RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta dissertação será disponibilizado somente a partir de 28/02/2022. Araraquara 2020 Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho” Faculdade de Odontologia de Araraquara Programa de Pós-Graduação em Odontologia Gabriel Garcia de Carvalho Terapia Fotodinâmica Antimicrobiana com Utilização da Clorina-e6 sobre Biofilme Periodontopatogênico Araraquara 2020 Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho” Faculdade de Odontologia de Araraquara Programa de Pós-Graduação em Odontologia Gabriel Garcia de Carvalho Terapia Fotodinâmica Antimicrobiana com Utilização da Clorina-e6 sobre Biofilme Periodontopatogênico Orientadora: Profa. Dra. Daniela Leal Zandim-Barcelos Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Odontologia, Área Periodontia, da Faculdade de Odontologia de Araraquara, da Universidade Estadual Paulista “Júlio Mesquita Filho”, para obtenção do título de Mestre em Odontologia. Carvalho, Gabriel Garcia de Terapia fotodinâmica antimicrobiana com utilização da Clorina-e6 sobre biofilme periodontopatogênico / Gabriel Garcia de Carvalho.-- Araraquara: [s.n.], 2020 45 f.; 30 cm. Te Dissertação (Mestrado em Odontologia) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Odontologia Orientadora: Profa. Dra. Daniela Leal Zandim-Barcelos Coorientadora: Profa. Dra. Denise Madalena Palomari Spolidorio 1. Fotoquimioterapia 2. Doenças periodontais 3. Periodontite I. Título Ficha catalográfica elaborada pela Bibliotecária Marley C. Chiusoli Montagnoli, CRB/5646 Universidade Estadual Paulista (Unesp), Faculdade de Odontologia, Araraquara Diretoria Técnica de Biblioteca e Documentação Gabriel Garcia de Carvalho Terapia Fotodinâmica Antimicrobiana com Utilização da Clorina-e6 sobre Biofilme Periodontopatogênico Dissertação para obtenção do grau de Mestre em Odontologia Comissão Examinadora Profa. Dra. Daniela Leal Zandim-Barcelos (Orientadora) Departamento de Diagnóstico e Cirurgia / Faculdade de Odontologia de Araraquara - UNESP Profa. Dra. Carla Raquel Fontana Mendonça Departamento de Análises Clínicas / Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara - UNESP Prof. Dra. Juliana Rico Pires Centro Universitária da Fundação Educacional de Barretos Araraquara, 02 de março de 2020 DADOS CURRICULARES Gabriel Garcia de Carvalho NASCIMENTO 15 de Abril de 1992 – João Pessoa – PB – Brasil FILIAÇÃO Adriana Coeli Garcia de Carvalho Arlan Giovanni Duarte Carvalho 2010 – 2017 Graduação em Odontologia Universidade Federal da Paraíba 2017 Atualização em Cirurgia Oral Associação Brasileira de Odontologia – Secção Paraíba 2018 – Atual Curso de Pós-Graduação em Odontologia, Área de Concentração em Periodontia – Nível Mestrado Faculdade de Odontologia de Araraquara À Telma Ribeiro Garcia (tia – In memoriam), pelo suporte incondicional desde meu nascimento por ser exemplo de ética e profissionalismo por me guiar e ser meu maior desígnio. Agradecimentos Aos meus pais e irmão, por sonharem comigo este caminho, por todo o apoio e incentivo. Os frutos colhidos serão sempre originados dos princípios que eles forneceram em meu crescimento. A minhas avós, por constituírem a base de minha família, por iluminar o meu caminho com carinho e cuidado. À Paula, por todo o companheirismo e paciência, pelos desafios superados ao meu lado, por me estimular nas horas difíceis e brindar minhas conquistas. À professora, Daniela, a Dani!, por compreender minhas dificuldades e extrair o máximo de minha capacidade. Sou grato pela confiança depositada em mim para conduzir este estudo, pelo seu acolhimento e orientação, e pela preciosa contribuição em minha formação pessoal e profissional. À professora Denise Spolidorio, por me recepcionar com empatia em seu laboratório e me fazer sentir parte de seu honrado grupo de pesquisa. Sua contribuição é amplamente reconhecida nesta pesquisa. Aos professores Kleber Oliveira e Alessandra Rasteli, pela orientação na área (fotônica) até então pouco conhecida por mim, e pela disponibilidade de material e equipamento para realização deste estudo. À Patrícia Maquera, a Patty, pela paciência e disposição em transmitir seu conhecimento e acompanhar os ensaios laboratoriais com rigor. Ao amigo Julio Puetate, pela sua imensa contribuição e parceria para o desenvolvimento deste estudo, mas ainda, por sua amizade e companheirismo, em especial, nos momentos mais difíceis. Aos companheiros de mestrado, pela parceria e colaboração durante todo o período do curso. A todos os funcionários da FOAr, que trabalham diariamente para tornar minúscula as nossas imensas dificuldades. À FOAr – UNESP, pelo apoio institucional. À CAPES O presente trabalho foi realizado com o apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Código de financiamento 001 (Processo: 88882.329991/2019-01). À FAPESP FAPESP – Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (Processo No 2016/00275-8, 2018/0836-2, 2018/00106-7 e 2013/07276-1) pelo apoio financeiro essencial para realização dessa pesquisa. Meu Nordeste Nasci na terra seca, dura e sofrida Onde não se chora a dor deixada pela ferida Vi o sol queimar o verde e a flor Deixando o cinza, como principal cor Pedi a Deus todos os dias Pra água cair do céu e me dar alegria Sofri com a fome e a dor Mas sigo, singelo, com fé e amor A cicatriz na pele é fruto do trabalho De onde tirei o sustento Dia e noite, sem nenhum atrapalho Minha terra amada, de beleza pura e clara Cheia de glória e lamento Lugar do meu nascimento Minha joia rara* * Diogo Carneiro, Meu Nordeste. Riacho dos Cavalos – PB, Dia do Nordestino, 08 de outubro de 2019. Carvalho GG. Terapia fotodinâmica antimicrobiana com utilização da clorina-e6 sobre biofilme periodontopatogênico [dissertação de mestrado]. Araraquara: Faculdade de Odontologia da UNESP; 2020. RESUMO A resistência bacteriana é uma ameaça real alertada pela OMS. A terapia fotodinâmica antimicrobiana (TFDA) pode ser uma das soluções para superar este desafio, uma vez que já demonstra ação antimicrobiana frente a inúmeros patógenos. A clorina-e6 (Ce6) provou ser um fotossensibilizador (FS) com potente efeito quando irradiada pela luz vermelha, contra diferentes biofilmes. No entanto, o principal pico de absorção deste FS está no espectro visível de luz azul, ainda insuficientemente investigado. Este estudo teve como objetivo avaliar o efeito da TFDA com utilização da Ce6 irradiada a 450 e 660 nm contra biofilmes relacionados à doença periodontal. Biofilmes monoespécie de Streptococcus oralis, Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas gingivalis e Aggregatibacter actinomycetemcomitans foram desenvolvidos em condições adequadas por cinco dias. A TFDA foi realizada em diferentes concentrações de fotossensibilizador (100 e 200 µM) e comprimentos de onda de luz (450 e 660 nm), e comparada ao controle negativo (DMSO a 1%) e positivo (clorexidina a 0,2%) por análise de unidades formadoras de colônias (UFC) e microscopia confocal. O uso de luz e FS também foram testados individualmente. A maior redução bacteriana foi observada no grupo em que a TFDA foi realizada com utilização da Ce6 a 200 µM e aplicação de luz azul para todas as cepas (redução de 4,01 log10 para A. actinomycetemcomitans e redução total para P. gingivalis e S. oralis), exceto para F. nucleatum, onde o melhor resultado foi obtido com a TFDA utilizando irradiação por luz vermelha (redução de 3,36 log10) (p <0,05). O efeito antimicrobiano da TFDA usando Ce6 contra os biofilmes monoespécie testado foi confirmado por meio de microscopia confocal. FS na ausência de luz reduziu significativamente o número de células viáveis quando comparado ao grupo não tratado, em todos os biofilmes testados, exceto para F. nucleatum. A correlação entre redução bacteriana e concentração do FS foi observada apenas em biofilmes de algumas cepas testadas. O uso de TFDA mediado por Ce6 promoveu redução significativa de células bacterianas viáveis, com redução mais evidente nos grupos tratados com luz azul para S. oralis, P. gingivalis e A. actinomycetemcomitans. Palavras-chave: Fotoquimioterapia. Fármacos fotossensibilizadores. Periodontite. Carvalho GG. Chlorin-e6-mediated antimicrobial photodynamic therapy against periodontitis- related pathogens [dissertação de mestrado]. Araraquara: Faculdade de Odontologia da UNESP; 2020. ABSTRACT Antimicrobial photodynamic therapy (aPDT) has been used in the treatment of many infection diseases as main or adjuvant therapy. Chlorin-e6 (Ce6), as a photosensitizer (PS), has demonstrated significant reduction of microorganisms’ viability when irradiated by red light. However, the main absorption peak of this PS is located at blue light visible spectrum, which has been poorly investigated. This study aimed at evaluating the effect of pure-chlorin-e6-mediated aPDT and different light sources (450 or 660 nm) against biofilms related to periodontitis. Streptococcus oralis, Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas gingivalis, and Aggregatibacter actinomycetemcomitans single-species biofilms were developed under proper conditions for five days. aPDT was performed using different concentrations of Ce6 (100 and 200 µM), wavelengths (450 and 660 nm) and compared to negative and positive (0.2% Chlorhexidine) control after colony forming unit and confocal laser scanning microscopy (CLSM) analysis. The use of light and PS were also individually tested. The greatest bacterial elimination was observed in the group where aPDT was employed with blue light and concentration of 200 µM for all bacterial strains tested (reduction of 4.01 log10 for A. actinomycetemcomitans, and total elimination for P. gingivalis and S. oralis), except for F. nucleatum, where the lowest mean value was observed in the group that received aPDT with red light and 200 µM Ce6 (3.36 log10 reduction) (p<0.05). The antimicrobial effects of aPDT mediated by Ce6 for all single pathogenic biofilms were confirmed by live/dead staining under CLSM analysis. For all single-species biofilms, the use of aPDT mediated by chlorin-e6 photosensitizer under blue or red-light irradiation (450 and 660 nm) promoted a significant reduction in bacterial viability, especially in the groups treated with blue light for S. oralis, P. gingivalis, and A. actinomycetemcomitans. Keywords: Photodynamic Therapy. Photochemotherapy. Photosensitizing Agents. Periodontitis. SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO .......................................................................................... 10 2 PROPOSIÇÃO ............................................................................................. 15 3 PUBLICAÇÃO ............................................................................................ 16 4 CONCLUSÃO ............................................................................................. 34 REFERÊNCIAS ............................................................................................. 35 APÊNDICE - METODOLOGIA .................................................................. 40 ANEXO - CERTIFICADO DO COMITÊ DE ÉTICA ..................................... 45 1 INTRODUÇÃO A doença periodontal afeta grande parte da população mundial, encontrando-se no grupo das patologias bucais mais recorrentes, sendo uma das principais causas da perda dentária. Essa doença tem sua origem relacionada a fatores microbiológicos, e de maneira geral são divididas em gengivite e periodontite, dependendo do tecido comprometido pela inflamação. Trata-se de uma doença infecciosa dependente da interação de bactérias com seu hospedeiro, estas apresentam fatores de virulência que modificam a resposta imunoinflamatória do hospedeiro, especialmente quando organizadas em forma de biofilme e localizadas no sulco gengival1,2. A remoção e alteração da microbiota patogênica do biofilme é imprescindível para a prevenção e controle da doença periodontal, sendo a Raspagem e o Alisamento Radicular (RAR) a terapia não-cirúrgica de escolha para tratamento da doença e manutenção da homeostasia periodontal. Apesar dos resultados clínicos positivos obtidos com RAR3-6, esta terapia pode apresentar limitações e insucessos quando abordada isoladamente em determinados quadros clínicos. Assim, terapias alternativas têm sido investigadas em virtude do limitado acesso à superfície radicular durante RAR7-9, da presença de periodontopatógenos nas bolsas mais profundas10 e da habilidade de algumas bactérias em invadir tecido adjacente11. Quando consideramos o tratamento de doença periodontal instalada, o uso de antibióticos locais ou sistêmicos é apresentado como alternativa, mas seu uso como coadjuvante pode induzir efeitos sistêmicos indesejáveis e formação de espécies bacterianas resistentes à terapia medicamentosa12- 14. Além disso, a eficácia da terapia com uso de antibióticos sistêmicos depende da colaboração do paciente em seguir corretamente o protocolo medicamentoso indicado. Compreendendo o crescimento da resistência das cepas bacterianas pelo uso indiscriminado de antibióticos e o interesse de pesquisadores em buscar estratégias terapêuticas que apresentem pouco ou nenhum efeito colateral, nota-se o crescimento exponencial da utilização dos lasers e de outras fontes de luz no tratamento de diversas patologias, bem como as periodontais15,16. Neste contexto, a terapia fotodinâmica antimicrobiana (TFDA) tem se destacado como um procedimento adjunto no combate de infecções microbianas. Diversos estudos comprovam a eficácia da TFDA, tanto in vitro como in vivo, em animais e humanos, no tratamento das doenças periodontais17-28. A TFDA consiste na excitação do fotossensibilizador (FS, em seu estado fundamental) por uma luz no espectro visível (laser de diodo semicondutores de baixa potência), com a energia absorvida, esta molécula pode sofrer transição ao estado singleto ou tripleto excitado, que poderá desencadear três reações. Na reação de tipo I, ocorre a transferência de elétron entre o FS e oxigênio molecular, permitindo o seu retorno ao estado fundamental e a formação de espécies reativas de oxigênio. Na reação tipo II, o FS transfere sua energia de excitação para o oxigênio molecular no estado fundamental, resultando na produção do oxigênio singleto, um poderoso agente oxidante altamente tóxico para as células29. Acredita-se que os processos do Tipo II preservem melhor a estrutura molecular do FS em um estado fotoativável e, em algumas circunstâncias, uma única molécula de FS pode gerar 10 000 moléculas de oxigênio singleto. Uma terceira via (Tipo III), pouco comum, ocorre na ausência de oxigênio, quando a molécula do FS interage diretamente com uma biomolécula, provocando um dano celular (efeito citotóxico) e consequente destruição do FS29-31. A TFDA não induz a inviabilidade celular de áreas distantes à área tratada, pois seus produtos citotóxicos (ex. oxigênio singleto e hidroxilas) não migram mais que 0,02 mm após sua formação32. Dentre as vantagens do emprego desta nova terapia, encontram-se: a diminuição da potência e intensidade da fonte de luz utilizada, viabilizando financeiramente o seu uso e reduzindo o risco de danos aos tecidos e microbiota adjacentes; a morte bacteriana rápida e localizada, evitando a manutenção de altas concentrações de fármacos por longo período (antibióticos e antissépticos); o fato do efeito bactericida não estar ligado à mediação de radicais químicos, reduzindo o risco à resistência bacteriana; o acesso facilitado a regiões de difícil acesso pela terapia convencional (RAR), como bolsas profundas e bi- ou trifurcação de raízes33. A TFDA tem sido indicada como terapia coadjuvante no tratamento da periodontite, retratamento de bolsas residuais, descontaminação para terapia cirúrgica, terapia de manutenção, dentre outros34-36. Sua indicação na terapia de manutenção tem como vantagem o menor desgaste da superfície radicular, que seria um aspecto negativo da utilização da técnica convencional (RAR). Neste caso a PDT seria utilizada isoladamente, reduzindo a incidência de hipersensibilidade causada pela remoção de cemento nas múltiplas sessões de RAR37. Um fotossensibilizador ideal deve ser atóxico, demonstrar toxicidade local apenas após excitação por luz e ter alto rendimento quântico para produção de espécies reativas de oxigênio (ROS)12,38. Diversos fotossensibilizadores estão descritos na literatura, sendo as fenotiazinas azul de metileno e azul de toluidina os mais referidos21,39-44, porém alguns estudos não têm demonstrado benefícios clínicos adicionais no tratamento periodontal21,40,45,46. Desta forma, novos fotossensibilizadores estão surgindo na estratégia de superar as deficiências destes citados anteriormente. A clorina-e6 (Ce6) surgiu em meados dos anos 90 como um FS de segunda geração bastante promissor inicialmente em terapias oncológicas47. A Ce6 e seus derivados estão sendo utilizados em diversos tratamentos com utilização de luz, como cânceres48,49, leucoplasias50, infecções endodônticas51, e contra cepas de Streptococcus mutans52. Algumas formulações a base de clorina- e6 estão disponíveis no mercado para tratamento antibacteriano, antienvelhecimento e antineoplásico, como Revixan®, Photolon® e Photodithazine®. Este FS também demonstrou atividade antimicrobiana, in vitro, quando utilizado sobre bactérias presentes na doença periodontal na forma planctônica, apresentando redução das unidades formadoras de colônia53-55. Os estudos citados não testaram a utilização desse FS contra microrganismos organizados na forma de biofilme. Os biofilmes são estruturas biológicas constituídas por microrganismos envoltos por uma matriz extracelular de polissacarídeos, que assegura a sobrevivência dos mesmos56,57, agindo como uma barreira protetora a agentes físicos e químicos externos, o que pode limitar a penetração de agentes antimicrobianos58. Particularmente na cavidade oral, o biofilme é responsável pelo desenvolvimento de diversas patologias, incluindo a doença periodontal. Também não foram encontrados na literatura estudos clínicos avaliando a eficácia do uso deste FS diretamente no tratamento da doença periodontal. Fotossensibilizadores a base de clorina-e6 apresentam dois picos de absorção de luz, na luz vermelha e azul (Gráfico 1). Tradicionalmente, a luz vermelha é preferida por se acreditar em sua maior capacidade de penetração nos tecidos. Porém, comprimentos de onda em torno de 412 nm (azul) apresentaram 30-33% maior coeficiente de absorção de energia e efeito bactericida que comprimentos de onda equivalentes a luz visível vermelha59. Estes resultados demonstram que fotossensibilizadores excitados em comprimentos de onda na luz visível azul podem ser preferidos em terapias que visem tratar superfícies, como é o caso dos protocolos antimicrobianos sobre biofilmes.60 Um estudo recente avaliou a ativação deste FS nos dois comprimentos de onda, 405 nm (luz azul) e 660 nm (luz vermelha). Para a pele, os valores de saturação foram de aproximadamente 0,2 J/mm2 para ambos os comprimentos de onda, indicando que cerca de 40% do incidente da energia é absorvida dentro do tecido. No entanto, para a mucosa, o valor de saturação para comprimento de onda de 405 nm foi de 0,28 J/mm2 (56% da intensidade do incidente é absorvida); e para o de 660 nm, a energia absorvida foi muito menor, aproximando-se de 0,03 J/mm2 (6% da intensidade do incidente) para a espessura da camada de 4 mm. Por este motivo a luz azul tem atraído a atenção de pesquisadores e indústrias que sugerem a utilização da luz azul em tratamentos dermatológicos. Em um estudo de optimização de solventes utilizados na diluição de fotossensibilizadores, foi possível observar maior espectro de absorção quando a Ce6 foi diluída em solventes polares e excitada sobre comprimentos de onda de luz azul61. É importante levantar que a luz azul está comumente presente na prática odontológica, onde é utilizada na polimerização de materiais restauradores ou fotoativação de adesivos e clareadores, portanto, estes equipamentos já disponíveis no consultório podem ser empregados na terapia fotodinâmica quando fotossensibilizadores ativados na luz azul são escolhidos, reduzindo eventuais custos relativos à equipamentos necessários para realização da TFDA. Gráfico 1- Espectro de absorção da clorina-e6 Fonte: Elaboração própria. De maneira geral, poucos estudos avaliaram o efeito antimicrobiano da TFDA com utilização da Ce6 como fotossensibilizador contra patógenos orais53-58,62. Um estudo desenvolvido recentemente avaliou a efetividade de um fotossensibilizador a base de clorina-e6 (Photodithazine®) contra biofilme monoespécie de microrganismos periodontopatogênicos, onde a TFDA com uso da clorina-e6 apresentou redução significante da viabilidade microbiana (1,12 e 2,66 log10)63. O Photodithazine® é um fotossensibilizador composto por Ce6 (~60%) e outros derivados do extrato bruto da clorofila. No presente estudo, foi testado o extrato puro da Ce6 (100%), composto ainda não patenteado, desenvolvido pelo Laboratório de Química Bio-orgânica, UFSCar – São Carlos. Não há registro de estudos que tenham avaliado a excitação de fotossensibilizadores a base de Ce6 em comprimentos de onda na luz azul contra microrganismos. Além disto, até o presente momento, não existem relatos na literatura do emprego da TFDA com uso da clorina-e6 como terapia adjunta no tratamento da doença periodontal. Assim, desenvolvemos o presente estudo com a seguinte hipótese principal: a terapia fotodinâmica com utilização da Ce6 apresenta efeito antimicrobiano sobre biofilme de periodontopatógenos. 4 CONCLUSÃO A terapia fotodinâmica antimicrobiana com utilização da clorina-e6 apresentou efeito antimicrobiano significativo quando irradiada por luz azul ou vermelha sobre biofilme periodontopatogênico, com redução mais evidente nos grupos tratados com luz azul para S. oralis, P. gingivalis e A. actinomycetemcomitans. REFERÊNCIAS * 1. Newman MG, Takei HH, Klokkevold PR, Carranza FA. Carranza, periodontia clínica. 11.ed. Rio de Janeiro: Elsevier; 2011. p. 117-20. 2. Socransky SS, Haffajee AD. Periodontal microbial ecology. Periodontol 2000. 2005; 38: 135- 87. 3. Badersten A, Nilveus R, Egelberg J. Effect of nonsurgical periodontal therapy. I. Moderately advanced periodontitis, J Clin Periodontol. 1981; 8(1): 57-72. 4. Carvalho LH, D'Avila GB, Leão A, Haffajee AD, Socransky SS, et al. 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