura da molécula de amilose e da amilopectina (Adaptado de WONG, 1989). Os grânulos de amido são estruturas semicristalinas formadas pelo arranjo na direção radial das macromoléculas lineares (amilose) e ramificadas (amilopectina). Essas moléculas formam pontes de hidrogênio, pois estão associadas paralelamente, o que resulta no 12 aparecimento de regiões cristalinas ou micelares. Assim, os grânulos são birrefringentes mostrando uma cruz de polarização (Cruz de Malta) se observados sob luz polarizada (FRANCO et al., 2001). Figura 1.4. Esquema representando a ação das enzimas amilolíticas e pululíticas (desramificadoras). Os círculos representam os monômeros de glicose, os preenchidos indicam os monômeros com carbono anomérico livre (redutores) (Adaptado de BERTOLDO; ANTRANIKIAN, 2002). A localização das enzimas no grão de trigo não é uniforme. Muitas enzimas são encontradas nas camadas externas (farelo), e no germe. Isto significa que durante a moagem do grão as enzimas são distribuídas desigualmente. O endosperma geralmente tem uma menor atividade enzimática (POUTANEN, 1997). A degradação total do grânulo de amido ocorre por uma ação combinada de várias enzimas amilolíticas que clivam as ligações glicosídicas α-1,4 e α-1,6 da molécula de amilose e da amilopectina (Figura 1.4). Na farinha de trigo existem duas enzimas naturais que são a α- amilase e a β-amilase. Normalmente, há uma variação da quantidade de α-amilase presente no trigo e na farinha em função das condições do plantio, enquanto que a quantidade de β- amilase, praticamente não se altera (POUTANEN, 1997). Em panificação o amido começa a exercer seu papel nas temperaturas entre 54ºC e 63ºC. Nessa faixa de temperatura os grânulos de amido gelatinizam e como resultado, o grânulo perde sua cristalinidade, tornando-se amorfo. Nesta fase a estrutura do grânulo é rompida e as moléculas, principalmente a amilose, é lixiviada para fora do grânulo, entretanto, no miolo do pão os grânulos de amido remanescentes ainda estão presentes, e a estrutura em 13 rede da gelatinização das moléculas de amido tem um papel vital na sua formação (SLUIMER, 2005). O amido também exerce um papel dominante no processo de envelhecimento do pão. Durante o resfriamento do pão, após o forneamento, as moléculas de amido começam a se agregar formando regiões mais cristalinas que resultam na firmeza inicial do pão. A firmeza do miolo durante o armazenamento é atribuída à agregação das moléculas de amilopectina e em menor grau das moléculas de amilose (SLUIMER, 2005). 1.2.2.2. Proteínas As proteínas também são moléculas importantes na farinha de trigo, Osborne (1924) citado por Goesaert et al. (2005) introduziu uma classificação das proteínas de plantas baseada na solubilidade usando os seguintes solventes para extração: (1) água, (2) solução salina diluída, (3) solução água-álcool e (4) solução ácida ou básica diluída. Usando este esquema de classificação, Osborne classificou as proteínas do trigo em albuminas, globulinas, gliadinas e gluteninas, respectivamente. Do ponto de vista funcional as proteínas do trigo classificam-se em dois grupos: as proteínas do glúten (gliadina e glutenina) que apresentam um papel fundamental em panificação e as proteínas “não glúten” ou “proteínas solúveis” que são aquelas que não fazem parte da formação da rede de glúten durante a mistura da farinha de trigo com água. As proteínas “não glúten” representam cerca de 20% das proteínas totais e estão localizadas principalmente nas camadas externas do grão, com baixa concentração no endosperma e tem como função serem proteínas estruturais (constituinte de membranas). As proteínas do glúten, gliadina e glutenina, são usualmente encontradas na mesma proporção no endosperma dos grãos maduros onde elas formam uma matriz contínua ao redor do grânulo de amido (GOESAERT et al., 2005). As gliadinas e gluteninas são denominadas proteínas do glúten por formarem uma rede capaz de reter o gás carbônico responsável pelo crescimento da massa e do pão. O desenvolvimento do glúten começa com o processo de mistura, onde as proteínas são umidecidas e tornam-se inchadas (absorvem água). Posteriormente, com a contínua mistura, essas moléculas interagem umas com as outras através de pontes de hidrogênio (grupos OH) e pontes dissulfeto (grupos SH) intra e intermolecular formando a rede de glúten. A presença de grupos tiol (SH) na estrutura protéica é de extrema importância para o desenvolvimento do glúten (SLUIMER, 2005) (Figura 1.5). 14 Figura 1.5. Representação esquemática das gliadinas e gluteninas na rede glúten (SLUIMER, 2005). 1.2.2.3. Carboidratos não amiláceos Os carboidratos não amiláceos do grão de trigo são representados pela celulose, lignina e hemicelulose, principalmente as arabinoxilanas. Estudos sobre a histologia do grão de trigo realizados por Pomeranz (1988) mostraram que a concentração das arabinoxilanas não é uniforme e que a maior concentração ocorre na parede celular das camadas externas do grão (farelo) e uma menor quantidade no endosperma. A concentração de arabinoxilanas (AX) na farinha de trigo varia entre 1,5-2,5%, sendo que 0,4-0,8% são de arabinoxilanas extraída com água (WE-AX) e 1,1-1,9% são de arabinoxilanas não extraídas com água (WU-AX) (COURTIN; DELCOUR, 2002). Embora as arabinoxilanas sejam consideradas constituintes menores da farinha de trigo, são importantes para a funcionalidade dos cereais nos processos biotecnológicos. As arabinoxilanas (WE-AX) apresentam um impacto significativo sobre as propriedades do pão, como volume, textura do miolo e taxa de envelhecimento (HOSENEY, 1984). As xilanases são comumente usadas para melhorar o manuseio e/ou a qualidade dos produtos a base de cereais pela degradação e/ou a modificação das arabinoxilanas nativas (SORENSEN et al., 2004). O impacto das endoxilanases sobre a funcionalidade das arabinoxilanas em panificação depende fortemente da sua especificidade pelos substratos WE-AX e/ou WU-AX (COURTIN; GELDERS; DELCOUR, 2001). Do ponto de vista da funcionalidade mencionada acima pelos substratos, pode-se entender facilmente que o uso otimizado de endoxilanases que preferencialmente atacam o substrato WU-AX, causa um impacto positivo sobre as propriedades da massa e volume do pão como apresentado na Figura 1.6. Isto se deve pela redução das WU-AX e consequentemente o aumento das WE-AX (COURTIN; ROELANTS; DELCOUR, 1999; COURTIN; GELDERS; DELCOUR, 2001). 15 Apesar dos trabalhos mostrarem que as endoxilanases causam uma significativa melhora nas características da massa e do pão, o modo de ação exato dessas enzimas ainda está em debate e há vários pontos a serem esclarecidos. Figura 1.6. Representação esquemática da degradação enzimática da arabinoxilana (AX) e o efeito das diferentes frações de AX sobre o volume do pão (COURTIN; ROELANTS; DELCOUR,1999). 1.2.3. Xilana As hemiceluloses as quais incluem as arabinoxilana, xiloglucana, β-glucana e celulose são os principais polissacarídeos da parede celular do trigo e de outros cereais (REVANAPPA; SALIMATH, 2010). Schulze (1891), citado por Bastawde (1992) introduziu o nome hemicelulose para os materiais vegetais isolados ou extraídos com soluções alcalinas. A classificação das frações da hemicelulose depende do tipo de açúcar presente na molécula. Os principais monômeros presentes na hemicelulose são a D-xilose, D-manose, D-galactose e L-arabinose. As principais fontes de hemicelulose são as culturas de cana-de-açúcar, sorgo, as culturas ricas em amido como os cereais (milho, trigo), os tubérculos (batata doce e mandioca) e os resíduos florestais (madeira) (MAGEE; KOSARIC, 1985). A hemicelulose juntamente com a celulose e a lignina constitue os principais componentes poliméricos da parede celular das plantas, interagindo entre si via ligações covalentes e não-covalentes (KULKARNI; SHENDYE; RAO, 1999; BEG et al., 2001). A xilana é o principal heteropolissacarídeo com função estrutural da parede celular da célula vegetal, e o segundo polissacarídeo mais abundante na natureza, totalizando 1/3 de toda a fonte de carbono renovável da Terra (PRADE, 1995). Solubilização xilanase Degradação xilanase Efeito positivo sobre volume do pão Efeito negativo sobre volume do pão S-AX com alto peso molecular S-AX com baixo peso molecular WE-AX com alto peso molecular WE-AX com baixo peso molecular Efeito negativo ou não sobre volume do pão 16 A estrutura da xilana é complexa e altamente ramificada. O grau de substituição e a natureza dos substituintes da cadeia lateral dependem da fonte e da espécie a partir da qual a xilana foi isolada. A cadeia principal é formada por unidades de D-xilopiranosil unidas por ligações glicosídicas β-1,4, podendo ser substituída em vários graus por glicuronopiranosil, 4- O-metil-D-ácido glicurônico, α-L-arabinofuranosil (arabinoxilanas), acetil, ácido ferúlico e/ou p- cumário como grupo lateral (KULKARNI; SHENDYE; RAO, 1999; LI et al., 2000). Segundo Timell (1964), na madeira dura a xilana existe como O-acetil-4-O- metilglicuronoxilana (Figura 1.7). Este polissacarídeo apresenta no mínimo 70 resíduos de β- xilopiranose unidas por ligações glicosídicas β-1,4. De acordo com Bouveng (1961), a acetilação dessas xilanas ocorre mais freqüentemente na posição C-3 do que na C-2 da molécula de xilose, mas a acetilação em ambas as posições já foram relatadas. A presença dos grupos acetil é responsável pela solubilidade parcial da xilana em água. 1 Figura 1.7. Composição da O-acetil-4-O-metilglicuronoxilana (xilana de madeira dura) (SUNNA; ANTRANIKIAN, 1997). Xilanas de madeira macia não são acetiladas e, portanto, são compostas por arabino-4- O-metilglicuronoxilana. Os resíduos de ácidos 4-O-metilglicurônico estão localizados na posição C-2 nos resíduos de xilose, enquanto, os resíduos de α-L-arabinofuranose estão unidos por meio de ligações glicosídicas α-1,3 na posição C-3 da molécula de xilose (Figura 1.8). As xilanas de madeira por apresentarem como grupo lateral o ácido glicurônico são conhecidas como glicuronoxilanas (PULS; SCHUSEIL, 1993). Segundo Kulkarni; Shendye; Rao (1999) o grau de polimerização e a quantidade de ramificações também variam. Xilanas de madeiras duras apresentam um maior grau de polimerização (150-200 resíduos de β-xilopiranose) e são mais ramificadas do que as xilanas de madeiras macias (70-130 resíduos de β-xilopiranose). Nos cereais as xilanas são tipicamente conhecidas como arabinoxilanas (arabinose/xilose - AX) que são xilanas que apresentam como grupo substituinte moléculas de L-arabinose ligadas ao carbono C-2 e/ou C-3 da xilose através de uma ligação glicosídica α-1,2 e/ou α-1,3 (Figura 1.9). Arabinoxilanas de cereais, também conhecidas como pentosanas, são mais solúveis em água e em solução alcalina do que as xilanas de materiais lignocelulósicos 17 devido a sua estrutura ramificada (KULKARNI; SHENDYE; RAO, 1999). Em xilanas de cereais, o substituinte arabinose pode ser esterificado com grupos fenólicos como o ácido ferúlico e o ácido p-cumárico (MÜLLER-HARVEY et al.,1986). Figura 1.8. Composição da arabino-4-O-metilglicuronoxilana. (madeira macia) (SUNNA; ANTRANIKIAN, 1997). Figura 1.9. Elementos estruturais da arabinoxilana. (A): resíduo de D-xilopiranose; (B) e (D): resíduo de D-xilopiranose substituído com resíduos de L-arabinose ligadas no C-2 e C-2 e C-3, respectivamente; (C): resíduo de arabinoxilana com substituinte L-arabinose esterificado com ácido ferúlico por meio de ligação éster (COURTIN; DELCOUR, 2002). Barry; Dillon (1940); Nunn; Parolis; Russel (1973); Eda; Ohnishi; Kato (1976), citados por Collins; Gerday; Feller (2005) em um artigo de revisão, afirmam que a xilana de cadeia linear, ou seja, sem grupos substituintes são encontradas em tabaco e em certas algas marinhas, onde os resíduos de xilopiranose são unidos por ligações β-1,3 e β-1,4 As arabinoxilanas presentes nos cereais estão localizadas na parede celular do farelo e do endosperma e na matriz que mantém as células unidas no grão. Segundo Courtin; Delcour 18 (2002) elas podem ser divididas em arabinoxilanas extraídas ou solúveis em água (water- extractable arabinoxylan - WE-AX) e arabinoxilanas não extraídas ou insolúveis em água (water-unextractable arabinoxylan - WU-AX). A formação de pontes de hidrogênio entre as arabinoxilanas e a água, é influenciada pela presença de arabinose nas cadeias ramificadas. A arabinose unida por ligações glicosídicas nas posições C-2 e/ou C-3 do monômero de xilose, tornam as arabinoxilanas mais hidrossolúveis. O grau de ramificação das arabinoxilanas pode influenciar a atuação das enzimas devido a um impedimento estérico (ROUBROEKS et al., 2001). Os açúcares que compõem as arabinoxilanas extraídas com em água (WE-AX) são xilose e arabinose, enquanto, as arabinoxilanas não extraídas com água (WU-AX) são compostas pela xilose, arabinose e glicose. Há diferenças entre essas duas moléculas no que se refere ao grau de ramificação, de polimerização e ao peso molecular, sendo que nas arabinoxilanas insolúveis (WU-AX) essas características são sempre superiores (ELIASSON; LARSSON, 2007). Segundo Courtin; Delcour (2002) cerca de 30% das arabinoxilanas encontradas na parede celular do endosperma da farinha de trigo são extraídas com água (WE-AX), devido a estas moléculas estarem superficialmente ligadas na parede celular. Ao contrário, as arabinoxilanas não extraídas com água (WU-AX), não são isoladas facilmente da parede celular devido às interações covalentes e não-covalentes com outras moléculas de xilanas ou interações com outros constituintes como proteínas, lignina ou celulose (LIYAMA; LAM; STONE, 1994). Quando as arabinoxilanas não extraídas com água (WU-AX) são tratadas com solução alcalina, as ligações que estabilizam as moléculas de arabinoxilanas são rompidas. A maior parte das arabinoxilanas WU-AX fica livre na matriz da parede celular e assim pode ser isolada pela água. Essas arabinoxilanas são conhecidas como arabinoxilanas solúveis em soluções alcalinas (alkali-solubilised arabinoxylan – AS-AX) (GRUPPEN; HAMER; VORAGEN, 1992). Outra maneira de isolar as arabinoxilanas não extraídas com água (WU-AX) é hidrolisá- las em moléculas menores pelo uso de enzimas xilanolíticas que degradam as ligações glicosídicas da cadeia principal. A hidrólise enzimática libera os carbonos C-1 e C-4 (hidrogenando-os) envolvidos nas ligações glicosídicas, tornando as arabinoxilanas solúveis em água. Essas arabinoxilanas são conhecidas como arabinoxilanas solubilizadas enzimaticamente (enzyme-solubilised arabinoxylan – ES-AX) (COURTIN; DELCOUR, 2001). 1.2.3.1. Enzimas xilanolíticas Xilanases (EC 3.2.1.8) são enzimas hidrolíticas que quebram as ligações glicosídicas da cadeia principal e das cadeias laterais do polissacarídeo xilana presente na parede celular das 19 células vegetais. Existem várias dessas enzimas, as quais exibem diversas particularidades, como: mecanismo de ação, especificidade por substratos, atividades hidrolíticas (produção, velocidade de reação e produtos formados) e características físico-químicas (COLLINS; GERDAY; FELLER, 2005). A maioria das enzimas xilanolíticas é sintetizada por bactérias e fungos, mas também podem ser encontradas em plantas, algas marinhas, protozoários, gastrópodes e artrópodes (DEKKER; RICHARDS 1976; PRADE, 1995). O primeiro relato dessas enzimas foi em 1955, quando elas foram originalmente denominadas de pentosanases e foram reconhecidas pela União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular (International Union of Biochemistry and Molecular Biology – IUBMB). Em 1961 as xilanases foram reconhecidas pelo Comitê de Enzima e identificadas pelo número de classificação (EC) (COLLINS; GERDAY; FELLER, 2005). Wong; Tan; Saddler (1988) classificaram as xilanases microbianas em dois grupos, baseando-se em suas propriedades físico-químicas, como massa molecular e ponto isoelétrico, mais do que em suas diferenças nas propriedades catalíticas. O primeiro grupo consiste de enzimas com massa molecular maior que 40 kDa e baixos valores de ponto isoelétrico (predominância de aminoácidos ácidos), enquanto que o segundo grupo é formado por enzimas com massa molecular menor que 40 kDa e altos valores de ponto isoelétrico (predominância de aminoácidos básicos), mas exceções existem. De acordo com Subramaniyan; Prema (2002) a heterogeneidade e a complexidade da xilana, requer um amplo complexo de enzimas atuando cooperativamente para hidrolisar este heteropolissacarídeo (Figura 1.10). Dekker; Richards (1976); Wong; Tan; Saddler (1988) observaram que as β-1,4-D- endoxilanases (EC 3.2.1.8) quebram internamente as ligações glicosídicas β-1,4 da cadeia principal da xilana, resultando em produtos com menor grau de polimerização como os xilooligossacarídeos, os quais podem ser hidrolisados a moléculas menores como xilotriose, xilobiose e xilose. Deste modo, a ação desta enzima afeta drasticamente a massa molecular e a solubilidade das arabinoxilanas e consequentemente sua funcionalidade. Para Sunna; Antranikian (1997), o ataque da enzima não é aleatório e a hidrólise das ligações glicosídicas depende da natureza do substrato como comprimento da cadeia e grau de ramificação. Segundo Dekker; Richards (1976), algumas β-1,4-D-endoxilanases podem liberar como produto a arabinose e serem chamadas de enzimas desramificadoras. O fungo termofílico Thermoascus aurantiacus produz quantidades significativas de endoxilanases termoestáveis quando cultivado sobre fermentação sólida usando farelo de trigo como fonte de carbono. Duas endoxilanases foram purificadas e caracterizadas a partir deste fungo (KALOGERIS et al., 1998). 20 Figura 1.10. (A): Enzimas xilanolíticas envolvidas na degradação da xilana. (B): Hidrólise de xilooligossacarideo pela β-xilosidase (COLLINS; GERDAY; FELLER, 2005). As β-1,4-D-xilosidases (EC 3.2.1.37) são exoenzimas que hidrolisam preferencialmente xilooligossacarídeos e xilobiose a partir da extremidade não redutora da molécula para liberação de xilose como produto final (WONG; TAN; SADDLER, 1988). Estudos têm mostrado que a incubação da β-xilosidase de Aspergillus awamori não é capaz de liberar quantidades significativas de xilose a partir da xilana, mas quando incubada com xilobiose, xilotriose e xilotetrose é acompanhado pela formação de xilose como produto principal (KORMELINK et al., 1992). Apesar da importância do papel das arabinosidases ou arabinofuranosidase na hidrólise da xilana, apenas poucas enzimas têm sido isoladas e caracterizadas. Existem dois tipos de arabinosidases, as exoenzimas α-L-arabinofuranosidases (EC 3.2.1.55), a qual é ativa sobre os grupos L-arabinofuranosil nos pontos de ramificação da xilana que são unidas aos resíduos de xilose por ligações α-1,2 e/ou α-1,3. O segundo grupo são as endoenzimas 1,5-α-L- arabinofuranosidase (EC 3.2.1.99), que hidrolisam os resíduos de L-arabinofuranosil unidos entre si por ligações α-1,5. Esta estrutura incomum da arabinoxilana é encontrada em sementes de agrião (VAN DER VEEN et al., 1992). Outra enzima do sistema xilanolítico é a α-D-glicuronidase (EC 3.2.1.-) que hidrolisa as ligações glicosídicas α-1,2 entre o ácido glicurônico e os resíduos de xilose das glicuronoxilanas. Apesar do papel importante das α-glicuronidases na biodegradação da xilana, poucas enzimas têm sido relatadas até agora (SUNNA; ANTRANIKIAN, 1997). 21 A especificidade da α-glicuronidase ao substrato varia de acordo com a fonte enzimática, por exemplo, enzimas isoladas de Agaricus bisporus e Streptomyces olivochromogenes requerem o substrato glicuronoxilana de baixo peso molecular. Estas enzimas liberam ácido 4-O-metilglicurônico a partir do substituinte 4-O-metilglicuronose de xilooligossacarídeos, mas não a partir da xilana. Entretanto, a presença de grupos acetil próximos aos grupos substituintes retarda a ação da α-glicuronidase produzida pelo Agaricus bisporus (PULS; SCHMIDT; GRAZOW, 1987; JOHNSON et al, 1989). Acetilxilana esterase (EC 3.1.1.6) remove os substituintes O-acetil da posição C-2 e C-3 dos resíduos de xilose nas xilanas acetiladas (acetilxilanas) (SUNNA; ANTRANIKIAN, 1997). Biely; Puls; Schneider (1985) foram os primeiros a relatarem a presença da acetilxilana esterase em microrganismos. Segundo Tenkanen; Poutanen (1992), a principal razão para a descoberta tardia desta enzima foi a falta de substrato adequado, já que as xilanas altamente acetiladas no seu estado natural perdiam os grupos acetil devido ao isolamento da xilana com soluções alcalinas. A atividade da acetilxilana esterase foi relatada como sendo parte do sistema xilanolítico de Trichoderma reesei e Schizophyllum commune (BIELY; PULS; SCHNEIDER, 1985). Os primeiros pesquisadores a relatarem as enzimas desramificadoras ácido ferúlico esterase (EC 3.1.1.-) e ácido p-cumárico esterase (EC 3.1.1.-) foram Mackenzie e Bilous, (1988). A enzima ácido ferúlico esterase hidrolisa as ligações ésteres entre os substituintes arabinose e ácido ferúlico na xilana. Similarmente a enzima ácido p-cumárico esterase hidrolisa as ligações ésteres entre a arabinose e o ácido p-cumárico na mesma molécula (MÜLLER- HARVEY et al., 1986; MACKENZIE; BILOUS, 1988). As xilanases originadas de fungos são classificadas em dois grupos: as xilanases desramificadoras que liberam arabinoses localizadas nas cadeias laterais das arabinoxilanas (Figura 1.10) e as xilanases não desramificadoras, as quais não liberam arabinose durante a catálise enzimática. (REILY, 1981). Muitas xilanases originadas de fungos como Neurospora crassa, Aspergillus niger e Streptomyces roseiscleorticus liberam arabinose do polissacarídeo arabinoxilana durante a catálise enzimática (TAKENISHI; TSUJISAKA, 1973; MISHRA; KESKAR; RAO, 1984). Entretanto, xilanases originadas de Trichoderma harzianum e outros fungos do grupo A. niger não liberam arabinose livre a partir das arabinoxilanas (WONG et al., 1986). Geralmente, arabinoxilanas altamente ramificadas interferem na atividade da xilanase, mas essas enzimas apresentam uma maior afinidade pelas ligações da cadeia principal, perto dos pontos de ramificação. A especificidade das xilanases pelos substratos pode ser devido às diferenças entre os resíduos de aminoácidos envolvidos no sítio catalítico (DEKKER; RICHARDS, 1976). O mecanismo enzimático proposto para a hidrólise das arabinoxilanas pela xilanase ocorre pelo processo catalítico ácido-base. O glutamato Glu172 é o catalisador ácido-base e o 22 Glu78 é o nucleófilo. A ligação glicosídica é quebrada pelo ataque nucleófilo do Glu78 do sítio ativo da enzima. O carbono 4 (C-4) permanece com o oxigênio que estava envolvido na ligação glicosídica e é estabilizado pela transferência de um próton do Glu 172, enquanto o carbono 1 (C-1) forma um intermediário com o Glu78. Na etapa seguinte da catálise o nucleófilo Glu78 é deslocado pela água (hidrólise) com a formação de uma hidroxila no carbono glicosil (C-1) e o outro hidrogênio da molécula de água é transferido para o Glu 172. Todas as xilanases mantêm a configuração anomérica do oxigênio glicosídico (C-1), isto indica que estas enzimas usam um mecanismo de duplo deslocamento (MIAO et al., 1994; DAVIES, HENRISSAT, 1995) (Figura 1.11). Figura 1.11. Mecanismo de reação das xilanases. A: estrutura em hélice da xilana é posicionada no sítio ativo da enzima entre o Glu172 (catalisador ácido-base) e o Glu78 (nucleófilo); B: A glicona (xilobiose) é ligada no Glu78. Este intermediário permanece no sítio ativo da enzima durante a reação de transglicosilação; C: A água desloca o nucleofílico; D: Dissociação e da aglicona (xilobiose) do sítio ativo permitindo um movimento enzimático para uma nova posição do substrato. (JEFFRIES, T. W, 1996). 1.2.3.2. Produção de xilanases termofílicas Na indústria de alimentos, há vários anos, as enzimas de microrganismos são usadas em processos como: panificação, produção de álcool, produção de queijo, clarificação de sucos e cervejas entre outros. O avanço das pesquisas sobre as características físico-químicas e de 23 purificação das enzimas, tem possibilitado o surgimento de novas aplicações enzimáticas na indústria (DEMIRIJAN et al., 2001). Em panificação a maioria dos estudos mostra a aplicação de xilanases mesofílicas sobre a melhoria da qualidade de pães e pouco se encontra com relação à xilanases termofílicas (KATINA et al., 2006; CABALLERO; GÓMEZ; ROSELL, 2007). Uma vantagem do uso de xilanase termoestável adviria de sua ação continuada mesmo a temperaturas superiores a temperatura de gelatinização do amido. Outra vantagem importante do uso de enzimas termofílicas nos processos industriais que requerem altas temperaturas é a diminuição dos riscos de contaminação microbiológica, comum quando se utiliza microrganismo mesofílico no processo (BECKER, 1997). Segundo Kumar; Nussinov, (2001) os microrganismos termofílicos sintetizam proteínas e enzimas que são resistentes à desnaturação por altas temperaturas e à proteólise, devido à presença de um número maior de forças estabilizadoras como as interações eletrostáticas, pontes dissulfeto, pontes de hidrogênio e interações hidrofóbicas. Para Everly; Alberto, (2000) a resistência a altas temperaturas e a proteólise é devido aos ácidos graxos saturados que compõem a membrana celular desses microrganismos. Essas moléculas podem se agrupar de forma uniforme em arranjos quase cristalinos, e por esse motivo apresentam ponto de fusão maior que dos ácidos graxos insaturados, fornecendo assim, um ambiente seguro para a célula que permanece íntegra para viver a altas temperaturas. Um melhor entendimento da capacidade que as proteínas e enzimas de microrganismos termofílicos têm de resistir a altas temperaturas faz-se necessário, e isso pode ser possível com o uso de novas metodologias que indiquem claramente as diferenças na estrutura dessas moléculas nos organismos termofílicos e mesofílicos. Fungos filamentosos como o Thermoascus aurantiacus são particularmente interessantes para a produção de xilanases do ponto de vista da indústria, devido ao fato deles excretarem as enzimas que degradam a xilana para o meio extracelular, eliminando assim a necessidade da ruptura celular para obtenção das enzimas. Além do mais, a produção de xilanases a partir de culturas de fungos é maior do que a partir de culturas de bactérias. Os fungos sintetizam uma variedade de xilanases que são necessárias para uma completa degradação da xilana (HALTRICH et al., 1997). Kohilu et al. (2001), relataram que membros da família Bacillus sp., Streptomyces sp., Thermoascus aurantiacus e Fusarium proliferatum sintetizam xilanases que catalisam reações à temperatura ótima entre 50 ºC e 80 ºC. Em geral, o conhecimento dos parâmetros como temperatura, pH, estabilidade enzimática e cinética, entre outros, são importantes para a aplicabilidade industrial satisfatória de qualquer enzima. 24 1.2.3.3. Aplicação industrial das xilanases As enzimas que degradam a xilana têm atraído muita atenção nos últimos anos devido a sua importante aplicação prática em vários processos industriais, incluindo a modificação de gêneros alimentícios a base de cereais, melhoramento da digestibilidade das rações oferecidas a animais, clareamento de bebidas como cervejas e sucos, branqueamento da polpa do papel, reciclagem de resíduos agrícolas e florestais e produção de biocombustível entre outros (SORENSEN et al., 2004). As hemicelulases são enzimas endógenas dos cereais principalmente do trigo. É um grupo de enzimas relativamente novo no que se refere a sua aplicação na indústria de panificação (SLUIMER, 2005). O uso de xilanases selecionadas no processo de panificação provoca mudanças na reologia da massa como: tempo de desenvolvimento, consistência, extensibilidade e resistência à quebra. Essas mudanças podem ser vistas no produto final, o pão, principalmente como o melhor desenvolvimento do volume e estrutura do miolo (POUTANEN, 1997; COURTIN, GELDERS, DELCOUR, 2001). As xilanases também podem influenciar as propriedades nutricionais dos alimentos a base de cereais, pela modificação da população dos carboidratos não amiláceos. Segundo Haskell et al. (1992); Glore et al. (1994) as arabinoxilanas solúveis em água são associadas a efeitos benéficos à saúde como: diminuição dos níveis de colesterol associado à redução dos riscos de doenças do coração e diabetes tipo II. As arabinoxilanas presentes nas dietas de aves domésticas a base de cereais como aveia, arroz e trigo são conhecidas por contribuir para o seu efeito antinutritivo, o qual está relacionado à propriedade das arabinoxilanas em aumentar a viscosidade das rações, dificultando a absorção intestinal dos nutrientes. As xilanases adicionadas ao processo de fabricação das rações degradam as arabinoxilanas da parede celular dos cereais, resultando num aumento à acessibilidade dos nutrientes e/ou a liberação de fragmentos de xilana considerados prebióticos (CHOCT; ANNISON, 1990). Na indústria de bebidas, como a de cervejas, vinhos e sucos, as xilanases são adicionadas ao processamento para proporcionar uma diminuição da viscosidade, redução da opacidade e aumento da capacidade de ligação dos fragmentos de arabinoxilanas à água melhorando a filtração e prevenindo o entupimento das membranas filtrantes (SORENSEN et al., 2004). Viikari et al. (1987) foram os primeiros a demonstrarem com detalhes que o tratamento da polpa de papel com hemicelulases, especialmente as xilanases reduz o requerimento de cloro para o branqueamento do papel. As xilanases degradam a xilana dentro da polpa do papel e rompem as fortes associações entre a celulose, lignina e hemicelulose permitindo assim, o acesso dos produtos químicos. 25 Anualmente toneladas de resíduos agroindustriais e florestais são geradas na natureza, sendo essa biomassa formada de celulose, lignina e hemicelulose, mas há vários anos, as xilanases estão sendo utilizadas como uma alternativa para reciclar esses resíduos. As xilanases juntamente com outras enzimas como as manases, ligninases, e celulases são empregadas para a geração de biocombustíveis como o etanol e o xilitol (GALBE; ZACCHI, 2002). 1.2.4. Ciclodextrina Villiers (1891), citado por Brewster; Loftsson (2007) foi o primeiro a relatar a existência de dextrina a partir da hidrólise de amido por Bacillus amylobacter, ele as denominou de “celulosina”, por sua semelhança com a celulose no que diz respeito à resistência à hidrólise ácida e por ser uma molécula não-redutora. Posteriormente Schardinger (1903), citado por Brewster; Loftsson (2007) observou que uma linhagem de bactérias isoladas de alimentos deteriorados fermentava o amido com a produção de dois compostos cristalinos que ele distinguiu pela reação de iodo como sendo α-dextrina e β-dextrina. Schardinger identificou a β- dextrina como sendo a “celulosina” identificadas anteriormente por Villiers. Hoje estes compostos são denominados de ciclodextrinas ou menos comumente de ciclomaltodextrina. A γ-ciclodextrina foi primeiramente descrita em 1935 por Freudenberg; Jacobi. Em 1938 Freudenberg; Cramer, citado por Brewster; Loftsson (2007) identificaram a estrutura química das ciclodextrinas, suas propriedades físico-químicas e sua capacidade de formar complexos de inclusão. Nos anos que se seguiram a descoberta de Freudenberg; Cramer (1935), apenas pequenas quantidades de CDs foram produzidas, prejudicando a exploração pela indústria desses novos oligossacarídeos. O avanço biotecnológico na década de 1970 e a comprovação da não toxicidade das CDs direcionaram as pesquisas para uma melhora dramática na produção em grande escala das três formas de ciclodextrina pura, transformando um processo químico caro e peculiar em um processo acessível (OGUMA; KAWAMOTO, 2003). As ciclodextrinas (CDs) são oligossacarídeos cíclicos derivado da molécula de amido ou maltodextrina, contento seis (α-CD), sete (β-CD), oito (γ-CD), nove (δ-CD), dez (ε-CD) ou mais resíduos de glicose unidos por ligações glicosídicas α-1,4, respectivamente. Devido a forma de cadeira das unidades glicopiranosil, as CDs apresentam uma forma de cone truncado ao invés de um cilindro perfeito (Figura 1.12) (LARSEN, 2002). Os grupos hidroxil (OH) são orientados para o exterior do cone, com os grupos OH primários dos resíduos de glicose na borda estreita do cone e os grupos OH secundários na borda ampla do cone. A cavidade central da ciclodextrina é linear formada pelo esqueleto carbônico e moléculas de oxigênio dos resíduos de glicose, o que fornece um caráter 26 relativamente hidrofóbico à cavidade. Os grupos hidroxil formam pontes de hidrogênio com moléculas de água circunvizinhas, resultando na hidratação da estrutura da molécula da ciclodextrina (LOFTSSON; BREWSTER, 1996; WINKLER et al., 2000). Em virtude da estrutura geométrica das ciclodextrinas com a cavidade interna hidrofóbica e a região externa hidrofílica, é possível a formação de complexos de inclusão cristalinos com uma variedade de compostos sólidos, líquidos e gasosos. Esse fenômeno é denominado de encapsulação ou interação molecular (YU; AOKI; MISAWA, 1988). Figura 1.12. Estrutura físico-química das α, β e γ-CDs (VENTURINI et al., 2008). As moléculas interagem com as ciclodextrinas através de ligações não covalentes simultâneas tais como: pontes de hidrogênio, interações eletrostáticas, forças de van der Waals, interações hidrofóbicas, interações dipolo-dipolo, transferências de cargas e efeitos estéreos. A formação de complexos de inclusão altera significativamente as características da molécula encapsulada. Estas alterações incluem modificações na reatividade química, fixação de substâncias voláteis, melhoria na solubilidade, estabilização de substâncias sensíveis à luz, calor e oxidação, proteção da degradação de substâncias por microrganismos, mascaramento de corantes ou pigmentos e de uma ampla variedade de compostos usados em alimentos, fármacos, cosméticos, produtos agrícolas e indústria química (SZEJTLI, 1992; BIWER; ANTRANIKAN; HEINZLE, 2002; VENTURINI et al., 2008). O mecanismo completo da formação dos complexos de inclusão é realizado em várias etapas, as quais envolvem a dessolvatação do substrato e a dessolvatação interna da ciclodextrina, mudanças conformacionais do receptor e do substrato, interação receptor- substrato, uma reorganização do solvente em torno e no interior da cavidade e a relaxação estrutural do complexo (LIPKOWITZ, 1998; REKHARSKY; INOUE, 1998; LO MEO et al., 2003). Tabushi et al. (1978) afirmaram que a estabilização do complexo da CD com o substrato por forças de van der Waals e a remoção da água de solvatação do substrato apolar são 27 fatores responsáveis pela entalpia de inclusão. O aumento da entropia devido à quebra da estrutura de solvatação do substrato apolar fornece a energia necessária para estabilizar o complexo de inclusão (LIPKOWITZ, 1998). Grupos carregados, como amônio e carboxilato, ou grupos hidrofílicos, como hidroxila, amino e carboxila, permanecem expostos à solvatação do meio mesmo após a inclusão em ambiente hidrofílico (ROSS; REKHARSKY, 1996). Entre as três ciclodextrinas, a β-CD é a de maior interesse, devido ao tamanho da sua cavidade hidrofóbica a qual é adequada para acomodar muitas moléculas semelhantes a compostos aromatizantes e drogas (SZEJTLI, 1992; DOUKYU; KUWAHARA; AONO, 2003). 1.2.4.1. Ciclodextrina glicosiltrasferase (CGTase) A ciclodextrina glicosiltransferase (EC 2.4.1.19, CGTase) é uma enzima que catalisa uma reação de transglicosilação intramolecular ou ciclização da molécula de amido e/ou da molécula de maltodextrina linear produzindo produtos denominados de ciclodextrinas (CDs) (BLACKWOOD; BUCKE, 2000). As CGTases também catalisam outras duas reações: a reação de acoplamento que é reversa a ciclização, onde as ciclodextrinas são clivadas e transferidas a um receptor linear (dextrinas lineares) e a reação de desproporcionação no qual dois oligossacarídeos lineares são convertidos em dois oligossacarídeos lineares de tamanhos diferentes (Van Der Veen, 2000). Em adição, estas enzimas possuem também uma fraca atividade hidrolítica, onde o amido é hidrolisado a dextrinas lineares e a água é o aceptor glicosil (BLACKWOOD; BUCKE, 2000; JEMLI et al., 2007) (Figura 1.13). Figura 1.13. Reações catalisada pela CGTase. Os hexágonos representam os monômeros de glicose, os preenchidos indicam os monômeros com carbono anomérico livre (redutores). (A) ciclização, (B) acoplamento, (C) desproporcionação, (D) hidrólise. (Adaptado de VAN DER VEEN, et al, 2000). A D C B ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ H2O ++++ 28 As CGTases são enzimas extracelulares e são sintetizadas por uma variedade de microrganismos, incluindo bactérias e recentemente também foram descobertas em archaea (Bacillus, Brevibacterium, Clostridium, Corynebacterium, Klebsiella, Micrococcus, Pseudomonas, Thermoanaerobacter e Thermoanaerobacterium). Todas as CGTases produzem uma mistura de α, β e γ-ciclodextrina por meio da reação de ciclização e a produção de diferentes ciclodextrinas e suas proporções dependem das condições de reação e principalmente da fonte microbiana da enzima. Deste modo, as CGTases podem ser classificadas de acordo com sua principal ciclodextrina produzida, alfa, beta ou gama- ciclodextrina. (BLACKOOD; BUCKE, 2000; VENTURINI et al., 2008). Enzimas que sintetizam predominantemente um tipo de CD são ideais para a aplicação industrial, pois o processo de separação de uma mistura de CDs é caro. Atualmente muitas CGTases são geneticamente modificadas para melhorar a produção e seletividade das ciclodextrinas (BIWER; ANTRANIKIAN; HEINZLE, 2002) A atividade da CGTase é comumente verificada usando a propriedade que a β-CD sintetizada pela ação da CGTase tem de formar complexos de inclusão coloridos com a fenolftaleína em pH básico. Assim, a concentração de β-CD é estimada espectrofotometricamente. Os tubos contendo os complexos de inclusão apresentam uma coloração mais clara com relação aos tubos onde não há formação do complexo, neste caso a fenolftaleína assume sua cor característica em pH básico (vermelho intenso) (USANOV et al., 2007). 1.2.4.2. Produção e aplicação industrial da ciclodextrina Comumente as CDs são industrialmente produzidas por dois tipos de processos distintos: o primeiro processo envolve o uso solvente e o outro processo não. No primeiro uma molécula orgânica principalmente o tolueno, álcool etílico ou acetona são usados para complexar e precipitar as CDs liberadas pela ação da CGTase. No segundo processo o agente complexante não é adicionado, portanto, uma mistura de diferentes CDs é formada. O segundo processo foi desenvolvido para a produção de β-CD, por esta ser uma molécula menos solúvel que pode ser facilmente separada das outras formas de CDs pelo processo de cristalização (BIWER; ANTRANIKIAN; HEINZLE, 2002). As ciclodextrinas produzidas pelo processo sem agentes complexantes orgânicos podem ser aplicadas na indústria de alimentos sem restrição, enquanto as CDs produzidas com adição de solventes apresentam várias desvantagens como toxicidade, inflamabilidade e o solvente têm que ser recuperado no final do processo por uma questão econômica (VAN DER VEEN et al., 2000; BIWER; ANTRANIKIAN; HEINZLE, 2002). 29 A produção e seletividade das CDs dependem do substrato, da origem da CGTase, do agente complexante e das condições de reação. O amido consiste de amilose e amilopectina, ambas servem como substrato para a CGTase (BLACKOOD; BUCKE, 2000; GRULL; STIFTER, 2001). Para a produção industrial das ciclodextrinas o amido de batata é o mais usado. O amido de milho contém alto teor de amilose (25%), mas a presença de complexos de amilose- lipídeos nos amidos de cereais, é um fator que dificulta o sucesso da ação da CGTase na conversão em ciclodextrina. Já o amido de mandioca e milho ceroso são substratos ideais para a ação da CGTase. (GRULL; STIFTER, 2001; BIWER; ANTRANIKIAN; HEINZLE, 2002; ALVES-PRADO et al., 2008). As CDs são normalmente vendidas como um pó fino e cristalino, o qual permanece estável por um longo tempo. Devido à fácil purificação, o preço da β-CD tem diminuído significativamente, enquanto, a α-CD e a γ-CD ainda são caras para a aplicação industrial (BIWER; ANTRANIKIAN; HEINZLE, 2002). Como já mencionado anteriormente, as ciclodextrinas (CDs) são capazes de formar complexos de inclusão com várias moléculas hidrofóbicas, alterando suas propriedades físico- químicas. Esta característica faz as CDs atrativas para aplicação em diferentes campos como a indústria de alimentos, químicas, farmacêuticas e têxteis, na agricultura e proteção ambiental (BIWER; ANTRANIKIAN; HEINZLE, 2002; BREWSTER; LOFTSSON, 2007). A β-ciclodextrina é mais usada na indústria para a formação de complexos de inclusão, devido á facilidade de produção, pois é mais estável e menos solúvel em água, sendo assim mais fácil sua separação das outras CDs. Em adição, a produção de β-ciclodedextrina a partir de amido é maior que as outras CDs (BONILHA, et al., 2006) Um dos aspectos que seguramente reveste as CDs de grande importância para serem potencialmente aplicadas em processos industriais refere-se à solubilidade de moléculas insolúveis em água. Na indústria farmacêutica as CDs são usadas para solubilizar e dissolver drogas, por exemplo: Uzqueda et al. (2006) analisaram as interações do antifúngico naftifina com β-CD e γ-CD, e observaram um aumento na solubilidade do fármaco em 5 e 2 vezes, respectivamente. A resolução nº 205 da ANVISA (Agencia Nacional de Vigilância Sanitária) regulamenta o uso de enzimas e preparações enzimáticas na produção de alimentos destinados ao consumo humano. As enzimas são consideradas coadjuvantes de tecnologia, capazes de provocar alterações desejáveis nas características de um alimento, e são classificadas quanto a sua origem: como animal, vegetal e microbiana. No caso de enzimas e preparações enzimáticas que contenham enzima de origem microbiana, deve-se constar o nome do microrganismo que deu origem à enzima e não devem ser utilizados microrganismos patogênicos na sua produção (BRASIL, 2006). 30 Os alimentos que contém em sua formulação ácidos graxos insaturados, como óleos de peixe e óleos vegetais, corantes naturais ou artificiais são facilmente degradados pela luz, oxigênio, calor e processos de descongelamento, resultando em produtos com sabor, odor e aparência desagradáveis. Estas alterações nos alimentos podem ser reduzidas e até mesmo evitadas pela complexação desses ingredientes com as ciclodextrinas (HEDGES, 1998). Alimentos coloridos com ingredientes naturais como o ketchup, apresentou alta estabilidade a temperatura de até 100ºC quando adicionado de 0,2% de β-CD (KAWASHIMA, 1980). Neste trabalho a β-CD encapsulou a molécula de licopeno e evitou sua degradação pelo calor. Outra aplicação interessante das CDs em alimentos é quando estas são usadas para reduzir a perda de aroma e inibir o crescimento microbiológico durante o armazenamento. A interação de aromas com as CDs é ainda de especial interesse para a indústria de alimentos (TOBITSUKA; MIURA; KOBAYASHI, 2005). A adição de CDs em alimentos emulsificados como maioneses e queijos podem aumentar a retenção de água e a vida útil do produto. Em processamento de produtos cárneos as CDs também aumentam a retenção de água e melhoram a textura (OTA; TAKEDA, 1981). O sabor amargo de fármacos, alimentos ou de qualquer outra substância dissolvida em solução aquosa ou na saliva, pode ser reduzido ou totalmente eliminado se o componente amargo formar um complexo de inclusão com uma CD apropriada (SZEJTLI; SZENTE, 2004). Na indústria de cosméticos, vitaminas lipossolúveis como retinol e tocoferol são produtos essenciais para o embelezamento da pele, mas por serem compostos naturais podem sofrer degradação induzida por oxidação e pela luz. A formação do complexo de inclusão desses compostos com as ciclodextrinas protege-os contra a degradação (ZHAOFENG et al., 2007). Na indústria química, as CDS podem ser usadas em processos de separação devido a sua habilidade de discriminar isômeros posicionais, grupos funcionais, homólogos e enantiômeros (HAN, 1997). As ciclodextrinas também são aplicadas no setor agrícola e na proteção do meio ambiente. Complexos de inclusão podem ser formados com vários produtos agrícolas incluindo herbicidas, agentes reguladores de plantas, inseticidas e fungicidas, reduzindo assim, a toxicidade dos produtos químicos agrícolas e permitindo uma liberação controlada destes no meio ambiente. Atualmente a proteção ambiental é uma preocupação constante e as CDs vêm sendo usadas para complexar moléculas poluentes e metais pesados do solo, água e atmosfera (ZHAOFENG et al., 2007). 31 1.3. Referências ALVES-PRADO, H. F; CARNEIRO, A. A. J; PAVEZZI, F; C; GOMES, E; BOSCOLO, M; FRANCO, C. M. L; DA SILVA, R. Production of cyclodextrins by CGTase from Bacillus clausii using different starches as substrates. Applied Biochemistry And Biotechnology, v. 146, p. 3-13, 2008. BASTAWDE, K. B. Xylan structure, microbial xilanases, and their mode of action. World Journal of Microbiology and Biotechnology, v. 8, p. 253-368, 1992. BECKER, P. 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