UNESP – UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Júlio de Mesquita Filho” Instituto de Química de Araraquara Programa de Pósgraduação em Química Estudo fitoquímico e atividades biológicas do extrato etanólico das folhas de Jatropha aethiopica (Euphorbiaceae) DAYLIN GAMIOTEA TURRO Tese apresentada ao Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Química. Orientadora: Profª. Drª. Lourdes Campaner dos Santos Co-Orientador: Prof. Dr. Daniel Rinaldo Araraquara 2018 Dados curriculares Dados pessoais Nome: Daylin Gamiotea Turro Filiação: Delfin Adalberto Gamiotea Spengler e Mirsa Turro Guilian Naturalidade: La Habana/Cuba E-mail: gamiotea.turro@unesp.br daylingamioteaturro@gmail.com Formação acadêmica Graduação Instituição: Universidad de La Habana, Facultad de Química. Local: La Habana/Cuba. Curso: Química Licenciatura. Período: 1991 – 1996. Pós-graduação: Mestrado Instituição: Universidad de La Habana, Facultad de Química. Titulo da dissertação: Semisíntesis de derivados de Prostaglandina B2 con borohidruro de sodio. Orientador: Dr. José Antonio González Lavaut Local: Universidad de La Habana, Facultad de Química Período: 09/1998– 11/2000. Doutorado Instituição: Universidade Paulista ―Júlio de Mesquita Filho‖, UNESP, Instituto de Química de Araraquara. Titulo da Tese: Estudo fitoquímico e atividades biológicas do extrato etanólico das folhas de Jatropha aethiopica (Euphorbiaceae). Orientadora: Profª. Drª. Lourdes Campaner dos Santos Co-Orientado: Prof. Dr. Daniel Rinaldo Bolsista: CAPES (período 10/2014 – 07/2018) Local: Araraquara/SP Período: 08/2014 – 07/2018 Atuação profissional Instituto de Investigaciones Fundamentales em Agricultura Tropical ―Alejandro de Humboldt‖ (INIFAT). Período: 2006-2014. Vínculo: Servidor público. Especialista em pesquisa e desenvolvimento. Carga horária: 44. Regime: Dedicação exclusiva. Centro de Química Farmaceútica (CQF). Período: 1996-2004, Vínculo: Servidor público. Pesquisador. Carga horária: 44, Regime: Dedicação exclusiva. Artigos publicados em revistas científicas 1. GAMIOTEA-TURRO, D.; CAMAFORTE, N.A.P.; VALERINO-DIAZ, A.B.; ORTIZ- NUÑEZ, Y.; RINALDO, D.; BOSQUEIRO, J.R.; DOKKEDAL, A.L. AND SANTOS, L.C. Qualitative and quantitative analysis of ethanolic extract and phenolic fraction of Jatropha aethiopica (Euphorbiaceae) leaves and their hypoglycemic potential. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 66, n. 6, p. 1419–1427, 2018. 2. VALERINO-DIAZ, A.B.; GAMIOTEA-TURRO, D.; ZANATTA, C.; VILEGAS, W. GOMES MARTINS, C. H.; SOUZA SILVA, T.; RASTRELLI, L. AND SANTOS L.C. New polyhydroxylated steroidal saponins from Solanum paniculatum L. leaf alcohol tincture with antibacterial activity against oral pathogens. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 66, n. 33, p. 8703–8713, 2018. 3. THAYNA HENRIQUES MARCONDES; DAYLIN GAMIOTEA TURRO; ANA CAROLINE ZANATTA SILVA; LOURDES CAMPANER DOS SANTOS. Avaliação do potencial antirradicalar e determinação do teor de flavonoides totais das frações acetato de etila e n-butanol das folhas de Jatropha aethiopica (Euphorbiaceae) coletadas em Havana, Cuba. Revista de Ciências Farmacêuticas Básica e Aplicada, v. 37 Supl. 1, Agosto 2016. 4. YARELIS ORTIZ NÚÑEZ; JANET RODRÍGUEZ SÁNCHEZ; YULIET AGUADO RODRÍGUEZ; MARÍA E. RUENES FIGUEROA; MARÍA E. ÁLVAREZ VALDÉS; YANNIN LORENZO RODRÍGUEZ; LUZ DIVINA LIÑEIRO; DAYLIN GAMIOTEA TURRO; IVÁN SIXTO SAYAGO. Efecto de la aplicación combinada de extractos de paraiso y el bioproducto dimabac sobre la germinación de semillas de tomate (var. Inifat-28) en cepellón. Agrotecnia de Cuba, v. 37, n. 2, p. 39-51, 2013. 5. YARELIS ORTIZ NÚÑEZ; RAFAEL F. CASTAÑEDA RUIZ; MARÍA E. ÁLVAREZ VALDÉS; YANNIN LORENZO RODRÍGUEZ; BEATRIZ RAMOS GARCÍA; LIUBA PLANA PÉREZ; IRMA MARRERO GRANADO; DORIS GARCÍA VÁZQUEZ; YULIET AGUADO RODRÍGUEZ; MARÍA E. RUENES FIGUEROA; DAYLIN GAMIOTEA TURRO. Actividad fungicida de espécies de Cladobotryum sobre Cladosporium colocasiae y Cladosporium oxysporum. Agrotecnia de Cuba, v. 36, n. 1, p. 80-84, 2012. 6. YARELIS ORTIZ NÚÑEZ; IRAIDA SPENGLER SALABARRÍA; RUBÉN AVILÉS PACHECO; YAMILET RODRÍGUEZ DÍAZ; MARÍA E. ÁLVAREZ VALDÉS; YANNIN LORENZO RODRÍGUEZ; DAYLIN GAMIOTEA TURRO; YOLANDA MARTÍNEZ; YULIET AGUADO RODRÍGUEZ. Agroquímicos naturales a partir de plantas cubanas. Agrotecnia de Cuba, v. 33, n. 1, p. 28-35, 2009. 7. IRAIDA SPENGLER SALABARRÍA; ALEXANDER B. VALERINO DÍAZ; TELCE GONZÁLEZ MORERA; DAYLÍN GAMIOTEA TURRO; TRINA H. GARCÍA PÉREZ. Estudio fitoquímico y de actividad alelopática del extracto de n-hexano del follaje de Lantana trifolia L. Revista CENIC Ciencias Químicas, v. 40, n. 1, p. 33-37, 2009. 8. DAYLIN GAMIOTEA-TURRO; OSMANY CUESTA-RUBIO; SYLVIA PRIETO- GONZÁLEZ; FRANCESCO DE SIMONE; SIRO PASSI; LUCA RASTRELLI. Antioxidative Constituents from the Leaves of Hypericum styphelioides. Journal of Natural Product, v. 67, n. 5, p. 869–871, 2004. 9. PRIETO-GONZÁLEZ, S.; GONZÁLEZ, J. A.; MOLINA, J., DIEGUEZ, R.; GARRIDO, G.; GAMIOTEA-TURRO, D.; HERRADA, D.; AGUERO, J. B.; MORA, G. A.; VELEZ, H.; RASTRELLI, L. Utilización de productos naturales en el tratamiento antiviral. Revista Cubana de Química, v. 13, p. 408-412, 2001. 10. GAMIOTEA, D.; RIVAS, Y.; RUIZ, R.; MARQUEZ, M.; GARCIA, N. AND GONZALEZ, J. A. Pseudoplexaura porosa y Eunicea tourniforti: Aplicación de dos nuevas gorgonias em la hidrolisis del éster metílico de Prostaglandina A2. Revista Cubana de Farmacia, Supp. Esp., v. 34, p. 345–347, 2000. Participação em congressos 1. Gamiotea-Turro, D.; Valerino-Diaz, A. B.; Ortiz-Nuñez, Y.; Rinaldo, D., Bosqueiro, J. R.; Camaforte, N. A. and Santos, L. C. Chemical characterization of antidiabetic active ethanolic extract from Jatropha aethiopica (Euphorbiaceae) leaves. 41ª Reunião Anual Sociedade Brasileira de Química, 2018. 2. Valerino-Díaz, A. B.; Gamiotea-Turro, D.; Zanatta, A. C.; Vilegas, W. and Santos, L. C. New steroidal saponins from Solanum paniculatum L. (Solanaceae) leaves. 41ª Reunião Anual Sociedade Brasileira de Química, 2018. 3. Rodriquez, J. E.; Rodriguez, Z. and Gamiotea-Turro, D. Characterization of N,N,N- trimethylchitosan chloride obtained on a bench scale. VII Congresso Internacional de Biomateriais, 2018. 4. Valerino-Diaz, A. B.; Gamiotea-Turro, D.; Martins, C. H. G.; Ambrosio, M. A.; Vilegas, W. and Santos, L. C. Antimicrobial activity of the ethanolic extract and the https://pubs.acs.org/author/Gamiotea-Turro%2C+Daylin https://pubs.acs.org/author/Cuesta-Rubio%2C+Osmany https://pubs.acs.org/author/Prieto-Gonz%C3%A1lez%2C+Sylvia https://pubs.acs.org/author/Prieto-Gonz%C3%A1lez%2C+Sylvia https://pubs.acs.org/author/de+Simone%2C+Francesco https://pubs.acs.org/author/Passi%2C+Siro https://pubs.acs.org/author/Rastrelli%2C+Luca saponin fraction from Solanum paniculatum L. 6th BCNP Brazilian Conference on Natural Products/XXXII RESEM, 2017. 5. Gamiotea-Turro, D.; Valerino-Diaz, A. B.; Marcondes, T. H. and Santos, L. C. Phenolic compounds from Jatropha aethiopica used in the folk Cuban medicin. XIII Jornada Paulista de Plantas Medicinais, 2017. 6. Marcondes, T. H.; Gamiotea-Turro, D. and Santos, L. C. Avaliação do potencial antirradicalar e determinação do teor de flavonoides totais das frações acetato de etila e n-butanol das folhas de Jatropha aethiopica (Euphorbiaceae) coletadas em Havana, Cuba. VI Congresso Científico da UNESP e II Jornada de Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia, 2016. 7. Daylin Gamiotea-Turro and Iván S. Sayago. Uso y abuso de los agroquímicos. Consecuencias. Intercambio participativo sobre el sistema agroecológico de producción de hortalizas bajo condiciones de organoponia, 2014. 8. Gamiotea-Turro, D.; Ruenes-Figueroa, M. E.; Álvarez-Valdés, M. E.; Aguado- Rodriguez, Y.; Lorenzo-Rodriguez, Y.; Ortiz-Nuñez, Y.; Valerino-Diaz, A. B.; Spengler-Salabarria, I. Natural products: Bioregulators in the seed germination for obtaining innocuous foods. III Congreso Internacional de Farmacologia de productos Naturales (FAPRONATURA 2012), 2012. 9. Gamiotea-Turro, D.; Aguado-Rodriguez, Y.; Ruenes-Figueroa, M. E.; Álvarez- Valdés, M. E.; Ortiz-Nuñez, Y.; Lorenzo-Rodriguez, Y. and Valerino-Diaz, A. B. Extratos vegetais como promotores da germinação de sementes de hortaliças. IV Congreso de Agricultura Tropical - Tropico 2012, 2012. 10. Gamiotea-Turro, D.; Álvarez-Valdés, M. E.; Perera, W.; Aguado-Rodriguez, Y.; Ortiz-Nuñez, Y.; Valerino-Diaz, A. B.; Spengler-Salabarria, I.; Lorenzo-Rodriguez, Y. Propiedades anti-oxidantes de la Jatropha aethiopica. IV Congreso Iberoamericano y del Caribe de Productos y Medicinas Naturales (ProdMedNatur 2010), 2010. 11. Gamiotea-Turro, D.; Álvarez-Valdés, M. E.; Aguado-Rodriguez, Y.; Ortiz-Nuñez, Y.; Lorenzo-Rodriguez, Y. and Valerino-Diaz, A. B. Usos etnomédicos de las especies de Jatrophas presentes en el Arboretum del INIFAT. Ier Congreso Internacional LABIOFAM 2010. Ier Simposio de Productos Naturales en la Terapia contra el Cáncer, 2010. 12. Ortiz-Nuñez, Y.; Castañeda, R. F.; Plana, L.; Álvarez-Valdés, M. E.; Lorenzo- Rodriguez, Y.; Ramos, B.; Gonzalez, N.; Aguado-Rodriguez, Y.; Gamiotea-Turro, D. and Ruenes-Figueroa, M. E. Actividad fungicida de hongos anamórficos sobre especies de Cladosporium spp. XVII Congreso Científico Internacional del INCA, 2010. 13. Gamiotea-Turro, D.; Perera, W.; Álvarez-Valdés, M. E.; Lorenzo-Rodriguez, Y.; Ortiz-Nuñez, Y.; Aguado-Rodriguez, Y.; Valerino-Diaz, A. B.; Spengler-Salabarria, I. Determinación de la capacidad antioxidante y del contenido de fenoles totales de la especie Jatropha aethiopica. XVIII Congresso Ítalo- Latino-americano de Etno medicina. “Juan Tomás Roig y Mesa”. VIII Taller de los Productos Naturales, 2009. 14. Gamiotea-Turro, D.; Álvarez-Valdés, M. E.; Lorenzo-Rodriguez, Y.; Ortiz-Nuñez, Y.; Aguado-Rodriguez, Y.; Valerino-Diaz, A. B.; Spengler-Salabarria, I. Propriedades etnomédicas de três espécies de Jatropha cultivadas em Cuba. XVIII Congresso Ítalo- Latino-americano de Etno medicina. “Juan Tomás Roig y Mesa”. VIII Taller de los Productos Naturales, 2009. 15. M. E. Álvarez Valdés, M. Alfonso, R. Avilés, Y. Ortiz-Nuñez, Y. Martínez, Y. Lorenzo, D. Gamiotea-Turro, Y. Aguado. Atividade inseticida e fungicida de Thuja orientalis L. IV encuentro Internacional por el Desarrollo Forestal Sostenible, 2009. 16. Y. Ortiz-Nuñez, I. Spengler Salabarria, Y. Rodríguez Díaz, M. E. Álvarez Valdés, Y. Lorenzo Rodríguez, D. Gamiotea-Turro, Y. Aguado. Actividad antimicrobiana de Juniperus lucayana B. IV encuentro Internacional por el Desarrollo Forestal Sostenible, 2009. 17. Gamiotea-Turro, D.; Álvarez-Valdés, M. E.; Lorenzo-Rodriguez, Y.; Sánchez, R.; Hernández, Y.; González, M; Ortiz-Nuñez, Y.; Valerino-Diaz, A. B. and Spengler- Salabarria, I. Jatropha aethiopica: Composición química y actividad alelopática. 19 Conference of Chemistry, 2008. 18. Pérez, C. E.; Álvarez, M. E.; González, M.; Villasana, R.; Pérez, D.; Gamiotea- Turro, D. and Spengler, I. Composición química y actividad alelopatica frente a malezas de las hojas de Wedelia trilobata L. 19 Conference of Chemistry, 2008. 19. Gamiotea-Turro, D.; Álvarez-Valdés, M. E.; Lorenzo-Rodriguez, Y.; Sánchez, R.; Hernández, Y.; González, M; Ortiz-Nuñez, Y.; Valerino-Diaz, A. B. and Spengler- Salabarria, I. Estudio preliminar de germinación de semillas de interés económico utilizando extractos de plantas. XVI Congreso Científico Internacional del INCA, 2008. 20. Gamiotea-Turro, D.; González-Lavaut, J. A. and Ramirez, E. Zanthoxylum Kellermanii: Especie con potencial antimicrobiano. 4to Congreso Forestal de Cuba. III Encuentro Internacional de Jóvenes Investigadores, 2007. 21. González, J. A.; Rivas, Y.; Fernández, O.; Orta, R.; Padilla, A.; Castro, M. and Gamiotea-Turro, D. Prostanoides bioactivos de una fuente natural. II Encuentro Internacional de Farmacia y Nutrición, 2003. 22. Gamiotea, D.; Prieto, S.; González, J. A.; Molina, J.; Aguero, J.; Marquez, L. and Rivas, Y. Modulación de la actividad antiviral por efecto de la luz en el género Hypericum. FotoCiencias 2002, 2002. 23. Gamiotea, D.; Prieto, S.; González, J. A.; Molina, J.; Aguero, J.; Marquez, L. and Rivas, Y. Evaluación Fitoquímica de la especie Hypericum styphelioides, A. Rich. Congreso Italo-Latinoamericano de Etnomedicina “Félix Pifano”, 2001. 24. González, J. A.; Rivas, Y.; Fernández, O.; Orrett, E.; Orta, R.; Padilla, A.; Castro, M. and Gamiotea-Turro, D. Potencialidades de un recurso natural. IV Congreso Internacional de Química, 2001. 25. Gamiotea, D.; Rivas, Y.; Ruiz, R.; Marquez, L.; Garcia, N. and González, J. A. Pseudoplexaura porosa y Eunicea tourniforti: Aplicación de dos nuevas gorgonias en la hidrolisis del éster metílico de Prostaglandina A2. IV Encuentro Iberoamericano de las Ciencias Farmacéuticas y Alimentarias, 2000. 26. Gamiotea-Turro, D.; García, N.; González, J. A. and Rivas, Y. Prostaglandina E1: Intermediaros para su obtención. III Congresso Internacional de la Sociedade Cubana de Química, 1998. 27. Gamiotea-Turro, D.; González, J. C.; Estévez-Rodríguez, Y. and Ramos-Cairo, R. Hidracinas aromáticas para el marcaje de anticuerpos monoclonales. III Congresso Internacional de la Sociedade Cubana de Química, 1998. Organização de cursos 1. 1ra Escola de Verão do Insitutto de Química de Araraquara (UNESP-SP) (Fevereiro 2018). Profa. Dra. Lourdes C. dos Santos, Profa. Dra. Isabele R. Nascimento, Daylin Gamiotea-Turro, Alexander B. Valerino Díaz, Ana C. Zanatta, Felipe Hilário, Marcelo Amorim, Mayra Fonseca, Weslei Botero. 2. Protecção de Plantas (2013): Dra. Yarelis Ortiz Nuñez, Dr. Rubén Avilés, Daylin Gamiotea Turro (Alelopatia). 3. Manejo Integrado de Pragas (2012; 2011): Dra. Yarelis Ortiz Nuñez, Dr. Rubén Avilés, Daylin Gamiotea Turro, Maria de los A. Sayas. Bancas Graduação 1 Spengler-Salabarria, I.; Nogueiras, C. e Gamiotea-Turro, D. Participação em banca de Lyanne Rodríguez Pérez. ―Triterpenos con potencial anti- inflamatório aislados de la corteza del tallo de Maytenus elaeodendroides (Griseb)‖, 2012, Universidade de Havana, Cuba. Comissões julgadoras 1 Presidente de Sessão Avaliadora na Sociedade Cubana de Química (2009). Daylin Gamiotea-Turro. 2 Membro da Comissão do Forum Municipal de Ciência e Técnica (2007; 2006). Daylin Gamiotea-Turro. Orientações 1 Supervisão do desenvolvimento do TTC da aluna Thayna Henrique Marcondes, estudante do curso de Bacharelado em Química do Instituto de Química de Araraquara; onde desenvolve o projeto intitulado ―Estudo fitoquímico comparativo de metabólitos secundários produzidos pela espécie Jatropha multifida L. cultivada no Brasil e em Cuba‖ com bolsa CUCA. “Debes amar la arcílla que va en tus manos, debes amar su arena hasta la locura; y sí no, no la emprendas que será en vano, Sólo el amor alumbra lo que perdura, sólo el amor convierte en milagro el barro. Debes amar la hora que nunca brilla y sí no, no pretendas tocar lo cierto Sólo el amor engendra la maravilla, sólo el amor consigue encender lo muerto” (Silvio Rodríguez) Dedicado a: Delfin Adalberto Gamiotea Spengler Meu Pai In memoriam AGRADECIMENTOS À Deus, por permitir estarmos hoje reunidos defendendo uma parte muito importante da minha vida. À professora Lourdes Campaner dos Santos, por ser mãe, amiga, colega. Muito obrigada professora por ser como você é, autentica e única. Ao Prof. Dr. Daniel Rinaldo, pela sua amizade e me aceitar como doutoranda compartilhando os seus conhecimentos. Ao Brasil, pela oportunidade que brinda aos estrangeiros para sermos formados nas suas Instituções. Às agências de fomento CAPES, FAPESP e CNPq, pelo apoio na realização das pesquisas. Ao Instituto de Química e sua Seção Técnica de Pós-Graduação por abrirem as oportunidades a Cuba. Wennia, Célia, Cintia, obrigado. Aos servidores públicos da Biblioteca, da STAEPE, da STI, dos Serviços de Manuntenção e Serviços Gerais. Muito obrigada pela paciência e compreensão. Ao departamento de Química Orgânica, seus Docentes, Graduando e Pós-Graduandos, por oferecer-me seus laboratórios e companheirismo. Por demonstrar-me que o conhecimento pode estar em qualquer um de nós e principalmente, aprendi valorizar à Fitoquímica como uma parte ainda importante no desenvolvimento da Química. Não posso deixar de mencionar ao Dr. Nivaldo Boralle, Lucineia Vizzotto Marconcini, Prof. Dr. Ian Castro Gamboa, Profa. Dra. Isabele Rodrigues Nascimento, Dra. Juliana Rodrigues, João Luiz Bronzel Junior, Camila Luiza Cunha, Mayra Fonseca Costas e Natália Vieira. Espero todos saibam o por que do meu agradecimento, meu profundo carinho e respeito por vocês. Aos colegas do meu grupo de Fitoquímica, primeiro por recebermos como família e depois por ensinar-me a crecer e me valorizar como profissional e pessoa: ao Weslei Botero, Felipe Hilário, Maiara Borges, João Pedro, Henrique Veloso, Pedrinho, Marcelo. À Ana Carolina Zanatta Silva (Aninha) e Thayna H. Marcondes, meu carinho, admiração e respeito muito especial. À comunidade de Cubanos em Araraquara sem os quais a nossa vida teria sido diferente. Alguns conhecia desde Cuba, outros conheci aqui, mas ficaram como família. As famílias podem ter os seus problemas. Porém, acredito que na hora certa eles estarão presentes. Uns já continuaram suas vidas em outras terras, outros continuam aqui, mas sempre seremos ―Cubanos em Araraquara‖ Mayté Paredes, Celia M. Casado Martins, Jorge R. Chanfrau, Bárbara M. Reyes, Deivys Leandro, Ana Isa Pérez Cordoves, Yayma Veranes, Leonar D. Granela, Michael Pérez Rodríguez, Yani, Viviam Ruz, Antonio Fernández, Patricia Carreaga e Paulo Henrique quem é um cubano mais. Os médicos cubanos Jorge, Yadian e Erika, Yisel. Con ellos mi tranquilidad, mi salud y de mi familia, siempre estuvieron seguros. Aos amigos de São Carlos: Dianne, Yuleidi, Humberto, Elsie e Marcus, Înes. Às Instituções e pessoas que chegaram à nossa vida não por acaso e sim para formar parte do nosso passado, presente e futuro: Aos professores da escola EE Antônio J. de Carvalho, EE Narciso da Silva César, Lar Nossa Sra. das Merces que acolheram a minha filha com muito amor (Andreia, Dalva, Rosângela, Irmã Cida, Sueli, Joseane, etc). Os meus vizinhos que formam parte da minha família brasileira: Maria Cecília Onofrio, Dona Luzia, Daiana (francesa), Wolter Logatte, Christina. Aos amigos dos nossos amigos que já são os meus amigos: Marcelio Souza, Vanusa e Flia, Daiana, Osmar e Katia, etc. Mis amigos de siempre: Araisa y Flia, Wilmer Perera y Flia, Abel Gómez y Flia, Moisés Terrero “del Valle” y Flia, Yaelis Rivas y Flia. Todos son y siempre serán importantes en nuestras vidas. Maite Docampo y Flia, mi mejor e incondicional amiga. Sin ti, sabes que esta batalla hubiera sido más difícil. Jorge L. Escobar, Dunia García y Flia: Gracias por el afecto y las muestras de amistad y cariño sincero sobre todo em esta última etapa. Mis querid@s amig@s del INIFAT, Yarelis Ortiz, Maria Elena Álvarez, Yuliet Aguado, Evelyn Gueishman, Ivan Sayago, Zoraida, Yannin, Ruben, Pancho. Están siempre presentes en mi corazón. Maria Eugenia Ruenes Figueroa, de amiga pasaste a hermana que sin darme cuenta. No tengo más que escribir porque todo te lo he dicho. Mi família: primos, tios, ahijados, comadres y compadres. No imaginan el tamaño de la alegria cuando sé de uds, cuando nos reunimos en nuestras vacaciones em Cuba, cuando nos vemos por IMO. Wilmer, Tomasito, Yahima, Dulce, Iraida, Carlos, Anita, Ritsie, Fernandito, Anneriesse, Annerys. A Beatris Leander y Marlon Valerino por siempre estar presente como si estuvieramos em el mismo País. Los quiero mucho, mucho. A mi suegra, cuñados y concuñas. Sin uds no existiera esse hombre maravilloso que siempre me acompaña. Uds. también son mi família: Miriam, Reinier, Martín, Yaquelin, Yaneisy, Mercedes, etc. Mi madre, Mirsa Turro Guilian, mi inspiración y mi fuerza. Dios te bendiga siempre y nos permita disfrutar de tu claridade, alegria y sabiduria por muchos años más. Mi hermano, Alberto L. Gamiotea Turro: Siempre en mis pensamentos. Cuídate y DtB. A minha pequena princessa, Lauren Valerino Gamiotea. Meu todo, a minha razão de viver, a minha maior motivação para me aventurar nessa história e para quem eu quero continuar. Alexander B. Valerino Díaz: Meu esposo, amigo, cúmplice, companheiro, colega de trabalho. Não tenho palavras para descrever o importante que você é na minha vida. Muito obrigada mesmo por aceitar os meus defeitos e sobre tudo, por essa caminhada que estamos fazendo juntos. A todos, ―Muchas gracias‖. RESUMO A espécie Jatropha aethiopica (Euphorbiaceae) é usada em Cuba como planta ornamental e medicinal, conhecida como "Chaya" ou "mata diabetes". As pessoas garantem que o chá feito das folhas é capaz não só controlar o diabetes, mas também curá-la. Este trabalho teve como objetivo o estudo químico através da identificação, isolamento e elucidação estrutural dos metabólitos presentes no extrato etanólico das folhas de Jatropha aethiopica, assim como avaliar a atividade hipoglicemiante e a citotoxicidade desse extrato. Técnicas cromatográficas de isolamento e purificação (Sephadex LH-20, Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada ao Detector de Arranjo de Diosdos (CLAE-DAD), Cromatografia Líquida de Media Pressão (CLMP)), assim como a otimização desses métodos, possibilitaram o isolamento e caracterização química de 12 substâncias utilizando técnicas espectroscópicas e espectrométricas. Foram quantificados por CLAE-DAD tanto no extrato etanólico quanto na fração fenólica, os metabolitos secundários identificados majoritariamente no DAD. A metodologia analítica foi validada segundo as normas da ANVISA. A análise por Cromatografia Líquida acoplada a espectrometria de massas com interface de ionização por electrospray (LC- ESI-MS/MS), foi útil na confirmação da presença de vários isômeros de flavonoides e compostos nitrogenados, bem como, na determinação do possível mecanismo de fragmentação dessas substâncias. A atividade hipoglicemiante foi determinada usando um modelo de camundongo swiss, no entanto a atividade citotóxica foi determinada mediante os testes colorimétricos MTT (Brometo de 3-((4,5-dimetiltiazol)-2, il)-2,5- difeniltetrazólio) e XTT (Hidrato de benzenilsulfito 3’-[1-[(fenilamino]-carbonil-3,4-tetrazólio]-bis-(4- metoxi-6-nitro) de sódio) para linhagens tumorais e células normais, respectivamente. Das 27 substâncias identificadas a partir do extrato etanólico das folhas de J. aethiopica, foram isoladas e caracterizadas duas substâncias nitrogenadas, três ácidos fenólicos e sete flavonoides: 3-carboxiamida-1-metilpiridinium (1); N-(2-aminobutilamil)-N-(1-hidroxi-1- isopropil)-N-2-oxo-5-amino-5-pentanol (2); ácido protocatecuico (3); quercetina 3-O-β-D- galactopiranosídeo [α-L-ramnopiranosil-(1'''→2'')]-[α-L-ramnopiranosil-(1''''→6'')] (4); quercetina 3-O-β-D-glicopiranosídeo [α-L-ramnopiranosil-(1'''→2'')]-[α-L-ramnopiranosil- (1''''→6'')] (5); canferol 3-O-β-D-galactopiranosídeo [α-L-ramnopiranosil-(1'''→4'')]-[α-L- ramnopiranosil-(1''''→6'')], descrita pela primeira vez nesse trabalho (6); canferol 3-O- β-D- glicopiranosídeo [α-L-ramnopiranosil-(1'''→2'')]-[α-L-ramnopiranosil-(1''''→6'')] (7); rutina (8); canferol-3-O-rutinosídeo (9); ácido cafeico (10); ácido p-cumárico (11) e quercetina (12). Na quantificação demonstrou-se os altos conteúdos de flavonoides que apresenta o extrato etanólico (62,5 mg g-1) e a fração fenólica (61,7 mg g-1). As demais estruturas das substâncias identificadas por análises de LC-ESI-MS, correspondem aos isômeros dos flavonoides isolados e outras estruturas ainda não identificadas. O estudo de atividade hipoglicemiante monstrou a potencialidade das folhas de J. aethiopica. Tanto os testes antitumorais quanto os de viabilidade celular mostraram a baixa citotoxicidade dessa espécie pelo qual pode-se sugerir que a mesma possa ser utilizada em formulações de tintura. Portanto, os dados desse trabalho podem auxiliar no potencial uso de J. aethiopica pela população. Palavras chaves: Jatropha aethiopica; atividade hipoglicemiante; quantificação; flavonoides triglicosídeos; substâncias nitrogenadas. ABSTRACT Jatropha aethiopica (Euphorbiaceae) leaves are used in Cuba both as ornamental and medicinal plant. This species is known as "Chaya" or "mata diabetes". People have hypothesized that consumption of the tea made from fresh leaves is capable of not only controlling diabetes but also curing it. The main of this work was to study the chemical composition through the identification, isolation and structural elucidation of the metabolites present in the ethanolic extract of the leaves of J. aethiopica, as well as to evaluate the antihyperglycemic activity and cytotoxicity of this extract. Isolation and purification chromatography techniques (Sephadex LH-20, High Performance Liquid Chromatography coupled to the Photodiode Array Detector (HPLC-PAD), Medium Pressure Liquid Chromatography (MPLC)), as well as the optimization of these methods, allowed the isolation and chemical characterization of 12 substances using spectroscopic and spectrometric techniques. The secondary metabolites identified by DAD detection at the ethanolic extract and the phenolic fraction, were quantified. The analytical methodology was validated according to ANVISA standards. Liquid Chromatography coupled to mass spectrometry with electrospray ionization interface (HPLC-ESI-MS/MS) analysis, was useful in confirming the presence of several isomers of flavonoids and nitrogen compounds, in addition to determinate the probable fragmentation mechanism of these substances. Hypoglycemic activity was determined using a swiss mouse model; nevertheless, cytotoxic activity was determined by the MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)- 2,5-diphenyltetrazolium bromide) and XTT ((sodium 2,3,-bis(2-methoxy-4-nitro-5- sulfophenyl)-5-[(phenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium) colorimetric assays for tumor and normal cell lines, respectively. Of the 27 substances identified from the ethanolic extract of the J. aethiopica leaves, two nitrogenous substances, three phenolic acids and seven flavonoids were isolated and characterized: 3-carbamoyl-1-methylpyridinium (1); 3-amino- 4-((5-amino-5-hydroxy-2-oxopentyl) (1-hydroxy-2-methylpropyl) amino) butanamide (2); protocatechuic acid (3); quercetin 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1'''→2'')-[α-L- rhamnopyranosyl-(1''''→6'')]-β-D-galactopyranoside (4); quercetin 3-O-α-L- rhamnopyranosyl-(1'''→2'')-[α-L-rhamnopyranosyl-(1''''→6'')]-β-D-glucopyranoside (5); kaempferol 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1'''→4'')-[α-L-rhamnopyranosyl-(1''''→6'')]-β-D- galactopyranoside, descrita pela primeira vez nesse trabalho (6); kaempferol 3-O-α-L- rhamnopyranosyl- (1'''→2'')- [α-L-rhamnopyranosyl- (1''''→6'')]-β-D-glucopyranoside (7); rutin (8); kaempferol-3-O-rutinoside (9); caffeic acid (10); p-cumaric acid (11) e quercetin (12). High content of the quantified flavonoids in the ethanolic extract (62.5 mg g-1) and in the phenolic fraction (61.7 mg g-1) were demonstrated. The remaining structures of the identified substances by the LC-ESI-MS analysis correspond to isomers of the isolated flavonoids and other structures not identified. The hypoglycemic activity study showed the potentiality of J. aethiopica leaves. Both antitumor and cell viability tests showed the low cytotoxicity of this species by which suggest it the use in tincture formulations. Therefore, the data of this work can help in the potential use of J. aethiopica by the population. Key words: Jatropha aethiopica, hypoglycemic activity; quantification; triglycosilated flavonoids; nitrogens compounds. LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária BPC Base Peak Chromatogram 13C Isótopo do carbono CCD Cromatografia em camada delgada CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência CLMP Cromatografia Líquida de Media Pressão CLAE-DAD Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada com Detector de Arranjo de diodos D2O Água deuterada DAD Detetor de arranjo de Diodos DM Diabetes Mellitus DMSO-d6 Dimetilsulfóxido deuterado EM Espectrometria de Massas ESI Electrospray ionization (Ionização por electrospray) FCN Fração de Compostos Nitrogenados FF Fração Fenólica Frç Fração 1H Isótopo do hidrogênio HMBC Heteronuclear Multiple Bond Coherence HPLC High Performance Liquid Chromatography (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência) HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence LC-ESI-MS/MS Liquid Cromatography- Electrospray ionization-Mass Spectrometer LC-ESI-QTOF- MS Liquid Cromatography- Electrospray ionization-Quadrupole Time of Flight Mass Spectrometer LP07 Linhagem celular: adenocarcinoma de pulmão murino MCF-7 Linhagem celular: adenocarcinoma de mama humano MeOH Metanol MPLC Medium Pressure Liquid Chromatography (Cromatografia Líquida de Media Pressão) MS Mass Spectrometry (Espectrometria de Massas) MTT Brometo de 3-((4,5-dimetiltiazol)-2, il)-2,5-difeniltetrazólio m/z Relação massa carga 15N Isótopo do nitrogênio n-BuOH n-Butanol NCDs Noncommunicable diseases (doenças não transmissíveis) OMS Organização Mundial de Saúde PAD Photodiode Array Detector (Detector com Arranjo de Fotodiodos) PFGSE Pulsed field-gradient spin echo (Ecos de spin com gradientes de campo magnético pulsados) ppm Partes por milhão PTFE Politetrafluoroetileno RMN Ressonância Magnética Nuclear RP18 Reversed Phase octadecylsilan (Fase reversa octadecilsilano) RPMI Meio de cultura para o crecimento de células (Roswell Park Memorial http://www.who.int/ncds/en/ Institute medium) SPE Solid Fase Extraction (Extração em fase sólida) STZ Estreptozotocina (streptozotocin) TFA Ácido Trifluoracético TOCSY 1D Total Correlation Spectroscopy 1 Dimension UNESP-SP Universidade Estadual Paulista ―Júlio Mesquita Filho‖ – São Paulo UV Ultravioleta XTT Hidrato de benzenilsulfito 3’-[1-[(fenilamino]-carbonil-3,4-tetrazólio]-bis-(4- metoxi-6-nitro) de sódio LISTA DE FIGURAS Figura 1. Espécies de importância económica dentro da família Euphorbiaceae 25 Figura 2. Espécies do gênero Jatropha. 31 Figura 3. Espécie Jatropha aethiopica Muell Arg 35 Figura 4. Fluxograma de preparo e fracionamento do EE das folhas de J. aethiopica 53 Figura 5. Perfil cromatográfico do extrato etanólico de folhas de J. aethiopica, com espectros no UV representativos 55 Figura 6. Representação dos sistemas benzoil (II) e cinamoil (I) dos flavonoides. Bandas I e II em um espectro no UV de flavonoide glicosilado e outro não glicosilado na posição 3 56 Figura 7. Fluxograma de isolamento das substâncias nos extrato etanólico das folhas de J. aethiopica 58 Figura 8. Espectro RMN 1H de 3 59 Figura 9. Estrutura do ácido protocatecuico 3 60 Figura 10. Espectro RMN 1H de 10 61 Figura 11. Estrutura do ácido cafeico 10 61 Figura 12. Espectro RMN 1H de 11 62 Figura 13. Estrutura do ácido p-cumárico 11 63 Figura 14. Espectro RMN 1H de 4 65 Figura 15. Mapa de contorno gHSQC de 4 65 Figura 16. Mapa de contorno gHMBC de 4 66 Figura 17. Espectro TOCSY 1D com irradiação em H 5,57 de 4 66 Figura 18. Espectro TOCSY 1D com irradiação em H 5,05 de 4 67 Figura 19. Espectro TOCSY 1D com irradiação em H 4,38 de 4 67 Figura 20. Mapa de contorno gHMBC de 4 68 Figura 21. LC-MS (modo negativo) do extrato de J. aethiopica. Íon extraído m/z 755 69 Figura 22. Espectros de massas obtidos do pico de m/z 755 substância 4 70 Figura 23. Espectro ESI-MS/MS (modo negativo) de 4 70 Figura 24. Diagrama de fragmentação de flavonóis 71 Figura 25. Estrutura do flavonoide 4 72 Figura 26. Espectro RMN 1H de 5 73 Figura 27. Mapa de contorno gHSQC de 5 74 Figura 28. Mapa de contorno gHMBC de 5 74 Figura 29. Espectro TOCSY 1D com irradiação em H 5,53 de 5 75 Figura 30. Espectro TOCSY 1D com irradiação em H 5,06 de 5 75 Figura 31. Espectro TOCSY 1D com irradiação em H 4,33 de 5 76 Figura 32. Mapa de contorno gHMBC de 5 77 Figura 33. Estrutura do flavonoide 5 77 Figura 34. Espectro RMN 1H de 6 78 Figura 35. Mapa de contorno gHSQC de 6 79 Figura 36. Mapa de contorno gHMBC de 6 80 Figura 37. Espectro TOCSY 1D com irradiação em H 5,55 de 6 81 Figura 38. Espectro TOCSY 1D com irradiação em H 5,05 de 6 81 Figura 39. Espectro TOCSY 1D com irradiação em H 0,80 de 6 82 Figura 40. Espectro TOCSY 1D com irradiação em H 4,35 de 6 82 Figura 41. Mapa de contorno gHMBC de 6 83 Figura 42. LC-MS (modo negativo) do extrato de J. aethiopica. Íon extraído m/z 739 84 Figura 43. ESI-MS/MS (modo negativo) do extrato de J. aethiopica. Íon extraído m/z 739 84 Figura 44. Diagrama de fragmentação do íon m/z 739 com clivagem homolítica via radical na posição 3-O-Glicosídeo e formação do íon radical [Y0H]  85 Figura 45. Estrutura do flavonoide 6 85 Figura 46. Espectro RMN 1H de 7 86 Figura 47. Mapa de contorno gHSQC de 7 87 Figura 48. Mapa de contorno gHMBC de 7 87 Figura 49. Espectro TOCSY 1D com irradiação em H 5,48 de 7 88 Figura 50. Espectro TOCSY 1D com irradiação em H 5,04 de 7 88 Figura 51. Espectro TOCSY 1D com irradiação em H 0,78 de 7 89 Figura 52. Espectro TOCSY 1D com irradiação em H 4,31 de 7 89 Figura 53. Mapa de contorno gHMBC de 7 90 Figura 54. Estrutura do flavonoide 7 91 Figura 55. Espectro RMN 1H de 8 92 Figura 56. Mapa de contorno gHSQC de 8 92 Figura 57. Mapa de contorno gHMBC de 8 93 Figura 58. Estrutura do flavonoide 8 93 Figura 59. Espectro RMN 1H de 9 94 Figura 60. Mapa de contorno gHSQC de 9 95 Figura 61. Mapa de contorno gHMBC de 9 96 Figura 62. Estrutura do flavonoide 9 96 Figura 63. Espectro RMN 1H de 12 97 Figura 64. Estrutura do flavonoide 12 97 Figura 65. Espectro RMN 1H da fração G-160 102 Figura 66. Espectro DOSY da fração G-160 103 Figura 67. Mapa de contorno gHMBC-15N da mistura G-160 104 Figura 68. Mapa de contorno gHSQC mistura G-160 104 Figura 69. Mapa de contorno gHMBC da mistura G-160 105 Figura 70. Espectro TOCSY 1D da substância 1 106 Figura 71. Espectro de massas mistura G-160 107 Figura 72. Espectro de massas MSMS do íon m/z 137 107 Figura 73. Estrutura da substância 1 107 Figura 74. Espectro RMN 1H da substância 2 identificada da mistura de G- 160 109 Figura 75. Mapa de contorno gHMBC-15N da substância 2 na mistura G- 160 109 Figura 76. Mapa de contorno gHSQC da mistura G-160 110 Figura 77. Mapa de contorno gHMBC da mistura G-160 111 Figura 78. Espectro TOCSY 1D da substância 2, irradiado em H 4,24 111 Figura 79. Espectro TOCSY 1D da substância 2, irradiado em H 3,20 112 Figura 80. Espectro TOCSY 1D da substância 2, irradiado em H 0,90 112 Figura 81. Espectro de massas mistura G-160 113 Figura 82. Espectro de massas MSMS do íon m/z 137 113 Figura 83. Diagrama do padrão de fragmentação proposto para a substância 2 114 Figura 84. Estrutura da substância 2 114 Figura 85. Perfil por LC-ESI-MS do extrato etanólico das folhas de J. aethiopica 116 Figura 86. Espectros representativos de ESI-MS/MS para distinguir as classes de metabólitos por meio de identificação da aglicona 118 Figura 87. Espectros ESI-MS/MS para os íons precursores m/z 757 (A – C) com diferente tR 124 Figura 88. Espectros ESI-MS/MS para os íons precursores m/z 611 (A – B) com diferente tR 125 Figura 89. Espectros ESI-MS/MS para os íons precursores m/z 741 (A – B) e m/z 595 (C – D) com diferente tR 126 Figura 90. Espectros ESI-MS/MS para os íons precursores m/z 771 (A – B), m/z 625 (C – D) e m/z 479 (E – F) com diferente tR 127 Figura 91. Diagrama de fragmentação de flavonoides. Adaptado de VUCKICS; GUTTMAN, 2010 128 Figura 92. Perfil cromatográfico da fração fenólica (FF) das folhas de J. aethiopica 131 Figura 93. Curvas analíticas obtidas pelo método de calibração externa das soluções padrões 132 Figura 94. Espectros de UV dos padrões comparados com os compostos isolados no laboratório 133 Figura 95. Efeito do tratamento com EE de J. aethiopica a la concentração de 500 mg kg-1 138 Figura 96. Efeito da fração de compostos nitrogenados (FCN) do tratamento de J. aethiopica nas doses de 50, 100 e 200 mg kg-1 140 Figura 97. Efeito da fração fenólica (FF) do tratamento de J. aethiopica nas doses de 50, 100 e 200 mg kg-1 140 Figura 98. Efeito das frações de compostos nitrogenados e fenólica do tratamento de J. aethiopica nas doses de 50 e 200 mg kg-1 141 Figura 99. Reação de redução do MTT ao formazan 144 Figura 100. Gráfico comparativo entre os valores de IC50 para as linhagens tumorais 145 Figura 101. Reação de redução do XTT ao formazan 146 Figura 102. Viabilidade celular de fibroblastos de pulmão de humano (GM07492A) tratadas com diferentes concentrações (μg mL-1) de extrato etanólico de Jatropha aethiopica 147 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Exemplo de metabólitos obtidos de espécies do gênero Jatropha 27 Tabela 2. Resumo de estudos de atividade hipoglicemiante (IC50) de algumas espécies de Jatropha 33 Tabela 3. Colunas RP18 utilizadas no presente trabalho 38 Tabela 4. Rendimento das frações obtidas da partição líquido-líquido 57 Tabela 5. Deslocamentos de hidrogênio de compostos 3 (ácido protocatecuico), 10 (ácido cafeico) e 11 (ácido p-cumárico) isolados das folhas de J. aethiopica 63 Tabela 6. Dados de RMN13C dos flavonoides isolados 4, 5, 6, 8, 8, 9 e 12 99 Tabela 7. Dados de RMN1H dos flavonoides isolados 4, 5, 6, 8, 8, 9 e 12 100 Tabela 8. Dados da RMN 1H e 13C da substância 1 (Cd = 9,04) da fração G160 105 Tabela 9. Dados de RMN 1H e 13C da substância 2 (Cd = 9,10) 110 Tabela 10. Proposta de identificação dos compostos a partir do extrato etanólico das folhas de J. aethiopica por LC-MS e MS/MS 119 Tabela 11. Estruturas propostas de flavonoides do extrato etanólico das folhas de J. aethiopica identificadas por CLAE-ESI-HRMS/MS 122 Tabela 12. Parâmetros das curvas analíticas dos padrões 132 Tabela 13. Precisão intra-dia e inter-dia para o método de determinação do Ácido protocatecuico (AcP) 134 Tabela 14. Precisão intra-dia e inter-dia para o método de determinação da rutina (R) 134 Tabela 15. Exatidão do método para o extrato etanólico (EE) e fração fenólica (FF) das folhas de J. aethiopica 135 Tabela 16. Teor dos compostos isolados no extrato etanólico (EE) e fração fenólica (FF) das folhas de J. aethiopica 136 Tabela 17. Efeito do extrato etanólico (EE) de J. aethiopica (500 mg kg-1 por peso) sobre os níveis de glicose em camundongos normoglicêmicos e diabéticos depois de 14 dias de tratamento 137 Tabela 18. Efeito do tratamento de extrato bruto de J. aethiopica (500 mg kg-1 por via oral) em parâmetros de soro após 14 dias de tratamento 139 Tabela 19. Efeito das frações de compostos nitrogenados (FCN) e fenólica (FF) nos níveis de glicose no sangue (mg dL-1) após 7 dias de tratamento 141 Tabela 20. Efeito das frações dos compostos nitrogenados e fenólicas de J. aethiopica em parâmetros séricos após 7 dias de tratamento 142 Tabela 21. Valores de citotoxicidade para o EE das folhas de J. aethiopica 144 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO .......................................................................................................24 1.1. EUPHORBIACEAE .............................................................................................24 1.2 JATROPHA. .........................................................................................................26 1.2.1 Substâncias isoladas do gênero Jatropha. ...................................................... 26 1.2.2 Usos ................................................................................................................ 30 1.2.3 Atividade biológica de compostos fenólicos isolados do gênero Jatropha. ..... 31 1.3 Jatropha aethiopica. ............................................................................................34 2. Objetivos ..............................................................................................................36 2.1 Objetivo geral: ......................................................................................................36 2.2 Objetivos específicos: ..........................................................................................36 3. PARTE EXPERIMENTAL .....................................................................................37 3.1 Materiais, Reagentes e Soluções. .......................................................................37 3.2 Procedimentos gerais instrumentais ....................................................................37 3.3 Metodologia .........................................................................................................40 3.3.1 Etapa Botânica. ............................................................................................... 40 3.3.2 Preparação dos extratos .................................................................................. 40 3.3.3 Etapa Química ................................................................................................. 41 3.3.3. Etapa cromatográfica ...................................................................................... 42 3.3.4 Etapa de avaliação da atividade biológica ....................................................... 45 4. RESULTADOS E DISCUSSÕES ....................................................................53 4.1. Etapa química .....................................................................................................54 4.1.1 Obtenção dos extratos das folhas de espécies de Jatropha aethiopica por percolação. ............................................................................................................... 54 4.1.2 Perfil cromatográfico. ....................................................................................... 54 4.1.3 Fracionamento em Sephadex® LH-20 e CLME. .............................................. 57 4.2 Elucidação estrutural dos compostos isolados do extrato etanólico das folhas de J. aethiopica ..................................................................................................................58 4.2.1 Identificação dos ácidos fenólicos ................................................................... 59 4.3 Análises por LC–ESI–MS. .................................................................................115 4.4 Quantificação no extrato etanólico (EE) e na fração fenólica (FF) das substâncias isoladas. ..................................................................................................................130 4.4.1 Linearidade e sensibilidade. .......................................................................... 131 4.3.2 Seletividade. .................................................................................................. 133 4.3.3 Precisão. ........................................................................................................ 134 4.3.4 Exatidão. ........................................................................................................ 135 4.3.5 Quantificação dos compostos isolados. ......................................................... 135 4.4 Atividades biológicas. ........................................................................................136 4.4.1 Efeito hipoglicêmico e anti-hiperglicêmico do tratamento com J. aethiopica. 136 4.4.2 Determinação da citotoxicidade. .................................................................... 143 4.4.3 Determinação da citotoxicidade em células normais. .................................... 146 5. C0NCLUSÕES ....................................................................................................148 REFERÊNCIAS .......................................................................................................150 Introdução 24 1 INTRODUÇÃO Desde a antiguidade as pessoas procuravam drogas na natureza em busca de amenizar as doenças. O início do uso das plantas medicinais foi instintivo, como é o caso dos animais (HALBERSTEIN, 2005). De fato, a demanda por fontes naturais aumentou de 8% a 15% ao ano na Europa, América do Norte e Ásia nos últimos vinte anos (VERMA; SINGH, 2008). No entanto, pesquisadores pertencentes a diversas áreas do conhecimento como química, biologia e farmacologia, têm direcionado esforços para reunir informações e validar o conhecimento desta medicina tradicional (FABREGA Jr., 2012). Pesquisadores de diferentes países têm reunido informações sobre a composição química de espécies vegetais, assim como sobre seu uso com interesse farmacológico e medicinal (INTA et al., 2013; PRABHU et al., 2014). Portanto, é importante que exista um interesse em pesquisas com espécies vegetais para o conhecimento de sua composição química e seu potencial farmacológico. 1.1. EUPHORBIACEAE A família Euphorbiaceae (também conhecida como família Spurge), possui mais de 300 gêneros e cerca de 7.500 espécies segundo vários autores (GOVAERTS; FRODIN; RADCLIFFE-SMITH, 2000; WEBSTER, 1994). Essa família está dividida em cinco subfamílias devido, principalmente a critérios morfológicos (WEBSTER, 1994). Várias plantas da família Spurge são de considerável importância econômica. Entre as plantas proeminentes estão a mandioca (Manihot esculenta), uma das principais fontes de amido na alimentação humana; a mamona (Ricinus communis) e o pinhão-manso (Jatropha curcas) devido ao seu potencial para extração de óleo. Por outro lado, Hevea brasiliensis conhecida como borracha do Pará ou seringueira, é a principal fonte de borracha natural, além de plantas ornamentais, como a poinsétia (Euphorbia pulcherrima) (WEBSTER, 1994) (Figura 1, Pagina 25). No entanto, a espécie Croton antisyphiliticus (pé-de-perdiz) utilizado pelas suas propriedades medicinais no tratamento de eczemas, depurativo do sangue, úlceras e anti-sífilis (RODRIGUES; CARVALHO, 2001). Introdução 25 Figura 1 – Espécies de importância económica dentro da família Euphorbiaceae Manihot esculenta (Mandioca) Euphorbia pulcherrima (Poinsétia) Hevea brasiliensis (Seringueira) Ricinus communis (Mamona) Croton antisyphiliticus (pé-de-perdiz) Euphorbiaceae apresenta-se como uma família com grande potencialidade medicinais devido as suas propriedades biológicas, assim como uma fonte importante de metabólitos pelo que podem contribuir para a descoberta de novas moléculas biologicamente ativas. Na medicina algumas espécies de Euphorbiaceae são utilizadas pelas suas propriedades antissépticas e citotóxicas, (RAHMAN; AKTER, 2013). Estudos já publicados relatam vários grupos de substâncias isoladas a partir de espécies da família Euphorbiaceae. Entre elas podemos mencionar alcaloides, terpenos (monoterpenos, diterpenos, triterpenos e sesquiterpenos), flavoniodes, lignanas, cumarinas, cumarinas- lignoides, outros compostos fenólicos, entre outros (AMINAH; KRISTANTI; TANJUNG, 2014; SABANDAR et al., 2013). Introdução 26 1.2 JATROPHA. O gênero Jatropha é constituído por cerca de 170 espécies e pertence à família Euphorbiaceae, subfamília Crotonoideae e tribo Jatropheae (SUJATHA; BAHADUR; REDDY, 2013; BAHADUR; PULLAIAH; MURTHY, 2013). Por ser um gênero de crescimento rápido, fácil propagação e adaptação, apresenta uma vasta distribuição (DEHGAN, 1982). O gênero abrange espécies africanas, indianas, sulamericanas, antilhanas e das regiões meso- americanas. Algumas espécies de Jatropha foram naturalizadas na América do Sul e nas regiões meso-americanas, México, Cuba, Peru, Bolívia, Costa Rica, Paraguai, Jamaica, Brasil, El- Salvador, Guatemala, Argentina, Republica Dominicana, Colombia, Nicarágua e nos estados americanos de Arizona e Texas. (SABANDAR et al., 2013; HELLER, 1996). A distribuição dessas plantas encontra-se majoritariamente nas Américas (Central e Sul), de onde a maior parte é nativa. Devido a esta distribuição, é um gênero morfologicamente diverso, composto por plantas herbáceas perenes, suculentas, facultativas anuais, geófitas, arbustos, subarbustos rizomatosos e árvores lenhosas, cada uma com uma região geográfica específica para o seu desenvolvimento (SUJATHA; BAHADUR; REDDY, 2013; SABANDAR et al., 2013; DEHGAN, 1982). Esta diversidade morfológica permitiu que várias espécies fossem cultivadas como plantas ornamentais devido a beleza das flores e folhas (SUJATHA; BAHADUR; REDDY, 2013). 1.2.1 Substâncias isoladas do gênero Jatropha. Vários produtos naturais bioativos foram descritos a partir de extratos de espécies de Jatropha, e estes são recursos promissores para o desenvolvimento de fármacos potenciais e outros produtos. Nesta revisão resumimos o progresso fitoquímico e listamos alguns compostos isolados do gênero Jatropha (Tabela 1, Pagina 27). Como observado, a diversidade de metabólitos do gênero Jatropha compreende substâncias fenólicas, terpenos, compostos nitrogenados, entre outros. Essa característica faz de Jatropha um gênero com espécies de alto valor na medicina tradicional e, portanto, justificando seu estudo químico e biológico (SABANDAR et al., 2013). Introdução 27 Tabela 1 – Exemplo de metabólitos obtidos de espécies do gênero Jatropha. N. Nome comum Nome IUPAC Estrutura Espécie/PP Referência 1 Integerrimene Acetato de 1,2,3,3a,4,5,8,9,10,11-deca- hidrociclopenta-anulen-1-il-(6Z, 12E) -2,5,11- trimetil-4,10-dioxo-8- (prop-1-en-2-il) J. integérrima Caule RAVINDRANATH et al., 2004a 2 Palmarumicina CP1 5-hidroxi-4H-espiro [naftaleno-1,2'-nafto [1,8-de] [1,3] dioxina] -4-ona J. integérrima Caule RAVINDRANATH et al., 2004a 3 3β,12-diidroxi-13- metilpodocarpano- 8,10,13-trieno (2S, 4aS, 10aR) -1,1,4a,7-tetrametil-1,2,3,4,4a, 9,10,10a-octa-hidrofenantreno-2,6-diol J. curcas Partes aéreas RAVINDRANATH et al., 2004b 4 Friedelina (4R, 4aS, 6aS, 6bR, 8aR, 12aR, 12bS, 14aS, 14bS) -4,4a, 6b, 8a, 11,11,12b, 14a-octametilicosa- hidropiceno-3 (2H) -ona J. curcas Partes aéreas RAVINDRANATH et al., 2004b 5 - (1R, 2R, 5S, 6S, 7S, 10S) -5-Epieudesm-4 (15) - eno-1R, 2, 6R-triol J. neupauciflora Casca GARCIA et al., 2006 Introdução 28 Tabela 1 – Continuação... N. Nome comum Nome IUPAC Estrutura Espécie/PP Referência 6 Gossipidieno Succinato de dimetil (2E, 3E) -2- (benzo-[1,3]- dioxol-5- ilmetileno) -3 - ((5,6-di-hidrobenzo-[1,3]- dioxol-5-il) metileno) J. gossypiifolia Caule DAS et al., 1999. 7 Jatrofan (E) -3- (benzo-[1,3]-dioxol-5-ilmetileno) -4- (3,4- dimetoxibenzil)-di-hidrofuran-2 (3H) -ona J. gossypiifolia Caule, raízes e sementes BANERJI et al., 1984 8 Propacina (2R, 3R) -3- (4-hidroxi-3-metoxifenil) -5-metoxi-2- metil-2,3- di-hidro-9H- [1,4] dioxino [2,3] cromen-9 - ona J. gossypiifolia Planta inteira DAS et al., 2001 9 5-hidroxipirrolidin- 2-ona 5-hidroxipirrolidin-2-ona J curcas Folhas STAUBMANN et al., 1999 10 Pirimidina-2,4- diona Pirimidina-2,4-(1H, 3H)-diona J. curcas Folhas STAUBMANN et al., 1999 Introdução 29 Tabela 1 – Continuação... N. Nome comum Nome IUPAC Estrutura Espécie/PP Referência 11 Curcamida N-(3-acetamidopropil)-cinamamida J. curcas Semente YAO et al., 2012 12 Fraxetina (7,8-diidroxi-6- metoxicumarina) 7,8-di-hidroxi-6-metoxi-2H-cromen-2-ona J. glandulífera Raízes PARTHASARAT HY et al.,1984 13 Vitexina Ácido (S)-4-(((5,7-di-hidroxi-2-(4-hidroxifenil)-4-oxo- 4H- cromen-8-il)-oxi)-amino)-5-oxopentanóico J. gossypiifolia Folhas SANKARA et al., 1971 14 Apigenina 5,7-di-hidroxi-2-(4-hidroxifenil)-4H-cromen-4-ona J. gossypiifolia Folhas SANKARA et al., 1971 PP: Parte da Planta Introdução 30 1.2.2 Usos O gênero Jatropha destacou-se nas últimas décadas, particularmente, pelo óleo proveniente das suas sementes, que é considerado uma potencial matéria-prima para a produção de biodiesel (da SILVA et al., 2014). A espécie J. curcas é a mais estudada do gênero pelas suas sementes serem ricas em óleo, o que levou nos últimos 20 anos ao aparecimento de vastas áreas de plantações dessa espécie em alguns países da Ásia, África e América do Sul (DEVAPPA; MAKKAR; BECKER, 2010; de OLIVEIRA et al., 2009). Após a extração do óleo da semente, a torta restante é usada na desintoxicação e alimentação do gado (MAKKAR; ADERIBIGBE; BECKER, 1998; DEVAPPA; SWAMYLINGAPPA, 2008). O nome Jatropha é derivado das palavras gregas ''jatros'' (médico) e ''trophe'' (nutrição), o que justifica seu uso medicinal e na alimentação (KUMAR; SHARMA, 2008). Alguns de seus nomes populares são: óleo de noz selvagem, jatropha, pinhão, crioulo. (Fonte: Centro Mundial Agroflorestal [base de dados Agroforestree], http://tinyurl.com/yfvod37). Este gênero é utilizado como planta medicinal por mais de 80% da população mundial, onde destacamos a Ásia, América Latina e a África (DEVAPPA; MAKKAR; BECKER, 2010; SABANDAR et al., 2013). Três espécies podem ser destacadas por serem as mais utilizadas como medicinais: J. gossypiifolia, J. multifida e J. curcas. (SABANDAR et al., 2013) (Figura 2, Pagina 31). Este gênero é conhecido pelo efeito purgativo do óleo proveniente das suas sementes as quais são usadas para sintomas digestivos, diarreia, disenteria, vômitos, náusea e dor de estômago. Quanto às folhas de algumas das espécies, também apresentam semelhante efeito purgativo. Por outra parte, o óleo da semente, o látex, as folhas, a casca do caule ou da raiz trituradas, são aplicadas sobre a pele para tratar eczemas, coceiras, furúnculos, bolhas na boca, feridas e inchaços, assim como são igualmente aplicadas no tratamento de doenças venéreas e de trato urinário (DEVAPPA, MAKKAR e BECKER, 2010). As raízes das espécies J. gossypiifolia é usada no tratamento de lepra (FÉLIX-SILVA, 2014). http://tinyurl.com/yfvod37 Introdução 31 Figura 2 – Espécies do gênero Jatropha. J. gossypiifolia J. multifida J. curcas Fotos: Fornecidas pelo autor O látex das espécies J. curcas e J. mollissima é usado como antídoto do veneno de cobra, concentrado para o uso externo e diluído com água para uso interno (SABANDAR, et al., 2013; DEVAPPA; MAKKAR; BECKER, 2010). Os extratos aquosos e alcoólicos do caule e da casca da espécie J. macarantha são usados como estimulante sexual masculino. (DEVAPPA; MAKKAR; BECKER, 2011) 1.2.3 Atividade biológica de compostos fenólicos isolados do gênero Jatropha. A maioria das atividades biológicas relacionadas ao gênero Jatropha na literatura, são atribuídas aos compostos fenólicos, incluindo flavonóis, dos quais uma grande variedade está presentes nessas espécies. Estas propriedades incluem efeitos anticoagulante (FÉLIX-SILVA et al., 2014), anti-inflamatório (OLIVEIRA et al., 2010), antimalárico (JANSEN et al., 2010), antimicrobiano (DHALE; BIRARI, 2010; GAIKWAD et al., 2012), cicatrizações de feridas cutâneas (SANTOS et al., 2006), citotóxica (MATOS, 2004; NAZEEMA; GIRIJA, 2013), antitumoral (MATOS, 2004; MARIZ et al., 2010; DEVAPPA; MAKKAR; BECKER, 2011; NAZEEMA; GIRIJA, 2013; SABANDAR et Introdução 32 al., 2013), antioxidante (NAZEEMA; GIRIJA, 2013), antiviral (MARIZ et al., 2010), antiúlceras (SABANDAR et al., 2013), entre outras. Os flavonoides têm sido avaliados pelas suas propriedades citotóxicas. Devido as características estruturais, as flavonas e pterocarpanos apresentam valores de CIM50 que podem ser reconhecidos pelo Instituto Nacional do Câncer, que requer um valor CIM50 menor que 30 µg/mL para os extratos brutos ativos contra células cancerígenas (OSKOUEIAN et al., 2011; BOIK, 2001). Portanto, uma vez que um extrato apresente um valor de CIM50 inferior ou igual à exigida pelo Instituto Nacional do Câncer, este pode ser considerado uma fonte promissora de substâncias bioativas que podem, na sequência, serem purificadas para o desenvolvimento de drogas anticâncer, (OSKOUEIAN et al., 2011). Segundo SONODA et al., (2004), flavonas hidroxiladas nas posições 2’, 3’, 5 e 7 nos anéis A e B, apresentam maior atividade citotóxica quando testada frente a células leucêmicas (CIM50=9,5 µm), seguido de outras substâncias que não possuem substituintes na posição 3 do anel C (Tabela 2, Pagina 33). Por outro lado, SAK; KASEMAA; EVERAUS (2016), mostraram a atividade citotóxica da luteolina contra melanoma com CIM50=10 mg mL-1. Com esses valores de CIM50 as substâncias podem ser avaliadas como muito ativas e portanto, estabelecem um padrão de comparação com os metabolitos isolados da espécie em estudo. Diabetes mellitus (DM) é uma doença metabólica caracterizada pela hiperglicemia/hipoglicemia crônica causada por defeitos na ação da insulina e/ou a secreção dela, que afeta o metabolismo de proteínas, gorduras e carboidratos (BAVILONI et al., 2010). Além disso, DM é considerada pela Organização Mundial de Saúde (OMS) como uma das quatro principais doenças não transmissíveis (NCDs) e que afetam a muitas pessoas (WHO, 2016). Diabetes Mellitus Tipo 1 é caracterizado pela deficiência absoluta de produção de insulina e representa 5-10 % de todos os casos de diabetes e resulta de uma destruição auto-imune de células β pancreáticas. No Diabetes Mellitus tipo 2, que representa 90 a 95% dos casos de diabetes, a resistência à insulina e a falência progressiva das células β (diminui a massa celular β, a sensibilidade à glicose e a capacidade secretória) são características e vários fármacos são usados para aumentar a sensibilidade à insulina configurações (WHO, 2016). Introdução 33 Tabela 2 – Resumo de estudos de atividade hipoglicemiante (IC50) de algumas espécies de Jatropha. Espécie (Ref) Extrato (parte da planta) /Substância testada IC50 (mg mL-1) Estrutura isolada J. curcas (KUMAR et al., 2016) Hidroalcoólico (folhas) 400 - J.gossypifolia* (SALEEM et al., 2016) Metanol (raízes) Metanol (folhas) Diclorometano (folhas) Acetato de etila (folhas) n-butanol (folhas) <400 <400 392,41± 0,68 213,45± 0,12 218,47± 0,23 - - - - - J. gossypifolia** (GRANADOS et al., 2015) Metanol (folhas) Etil éter (folhas) Acetato de etila (folhas) 5,7,4'-tri-hidroxi-3',5'- dimetoxiflavanona Vitexina 135 57 >200 >200 - - J. curcas*** (EL-BAZ et al., 2014) Metanol (folhas) Rutina - -glicosidase ** absorção de glicose em miotubos resistentes à insulina ***mecanismo não determinado A diabetes aumenta 2-3 vezes o risco de ataque cardíaco e derrame cerebral (SARWAR et al., 2010). Suas opções de tratamento incluem a aplicação de insulina exógena ou combinando-a com outras drogas como metformina, glibenclamida e inibidores de alfa-glucosidase (acarbose e miglitol), que agem diminuindo a glicemia no jejum através de muitas vias. No entanto, o uso prolongado desses medicamentos é Introdução 34 susceptível de produzir efeitos colaterais adversos e também pode levar a um declínio na sua eficácia (SARWAR et al., 2010). A Tabela 2 (Pagina 33) apresenta estudos de extratos de diferentes polaridades, de várias partes de espécies de Jatropha, e a avaliação do potencial hipoglicemiante desses extratos. Como observado, extratos de várias polaridades tem sido avaliados pelas suas propriedades hipoglicemiantes, porém, poucos compostos foram testados. Por outro lado, a natureza das substâncias identificadas em extratos ativos é majoritariamente flavonóis. Existem várias drogas utilizadas para induzir o diabetes no modelo de estudo estabelecido. Nesse caso, a estreptozotocina (STZ), uma glicosamina-nitrosureia, é comumente usada para produzir o diabetes. A STZ é um potente agente alquilante de DNA, altamente tóxico, carcinogênico e diabetogênico, devido à destruição seletiva das células beta produtoras de insulina provocando assim o diabetes (MARINI, 2014; SILVA, 2011). 1.3 Jatropha aethiopica. Jatropha aethiopica Müell-Arg (Euphorbiaceae) foi introduzido em Cuba, de local e data não conhecidos (FUENTES-FIALLO et al., 2001). É uma árvore de até 4 m de altura e sua base possue mais do que 20 cm de diâmetro. A árvore tem também muitos ramos e produz uma seiva leitosa (ROIG Y MESA, 1974). Apesar da floração abundante que caracteriza a espécie, poucos frutos são produzidos, quase escassos (FUENTES- FIALLO et al., 2001) (Figura 3). A espécie J. aethiopica é usada em Cuba como planta ornamental e medicinal e em várias cidades é conhecida como "Chaya" ou "mata diabetes". As pessoas garantem que o chá feito das folhas não só controla o diabetes, mas também cura (ROIG Y MESA, 1974). Embora, as folhas de J. aethiopica sejam usadas na medicina popular, não há evidência experimental, provando suas propriedades hipoglicemiantes (ROIG Y MESA, 1974) e sua composição química ainda não foi definida. Considerando todos estes dados apresentados e a grande importância da validação do uso de plantas usadas na medicina tradicional, o estudo da espécie Jatropha aethiopica contribuirá com o enriquecimento do gênero Jatropha, assim como da família Euphorbiaceae, visto que esta espécie ainda não possui estudos químicos e biológicos Introdução 35 citados na literatura até o momento. Figura 3 – Espécie Jatropha aethiopica Muell Arg. Foto: Fornecida pelo autor Objetivos 36 2. Objetivos 2.1 Objetivo geral: Identificar, isolar e elucidar estruturalmente os metabólitos presentes no extrato etanólico das folhas de Jatropha aethiopica, assim como avaliar a atividade antihipoglicemiante e a citotoxicidade desse extrato. 2.2 Objetivos específicos: - Realizar o perfil cromatográfico por CLAE-DAD do extrato etanólico das folhas de Jatropha aethiopica; - Fracionar o extrato etanólico por técnicas cromatográficas convencionais até o isolamento dos metabólitos secundários; - Elucidar ou determinar as estruturas das substâncias isoladas por técnicas espectrométricas e espectroscópicas (RMN mono e bidimensionais, EM, UV); - Identificar metabólitos secundários do extrato etanólico das folhas de J. aethiopica por LC-ESI-QTOF-MS/MS; - Quantificar os metabolitos isolados a partir do extrato etanólico das folhas de J. aethiopica; - Realizar o ensaio de atividade hipoglicemiante de frações enriquecidas de compostos nitrogenados e fenólicos, assim como do extrato etanólico das folhas de J. aethiopica; - Realizar o ensaio antitumoral do extrato etanólico das folhas de J. aethiopica; - Realizar o ensaio de viabilidade de células normais com o extrato etanólico das folhas de J. aethiopica. Parte Experimental 37 3. PARTE EXPERIMENTAL 3.1 Materiais, Reagentes e Soluções. Os procedimentos experimentais foram realizados utilizando solventes grau PA: acetato de etila, n-butanol, etanol, clorofórmio, metanol, n-propanol (Synthlab); para as análises em CLAE foram utilizados solventes grau CLAE: metanol (Tedia) e água Milli-Q (Millipore®); para as análises em espectrômetro de massas foram utilizados solventes grau LC/MS: metanol, água e ácido fórmico (Merck) e para a análise em RMN das substâncias isoladas nos procedimentos cromatográficos foi utilizado solvente deuterado: DMSO- d6 (Aldrich). Cartuchos de extração em fase sólida (SPE) de adsorvente de fase reversa à base de octadecilsilano (RP18) com 500 mg mL-1 (33 μm, Supelco®) foram usados na etapa de preparo das amostra dos extratos e frações, sendo as soluções resultantes filtradas em membranas de PTFE (politetrafluoroetileno, teflon®, Millipore®) com poro de 0,45 ou 0,22 μm antes de análise por CLAE. Foram utilizadas placas de camada delgada de sílica gel 60 em suporte de alumínio (Merck®) (20 x 20 cm x 0,2 mm) na triagem fitoquímica das frações. A eluíção foi realizada em cuba saturada com as fases móveis n-BuOH/CH3COOH/H2O (80:18:2, v/v/v), CHCl3/MeOH/H2O (65:25:10, v/v/v, fase orgânica) ou CHCl3/MeOH/H2O (43:37:20, v/v/v, fase orgânica). A revelação das placas foi feita com luz UV (Câmara com luz UV 254 nm - Chromatovue®) e anisaldeído/H2SO4, nesta ordem. 3.2 Procedimentos gerais instrumentais Os extratos e frações foram concentrados em rotaevaporador rotativo sob pressão reduzida (Heidolph®, Laborota 4001 – efficient) equipado com bomba a vácuo (Heidolph, Rotavac valve control). As balanças analíticas Bioprecisa® FA2104N (capacidade 200 g e precisão de 0,1 mg) e Shimadzu® modelo AY-220 (capacidade para 220 g e precisão de 0,0001 mg) foram usadas na pesagem das folhas, dos extratos e frações, respectivamente. O fracionamento por cromatografia de permeação em gel foi realizado em colunas de vidro com 80 cm de altura por 2 cm de diâmetro interno, empacotada com Sephadex® LH-20 (Pharmacia). O solvente foi bombeado para a coluna com o auxílio de uma bomba Parte Experimental 38 peristáltica (Pharmacia) a uma vazão de 3,0 mL min-1. As frações foram coletadas em um coletor automático Redifrac (Pharmacia). As analises cromatográficas foram realizadas em um cromatógrafo líquido de alta eficiência (analítico gradiente quaternário) modelo PU-2089 (Jasco®), acoplado a um detector de arranjo de foto diodos, modelo MD-2018 (Jasco®) e a um injetor automático modelo AS-2055 (Jasco®). No entanto, as separações foram realizadas em um cromatógrafo líquido semi-preparativo de gradiente binário (Jasco®), acoplado a um detector de arranjo de foto diodos com faixa de varredura de 195-650 nm e intervalo mínimo de 1 nm (Jasco®). A aquisição e processamento dos dados cromatográficos foi realizada com o software ChromNAV (Cromatec®). As colunas utilizadas tanto no modo analítico quanto no semi-preparativo, estão sendo reportadas na Tabela 3. Testes foram feitos por CLAE com detector de índice de refração (IR) modelo Knauer‒Azura, com detector smartline 2300, com duas bombas modelos Pump 1 ASM 2.1L Knauer (10 mL/min) e Pump 2P 6.1 L Knauer (50 mL/min), foi utilizado no modo analítico utilizando as colunas da Tabela 3. Tabela 3 – Colunas RP18 utilizadas no presente trabalho. Modelo Características Modo 1 Thermo Hypersil Gold 250 x 4,6 mm x 5 µm Analítico 2 Luna Phenomenex® 250 x 4,6 mm x 5 µm Analítico 3 Luna Phenomenex® 250 x 10 mm x 5 µm Semipreparativo 4 Synergi Hydro RP 250 x 4,6 mm x 5 µm Analítico 5 Synergi Hydro RP 250 x 10 mm x 5 µm Semipreparativo 6 HILIC Phenomenex® 250 x 4,6 mm x 5 µm Analítico Em todas as condições foram usadas coluna guarda (4 x 3 mm) A cromatografia líquida de media pressão (CLMP) foi realizada em um sistema Buchi®, equipado com uma bomba Gerente C-615. Os experimentos de RMN mono e bidimensionais de 1H e 13C, HSQC, HMBC, TOCSY e HMBC-15N, foram obtidos em espectrômetro de Ressonância Magnética Nuclear Bruker® Avance III HD 600 (14,1 Tesla), usando uma sonda criogênica 5 mm, detecção inversa de três canais (1H, 13C, 15N), um gradiente z, além de ajuste (do inglês: tuning) automático e correspondência (ATM) dimetilsulfoxido deuterado (DMSO-d6 (Aldrich) ou água deuterada (D2O (Aldrich)). O software Top Spin versão 3.5 foi utilizado durante aquisição dos deslocamentos químicos de cada espectro, assim como na interpretação dos dados. Parte Experimental 39 Os experimentos de espectrometria de massas foram realizados no laboratório de ―Bioprospecção de Produtos Naturais‖ do Campus Litoral Paulista (UNESP-SP), coordenado pelo Prof. Dr. Wagner Vilegas e participação do Dr. Marcelo Tangerina. A análise das amostras foi realizada por injeção direta em um analisador Ion Trap (sigla em inglês IT) Thermo Scientific LTQ XL equipado com uma fonte de ionização por eletrospray (ESI) (Thermo, San Jose, CA, EUA) (FIA-ESI-IT-MS). Utilizou-se tubo capilar de sílica fundida a 280°C, voltagem de pulverização de 5,00 kV, voltagem do capilar de -35 V, voltagem da lente de -100 V e uma vazão de 5,0 μL min-1. As amostras foram analisadas no modo negativo com varredura completa registrada na faixa m/z de 100-2000. As fragmentações em múltiplos estágios (ESI-MSn) foram realizadas utilizando o método de dissociação induzida por colisão (CID) com hélio para ativação dos íons. O primeiro evento foi um espectro de massas de varredura completa para monitoramento da intensidade de todos os íons produzidos nessa faixa m/z. Os experimentos de fragmentação MSn para as substâncias de interesse foram realizados utilizando uma energia de colisão de 30% e um tempo de ativação de 30 ms. Os íons produto foram então submetidos a sucessivas fragmentações nas mesmas condições, até que não foram observados mais fragmentos. A análise por UPLC-ESI-IT-MS foi realizada num equipamento de cromatografia líquida de ultra eficiência Thermo Scientific®, consistindo num injetor automático (Accela AS), uma bomba quaternária (Accela 600) acoplada a um espectrômetro de massas LTQ XL descrito acima, operando nas mesmas condições. As separações cromatográficas foram realizadas numa coluna RP-C18 ACQUITY UPLC BEH C18 (2,1 x 50 mm de diâmetro, 1,7 mm à temperatura ambiente. As fases móveis consistiram no eluente A (0,1% de ácido fórmico em água, v/v) e no eluente B (0,1% de ácido fórmico em metanol, v/v). A O volume de injeção utilizado para cada amostra foi de 10 μL e a vazão de 0,350 mL min-1 com um programa de gradiente linear: 5-100% B de 0 a 8,0 min. Depois de manter 100% de B durante 5 min, a coluna foi recondicionada à condição inicial para as análises realizadas em sequência. Os espectros de massas foram adquiridos no modo negativo e processados no software Xcalibur (versão 2.0). Para a identificação e proposta das substâncias encontradas, foi utilizado uma biblioteca de metabólitos e uma base de dados de referência online (METLIN, KNApSAcK Core System e SciFinder®). Os experimentos de LC/MS no modo positivo foram realizados no laboratório do Prof. Dr. Norberto Peporine Lopes do Núcleo de Pesquisa em Produtos Naturais e Parte Experimental 40 Sintéticos e da Central de Espectrometria de Massas de Micromoléculas Orgânicas na USP de Riberão Preto e com a participação do Dr. Alan Pilon. Os espectros foram obtidos num espectrômetro de massas modelo Bruker Maxis Impact e configuração ESI-QqTOF- MS. A separação cromatográfica foi realizada numa coluna kinetex 2.6 um XB-C18 100 Angstroms (100 x 2.1 mm) a uma vazão de 0.4 mL min-1. A condição inicial: 5% de B (ACN + 0.1% ácido fórmico), temperatura de coluna: 40°C. Como condição de eluição usou-se 5% B a 35% B (23 min), 35% a 100% B (40 min), manteve-se em 100% B (48 min), 100% B a 5% B (50 min), manteve-se em 5% B até 60 min Solvente A: agua + 0.1% ácido fórmico. Os parâmetros do massas: End Plate: 500V Voltagem do capilar: 4500V Nebulizador: 4.5. Bar Dry gas: 9.0 L min-1 e temperatura: 200°C, Configurado em modo Auto-MS/MS. Os espectros de massas adquiridos no modo positivo foram processados no software DataAnalysis 4.1. Para a identificação e proposta das substâncias encontradas, foi utilizado uma biblioteca de metabólitos e uma base de dados de referência online (METLIN, KNApSAcK Core System e SciFinder®). 3.3 Metodologia 3.3.1 Etapa Botânica. As folhas de J. aethiopica Muell-Arg. foram obtidas de alguns espécimes adultos no município de Boyeros, em Havana - Cuba, de agosto a setembro de 2014. Os espécimes foram autenticados pelo Dr. Victor Fuentes-Fiallo, pesquisador titular da Estação Experimental de Plantas Medicinais "Dr. Juan T. Roig ", Cuba. Uma exsicata (INIFAT # 1165) foi depositada no Herbário do Instituto de Pesquisas Fundamentais em Agricultura Tropical (INIFAT), em Havana. 3.3.2 Preparação dos extratos a) Secagem O material botânico coletado e identificado foi seco em estufa em ar circulante a 40°C. Parte Experimental 41 b) Moagem O material botânico foi finamente dividido em moinho de facas com rotor vertical MAO 90 CF a fim de se facilitar a extração de seus constituintes químicos na etapa seguinte. 3.3.3 Etapa Química 3.3.3.1 Extração O pó obtido na moagem foi extraído com etanol por meio da percolação exaustiva. Uma quantidade do pó (800,0 g) foi intumescida em 1,5 L do solvente extrator (etanol) durante 2 horas. Em seguida, o percolador foi empacotado homogeneamente com a mistura pó e etanol e o efluente foram coletados na vazão de 1,0-2,0 mL min-1 Kg-1. Foi padronizado o procedimento operacional da percolação para a etapa de obtenção de extratos mantendo-se constante a razão droga vegetal: solvente extrator (1:5 m/v). Após a extração, o solvente extrator foi rotoevaporado sob pressão reduzida em evaporador rotativo em temperatura inferior a 40°C. O extrato etanólico (EE) foi transferido para vidro tarado e deixado em capela até completa eliminação do solvente. A massa de EE obtido foi 80,0 g (10%). 3.3.3.2 Extração líquido-líquido O extrato etanólico das folhas de J. aethiopica foi submetido a um processo de partição líquido-líquido com solventes de polaridade crescente. Para isso, foram solubilizados 40,0 g do EE das folhas em 150 mL de etanol e depois foi adicionado 1850 mL de água para uma relação final de 1:50 (m/v). Na sequência, a solução aquosa foi particionada como n-hexano, acetato de etila e n-butanol. Cada processo foi repetido por três vezes (600 mL x 3), a fim de esgotar os compostos solúveis nesses solventes. As frações obtidas foram concentradas em rotaevaporador rotativo sob pressão reduzida a 35°C, transferidas para vidros tarados e deixadas em capela até completa eliminação dos solventes. Parte Experimental 42 3.3.3. Etapa cromatográfica 3.3.3.1 otimização do perfil cromatográfico do extrato etanólico (EE) das folhas de J. aethiopica por CLAE-DAD O EE foi passado pelo cartucho de SPE (ver seção 3.1), posteriormente foi seco e redissolvido numa concentração de 5 mg mL-1 na mistura MeOH:H2O (9:1) para injeção no CLAE. As análises cromatográficas foram realizadas em cromatógrafo líquido de alta eficiência (CLAE) (descrito na seção 3.2) no modo analítico, onde foram usadas várias colunas segundo a Tabela 3 (Pagina 38). O volume de injeção foi de 10 µL, a vazão utilizada de 1 mL.min-1 e a temperatura do forno ajustada para 25°C. A composição da fase móvel utilizada foi: água (eluente A) e metanol ou acetonitrila (eluente B), acidificados com 0,1% de TFA em todos os casos, sendo que as otimizações cromatográficas decorreram de acordo com a resolução dos picos cromatográficos, sendo necessárias modificações na proporção da fase móvel e no tempo de análise. 3.3.3.2 Fracionamento em Sephadex LH-20 do extrato de acetato de etila das folhas de J. aethiopica A fração acetato de etila (3,0 g) foi solubilizada em metanol (10,0 mL), utilizando ultrassom por 10 minutos e centrifugado por 15 minutos. O sobrenadante foi filtrado em papel de filtro e passado por coluna de Sephadex LH-20 (85 x 2,5 cm, H x d.i.) com bomba peristáltica e coletor automático, utilizando metanol como eluente. As frações com aproximadamente 3 mL foram recolhidas em coletor automático Redifrac (Pharmacia). Foram obtidas 186 frações, as quais foram eluídas em clorofórmio:metanol:água, (65:25:15, v/v/v) e (43:37:20, v/v/v) e reveladas sob luz UV. Estas frações foram reunidas por CCD, de acordo com a coloração e o Rf, resultando em 18 frações. Da fração 17 (F17) foi isolada a substância 12 (6 mg). Parte Experimental 43 3.3.3.3 Separaçoes em CLMP Na sequência, submeteu-se o extrato etanólico (20 g) a CLMP equipado com coluna de modo reverso C18 (90 g), para se obter duas frações: uma fração de compostos nitrogenados (Frç-01 - FCN) e outra de fenólicos (Frç-02 - FF). Para evitar um prejudicial alargamento da banda extra-coluna, devido ao volume de injeção, foi preparada uma disfusão em fase sólida da amostra. Portanto, no fracionamento foram pesados cada vez 1,5 g do extrato etanólico das folhas de J. aethiopica para 4,5 g de areia de quartzo branco (50-70 mesh, SIGMA-ALDRICH). 3.3.3.4 Separações em CLAE-DAD semi-preparativo A fração F9 (190 mg), obtida do fraçõamento em sephadex LH – 20, foi submetida a um procedimento de purificação por CLAE- DAD (semi-preparativo, gradiente). A amostra foi solubilizada em 3,8 mL de fase móvel (MeOH/H2O, 9:1, v/v) e filtrada em membranas de PTFE (politetraflouroetileno, teflon®, Millipore®) com poro de 0,45 µm. A separação dos compostos foi realizada em uma coluna de modo reverso RP18 (Tabela 3, Pagina 38). O volume injetado foi de 400 µL, e a vazão de 13,0 mL min- 1. A fase móvel utilizada consistiu de água 67 % (eluente A) e metanol 33 % (eluente B) contendo 0,1 % de TFA. O método de eluição foi o gradiente com uma rampa de eluição de 25 min, variando a proporção de MeOH de 33 a 50 %. Este procedimento de separação forneceu cinco picos denominadas 3 (5 mg), 8 (59 mg), 9 (6 mg), 10 (6 mg) e 11 (4 mg). As substâncias foram identificadas segundo dados dos experimentos de RMN mono e bidimensionais e com coinjeção de padrões autênticos existentes em nosso laboratório. A fração dos compostos nitrogenados (Frç-01 FCN) (145 mg) obtida do fraçõamento por CLMP, foi sujeita a CLAE-DAD semi-preparativo utilizando a coluna 5 (Tabela 3, Pagina 37) no modo isocrático 10% de metanol (%B) em 10 min. No entanto, para fração fenólica (Frç-02 FF) (160 mg) foi utilizado um gradiente 5-13% em 10 min seguido de gradiente de 13-65% de metanol (%B) em 20 min. Deste procedimento foi possível obter as substâncias 1+2 (4,1 mg) a partir de FCN e 4+5 (2,9 mg) e 6+7 (2 mg) de FF, respectivamente. Parte Experimental 44 3.3.3.5 Etapa de quantificação no extrato etanólico e fração fenólica das substâncias isoladas A quantificação de alguns das substâncias isoladas de J. aethiopica foi realizada por CLAE-DAD utilizando um padrão de calibração externo (RIBANI et al., 2004; ROBARDS, 2003). Os flavonoides glicosilados identificados no extrato etanólico (EE) e na fração fenólica (FF) das folhas de J. aethiopica, assim como o ácido protocatecuico identificado no EE, foram quantificados. As curvas foram construídas utilizando padrões de ácido protocatecuico, quercetina e canferol (Sigma). Soluções estoque de 1000 μg mL-1 dos padrões foram preparadas realizada a diluição seriada de 250 - 3,90 μg mL-1 e 500 - 7,8 μg mL-1, respectivamente. Cada nível de concentração foi analisado em triplicata e as medições foram monitoradas a 254 nm. As áreas médias dos picos cromatográficos obtidos foram interpoladas em função da concentração utilizando regressão linear e foram utilizadas para gerar as curvas analíticas. O coeficiente de correlação (r2), coeficientes lineares (a) e angulares (b) foram obtidos a partir das curvas analíticas de cada padrão. O limite de detecção (LD) e o limite de quantificação (LQ) foram calculados utilizando as expressões I e II, respectivamente (MARCUCCI, 2011): LD = 3.3 s/S I LQ = 10 s/S II Onde s representa o desvio padrão da intersecção com o eixo Y e S representa o coeficiente angular da curva analítica. A precisão do método de CLAE-DAD foi estimada a partir dos testes de recuperação das substâncias isoladas, o ácido protocatecuico (AcP) e a rutina. Nesse caso, o extrato foi fortificado com três níveis de concentrações conhecidas (baixa, média e alta) dos compostos (3,15 e 62 μg mL-1 para AcP e 15, 62 e 250 μg mL-1 para a rutina). O valor médio de recuperação foi calculado utilizando a fórmula (III): % de recuperação = [(𝐶f / 𝐶nf + 𝐶pd)] × 100 III Onde 𝐶f corresponde a concentração fortificada, 𝐶nf corresponde à concentração não fortificada e 𝐶pd corresponde à concentração do padrão adicionado. O ensaio de repetitividade (precisão) foi realizado com as soluções estoques dos padrões (1000 µg.mL-1), os quais foram diluídos a três níveis de concentrações. As soluções Parte Experimental 45 utilizadas nos ensaios intra-dia e inter-dia foram preparadas individualmente para cada dia de injeção. 3.3.4 Etapa de avaliação da atividade biológica 3.3.4.1 Avaliação da atividade hipoglicemiante O extrato etanólico e as frações fenólicas e nitrogenadas, foram submetidas a testes farmacológicos em parceria com o Laboratório de Fisiologia do Pâncreas Endócrino da Faculdade de Ciências de Bauru/UNESP, coordenado pelo Prof. Dr. José Roberto Bosqueiro e com participação da Dra. Nathalia Aparecida de Paula Camaforte. 3.3.4.1.1 Animais Camundongos suíços machos (com 60 dias de idade, pesando 40,0 g) foram obtidos do Biotério Central em Botucatu (SP, Brasil) da Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho" (UNESP). Os animais foram mantidos sob condições ambientais padrão: 22 ± 2°C, 12/12h ciclo luz/escuridão. Eles foram mantidos com alimentos industrializados (Labina®, Purina, Brasil) e água ad libitum. O Comitê de Ética local (CEP- FC) aprovou os procedimentos, que seguiram todas as recomendações para o uso ético de animais declarado pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) (www.cobea. org.br). 3.3.4.1.2 Indução de diabetes experimental A indução do diabetes foi realizado utilizando uma única injeção de 150 mg/kg de peso corporal de estreptozotocina (STZ, Sigma-Aldrich®, St. Louis, MO, EUA) em camundongos em jejum durante 12-14 h. A STZ foi dissolvida em tampão citrato (pH 4,5) e injetada imediatamente por via intraperitoneal. Os animais foram mantidos em jejum Parte Experimental 46 durante 3 h após a indução e, nas próximas 24 h, receberam uma solução de glicose (10%) para prevenir a hipoglicemia. No sétimo dia após a injeção de STZ, os animais com glicemia de jejum superior a 250 mg dL-1 foram incluídos no estudo (VAREDA et al., 2014). 3.3.4.1.3 Tratamento com extrato etanólico de J. aethiopica e medição de glicemia Os animais foram divididos aleatoriamente em cinco grupos (n = 8/grupo): CTLSAL - camundongos não diabéticos tratados com solução salina; CTLEXT – camundongos não diabéticos tratados com extrato de J. aethiopica a 500 mg kg-1 b.w.; STZSAL - ratos diabéticos tratados com solução salina; STZMET - camundongos diabéticos tratados com metformina a 300 mg kg-1 b.w.; STZEXT - camundongos diabéticos tratados com o extrato de J. aethiopica a 500 mg kg-1 de peso corporal. Tanto a solução salina quanto o extrato e a metformina, foram administrados por via oral por sonda uma vez por dia durante 14 dias consecutivos. A glicemia de jejum foi medida semanalmente usando um glucômetro (One touch, Johnson & Johnson). 3.3.4.1.4 Teste de tolerância oral à glicose (oGTT) após o tratamento com J. aethiopica Para o teste, todos os grupos foram submetidos a jejum durante 8-10h e receberam o respectivo tratamento por gavagem 30 min antes da medição da glicemia no tempo zero. Depois disso, os animais receberam uma carga oral de D-glicose (2,0 g kg-1 por peso) e, em seguida, mediu-se a glicemia em 15, 30, 60, 90 e 120 minutos após a administração da glicose. As amostras de sangue foram obtidas a partir da ponta da cauda sob anestesia (Tiopental® 60 mg kg-1 b.w.) e os níveis de glicose foram medidos usando o kit enzimático (Dolles®, Goiás, Brasil). O desvio na concentração de glicose no sangue a partir do valor basal foi analisado e representado como glândula sanguínea delta. Parte Experimental 47 3.3.4.1.5 Teste de tolerância oral à glicose (oGTT) para a determinação da dose das frações nitrogenadas e fenólicas Os animais foram divididos em oito grupos (n = 10/grupo): CTLSAL: camundongos não diabéticos tratados com solução salina; STZSAL: camundongos diabéticos tratados com solução salina; FCN50: camundongos diabéticos tratados com 50 mg kg-1 de fração de compostos nitrogenados; FCN100: camundongos diabéticos tratados com 100 mg kg-1 de fração de compostos nitrogenados; FCN200: camundongos diabéticos tratados com 200 mg kg-1 de fração de compostos nitrogenados; FF50: camundongos diabéticos tratados com 50 mg kg-1 de fração de compostos fenólicos; Camundongos diabéticos FF100 tratados com 100 mg kg-1 de fração de compostos fenólicos e FF200: camundongos diabéticos tratados com 200 mg kg-1 de fração de compostos fenólicos. Todos os grupos estavam em jejum durante 8-10h, receberam o respectivo tratamento por gavagem 30 minutos antes da medição da glicemia no tempo zero. Depois disso, os animais receberam uma carga oral de D-glicose (2,0 g kg-1 por peso) e, em seguida, mediu-se a glicemia em 30, 60 e 90 min após a administração de glicose. As amostras de sangue foram obtidas a partir da ponta da cauda, sob anestesia (Tiopental® 60 mg kg-1 b.w.), e os níveis de glicose foram medidos usando o kit enzimático (Dolles®, Goiás, Brasil). O desvio na concentração de glicose no sangue a partir do valor basal foi analisado e representado como glândula sanguínea delta. 3.3.4.1.6 Tratamento com frações dos compostos nitrogenados e fenólicos; medição da glicemia Os animais foram divididos aleatoriamente em cinco grupos (n = 8 /grupo): CTLSAL - camundongos não diabéticos tratados com solução salina; STZSAL - camundongos diabéticos tratados com solução salina; STZMET - camundongos diabéticos tratados com metformina a 300 mg kg-1 b.w.; FCN50 - camundongos diabéticos tratados com a fração de compostos nitrogenados a uma dose de 50 mg kg-1 b.w; FF200 - camundongos diabéticos tratados com a fração de compostos fenólicos a uma dose de 200 mg kg-1 b.w. A solução salina, as frações e a metformina foram administradas por via oral por sonda uma vez ao dia durante sete dias consecutivos. A glicemia de jejum foi medida semanalmente usando um glucômetro (One touch, Johnson & Johnson). Parte Experimental 48 3.3.4.1.7 Teste de tolerância oral à glicise (oGTT) após o tratamento com as frações Todos os grupos estavam em jejum durante 8-10h e receberam o respectivo tratamento por gavagem 30 minutos antes da medição da glicemia no momento zero. Depois disso, os animais receberam uma carga oral de D-glicose (2,0 g kg-1 de peso corporal) e, em seguida, a glicemia foi medida aos 15, 30, 60 e 90 min após a administração de glicose. As amostras de sangue foram obtidas a partir da ponta da cauda sob anestesia (Tiopental® 60 mg kg-1 b.w.) e os níveis de glicose foram medidos usando o kit enzimático (Dolles®, Goiás, Brasil). O desvio na concentração de glicose no sangue a partir do valor basal foi analisado e representado como glândula sanguínea delta. 3.3.4.1.8 Parâmetro bioquímicos No final do tratamento com o extrato etanólico, as frações de compostos nitrogenados ou fenólicos, os animais estavam em jejum durante 8-10 h e as amostras de sangue foram coletadas e centrifugadas a 1500 rpm durante 10 min para obter soro e armazenadas a -80°C. A ureia, proteínas totais, colesterol total (TC), HDL-colesterol e triglicerídeos (TG) foram medidos por espectrofotometria usando o equipamento A15 da Bioclin® usando kits Biosystems. O colesterol VLDL foi medido de acordo com a fórmula: VLDL = TG / 5. Todos os testes foram realizados em duplicata. 3.3.4.1.9 Análise estatística Os resultados foram expressos como médias ± desvio padrão (DP). A análise estatística foi realizada usando o software Instat 3®. Para comparações múltiplas, a ANOVA foi utilizada, seguida do teste de Tukey e para comparação entre dois grupos, o teste t de Student foi utilizado. O nível de significância adotado foi p <0,05. Parte Experimental 49 3.3.4.2 Avaliação da atividade citotóxica pela técnica de MTT (Brometo de 3-((4,5- dimetiltiazol)-2, il)-2,5-difeniltetrazólio) A avaliação da atividade citotóxica foi realizada no Departamento de Análises Clínicas da FCFAr - Unesp Araraquara sob a supervisão da Profa. Dra. Iracilda Z. Carlos. O ensaio de viabilidade celular seguiu a metodologia descrita por MOSMANN (1983). 3.3.4.2.1 Ajuste das concentrações das suspensões das células tumorais A linhagem tumoral adenocarcinoma de pulmão murino (LP07) e adenocarcinoma de mama humano (MCF-7), foram cedida pelo Instituto de Oncologia Angel H. Roffo – Buenos Aires – Argentina e pelo Banco de Células de Rio de Janeiro – Rio de Janeiro. As células LP07 e MCF-7 foram cultivadas em meio RPMI-1640-C, suplementado com 10 % de soro fetal bovino, 2 mM L-glutamina e 80 µg.mL-1 de antibiótico em frascos plásticos (Corning) em estufa a 37°C, com atmosfera úmida e tensão constante de 5 % de CO2. Foram realizados repiques três vezes por semana. O número de células foi determinado pela contagem em câmara hemocitométrica tipo Neubauer (Boeco) e ajustado a uma concentração de 5 x 104 células.mL-1. 3.3.4.2.2 Ajuste das amostras avaliadas A solução-mãe do extrato avaliado foi preparada em concentração máxima de DMSO de 5 % v/v, conforme os métodos convencionais. A solução foi diluídaa em MEM (Minimum Essential Medium) por diluição sucessiva nas concentrações de 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.2, 15.7 e 7.8 µg.mL-1. 3.3.4.2.3 Ensaio de viabilidade celular de células tumorais LP07 e MCF-7 A determinação da citotoxicidade do extrato sobre as células tumorais foi quantificada pelo método baseado na capacidade das células viáveis de reduzirem o MTT pela ação de enzimas desidrogenasses presentes na mitocôndria ativa formando cristais Parte Experimental 50 de formazana (MOSMANN, 1983). As amostras (200 µL) de LP07 e MCF-7 (5 x 104 células.mL-1) foram adicionadas em placas de 96 poços e então pré-incubadas na ausência do extrato investigado por 24 h para que as células se adaptem antes da adição dos agentes de teste. Após 24 h de incubação, formado o tapete celular, os sobrenadantes foram removidos e os extratos foram adicionados (200 µL; 1000 – 7,8 μg.mL-1). O efeito do extrato sobre as células foi determinado após 24 h de incubação. Os sobrenadantes foram removidos, e a solução de MTT (100 μL; 1 mg.mL-1) foi adicionada a cada poço contendo as amostras. O ensaio de MTT foi realizado e as placas foram incubadas durante 3 horas, o conteúdo da placa foi novamente vertido e 100 µL de álcool isopropílico foram adicionados a cada orifício para solubilizar os cristais formados. Somente células e meio de cultura foram utilizados como controle, equivalendo a 100 % de viabilidade celular. A leitura da absorbância foi realizada no Fotocolorímetro multicanal UV-Vis Multiscan Ascent (Labsystems), em comprimento de onda de 540 nm e filtro de referência 620 nm. Os valores correspondentes à concentração que reduz em 50 % a viabilidade celular (CIM) dos extratos foram quantificados através de curvas dose-resposta Concentração da Amostra x Viabilidade Celular utilizando o software Origin® 8.0. O experimento foi realizado em triplicata. 3.3.4.3 Avaliação da atividade citotóxica frente a células normais pela técnica de XTT (Hidrato de benzenilsulfito 3’-[1-[(fenilamino]-carbonil-3,4-tetrazólio]-bis-(4-metoxi-6-nitro) de sódio) A avaliação da atividade citotóxica frente a células normais foi realizada no Laboratório de Mutagênese na Universidade de Franca sob a supervisão da Profa. Dra. Denise Crispim Tabares e participação da pós-graduanda Fernanda Diniz de Sousa. O ensaio de viabilidade celular seguiu a metodologia descrita por BERRIDGE; HERST; TAN, (2005). Parte Experimental 51 3.3.4.3.1 Ajuste das concentrações das suspensões das células normais A avaliação atividade citotóxica foi utilizando o ensaio colorimétrico do XTT (ROEHM et al., 1991) -Kit XTT (Roche Diagnostics). A linhagem normal de fibroblasto de pulmão humano (GM07492A), foi gentilmente cedida pelo Laboratório de Mutagênese da Universidade de São Paulo do Campus de Ribeirão Preto, São Paulo. As células encontram-se estocadas em nitrogênio líquido (–195°C), em alíquotas de 1 x 106 células mL-1 em uma solução de congelamento composta de 50% de meio de cultura (HAM F10 + DMEM, na proporção 1:1, Sigma-Aldrich, 40% de soro bovino fetal (Nutricell) e 10% de DMSO (Sigma-Aldrich). Para realização dos experimentos as células foram descongeladas e colocadas em cultivo em meio de cultura HAM F10 + DMEM, na proporção 1:1. O meio de cultura foi suplementado com 10% de soro bovino fetal, 1,2 g L- 1 de bicarbonato de sódio (Sigma-Aldrich), 0,1 g L-1 de estreptomicina (Sigma-Aldrich) e 0,06 g L-1 penicilina (Sigma-Aldrich). As células foram cultivadas em monocamada com 10 mL de meio de cultura utilizando frascos descartáveis de 25cm² (Corning) a 36,5°C em estufa de CO2 (Sanyo) em atmosfera de 5% de gás carbônico (CO2). A cada dois ou três dias, as células foram sub cultivadas, usando PBS para lavá-las e tripsina (solução 10x, Sigma-Aldrich) na proporção 1 tripsina: 9 PBS, para desprender as células da superfície interna do frasco de cultura. Após o desprendimento das células 1,5 mL de meio de cultura completo (suplementado com 10% de soro bovino fetal) foi adicionado ao frasco para inativação da tripsina e homogeneizado. Em seguida, 200 µL de células foram colocados em cultivo em novos frascos contendo 10 mL de meio de cultura completo e incubado a 36,5°C. Para a realização dos ensaios, a linhagem celular escolhida (GM07492A) foi utilizada a partir da quarta passagem até a décima quarta passagem. 3.3.4.3.2 Ensaio de viabilidade celular com as células normais GM07492A A atividade citotóxica na linhagem celular foi avaliada após 24 horas de tratamento. A metodologia utilizada foi de acordo com orientações do fabricante com algumas modificações. O extrato etanólico (EE) das folhas de J. aethiopica foi diretamente diluído em meio de cultura (HAM F10 + DMEM 1:1) suplemento com 10% de soro bovino fetal nas diferentes concentrações que variam de 2500 a 19,50 μg mL-1. Parte Experimental 52 Para realizar os experimentos, 1x10³ células foram semeadas em microplacas de 96 poços. Em cada poço, o volume máximo foi de 100 μL de meio de cultura (HAM F10 + DMEM 1:1) suplementado com 10% de soro bovino fetal. Após 24 h, as culturas foram tratadas com as diferentes concentrações do EE acima descrito. Os grupos controles negativos (sem tratamento), solvente (DMSO 0,4%) e positivo (DMSO 25%), foram incluídos nos poços. Na sequência, as placas foram incubadas a 36,5°C por 24 horas. Depois desse período de tratamento, o meio de cultura foi removido e as células foram lavadas com 100 μL de PBS para retirar o tratamento evitando possíveis alterações no resultado e expostas a 100 μL de meio cultura HAM-F10 sem vermelho de fenol. Então, 25 μL de XTT foram adicionados em cada poço e as microplacas incubadas a 36,5°C por 17h. A absorbância das amostras foi determinada através de um leitor de multiplacas (Elisa –Asysm programa Microwin 2.000) no comprimento de onda de 450 nm e comprimento de referência de 620 nm. A quantidade de produto solúvel formado (formazan) foi proporcional ao número de células viáveis. Os experimentos foram realizados em triplicata e os resultados de IC50 (concentração que inibe 50% de crescimento) obtidos para as células normais ou sadias, GM07492A. Os resultados obtidos foram analisados estatisticamente por análise de variância (ANOVA) e foi utilizado o método Tukey para a comparação dos diferentes tratamentos. As diferenças estatisticamente significativas foram consideradas quando P < 0,05. Todas as análises foram realizadas no GraphPad Prisma, V. 5.00. Resultados e Discussões 53 4. RESULTADOS E DISCUSSÕES O fracionamento do extrato etanólico (EE) das folhas de Jatropha aethiopica, assim como um resumo das etapas de trabalho desenvolvidas, são apresentadas na Figura 4. Figura 4 – Fluxograma de preparo e fracionamento do EE das folhas de J. aethiopica. Resultados e Discussões 54 O fluxograma da Figura 4 apresenta as etapas desenvolvidas durante a pesquisa. A partir do material vegetal seco e moído, foi obtido o extrato etanólico (EE) por percolação (80,0 g). Na sequência, o extrato foi dividido em cinco partes para realizar os estudos químicos (70,0 g) e biológicos (10,0 g). A partir do extrato etanólico obtiveram-se as frações de compostos nitrogenados (FCN) e de compostos fenólicos (FF) mediante CLMP tanto para isolamento de substâncias quanto para testes biológicos. Os perfis cromatográficos por CLAE-DAD e LC-MS, foram otimizados variando os diferentes parâmetros até atingir uma boa resolução. O isolamento das substâncias (3,8,9,10,11 e 12) foi realizado a partir da fração acetato de etila obtida da partição líquido-líquido do EE com solventes de diferente polaridade e das frações FCN e FF. Esta etapa possibilitou a caracterização de 6 substâncias em mistura (1+2 e 4+5, 6+7, res