UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS – RIO CLARO unesp PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS (MICROBIOLOGIA APLICADA ) Seleção de fungos termofílicos para produção de lípase e aplicação na produção de biodiesel ANA LÚCIA FERRAREZI Tese apresentada ao Instituto de Biociências do Câmpus de Rio Claro, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas – Microbiologia Aplicada. FEVEREIRO - 2011 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS – RIO CLARO unesp PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS (MICROBIOLOGIA APLICADA ) Seleção de fungos termofílicos para produção de lípase e aplicação na produção de biodiesel ANA LÚCIA FERRAREZI Tese apresentada ao Instituto de Biociências do Câmpus de Rio Claro, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas – Microbiologia Aplicada. FEVEREIRO - 2011 Orientadora: Eleni Gomes Co-orientador: Gustavo O. Bonilla-Rodriguez Dedico este trabalho aos meus pais, minhas irmãs, e ao meu marido, pois sempre me incentivaram a continuar a caminhada. "A verdadeira felicidade está na própria casa, entre as alegrias da família." (Leon Tolstoi) “As grandes idéias surgem da observação dos pequenos detalhes.” (Augusto Cury) Agradeço: À Deus, por iluminar meus olhos diante dos pequenos detalhes e por colocar em meu caminho tantas pessoas importantes. À Profª Drª Eleni Gomes, que me recebeu em seu grupo de pesquisa, pela orientação, incentivos e ensinamentos valiosos. À minha família, meus pais Paulo e Cidinha, minhas irmãs Aline e Andressa, e meu marido Elison, por serem meu porto seguro nos momentos de tristeza, dificuldade e de alegrias. Ás amigas queridas Bárbara M. Bonine, Tássia C. Egea, Débora N. Okamoto e Letícia M. Zamphorlim, pelo companheirismo e principalmente por sempre estarem ao meu lado nos momentos mais difíceis dessa fase da minha vida. Aos professores que colaboraram para o andamento desse projeto, Dr. Geraldo Nery, Dr. Gustavo O. Bonilla Rodriguez e Dr. Roberto da Silva por valiosas contribuições ao longo do trabalho. À Profª Drª Heizir Ferreira de Castro por me receber de tão longe e me ensinar os caminhos para chegar ao misterioso Biodiesel e ao Prof. Dr. Mauricio Boscolo, que apesar do tempo escasso, está sempre disponível para infindáveis dúvidas. À Profª Drª Dejanira de Franceschi de Angelis pela paciência e compreensão durante a disciplina Microbiologia e Bioquímica da Fermentação etanólica. Aos meus novos companheiros na busca por enzimas Janaina Pires Borges e Thiago H. Kobe Ohe pela contribuição e o companheirismo de vocês que foram fundamentais para que tudo desse certo e aos mais novos integrantes do nosso grupo e não menos importantes, Bárbara Garcia, Rafaela Rodrigues de Brito, Jacqueline Shimizu e Pedro Henrique Vendramini. A todos os companheiros do laboratório de Bioquímica e Microbiologia Aplicada pela maravilhosa convivência, risadas, baladinhas, bolos e almoço-terapia: Bárbara Bonine, Tássia, Fabiana, Natalia, Andréia, Ellen, Daniela, Carolina Merheb, Milla, Larissa, Rodrigo Simões Leite, Ariane Zanchetta, Gisele, Carolina Bezerra, Ricardo, Thiago, Josiane, Bárbara Garcia, Rodolfo, André, Ruan, Márcia, Cristiane e à Priscila e Rosângela mesmo não estando mais em nosso laboratório foram importantes na minha história. Às amigas do laboratório de Bioquímica de proteínas Patrícia Peres Polizelli, Rejane Ouchi, Angélica Souza, Evandro Ricardi, Lílian Caroline Oliveira e Laís Ramires Mendicino pela longa convivência desde o mestrado, pelo carinho, amizade e companheirismo. À Lívia Souza, Grazielle Silva e Poliana Tiosso que me receberam em Lorena e me ensinaram muito. Pelo companheirismo durante os 20 dias que fiquei com vocês, foi muito bom conhecê-las. À FAPESP pelo imprescindível apoio financeiro. “No fim tudo dá certo, Se não deu certo É porque ainda não chegou ao fim.” (Fernando Sabino) “Posso ter defeitos, viver ansioso e ficar irritado algumas vezes, mas não esqueço de que minha vida é a maior empresa do mundo. E que posso evitar que ela vá à falência. Ser feliz é reconhecer que vale a pena viver, apesar de todos os desafios, incompreensões e períodos de crise. Ser feliz é deixar de ser vítima dos problemas e se tornar um autor da própria história. É atravessar desertos fora de si, mas ser capaz de encontrar um oásis no recôndito da sua alma. É agradecer a Deus a cada manhã pelo milagre da vida. Ser feliz é não ter medo dos próprios sentimentos. É saber falar de si mesmo. É ter coragem para ouvir um não. É ter segurança para receber uma crítica, mesmo que injusta.” (Augusto Cury) RESUMO As enzimas são catalisadores muito eficientes e de grande interesse na aplicação industrial. As lipases (E.C. 3.1.1.3) são serina-hidrolases que agem na hidrólise, esterificação e transesterificação de acilgliceróis de cadeia longa. Lipases microbianas têm sido amplamente usadas devido à sua especificidade. Na transesterificação moléculas de triacilglicerol reagem com um álcool na presença de um catalisador formando uma mistura de glicerol e ésteres de ácidos graxos. O biodiesel, definido como ésteres metílicos ou etílicos, tem atraído crescente interesse como uma fonte de energia renovável, substituindo o diesel produzido a partir de combustíveis fósseis. O presente trabalho tem como objetivo principal efetuar a prospecção de fungos termofílicos que apresentem produção significativa de lipase e, concomitantemente, atividade transesterificante. As linhagens foram selecionadas por detecção de atividade lipolítica em placas de ágar contendo Rodamina B, por fermentação submersa (FSm) e fermentação em estado sólido (FES). Foram testadas linhagens de fungos termofílicos da coleção do laboratório de Bioquímica e Microbiologia Aplicada, sendo Thermomucor indicae-seudaticae N31, Rhizomucor pusillus Myceliophtora sp F2.1.4, Myceliophtora sp M7.7, F2.1.1, F2.1.3 e Thermomyces lanuginosus TO-05 os que mostraram um maior potencial hidrolítico. Estudos adicionais avaliaram a produção de lipase através da modificação da fonte de componentes nutricionais e algumas propriedades físicas na produção de lipase por T. indicae-seudaticae N31 em FSm, e por R. pusillus e T. indicae-seudaticae N31 em FES. Os estudos dos processos fermentativos foram bem sucedidos, havendo um aumento de 16 vezes na produção de lipase de R. pusillus e de 36 vezes na lipase de T. indicae-seudaticae N31, ambas em FES. A lipase de T. indicae-seudaticae N31 produzida em FSm e FES foram caracterizadas, a temperatura ótima foi a 40 ºC e a estabilidade em uma faixa de pH de 4 a 8, em ambas as enzimas. A lipase produzida em FSm apresentou pH ótimo 6-7 e se mostrou estável de 35 a 50 ºC, enquanto que a lipase produzida em FES apresentou pH ótimo ao redor de 3-4 e é termolábil. Os fungos: T. indicae-seudaticae N31, R. pusillus, Myceliophtora sp M7.7, F2.1.1, F2.1.3 e T. lanuginosus TO-05 foram selecionados e suas hifas imobilizadas em bucha vegetal por meio de fermentação semi-sólida, e testadas na esterificação e transesterificação. As lipases das hifas imobilizadas apresentaram maiores valores de atividade hidrolítica para todos os fungos quando comparadas com as produzidas em FSm e FES. As hifas imobilizadas foram submetidas à esterificação (ácido oléico e etanol, ácido butírico e n-butanol) e observamos que todos os fungos testados apresentaram atividade. No entanto, R. pusillus e Myceliophtora sp M7.7 apresentaram altos rendimentos na conversão de ácido oléico em etil oleato, sendo o rendimento de 80 e 70%, respectivamente. Assim, esses dois fungos foram selecionados e as suas hifas imobilizadas foram submetidas a transesterificação. É notável que somente as hifas imobilizadas de R. pusillus produziram ésteres na presença de óleo de canola e de soja, com rendimento de apenas 11 e 12%, respectivamente. Entretanto, acreditamos ser importante o estudo das condições da reação na tentativa de aumentar o rendimento, já que muitos fatores podem ser determinantes neste tipo de reação. Palavras-chave: Lipase. Fermentação em estado sólido. Fermentação submersa. Enzimas termofílicas. Imobilização de células. Biodiesel. ABSTRACT Enzymes are efficient catalysts and interesting for industrial applications. Lipases (EC 3.1.1.3) constitute a group of serine hydrolases that catalyze the hydrolysis, esterification and transesterification reactions of long chain acylglycerols. Microbial lipases have been widely used for biotechnological applications due to their specificity. In transesterification, molecule of a tryacylglicerol react with an alcohol in the presence of catalyst, producing a mixture of fatty esters and glycerol. Biodiesel, defined as methyl or ethyl fatty esters and has attracted considerable attention as a renewable source of energy, in substitution of fossil fuels. The main goal of the present work is the screening of thermophilic fungi that present outstanding lipase production and in parallel able to perform transesterification reaction. Strains were screened for lipase activity on agar plates containing Rhodamine B, for submerged fermentation (SmF) and solid state fermentation (SSF). The tested thermophilic strains were from the collections of the Biochemistry and Applied Microbiology Laboratory, where Thermomucor indicae-seudaticae N31, Rhizomucor pusillus Myceliophtora sp F2.1.4, Myceliophtora sp M7.7, F2.1.1, F2.1.3 and Thermomyces lanuginosus TO-05 had the highest lipase production. Additional studies attempted to improve lipase production by nutrient source modifications and physicals conditions in FmS by T. indicae-seudaticae N31 and in FSS by T. indicae-seudaticae N31 and R. pusillus. The fermentations studies were successful, with a 16 fold enhancement in lipase yield compared to the initial medium from lipase R. pusillus and 36 fold for the lipase T. indicae-seudaticae N31, both in FES. The lipase from T. indicae-seudaticae N31 cultured in SSF and SmF, exhibited maximum lipolytic activity at 40 ºC and stability for the pH range from 4 to 8. The enzyme produced by FmS presented maximum activity at pH 6-7 and thermostable at 35-50 ºC, whereas the lipase from FSS displayed an optimum pH around 3-4 and thermal lability. The fungi T. indicae- seudaticae N31, R. pusillus, Myceliophtora sp M7.7, F2.1.1, F2.1.3 and T. lanuginosus TO-05 were selected and their hyphae immobilized in loofa sponges in FmS and tested in esterification and transesterification reactions. The lipases from immobilized hyphae displayed higher hydrolytic activity for all the tested fungi when compared to those produced by FmS and FSS. Immobilized hyphae were submitted to esterification (oleic acid and ethanol, butyric acid and ethanol-butanol), and we observed that all the tested fungi presented activity. However, R. pusillus and Myceliophtora sp M7.7 showed high yields of 80 and 70%, respectively, for the conversion from oleic acid to ethyl oleate. Accordingly, both immobilized fungi were selected and tested for transesterification. Remarkably, only R. pusillus cells showed esters in the presence of canola and soybean oils, with yields of only 11 and 12% respectively. However, we believe that it is important to study the reaction conditions in an attempt to improve ester production, since many factors can be decisive in this type of reaction. Key words: Lipase. Solid state fermentation. Submerged fermentation. Thermophilic enzymes. Immobilized Cells. Biodiesel. APRESENTAÇÃO O objetivo do trabalho foi padronizar metodologias e selecionar cepas fúngicas termofílicas com capacidade de produzir enzimas lipolíticas com propriedade de transesterificação e testá-las na produção de biodiesel. Assim, o presente trabalho foi dividido em 5 capítulos. Neste primeiro capítulo são introduzidos os principais itens do trabalho apresentados em uma revisão bibliográfica sobre o tema da pesquisa abordando aspectos sobre as lipases, aplicações biotecnológicas dessas enzimas e lipases termoestáveis, aplicação das lípases na produção de biodiesel e imobilização. Os capítulos 2 e 3 tratam especificamente dos resultados relacionados à seleção de fungos termofílicos produtores de lipase por fermentação submersa e fermentação em estado sólido. Nestes capítulos são apresentadas as linhagens testadas, e os resultados de produção das enzimas em testes de pré-seleção (detecção da atividade lipolítica em placa de petri) e pelas fermentações, ao qual são selecionados alguns fungos de interesse para dar continuidade ao trabalho. No capítulo 4 apresentam-se os dados de caracterização bioquímica das lipases produzidas por Thermomucor indicae-seudaticae N31, linhagem selecionada por apresentar resultados expressivos de produção da enzima tanto por fermentação submersa quanto por fermentação em estado sólido. No capítulo 5 são apresentados os dados de imobilização das hifas fúngicas para realizadas com as linhagens selecionadas nos capítulos 2 e 3. Neste capítulo, também são mostrados os resultados obtidos aplicando-se as hifas imobilizadas na produção de biodiesel e as perspectivas para trabalhos futuros. Ao final do trabalho são acrescentados 2 apêndices, no qual mostram alguns dados adicionais. No apêndice A, são apresentadas algumas tabelas e figuras que complementam o trabalho. O apêndice B trata-se da apresentação de algumas metodologias que foram necessárias a sua padronização e as melhores condições obtidas. LISTA DE ILUSTRAÇÕES Página CAPÍTULO I – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA............................................................ 19 Figura 1. Representação da estrutura α/β-hidrolase e sítio catalítico das lípases.......... 21 Figura 2. Sítio ativo da enzima...................................................................................... 21 Figura 3. Representação esquemática das reações catalisadas pela lipase..................... 22 Figura 4. Representação das reações catalisadas por lípases (Seletividade).................. 23 Figura 5. Mecanismo de ação das lípases...................................................................... 24 Figura 6. Exemplo de lipase na catalise de um intermediário quiral na síntese de fármacos......................................................................................................................... 27 Figura 7. Representação da reação de transesterificação............................................... 31 Figura 8. Efeito da concentração da água na conversão de produtos de transesterificação enzimática e hidrólise............................................................................ 35 CAPÍTULO II – SELEÇÃO DE FUNGOS TERMOFÍLICOS PRODUTORES DE LIPASE EM FERMENTAÇÃO SUBMERSA.................................................................. 47 Figura 1. Curva de lipase em função do tempo de cultivo de T. indicae-seudaticae N31. 58 Figura 2. Curva de lipase em função do tempo de cultivo de Rhizomucor pusillus.......... 59 Figura 3. Curva de lipase em função do tempo de cultivo de Aspergillus sp T4.6.2......... 60 Figura 4. Curva de lipase em função do tempo de cultivo de Aspergillus sp T4.6.1......... 61 Figura 5. Curva de lipase em função do tempo de cultivo de Aspergillus sp T5.1.2......... 62 Figura 6. Curva de lipase em função do tempo de cultivo de Bothryosphera rodhina..... 63 Figura 7. Efeito da concentração de oleo de soja e de glicoses na produção de lipase em FSm.................................................................................................................................... 66 Figura 8. Efeito do pH inicial do meio de cultivo e da temperatura na produção de lipase em FSm.................................................................................................................... 67 Figura 9. Zimograma SDS-PAGE..................................................................................... 69 CAPÍTULO III – SELEÇÃO DE FUNGOS TERMOFÍLICOS PRODUTORES DE LIPASE EM FERMENTAÇÃO EM ESTADO SÓLIDO................................................. 74 Figura 1. Efeito da composição do substrato sólido e da quantidade de inoculo sobre a produção de lipase Thermomucor indicae-seudaticae N31............................................... 81 Figura 2. Efeito da composição do tipo de fonte de nitrogênio e sua concentração sobre a produção de lipase Thermomucor indicae-seudaticae N31............................................ 81 Figura 3. Efeito da composição da de fonte de carbono sobre a produção de lipase Thermomucor indicae-seudaticae N31.............................................................................. 83 Figura 4. Efeito do Volume da solução nutriente sobre a produção de lipase Thermomucor indicae-seudaticae N31.............................................................................. 84 Figura 5. Efeito do tipo e volume da solução de extração sobre a produção de lipase Thermomucor indicae-seudaticae N31.............................................................................. 85 Figura 6. Efeito da temperatura sobre produção de lipase por FES pelo Thermomucor indicae-seudaticae N31...................................................................................................... 87 Figura 7. Efeito da suplementação do meio de cultivo e da quantidade de inoculo sobre a produção de lipase por Rhizomucor pusillus................................................................... 88 Figura 8. Efeito da suplementação de carbono e nitrogênio sobre a produção de lipase por Rhizomucor pusillus..................................................................................................... 89 Figura 9. Efeito da concentração de nitrogênio e açúcar no meio de cultivo sobre a produção de lipase por Rhizomucor pusillus...................................................................... 90 Figura 10. Efeito do tipo de óleo e volume de solução nutriente sobre a produção de lipase por Rhizomucor pusillus.......................................................................................... 91 Figura 11. Efeito do tipo e volume da solução de extração sobre a produção de lipase por Rhizomucor pusillus..................................................................................................... 92 Figura 12. Efeito da temperatura sobre a produção de lipase por FES pelo Rhizomucor pusillus............................................................................................................................... 93 Figura 13. Zimograma SDS-PAGE................................................................................... 97 CAPÍTULO IV – CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DE LIPASES PRODUZIDAS POR FUNGOS TERMOFÍLICOS.......................................................... 102 Figura 1. Produção de lipase pelo T. indicae-seudaticae N31 em FES e FSm.................. 107 Figura 2. Efeito do pH na atividade da lipase de T. indicae-seudaticae N31 produzida em FSm e FES.................................................................................................................... 108 Figura 3. Efeito da Temperatura sobre a atividade da lipase de T. indicae-seudaticae N31 produzida em FSm e FES........................................................................................... 109 Figura 4. Efeito da temperatura e do pH sobre a estabilidade da lipase de T. indicae- seudaticae N31 produzida em FSm................................................................................... 110 Figura 5. Efeito da temperatura e do pH sobre a estabilidade da lipase de T. indicae- seudaticae N31 produzida em FES.................................................................................... 111 CAPÍTULO V – IMOBILIZAÇÃO DE HIFAS FÚNGICAS E APLICAÇÃO NA PRODUÇÃO DO BIODIESEL......................................................................................... 115 Figura 1. Medida dos cubos de bucha vegetal e esponja de polipropileno........................ 118 Figura 2. Fermentação submersa com hifas imobilizadas................................................. 122 Figura 3. Bucha vegetal antes após a imobilização das hifas fúngicas ............................. 123 Figura 4. Curva de produção de lipase da hifa imobilizada de Myceliophthora sp F2.1.1 em bucha vegetal................................................................................................................ 124 Figura 5. Myceliophthora sp M7.7 imobilizado em bucha vegetal................................... 124 Figura 6. Curva de produção de lipase da hifa imobilizada de Myceliophthora sp F2.1.3 em bucha vegetal................................................................................................................ 125 Figura 7. Curva de produção de lipase da hifa imobilizada de Myceliophthora sp M7.7 bucha vegetal...................................................................................................................... 126 Figura 8. Curva de produção de lipase da hifa imobilizada de Rhizomucor pusillus em bucha vegetal...................................................................................................................... 127 Figura 9. Atividade de lipase do meio de cultura líquida da FSm de Rhizomucor pusillus............................................................................................................................... 127 Figura 10. Curva de produção de lipase da hifa imobilizada de Thermomucor indicae- seudaticae N31 em bucha vegetal...................................................................................... 128 Figura 11. Curva de produção de lipase da hifa imobilizada de Thermomyces lanuginosus TO-05 em bucha vegetal................................................................................ 129 Figura 12. Atividade de esterificação catalisada por lipases presentes nas hifas imobilizadas de fungos termofílicos.................................................................................. 131 Figura 13. Rendimento das reações de esterificação catalisadas por lipases presentes nas hifas imobilizadas de fungos termofílicos, analisadas por CG.................................... 132 Figura 14. Hidrólise na presença de vários óleos............................................................... 133 Figura 15. Cromatograma da análise da transesterificação catalisada pela hifa de R. pusillus imobilizada em bucha........................................................................................... 134 APÊNDICE A: Figuras e Tabelas...................................................................................... 141 Figura 1A. Detecção da atividade lipolítica em placa em diferentes meios...................... 142 Figura 2A. Detecção da atividade de lipase em placa pelos fungos isolados do ambiente............................................................................................................................. 143 Figura 3A. Detecção da atividade de lipase em placa de fungos coletados e isolados do ambiente............................................................................................................................. 143 Figura 4A. Efeito de variáveis no meio nutriente, usado durante o processo de fermentação submersa pelo Thermomucor indicae-seudaticae N31................................. 144 Figura 5A. Efeito de variáveis no meio nutriente, usado durante o processo de 145 fermentação submersa pelo Rhizomucor pusillus.............................................................. Figura 6A. Cromatograma ilustrando os tempos de retenção dos padrões nas condições ideais no cromatógrafo gasoso........................................................................................... 145 APÊNDICE B: Padronização de Metodologias................................................................. 146 Figura 1B. Efeito da variação da concentração de Triton X-100 na atividade de lipase de Aspergillus sp T4.6.2..................................................................................................... 148 Figura 2B. Efeito da variação da concentração de isopropanol na atividade de lipase de Aspergillus sp T4.6.2......................................................................................................... 148 Figura 3B. Avaliação da atividades de lipase por duas metodologias diferentes.............. 150 Figura 4B. Perfil obtido na análise do padrão de etil éster na presença de lipase de T. indicae-seudaticae N31 analisadas em HPLC................................................................... 151 Figura 5B. Perfil de transesterificação pela lipase de F5.1.3............................................. 152 Figura 6B. Perfil de transesterificação pela lipase de Myceliophthora sp F2.1.3............. 153 Figura 7B. Perfil de transesterificação pela lipase Comercial de Rhizomucor miehei...... 154 Figura 8B. Representação esquemática da preparação de microesferas de quitosana por precipitação em meio alcalino............................................................................................ 155 Figura 9B. Teste realizado para escolha do solvente, etil oleato foi usado como padrão.. 159 Figura 10B. Cromatograma correspondente ao controle da reação................................... 161 Figura 11B. Cromatograma correspondente à reação com a Novozyme 435, como catalisador.......................................................................................................................... 161 Figura 12B. Cromatograma correspondente a reação com a enzima de Candida rugosa como catalisador................................................................................................................ 162 Figura 13B. Cromatograma correspondente a reação com a enzima de Rhizomucor miehei como catalisador..................................................................................................... 162 Figura 14B. Cromatograma correspondente a reação com a enzima de pâncreas de porco como catalisador...................................................................................................... 163 LISTA DE TABELAS Página CAPÍTULO I – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA.................................................................. 19 Tabela 1. Aplicações industriais de lipases microbianas.......................................................................................................................... 26 Tabela 2. Relação de algumas lípases que são utilzadas nas formulações de alguns detergentes........................................................................................................................... 27 Tabela 3. Temperatura e pH ótimos de atividade de algumas lipases microbianas.......................................................................................................................... 29 CAPÍTULO II – – SELEÇÃO DE FUNGOS TERMOFÍLICOS PRODUTORES DE LIPASE EM FERMENTAÇÃO SUBMERSA.............................................................. 47 Tabela 1. Relação de fungos testados na detecção da atividade lipolítica em placa..................................................................................................................................... 53 Tabela 2. Efeito da variação da glicose e da concentração de Tween 80 na produção de lipase em FSm...................................................................................................................................... 56 Tabela 3. Precipitação do extrato bruto da lipase de T. indicae-seudaticae N31 produzida por FSm............................................................................................................... 68 CAPÍTULO III – SELEÇÃO DE FUNGOS TERMOFÍLICOS PRODUTORES DE LIPASE EM FERMENTAÇÃO EM ESTADO SÓLIDO................................................... 74 Tabela 1. Relação dos fungos testados em FES................................................................... 79 Tabela 2. Precipitação do extrato bruto da lipase de T. indicae-seudaticae N31 produzida por FES............................................................................................................... 96 CAPÍTULO V – IMOBILIZAÇÃO DE HIFAS FÚNGICAS E APLICAÇÃO NA PRODUÇÃO DO BIODIESEL........................................................................................... 115 Tabela 1. Dados obtidos da curva de calibração.................................................................. 120 Tabela 2. Comparação entre os diferentes processos de fermentação utilizados para a produção de lipase ............................................................................................................... 130 Tabela 3. Rendimento da reação de transesterificação catalisada pela hifa de R. pusillus imobilizada em bucha.......................................................................................................... 135 APÊNDICE B: Padronização de Metodologias................................................................... 146 Tabela 1B. Apresenta a composição das reações de transesterificação testadas................. 150 Tabela 2B. Atividade das lipases imobilizadas em PHB e quitosana.................................. 157 Tabela 3B. Atividade e umidade das lipases imobilizadas em PHB (poli-hidroxibutirato) e quitosana............................................................................................................................ 157 Tabela 4B. Protocolo de corrida do HPLC de fase reversa.................................................. 159 SUMÁRIO Página CAPÍTULO I – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA................................................................ 19 Lípases............................................................................................................................... 20 Aplicações biotecnológicas das lIpases............................................................................. 25 Lipases termoestáveis........................................................................................................ 28 Aplicação de Lipases na produção de biodiesel................................................................. 30 Imobilização....................................................................................................................... 36 Referencias......................................................................................................................... 38 CAPÍTULO II – SELEÇÃO DE FUNGOS TERMOFÍLICOS PRODUTORES DE LIPASE EM FERMENTAÇÃO SUBMERSA.................................................................. 47 II.1 Introdução.................................................................................................................... 48 II.2 Objetivos..................................................................................................................... 49 2.1 Objetivos específicos................................................................................................... 49 II.3 Materiais e Métodos.................................................................................................... 49 3.1 Seleção de Microrganismos Termofílicos.................................................................... 49 3.2 Meios de cultura ......................................................................................................... 49 3.3 Detecção da atividade lipolítica em placas de Petri..................................................... 50 3.4 Fermentação Submersa (FSm)..................................................................................... 50 3.4.1 Efeitos das concentrações de glicose e óleo de soja dos meios na produção de lipase por FSm................................................................................................................... 51 3.4.2 Efeitos da temperatura e pH sobre a produção de lipase em FSm.................................................................................................................................... 51 3.5 Quantificação da atividade de lipase por hidrólise de sustrato cromogênico.............. 51 3.6 Proteína Total.............................................................................................................. 52 3.7 Precipitação................................................................................................................. 52 3.8 Eletroforese.................................................................................................................. 52 II.4 Resultados e Discussão............................................................................................... 53 4.1 Detecção da atividade lipolítica em placas de Petri.................................................... 53 4.2 Produção de lípases em Fermentação Submersa (FSm).............................................. 55 4.2.1 Efeito do tempo de cultivo na produção de lipase pelos fungos selecionados em FSm.................................................................................................................................... 56 4.3 Efeito das variações das condições de Fermentação submersa sobre a produção de lipase por T. indicae-seudaticae N31................................................................................. 65 4.4 Precipitação e SDS-PAGE........................................................................................... 67 II.5 CONCLUSÃO............................................................................................................. 69 II.6 REFERÊNCIAS.......................................................................................................... 70 CAPÍTULO III – SELEÇÃO DE FUNGOS TERMOFÍLICOS PRODUTORES DE LIPASE EM FERMENTAÇÃO EM ESTADO SÓLIDO................................................. 74 III.1 Introdução.................................................................................................................. 75 III.2 Objetivos.................................................................................................................... 75 2.1 Objetivos específicos................................................................................................... 75 III.3 Materiais e Métodos................................................................................................... 76 3.1 Seleção de Microrganismos Termofílicos.................................................................... 76 3.2 Meios de cultura........................................................................................................... 76 3.3 Fermentação em estado sólido (FES)........................................................................... 76 3.3.1 Estudo da variação das condições de FES sobre a produção de lipase..................... 77 3.4 Quantificação da atividade de lipase por hidrólise de sustrato cromogênico.............. 77 3.5 Proteína Total............................................................................................................... 78 3.6 Precipitação.................................................................................................................. 78 3.7 Eletroforese.................................................................................................................. 78 III.4 Resultados e Discussão.............................................................................................. 79 4.1 Fermentação em Estado Sólido (FES)......................................................................... 79 4.2 Estudo das condições da Fermentação em Estado Sólido por T. indicae-seudaticae N31 e Rhizomucor pusillus................................................................................................ 80 4.3 Precipitação e SDS-PAGE........................................................................................... 95 III.5 Conclusão................................................................................................................... 97 III.6 Referências…………………………………………………………………………. 99 CAPÍTULO IV – CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DE LIPASES PRODUZIDAS POR FUNGOS TERMOFÍLICOS.......................................................... 102 VI.1 Introdução.................................................................................................................. 103 VI.2 Objetivos.................................................................................................................... 104 2.1 Objetivos específicos................................................................................................... 104 VI.3 Materiais e Métodos................................................................................................... 104 3.1 Seleção de Microrganismos Termofílicos.................................................................... 104 3.2 Meios de cultura........................................................................................................... 104 3.3 Fermentação Submersa (FSm)..................................................................................... 105 3.4 Fermentação em estado sólido (FES)........................................................................... 105 3.5 Quantificação da atividade de lipase por hidrólise de sustrato cromogênico.............. 105 3.6 Efeito da Temperatura e pH ótimos............................................................................. 106 3.7 Efeito da Estabilidade em pH e Temperatura.............................................................. 106 IV.4 Resultados e Discussão.............................................................................................. 106 Caracterização bioquímica das lipases do Thermomucor indicae-seudaticae N31 produzidas por FSm e FES................................................................................................. 106 IV.5 Conclusão................................................................................................................... 112 IV.6 Referências…………………………………………………………………………. 113 CAPÍTULO V – IMOBILIZAÇÃO DE HIFAS FÚNGICAS E APLICAÇÃO NA PRODUÇÃO DO BIODIESEL......................................................................................... 115 V.1 Introdução................................................................................................................... 116 V.2 Objetivos..................................................................................................................... 116 2.1 Objetivos específicos................................................................................................... 117 V.3 Materiais e Métodos.................................................................................................... 117 3.1 Meios de cultura........................................................................................................... 117 3.2 Fermentação semi-sólida e imobilização das hifas...................................................... 117 3.3 Quantificação da atividade de lipase hidrolítica por titulometria................................ 118 3.4 Reação de Esterificação............................................................................................... 119 3.5 Reação de Transesterificação....................................................................................... 120 3.6 Análise dos ésteres por Cromatógrafia Gasosa (CG)................................................... 120 V.4 Resultados e Discussão............................................................................................... 121 4.1 Imobilização das hifas fúngicas................................................................................... 121 4.2 Seleção das hifas imobilizadas pela esterificação........................................................ 130 4.3 Transesterificação........................................................................................................ 133 V.5 Conclusão.................................................................................................................... 136 V.6 Referências………………………………………………………………………….. 137 APÊNDICE A: Figuras e Tabelas...................................................................................... 141 APÊNDICE B: Padronização de Metodologias................................................................. 146 Padronização de metodologias........................................................................................... 147 1. Quantificação de atividade de lipase.............................................................................. 147 1.1 Efeito da variação dos componentes do ensaio na metodologia de quantificação da atividade hidrolítica de lipase............................................................................................ 147 1.2 Avaliação dos métodos propostos na quantificação da atividade hidrolítica de lipase.................................................................................................................................. 149 2. Ensaios de transesterificação......................................................................................... 150 2.1 Padronização dos primeiros ensaios de transesterificação e esterificação................... 150 2.2 Padronização da transesterificação de lipases imobilizadas........................................ 155 3. Padronização da metodologia do HPLC........................................................................ 158 3.1 HPLC de Fase Reversa................................................................................................ 158 3.2 Método de quantificação da atividade de transesterificação por HPLC...................... 160 4. Outras Metodologias...................................................................................................... 163 4.1 Quantificação da atividade hidrolítica de lipase por titulometria................................ 163 4.2 Reação de Transesterificação....................................................................................... 164 4.3 Reação de Esterificação............................................................................................... 164 5. Referências..................................................................................................................... 166 CAPÍTULO I: REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 20 Lipases As enzimas possuem a função de catalisar reações nos sistemas biológicos podendo aumentar a velocidade de uma reação em até 1014 vezes. Atualmente, cerca de 4000 enzimas são conhecidas e destas, 200 são de interesse comercial sendo a maioria de origem microbiana (SHARMA et. al., 2001). As enzimas são classificadas de acordo com os tipos de reações que catalisam: oxidoredutases, transferases, hidrolases, liases, isomerases e ligases. Lipases (triacilglicerol acil hidrolases, EC 3.1.1.3) são serino-hidrolases que hidrolisam e modificam ligações carboxil éster de lipideos e seus derivados. As enzimas lipolíticas atuam em uma interface lipídio-água com ação importante sobre compostos insolúveis em água. Apresentam uma estrutura de α/β-hidrolase, pois são constituídas por α- hélices e folhas β (figura 1) (BORNSCHEUER, 2002; KHARE et. al., 2000; JOSEPH et al., 2008). A tríade catalítica é constituída por Ser-His-Asp/Glu. O resíduo de Serina atua como um nucleófilo, comum a todas as hidrolases e essencial para a catálise, e usualmente uma sequência consenso Gly-x-Ser-x-Gly que é encontrada ao redor da Serina do sítio ativo (BHARDWAJ et al., 2001; BORNSCHEUER, 2002; JOSEPH et al., 2008; NEUGNOT et al., 2002). A figura 2 ilustra a tríade catalítica da Calb A (Candida antartica) e a cavidade catalítica ocupada por uma molécula de palmitato (figura 2A) e p-nitrofenil palmitato (figura 2B) (ERICSSON et al., 2008). O sítio é composto por uma folha β central formada por 8 β (β1-β8) conectadas à seis α-hélices (A-F), a ligação do substrato à tríade catalítica é localizada no topo da folha β central (CASTRO et al., 2004; PLEISS et al., 1998; JOSEPH et al., 2008). As esterases possuem uma estrutura bem semelhante às da lipase, mas apresentam uma seqüência motivo Gly-x-x-Leu que não é observada nas lipases. As esterases seguem o modelo cinético simples de Michaelis-Menten, ao qual refere-se à hidrolise de um substrato solúvel em meio aquoso, diferente das lipases que necessitam de uma concentração mínima de substrato para se atingir uma alta atividade, sendo um exemplo perfeito de catálise heterogênea. Essas enzimas podem ser diferenciadas também pelo substrato, lipases preferem substrato insolúvel em água, normalmente triacilglicerol composto por ácidos graxos de cadeia longa, enquanto que as esterases hidrolisam ésteres simples, ácidos graxos de cadeia curta (BORNSCHEWER, 2002; REIS et al., 2009). 21 Figura 1. Representação esquemática da estrutura α/β-hidrolase e sítio catalítico das lipases (BORNSCHEUER, 2002). Outro fator para se distinguir as lipases das esterases, é que as primeiras exibem um aumento da atividade enzimática numa interface de lipídios insolúveis e água. Esse processo de ativação é conhecido como ativação interfacial, e acarreta em mudanças conformacionais na estrutura da enzima (ERICSSON et al., 2008). O fenômeno de ativação interfacial das lipases foi descrito pela primeira vez em 1936 por Holwerda e colaboradores, e depois em 1945 por Schonheyder e Volqvartz. Reações lipolíticas são fortemente dependentes da ativação interfacial, da cinética de difusão e partição de substratos, produtos e inibidores (REIS et al., 2009). A maioria das lipases também possui um domínio hidrofóbico denominado “tampa” que cobre o sítio catalítico da enzima. Desse modo, a enzima apresenta dois estados conformacionais, um é a forma fechada ou inativa e a outra é aberta ou ativa. Desnuelle e colaboradores postularam em 1960 que a ativação interfacial está associada a mudanças conformacionais da estrutura da lipase. A ativação interfacial resulta num rearranjo da estrutura, no qual a tampa aberta expõe o sítio ativo à ação do substrato. Isso só ocorre na presença de uma concentração mínima de substrato, como trigliceróis ou solventes orgânicos hidrofóbicos, ocorrendo a formação de micelas (BORNSCHEUER, 2002; PLEISS et al., (A) (B) Figura 2. Sítio ativo da enzima, representado a Serina (S184), Histidina (H366) e Aspartato (D334) em dois ângulos diferentes, ilustrando o substrato na cavidade catalítica. (A) Palmitato; (B) p-nitrofenil palmitato; Estrutura tridimensional da Calb A de Candida antarctica (ERICSSON et al. 2008). 22 1998; JOSEPH et al., 2008). Em estudos posteriores revelaram que a presença da “tampa” não está correlacionada com a ativação interfacial de todas as lípases. Em Pseudomonas aeruginosa, Burkolderia glumae e Candida antarctica B embora as lípases apresentem a “tampa” em sua estrutura não possuem ativação interfacial (CASTRO et al., 2004). Além da hidrólise, as lipases possuem ferramentas para catalisar outros tipos reações, tais como esterificação, glicerólise, aminólise e transesterificação (figura 3) (JOSEPH et al., 2008; REIS et al., 2009). A transesterificação refere-se a troca de radicais acil entre um éster e um ácido (acidólise), um éster e outro éster (interesterificação) ou um éster e um álcool (alcoólise) (VILLENEUVE et al., 2000). Figura 3. Representação das reações catalisadas pela lípase: Hidrólise, esterificação, interesterificação, alcóolise, acidólise, aminólise; 23 O tamanho e a geometria do substrato, e as condições da reação influenciam na especificidade da enzima por seu substrato (BROCA et al. 2003, JOSEPH et al., 2008). Essa especificidade consiste na capacidade que as lipases possuem de distinguir fatores estruturais das cadeias acil, como tamanho da cadeia, número, posição ou configuração de ligações duplas, presença de ramificações e natureza da fonte acil (ácidos graxos livres, ester alquil, glicerol ester etc) (ANTCZAK et al., 2009). Essas características especiais das lípases são definidas como: alta especificidade ao substrato, quimio, régio e enantioseletividade. Também podem ser “tipo-seletivas”, selecionam os substratos de acordo com o tamanho da cadeia de carbonos e/ou número de insaturações no grupamento acila (CASTRO-OCHOA et al, 2005; KADEMI et al., 2005; JOSEPH et al., 2008; PAQUES, MACEDO, 2006; SHARMA et al., 2001). O impedimento estérico e interações hidrofóbicas são forças determinantes da seletividade das lipases por álcool e ácidos graxos (CYGLER et al., 1994; REIS et al., 2009). Elas podem ser regioseletivas, ou seja, atuar numa posição específica da ligação éster e podem ser divididas em três tipos (figura 4) (BORNSCHEUER, 2002; PAQUES, MACEDO, 2006): • 1,3-específica: hidrolisa ligação éster de ácidos graxos primários, liberando ácidos graxos na posição R1 ou R3 do triacilglicerol; • 2-específica: hidrolisa as ligações éster na posição R2 do triacilglicerol; • Não-específica: não distingue entre as posições da ligação éster para clivar, ou seja, hidrolisa ligação éster de ácidos graxos primários ou secundários, liberando ácidos graxos na posição R1, R2 ou R3 do triacilglicerol; Figura 4. Representação esquemática das reações catalisadas por lípases tipo não- específica (A) e 1,3-específica (B). (A) (B) 24 O mecanismo de ação da lipase (figura 5) é semelhante tanto para reações de hidrólise quanto para reações de síntese e acontece em etapas: (1) Primeiro o substrato entra no sítio ativo e sofre um ataque nucleofílico ao carbono da carbonila na ligação éster do substrato pelo oxigênio da Serina (Ser 184), que é ativada com a retirada de um próton pelo par Histidina/Aspartato (His366/Asp334), resultando em um arranjo intermediário tetraédrico 1 estabilizado pelos resíduos de Histidina e Aspartato e por ligações de hidrogênio com a Glicina (Gly185) e pela cadeia protonada de outro resíduo de Aspartato (Asp95). A Histidina doa um próton para a região alcoólica do substrato e um álcool é liberado formado um complexo acil-enzima (2). A Histidina aumenta a nucleoficidade de uma molécula de água ou álcool, ao qual exercem um ataque nucleofílico ao carbono da carbonila do resíduo ácido do substrato, formando um novo intermediário tetraédrico 2 (3). A histidina doa um próton para o oxigênio serínico, liberando os ésteres ou ácidos graxos e regenerando a enzima (4) (BORNSCHEUER, 2002; ERICSSON et al., 2008; REIS et al., 2009). As lipases estão envolvidas em funções fisiológicas da maioria dos micro-organismos, como no caminho metabólico do processamento de fontes de carbono, na patogenicidade e na detoxificação de biocidas (PRIM et al., 2003). A capacidade hidrolítica das lípases é conhecida há mais de 300 anos, e a sua capacidade de síntese foi reconhecida há 70 anos atrás. Claude Bernard foi o primeiro a descobrir, em 1856, a lipase pancreática e percebeu que ela hidrolisava óleos insolúveis Figura 5 – Mecanismo de ação das lipases (ERICSSON et al., 2008). Enzima Livre Tetraedro intermediário 1 Tetraedro intermediário 2 Acil enzima 25 (HASAN et al., 2006). Entre os micro-organismos, os fungos e as leveduras são considerados importantes produtores de lipases, que geralmente são extracelulares. Enzimas microbianas são mais utilizadas devido à grande variedade de atividade catalítica disponível, maior rendimento, fácil manipulação genética, ausência de flutuações sazonais, rápido crescimento microbiano em meios de cultura de baixo custo (HASAN et al., 2006). As enzimas lipolíticas comerciais, geralmente, são obtidas de Rhizopus delemar (ESPINOSA et al. 2005; CRUZ et al. 1993; SHIMADA et al. 1996), Humicola lanuginosa (MORINAGA et al. 1986, IVANOVA et al. 2002), Penicillium chrysogenum (FERRER et al., 2000), Fusarium heterosporum (NAGAO et al. 1998), Rhizopus chinensis (NAKASHIMA et al. 1988) e Candida rugosa (OBRADORS et al., 1993). A maioria das lipases microbianas são do tipo ácidas ou neutras (HASAN et al., 2009, IIZUMI et al., 1990). Lipases microbianas com propriedades alcalinas e termofílicas têm sido relatas em Alcaligenes sp (HASAN et al., 2009, KAKUSHO et al., 1998), Pseudomonas fragi (HASAN et al., 2009, NISHIO et al., 1987), P. nitroreducens (HASAN et al., 2009, WATANABE et al. 1977). Novas aplicações vêm sendo desenvolvidas, baseadas nas características catalíticas dessas enzimas, especialmente na sua capacidade de catalisar reações de síntese em sistemas com baixa concentração de água (BANCERZ, GINALSKA, 2007; CIHANGIR, SARIKAYA, 2004). Aplicações biotecnológicas das lipases As lipases são largamente utilizadas no processamento de óleos e gorduras, como componentes de detergentes, na síntese de fármacos e cosméticos, síntese de biopolímeros, de biodiesel, e de produtos derivados do leite, na indústria alimentícia, agroquímicos e têxtil (HANSEN et al., 2006; PANDEY et al., 1999, JOSEPH et al., 2008). Podem ser usadas também para acelerar a degradação de resíduos de gordura (MASSE et al., 2001), sendo aplicadas principalmente em biorreatores, constituindo ferramentas importantes no tratamento de resíduos domésticos e industriais (BALCÃO et al., 1996; SHARMA et al., 2001; NYBROE et al., 1992). São considerados biocatalisadores importantes para a química orgânica e síntese de fármacos, devido ao seu grande potencial catalítico, e são muito usadas na indústria de química fina, especialmente na produção de aditivos alimentícios (compostos de sabor e aroma) (CIHANGIR, SARKAYA 2004; FOREST et al., 2008; STRAATHOF et al., 2002). A tabela 1 resume algumas das aplicações mais importantes de lipases microbianas (TREVISAN, 2004): 26 Tabela 1: Aplicações industriais de lipases microbianas. O comportamento químio- régio- e enantioespecífico das lipases tem provocado grande interesse por cientistas e indústrias. Alguns processamentos de químicos manufaturados usando óleos e gorduras têm sido desenvolvidos com maior rapidez, maior especificidade e em condições mais amenas devido à atuação das lipases (HANSAN et al., 2006; SAXENA et al., 2003). Especificidade posicional, especificidade de ácido graxo, termoestabilidade e pH são as principais características que tornam essas enzimas com grande potencial de aplicação tecnológico. O mercado global da indústria enzimática foi estimado em 2 bilhões de dólares em 2004. E o crescimento anual foi estimado em 4 a 5% AAGR até 2009 (Average Annual Growth Rate – taxa de crescimento anual). No entanto, estima-se que o mercado enzimático irá atingir 7 bilhões em 2013, com um crescimento anual de 6,3%, especialmente na industria farmacêutica e na utilização da enzima como biocatalisadores. Proteases, amilases, lipases e celulases são as enzimas mais utilizadas nas indústrias, sendo que as proteases e amilases lideram o mercado com 25% e 20%, respectivamente (HASAN et al., 2006 e 2010). Nas ultimas duas décadas houve um aumento significativo na utilização de lipases em aplicações biotecnológicas, e entre os processos bioquímicos relatados na literatura, 35% das enzimas empregadas referem-se às lipases (HASAN et al., 2010; PAQUES, MACEDO, 2006). O uso de lipase no mercado de detergentes e cosméticos foi esperado um crescimento de 9,13% entre os períodos de 2001 a 2010. É estimado que anualmente, mil toneladas de Indústria Ação catalítica Produto ou Aplicação Detergentes Hidrólise de gordura Remoção de manchas de óleo de tecidos Lacticínios Hidrólise de gordura, amadurecimento de queijo Desenvolvimento de sabor em leite, queijo e manteiga Panificação Hidrólise, melhoria do sabor Prolongamento do tempo de prateleira Bebidas Hidrólise, melhoria do aroma Bebidas Molhos Hidrólise, melhoria da qualidade Maionese, molhos e coberturas Frigoríficos Hidrólise, desenvolvimento do sabor Derivados de carne e peixe, remoção de gordura Óleos e gorduras Transesterificação, hidrólise Manteiga de cacau, margarina, glicerol, mono e diglicerídeos Produtos químicos Enantioseletividade, síntese Intermediários quirais, produtos químicos Produtos farmacêuticos Transesterificação, hidrólise Lipídeos especiais, auxiliares digestivos Cosméticos Síntese Emulsificantes, hidratantes Couro Hidrólise Produtores de couro Papel Hidrólise Papel de melhor qualidade 27 lipases serão adicionadas em aproximadamente 13 bilhões de toneladas de detergentes (HASAN et al., 2010). A primeira lipase comercial, Lipolase, foi introduzida no mercado pela Novozyme em 1994. Essa enzima foi produzida pelo Humicola lanuginosus e expressa em Aspergillus oryzae (HOQ et al, 1985). A Novo também foi responsável pela produção da enzima que constitui a formulação do detergente LipoPrime. Outros tipos de enzima também são utilizadas na constituição de detergentes, como as amilases, celulases, manases e principalmente as proteases alcalinas e subtilisinas. A tabela 2 mostra a relação de algumas lipases que são utilizadas em formulações de detergentes (HASAN et al., 2010). Tabela 2. Relação de algumas lípases utilizadas nas formulações de alguns detergentes (JAEGER, REETZ, 1998; KUMAR et al., 1998). Nome comercial Micro-organismo Fabricante Lipolase Enzima recombinante de H. lanuginosus expressa em A. oryzae. Novozyme, Dinamarca. Lumafast Enzima recombinante de Pseudomonas mendocina expressa em Bacillus sp. Genencor International, USA. Lipomax Pseudomonas alcaligenes. Genencor International, USA. Lipofast Não divulgado. Advanced Biochemicals, Índia. Fármacos, agro-químicos, compostos quirais complexos apresentam síntese elaborada. A utilização de biocatalisadores facilitou a produção de enantiômeros puros, um dos principais fatores que expandiu a utilização de enzimas nessa área. Novas lipases enantioseletivas estão sendo usadas na catálise da síntese de medicamentos terapêuticos. Como exemplo, podemos citar a lipase de Pseudomonas AK que foi utilizada na síntese de um composto quiral intermediário (2) que gera como produto um potente agente anti-tumoral (epotilona) (figura 6) (JAEGER, EGGERT, 2002). Figura 6. Atuação de lipases na catalise de um intermediário quiral (2) na síntese de fármacos. Reação Produto 28 Devido à vasta aplicação das lípases, novos micro-organismos estão sendo isolados na busca por lipases microbianas com propriedades diferenciadas. Os micro-organismos produtores de lipases têm sido encontrados em diversos hábitats, como resíduos industriais, indústrias de óleos vegetais, lacticínios, solo contaminado com óleo, sementes oleaginosas e alimentos em decomposição (HASAN et al., 2010; TREVISAN, 2004). O isolamento de micro-organismos termofílicos pode ser feito com sucesso a partir de solos, pilhas de compostagem e fontes termais (ANDERSCH et al., 1997). Lipases termoestáveis Enzimas termofílicas podem ser produzidas por micro-organismos termofílicos e mesofílicos. Lipases provenientes de micro-organismos termofílicos têm sido cada vez mais utilizadas, pois apresentam alta estabilidade e atividade em temperaturas altas, além de outras propriedades intrínsicas que conferem a elas estabilidade a agentes desnaturantes e a maiores variações de pH. Essas características fazem com que essas enzimas sejam ideais nos processos industriais e químicos, os quais podem ocorrer em temperaturas relativamente altas e na presença de solventes orgânicos (CASTRO-OCHOA et al, 2005; GOMES et al., 2007). Devido à sua estabilidade, as lipases termoestáveis podem ser usadas em sua forma de enzima nativa, em membranas de reator, imobilizadas covalentemente ou adsorvidas em resinas de troca iônica, cavidades fibrosas ou ligadas a cristais (ANDERSCH et al., 1997). Várias vantagens são observadas ao se utilizar enzimas termofílicas: temperaturas mais altas podem ser aplicadas aos processos industriais, evitando a contaminação por micro- organismos mesofílicos; temperaturas mais elevadas nos processos reduz a viscosidade e aumenta a solubilidade do composto, o coeficiente de difusão dos substratos aumenta o rendimento dos processos e a reatividade. Geralmente, enzimas termoestáveis são mais estáveis em presença de solventes e detergentes. Essas vantagens superam algumas desvantagens como a restrições no caso de substratos e produtos lábeis. (HAKI et al., 2003; HASAN et al., 2006). A maioria das lipases termofílicas microbianas são ativas a 60ºC e pH 7, no entanto, as enzimas de algumas linhagens podem atuar em situaçõe extremas de pH e temperatura. A temperatura e o pH de algumas lipases estão destacados na tabela 3. Tolerância alcalina e termoestabilidades estão entre as principais características importantes comercialmente. Este ponto tem motivado uma busca continua por lipases que exibam características especiais, como estabilidade em relação a pH, temperatura, força iônica e solventes orgânicos (ABEL et al., 2000; HAKI et al., 2003; KULKURANI, GADRE, 1999). 29 Tabela 3. Temperatura e pH ótimos de atividade de algumas lipases e os respectivos micro-organismos produtores. Micro-organismo Propriedades Enzimáticas Referência Temperatura ótima (ºC) pH ótimo Bacillus sp. RSJ-1 50 8,0-9,0 Sharma et al. (2002) Bacillus strin J 33 60 8,0 Nawani et al. (1998) Bacillus stearothermophilus 68 -- Gupta et al. (1999) Bacillus thermocatenletus 60-70 8,0-9,0 Klibanov (1983) Bacillus thermoleovorans ID-1 70-75 7,5 Dong-Woo et al. (1999) Geobacillus sp. 70 9,0 Abdel-Fattah (2002) Pseudomonas sp. 65 9,6 Kulkurani and Gadre (1999) Pseudomonas sp. 90 11,0 Rathi et al. (2000) Pyrobaculum calidifontis 90 -- Hotta et al. (2002) Pyrococcus horikoshii 97 5,6 Ando et al. (2002) Pyrococcus horikoshii 95 7,0 Yan et al. (2000) --Não avaliado pelos autores. Análises moleculares de lipase têm sido realizadas no intuito de se entender a estrutura e atuação dessas enzimas, em especial das enzimas termofílicas, o que pode ajudar os pesquisadores na engenharia de novas lipases para aplicações biotecnológicas de acordo com a demanda e as necessidades das indústrias (HASAN et al., 2010). Apesar de seqüências homólogas de proteínas mesofílicas e termofílicos serem bastante conservadas, algumas diferenças parecem influenciar na estabilização de proteínas termofílicas. Comparações entre as seqüências de aminoácidos dessas proteínas, indicaram a tendência de Gly serem substituídas por Ala e Lys por Arg nas termofílicas. Alto conteúdo de alanina em proteínas termofílicas sugere melhor formação no dobramento de α-hélices. Sugere-se que resíduos de Arg são mais bem adaptados à altas temperaturas do que Lys, devido ao seu alto pKa e estabilização de ressonância. Mais resíduos de aminoácidos carregados também são encontrados em termofílicos do que em mesofílicos, que apresentam maior quantidade de resíduos polares não carregados (especialmente Gln). Proteínas termofílicas também possuem um conteúdo um pouco maior de resíduos hidrofóbicos e aromáticos que as mesofílicas. Cisteínas são altamente sensíveis à oxidação em altas temperaturas, o que sugere uma menor quantidade na estrutura de proteínas termofílicas. Além da composição de resíduos de aminoácidos, a sua distribuição e interações também podem ser relevantes. Dill (1990) notou que efeitos de formação de pontes salinas, interações aromáticas e superfícies hidrofóbicas são fatores importantes na estabilização de α-hélices, estruturas importantes na estabilização de proteínas termofílicas. A possibilidade de aplicação 30 de enzimas termofílicas resulta de conhecimentos adquiridos pela biologia molecular e estudos bioquímicos, como purificação e caracterização de proteínas (VIEILLE, ZEIKUS, 2001). A demanda por lipases termoestáveis vem crescendo nos últimos anos, por isso vários trabalhos vêm sendo publicados sobre estudos de purificação e caracterização dessas enzimas (ABRAMIC et al., 1999; HANDELSMAN, SHOHAN, 1998; HIOL et al., 1999; HIOL et al., 2000; IMAMURA, KITAURA, 2000; KIM et al., 1998; MOZHAEV et al., 1993; SUGIHARA et al., 1991; SUGIHARA et al., 1992, TRODLER et al., 2008). Normalmente, as enzimas de fungos filamentosos e termofílicos podem ser produzidas por Fermentação submersa (FSm), Fermentação em estado sólido (FES) ou por fermentação semi-sólida. A FSm é a utilização de meio fermentativo líquido com nutrientes solúveis, sendo esse processo o mais utilizado na produção de lípases (MARTINS, 2001; ALONSO, 2001). Fermentação em estado sólido (FES) caracteriza-se pelo uso de substrato sólido, que pode ser fonte de nutriente e/ou suporte de crescimento microbiano, com ausência de água entre as partículas (SINGHANIA et al, 2009). Fermentação semi-sólida, por sua vez, é um termo muitas vezes usado como sinônimo de FES, porém, como definição de uma terminologia diferencial será aqui considerado como o uso de substrato sólido como suporte para o crescimento microbiano, porém, estando os nutrientes minerais e fontes de carbono solúveis em meio líquido. (MATEOS-DIAZ et al., 2006; SUN, XU, 2008). Esses três processos fermentativos têm suas vantagens e desvantagens em relação aos componentes usados como fontes de nutriente para o micro-organismo, ao controle operacional e dos parâmetros fermentativos. A escolha de um processo ou outro depende do propósito da fermentação, da adaptação do micro-organismo ao sistema usado, do tipo de produto que se quer obter e da pureza esperada. Aplicação de Lipases na produção de biodiesel Há 100 anos, Rudolf Diesel testou óleos vegetais como combustíveis de motores. Nas décadas de 30 e 40, óleos vegetais eram utilizados em motores em situações emergenciais. Entretanto, o uso direto destes óleos nos motores é considerado insatisfatório, pois apresentam alguns problemas como alta viscosidade, elevado índice de acidez e deposição de compostos de carbono. Recentemente, com o aumento do preço do óleo cru e a reserva limitada de combustíveis fósseis, aliada ao aumento da poluição do ar e à magnitude dos problemas de aquecimento global causado pelo excesso de CO presente na atmosfera, tem se intensificado a busca por fontes alternativas de combustíveis, como o biodiesel. O biodiesel pode diminuir a 31 emissão de compostos tóxicos como CO e SOx (HARDING et al., 2007; FANGRUI et al., 1999; FUKUDA et al., 2001). O biodiesel é um combustível proveniente de uma fonte energética renovável, que é produzido convertendo-se moléculas de triacilglicerol dos óleos vegetais em metil ou etil éster de cadeia longa, por meio de reações de transesterificação com uso de catalisadores químicos como ácidos ou bases (ANTCZAK et al., 2009; JAEGER, EGGERT, 2002). Craqueamento térmico (ou pirólise), microemulsão e transesterificação são os processos que podem ser utilizados para a produção do biodiesel. Os dois primeiros processos apresentam um alto custo e geram biodiesel de baixa qualidade. Assim, a transesterificação é o procedimento mais usual na síntese de biodiesel (ROBLES-MEDINA et al., 2009). Vários processos industriais relevantes utilizam a reação de transesterificação para a produção de diferentes compostos. Na transesterificação de óleos vegetais, moléculas de triacilglicerol e álcool são transformados em alquil ésteres de ácidos graxos. Todo o processo é uma sequência de três reações consecutivas reversíveis, com a formação de mono e diglicerídeos como produtos intermediários (figura 7) (BAJAJ et al., 2010; SCHUCHARDT et al., 1998). Os ésteres de ácidos graxos, produtos de reações de transesterificação, são utilizados como matéria-prima em vários tipos de indústrias, na produção de surfactantes não-iônicos, emulsificantes, agentes plastificantes e lubrificantes, aditivos farmacêuticos e cosméticos, óleos comestíveis não-calóricos, aditivos de alimentos ou ainda, podem ser utilizados como uma fonte alternativa de combustível, o biodiesel (SCHUCHARDT et al., 1998). O biodiesel (alquil ésteres) possui propriedades físico-química e potencial energético semelhante aos do petrodiesel. Pode ser usado em veículos na forma pura ou misturado ao diesel convencional, sem modificações no motor, visto que o biodiesel possui melhores propriedades lubrificantes, que melhora o rendimento do motor e o tempo de vida do mesmo. No Brasil, o biodiesel é usado misturado ao diesel, em 2010, começou-se a usar o B5, ou seja, Figura 7. Representação da reação de transesterificação de uma molécula de triacilglicerol e três moléculas de álcool, na presença de um catalisador enzimático formando ésteres de ácidos graxos, glicerol, mono e diglicerídeos (ROBLES-MEDINA et al., 2009). Triacilglicerol Álcool Ésteres (biodiesel) Glicerol Acilglicerol: monoglicerídeos e diglicerídeos. 32 5% de biodiesel é adicionado ao diesel vendido nos postos de combustível de acordo com a Resolução ANP Nº 7, de 19/03/2008 (DOU 20.3.2008). A produção mundial de biodiesel foi de aproximadamente 8,5 bilhões de tonelada em 2007, e a ANP estima a produção anual de biodiesel no Brasil seja de aproximadamente 176 milhões de litros (http://www.biodieselbr.com/biodiesel/brasil/biodiesel-brasil.htm). A conversão de óleos e álcoois em ésteres podem ser realizadas por diferentes catalisadores ou em condições supercríticas. Os catalisadores utilizados podem ser classificados como: químico alcalino (hidróxido de sódio, hidróxido de potássio e metóxido de sódio), químico ácido (ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido clorídrico e ácido sulfônico), enzimático (lipases) e inorgânicos heterogêneos. Praticamente 100% da produção mundial de biodiesel é feita por catalisador químico alcalino. No entanto, pequenas quantidades de ácidos graxos livres ou a presença de água pode levar à formação de sabão causando redução do rendimento. Também existe a necessidade de se tratar os efluentes gerados, pois existe um alto consumo de água nos passos de purificação desse processo. O subproduto formado, o glicerol, apresenta uma alta viscosidade e normalmente se apresenta contaminado com a base, havendo a necessidade de purificação, esses fatores dificultam o processo especialmente no que se refere aos custos. A vantagem desse processo é o baixo custo e o alto rendimento na conversão. Na catálise química por ácidos não ocorre a formação de sabões, mas uma alta temperatura e uma alta razão molar é requerida. Os catalisadores ácidos raramente são usados em escala industrial por serem mais corrosivos, e apresentam baixo rendimento em relação à catálise básica (SHARMA et al., 2008; ROBLES-MEDINA et al., 2009). No entanto, tem se estudado a utilização de enzimas como biocatalisadores. Com a utilização de lipases como catalisadoras no processo, vários problemas são eliminados, como a temperatura de reação que é mais branda (30-40ºC, representando economia de energia), a conversão dos ésteres é completa, a recuperação do glicerol é simples, não é necessária a purificação de ésteres, é possível a utilização de compostos não-tóxicos, o processo apresenta alta especificidade influenciando da composição do alquil éster produzido, a presença de determinadas quantidades de água é permitida, podem atuar em óleos de diferentes origens inclusive o residual contendo alta taxa de acidez. Além de serem biodegradáveis e não-tóxicos diferentes de alguns catalisadores químicos. Quando se utiliza lipase imobilizada, o biocatalisador pode ser facilmente separado e pode adicionar maior estabilidade à enzima. A lipase pode ser transformada geneticamente alcançando melhor eficiência. Recentemente, lípases termoestáveis e tolerantes à álcool de cadeia curta foram clonadas e utilizadas na 33 síntese de biodiesel (YANG et al., 2009). Esse processo, no entanto, apresenta algumas desvantagens, como menor rendimento quando comparado com o processo sintetizado por catalisador alcalino e também um alto custo em função do preço da enzima (FUKUDA et al., 2001; HARDING et al., 2007;WANG et al., 2006). A possibilidade de se utilizar enzimas com atividade em elevadas temperaturas, pode aperfeiçoar o processo devido à maior reatividade (maior velocidade de reação, menor restrição de difusão, maior solubilidade do substrato e produtos favorecendo o deslocamento do equilíbrio em reações endotérmicas), ao aumento da solubilidade dos lipídeos e de outros substratos hidrofóbicos em água, a diminuição da viscosidade do substrato, ao aumento da solubilidade dos reagentes, à redução do risco de contaminação por micro-organismos mesofílicos que são a maioria no ambiente. As lipases termoestáveis podem ser também tolerantes a solventes e detergentes. Essa propriedade está relacionada com a estrutura da enzima e é influenciada por fatores como pH do meio e presença de íons metálicos (TREVISAN, 2004). Existem vários fatores que também são considerados importantes e afetam o rendimento das reações como, temperatura, presença de água, agitação, índice de acidez e de peróxido (BAJAJ et al., 2010). Watanabe e colaboradores (2002) observaram que o conteúdo de fosfolipídios presente nos óleos pode influenciar negativamente na produção do biodiesel por lipases. Quando esse conteúdo era superior a 1%, a síntese na presença de lipase de Candida antarctica era completamente inibida. Óleos vegetais (soja, milho, algodão, palma etc) são considerados excelentes fontes de energia renovável e potencialmente inesgotável. São comumente compostos por moléculas de triacilglicerol, sendo bons substratos em reações de transesterificação para a produção do biodiesel (ésteres derivados de ácidos graxos) (FANGRUI et al., 1999; MEHER et al., 2006; SCHUCHARDT et al., 1998). Vários tipos de óleos e gorduras podem ser usados na síntese enzimática de biodiesel, tornando a lipase um catalisador competitivo em relação aos químicos. O uso de óleo residual ou de fritura é um fator relevante na reciclagem desses óleos, que podem ser catalisados por lípases. Vários tipos de álcoois também (C1 a C4) podem ser usados nessas reações: metanol, etanol, propanol, isopropanol, 2-propanol, n-butanol e isobutanol. O metanol e o etanol são os mais baratos e produzidos em maior escala, por isso são os mais utilizados. A taxa de catálise enzimática da transesterificação normalmente aumenta com o tamanho da cadeia de hidrocarboneto dos álcoois. Entretanto, o excesso de álcool pode causar inativação da enzima, esse é um dos maiores obstáculos na produção enzimática do biodiesel. A velocidade do 34 rendimento da reação por catálise enzimática está relacionada com a taxa de desnaturação enzimática. Para resolver esse problema, três soluções têm sido testadas: adição do álcool em várias alíquotas para evitar que ocorra desnaturação da enzima, utilização de solventes e alterações acil-aceptor. A adição de álcool em alíquotas é a opção mais utilizada. Metil acetato ou etil acetato são os mais utilizados como acil-aceptor, esse método não é muito vantajoso pelo alto custo. Algumas vezes, a reação pode ser realizada em sistema com solvente orgânico, o que melhora a solubilidade do álcool no óleo, sendo terc-butanol um dos solventes mais utilizados. (ANTCZAK et al., 2009; TAN et. al., 2010). A adição de álcool à reação é dependente da resistência da enzima ao álcool e ao conteúdo de água presente. A velocidade de desnaturação da enzima pelo metanol pode aumentar com a adição de água à reação, no entanto, em sistemas contendo etanol, propanol, isopropanol, butanol e isobutanol a presença de pequenas quantidades de água se faz necessária. A estrutura e a concentração do álcool afetam a estabilidade enzimática, sendo esse o fator ao qual se baseia a escolha de sistemas livres ou não de solvente, já que usualmente os solventes orgânicos protegem a enzima de desnaturação pelo álcool (ANTCZAK et al., 2009; SHIMADA et al, 2002). Algumas peculiaridades são importantes para o sucesso das reações, como utilizar um excesso molar de álcool sobre o óleo, o que aumenta o rendimento da reação. Entretanto, também pode inativar a enzima, particularmente quando o álcool é insolúvel na mistura, podendo formar emulsão, dependendo da intensidade de agitação. A adição de solvente orgânico à mistura aumenta a solubilidade do álcool, protegendo a enzima de inativação ou pode ser adicionado em porções mantendo a concentração de álcool baixo, já que um grande rendimento na produção de biodiesel apresenta como pré-requisito o excesso molar de álcool (ANTCZAK et al., 2009). Para a razão molar de metanol:óleo de girassol em 3:1 (em hexano) a taxa de conversão chegou a 72% em 24h, utilizando-se a enzima imobilizada de Pseudomonas fluorescens. Já usando-se uma razão molar 4,5:1 houve inativação da enzima (SOUMANOU, BORNSCHEUER, 2003). Em um estudo que se variou a razão molar de 1:1 a 6:1, e a maior taxa de conversão observada foi em 6:1 (FUKUDA et al., 2001). A temperatura ótima para a atividade de lipase observada na transesterificação variou entre 30º e 55ºC (ISO et al.,2001). A água tem uma forte influencia na atividade e na estabilidade da lipase. Estudos revelam que a adição de pequenas alíquotas à catálise enzimática leva a um aumento da taxa de conversão na síntese de ésteres, pois pequenas quantidades de água são necessárias para manterem a enzima ativa, mas uma quantidade maior que o necessário pode influenciar no equilíbrio químico deslocando a reação para a 35 hidrólise (ANTCZAK et al., 2009; TAN et al., 2010). Shah e Gupta (2007) avaliaram a adição de 1-10% de água na etanólise utilizando-se a lipase de P. cepacia, e observaram um rendimento de 98% com adição de 5% de água e apenas 70% quando a água não foi adicionada à reação. A figura 8 mostra a relação entre à adição de água e o equilíbrio entre as reações de hidrólise e transesterificação (ANTCZAK et al., 2009). Grupos polares de resíduos de aminoácidos das enzimas podem estar positiva ou negativamente carregados dependendo do pH em seu micro-ambiente e podem afetar as reações em soluções não aquosas, a esse efeito denomina-se “memória de pH”. O ajuste do pH no micro-ambiente enzimático se faz necessário, contribuindo para um aumento da atividade catalítica, geralmente esse ajuste é feito na preparação da lipase (ADAMCZAK, BEDNARSKI, 2004; ANTCZAK et al., 2009). Estudos indicam que o glicerol também causa efeito na síntese do biodiesel, pois o aumento da concentração do glicerol, conforme é produzido causa inibição da proteína. Alguns autores observaram o efeito do glicerol em lípases imobilizadas em matrizes hidrofílicas. A molécula de glicerol é adsorvida ao suporte formando um revestimento, impedindo o acesso da enzima ao substrato hidrofóbico. A adição de outras substâncias hidrofílicas pode solucionar o problema, removendo o glicerol. Em algumas preparações de lipase pode-se ser utilizar o terc-butanol, utilizado como solvente orgânico nas reações de Figura 8. Efeito da concentração da água na conversão de produtos de transesterificação enzimática (alquil ésteres) e na hidrólise (ácidos graxos). A concentração ótima depende da enzima e da composição do meio reacional (ANTCZAK et al., 2009). 36 transesterificação, protegendo as enzimas desse efeito (DOSSAT et al., 1999; DU et al., 2003). O estudo das condições da reação de transesterificação é fundamental para uma alta eficiência catalítica, e produção de enzimas por micro-organismo aliados à imobilização tem o intuito de diminuir os custos do biocatalisador, tornando-o competitivo aos catalisadores químicos (BAJAJ et al., 2010). Imobilização A maior desvantagem da produção do biodiesel pelo processo enzimático é o custo, por isso lipases imobilizadas têm sido muito utilizadas em pesquisas recentes. A fácil recuperação e a reutilização são as principais vantagens de se usar biocatalisadores imobilizados. Maior estabilidade e rendimento têm sido observados (TAMALAMPUDI et al., 2008). Enzimas imobilizadas são definidas como enzimas fisicamente confinadas ou localizadas em um suporte com retenção da sua atividade catalítica e podem ser usadas repetidamente e continuamente. Vários métodos podem ser utilizados na imobilização de enzimas, como adsorção, ligação covalente, encapsulação ou ligação-cruzada (JEGANNATHAN et al., 2008; TAN et al., 2010). A adsorção é a técnica mais utilizada na imobilização de enzimas para utilização na produção do biodiesel. A enzima se liga à superfície de um carreador por forças fracas, como van der Walls e interações hidrofóbicas, são facilmente recuperadas e apresentam baixo custo (JEGANNATHAN et al., 2008; TAN et al., 2010). Os principais suportes utilizados são: resina acrílica, membrana têxtil, polipropileno, celite e terra diatomácea (ROYON et al., 2007). Vários autores estudaram a imobilização de lipases de diferentes fontes na produção do biodiesel: Candida antartica (DU et al., 2004; SHIMADA et al., 1999; WANG et al., 2007; WATANABE et al., 2000), Candida sp. 99–125 (LU et al., 2007, 2008, 2009, 2010; LV et al., 2008; NIE et al., 2006; TAN et al., 2006), Pseudomonas fluorescens (ISO et al., 2001; SALIS et al., 2008; SOUMANOU, BORNSCHEUER, 2003), Pseudomonas cepacia (SALIS et al., 2005; SHAH, GUPTA, 2007), lipase de pâncreas suíno (YESILOGLU, 2004), Rhizomucor Miehei e Chromobacterium viscosum (SHAH et al., 2004; SHIEH et al., 2003; YESILOGLU, 2004). A enzima pode se ligar também ao suporte por ligação covalente, a vantagem é que a ligação é irreversível, assim a enzima não é liberada em condições adversas (TREVAN, 37 1988a). Na encapsulação, uma matriz polimérica captura a lipase mantendo-a no seu interior, esse é um método rápido e barato. No entanto, só podem ser utilizadas quando o substrato apresentar baixa massa molar, substratos maiores não conseguem se difundir pelo poro do polímero (JEGANNATHAN et al., 2008; TAN et al., 2010). O custo ainda é um obstáculo na utilização de biocatalisadores imobilizados, pois há a necessidade de processos caros de purificação para separar a enzima do meio de cultivo. Desse modo, a utilização da biomassa fúngica inteira ou confinada em esponjas de poliuretano vem sendo relatada na literatura como biocatalisador na produção do biodiesel (TAMALAMPUDI et al., 2008). As células mantêm uma comunicação com o meio através da sua superfície, a membrana plasmática e as proteínas são cruciais nessa comunicação. Algumas proteínas atravessam a membrana, outras estão ligadas por interações não-covalentes com os componentes da membrana, outras proteínas específicas estão ancoradas na superfície celular participando da sinalização celular. Atualmente, a biotecnologia tem-se utilizado do mecanismo de transporte de proteínas da membrana plasmática em vários processos de bioconversão (FUKUDA et al., 2009). A biomassa fúngica e as hifas confinadas em esponjas de poliuretano têm se mostrado mais eficientes com fungos filamentosos. Esta segunda técnica apresenta maior facilidade na reutilização e é fácil de executar já que as células podem se imobilizar espontaneamente durante o processo de fermentação nas esponjas (BAJAJ et al., 2010). A utilização de bucha vegetal pode representar um barateamento no custo do processo, tornando esse tipo de biocatalisador viável economicamente. E o fato de ser um produto natural representa a utilização de um produto biodegradável, não agredindo o meio ambiente. Diante da importância do uso de enzimas como catalisadores, especialmente em reações de transesterificação, o presente trabalho tem como enfoque selecionar fungos termofílicos produtores de lipases com propriedade de transesterificação e um processo otimizado de produção de biodiesel, com baixos custos, alta eficiência e uma grande capacidade de reutilização do catalisador. 38 REFERENCIAS ABDEL-FATTAH, Y. Optimization of thermostable lipase production from a thermophilic Geobacillus sp. using Box–Behnken experimental design. Biotechnology Letters, v. 24, p. 1217–1222, 2002. ABEL, H. et al. Purification and characterization of an extracellular lipase from a thermophilic Rhizopus oryzae strain isolated from palm fruit. Enzyme Microbiology and Technology, v. 26, p. 421–430, 2000. ABRAMIC, M. et al. Purification and properties of extracellular lipases from Streptomyces rimosus. Enzyme and Microbial Technology, v. 25, p. 522-529, 1999. ADAMCZAK, M.; BEDNARSKI, W. 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