ROSILENE BATISTA DE AGUIAR ALMEIDA 
 
 

 
 
 

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE DOS ÓLEOS ESSENCIAIS DE 
Cymbopogon citratus (D.C.) Stapf, Tagetes minuta L. e 

Curcuma zedoaria Roscoe FRENTE AOS 
MICRORGANISMOS Candida spp., Staphylococcus spp. e 

Streptococcus mutans 
 
 
 
 

 
2010



 

 

ROSILENE BATISTA DE AGUIAR ALMEIDA 
 

 
 
 
 
 

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE DOS ÓLEOS ESSENCIAIS DE 
Cymbopogon citratus (D.C.) Stapf, Tagetes minuta L. e Curcuma 

zedoaria Roscoe FRENTE AOS MICRORGANISMOS Candida spp., 
Staphylococcus spp. e Streptococcus mutans 

 
 
 
 
 
Tese apresentada à Faculdade de Odontologia de São José dos Campos, 

Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção 

do título de DOUTOR, pelo Programa de Pós-Graduação em 

BIOPATOLOGIA BUCAL, Área Biopatologia Bucal. 

 
 
 
 
 

Orientador: Prof. Titular Antonio Olavo Cardoso Jorge 

 

 

 

São José dos Campos 

2010 



1 

 

 

Apresentação gráfica e normalização de acordo com: 
Alvarez S, Coelho DCAG, Couto RAO, Durante APM. Guia prático para 
Normalização de Trabalhos Acadêmicos da FOSJC. São José dos 
Campos: FOSJC/UNESP; 2008 
 

 
 

 
A64a Almeida,  Rosilene Batista de Aguiar. 

   Avaliação da atividade dos óleos essenciais de Cymbopogon citratus (D.C.) 
Stapf, Tagetes minuta L. e Curcuma zedoaria Roscoe frente aos 
microrganismos Candida spp., Staphylococcus spp. e Streptococcus mutans / 
Rosilene Batista de Aguiar Almeida. __ São José dos Campos : [s.n.], 2011 
    138 f.  : il.  

 
     Tese (Doutorado em Biopatologia Bucal) – Faculdade de Odontologia de São 
Jose dos Campos, Universidade Estadual Paulista, 2011. 

  Orientador: Prof. Dr. Antonio Olavo Cardoso Jorge.  
 
 

    1. Biofilme. 2. Teste de sensibilidade microbiana. 3. Óleos essenciais. 4. Candida 
spp. 5. Staphylococcus spp. 6. Streptococcus mutans. I. Jorge, Antonio Olavo 
Cardoso.  Universidade Estadual Paulista. Faculdade de Odontologia de São José 
dos Campos. III. Título 

 
tD17 

 
Ficha catalográfica elaborada pelo Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação da 

Faculdade de Odontologia de São José dos Campos – UNESP 
 
 
 
 

 
 

AUTORIZAÇÃO 

 
 
 

Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste  trabalho, 

por qualquer meio convencional ou eletrônico, desde que citada a 

fonte.  

 

São José dos Campos, 05 de Janeiro de 2011.  

Assinatura:  

E-mail: rosileneaguiar@gmail.com  

 



2 

 

 

 
 
 
 
 

BANCA EXAMINADORA 
 
 

Prof. Tit. Antonio Olavo Cardoso Jorge (Orientador) 

Faculdade de Odontologia de São José dos Campos 

Universidade Estadual Paulista - UNESP 

 

Profa. Dra. Juliana Campos Junqueira 

Faculdade de Odontologia de São José dos Campos 

Universidade Estadual Paulista - UNESP 

 

Prof. Dr. Geraldo Batista de Melo 

Universidade Federal de Uberlândia - UFU 

 

Profa. Dra. Silvana Soléo Ferreira dos Santos 
Universidade de Taubaté 

. 

Profa. Adj. Rosilene Fernandes da Rocha 

Faculdade de Odontologia de São José dos Campos 

Universidade Estadual Paulista - UNESP 

 

 

 

São José dos Campos, 06 dezembro de 2010. 
 
 



3 

 

 

DEDICATÓRIA 

 
 
 
 
Aos meus pais, Arquimino e Alaide, por serem a minha 

base, pelo exemplo de vida, pelo amor, incentivo, sempre dispostos a se 

sacrificar pelos filhos. 

 

Ao meu marido pelo amor, motivação e pelo apoio me 

ajudando a concretizar esta conquista. 

 
A minha amada filha Evelyn que sempre está comigo, nas 

horas boas e difícies sendo compreensiva e companheira.  

 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 



4 

 

 

AGRADECIMENTO ESPECIAL 
 
 
 
 
Ao meu orientador Prof. Tit. Antonio Olavo Cardoso Jorge, 

uma pessoa sabia, não só parte na acadêmica como também na vida e 

que nos ensina por meios de suas atitudes a lidar com as diferentes 

situações no nosso cotidiano acadêmico, pela amizade e confiança. Toda 

a minha gratidão e admiração. 

 

 

À Profa. Dra. Juliana Campos Junqueira por toda atenção 

a mim destinada, desde o meu primeiro dia no laboratório, sempre 

apoiando, orientando, pela amizade. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



5 

 

 

AGRADECIMENTOS 
 
 
 
 

À Deus todo poderoso, que dá forças para conquistar dia após dia. 

 

À Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, na pessoa do 

diretor da Faculdade de Odontologia de São José dos Campos, Prof. Adj. 

José Roberto Rodrigues e do vice-diretor Prof. Dr. Carlos Augusto 

Pavanelli. 

 

Ao Programa de Pós-graduação em Biopatologia Bucal. 

 

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) 

pela concessão do Auxílio à Pesquisa que possibilitou a aquisição dos 

materiais necessários para a realização deste trabalho. Projeto número 

2009/520481. 

 

À CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível 

Superior) pela bolsa de estudo concedida. 

 

Aos docentes do Programa de Pós-graduação em Biopatologia Bucal.  

 

À Profa. Adj. Cristiane Yumi Koga Ito sempre disposta a ajudar, apesar 

das inúmeras tarefas, pela sua atenção e amizade.  

 

À Profa. Adj. Rosilene Fernandes da Rocha pela amizade e incentivo, a 

primeira pessoa que me recebeu no Departamento de Biopatologia Bucal. 

 



6 

 

 

À Profa. Dra. Luciane Dias de Oliveira, pela amizade, um sorriso amigo 

que sempre a acompanha. 

 

Ao Prof. Dr. Gokithi Akisue e Prof. Lincoln Marcelo Lourenço Cardoso pela 

disponibilidade e colaboração no fornecimento das plantas utilizadas 

neste trabalho. 

 

Às secretárias da Seção de Pós-Graduação Rosemary de Fátima 

Salgado, Erena Michie Hasegawa, Lílian Faris das Graças e Maria 

Aparecida Consíglio de Souza pela presteza e disponibilidade no decorrer 

do curso. 

 

Ao Carlos Guedes, por toda ajuda referente ao processo FAPESP. 

 

Aos funcionários Sérgio Giovanny Alves, Maria de Fátima Pires, Ana 

Paula e Domingos Gonçalves Pontes pelo coleguismo e auxílios 

prestados durante o desenvolvimento do trabalho laboratorial. 

 

Aos colegas e amigos da pós-graduação, aos que já saíram e aos atuais, 

sempre dispostos a ajudar uns aos outros. 

 

A minha amiga ex aluna do curso Claunencil de Fátima Carreto que 

sempre me ajudou nos meus primeiros meses no laboratório, a Marta 

Majewski, ao Jonatas Rafael de Oliveira e a Simone Furgeri Godinho 

Vilela pela amizade e companheirismo, pelos bons e não tão bons 

momentos que passamos juntos.  

 

Aos meus pais, Arquimino Preto de Aguiar e Alaide Batista de Aguiar, pela 

dedicação, sempre com muito amor, todos os dias da minha vida. 

 

 



7 

 

 

Ao meu marido, Odenir de Almeida, pelo amor e incentivo. 

 

A minha filha Evelyn Natalie, por me fazer feliz todos os dias, através de 

seus atos, “lembrancinhas de papel”... 

 

Aos meus irmãos Andreza e Alexandre que mesmo longe estavam 

presentes. 

 

À família do meu marido Maria Aparecida da Silva e Oswaldo de Almeida 

in memorian que sempre torceram por mim. 

 

A todos aqueles que de alguma forma contribuíram para tornar possível a 

realização deste trabalho. 

 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 
 
 
 
 



8 

 

 

 
 
 
 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Se as águas do mar da vida quiserem te afogar, segura na 

mão de Deus e vai. Não temas segue adiante e não olhes 

para trás segura na mão de Deus e vai... 
 



9 

 

 

SUMÁRIO 
 
 
 
 
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 11 

RESUMO 12 

1 INTRODUÇÃO 14 

2 REVISÃO DA LITERATURA 18 

2.1 Microrganismos 18 

2.2. Leveduras do gênero Candida 19 

2.3 Staphylococcus spp. 21 

2.4 Streptococcus mutans 24 

2.5 Biofilme 25 

2.6 Plantas medicinais 26 

3 PROPOSIÇÃO 32 

4 MATERIAL E MÉTODO 33 

4.1 Óleos essenciais 33 

4.2 Microrganismos utilizados e preparo das suspensões 34 

4.3 Determinação da concentração inibitória mínima e 
microbicida (CIM e CMM) 

35 

4.4 Avaliação dos efeitos dos óleos essenciais sobre o biofilme 
formado em resina acrílica por C. albicans, S. aureus e  
S. mutans 

37 

4.5 Grupos e condições experimentais 38 

4.6 Sensibilidade dos microrganismos frente aos óleos 
essenciais em biofilme 

39 

4.7 Visualização em Microscopia Eletrônica de Varredura 42 

5. RESULTADOS 45 

5.1 Concentração inibitória mínima e microbicida (CIM e CMM) 
do óleo essencial de Cympopogon citratus (D.C.) Stapf 

46 



10 

 

 

5.2 Efeitos do óleo essencial de Cymbopogon citratus (D.C.) 
Stapf sobre biofilme 

48 

5.3 Visualização em MEV dos efeitos do óleo essencial de  
C. citratus no biofilme 

50 

5.4 Concentração inibitória mínima e microbicida (CIM e CMM) 
do óleo essencial de Tagetes minuta L. 

59 

5.5 Efeitos do óleo essencial de Tagetes minuta L sobre 
biofilme  

60 

5.6 Visualização em MEV dos efeitos do óleo essencial de   
T. minuta  no biofilme 

62 

5.7 Concentração microbicida mínima e microbicida (CIM e 
CMM) do óleo essencial de Curcuma zedoaria Roscoe 

73 

5.8 Efeitos do óleo essencial de Curcuma zedoaria Roscoe 
sobre biofilme  

75 

5.9 Visualização em MEV dos efeitos do óleo essencial de  
C. zedoaria no biofilme 

77 

6 DISCUSSÃO 85 

7 CONCLUSÃO 98 

8 REFERÊNCIAS 100 

9 APÊNDICE 114 

ANEXO 135 

ABSTRACT 136 

 
 
 
 
 
 
 
 
 



11 

 

 

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 
 

 

 

 

ATCC = American Type Culture Collection 
BHI = Brain heart infusion (infusão cérebro coração) 
C = Controle 
CIM = Concentração inibitória mínima 
CMM = Concentração microbicida mínima 
CO2 = gás carbônico 
ºC = grau Celsius 
D.C. = Augustin-Pyramus De Candolle (1778-1841, suiço) 
DO = Densidade óptica 
g = grama 
kGy = KiloGray 
L = litro 
L. = Carolus Linnaeus (1707-1778, sueco) 
h = hora 
Log = logaritmo 
mg = miligrama 
mL = mililitro 
MEV = microscopia eletrônica de varredura 
mg/mL = miligrama por mililitro 
min = minuto 
MSBS = Mitis salivarius bacitracina sacarose 
NaCl = cloreto de sódio 
nm = nanômetro 
PBS = Solução fisiológica tampão fosfato 
UFC/mL = Unidades formadoras de colônias por mililitro 
µL = microlitro 
% = por cento 
spp. = espécies 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 



12 

 

 

Almeida RBA. Avaliação da atividade dos óleos essenciais de 
Cymbopogon citratus (D.C.) Stapf, Tagetes minuta L. e Curcuma zedoaria 
Roscoe frente aos microrganismos Candida spp., Staphylococcus spp. e 
Streptococcus mutans [tese]. São José dos Campos: Faculdade de 
Odontologia de São José dos Campos, Univ Estadual Paulista; 2010. 
 
 
 

RESUMO 
 
 
 
 
Na procura de meios preventivos e curativos para doença periodontal e 
cárie dentária, plantas medicinais com finalidade fungicida, bactericida e 
antiinflamatória vêm sendo investigadas. O objetivo desse trabalho foi o 
de avaliar a atividade antimicrobiana utilizando-se óleos essenciais de 
Cymbopogon citratus (D.C.) Stapf, Curcuma zedoaria Roscoe e Tagetes 
minuta L. sobre cepas de Staphylococcus spp., Streptococcus mutans e 
Candida spp. em crescimento planctônico e em biofilme. Para estudo dos 
microrganismos em crescimento planctônico, foram determinadas a 
Concentração Inibitória Mínima e a Concentração Fungicida Mínima de 
nove cepas clínicas e uma cepa padrão para cada espécie: C. albicans, 
C. tropicalis, C. glabrata, S. aureus, S. epidermidis e S. mutans. Para 
avaliação dos efeitos dos óleos essenciais em biofilme, foram utilizadas 
cepas padrão de Candida albicans (ATCC 18804), Staphylococcus aureus 
(ATCC 6538) e Streptococcus mutans (ATCC 35688) isolados e em 
associações em corpos-de-prova durante cinco dias. A seguir, os corpos-
de-prova em resina acrílica foram lavados e colocados em contato com 
óleos essenciais durante 5 min. O número de unidades formadoras de 
colônias obtidas em cada biofilme (UFC/mL) foram submetidos à análise 
estatística descritiva e teste t-Student utilizando-se o software Minitab 
considerando-se o nível de significância p ≤ 0,05. Também foi realizada 
microscopia eletrônica de varredura (MEV) nos corpos-de-prova em 
resina acrílica com biofilme com tratamento e controle. Foram observadas 
reduções significativas do número de unidades formadoras de colônias 
(UFC/mL) tanto no biofilme como em associação. As maiores reduções 
ocorreram no tratamento do óleo essencial de C. citratus, seguidas pelo 
óleo de T. minuta e C. zedoaria. Os óleos essenciais de Cymbopogon 
citratus, Tagetes minuta e Curcuma zedoaria apresentaram atividade 
bacteriostática, fungistática e microbicida sobre todas as cepas de 
Staphylococcus spp., Streptococcus mutans e Candida spp. na forma 
planctônica. As cepas mais sensíveis em relação a concentração 
microbicida mínima do óleo essencial de C. citratus foram C. albicans, C. 
tropicalis e C. glabrata seguidas pelas cepas de S. epidermidis, S. aureus 
e S. mutans. As cepas mais sensíveis em relação concentração 



13 

 

 

microbicida mínima do óleo essencial de T. minuta foram às C. albicans, 
C. tropicalis, C. glabrata; seguidas então pelas cepas bacterianas S. 
aureus e S. epidermidis e S. mutans. As cepas mais sensíveis em relação 
concentração microbicida mínima do óleo essencial de óleo de C. 
zedoaria foi C. albicans e a mais resistente foi S. mutans. Foi observada 
atividade microbiostática dos óleos essenciais sobre os biofilmes simples 
e mistos, com reduções significativas das UFC/mL. 
 
 
 
 
Palavras-chave: Biofilme. Teste de sensibilidade microbiana. Óleos 
essenciais. Candida spp. Staphylococcus spp. Streptococcus mutans.  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 



14 

 

 

1 INTRODUÇÃO 

 

 

 

 

As plantas medicinais representam um importante recurso 

terapêutico desde a antiguidade até nossos dias. O uso de plantas 

medicinais é um aspecto característico da humanidade, sendo conhecido 

desde a antiguidade (Queralt et al., 2005, Gurib-Fakim, 2006; Gregio et 

al., 2006). Atualmente as pesquisas com o propósito de obter novos 

medicamentos a partir de plantas ou de aprimorar os fitoterápicos já 

existentes, representam importante papel na prevenção e no tratamento 

de algumas doenças (Queralt et al., 2005; Xavier et al., 2007; Sousa et 

al., 2008).  

Torna-se difícil selecionar as espécies vegetais que 

devem ser investigadas quanto ao seu potencial farmacológico, levando-

se em conta a imensa quantidade e espécies a serem exploradas. Por 

isso, os relatos da medicina popular costumam ser utilizados na 

identificação de espécies vegetais potencialmente terapêuticas, auxiliando 

nas pesquisas com plantas medicinais (Albuquerque et al., 2007).  

Outro fator a ser considerado reporta à acessibilidade e 

aos custos dos medicamentos fitoterápicos. Pesquisas com plantas 

medicinais geralmente originam medicamentos em um curto prazo de 

tempo, com custos muitas vezes inferiores, para que possam ser 

utilizados como parte do atendimento às necessidades primárias de 

saúde da população que, em geral, encontra-se sem condições 

financeiras de arcar com os preços elevados dos medicamentos 

convencionais (Devienne et al., 2004; Lima Jr; Dimenstein, 2006). 

A validação da utilização de plantas medicinais depende 

da investigação sistemática realizada com metodologia química, 

farmacológica e microbiológica, que somados a outros fatores irão resultar 



15 

 

 

no medicamento fitoterápico (Rojas et al.,1992; Mosihuzzaman; 

Choudhary, 2008;).  

Os óleos essenciais constituem-se de elementos voláteis 

contidos em muitos órgãos vegetais, e estão relacionados com diversas 

funções necessárias à sobrevivência vegetal, exercendo papel 

fundamental na defesa contra microrganismos (Siqui et al., 2000; Vukovic 

et al., 2007).  

A espécie Cymbopogon citratus (D.C.) Stapf, conhecida 

como capim-limão ou erva cidreira, é produtora de óleo essencial de alto 

valor comercial. O principal componente do óleo essencial dessa planta é 

o citral, uma mistura dos isômeros neral (cis-citral) e geranial (trans-citral) 

(Liberalli et al., 1946; Lewinsohn et al.,1998; Barbosa et al., 2008). Tais 

componentes apresentam propriedades antifúngica (Schuck et al., 2001), 

antibacteriana (Cimanga et al., 2002), diurética (Gálvéz, et al., 1998) e 

anticarcinogênica (Puatanachokchai et al., 2002). 

Outra espécie, Tagetes minuta L., popularmente 

conhecida como vara-de-rojão, rabo-de-foguete, cravo-de-defunto, cravo-

de-urubu ou chinchilho, também tem sido estudada por apresentar 

atividade antimicrobiana (Lorenzi; Matos, 2002). 

Outra planta de interesse, que também apresenta 

propriedades terapêuticas é a Curcuma zedoaria Roscoe conhecida como 

curcuma ou zedoaria. Estudos indicaram que seus rizomas possuem 

substâncias medicinais como pineno, canfeno, cineol, cânfora e borneol 

(Pereira, et al., 2004). Dentre suas propriedades terapêuticas na prática 

popular destacam-se a expectorante, diurética, calmante, colerética, 

depurativa, anti-séptica, antifúngica, anti-helmíntica, antitumoral, 

aromática e anti-inflamatória (Teske; Trenitini, 1994; Kato; Fischer, 1996; 

Schulz et al., 2002). 

Na procura de meios preventivos para doença periodontal 

e cárie, estudos com plantas medicinais com propriedades fungicidas, 

bactericidas e antiinflamatórias são relatados na literatura. A cavidade 



16 

 

 

bucal abriga uma grande quantidade e variedade de microrganismos em 

uma microbiota estabelecida. Os fatores que influenciam esse complexo 

ecossistema são a higiene bucal, integridade dos dentes e mucosa, a 

natureza e a velocidade do fluxo salivar, a composição e a consistência 

da dieta, uso de antibióticos, o estado fisiológico e a saúde do hospedeiro 

(Aas et al., 2005; Huyghe et al., 2008). 

A remoção do biofilme dentário é um fator importante na 

prevenção da cárie e doença periodontal (Marsh, 2005). Alguns produtos 

de origem vegetal são utilizados na higiene bucal com a vantagem de não 

apresentarem efeitos colaterais, quando comparados a produtos sintéticos 

(Moran et al., 1992). Assim, com a comprovação científica de que 

determinadas plantas poderiam ser utilizadas no tratamento de doenças 

bucais, a odontologia e a população poderão se beneficiar ao utilizar a 

fitoterapia.  

A odontologia durante muito tempo considerou a cárie 

como uma doença a ser tratada apenas com preparos dos dentes e 

restaurações das cavidades. Estas condutas cuidavam apenas dos 

sintomas da doença, acreditando que as técnicas operatórias e os 

materiais restauradores seriam capazes de tratá-la. Esta filosofia levou 

muitas vezes à mutilação progressiva das estruturas dentárias (Murdoch-

Kinch; Mclean, 2003; Fontana et al., 2010;). Atualmente, a Odontologia 

moderna tem como objetivos principais prevenir novas lesões, paralisar as 

já existentes e evitar lesões recorrentes, além da promoção de saúde 

bucal e conservação da estrutura dentária (Murdoch-kinch; Mclean, 2003). 

Almeja-se atualmente, o tratamento das causas da doença cárie e não 

somente de suas seqüelas (Fontana; González-Cabezas, 2000; Murdoch-

Kinch; Mclean, 2003; Fontana et al., 2010). 

Estudos demonstraram a capacidade de diferentes 

microrganismos em se aderir às superfícies dentárias e próteses dentais. 

Entre esses microrganismos, estão incluidas bactérias e espécies de 

leveduras do gênero Candida (Maza et al., 2002). As proteínas salivares 



17 

 

 

principalmente as mucinas, que recobrem a mucosa bucal e as 

superfícies inertes das próteses dentárias podem atuar como receptores 

específicos de Candida albicans e de outros microrganismos (Baena-

Monroy et al., 2005). 

Os microrganismos do gênero Candida são geralmente 

comensais da cavidade bucal, mucosas, trato digestivo, genital e urinário 

de indivíduos sadios, mas dependendo do estado fisiológico do indivíduo 

e de fatores predisponentes, podem transformar-se na forma parasitária, 

produzindo candidose (Soll, 2002). 

As bactérias estão se tornando resistentes a múltiplos 

antimicrobianos, representado um desafio no tratamento de infecções. 

Assim, faz-se necessário encontrar novas substâncias com propriedades 

antimicrobianas para serem utilizadas no combate desses microrganismos 

(Ahmad; Beg, 2001; Jorge, 2006; Mbosso et al., 2010). 

Baena-Monroy et al., (2005), verificaram que Candida 

albicans, Staphylococcus aureus e Streptococcus mutans colonizam com 

freqüência a mucosa bucal de pacientes com prótese dentária. A principal 

espécie bacteriana correlacionada com cárie dentária de superfície lisa é 

representada por Streptococcus mutans (Pin et al., 2005; Jorge, 2006). 

O objetivo do presente trabalho foi o de avaliar a atividade 

antimicrobiana de óleos essenciais das plantas Cymbopogon citratus 

(D.C.) Stapf, Tagetes minuta L. e Curcuma zedoaria Roscoe frente a 

cepas de Candida albicans, C. tropicalis, C. glabrata, Staphylococcus 

aureus, S. epidermidis e Streptococcus mutans. Foram também avaliados 

os efeitos dos mesmos óleos essenciais em biofilmes formados in vitro 

por cepas padrão de C. albicans, S. aureus e S. mutans na superfície de 

discos de resina acrílica. 

 

 

 



18 

 

 

2 REVISÃO DA LITERATURA 
 
 
 
 

2.1 Microrganismos 
 

 

Todo indivíduo possui uma microbiota indígena que inclui 

todas as classes de microrganismos (bactérias, fungos, protozoários e 

vírus) esta é composta por cerca de 500 a 1000 espécies diferentes, 

residindo no indivíduo. Tem sido estimado que o nosso corpo é composto 

de aproximadamente 10 trilhões de células (incluindo as células nervosas, 

musculares e epiteliais), e que temos aproximadamente 10 vezes mais 

microrganismos (100 trilhões) vivendo em nosso organismo (Burton; 

Engelkirk, 2004). 

Os microrganismos presentes na microbiota bucal 

desempenham importante papel em manter a saúde bucal, entretanto o 

distúrbio desse sistema pode levar a ocorrência de doenças. Os 

microrganismos que compõem essa microbiota contribuem para o 

desenvolvimento do sistema imune do hospedeiro, seguidos de uma 

colonização balanceada de uma grande variedade de microrganismos 

que podem potencialmente invadir outros tecidos do hospedeiro 

(Barbieri et al., 2007). 

 

 

 

 

 

 

 



19 

 

 

2.2 Leveduras do gênero Candida  
 

 

O gênero Candida compreende aproximadamente 150 

espécies de leveduras, Gram-positivas, não produtoras de esporos. A 

espécie de maior importância médica é Candida albicans seguida por 

C. glabrata e C. tropicalis que perfazem cerca de 80% do isolamento de 

candidoses, são aeróbias, embora, sejam capazes de crescer em 

anaerobiose (Jorge, 2006). 

Candida albicans é a levedura mais frequentemente 

isolada de amostras clínicas humanas (Komiyama et al., 2004; Burton; 

Engelkirk, 2004; Jorge, 2006), é considerada uma das leveduras mais 

patogênicas para o ser humano, colonizando língua, palato e demais 

mucosas bucais (Jorge, 2006; Jain et al., 2010) podendo estar presentes, 

também, no biofilme subgengival (Slots et al.,1988). Esse microrganismo 

é correlacionado com grande número de infecções oportunistas que em 

indivíduos imunocomprometidos, podem ser fatais (Baillie; Douglas, 1998; 

Lengeler et al., 2000; Jain et al., 2010). 

Candida spp. é um organismo comensal presente no ser 

humano na pele e membranas mucosas da boca, trato gastrintestinal e 

geniturinário sem causar infecções, coexistindo com o hospedeiro (Hube; 

Naglik, 2001). O estado fisiológico do hospedeiro é o fator primário na 

etiologia da candidose, quando há uma queda das condições 

imunológicas do hospedeiro, Candida albicans é líder em infecções da 

boca, pele e vagina. Este tipo de infecção local pode tornar-se uma porta 

de entrada para invasão de microrganismos na corrente sanguínea, 

podendo tornar-se uma infecção generalizada ou sistêmica (Hube; Naglik, 

2001; Burton; Engelkirk, 2004). Além disso, em pacientes severamente 

imunocomprometidos, a levedura pode causar sérias infecções nas 

mucosas, que incluem candidoses vaginais, infecções bucais ou 



20 

 

 

sistêmicas (Ellepola; Samaranayake,1998; O’Sullivan et al., 2000; 

Chandra et al., 2001; Hube; Naglik, 2001). 

Um aumento do número de indivíduos 

imunocomprometidos, tal como aqueles com infecção pelo HIV, 

neutropenicos, pacientes em tratamento intensivo, uso de medicamentos 

imunossupressivos depois de transplante de órgãos são causas 

freqüentes de infecção na mucosa por Candida (Richardson, 2005). Em 

adição quase 3/4 de todas as mulheres saudáveis já tiveram pelo menos 

uma vez infecção vaginal por leveduras (Hube; Naglik, 2001). 

Os fatores de virulência expressos por Candida albicans 

para causar infecção podem variar muito, dependendo do tipo da 

infecção, o local e a natureza da resposta do hospedeiro (Hube; 

Naglik, 2001). Candida albicans é um microrganismo com grande 

repertório de atributos de virulência para colonizar o hospedeiro, 

causando danos, resistindo ou enganando o sistema de defesa do 

hospedeiro (Chaffin et al., 1998). Embora o objetivo principal do 

microrganismo não seja causar doença ou danos no hospedeiro, e sim, 

sobreviver e reproduzir (Burton; Engelkirk, 2004). 

Candida glabrata é a segunda espécie do gênero mais 

recuperada da cavidade bucal de humanos, representa cerca de 7% das 

espécies isoladas da boca. Essa espécie é isolada freqüentemente de 

pacientes portadores de próteses total, incluindo aqueles com estomatite 

(Jorge, 2006). 

Candida tropicalis pode ser encontrada em candidoses 

invasivas e hospitalares, com infecções indistinguíveis das produzidas por 

Candida albicans. Ela é encontrada no ambiente e culturas de rotina do 

nariz, garganta, pele, vagina e trato gastrintestinal de indivíduos 

saudáveis (Jorge, 2006).  

A candidose bucal também já foi muito estudada em 

pacientes que fazem uso de próteses totais ou parciais. As leveduras 

aderem-se e colonizam as superfícies bucais, incluindo mucosas e 



21 

 

 

próteses acrílicas e tem habilidade de co-agregar com bactérias bucais 

(Barbeau et al., 2003; Cross et al., 2004; Ramage et al., 2004). 

 

 

2.3 Staphylococcus spp. 
 
 

O gênero Staphylococcus pertence à família 

Staphylococaceae. São relatadas 48 espécies do gênero Staphylococcus, 

sendo ubíquo na natureza (Tse et al., 2010), dessas, 16 são encontradas 

em seres humanos e podem provocar diferentes síndromes clínicas, 

incluindo infecções cutâneas, oportunistas, das vias urinárias e sistêmicas 

(Blatt; Piazza, 2004; Trülzsch et al., 2007; Xavier et al., 2007). O 

tratamento de infecções pós-operatórias é dificultado pelo aparecimento 

dos microrganismos resistentes aos antibióticos, os quais contribuem 

significantemente para morbidez e mortalidade de pacientes 

hospitalizados (O’Gara; Humphreys, 2001; Jabra-Rizk et al., 2006).  

O gênero Staphylococcus não é usualmente pertencente 

à cavidade bucal humana, e quando isso acontece, eles são considerados 

transitórios (Loberto et al., 2004). O gênero apresenta importantes 

propriedades de virulência e causa uma larga gama de doenças 

infecciosas humanas incluindo pneumonia, septicemia, endocardites, 

doença periodontal entre outros (Wertheim et al., 2005; Baba et al., 2008). 

A espécie mais implicada em doenças no ser humano é 

S. aureus. S. epidermidis também é um importante patógeno, sobretudo 

para aqueles portadores de próteses valvulares cardíacas (Huebner; 

Goldmann, 1999; Jorge, 2007). 

As espécies do gênero Staphylococcus consistem em 

cocos Gram-positivos, tipicamente arranjados em grupos, lembrando 

“cachos de uva”, ou ainda isolados e em pequenas cadeias, não 



22 

 

 

esporulam, são imóveis, anaeróbios facultativos e produtores de catalase 

em sua maioria (Jorge, 2006). 

Em geral, os Staphylococcus apresentam uma relação 

benigna ou simbiótica com o hospedeiro; entretanto podem tornar-se 

patogênicos quando ganham acesso aos tecidos por meio de 

traumatismos da barreira cutânea, inoculação por agulhas, ou 

implantação direta por próteses médicas (Pallin et al., 2008). 

S. aureus é um dos mais significantes agentes etiológicos 

de processos infecciosos adquiridos, tanto em pacientes ambulatoriais 

como em pacientes hospitalizados (Pallin et al., 2008). Apresenta ampla 

variedade de fatores de virulência, como toxinas, adesinas, cápsula, 

formação de biofilme e enzimas extracelulares que mediam a invasão 

tecidual e a sobrevida no sítio da infecção (Götz, 2004; Blatt; Piazza, 2004 

Gordon; Lowy, 2008). Algumas espécies são produtoras de coagulase, 

característica que classifica os estafilococos em coagulase-positivos e 

negativos (Jorge, 2006).  

Cepas de S. aureus resistentes aos medicamentos foram 

sendo isoladas à medida que novos antimicrobianos foram desenvolvidos 

e introduzidas no tratamento das infecções. A habilidade de adquirir 

resistência levou ao aparecimento de amostras resistentes a praticamente 

todos os agentes antimicrobianos disponíveis (Spellberg et al., 2008). 

Estas cepas podem ser isoladas em materiais e equipamentos usados em 

ambiente hospitalar e constituem um dos problemas mais relevantes no 

controle de infecções e na terapêutica antimicrobiana (Rossi;  Andreazzi, 

2005; Jorge, 2007).  

Loberto et al. (2004) avaliaram 88 pacientes com 

periodontitis crônica, antes de receberem tratamento periodontal ou 

antibiótico. Os resultados demonstraram que em 14 dos indivíduos 

(15,9%) foram isolados S. epidermidis em amostras subgengival e de 24 

indivíduos (27,27%) na cavidade bucal, enquanto que S. aureus estavam 

presentes em (25%) de amostras da cavidade bucal. 



23 

 

 

Querido (2006), quando estudou microganismos da 

cavidade bucal de indivíduos submetidos à antibióticoterapia para 

tratamento de tuberculose pulmonar verificou que, dos 50 indivíduos 

amostrados, 96% dos pacientes com tuberculose e 92% do grupo controle 

apresentaram Staphylococcus spp. na cavidade bucal. No sulco gengival 

Staphylococcus spp. estavam presente em 44% dos indivíduos do grupo 

controle e 38% no grupo tuberculose.  

S. epidermidis são coagulase negativos e encontram-se 

largamente distribuidos pelo organismo humano, constituindo a maioria 

das bactérias comensais da microbiota. No passado esses 

microrganismos eram considerados como não-patogênicos e seus 

isolamentos em laboratório eram considerados como contaminação da 

espécie. Entretanto, esses organismos frequentemente contaminam o 

sangue e outros materiais clínicos e são responsáveis por infecções 

hospitalares, veiculados por cateteres e sondas. A espécie não produz 

toxinas e faz parte da microbiota endógena humana, sendo que as 

infecções causadas por esta espécie são geralmente de origem 

hospitalar, sendo apontado como importante agente de bacteremia, em 

serviços de oncologia e neonatologia. É também reconhecida a sua 

crescente freqüência em infecções associadas à implantação de próteses 

cardíacas, articulares e vasculares e de cateteres intravenosos (O’Gara; 

Humphreys, 2001). 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



24 

 

 

2.4 Streptococcus mutans 
 
 

Os estreptococos do grupo mutans incluem as principais 

espécies bacterianas envolvidas na cárie dentária de superfície lisa. 

Apresentam-se como cocos Gram-positivos, usualmente dispostos em 

cadeias, são anaeróbios facultativos ou estritos, seu crescimento é 

estimulado pela presença de CO2 (Pin et al., 2005; Canetierri et al., 2006). 

Apresentam células esféricas ou ovais, por vezes alongadas, de cerca de 

0,5 a 0,75 µm, são imóveis, capsulados e não formam esporos. São 

constituído por sete espécies e por oito sorotipos. As espécies deste 

grupo mais comumente relacionadas com o desenvolvimento da cárie 

dental em humanos são S. mutans e S sobrinus 

(Balakrishnamet et al., 2002; Jorge, 2006). 

Durante seu processo evolutivo, S. mutans desenvolveu 

fatores que determinam sua cariogenicidade ou virulência, como o 

sistema enzimático para o metabolismo da sacarose, substância mais 

cariogênica consumida pelos seres humanos (Kuramitsu et al., 2007). 

S. mutans é considerado um microrganismo cariogênico para todas as 

espécies de animais dentados até hoje testadas. Observa-se, entretanto, 

que cáries obtidas com a participação de S. mutans e da microbiota 

normal da boca são mais extensas e freqüentes do que só com 

S. mutans, demonstrando assim, a participação efetiva da microbiota 

bucal na etiologia da doença (Napimoga et al., 2005; Forssten et al., 

2010).  

Para colonizar a cavidade bucal, S. mutans adere nas 

superfícies duras, não descamativas, as quais coloniza e se acumula 

como parte da complexa microbiota do biofilme dentário 

(Kuramitsu et al., 2007; Jorge, 2007). 

 



25 

 

 

A cárie é uma doença infecciosa e transmissível, de 

origem microbiana, causando um processo de desmineralização por meio 

da produção de ácidos orgânicos, principalmente o ácido lático, originado 

da fermentação dos carboidratos da dieta do hospedeiro, pelas bactérias. 

Devido à sua natureza multifatorial e origem microbiana, pode variar de 

intensidade e prevalência de acordo com as condições endógenas de 

cada hospedeiro como dentes, película adquirida, saliva, dieta e 

microbiota (Balakrishnan et al., 2000; Barbieri et al., 2007).  

 

 

2.5 Biofilme 
 
 

O biofilme consiste em comunidades de células 

bacterianas ou outros microrganismos envolvidos por uma matriz 

polissacarídica extracelular que é secretada pelos próprios 

microrganismos, que permanecem aderentes a superfícies inertes ou 

vivas (Götz, 2002; Lamfon et al., 2003;). Os microrganismos crescem em 

pequenos grupos (microcolonias) que são separados por um sistema de 

canais de água. O fluido que circula entre esses canais, banha as 

microcolonias com nutrientes dissolvidos e levando os produtos residuais. 

Os biofilmes tem importância médica podendo ser encontrados em 

praticamente todo lugar, eles vem sendo envolvidos em doenças tal como 

endocardites, fibrose cistica, doença periodontal, infecções renais, 

infecções do ouvido médio e infecções na próstata (O’Gara; Humphreys, 

2001; Burton; Engelkirk, 2004). 

A formação do biofilme possui etapas seqüenciais. 

Inicialmente os microrganismos se aderem à superfície dental, ocorre 

crescimento celular e formação de microcolônias e posteriormente 

maturação do biofilme. Cada passo pode ser influenciado por fatores 



26 

 

 

genéticos e fisiológicos desse modo formando uma massa celular, 

aderente, reforçada e arquitetural (Götz, 2002; Kreth et al., 2004). 

Biofilmes são muito resistentes a antibióticos e 

desinfetantes. Antibióticos que, no laboratório tem se mostrado efetivo 

contra microrganismos na forma planctônica, torna-se ineficiente contra os 

mesmos microrganismos no biofilme (Burton; Engelkirk, 2004). 

Vicente et al. (2008) avaliaram 237 crianças, na faixa 

etária de 5 a 11 anos durante 12 meses e observaram que 81% das 

crianças apresentaram alta contagem de S. mutans e apenas 19% 

apresentaram baixa contagem em agar Mitis salivarius bacitracina 

sacarose. Com relação ao índice de atividade de cárie, verificou-se que 

73% apresentaram alta prevalência da doença. A concentração de 

S. mutans é freqüentemente alta na saliva de pacientes com elevados 

níveis de cárie dental. 

O desenvolvimento da cárie ocorre na presença de 

microrganismos na superfície dentária, entretando a simples colonização 

por estes microrganismos não implica no seu desenvolvimento. Segundo 

Gilbert et al. (2007) o fator primário de uma boa saúde bucal é a rotina no 

controle do biofilme dentário.  

Enquanto no passado, pesquisadores estudavam 

caminhos para controlar o crescimento de bactérias em cultivos 

planctônicos, os mesmos estão agora concentrando seus esforços para 

entender e controlar o biofilme (Burton; Engelkirk, 2004). 

 

 

2.6 Plantas medicinais 
 
 

A expressão fitoterapia é atribuída a medicamentos 

originados exclusivamente de material botânico integral ou seus extratos 

usados com o propósito de tratamento de doenças. As plantas medicinais 



27 

 

 

são aquelas que possuem atividade biológica, possuindo um ou mais 

princípios ativos úteis à saúde humana (Ferreira et al., 1998). As plantas 

produzem uma variedade de compostos com propriedades 

antimicrobianas (Duarte et al., 2005). 

Atualmente, as pesquisas realizadas com plantas 

confirmam a ação medicinal de muitas plantas tradicionalmente usadas, o 

que traz aos pesquisadores a convicção de que há muito a aprender com 

os costumes populares (Devienne et al., 2004). 

Plantas dos biomas brasileiros tem sido utilizadas como 

medicina natural pelas populações locais para o tratamento de várias 

doenças, como por exemplo, malária, infecção fúngica e bacteriana 

(Sartoratto et al., 2004). Apesar da rica flora brasileira, somente dados de 

poucas plantas estão disponiveis, incluindo espécies nativas e exóticas, 

que foram introduzidas no Brasil após a colonização e vem sendo 

incorporadas na medicina popular (Duarte et al., 2005) 

Os óleos essenciais contidos nas plantas aromáticas são 

responsáveis pelos diferentes odores que emanam das plantas, 

constituem-se em complexas misturas de substâncias voláteis (Ye, 2009), 

sintetizadas graças a energia solar pelas células secretoras das plantas 

aromáticas e que se apresentam como substância líquida e oleosa.  

A espécie Cymbopogon citratus (D.C.) Stapf (Figura 1), 

também conhecida como capim-limão ou erva cidreira, entre outros, 

pertence à família Gramineae originária da Ásia e subespontânea nos 

países tropicais. Desenvolve-se em todo o Brasil e caracteriza-se por ser 

uma erva perene, com folhas ásperas, aromáticas, estreitas e com mais 

de 50 cm de comprimento (Cimanga et al., 2002). É uma planta de grande 

resistência e versatilidade, suportando larga variedade de solo e de clima, 

embora não se adaptem bem em solo úmidos e enxarcados, assim como 

zonas frias, sujeitas a geadas (Liberalli et al., 1946) 

É uma planta com largo uso popular na preparação de 

chás e seu óleo essencial, rico em citral (geranial e neral), é usado na 



28 

 

 

indústria de perfumes, alimentos e medicamentos (Kochima et al., 2006), 

possuindo alto valor comercial.  

Schuck et al. (2001) avaliaram a atividade antimicrobiana 

de C. citratus por meio da técnica de difusão em agar de cepas ATCC de 

Staphylococcus aureus, Escherichia coli e os resultados revelaram que o 

óleo essencial a 0,5% apresentou diâmetro de inibição variando de 12 a 

16 mm para E. coli e superior a 40 mm para S. aureus na diluição 1,5%. 

 

 
Figura 1 – Cymbopogon citratus (D.C.) Stapf 
                             Fonte:www.google.com.br/images - pesquisar Cymbopogon citratus 
 
 

O gênero Tagetes engloba algumas espécies da família 

das Compositae ou Asteraceae, é nativa de regiões temperadas e 

montanhosas do sudeste da América do Sul, podendo ser encontradas 

nos países como Argentina, Bolivia, Peru e Paraguai. T. minuta é 

encontrada no Brasil onde se aclimataram perfeitamente, tornando-se até 

subespontâneas (Lorenzi; Matos, 2002).  

Segundo Kissmann; Groth (1992), Tagetes minuta L. 

(Figura 2), a espécie minuta faz referência ao tamanho das flores e não 

da planta, que pode alcançar até 2 metros de altura. Segundo Soule 

(1993) a planta é popularmente denominada vara-de-rojão, rabo-de-

foguete, cravo-de-defunto, cravo-de-urubu, chinchilho, coari, coari-bravo, 



29 

 

 

estrondo, sendo considerada como planta daninha infestante, de cultivos 

anuais e perenes, bem como na beira de estradas e terrenos baldios.  

Héthelyi et al. (1987) utilizaram a técnica de arraste a 

vapor para a extração do óleo essencial de T. minuta e através de 

métodos cromatográficos, separaram e dosaram alguns componentes que 

foram identificados por espectrometria de massa (ocimeno, 

diidroxitagetona, tagetona e ocimenona). 

Souza et al. (2000) utilizaram decocto de Tagetes minuta 

em testes para determinar a atividade antimicrobiana através da técnica 

de diluicão seriada, utilizando inóculos de bactérias Gram-positivas 

(Staphylococcus aureus e Enterococcus faecium) e Gram-negativas 

(Salmonella gallinarum e Escherichia coli) e verificaram o atributo anti-

séptico, conferido popularmente ao decocto. 

 

 
Figura 2 – Tagetes minuta L. 
                             Fonte:www.google.com.br/images - pesquisar Tagetes minuta 

 

A Curcuma zedoaria Roscoe (Figura 3), conhecida 

popularmente como gajitsu, curcuma ou zedoária, é uma espécie 

herbácea, perene, pertencente à família vegetal Zingiberaceae, de 

ocorrência espontânea na Ásia e utilizada desde a idade média como 



30 

 

 

condimento, corante, aromatizante e para fins terapêuticos. As partes 

vegetais empregadas com finalidades terapêuticas são as raízes e os 

rizomas, ricos em óleos essenciais, os quais podem ser empregados na 

forma de infuso, decocto, tintura, pó ou pedaços mastigáveis (Teske; 

Trenitini,1994; Kato; Fischer,1996). Os rizomas têm de 1,5 a 5% de óleo 

essencial, o qual é constituído principalmente por pineno, canfeno, cineol, 

cânfora e borneol (Pereira et al., 2004). 

Entre as indicações terapêuticas da C. zedoaria, 

destacam-se as propriedades, expectorantes, diuréticas, calmantes, 

colerética, anti-séptica, antifúngica, anti-helmíntica, antimicrobiana, 

antitumoral, aromática e antiinflamatória (Teske; Trenitini, 1994; Kato; 

Fischer,1996; Schulz et al., 2002). Nicoletti et al. (2003) estudaram a 

atividade antimicrobiana do extrato fluido da C. zedoaria frente aos 

microrganismos: Aspergillus niger, Candida albicans, Escherichia coli, 

Pseudomonas aeruginosa, Salmonella choleraesuis, Staphylococcus 

aureus e Tricophyton mentagrophytes e a ação do extrato foi mais efetivo, 

entretanto, contra Staphylococcus aureus. 

Lai et al. (2004) avaliaram o potencial antimicrobiano do 

óleo essencial de Curcuma zedoaria em microrganismos Gram positivos   

(Bacillus cereus) e Gram negativos (Escherichia coli, Pseudomonas 

aeruginosa, Vibrio parahaemolyticus). Os autores constataram que, 

Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus e Vibrio 

parahaemolyticus foram mais sensíveis, enquanto que a cepa de 

Escherichia coli apresentou maior resistência. 

 



31 

 

 

 
Figura 3 - Curcuma zedoaria Roscoe 
                             Fonte:www.google.com.br/images - pesquisar Curcuma zedoaria 

 
A partir do extrato hidroalcóolico de C. zedoaria foram 

obtidas soluções aquosas a 7,1%, sendo empregadas como coadjuvante 

químico no controle mecânico do biofilme dentário e gengivite por 

apresentarem significativa ação anti-inflamatória e antimicrobiana 

(Sandrini et al., 1997; Pereira et al., 2004). 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



32 

 

 

3 PROPOSIÇÃO 
 
 
 
 

A presente pesquisa teve como objetivos: 

a) Determinar as concentrações inibitórias mínimas (CIM) e 

concentrações microbicidas mínimas (CMM) dos óleos 

essenciais extraídos de Cymbopogon citratus (D.C.) Stapf, 

Tagetes minuta L. e Curcuma zedoaria Roscoe sobre cepas 

clínicas e padrão de Candida albicans, Candida tropicalis, 

Candida glabrata, Staphylococcus aureus, Staphylococcus 

epidermidis e Streptococcus mutans; 

b) Verificar os efeitos desses óleos essenciais sobre biofilmes 

formados na superfície da resina acrílica por cepas padrão 

de Candida albicans, Staphylococcus aureus e 

Streptococcus mutans. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



33 

 

 

4 MATERIAL E MÉTODO 

 
 
 
 

4.1 Óleos essenciais 
 
 

Foram utilizados óleos essenciais de Cymbopogon 

citratus (D.C.) Stapf, Tagetes minuta L. e Curcuma zedoaria Roscoe  

(Figura 1 a 3).  

As espécies Cymbopogon citratus (D.C.) Stapf, Tagetes 

minuta L. e Curcuma zedoaria Roscoe foram coletadas no Sítio Pinheiros, 

na localidade de Sarapuí-do-Alto, Vila Élvio, município de Piedade, estado 

de São Paulo, Brasil. As plantas foram coletadas no período da manhã 

entre 9:00 e 10:00 h. As datas das coletas foram: 06/09/2007 para C. 

citratus, 20/06/2009 para T. minuta e 19/11/2009 para C. zedoaria. 

As exsicatas foram depositadas no Herbário SPF do 

Departamento de Botânica da Universidade de São Paulo, Rua do Matão, 

277, edifício Sobre-as-Ondas, CEP 05508-090, São Paulo, SP, Brasil, sob 

os números G. Akisue 031 (SPF) para C. citratus e G. Akisue 033 (SPF) 

para T. minuta. 

A extração dos óleos foi realizada no Laboratório de 

Farmacognosia e Plantas Medicinais da Faculdade de Pindamonhangaba 

(FAPI), pela técnica de hidrodestilação por arraste de vapor d´água 

empregando-se aparelho do tipo Clevenger modificado (Wasicky; 

Akissue, 1969). Para a extração dos óleos essenciais foram utilizadas as 

folhas de C. citratus, as inflorências de T. minuta e os rizomas de             

C. zedoaria. 

 



34 

 

 

4.2 Microrganismos utilizados e preparo das suspensões 
 

 

Para determinação da concentração inibitória mínima 

(CIM) foram utilizadas 54 cepas clínicas, sendo 9 de cada espécie e 1 

cepa padrão a seguir: Staphylococcus aureus, Staphylococcus 

epidermidis, Streptococcus mutans, Candida albicans, Candida tropicalis 

e Candida glabrata. Essas cepas são provenientes do Laboratório de 

Microbiologia da Faculdade de Odontologia de São José dos Campos / 

UNESP e foram isoladas da cavidade bucal humana no trabalho de 

Querido (2006). O projeto de pesquisa do presente trabalho foi aprovado 

pelo Comitê de Ética em pesquisa da Faculdade de Odontologia de São 

José dos Campos –Unesp, sob protocolo nº 01/ 2008-PH/CEP (Anexo A). 

Para avaliação dos efeitos dos óleos essenciais no 

biofilme formado nos corpos-de-prova de resina acrílica foram estudadas 

as seguintes cepas padrão: Candida albicans (ATCC 18804), 

Staphylococcus aureus (ATCC 6538) e Streptococcus mutans (ATCC 

35688). A partir das cepas clínicas e cepas padrão foram preparadas 

suspensões em solução de NaCl a 0,85% contendo 106 células 

quantificadas em espectrofotômetro (Micronal - B582, São Paulo, Brasil) 

(Figura 4) utilizando-se os parâmetros do Quadro 1. Solução de NaCl a 

0,85% foi empregada como branco. 

 
Quadro 1 – Microrganismos utilizados no preparo das suspensões com respectivos 

meios de cultura, condições de incubação, densidade óptica (DO) e 
comprimento de onda. 

 
Microrganismos 

Meios de 
cultura* 

Incubação DO 
Comprimento de 

onda (nm) 

Candida spp. Agar Sabouraud 37ºC/24 h 0,284 530 

Staphylococcus spp. 
Brain Heart 

infusion 
37ºC/24 h 0,374 490 

S. mutans 
Brain Heart 

infusion 

37ºC/24 h com 5% 

de CO2 
0,620 398 

* Difco, Detroit, USA 



35 

 

 

     
(a)  (b) 

  
  (c) 

Figura 4 – Padronização da suspensão microbiana: (a) coleta do microrganismo do agar 
com auxílio de alça de platina; (b) aparelho de espectrofotômetro utilizado 
para padronização da suspensão de microrganismo; (c) suspensão 
microbiana padronizada, contendo 106 células/mL. 

 

 

4.3 Determinação da concentração inibitória e microbicida mínima 
(CIM e CMM) 
 

 

Para determinação da concentração inibitória mínima 

(CIM) dos óleos essenciais de C. citratus, T. minuta e C. zedoaria foi 

utilizado o método de microdiluição em caldo. Os óleos essenciais foram 

colocados em tubos de ensaios esterilizados juntamente com água 

destilada estéril e Tween 80, de acordo, com o volume e concentração 

desejada (Lima et al., 2006). A solução foi agitada por 5 minutos 

utilizando-se aparelho Vortex (Fanem), obtendo-se então uma solução 



36 

 

 

com a concentração final desejada para cada óleo essencial para cada 

espécie.  

Em placas de 96 poços (Costar Corning, New York, EUA), 

foram acrescentados préviamente 125 µL do caldo Sabouraud ou BHI em 

todos os poços, a seguir, nas primeiras colunas dos poços da placa de 96 

poços foram colocadas 125 µL da solução do óleo essencial com a 

concentração préviamente estabelecida para cada espécie. Diluições 

seriadas dos óleos essenciais foram realizadas na placa com auxílio de 

micropipeta automática de forma a representarem 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 

1/64 e 1/128 da concentração inicial (Lima et al., 2006). A seguir, foram 

adicionados em todos os poços da placa 12,5 µL da suspensão 

padronizada (106 células/mL) de cada cepa de Staphylococcus spp., 

Streptococcus mutans e Candida spp. Os ensaios foram realizados em 

duplicata. O grupo controle foi constituído de 125 µL de caldo Sabouraud 

e 125 µL de água destilada autoclavada com Tween 80 (Lima et al., 2006) 

nas mesmas diluições utilizadas na solução do óleo essencial e 12,5 µL 

da suspensão dos microrganismos. Após, incubação em estufa 

bacteriológica por 24 horas a 37°C para Candida spp. e Staphylococcus 

spp. e para Streptococcus mutans por 24 horas a 37°C em estufa de CO2, 

a leitura foi realizada por observação visual da turvação do meio. Foi 

considerada concentração inibitória mínima (CIM) a menor concentração 

do óleo essencial testado, capaz de inibir o crescimento microbiano em 

caldo.  

Na determinação da concentração microbicida mínima 

(CMM) dos óleos essenciais de C. citratus, T. minuta e C. zedoaria três 

inóculos do teste anterior que não apresentaram crescimento em caldo 

foram semeados em placas contendo agar Sabouraud dextrose para 

determinação da concentração fungicida mínima para Candida spp. e 

agar BHI para a determinção bactericida mínima para Staphylococcus 

spp. e Streptococcus mutans. Para isso, 100 μL do inóculo foram 

semeados em agar Sabouraud dextrose ou agar BHI (Quadro 1) 



37 

 

 

utilizando-se alça Drigalski (Figura 10b). Após período de incubação de 48 

horas a 37°C e para S. mutans 48 horas a 37°C em estufa de CO2, foi 

verificado crescimento de colônias características de cada espécie. Foi 

considerada concentração microbicida miníma como sendo a menor 

concentração dos óleos essenciais testados capazes de inibir totalmente 

o crescimento microbiano em meio de cultura sólido em placas de Petri. 

 

 

4.4 Avaliação dos efeitos dos óleos essenciais sobre o biofilme 
formado em resina acrílica por C. albicans, S. aureus e S. mutans  
 

 

Foram utilizados como corpos-de-prova (Figura 5a e 5b), 

discos para confecção de prótese ocular com pino (Clássico, São Paulo, 

Brasil), em resina acrílica incolor, com 11 mm de diâmetro. Para os 

ensaios cada corpo-de-prova recebeu duas camadas de esmalte (Figura 

5) para unhas (Colorama, São Paulo, Brasil) no pino e na base, a fim de 

que, ocorresse uma delimitação da área para formação do biofilme, o qual 

foi formado somente na parte superior do corpo-de-prova. Após a 

secagem do esmalte nos corpos-de-prova em resina acrílica, os mesmos 

foram embalados e encaminhados para esterilização por radiação gama 

(cobalto 60), com dosagem de 20 KGy por 6 h (Embrarad, São Paulo, 

Brasil). 

 

 

 

 

 

 

 

 



38 

 

 

     
(a)                                     (b)                             

Figura 5 – Corpo-de-prova em resina acrílica incolor para confecção de prótese ocular 
com pino (Clássico, São Paulo, Brasil): (a) Corpo-de-prova com pino; 
(b) corpo-de-prova com a base pintado com esmalte para unhas; corpo-de-
prova com o pino e a base pintados com esmalte para unhas. 

 

 

4.5 Grupos e condições experimentais 
 
 

Após esterilização os corpos-de-prova em resina acrílica  

foram divididos nos grupos experimentais, conforme Quadro 2: 

 
Quadro 2 – Distribuição dos corpos-de-prova em resina acrílica  nos grupos 

experimentais e controle 
 

 

 
 

Grupos Biofime C. citratus Controle C. zedoaria Controle T. minuta Controle 

G1 C. albicans 12 12 12 12 12 12 

G2 S. aureus 12 12 12 12 12 12 

G3 S. mutans 12 12 12 12 12 12 

G4 
C. albicans 

e S. aureus 
12 12 12 12 12 12 

G5 
C. albicans 

e S. mutans 
12 12 12 12 12 12 

G6 
S. aureus 

e S. mutans 
12 12 12 12 12 12 

G7 

C. albicans, 

S. aureus 

e S. mutans 

12 12 12 12 12 12 

Total 84 84 84 84 84 84 



39 

 

 

Os corpos-de-prova em resina acrílica foram colocados na 

fileira A de placas de cultura de células com 24 poços (Costar Corning, 

New York. EUA), sendo adicionado posteriormente 2 mL do caldo BHI 

(Brain Heart Infusion, Difco, Detroit, USA) sacarosado (5%). A seguir, foi 

inoculado 100 µl de suspensão contendo 106 células de cada 

microrganismo, conforme o grupo experimental (Quadro 2). As placas 

foram incubadas por 5 dias em estufa bacteriológica a 37ºC para os 

grupos G1, G2 e G4 e para os grupos contendo S. mutans (G3, G5, G6 e 

G7) em estufa bacteriológica de CO2 a 5%.  

Após crescimento dos biofilmes (Figura 7), os corpos-de-

prova em resina acrílica foram lavados duas vezes a fim de remover o 

material que não se aderiu. Para a lavagem foi colocado em cada poço da 

segunda e terceira fileira da placa, 2 mL de PBS (Phosphate Buffer 

Saline) pH 7, onde foram imersos os corpos-de-prova de resina acrílica e 

homogeneizados por 5 minutos para cada fileira (Figura 7) em agitador 

Orbital (Solab, Piracicaba, Brasil).  

 

 

4.6 Sensibilidade dos microrganismos frente aos óleos essenciais 
em biofilmes 
 
 

Para avaliar a sensibilidade dos microrganismos aos 

óleos essenciais, os corpos-de-prova em resina acrílica foram transferidos 

para um recipiente (50 mL) contendo 5 mL da solução diluída do óleo 

essencial de Cymbopogon citratus, Tagetes minuta e Curcuma zedoaria 

pré estabelecidos na CIM e CMM para cada microrganismo, 

permanecendo por 5 min (Figura 8). Para o controle, os corpos-de-prova 

em resina acrílica foram colocados em solução de água com Tween 80 

pelo mesmo período de tempo. A seguir, os corpos-de-prova em resina 

acrílica foram mergulhados em placas de 24 poços contendo PBS pH 7 



40 

 

 

para retirar possíveis resíduos de óleo essencial (Figura 8b) e colocados 

em tubos de ensaio Falcon contendo 10 ml de solução PBS esterilizada 

os quais foram submetidos ao homogeneizador ultra-sônico (Sonoplus HD 

2200 - Bandelin Eletronic), utilizando-se potência de 50 W durante 30 

segundos, para dispersão dos microrganismos aderidos à superfície do 

corpo-de-prova (Figura 9). A partir da solução obtida, foram realizadas 

diluições (10 -1 a 10 -4 mL), das quais alíquotas de 100 µL foram 

semeadas em duplicata em agar Sabouraud dextrose com cloranfenicol 

(União Química, São Paulo, Brasil) (0,1 mg/mL de meio) para cepas de C. 

albicans; agar manitol (Difco, Detroit, USA) para S. aureus e agar mitis 

salivarius acrescido de bacitracina (0,2 UI/mL) (União Química, São 

Paulo, Brasil) e 15% de sacarose (Synth, Brasil) (MSBS) para S. mutans.  

Após 48 horas de incubação o número de unidades 

formadoras de colônias (UFC/mL) foram determinadas para cada corpo-

de-prova. As placas escolhidas para contagem foram aquelas que 

apresentaram entre 30 e 300 colônias de cada diluição. Os resultados da 

contagem de UFC/mL foram transformados em logarítimo de base 10 

(Log10) e submetidos à análise estatística descritiva e teste t-Student 

utilizando-se o software Minitab (Inc. PA, USA) considerando-se o nível de 

significância p ≤ 0,05. 

 

 

 

 

 

 

 

 



41 

 

 

 
Figura 6 – Formação do biofilme em placa 24 poços. Primeira fileira com caldo BHI 

sacarosado, corpo-de-prova e suspensão microbiana. 
 
 

  

 (a) (b) 
Figura 7 – Procedimento para o tratamento do biofilme nos corpo-de-prova após 5 dias 

de incubação em estufa bacteriológica. (a) Primeiro enxágüe dos corpos-de-
prova em resina acrílica em solução PBS; (b) agitador orbital utilizado para 
auxiliar a remoção das células microbianas não-aderidas. 

 
 

     

 (a) (b) 

Figura 8 – Avaliação da sensibilidade dos microrganismos frente os óleos essenciais. 
(a) corpos-de-prova em resina acrílica  transferidos para um recipiente (50 
mL) contendo 5 mL da solução diluída do óleo essencial; (b) corpos-de-prova 
em resina acrílica  mergulhados na quarta fileira da placa de 24 poços 
contendo PBS para retirar resíduo do óleo essencial após o tratamento. 

 



42 

 

 

       
 (a) (b) (c) 
Figura 9 - Dispersão do biofilme para a quantificação dos microrganismos. 

(a) homogeneizador ultra-sônico; (b) inserção do corpo-de-prova na 
solução de PBS; (c) dispersão do biofilme do corpo-de-prova para solução 
de PBS com auxílio do homogeneizador ultrasônico.  

 
 

      
 (a) (b) 
Figura 10 - Quantificação dos microrganismos. (a) inoculação da suspensão microbiana 

em placa de Petri com agar; (b) semeadura da suspensão microbiana em 
meio de cultura sólido com auxílio de alça Drigalski. 

 

 

4.7 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) 
 

 

Para visualizar os efeitos do óleo essencial nos biofilmes 

formados de C. albicans, S. aureus e S. mutans e das demais 

associações de microrganismos, foi realizada a microscopia eletrônica de 

varredura (MEV) (JSM-5310, JEOL, Japão) no Instituto Nacional de 

Pesquisas Espaciais (INPE) de São José dos Campos/SP. 



43 

 

 

Foram utilizados 2 corpos-de-prova (1 tratamento e 1 

controle) em resina acrílica de cada grupo para ser submetido à análise 

em microscopia eletrônica de varredura (Quadro 3). 

 
Quadro 3 - Distribuição dos corpos-de prova submetidos à microscopia eletrônica de 

varredura.  
 

 
 

 
Os corpos-de-prova em resina acrílica foram removidos 

do caldo e foi realizada a fixação dos microrganismos aderidos na 

superfície dos corpos-de-prova em resina acrílica com glutaraldeído 2,5% 

por 1 hora. A seguir os biofilmes foram desidratados em solução alcoólica 

a 10%, 25%, 50%, 75% e 90% por vinte minutos em cada e finalmente por 

uma hora em álcool absoluto (Figura 11). As placas foram incubadas em 

estufa bacteriológica por 24 horas para secagem do biofilme. 

A seguir os corpos-de-prova em resina acrílica, foram 

fixados em stubs metálicos (Figura 12) e foi realizada a metalização das 

amostras por spputtering (Denton Vacuum Desk, Denton Vacuum, USA) 

com fio de ouro de 10-9 mm de espessura (Figura 12). Posteriormente, os 

biofilmes formados nos corpos–de-prova foram visualizados e 

Grupos Biofime C. citratus Controle C. zedoaria Controle T. minuta Controle 

G1 C. albicans 1 1 1 1 1 1 

G2 S. aureus 1 1 1 1 1 1 

G3 S. mutans 1 1 1 1 1 1 

G4 
C. albicans 

e S. aureus 
1 1 1 1 1 1 

G5 
C. albicans 

e S. mutans 
1 1 1 1 1 1 

G6 
S. aureus 

e S. mutans 
1 1 1 1 1 1 

G7 

C. albicans, 

S. aureus 

e S. mutans 

1 1 1 1 1 1 

Total 7 7 7 7 7 7 



44 

 

 

fotografados no microscópio eletrônico de varredura em 15 KV nos 

aumento de 1000 e 5000 vezes.  

        

 (a) (b) 
Figura 11 – Preparo dos corpos-de-prova em resina acrílica  para metalização. (a) Placa 

de Petri de 24 poços (coluna 1 caldo BHI com biofilme; coluna 2 e 3 solução 
PBS para dispersão das células não aderidas; coluna 4 lavagem após 
tratamento com o óleo essencial; coluna 6 imersão do corpo-de-prova em 
glutaraldeido (2%); (b) Colunas da placa (1 a 6) com as diferentes 
concentrações do álcool (10, 25, 50, 75, 90 e 100%). 

 
 
 

          
 (a) (b) 
Figura 12 – Processo de metalização.dos corpos-de-prova em resina acrílica. 

(a) aparelho metalizador com corpos de prova fixados nos stubs metálicos 
antes da metalização; (b) stubs com os corpos-de-prova em resina acrílica  
metalizados.  

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 



45 

 

 

5 RESULTADOS 
 

 

 

 

Os óleos essenciais utilizados apresentaram redução de 

UFC/mL em relação ao grupo controle para todas as concentrações 

testadas, tanto para a forma planctônica quanto para o biofilme. 

De acordo com os resultados, as diluições dos óleos 

essenciais variaram para cada óleo, sendo que o óleo de C. citratus foi o 

que apresentou menor concentração para o efeito inibitório ou microbicida 

tanto na forma planctônica como em biofilme. Para facilitar o 

entendimento, os resultados obtidos estão demonstrados nas Tabelas 1 a 

6 de acordo com o óleo essencial utilizado, a concentração utilizada do 

óleo essencial e a porcentagem dos microrganismos inibidos (CIM) ou 

mortos (CMM) em cada concentração do óleo. A porcentagem dos 

microrganismos inibidos é apresentada nas colunas das Tabelas 1 a 6. 

Todas as cepas ATCC dos microrganismos apresentaram (CIM e CMM) 

dos óleos essenciais testados sempre numa diluição posterior ao das 

maiorias das cepas clínicas de cada espécie utilizada (Tabelas 1 a 6). 

Na análise dos resultados da CIM observou-se que as 

leveduras foram as cepas que apresentaram maior sensibilidade frente 

aos óleos essenciais. Por esse motivo foram aplicados nos biofilmes duas 

concentrações diferentes dos óleos essenciais. A menor concentração foi 

uitlizada quando o biofilme isolado ou misto era composto por C. albicans 

e a maior concentração dos óleos para as bactérias, conforme verificado 

na CMM. As concentrações dos óleos foram para C. citratus (0,062 e 

0,5%), T. minuta (0,78 e 8%), e C. zedoaria (3,12 e 6,25%). 

Os dados da contagem das unidades formadoras de 

colônia (UFC/mL) transformados em Log10  (tratamento e controle) no 

biofilme, foram submetidos à análise estatística descritiva e teste t-



46 

 

 

Student utilizando-se o software Minitab (Inc. PA, USA) considerando-se 

com nível de significância p ≤ 0,05. 

Para a visualização dos microrganismos nos corpos-de-

prova com a aplicação o óleo essencial (tratamento) e sem o óleo 

(controle), os mesmos foram submetidos a microscopia eletrônica de 

varredura. 

 

 

5.1 Concentração inibitória e microbicida mínima (CIM e CMM) do 
óleo essencial de Cympopogon citratus (D.C.) Stapf 
 
 

O óleo essencial de C. citratus apresentou atividade 

bacteriostática em todas as cepas de Staphylococcus spp. e S. mutans. A 

CIM foi de 0,25% para 80% das cepas de S. aureus e 0,125% para 60% 

das cepas de S. epidermidis. Para S. mutans, a concentração do óleo 

essencial de C. citratus a 0,25% inibiu 50% das cepas estudadas. No 

grupo controle, todas as cepas analisadas apresentaram crescimento 

microbiano (Tabela 1).  

A concentração inibitória mínima (CIM) do óleo essencial 

de C. citratus foi de 0,062% para 70% das cepas de C. albicans e 100% 

das cepas de C. tropicalis e 50% para C. glabrata (Tabela 1). No grupo 

controle, houve crescimento microbiano para todas as cepas estudadas.  

 

 

 

 

 

 

 



47 

 

 

Tabela 1 – Porcentagem de cepas dos microrganismos inibidos pelo óleo essencial de 
Cymbopogon citratus em relação à CIM 

 

Microrganismos 
Porcentagem da diluição do óleo essencial de C. citratus 

2 1 0,5 0,25 0,125 0,062 0,031 0,015 0,007 

S. aureus 100 100 100 80 20 0 0 0 0 

S. epidermidis 100 100 100 100 60 40 0 0 0 

S. mutans 100 100 100 50 40 10 0 0 0 

C. albicans 100 100 100 100 100 70 30 0 0 

C. tropicalis 100 100 100 100 100 100 80 20 0 

C. glabrata 100 100 100 100 100 50 40 10 0 

 

O óleo essencial de C. citratus apresentou atividade 

microbicida para todas as cepas avaliadas. A CMM do óleo essencial de 

C. citratus foi 0,5% para 80% das cepas de S. aureus, 0,125% para 90% 

das cepas de S. epidermidis, 0,5% para 70% das cepas de S. mutans, e 

0,125% para 90% das cepas de C. albicans, 100% das cepas de C. 

tropicalis e 60% das cepas de C. glabrata (Tabela 2).  

 
Tabela 2 – Porcentagem de cepas dos microrganismos inibidos pelo óleo essencial de 

Cymbopogon citratus em relação à CMM 
 

Microrganismos 
Porcentagem da diluição do óleo essencial de C. citratus 

2 1 0,5 0,25 0,125 0,062 0,031 0,015 0,007 

S. aureus 100 100 80 20 0 0 0 0 0 

S. epidermidis 100 100 100 100 90 10 0 0 0 

S. mutans 100 100 70 20 10 0 0 0 0 

C. albicans 100 100 100 100 90 10 0 0 0 

C. tropicalis 100 100 100 100 100 80 20 0 0 

C. glabrata 100 100 100 100 60 40 0 0 0 

 

 

 

 

 

 



48 

 

 

5.2 Efeitos do óleo essencial de Cymbopogon citratus (D.C.) Stapf 
sobre biofilme  
 
 

O óleo essencial de C. citratus a 0,062% apresentou 

atividade antimicrobiana sobre biofilme de C. albicans isoladamente ou 

em associações. Houve diferença estatisticamente significante entre os 

grupos óleo essencial e controle para os biofilmes formados por 

C. albicans (p = 0,0001), C. albicans e S. aureus (p = 0,0001), C. albicans 

e S. mutans (p = 0,0001), C. albicans, S. aureus e S. mutans (p = 0,001). 

Esses resultados estão representados na Figura13. 

 

C. albicans

0 2 4 6 8

*C. albicans

*C. albicans+S. aureus

*C. albicans+S. mutans

*C. albicans+S. aureus+S. mutans Óleo
Controle

UFC/mL (Log)

Bi
of

ilm
e

 
Figura 13 - Médias e Desvio padrão dos dados de UFC/mL (Log) obtidos nos teste de 

biofilme de Candida albicans isolado ou em associações. 

* Diferença estatística (p ≤ 0,05) 

 

O óleo essencial de C. citratus a 0,5% apresentou 

atividade antimicrobiana sobre o biofilme formado por S. aureus 

isoladamente ou em associações. Houve diferença estatisticamente 

significante entre os grupos óleo essencial e controle para os biofilmes 

formados por S. aureus (p = 0,0001), S. aureus e C. albicans (p = 0,001), 

S. aureus e S. mutans e (p = 0,0001), S. aureus, C. albicans e S. mutans 

(p = 0,0001). Esses resultados estão representados na Figura 14. 



49 

 

 

S. aureus

0 2 4 6 8

*S. aureus

*S. aureus+C. albicans

*S. aureus+S. mutans

*S. aureus+C. albicans+S. mutans Óleo
Controle

UFC/mL (Log)

Bi
of

ilm
e

 
Figura 14 - Médias e Desvio padrão dos dados de UFC/mL (Log) obtidos nos teste de 

aderência de S. aureus isolado ou em associações.  

* Diferença estatística (p ≤ 0,05) 

 

Na figura 15 observa-se que o óleo essencial de C. 

citratus a 0,5% apresentou atividade antimicrobiana em biofilme de          

S. mutans formado isoladamente ou em associações. Houve diferença 

estatisticamente significante entre os grupos óleo essencial e controle 

para os biofilmes formados por S. mutans (p = 0,0001), S. mutans e C. 

albicans (p = 0,004), S. mutans e S. aureus (p = 0,013). Nas associações 

de C. albicans, S. aureus e S. mutans não houve diferença 

estatisticamente significante (p = 0,461). Esses resultados estão 

representados na Figura 15. 

 

 

 



50 

 

 

S. mutans

0 2 4 6 8

*S. mutans

*S. mutans+C. albicans

*S.mutans+S. aureus

S.mutans+C. albicans+S. aureus
Óleo
Controle

UFC/mL (Log)

Bi
of

ilm
e

 
Figura 15 – Médias e Desvio padrão dos dados de UFC/mL (Log) obtidos nos teste de 

aderência de S. mutans isolado ou em associações.  

* Diferença estatística (p ≤ 0,05) 

 

Analisando todos os grupos controles, pode-se observar 

que C. albicans e S. aureus apresentaram maior número de UFC/mL 

quando o biofilme foi formado pelo microrganismo isolado em relação ao 

biofilme formado pela associação desses dois microrganismos.  

Entretanto, quando foi realizada associações de Candida albicans e S. 

aureus com S. mutans, o número de UFC/mL foi semelhante ao biofilme 

isolado (Figura 15 ). 

 

 

5.3 Visualização em MEV dos efeitos do óleo essencial de C. citratus 
no biofilme  
 

Após a avaliação dos dados em UFC/mL e a análise 

estatística, foram realizados testes de aderência em corpos-de-prova em 

resina acrílica para a visualização em microscopia eletrônica de varredura 

de acordo com os grupos experimentais. Nas análises produzidas por 

MEV foi possível visualizar a aderência no diferentes grupos 

experimentais utilizando o tratamento com o óleo essencial de 

Cymbopogon citratus (Figuras 16 a 22). 



51 

 

 

      
(a) (b) 

      
 (c) (d) 
Figura 16 – MEV de biofilmes de C. albicans (G1) em corpos-de-prova de resina acrílica  

após 5 dias de crescimento. (a) MEV do corpo-de-prova com biofilme após 
tratamento com óleo essencial de C. citratus à 0,062% por 5 min, aumento 
1000x; (b) MEV do corpo-de-prova do controle aumento 1000x; (c) MEV do 
corpo-de-prova com biofilme após tratamento com o óleo essencial de C. 
citratus, aumento 5000x; (d) MEV do corpo-de-prova do controle, aumento 
5000x. Observa-se diferenças entre os tratamentos (Figuras 16a e 16c) em 
relação ao controle (Figuras 16b e 16d) e na camada mais interna a 
visualização de polisacarídeos extracelulares (Figura 16d). 

 
 
 
 
 
 
 
 
 



52 

 

 

      
 (a) (b) 

      
 (c) (d) 
Figura 17 – MEV de biofilmes de S. aureus (G2) em corpos-de-prova de resina acrílica  

após 5 dias de crescimento. (a) MEV do corpo-de-prova com biofilme após 
tratamento com óleo essencial de C. citratus à 0,5% por 5 min, aumento 
1000x; (b) MEV do corpo-de-prova do controle aumento 1000x; (c) MEV do 
corpo-de-prova com biofilme após tratamento com o óleo essencial de C. 
citratus, aumento 5000x; (d) MEV do corpo-de-prova do controle, aumento 
5000x. As Figuras 17a e 17c mostram uma redução no número de células. 
Observa-se que na Figura 17d mostra um aglomerado de células.  

 

 

 

 

 

 

 



53 

 

 

      
 (a) (b) 

      
 (c) (d) 
Figura 18 – MEV de biofilmes de S. mutans (G3) em corpos-de-prova de resina acrílica  

após 5 dias de crescimento. (a) MEV do corpo-de-prova com biofilme após 
tratamento com óleo essencial de C. citratus à 0,5% por 5 min, aumento 
1000x; (b) MEV do corpo-de-prova do controle aumento 1000x; (c) MEV do 
corpo-de-prova com biofilme após tratamento com o óleo essencial de C. 
citratus, aumento 5000x; (d) MEV do corpo-de-prova do controle, aumento 
5000x. Visualiza-se redução do número de células após o tratamento em 
relação ao controle. 

 

 

 

 

 

 



54 

 

 

      
 (a) (b) 

      
 (c) (d) 
Figura 19 – MEV de biofilmes em associações de C. albicans e S. aureus (G4) em 

corpos-de-prova de resina acrílica após 5 dias de crescimento. (a) MEV do 
corpo-de-prova com biofilme após tratamento com óleo essencial de C. 
citratus à 0,062% por 5 min, aumento 1000x; (b) MEV do corpo-de-prova do 
controle aumento 1000x; (c) MEV do corpo-de-prova com biofilme após 
tratamento com o óleo essencial de C. citratus, aumento 5000x; (d) MEV do 
corpo-de-prova do controle, aumento 5000x. Observa-se uma pequena 
redução do número de células (Figuras 19a e 19c).  

 

 

 

 

 

 



55 

 

 

      
 (a) (b) 

      
 (c) (d) 
Figura 20 – MEV de biofilmes em associações de C. albicans e S. aureus (G4) em 

corpos-de-prova de resina acrílica  após 5 dias de crescimento. (a) MEV do 
corpo-de-prova com biofilme após tratamento com óleo essencial de C. 
citratus à 0,5% por 5 min, aumento 1000x; (b) MEV do corpo-de-prova do 
controle aumento 1000x; (c) MEV do corpo-de-prova com biofilme após 
tratamento com o óleo essencial de C. citratus, aumento 5000x; (d) MEV do 
corpo-de-prova do controle, aumento 5000x. Com o aumento da 
concentração do óleo essencial teve uma diminuição do número de células 
(Figuras 20a e 20c) com relação ao controle (Figuras 20b e 20d). Pode-se 
também comparar em relação às Figuras 19a e 19c. 

 

 

 

 

 



56 

 

 

      
 (a) (b) 

      
 (c) (d) 
Figura 21 – MEV de biofilmes em associações de C. albicans e S. mutans (G5) em 

corpos-de-prova de resina acrílica  após 5 dias de crescimento. (a) MEV do 
corpo-de-prova com biofilme após tratamento com óleo essencial de C. 
citratus à 0,5% por 5 min, aumento 1000x; (b) MEV do corpo-de-prova do 
controle aumento 1000x; (c) MEV do corpo-de-prova com biofilme após 
tratamento com o óleo essencial de C. citratus, aumento 5000x; (d) MEV do 
corpo-de-prova do controle, aumento 5000x. Observa-se uma redução do 
número de células (Figuras 21a e 21c). 

 

 

 

 

 

 



57 

 

 

      
 (a) (b) 

      
 (c) (d) 
Figura 22 – MEV de biofilmes em associações de S. mutans e S. aureus (G6) em corpos-

de-prova de resina acrílica  após 5 dias de crescimento. (a) MEV do corpo-
de-prova com biofilme após tratamento com óleo essencial de C. citratus à 
0,5% por 5 min, aumento 1000x; (b) MEV do corpo-de-prova do controle 
aumento 1000x; (c) MEV do corpo-de-prova com biofilme após tratamento 
com o óleo essencial de C. citratus, aumento 5000x; (d) MEV do corpo-de-
prova do controle, aumento 5000x. Na Figura 29d pode-se observar a 
formação de grande quantidade de polissacarídeos extracelulares entre as 
células microbianas. 

 

 

 

 

 



58 

 

 

      
 (a) (b) 

      
 (c) (d) 
Figura 23 – MEV de biofilmes em associações de C. albicans, S. aureus e S. mutans 

(G7) em corpos-de-prova de resina acrílica  após 5 dias de crescimento. 
(a) MEV do corpo-de-prova com biofilme após tratamento com óleo 
essencial de C. citratus à 0,5% por 5 min, aumento 1000x; (b) MEV do 
corpo-de-prova do controle aumento 1000x; (c) MEV do corpo-de-prova 
com biofilme após tratamento com o óleo essencial de C. citratus, aumento 
5000x; (d) MEV do corpo-de-prova do controle, aumento 5000x. Observa-
se nas Figuras 23c e 23d a formação de polissacarídeos extracelulares 
entre as células microbianas.  

 

 

 

 



59 

 

 

5.4 Concentração inibitória e microbicida mínima (CIM e CMM) do 
óleo essencial de Tagetes minuta L. 
 

Atividade bacteriostática também foi encontrada a partir 

do óleo essencial de T. minuta em todas as cepas de Staphylococcus spp. 

e S. mutans. A CIM foi de 2% para 80% das cepas de S. aureus e para 

70% das cepas de S. epidermidis. Para S. mutans, a concentração do 

óleo essencial de T. minuta a 4% inibiu 70% das cepas de S. mutans 

estudadas.  

Para as cepas de Candida spp. avaliadas, também, 

observou-se atividade fungistática para o óleo essencial de T. minuta. A 

concentração inibitória mínima (CIM) do óleo essencial de T. minuta foi de 

0,39% para 100% das cepas de C. albicans. No entanto, 70% das cepas 

de C. tropicalis apresentaram inibição a 1% do óleo, já para as cepas de 

C. glabrata, 70% delas apresentaram CIM de 2% (Tabela 3).  

 
Tabela 3 – Porcentagem de cepas dos microrganismos inibidos pelo óleo essencial de 

Tagetes minuta em relação à CIM 
 

Microrganismos 
Porcentagem da diluição do óleo essencial de T. minuta 

8 4 2 1 0,5 0,25 0,125 0,062 0,031 

S. aureus 100 100 80 20 0 0 0 0 0 

S. epidermidis 100 100 70 30 0 0 0 0 0 

S. mutans 100 70 30 0 0 0 0 0 0 

C. tropicalis 100 100 100 70 20 10 0 0 0 

C. glabrata 100 100 70 20 10 0 0 0 0 

 
 

 

 

 

 



60 

 

 

A CMM do óleo essencial de T. minuta a 4% foi efetivo 

para 80% das cepas de S. aureus, para 70% das cepas de S. epidermidis, 

8% para 70% das cepas de S. mutans, e 0,78% para 100% das cepas de 

Candida albicans, 2% para 70% das cepas de C. tropicalis e para 50% 

das cepas de C. glabrata (Tabela 4). 

 
Tabela 4 – Porcentagem de cepas dos microrganismos inibidos pelo óleo essencial de 

Tagetes minuta em relação à CMM 
 

Microrganismos 
Porcentagem da diluição do óleo essencial de T. minuta 

8 4 2 1 0,5 0,25 0,125 0,062 0,031 

S. aureus 100 80 20 0 0 0 0 0 0 

S. epidermidis 100 70 30 0 0 0 0 0 0 

S. mutans 70 30 10 0 0 0 0 0 0 

C. tropicalis 100 100 70 20 10 0 0 0 0 

C. glabrata 100 100 50 30 20 0 0 0 0 

 

 

5.5 Efeitos do óleo essencial de Tagetes minuta sobre biofilme  
 
 

Foi utilizado o óleo essencial de Tagetes minuta a 0,78% 

sobre biofilme de C. albicans, o mesmo apresentou atividade 

antimicrobiana isoladamente ou em associações dos microrganismos. 

Houve diferença estatisticamente significante entre os grupos óleo 

essencial e controle para os biofilmes formados por C. albicans              

(p= 0,0001), C. albicans e S. aureus (p = 0,0001), C. albicans e S. mutans    

(p = 0,0001), C. albicans, S. aureus e S. mutans (p = 0,001). Esses 

resultados estão representados na Figura 24. 



61 

 

 

C. albicans

0 2 4 6 8

*C. albicans

*C. albicans+S. aureus

*C. albicans+S. mutans

*C. albicans+S. aureus+S. mutans Óleo
Controle

UFC/mL (Log)

Bi
of

ilm
e

 
Figura 24- Médias e Desvio padrão dos dados de UFC/mL (Log) obtidos nos teste de 

biofilme de Candida albicans isolado ou em associações.  

* Diferença estatística (p ≤ 0,05) 

 

No biofilme formado por S. aureus isoladamente ou em 

associações foi utilizado a óleo essencial de T. minuta a 8%. Houve 

diferença estatisticamente significante entre os grupos óleo essencial e 

controle para os biofilmes formados por S. aureus (p = 0,004), S. aureus e 

S. mutans e (p = 0,001), S. aureus, C. albicans e S. mutans (p = 0,0001). 

Com exceção do grupo S. aureus e C. albicans (p = 0,372). Esses 

resultados estão representados na Figura 25 . 

S. aureus

0 2 4 6 8

*S. aureus

S. aureus+C. albicans

*S. aureus+S. mutans

*S. aureus+C. albicans+S. mutans Óleo
Controle

UFC/mL (Log)

Bi
of

ilm
e

 
Figura 25- Médias e Desvio padrão dos dados de UFC/mL (Log) obtidos nos teste de 

aderência de S. aureus isolado ou em associações.  

* Diferença estatística (p ≤ 0,05) 



62 

 

 

A mesma diluição do óleo essencial de T. minuta a 8% foi 

aplicados no biofilme de S. mutans isoladamente ou em associações. 

Houve diferença estatisticamente significante entre os grupos óleo 

essencial e controle para os biofilmes formados por S. mutans                 

(p = 0,0001), S. mutans e Candida albicans (p = 0,0001), S. mutans e      

S. aureus (p = 0,011) e nas associações de Candida albicans, S. aureus e 

S. mutans (p = 0,0001). Esses resultados estão representados na Figura 

26.  

S. mutans

0 2 4 6 8

*S. mutans

*S. mutans+C. albicans

*S. mutans+S. aureus

*S. mutans+C. albicans+S. aureus Óleo
Controle

UFC/mL (Log)

Bi
of

ilm
e

 
Figura 26 – Médias e Desvio padrão dos dados de UFC/mL (Log) obtidos nos teste de 

aderência de S. mutans isolado ou em associações.  

* Diferença estatística (p ≤ 0,05) 

 

Analisando todos os grupos, pode-se observar que o 

biofilme formado por S. mutans apresentou maior número de UFC/mL 

quando o biofilme foi formado pelo microrganismo isolado (Figura 26)  

 

 

5.6 Visualização em MEV dos efeitos do óleo essencial de T. minuta 
no biofilme  
 
 

Foram realizados testes de aderência em corpos-de-prova 

em resina acrílica para a visualização em microscopia eletrônica de 

varredura de acordo com os grupos experimentais. Através das análises 



63 

 

 

produzidas por MEV foi possível visualizar a aderência no diferentes 

grupos experimentais utilizando o tratamento com o óleo essencial de 

Tagetes minuta L. (Figuras 27 a 36).  
 

      
 (a) (b) 

      
 (c) (d) 
Figura 27 – MEV de biofilmes de C. albicans, (G1) em corpos-de-prova em resina acrílica  

após 5 dias de crescimento. (a) MEV do corpo-de-prova com biofilme após 
tratamento com óleo essencial de T. minuta à 0,78% por 5 min, aumento 
1000x; (b) MEV do corpo-de-prova do controle aumento 1000x; (c) MEV do 
corpo-de-prova com biofilme após tratamento com o óleo essencial de T. 
minuta, aumento 5000x; (d) MEV do corpo-de-prova do controle, aumento 
5000x. Observa-se redução no número de microrganismo (Figura 27c e 
27d).  

 
 
 



64 

 

 

      
 (a) (b) 

      
 (c) (d) 
Figura 28 – MEV de biofilmes de S. aureus (G2) em corpos-de-prova em resina acrílica  

após 5 dias de crescimento. (a) MEV do corpo-de-prova com biofilme após 
tratamento com óleo essencial de T. minuta à 8% por 5 min, aumento 
1000x; (b) MEV do corpo-de-prova do controle aumento 1000x; (c) MEV do 
corpo-de-prova com biofilme após tratamento com o óleo essencial de T. 
minuta, aumento 5000x; (d) MEV do corpo-de-prova do controle, aumento 
5000x. Ocorreu pequena diminuição de microrganismo na Figura 28a e 28c 
para Figura 28b e 28d. 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 



65 

 

 

      
 (a) (b) 

      
 (c) (d) 
Figura 29 – MEV de biofilmes de S. mutans (G3) em corpos-de-prova de resina acrílica 

após 5 dias de crescimento. (a) MEV do corpo-de-prova com biofilme após 
tratamento com óleo essencial de T. minuta à 8% por 5 min, aumento 
1000x; (b) MEV do corpo-de-prova do controle aumento 1000x; (c) MEV do 
corpo-de-prova com biofilme após tratamento com o óleo essencial de T. 
minuta, aumento 5000x; (d) MEV do corpo-de-prova do controle, aumento 
5000x. Observa-se nas figuras a formação de um biofilme mais espesso. 
Não foi possível observar redução após o tratamento com o óleo essencial, 
embora se observa que na Figura 29c os microrganismos estão menos 
compactados em relação a Figura 29d. 

 

 

 

 

 



66 

 

 

      
 (a) (b) 

       
 (c) (d) 
Figura 30 – MEV de biofilmes em associações de C. albicans e S. aureus (G4) em 

corpos-de-prova de resina acrílica  após 5 dias de crescimento. (a) MEV do 
corpo-de-prova com biofilme após tratamento com óleo essencial de T. 
minuta à 0,78% por 5 min, aumento 1000x; (b) MEV do corpo-de-prova do 
controle aumento 1000x; (c) MEV do corpo-de-prova com biofilme após 
tratamento com o óleo essencial de T. minuta, aumento 5000x; (d) MEV do 
corpo-de-prova do controle, aumento 5000x. Observa-se um aglomerado 
das células fúngicas e bacterianas (Figuras 30c e 30d). 

 

 

 

 

 

 



67 

 

 

      
 (a) (b) 

      
 (c) (d) 
Figura 31 – MEV de biofilmes em associações de C. albicans e S. aureus (G4) em 

corpos-de-prova de resina acrílica  após 5 dias de crescimento. (a) MEV do 
corpo-de-prova com biofilme após tratamento com óleo essencial de T. 
minuta à 8% por 5 min, aumento 1000x; (b) MEV do corpo-de-prova do 
controle aumento 1000x; (c) MEV do corpo-de-prova com biofilme após 
tratamento com o óleo essencial de T. minuta, aumento 5000x; (d) MEV do 
corpo-de-prova do controle, aumento 5000x. Observa-se maior quantidade 
de C. albicans e S. aureus no grupo controle (Figura 31d), entretanto a 
análise estatística não foi significativa para S. aureus. 

 

   

 

 



68 

 

 

            
 (a) (b) 

       
 (c) (d) 
Figura 32 – MEV de biofilmes em associações de C. albicans e S. mutans (G5) em 

corpos-de-prova em resina acrílica  após 5 dias de crescimento. (a) MEV 
do corpo-de-prova com biofilme após tratamento com óleo essencial de T. 
minuta à 0,78% por 5 min, aumento 1000x; (b) MEV do corpo-de-prova do 
controle aumento 1000x; (c) MEV do corpo-de-prova com biofilme após 
tratamento com o óleo essencial de T. minuta, aumento 5000x; (d) MEV do 
corpo-de-prova do controle, aumento 5000x. Observa-se que na 
concentração utilizada o óleo teve pouca redução no número de células, 
embora a análise estatística foi significativa (Figura 32c). 

 

 

 

 

 

 



69 

 

 

      
 (a) (b) 

      
 (c) (d) 
Figura 33 – MEV de biofilmes em associações de C. albicans e S. mutans (G5) em 

corpos-de-prova em resina acrílica  após 5 dias de crescimento. (a) MEV 
do corpo-de-prova com biofilme após tratamento com óleo essencial de T. 
minuta à 8% por 5 min, aumento 1000x; (b) MEV do corpo-de-prova do 
controle aumento 1000x; (c) MEV do corpo-de-prova com biofilme após 
tratamento com o óleo essencial de T. minuta, aumento 5000x; (d) MEV do 
corpo-de-prova do controle, aumento 5000x. Com relação a Figura 32c 
observa-se que na Figura 33c teve uma maior redução no número de 
células devido à maior concentração do óleo essencial de T. minuta a 8%. 

 

 

 

 

 



70 

 

 

      
 (a) (b) 

      
 (c) (d) 
Figura 34 – MEV de biofilmes em associações de S. mutans e S. aureus (G6) em corpos-

de-prova em resina acrílica  após 5 dias de crescimento. (a) MEV do corpo-
de-prova com biofilme após tratamento com óleo essencial de T. minuta à 
8% por 5 min, aumento 1000x; (b) MEV do corpo-de-prova do controle 
aumento 1000x; (c) MEV do corpo-de-prova com biofilme após tratamento 
com o óleo essencial de T. minuta, aumento 5000x; (d) MEV do corpo-de-
prova do controle, aumento 5000x. A Figura 34d apresenta uma camada 
espessa e volumosa de células bacterianas em relação a Figura 34c.  

 

 

 

 

 

 



71 

 

 

      
 (a) (b) 

      
 (c) (d) 
Figura 35 – MEV de biofilmes em associações de C. albicans, S. aureus e S. mutans 

(G7) em corpos-de-prova em resina acrílica  após 5 dias de crescimento. 
(a) MEV do corpo-de-prova com biofilme após tratamento com óleo 
essencial de T. minuta à 0,78% por 5 min, aumento 1000x; (b) MEV do 
corpo-de-prova do controle aumento 1000x; (c) MEV do corpo-de-prova com 
biofilme após tratamento com o óleo essencial de T. minuta aumento 5000x; 
(d) MEV do corpo-de-prova do controle, aumento 5000x. Observa-se um 
aglomerado de células microbianas na Figura 35d com relação a Figura 35c. 

 

 

 

 

 

 



72 

 

 

      
 (a) (b) 

      
 (c) (d) 
Figura 36 – MEV de biofilmes em associações de C. albicans, S. aureus e S. mutans 

(G7) em corpos-de-prova em resina acrílica  após 5 dias de crescimento. 
(a) MEV do corpo-de-prova com biofilme após tratamento com óleo 
essencial de T. minuta à 8% por 5 min, aumento 1000x; (b) MEV do corpo-
de-prova do controle aumento 1000x; (c) MEV do corpo-de-prova com 
biofilme após tratamento com o óleo essencial de T. minuta, aumento 
5000x; (d) MEV do corpo-de-prova do controle, aumento 5000x. Observa-se 
uma redução do número de células bacterianas e fúngicas (Figura 36c) em 
relação a Figura 35c. 

 

 

 

 

 



73 

 

 

5.7 Concentração inibitória e microbicida mínima (CIM e CMM) do 
óleo essencial de Curcuma zedoaria Roscoe 
 
 

O óleo essencial de C. zedoaria apresentou CIM de 

6,25% para 50% das cepas de S. aureus e para 30% das cepas de S. 

epidermidis. Para S. mutans, a concentração do óleo essencial de C. 

zedoaria a 12,5% inibiu 40% das cepas estudadas (Tabela 5).  

Para as leveduras do gênero Candida avaliadas, também, 

apresentaram atividade fungistática para o óleo essencial de C. zedoaria. 

A concentração inibitória mínima do óleo essencial de C. zedoaria foi de 

0,78% para 70% das cepas de C. albicans. As cepas de C. tropicalis e C. 

glabrata na diluição 12,5% do óleo apresentaram inibição de 50 e 40% 

respectivamente. No grupo controle houve crescimento microbiano para 

todas as cepas estudadas.  

 
Tabela 5 – Porcentagem de cepas dos microrganismos inibidos pelo óleo essencial de C. 

zedoaria em relação à CIM 
 

Microrganismos 
Porcentagem da diluição do óleo essencial de C. zedoaria 

25 12,5 6,25 3,12 1,56 0,78 0,39 0,19 0,09 

S. aureus 100 100 50 20 20 10 0 0 0 

S. epidermidis 100 60 30 10 0 0 0 0 0 

S. mutans 40 40 10 10 0 0 0 0 0 

C. albicans 100 100 100 100 100 70 30 0 0 

C. tropicalis 100 50 40 10 0 0 0 0 0 

C. glabrata 100 40 30 30 0 0 0 0 0 

 

 

 

 

 



74 

 

 

A CMM do óleo essencial de C. zedoaria foi 12,5% para 

50% das cepas de S. aureus, 25% para 60% das cepas de S. epidermidis, 

50% para 40% das cepas de S. mutans e 3,12% para 70% das cepas de 

Candida albicans. Nas cepas de C. tropicalis e C. glabrata 50 e 40% 

respectivamente apresentaram efeito fungicida a 25% do óleo essencial 

(Tabela 6). Ocorreu crescimento em todas as cepas analisadas em todas 

as diluições. 

 
Tabela 6 – Porcentagem de cepas dos microrganismos inibidos pelo óleo essencial de C. 

zedoaria em relação à CMM 
 

Microrganismos 
Porcentagem da diluição do óleo essencial de C. zedoaria 

50 25 12,5 6,25 3,12 1,56 0,78 0,39 0,19 

S. aureus 100 100 50 20 20 10 0 0 0 

S. epidermidis 100 60 30 10 0 0 0 0 0 

S. mutans 40 40 10 10 0 0 0 0 0 

C. albicans 100 100 100 100 70 20 10 0 0 

C. tropicalis 100 50 40 10 0 0 0 0 0 

C. glabrata 100 40 30 30 0 0 0 0 0 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



75 

 

 

5.8 Efeitos do óleo essencial de Curcuma zedoaria sobre biofilme  
 

 
No tratamento do biofilme com o óleo essencial de C. 

zedoaria a 3,12% sobre C. albicans isoladamente ou em associações 

apresentou reduções significativas. Houve diferença estatisticamente 

significante entre os grupos óleo essencial e controle para os biofilmes 

formados por C. albicans (p = 0,001), C. albicans e S. aureus (p = 0,034), 

Candida albicans e S. mutans (p = 0,0001), C. albicans, S. aureus e S. 

mutans (p = 0,001). Esses resultados estão representados na Figura 37. 

 

C. albicans

0 2 4 6 8

*C. albicans

*C.albicans+S.aureus

*C.albicans+S. mutans

*C. albicans+S. aureus+S. mutans
Óleo
Controle

UFC/mL (Log)

Bi
of

ilm
e

 
Figura 37 - Médias e Desvio padrão dos dados de UFC/mL (Log) obtidos nos teste de 

biofilme de Candida albicans isolado ou em associações.  

* Diferença estatística (p ≤ 0,05) 

 

O óleo essencial de C. zedoaria a 6,25% apresentou 

atividade antimicrobiana sobre o biofilme formado por S. aureus 

isoladamente ou em associações. Houve diferença estatisticamente 

significante entre os grupos óleo essencial e controle para os biofilmes 

formados por S. aureus (p = 0,025), S. aureus e C. albicans (p = 0,006). 

Para os grupos formados S. aureus e S. mutans (p = 0,063), S. aureus, C. 

albicans e S. mutans (p = 0,264) não houve diferença estatisticamente. 

Esses resultados estão representados na Figura 38. 



76 

 

 

S. aureus

0 2 4 6 8

*S. aureus

*S. aureus+C. albicans

S. aureus+S. mutans

S. aureus+C. albicans+S. mutans Óleo
Controle

UFC/mL (Log)

Bi
of

ilm
e

 
Figura 38 - Médias e Desvio padrão dos dados de UFC/mL (Log) obtidos nos teste de 

aderência de S. aureus isolado ou em associações.  

* Diferença estatística (p ≤ 0,05) 

 

O óleo essencial de C. zedoaria a 3,12% apresentou 

atividade antimicrobiana no biofilme isoladamente ou em associações de 

S. mutans. Houve diferença estatisticamente significante entre os grupos 

óleo essencial e controle para os biofilmes formados por S. mutans         

(p = 0,0001), S. mutans e C. albicans (p = 0,0001), S. mutans e S. aureus 

(p = 0,0001), C. albicans, S. aureus e S. mutans (p = 0,017). Esses 

resultados estão representados na Figura 39. 

 

S. mutans

0 2 4 6 8

*S. mutans

*S. mutans+C. albicans

*S. mutans+S. aureus

*S.mutans+C. albicans+S. aureus
Óleo
Controle

UFC/mL (Log)

Bi
of

ilm
e

 
Figura 39 – Médias e Desvio padrão dos dados de UFC/mL (Log) obtidos nos teste de 

aderência de S. mutans isolado ou em associações. 

* Diferença estatística (p ≤ 0,05) 



77 

 

 

Analisando todos os grupos formados, pode-se observar 

que S. mutans apresentaram menor número de UFC/mL do tratamento 

em relação aos outros microrganismos (Figura 39).  

 
 

5.9 Visualização em MEV dos efeitos do óleo essencial de C. zedoaria 
no biofilme  
 
 

 

Após a avaliação dos dados em UFC/mL e a análise 

estatística, foram realizados testes de aderência em corpos-de-prova em 

resina acrílica  para a visualização em microscopia eletrônica de 

varredura de acordo com os grupos experimentais. Através das análises 

de MEV foi possível visualizar a aderência nos diferentes grupos 

experimentais utilizando o tratamento com o óleo essencial de Curcuma 

zedoaria (Figuras 40 a 46).  

 

 

 

 

 

 

 

 



78 

 

 

      
 (a) (b) 

      
 (c) (d) 
Figura 40 – MEV de biofilmes de C. albicans (G1) em corpos-de-prova de resina acrílica 

após 5 dias de crescimento. (a) MEV do corpo-de-prova com biofilme após 
tratamento com óleo essencial de C. zedoaria à 3,12% por 5 min, aumento 
1000x; (b) MEV do corpo-de-prova do controle aumento 1000x; (c) MEV do 
corpo-de-prova com biofilme após tratamento com o óleo essencial de C. 
zedoaria, aumento 5000x; (d) MEV do corpo-de-prova do controle, aumento 
5000x. Na Figura 40a e 40c se observa redução do número de células 
fúngicas em relação a Figura 40b e 40d. 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 



79 

 

 

      
 (a) (b) 

      
 (c) (d) 
Figura 41 – MEV de biofilmes de S. aureus (G2) em corpos-de-prova em resina acrílica  

após 5 dias de crescimento. (a) MEV do corpo-de-prova com biofilme após 
tratamento com óleo essencial de C. zedoaria à 6,25% por 5 min, aumento 
1000x; (b) MEV do corpo-de-prova do controle aumento 1000x; (c) MEV do 
corpo-de-prova com biofilme após tratamento com o óleo essencial de C. 
zedoaria, aumento 5000x; (d) MEV do corpo-de-prova do controle, aumento 
5000x. Observa-se um aglomerado de células bacterianas na Figura 41d em 
relação a Figura 41c. De todos os biofilmes formados as cepas de S. aureus 
foram as que apresentaram maior crescimento tanto no biofilme isolado 
como nas associações. 

 
 
 
 
 
 
 
 



80 

 

 

      
 (a) (b) 

      
 (c) (d) 

 
Figura 42 – MEV de biofilmes de S. mutans (G3) em corpos-de-prova em resina acrílica  

após 5 dias de crescimento. (a) MEV do corpo-de-prova com biofilme após 
tratamento com óleo essencial de C. zedoaria à 3,12% por 5 min, aumento 
1000x; (b) MEV do corpo-de-prova do controle aumento 1000x; (c) MEV do 
corpo-de-prova com biofilme após tratamento com o óleo essencial de C. 
zedoaria, aumento 5000x; (d) MEV do corpo-de-prova do controle, aumento 
5000x. Na Figura 42c teve redução no número de células bacterianas em 
relaçãoa Figura 42d. 

 
 
 
 
 
 
 
 



81 

 

 

      
 (a) (b) 

      
 (c) (d) 
Figura 43 – MEV de biofilmes em associações de C. albicans e S. aureus (G4) em 

corpos-de-prova em resina acrílica  após 5 dias de crescimento. (a) MEV 
do corpo-de-prova com biofilme após tratamento com óleo essencial de C. 
zedoaria à 6,25% por 5 min, aumento 1000x; (b) MEV do corpo-de-prova 
do controle aumento 1000x; (c) MEV do corpo-de-prova com biofilme após 
tratamento com o óleo essencial de T. minuta, aumento 5000x; (d) MEV do 
corpo-de-prova do controle, aumento 5000x. Observa-se uma concentração 
de células microbianas (Figura 43d), enquanto que na Figura 43c houve 
redução no número de células fúngicas. 

 

 

 

 

 

 



82 

 

 

      
 (a) (b) 

      
 (c) (d) 
Figura 44 – MEV de biofilmes em associações de C. albicans e S. mutans (G5) de 

corpos-de-prova em resina acrílica  após 5 dias de crescimento. (a) MEV 
do corpo-de-prova com biofilme após tratamento com óleo essencial de C. 
zedoaria à 3,12% por 5 min, aumento 1000x; (b) MEV do corpo-de-prova 
do controle aumento 1000x; (c) MEV do corpo-de-prova com biofilme após 
tratamento com o óleo essencial de C. zedoaria, aumento 5000x; (d) MEV 
do corpo-de-prova do controle, aumento 5000x. Observa-se uma redução 
no número de C. albicans (Figura 44c). 

 

 

 

 

 

 



83 

 

 

      
 (a) (b) 

      
 (c) (d) 
Figura 45 – MEV de biofilmes em associações de S. mutans eS. aureus (G6) em corpos-

de-prova de resina acrílica  após 5 dias de crescimento. (a) MEV do corpo-
de-prova com biofilme após tratamento com óleo essencial de C. zedoaria à 
3,12% por 5 min, aumento 1000x; (b) MEV do corpo-de-prova do controle 
aumento 1000x; (c) MEV do corpo-de-prova com biofilme após tratamento 
com o óleo essencial de C. zedoaria, aumento 5000x; (d) MEV do corpo-de-
prova do controle, aumento 5000x. Observa-se uma menor aglomeração de 
células na Figura 45c com relação a Figura 45d, entretanto não houve 
diferença estatística no grupo S. mutans e S. aureus. 

 

 

 

 

 



84 

 

 

 

      
 (a) (b) 

      
 (c) (d) 
Figura 46 – MEV de biofilmes em associações de C. albicans, S. aureus e S. mutans 

(G7) em corpos-de-prova em resina acrílica  após 5 dias de crescimento. 
(a) MEV do corpo-de-prova com biofilme após tratamento com óleo 
essencial de C. zedoaria à 3,12% por 5 min, aumento 1000x; (b) MEV do 
corpo-de-prova do controle aumento 1000x; (c) MEV do corpo-de-prova com 
biofilme após tratamento com o óleo essencial de C. zedoaria, aumento 
5000x; (d) MEV do corpo-de-prova do controle, aumento 5000x. Observa-se 
a presença de polissacarídeos extracelulares (Figura 46a). 

 

 

 

 



85 

 

 

6 DISCUSSÃO 

 
 
 
 

Plantas medicinais têm sido utilizadas em vários países 

como tratamento alternativo no combate de diversas doenças, tanto na 

forma de extratos brutos, purificados, ou componentes bioativos isolados 

(Duarte et al., 2005). Muitos extratos de plantas e óleos essenciais 

isolados de plantas medicinais têm demonstrado exercer atividade 

biológica “in vitro” e “in vivo” (Kalemba; Kunicka, 2003; Kim, 2005; Bakkali 

et al., 2007; Palombo, 2009). 

Pesquisas com extratos ou óleos essenciais provenientes 

de espécies vegetais estão sendo realizadas com o objetivo de buscar 

uma aplicação racional dos princípios ativos desses vegetais no 

tratamento de infecções causadas por fungos, bactérias, parasitas ou 

vírus (Kunicka, 2003; Alves et al., 2000; Gurib-Fakim, 2006). Atualmente, 

muitas pesquisas estão sendo desenvolvidas utilizando-se de 

microrganismos patogênicos e resistentes aos antimicrobianos 

(Nascimento et al., 2000; Sartoratto et al., 2004). Diversos estudos 

realizados, assim como os resultados do presente estudo, revelaram 

potencial das plantas para tratamento terapêutico (Manohar et al., 2001; 

Rojas et al., 2003; Fisher; Phillips, 2008; Khan et al., 2008). Os óleos 

essenciais, coletados de diferentes plantas, e, utilizados no presente 

trabalho apresentaram capacidade microbicida para os microrganismos 

na forma planctônica, mesmo quando empregados em baixas 

concentrações. No presente estudo, os óleos essenciais das espécies 

Cymbopogon citratus, Curcuma zedoaria e Tagetes minuta foram também 

testados em biofilmes, onde é sabido que os microrganismos são mais 

resistentes aos antimicrobianos quando comparado com a forma 



86 

 

 

planctônica. A principal observação é que os óleos essenciais 

apresentaram efeitos antimicrobianos quando aplicados sobre biofilmes.  

O aumento da resistência aos antimicrobianos 

convencionais adquiridas pelos microrganismos é crescente e as 

perspectivas futuras da produção e uso de novos antimicrobianos ainda 

continua incerta. Desta forma, o uso das substâncias extraídas dos 

vegetais de conhecida atividade antimicrobiana podem ser significativos 

nos tratamentos terapêuticos (Loguercio et al., 2005). Os resultados 

obtidos no presente trabalho permitiram sugerir que as substâncias 

naturais presentes em Cymbopogon citratus, Curcuma zedoaria e Tagetes 

minuta podem constituir perspectiva para a obtenção de antibióticos 

naturais. Novos estudos avaliando a caracterização química, 

farmacológica e toxicológica dessas substâncias devem ser realizados, 

visando garantir o uso racional das plantas medicinais e aromáticas 

avaliadas. 

Para a extração dos princípios ativos de Cymbopogon 

citratus são utilizados diferentes métodos de preparo de suas folhas. 

Entre eles podemos citar: extrato hidroalcoólico, extrato glicólico e óleo 

essencial (Onawunmi,1989; Schuck et al., 2001; Sartoratto et al., 2004; 

Duarte et al., 2005). Em nosso estudo não foram testados os 

componentes do óleo essencial separadamente, entretanto, o óleo 

essencial de C. citratus apresenta três componentes principais em sua 

composição: alfa citral (geranial), beta citral (neral) e myrceno. Alfa citral e 

beta citral apresentam atividade antimicrobiana sobre microrganismos 

Gram-positivos e Gram-negativos. 

Nos resultados do presente estudo, o óleo essencial de C. 

citratus demostrou maior ação frente às cepas de C. albicans, C. tropicalis 

e C. glabrata, sendo efetivo na inibição e eliminação desses 

microrganismos. Observou-se também que o mesmo óleo foi eficaz contra 

bactérias S. epidermidis, S. aureus e S. mutans. Almeida et al. (2008) 

avaliaram a atividade antimicrobiana do extrato hidroalcoólico de C. 



87 

 

 

citratus por meio do método da microdiluição em caldo sobre Candida 

spp. e os resultados demonstraram que o extrato foi efetivo na 

concentração de 62,5 mg/mL para 96,6% das cepas de C. albicans e na 

concentração de 125 mg/mL para 50% das cepas C. 

tropicalis,concordando com os resultados do presente estudo. 

Também, foram encontrados efeitos antimicrobianos 

utilizando óleo essencial de C. citratus, por Onawunmi (1989), que 

analisaram a ação deste óleo a 0,05% sobre Staphylococcus aureus, 

Bacillus subtilis e Escherichia coli, pelo método de difusão em agar. O 

autor observou halos de inibição de 15 mm para E. coli, e 32 mm para B. 

subtilis e S. aureus, concluindo que o óleo essencial de C. citratus 

apresentou uma boa atividade antimicrobiana mesmo em baixas 

concentrações.  

Schuck et al. (2001), encontraram atividade antifúngica do 

óleo essencial de C. citratus sobre cepas de Candida albicans, C. 

parapsilosis e C. krusei, utilizando o método de difusão radial em agar. Os 

autores avaliaram a atividade antimicrobiana do extrato aquoso e óleo 

essencial de C. citratus em cepas padrão (ATCC) de S. aureus, E. coli e 

C. albicans e os resultados revelaram que o infuso das folhas frescas e a 

porção citral do óleo demonstraram atividade pa