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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO 
DE MESQUITA FILHO” 

FACULDADE DE MEDICINA 
 

 

 

 

Livia Carla Ramos Augusto 
 
 
 
 
 

Estudo de Leishmania spp. em amostras provenientes de 
cães e humanos e suas implicações em saúde pública na 

região de Bauru, São Paulo 
 

 

 

 

Dissertação apresentada à Faculdade de 
Medicina, Universidade Estadual Paulista “Júlio de 
Mesquita Filho”, Câmpus de Botucatu, para 
obtenção do título de Mestre em Doenças 
Tropicais.  

  

 

 

 

Orientadora: Profa. Dra. Virgínia Bodelão Richini Pereira 

 
 

 
 

Botucatu 
2018 



 

 

Livia Carla Ramos Augusto 

 

 

 

Estudo de Leishmania spp. em amostras provenientes de cães 
e humanos e suas implicações em saúde pública na região de 

Bauru, São Paulo 
 

 

 

 

 

Dissertação apresentada à Faculdade de 
Medicina, Universidade Estadual Paulista 
“Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de 
Botucatu, para obtenção do título de 
Mestre em Doenças Tropicais.  

  

  

  

 

Orientadora: Profa. Dra. Virgínia Bodelão Richini Pereira 

 

 

 

Botucatu 

2018 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



Dedicatória 
 

Dedico esse trabalho aos meus pais, Jurandi e Rita de Cássia. Obrigada por todo 

apoio, paciência, amor, compreensão e incentivo em todos os momentos da minha 

vida. Sem vocês, eu nada seria. 

   

 

 

 

 

 

 

 

 

 



Agradecimentos 
 

 À Deus e aos meus santos protetores, Nossa Senhora de Fátima, Santo 

Antônio e São Benedito, por me proporcionar tantas alegrias, conquistas e saúde. 

Agradeço diariamente. 

 À minha preciosa família, Jurandi, Rita de Cássia, Wesley, Luciana, Anna Júlia, 

Lucas, Larissa, Zezinho, Benjamin e Ângelo, por sempre estarem ao meu lado. Vocês 

são meu porto seguro, minha base e meus amores. 

 Ao meu eterno amor, João Gabriel, pelo apoio incondicional, incentivo nos 

momentos difíceis com muito carinho e compreensão. Obrigada por sempre estar ao 

meu lado. Amo você! 

 À minha orientadora, Virgínia, pela grande oportunidade, confiança, ajuda, 

ensinamentos e por acreditar no meu potencial. Apesar das minhas dificuldades em 

conciliar trabalho e estudo, você me incentivou e me fez acreditar que era possível. 

Obrigada por ser minha orientadora e amiga. 

 Ao financeiro da LC Plásticos, em especial minha prima Aline, que me ajudou 

a concluir as disciplinas e a conciliar o estudo com o trabalho.  

 As meninas da sorologia do IAL, Zezé, Milena, Bel e Adriana, pelo grande 

apoio, amizade e parceria no trabalho diário e nas pesquisas.  

 Aos meus colegas de trabalho do IAL, Luciana, Adriana Pensuti, Laís, 

Maricene, Lúcia, Lucas, Jean, Val, Mariana, Kelly, Cris, Cláudia, que de alguma 

maneira auxiliaram para a realização desse trabalho. 

 À Simone Tateishi, pelo auxílio na tradução do artigo. Muito obrigada. 

 À Kethlyn, uma pessoa amiga e dedicada. Muito obrigada por colaborar tanto 

com o trabalho.  

 À Aghata, parceira e amiga de um coração enorme. Obrigada por me incentivar, 

ajudar e sempre me ouvir nos momentos mais difíceis.  



  À Barbara, pela paciência em me ensinar as técnicas de biologia molecular e 

por contribuir imensamente para conclusão desse trabalho.  

 Agradeço a todos orientados e co-orientados da Prof. Virgínia, Débora, Thiago, 

Natássia, Livia, Wesley, por toda paciência com minhas dúvidas e angústias durante 

as análises e pelo grande apoio. 

 Ao Prof. Dr. Carlos Magno Castelo Branco Fortaleza, Dra. Laís M. Paiz e ao 

Prof. Dr. Rodrigo Costa da Silva, pelas correções e sugestões no trabalho. Obrigada 

por todo tempo dispensado em me ajudar.  

 À Prof. Dra. Simone Lucheis, por toda disponibilidade em colaborar com todas 

as pesquisas no IAL. 

 Ao Dr. José Eduardo Tolezano, pelo auxílio e orientações nas pesquisas 

realizadas no IAL.  

 Ao Prof. Dr. Cassiano Victória, que me recebeu com todo apoio e paciência 

para realização de todas as análises espaciais e ao Dr. Diego Borin Nóbrega por 

realizar as análises estatísticas. 

 À todos funcionários do Centro de Controle de Zoonose de Bauru, por todas as 

coletas e colaboração para realização desse trabalho.  

 Ao serviço de biblioteca da Universidade Estadual Paulista - UNESP – 

Botucatu, pela correção das referências bibliográficas e pela elaboração da ficha 

catalográfica. 

 Agradeço imensamente aos funcionários, docentes e alunos do Departamento 

de Higiene Veterinária e Saúde Pública da Faculdade de Medicina Veterinária e 

Zootecnia e do programa de Pós-Graduação em Doenças Tropicais da Faculdade de 

Medicina de Botucatu. Sou imensamente grata. 

 Agradeço a Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo 

(FAPESP) pelo auxílio à pesquisa nº 2012/21145-4 e 2015/17519-4. 

 

 



  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

 

 

 

 

 

 
 

“Talvez não tenha conseguido fazer o melhor, mas lutei 
para que o melhor fosse feito. Não sou o que deveria ser, 

mas Graças a Deus, não sou o que era antes”. 

      (Marthin Luther King) 
 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Resumo 



Ramos-Augusto, L.C. Estudo de Leishmania spp. em amostras provenientes de 
cães e humanos e suas implicações em saúde pública na região de Bauru, São 
Paulo. 2018. 118p. Dissertação (mestrado) - Faculdade de Medicina de Botucatu, 
Universidade Estadual Paulista, Botucatu, 2018. 

As leishmanioses são doenças zoonóticas de importância em saúde pública. Os 
objetivos do trabalho foram comparar as técnicas laboratoriais convencionas utilizadas 
para o diagnóstico de infecção por Leishmania spp.  em amostras de sangue humano 
e canino com técnicas moleculares e realizar a quantificação da carga parasitária. 
Além disso, realizar a análise espacial dos casos de leishmaniose visceral humana 
(LV) e canina (LVC), confirmados laboratorialmente e notificados, baseando-se na 
incidência da enfermidade, entre 2014 a 2016, no município de Bauru (SP), com intuito 
de identificar as áreas prioritárias para implementação de medidas de vigilância e de 
controle. Foram avaliadas amostras de 26 pacientes com suspeita clínica de LV por 
meio do exame parasitológico direto em aspirado de medula óssea, teste 
imunocromatográfico rápido (TR), reação de imunofluorescência indireta (RIFI), 
reação em cadeia da polimerase (PCR) e PCR em tempo real (qPCR). Além disso, 
foram avaliadas amostras de 22 pacientes humanos com suspeita clínica de 
leishmaniose tegumentar (LT) para realização da RIFI, PCR e qPCR. As amostras 
caninas foram obtidas por meio dos inquéritos sorológicos realizados em 4725 cães, 
pelo Centro de Controle de Zoonoses (CCZ) de Bauru, e, mediante a positividade no 
TR (TR-DPP®) foi realizado o teste imunoenzimático (ELISA), PCR e qPCR. A análise 
espacial foi realizada em 39 casos humanos de LV, com diagnóstico obtido a partir do 
critério clínico-laboratorial, e nos 4725 cães pertencentes aos inquéritos sorológicos 
realizados entre 2014 a 2016, destacando os casos de LVC.  Nas 26 amostras 
humanas analisadas para LV, a positividade obtida no parasitológico, TR, RIFI, PCR 
e qPCR foram: 80,8%, 80,8%, 73,1%, 84,6% e 84,6%. A RIFI foi a metodologia que 
obteve menor positividade e concordância com as demais metodologias e a carga 
parasitária se concentrou entre 100 e 1.000 parasitas/mL (68,2%). Nas 22 amostras 
humanas analisadas para LT, a positividade obtida na RIFI, PCR e qPCR foram: 9,1%, 
18,2 e 18,2%. A RIFI obteve menor positividade e concordância insignificante com as 
técnicas moleculares e a carga parasitária das amostras se concentraram entre 100 e 
1.000 parasitas/mL (100%). Nas amostras caninas, a positividade de 11,5% 
(543/4725) foi obtida em ambas as técnicas (TR-DPP® e ELISA). Nos cães TR-DPP® 
positivos, a positividade no ELISA, PCR e qPCR foram: 64,9%, 63,9% e 65%. A 
concordância foi excelente entre o ELISA e as técnicas moleculares. A carga 
parasitária se concentrou entre 1.000 e 10.000 parasitas/mL (73,9%). Foram 
identificadas cinco áreas com densidade alta de LV, localizadas nas regiões norte e 
oeste do município. Foram identificadas duas áreas com densidade alta de LVC, 
ambas localizadas na região norte. Em duas localidades, na região norte, houve 
sobreposição, compreendendo 68% dos casos de LVC notificados nos inquéritos 
sorológicos e 38,5% casos de LV humano. As técnicas moleculares em amostras de 
sangue constituem uma alternativa menos invasiva de diagnóstico tanto para LV 
quanto para LT em humanos, devido a alta positividade entre as amostras analisadas 
e/ou excelente concordância com as técnicas convencionais e, em cães, podem ser 
utilizadas tanto para o diagnóstico quanto para complementar os resultados 
sorológicos. As análises espaciais são capazes de gerar informações úteis que 
auxiliam em um melhor planejamento de ações de vigilância e no controle da doença, 
além da otimização do uso de recursos públicos para a execução dessas ações.  

Palavras-chave: leishmanioses, diagnóstico, análise espacial. 



 
 
 
 
 
 
 
 

Abstract 
 



Ramos-Augusto, L.C. Study of Leishmania spp. in samples from dogs and 
humans and their implications for public health in the region of Bauru, São 
Paulo. 2018. 118p. Thesis (Master) – Faculty of Medicine of Botucatu, Universidade 
Estadual Paulista, Botucatu, 2018. 

 
Leishmaniasis is a zoonotic disease of public health significance. The aims of the 
present study were to compare the conventional laboratory techniques used for the 
diagnosis of Leishmania spp. in human and canine blood samples with the molecular 
techniques and carry out the quantification of the parasite load. In addition, to perform 
a spatial analysis of visceral leishmaniasis in humans (VL) and dogs (CVL), laboratory 
confirmed and notified, based on the incidence of the disease in Bauru city (SP), during 
2014 to 2016, with the objective of identify priority areas for surveillance and control of 
VL. Twenty-six samples with clinical suspicion of VL were evaluated through direct 
parasitological in bone marrow aspirate, rapid immunochromatographic test (RT), 
indirect immunofluorescent antibody test (IFAT), polymerase chain reaction (PCR) and 
real-time PCR (qPCR). In addition, twenty-two human cases with clinical suspicion of 
TL were selected for the accomplishment of IFAT, PCR and qPCR. The canine 
samples were obtained through serological investigations carried out in 4,725 dogs by 
the Center for Zoonoses Control (CCZ) in Bauru, and by means of the positivity in RT 
(RT-DPP®) was realized the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), PCR and 
qPCR. The spatial analysis was performed in thirty-nine human cases of VL, with a 
diagnosis obtained from clinical laboratory, and in 4,725 dogs belonging to the 
serological investigations conducted during 2014 to 2016, highlighting CVL cases. In 
the twenty-six human samples analyzed for VL, the positivity obtained in 
parasitological, RT, IFAT, PCR and qPCR were: 80.8%, 80.8%, 73.1%, 84.6% and 
84.6%. IFAT was the methodology that obtained less positivity and agreement with 
other methodologies. The parasite load was concentrated between 100 and 1,000 
parasites/mL (68.2%). In the twenty-two human samples analyzed for tegumentary 
leishmaniasis (TL), the positivity obtained in the IFAT, PCR and qPCR were: 9.1%, 
18.2 and 18.2%. The IFAT obtained lower positivity and negligible agreement with the 
molecular techniques and the parasite load of the samples were concentrated between 
100 and 1,000 parasites/mL (100%). In the canine samples, 11.5% (543/4,725) of 
positivity were obtained for both techniques (RT-DPP® and ELISA). In RT-DPP® 
positive dogs, positivity in ELISA, PCR and qPCR were: 64.9%, 63.9% and 65%. The 
agreement was excellent between ELISA and molecular techniques. The parasite load 
was concentrated between 1,000 and 10,000 parasites/ml (73.9%). Five areas with 
high VL density were identified, located in the north and west regions of the city. Two 
areas with high CVL density were identified, both located in the north region. In two 
locations in the north region was overlap, comprising 68% of cases of CVL notified in 
serological investigations and 38.5% cases of human VL. Molecular techniques in 
blood samples consist in a less invasive diagnostic alternative for both VL and TL in 
humans, due to the higher positivity between the samples analyzed and/or the 
excellent agreement with the conventional techniques and, in dogs, can be used both 
for diagnosis and to complement the serological results. Spatial analysis provides 
useful information and can assist in the better surveillance planning actions and control 
of the disease, besides optimizing the use of resources for the execution of these 
actions. 

 

Key words: leishmaniasis, diagnosis, spatial analysis. 



     SUMÁRIO 

 

Capítulo I ......................................................................................... 8 

Revisão da Literatura .................................................................... 9 

Objetivos..................................................................................... 26 

Referências ................................................................................ 28 

Capítulo II ...................................................................................... 43 

Artigo Científico 1 ....................................................................... 44 

Artigo Científico 2 ....................................................................... 74 

Conclusão ..................................................................................... 93 

Apêndices...................................................................................... 95 

Anexos ........................................................................................ 100 

 



8 
  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Capítulo I 



9 
 

Revisão da Literatura 
  

 As leishmanioses são zoonoses de grande importância à saúde pública.  

De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), zoonoses são doenças 

ou infecções causadas por diversos tipos de agentes (bactérias, parasitas, vírus 

ou agentes não convencionais), transmitidos naturalmente de animais 

vertebrados para humanos. Além de serem um problema de saúde pública, 

muitas zoonoses causam impactos importantes na economia global (1).  

 As zoonoses foram reconhecidas há vários séculos e mais de 200 já foram 

descritas. De acordo com Jones et al. (2), ao analisarem 335 eventos de doenças 

infecciosas emergentes (DIE), entre 1940 e 2004, observaram que 60,3% destes 

eram zoonoses e 71,8% eram originárias de espécies de animais silvestres. 

Atualmente, 75% de todas as doenças novas, emergentes e re-emergentes, que 

afetam os seres humanos, são de origem zoonótica (3). 

 O termo zoonose emergente foi definido como um patógeno recém-

descoberto, que sofreu evolução recente ou que já tenha sido descrito 

anteriormente, mas que demonstra um aumento na sua incidência ou expansão 

geográfica quanto ao número de hospedeiros e/ou vetores (4). Vale ressaltar 

que, somente no último século, 14 doenças parasitárias ou infecciosas 

emergiram ou re-emergiram, destacando-se: ebola, dengue, chikungunya, zika 

e febre amarela (5).  

A expansão populacional e urbanização são fatores importantes 

responsáveis pelo surgimento dessas doenças.  Estima-se que a população 

mundial alcançará 10 bilhões em 2050 e 60% será urbana em 2030, significando 

um aumento da densidade demográfica em grandes centros urbanos (5). Além 

disso, para suportar a demanda nutricional, é necessária uma maior produção 

de alimentos e, consequentemente, um aumento da prática da agricultura e 

pecuária, muitas vezes envolvendo a criação de diversas espécies de animais 

na mesma região, colaborando com a transposição da barreira de infecção inter-

espécies (4). 

 Outros fatores que influenciam no aumento da ocorrência de zoonoses 

são: mudanças climáticas que facilitam a expansão de vetores, íntimo contato 



10 
 

com animais de estimação, turismo, globalização, domesticação e interação com 

animais silvestres, adaptação de patógenos a novas espécies hospedeiras e/ou 

aquisição de novos fatores de virulência, industrialização, transporte de pessoas 

e animais infectados, imunossupressão pelo vírus da imunodeficiência humana 

(HIV) e transplantes, desenvolvimento de resistência à fármacos, fatores sociais 

e culturais como diferentes tipos de alimentação e religião (4,6). 

 As leishmanioses são classificadas como doenças tropicais 

negligenciadas, assim como, dengue, raiva, hanseníase, doença de Chagas, 

tracoma, entre outras (7, 8). As doenças negligenciadas são causadas por 

agentes infecciosos ou parasitários, endêmicas principalmente em população de 

baixa renda e apresentam investimentos reduzidos em pesquisas, produção de 

medicamentos e controle (9). Essas doenças não só prevalecem em condições 

de pobreza, mas também contribuem para manutenção de desigualdades (10). 

De acordo com a OMS, mais de 1 bilhão de pessoas estão infectadas com uma 

ou mais doenças negligenciadas, representando 1/6 da população mundial (10, 

11). 

 As leishmanioses são doenças transmitidas por vetores e, atualmente, 

endêmica em 98 países (11). Aproximadamente, 12 milhões de pessoas estão 

infectadas no mundo e 350 milhões de pessoas possuem o risco de contrair a 

doença (11,12). Anualmente, estima-se 700 mil a 1 milhão de novos casos e 20 

mil a 30 mil óbitos (13).  

 Estudos recentes apontam que as leishmanioses produzem uma carga de 

enfermidades em 2,35 milhões de anos potenciais de vida perdidos e/ou 

ajustados por incapacitados (DALY - disability adjusted life years), sendo 2,3% 

somente nas Américas. DALY é um indicador, no qual, mede-se, 

simultaneamente, o efeito da mortalidade e dos problemas de saúde que afetam 

a qualidade de vida dos indivíduos (11,14). 

São doenças infecto-parasitárias importantes, causadas por protozoários 

intracelulares obrigatórios, posicionados taxonomicamente da seguinte forma: 

Domínio Eukarya; Ordem Kinetoplastida; Família Trypanosomatidae; Gênero 

Leishmania (15). Subdivididos em dois principais subgêneros: Leishmania, no 

qual o desenvolvimento do parasita ocorre na porção média e anterior do 



11 
 

intestino do vetor denominado região suprapilária, e Viannia, no qual o 

desenvolvimento ocorre uma parte na porção posterior do intestino do vetor 

denominado região peripilária (16). 

Tendo em vista que se obteve um maior conhecimento sobre o parasita e 

com o advento de novas tecnologias, recentemente foi proposto uma nova 

classificação em duas principais linhagens: Euleishmania, composto pelos 

subgêneros Leishmania (L.), Viannia (V.), Sauroleishmania (S.) e complexo L. 

enriettii, e a Paraleishmania, composto por L. hertigi, L. deanei, L. herreri, L. 

equatorensis, L. colombiensis e o gênero Endotrypanum (17). Até o momento, 

foram descritas 53 espécies de Leishmania, sendo 31 capazes de infectar 

mamíferos e 20 espécies são patogênicas ao homem (18).  

Como outros tripanossomatídeos, a Leishmania possui uma mitocôndria 

única ramificada denominada cinetoplasto, no qual, o seu material genético 

(kDNA) consiste em uma rede composta por milhares de círculos (maxicírculos, 

com poucas dezenas de cópias e minicírculos, com milhares de cópias) 

concatenados entre si, constituindo-se um dos maiores complexos estruturais 

mitocondriais na natureza (19). Os maxicírculos, assim como o DNA mitocondrial 

em outros eucariotos, codificam RNA ribossomal e proteínas da cadeia 

respiratória, enquanto que, os minicírculos são responsáveis por codificar os 

RNAs guias (guide RNAs), nos quais atuam na edição específica dos transcritos 

dos maxicírculos (20). 

As leishmanioses são tradicionalmente separadas em dois grupos: Velho 

Mundo (“Old World”) e Novo Mundo (“New World”). Essa divisão existe para se 

referir a região geográfica onde a infecção foi adquirida. Leishmanioses do Velho 

Mundo referem-se as espécies encontradas na Bacia do Mediterrâneo, Oriente 

Médio e África, enquanto que, as do Novo Mundo são as espécies encontradas 

no México, América Central e América do Sul (21). Uma diferença no genoma 

também foi descrita, onde as espécies pertencentes ao Velho mundo 

[Leishmania (L.) infantum, Leishmania (L.) donovani, Leishmania (L.) major, 

Leishmania (S.) tarentolae] compreendem 36 cromossomos, enquanto, que 

espécies do Novo Mundo [Leishmania (V.) braziliensis e Leishmania (L.) 

mexicana] possuem 35 e 34 cromossomos, respectivamente, devido a eventos 



12 
 

de fusão de dois a quatro cromossomos (22). Peacock et al. (23) analisaram o 

genoma das espécies L. (L.) infantum e L. (V.) braziliensis e compararam com a 

sequência do genoma de L. major. Identificaram 200 genes com uma distribuição 

diferente entre as espécies estudadas e mostraram que a formação de 

pseudogenes e a perda dos genes são os principais motivos que moldam os 

diferentes genomas. 

A transmissão de Leishmania ocorre por meio da picada de fêmeas 

hematófagas, pertencentes aos gênero Lutzomyia no Novo Mundo e 

Phlebotomus no Velho Mundo (18). Ao realizar o repasto sanguíneo em 

mamíferos infectados, ingerem também os macrófagos parasitados pelas formas 

amastigotas. Em seguida, dentro do trato digestório anterior do vetor, os 

macrófagos se rompem liberando o parasita, ocorrendo uma intensa reprodução 

por divisão binária e uma diferenciação para as formas flageladas promastigotas, 

denominado metaciclogênese (24). Dentro do vetor, ocorre a diferenciação do 

parasita em cinco formas principais: promastigotas procíclicas, nectomonadas, 

leptomonodas, haptomonadas e promastigotas metacíclicas (forma infectante) 

(24, 25). 

Após esse período, quando as fêmeas realizam um novo repasto 

sanguíneo, há liberação do parasita na forma promastigota metacíclica, 

flagelada, juntamente com sua saliva.  Na derme do hospedeiro, o parasita 

intracelular obrigatório, é fagocitado por células do sistema mononuclear 

fagocitário. Dentro dos macrófagos, no vacúolo parasitóforo, os parasitas se 

diferenciam para sua forma amastigota e se multiplicam intensamente. 

Posteriormente, há o rompimento das células e a liberação de novos parasitas 

capazes de infectar outras células e tecidos como os linfonodos, medula óssea 

e baço, inibindo cada vez mais a resposta imunológica do hospedeiro (26). 

Atualmente, são reconhecidas 521 espécies de flebotomíneos nas 

Américas, porém somente 60 foram implicados como vetores de Leishmania. A 

incriminação de espécies como vetores envolve uma análise detalhada como a 

densidade vetorial, antropofilia, distribuição geográfica coincidente com a 

presença do patógeno, sobrevivência e competência vetorial (27).   



13 
 

As leishmanioses são caracterizadas pelo amplo espectro de 

manifestações clínicas, variando, principalmente, de acordo com a espécie do 

parasita, da relação do parasita com hospedeiro e da resposta imunológica do 

indivíduo (15,28). Classicamente, as enfermidades são divididas em dois 

grandes grupos: leishmaniose visceral (LV) ou calazar, forma mais severa e fatal, 

caso não seja tratada; e a leishmaniose tegumentar (LT). 

 A LT pode ser subdivida em: cutânea (LC), forma mais comum com 

acometimento primário da pele e incapacitante quando a lesões são múltiplas; 

muco-cutânea (LMC), quando há o aparecimento de lesões tanto pele quanto na 

mucosa, sendo considerada uma doença mutiladora; cutânea difusa, severa, 

devido à deficiência da resposta imune celular; e cutânea disseminada, 

caracterizada pelo aparecimento de múltiplas lesões papulares com 

acometimento de vários segmentos corporais (12, 28,29). 

A LC é a forma clínica mais prevalente, sendo que 90% dos casos se 

concentram em sete países: Afeganistão, Argélia, Irã, Peru, Arábia Saudita, Síria 

e Brasil (30). De acordo com a OMS, em 2018, estima-se 0,6 a 1 milhão de novos 

casos no mundo, anualmente (13). No Brasil, entre 2000 e 2016, verificou-se 

uma média de 23.417 casos registrados anualmente, com um coeficiente de 

detecção de 12,6/100 mil habitantes (31, 32). 

No Brasil, foram identificadas sete espécies envolvidas nos casos de LC, 

sendo seis do subgênero Viannia e uma do subgênero Leishmania. As principais 

espécies são: L. (V.) braziliensis, L. (V.) guyanensis e L. (L.) amazonensis. A 

primeira espécie de Leishmania descrita foi L. (V.) braziliensis, considerada a 

mais importante no Brasil e na América Latina, pois possui uma ampla 

distribuição desde a América Central até o norte da Argentina. L.(V.) guyanensis 

ocorre, mais especificamente, na região norte do Brasil (Acre, Amapá, Roraima, 

Amazonas e Pará. L.(L.) amazonensis é prevalente no Amazonas, Pará, 

Rondônia, Tocantins e Maranhão e se estende para outros estados. 

Recentemente, as espécies L. (V.) lainsoni, L. (V.) naiffi, L. (V.) lindenberg e L. 

(V.) shawi foram identificadas em estados das regiões Norte e Nordeste (33).  

O primeiro vetor envolvido na transmissão de LC na região Neotropical foi 

Lutzomyia intermedia. Com o desmatamento, algumas espécies silvestres 



14 
 

desapareceram e/ou diminuíram e outras, como Lu. intermedia, se adaptaram 

em ambientes modificados pelo o homem, causando grande impacto na saúde 

pública. No Brasil, outras espécies também estão envolvidas, como a Lu. 

flaviscutellata, Lu. whitmani, Lu. umbratilis, Lu. wellcomei, Lu. migonei. Há 

estudos envolvendo a Lu. neivai e Lu. fischeri (34). 

Atualmente, a dinâmica de transmissão da LT podem assumir três 

padrões epidemiológicos: silvestre, onde a transmissão ocorre em área de 

vegetação primária, caracterizada como uma zoonose de animais silvestres e, 

com a entrada do homem, pode ocorrer a enzootia; ocupacional ou lazer, 

associada estritamente ao desmatamento desordenado de florestas para 

construção de usinas, hidrelétricas, atividades agropecuárias, entre outros; rural 

e periurbano, relacionada ao processo migratório, à ocupação de encostas, e 

aos aglomerados em centros urbanos, com a participação de animais 

domésticos como reservatórios da infecção (24). 

O primeiro caso de LC foi descrito por Lewis e Cunningham (1876), no 

Velho Mundo, causado por L. tropica (35). No Brasil, em 1885, Alexandre 

Cerqueira foi o primeiro a identificar a doença na Bahia e Gaspar Vianna (1911) 

foi o responsável por nomear a espécie mais prevalente no Brasil, L. braziliensis 

(15).  Em 1907, houve uma epidemia devido à construção da estrada de ferro 

noroeste, disseminando a doença no país, acompanhando a entrada do homem 

e a derrubada de matas, conhecida popularmente como "úlcera de Bauru" (36). 

De acordo com a Secretaria Estadual de Saúde do Estado de São Paulo 

(SES-SP), entre 2007 e 2017, foram confirmados 3.738 casos de LT, 

predominantemente no sexo masculino (67%), faixa etária entre 35 a 64 anos 

(50,36%), forma clínica cutânea (77,92%) e casos autóctones (65,44%). Nos 38 

municípios1 que compõem o Grupo de Vigilância Epidemiológica de Bauru (GVE-

Bauru) foram confirmados 41 casos, enquanto que, no município de São Paulo 

o GVE registrou 490 casos (37,38). 

                                                           
1 Agudos, Arealva, Avaí, Balbinos, Bariri, Barra Bonita, Bauru, Bocaina, Boracéia, Borebi, Brotas, 
Cabrália Paulista, Cafelândia, Dois Córregos, Duartina, Getulina, Guaiçara, Iacanga, Igaraçu do 
Tietê, Itaju, Itapuí, Jaú, Lençóis Paulista, Lins, Lucianópolis, Macatuba, Mineiros do Tietê, 
Paulistânia, Pederneiras, Pirajuí, Piratininga, Pongaí, Presidente Alves, Promissão, Reginópolis, 
Sabino, Torrinha e Uru. 



15 
 

As lesões tegumentares se iniciam, mais frequentemente, em áreas do 

corpo mais expostas ao inseto como orelhas, nariz, lábios, bochechas, pernas, 

mãos, antebraços e tornozelos (35). O período de incubação varia entre uma a 

quatro semanas, até anos. No ponto de inoculação do parasita, há aumento de 

temperatura e inchaço, formando um pequeno eritema, evoluindo posteriormente 

para pápula e nódulo, que ulceriza em um período de duas semanas a seis 

meses (39). A forma disseminada da doença é uma manifestação clínica rara, 

responsável por 2% dos casos reportados de LC no Brasil, o qual, se caracteriza 

pela presença de múltiplas lesões papulares acneiformes (40). 

Ao contrário da LC, a LMC ou “espúndia” é caracterizado 

imunologicamente pelo exagero das respostas celulares antileishmania e 

escassez de parasitos e o agente etiológico principal é L. (V) braziliensis (33). A 

progressão para mucosa ocorre em 1% a 10% dos pacientes, pois, depende de 

alguns fatores como a virulência do parasita, imunidade celular do indivíduo, 

gênero, idade, estado nutricional, entre outras características (21,41). Cerca de 

90% das pessoas com LMC possuem uma cicatriz de um primeiro episódio de 

LC. Alguns sinais importantes são eritema e ulceração nas narinas, com ou sem 

perfuração, ulceração no palato, edema gengival, entre outros (21).   

LV é a forma mais severa da doença, sendo fatal, se não tratada. No Leste 

da África e Subcontinente Indiano a espécie envolvida é L. (L.) donovani e na 

Europa, norte da África e na América Latina é L. (L.) infantum (42). Estima-se 

200 mil a 400 mil novos casos no mundo, anualmente. Atualmente, 90% dos 

casos registrados estão concentrados em cinco países: Brasil, Bangladesh, 

Índia, Sudão e Etiópia (43, 44). Cerca de 96% dos casos registrados nas 

Américas estão concentrados no Brasil, no entanto, observa-se uma expansão 

para Argentina, Colômbia, Paraguai e Venezuela (45). 

No Brasil, o primeiro registro de LV foi em 1913 em uma necropsia 

realizada em um indivíduo oriundo do estado do Mato Grosso, posteriormente, 

identificou-se outros casos nas regiões Norte e Nordeste (24). Descrita 

inicialmente como uma endemia rural, a doença passou por um processo de 

urbanização e expansão territorial, a partir de 1980 (46). Hoje, presente nas cinco 

regiões do país, acometendo 23 das 27 Unidades da Federação (UF), incluindo 



16 
 

recentemente o estado de Santa Catarina, que identificou casos humanos 

autóctones (47,48). 

De acordo com o Sistema de Informação de Agravos de Notificação 

(SINAN), foram confirmados 58.300 casos de LV, entre 2000 e 2016, com média 

anual de 3.479 casos confirmados e com coeficiente de incidência de 1,83/100 

mil habitantes (48,49).  

No estado de São Paulo, os casos autóctones de LV iniciaram-se no ano 

de 1999 em Araçatuba, região noroeste do estado, disseminando a doença no 

sentido sudoeste, em direção à região de Bauru. Fatores importantes para a 

expansão da ocorrência da LV no estado foram: elevada temperatura anual, 

presença de vetores, construção do gasoduto Brasil-Bolívia, entre 1997 e 1999 

e a rodovia Marechal Rondon (50, 51). 

De acordo com a SES-SP, entre 2014 e 2017, foram confirmados 525 

casos humanos de LV e 44 óbitos e, somente, no GVE-Bauru, foram confirmados 

120 casos humanos e cinco óbitos (52). Entre 2011 e 2014, o GVE-Bauru 

abrangeu 24,5% de casos no estado, seguido pelo GVE-Araçatuba (23,8%) e o 

GVE-Presidente Prudente (19,5%) (53).  

O principal vetor responsável pela transmissão da LV é Lutzomyia 

longipalpis, popularmente conhecido como mosquito-palha, asa-dura, birigui e 

cangalhinha, dependendo da região geográfica. São insetos (mosquitos) 

pequenos, coloração amarelada, voos saltitantes, hábitos crepusculares, e, 

quando em repouso, suas asas ficam semi-abertas e eretas. Adaptados a 

ambientes ricos em matéria orgânica, úmidos e com baixa luminosidade, podem 

ser encontrados no intra e peridomicílio e em abrigos de animais domésticos 

(24). 

Recentemente, Lutzomyia cruzi (Lu. cruzi) foi reconhecido como vetor nos 

estados: Mato Grosso do Sul e Mato Grosso (54,55). Carvalho et al. (56) 

apontam Migonemyia migonei (Mi. migonei) como suposto vetor no estado de 

Pernambuco e Guimarães et al. (57) publicaram que Lutzomyia migonei é outro 

vetor suscetível ao desenvolvimento da L. (L.) infantum. 



17 
 

Outras formas de transmissão relatadas, menos frequentes, como a 

transfusional, vertical, por acidente de laboratório com objetos contaminados e 

compartilhamento de seringas entre usuários de drogas. Atualmente, tem-se 

observado um aumento no número de casos de leishmanioses em indivíduos 

infectados com HIV (35,58). No Brasil, a incidência de coinfecção aumentou de 

0,7% (2001) para 8,5% (2012). Até o momento, foram reportados 35 países com 

casos autóctones de coinfecção (59). 

A maioria dos quadros clínicos de LV são oligossintomáticos, 

manifestando-se linfoadenopatia, hepatoesplenomegalia, pancitopenia, febre, 

anorexia, suores noturnos, perda de peso, pigmentação cutânea, entre outros. 

Caso a doença progrida, pode haver falha multissistêmica, hemorragia, caquexia 

e infecções secundárias, provocando a morte do indivíduo (35).  

A leishmaniose visceral canina (LVC) também é um importante problema 

de saúde pública. Os cães domésticos (Canis familiares) são considerados os 

principais reservatórios urbanos da LV, devido a sua grande susceptibilidade à 

infecção pelo parasita, alta parasitemia na pele, estreita relação com os seres 

humanos, tanto em áreas rurais quanto urbanas (60). 

 Os cães são considerados alvo importante para epidemiologia e para os 

programas de controle da LV, pois a enzootia canina normalmente tem precedido 

a ocorrência de casos humanos e a infecção canina tem sido mais prevalente 

(61). Estima-se que, pelo menos 2,5 milhões de cães estão infectados na 

Europa. Na América do Sul, os casos também são quantificados em milhões, 

sendo as maiores taxas encontradas na Venezuela e Brasil, onde a alta 

prevalência de infecção canina está associada ao alto risco para população 

humana (62, 63).  

Vale ressaltar que, outras espécies agem como reservatórios de 

Leishmania spp. como os carnívoros (Cerdocyon thous e Speothos venaticus), 

marsupiais (Didelphis marsupialis e D. albiventris), roedores (Rattus rattus e 

Thrichomys laurentius), primatas (Cebus apela e Chiropotes satanas), entre 

outros (24,60,64,65,66). 

A LVC é uma doença sistêmica, grave, de evolução lenta, que afeta tanto 

as vísceras quanto a pele do animal. O período de incubação é variável, mas em 



18 
 

média dura de três a sete meses. O quadro clínico pode ser classificado em: 

assintomáticos, ausência de sinais clínicos; oligossintomáticos, presença de 

adenopatia linfóide, pequena perda de peso e pelo opaco; e sintomáticos, além 

dos sinais anteriores, podendo haver alterações cutâneas (alopecia, eczema 

furfuráceo, úlceras, hiperqueratose), onicogrifose, emagrecimento acentuado, 

ceratoconjuntivite, paresia de membros posteriores (24). 

Autores apontam que a porcentagem de cães assintomáticos, que vivem 

em áreas endêmicas, pode atingir 60% a 80% da população infectada, servindo 

como fonte de infecção para o flebotomíneo e tendo um papel ativo na 

transmissão (62). Além disso, os sinais clínicos observados em cães podem ser 

comuns a outras patologias, como babesiose e erliquiose. Ainda a 

imunossupressão causada pela doença pode gerar infecções oportunistas que 

dificultam o diagnóstico clínico (67). 

 Em 1998, a região de Araçatuba foi a primeira em diagnosticar casos 

autóctones de LVC no estado de São Paulo. Desde então, verificou-se a 

expansão considerável da doença (68). O município de Bauru se destaca por ser 

uma região endêmica no centro-oeste do estado e com transmissão intensa da 

doença: somente entre 2014 e 2015, foram registrados 1484 casos de LVC (69). 

 O diagnóstico das leishmanioses é realizado por uma associação de 

informações clínicas, epidemiológicas e laboratoriais. De acordo com de Paiva-

Cavalcanti et al. (70), a falta de uma metodologia laboratorial “padrão-ouro” de 

diagnóstico em humanos e em animais é uma limitação no controle da doença, 

pois a obtenção de dados epidemiológicos precisos está associada com a 

implantação de medidas mais efetivas. 

Atualmente, o exame parasitológico é considerado “padrão-ouro” devido 

a sua alta especificidade, pois trata-se da visualização das formas amastigotas 

pelo microscópio óptico. A pesquisa direta pode ser realizada em raspado do 

bordo da lesão, biópsia com impressão do fragmento cutâneo em lâmina ou 

punção aspirativa da lesão quando se investiga a LT, enquanto que para LV, o 

parasitológico é realizado em amostras de tecidos como o baço, linfonodo e 

aspirado de medula óssea (28). Trata-se de uma metodologia invasiva e há 

variação da sensibilidade de acordo com o material utilizado: para esfregaço de 



19 
 

baço a sensibilidade varia de 93,1% a 98,7%, medula óssea de 52% a 85% e 

linfonodo 52% a 58%, relatado em humanos (71). De acordo com Laurenti (72), 

em cães, a sensibilidade na medula óssea varia de 50% a 83%, no linfonodo 

30% a 85% e 71% a 91% quando analisados em ambos os tecidos. 

A cultura é uma metodologia bastante informativa, porém mais demorada 

e  requer treinamento, pois a sensibilidade e especificidade diagnóstica estão 

intimamente ligadas à experiência do técnico. Além disso, sua sensibilidade 

tende a ser mais baixa e variável, pois depende do número de parasitas e sua 

dispersão na amostra (39). O meio clássico mais utilizado é o NNN (Novy-

MacNeal-Nicolle) e a utilização de meio líquido (LIT - liver infusion tryptose, ou 

de Schneider) sobre o NNN aumenta a sensibilidade e acelera o crescimento da 

cultura (24, 73).   

Os exames sorológicos são baseados na detecção de uma resposta 

humoral específica e há vários métodos descritos com sensibilidade e uma 

especificidade diagnóstica bastante variáveis (71). No entanto, há limitações 

importantes que podem acarretar um diagnóstico incorreto como as reações 

cruzadas com outras doenças e baixa acurácia do método em pacientes 

imunossuprimidos (59,74).  

No Brasil, as técnicas mais utilizadas são a reação de imunofluorescência 

indireta (RIFI), ensaios imunoenzimáticos (ELISA - enzyme-linked 

immunosorbent assay) e imunocromatográficos (73). 

A RIFI é uma técnica menos sensível do que o ELISA tanto para o 

diagnóstico de LT quanto para LV, em humanos (73, 75). No entanto, a RIFI é a 

técnica mais utilizada no país, em casos humanos, pois está amplamente 

distribuída por meio do programa de leishmanioses do Ministério da saúde. 

Reune algumas vantagens como fácil execução, rapidez, baixo custo, porém 

requer um microscópio de fluorescência e bastante treinamento técnico. Os 

resultados são expressos em títulos, assim, aceita-se como positivas títulos a 

partir de 80. De acordo com o Ministério da saúde, amostras humanas com título 

igual a 40 recomenda-se nova coleta após 30 dias (24). A sensibilidade do ensaio 

varia de 82% a 95% e a especificidade de 78% a 92%, de acordo com a 

preparação antigênica e da espécie de Leishmania utilizada (76). 



20 
 

O ELISA é expresso em unidades de absorbância à um raio de luz, em 

uma reação com diluições fixas (quantitativo) ou, na forma mais comum, apenas 

como reagente ou não reagente (qualitativo) (24). A sensibilidade varia entre 

90% e 100% e a especificidade 71% a 100%, variando também de acordo com 

o antígeno utilizado, assim como na RIFI (76). O antígeno solúvel bruto (CSA - 

crude soluble antigens), a partir de uma suspensão de promastigotas em salina 

tamponada fosfatada, é a forma mais comum utilizada para revestir as placas de 

ELISA, porém foram observadas reações cruzadas com outros agentes (77). 

Com intuito de diminuir as reações cruzadas e aumentar a especificidade, alguns 

antígenos purificados sintéticos ou recombinantes foram identificados, como a 

proteína recombinante K39 (rK39 - sequência de 39 aminoácidos de uma região 

quinase altamente conservada de L. infantum) e que, atualmente, estão sendo 

amplamente utilizados nos métodos de ELISA e em plataformas 

imunocromatográficas (76). 

Os testes imunocromatográficos ou testes rápidos (TR) permitem a 

detecção rápida de anticorpos para Leishmania spp.. O método utilizado em 

indivíduos, com quadro clínico sugestivo de LV, baseia-se na reação do sangue, 

soro ou plasma com o antígeno recombinante rK39 fixado em uma membrana 

de nitrocelulose presente no teste. No Brasil, inicialmente, era utilizado o Kalazar 

Detect® (InBios International), sendo que, a partir de 2015, foi substituído para o 

IT-LEISH® (Bio-Rad), no qual se mostrou mais sensível e específico. Em 2018, 

foi substituído pelo OnSite™ (Bio Advance Diagnóstico), também utilizando o 

rK39 e com as mesmas especificações técnicas do kit anterior (78,79). 

 Em áreas endêmicas para LV, o tratamento de indivíduos humanos, pode 

ser considerado em pacientes com manifestações clínicas e positividade em 

testes rápidos rK39, mas, em casos negativos, devem ser investigados mais 

profundamente por meio de outras metodologias (80). Sabe-se que em pacientes 

imunossuprimidos, há diminuição da sensibilidade aos testes sorológicos. Na 

Etiópia, houve diminuição na sensibilidade do TR de 87% para 77% em 

pacientes coinfectados com HIV (81) e, no Brasil, da Silva et al. (82), concluíram 

que pacientes coinfectados com HIV, com resultados negativos para rK39, 

devem ser investigados com testes sorológicos adicionais, que não se baseiem 

somente no antígeno rK39 ou aspirado de medula óssea.  



21 
 

Os métodos sorológicos para o diagnóstico de LVC preconizados pelo 

Ministério da saúde, eram o ELISA como método de triagem e a RIFI como 

confirmatório (68).  A partir da nota técnica emitida pelo Ministério da saúde (83), 

em dezembro do ano de 2011, houve a substituição do protocolo, orientando a 

implantação do TR-DPP® (Dual Path Plataform, Biomanguinhos, Brasil) com o 

antígeno recombinante rK28 (fusão das proteínas rK9, rK26 e rK39) como teste 

de triagem, e o teste de ELISA (EIE-Biomanguinhos, Brasil) como confirmatório.  

No entanto, pesquisadores apontam que os métodos sorológicos, 

utilizados para o diagnóstico de LVC, apresentam baixa sensibilidade 

ocasionando a manutenção dos animais infectados junto a população, 

colaborando com a manutenção do ciclo da doença (84,85). De acordo com 

Lopes et al. (85), em áreas endêmicas, um em cada cinco cães soronegativos 

estão infectados. Por outro lado, em áreas endêmicas, há grande exposição do 

cão ao parasita, ocasionando resultados sorológicos positivos, porém uma 

menor proporção desenvolve a doença (84). Por tanto, outras metodologias, 

principalmente as técnicas moleculares, têm sido amplamente estudadas e 

padronizadas. 

As técnicas moleculares, como a reação em cadeia da polimerase (PCR) 

e a PCR em tempo real (qPCR), são altamente sensíveis e específicas, e podem 

ser utilizadas em diferentes tipos de amostras, obtidas por meio de diversos tipos 

de procedimentos, invasivos ou menos invasivos, como em sangue periférico, 

swabs de lesão ativa, biópsias de linfonodo, baço, fígado e medula óssea 

(59,67,70,86). As amostras utilizadas podem ser provenientes de humanos (42), 

cães (87), flebotomíneos (88), animais silvestres (89), dentre outros. 

Existem diversas sequências alvos e protocolos de PCR para 

identificação do gênero e espécie de Leishmania. Os alvos mais frequentes são: 

as proteínas de choque térmico (70Dka heat shock proteins – hsp70), DNA do 

minicírculo do cinetoplasto (kDNA), subunidade do RNA ribossomal (SSUrRNA), 

gene da glicose-6-fosfato desidrogenase (g6pd), região de espaçadores 

transcritos internos (internal transcribed spacers - ITS), entre outros (90). Vários 

autores optam pelo alvo kDNA, devido ao seu elevado número de cópias por 

célula, aumentando a sensibilidade do ensaio (91). 



22 
 

A performance dos ensaios moleculares, para o diagnóstico, tem se 

mostrado melhor do que a microscopia ou cultura, particularmente em casos de 

baixa parasitemia como na LMC, em amostras obtidas de maneira menos 

invasiva como sangue e conjuntiva, em casos de coinfecção com HIV, recidivas 

e casos assintomáticos (39,59,42,92).  

Além disso, permitem acompanhar o tratamento instituído, verificar sua 

eficácia para que, posteriormente, os resultados negativos em ensaios 

moleculares possam indicar a cura clínica, por exemplo em casos de LV em 

humanos (93). Outra vantagem seria a capacidade de identificação da espécie 

envolvida, sendo importante para o prognóstico da doença, escolha do 

tratamento adequado e análises epidemiológicas, contribuindo para 

implementação de medidas de controle da doença (94).  

A utilização da qPCR possibilita a quantificação parasitária de uma 

maneira fidedigna, rápida, com menor risco de contaminação devido ao menor 

manuseio da amostra (95). Inicialmente utilizada em modelos animais, visando 

estudos experimentais para novos fármacos (96). 

 Aplicada em amostras caninas, onde foi evidenciado que o quadro clínico 

mais grave há uma maior carga parasitária nos gânglios linfáticos, indicando uma 

associação entre a quantidade de parasitas e as manifestações clínicas (97). 

Porém é controverso, pois, de acordo com Quaresma et al. (98), não houve 

diferenças significativas na carga parasitária entre animais sintomáticos e 

assintomáticos, sendo observado uma maior quantidade de Leishmania na 

medula óssea do que no sangue periférico. 

Em humanos, já foi descrito uma correlação entre uma maior carga 

parasitária com a presença de sinais clínicos (99) e uma associação com a 

resposta imune do indivíduo, importante para estudos sobre a patogenia da 

doença. Segundo Verma et al. (100), demostraram que a alta carga parasitária 

na LV está relacionada com um alto nível de interleucina-10 (IL-10), indicando-o 

como um marcador de severidade da doença. Além disso, a qPCR é bastante 

relevante e útil para monitorar a progressão da doença, após o início do 

tratamento, já evidenciado em casos com coinfecção com HIV (94, 101). 



23 
 

No Brasil, o Programa de Vigilância e Controle da LV (PVCLV), do 

Ministério da saúde, prevê medidas que possam diminuir a morbidade e 

letalidade e controlar o avanço das leishmanioses no país. Medidas que 

recomendam o controle vetorial, identificação e eliminação dos reservatórios 

caninos por meio dos inquéritos sorológicos, aperfeiçoamento das metodologias 

diagnósticas e rápida disponibilidade ao tratamento (46). 

Entretanto, há mais de 50 anos as mesmas estratégias são aplicadas e 

não foi possível reduzir a incidência da doença a um nível aceitável (46,60,102). 

Pelo contrário, os casos continuam aumentando e a doença se expandindo 

geograficamente (60,103). Atualmente no estado de São Paulo, existem 82 

municípios com transmissão humana e canina, seis com transmissão humana e 

47 com transmissão canina (104).  

Existe a necessidade de implantação de novas medidas para o controle 

da doença. Segundo Werneck (46), ações mais abrangentes como melhoria no 

tratamento dos pacientes com LV, ações educativas voltada à população, 

investimento em saneamento ambiental e priorizar pesquisa científica para guiar 

a incorporação de novas ferramentas de controle. 

 As geotecnologias são ferramentas úteis para o controle das doenças e, 

cada vez mais, estão sendo empregadas em saúde pública. Acarreta um melhor 

planejamento, monitoramento e avaliação das ações de saúde, 

consequentemente, redução nos gastos públicos e melhoria na implantação de 

novas políticas públicas (105, 106). 

O geoprocessamento é um conjunto de técnicas de coleta, tratamento e 

exibição de informações referenciadas em uma determinada área geográfica. 

Pode-se citar o sensoriamento remoto, digitalização dos dados, automação de 

tarefas cartográficas, sistema de posicionamento global (GPS) e o sistema de 

informação geográfica (SIG) (107). O SIG possui capacidade de integrar 

diferentes níveis de informações (vetoriais, de superfície, endereços), permitindo 

a apresentação e associação dos dados em diferentes formas (tabelas, gráficos 

e mapas) (106). 

Algumas vantagens da utilização das técnicas de geoprocessamento é a 

possibilidade de uma análise da difusão espacial das doenças e sua relação com 



24 
 

o meio ambiente, além da avaliação da saúde da população e na identificação 

de regiões sob alto risco de adoecer (106,108). 

A utilização do geoprocessamento para as leishmanioses é descrita por 

diversos autores. Souza et al. (109) realizaram uma análise de aglomerados 

espaço-temporais de LV em Bauru no período de junho de 2003 a outubro de 

2008 e verificaram que a doença estava aglomerada na região sudoeste. Ortiz e 

Anversa (110) também identificaram os principais bairros acometidos com LV, 

entre 2004 e 2012. Outras cidades no estado de São Paulo e Minas Gerais já 

realizaram estudos desta natureza (111, 112, 113). 

Áreas com altas taxas de prevalência de LVC, significam maior risco para 

a população humana, por essa razão, o geoprocessamento dos casos de 

infecção canina também é de grande importância para o controle da doença. 

Camargo-Neves et al. (114) realizaram uma análise espacial da LV, no munícipio 

de Araçatuba (SP), (1998- 1999) e associaram os setores em que há ocorrência 

de infecção humana com locais com altas taxas de prevalência de infecção 

canina. Bavia et al. (115), reforçam uma forte correlação entre a presença de 

cães positivos e de indivíduos acometidos com a doença, significando que os 

cães são os principais elos da cadeia epidemiológica. 

O conhecimento espacial tanto de casos humanos quanto caninos é 

importante para um controle efetivo da doença na região, principalmente em 

áreas endêmicas. Vários estudos demonstraram associações entre as 

características socioeconômicas como saneamento inadequado, baixa 

alfabetização e baixa renda e características ambientais como alta densidade de 

vegetação e o processo de urbanização com a presença da doença (116, 117, 

118). A realização de análises espaciais das leishmanioses e associações com 

diversos fatores contribuem para delimitações de áreas com maior risco à 

população.  

Com o passar dos anos, grandes avanços científicos foram alcançados 

em relação ao diagnóstico, tratamento e prevenção das leishmanioses, 

colaborando com a implementação e manutenção dos programas de controle. 

Entretanto, verifica-se ainda uma expansão de casos autóctones no país. Em 

vista disso, estudos que visam comparar as técnicas utilizadas para diagnóstico 



25 
 

e propor novas metodologias, como forma alternativa e/ou complementar, são 

de extrema importância. Além disso, o município de Bauru, área endêmica e um 

polo regional com papel importante na disseminação da LV, não possui trabalhos 

recentes de geoprocessamento de casos humanos e caninos. Assim, as análises 

espaciais da infecção irão colaborar com o um melhor planejamento de ações 

de vigilância e otimização de recursos públicos, contribuindo com a diminuição 

da incidência e prevalência da doença na região. 

 

 

 

 
 

 

 

 

 
 
 

 

 



26 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Objetivos 
 



27 
 

Objetivos 

 Realizar o diagnóstico parasitológico, sorológico e molecular de infecções 

por Leishmania spp. em amostras de cães e humanos provenientes dos 

municípios da região de Bauru, São Paulo, Brasil; 

 Comparar as técnicas diagnósticas para a pesquisa de Leishmania spp.; 

 Quantificar a carga parasitária em amostras dos cães e humanos; 

 Realizar o geoprocessamento das amostras humanas e caninas 

provenientes de novos casos no município de Bauru, entre 2014 e 2016. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



28 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Referências  



29 
 

Referências2 

1. World Health Organization. Zoonoses [Internet]. Geneva: WHO; 2018 

[acesso em 05 Janeiro 2018]. Disponível em: 

http://www.who.int/topics/zoonoses/en. 

2. Jones KE, Patel N, Levy M, Storeygard A, Balk D, Gittleman JL, et al. 

Global trends in emerging infectious diseases. Nature. 2008;451:990-4. 

3. United States Agency for International Development. Emerging pandemic 

threats [Internet]. USA: USAID; 2016 [citado 6 Jan 2018]. Disponível em: 

https://www.usaid.gov/news-information/fact sheets/emerging-pandemic-

threats-program. 

4. Cutler SJ, Fooks AR, Van Der Poel WHM. Public health threat of new, 

reemerging, and neglected zoonoses in the industrialized world. Emerg Infect 

Dis. 2010;16(1):1–7. 

5. Zanella JRC. Zoonoses emergentes e reemergentes e sua importância 

para saúde e produção animal. Pesqui Agropec Bras. 2016;51(5):510–9. 

6. Oryan A, Akbari M. Worldwide risk factors in leishmaniasis. Asian Pac J 

Trop Med. 2016;9(10):925-32. 

7. Organização Pan-Americana da Saúde. Relatório da OMS informa 

progressos sem precedentes contra doenças tropicais negligenciadas [Internet]. 

Brasília: PAHO; 2017 [citado 10 Jan 2018]. Disponível em: 

http://www.paho.org/bra/index.php?option=com_content&view=article&id=5401:

relatorio-da-oms-informa-progressos-sem-precedentes-contra-doencas-

tropicais-negligenciadas&Itemid=812. 

8. World Health Organization. Neglected tropical diseases [Internet]. 

Geneva: WHO; 2018 [citado 7 Jan 2018]. Disponível em: 

http://www.who.int/neglected_diseases/diseases/en/. 

                                                           
2 Segundo normas Vancouver: International Committee of Medical Journal Editors. Uniform 
Requirements for Manuscripts Submitted to Biomedical Journal: sample references [Internet]. 
Bethesda: U. S. National Library of Medicine; 2009 [update 2009 May 12; cited 2009 Set 10]. 
Available from: http://www.nlm.nih.gov.bsd. uniform_requirements.html.   



30 
 

9. Fundação Oswaldo Cruz. Doenças Negligenciadas [Internet]. Rio de 

Janeiro: Fiocruz; 2018 [citado 5 Mar 2018]. Disponível em: 

https://agencia.fiocruz.br/doen%C3%A7as-negligenciadas. 

10. Brasil. Ministério da Saúde. Departamento de Ciência e Tecnologia, 

Secretaria de Ciência, Tecnologia e Insumos Estratégicos. Doenças 

negligenciadas: estratégias do Ministério da Saúde. Rev Saude Publica. 

2010;44(1):200-2. 

11. Organização Pan-Americana da Saúde. Leishmaniosis [Internet]. 

Washington: PAHO; 2017 [citado 10 Jan 2018]. Disponível em: 

http://www.paho.org/hq/index.php?option=com_content&view=article&id=9417&

Itemid=40250&lang=en. 

12. Desjeux P. Leishmaniasis: current situation and new perspectives. Comp 

Immun Microbiol Infect Dis. 2004;(27):305-18. 

13. World Health Organization. Leishmaniosis [Internet]. Geneva: WHO; 2018 

[citado 10 Mar 2018]. Disponível em: http://www.who.int/en/news-room/fact-

sheets/detail/leishmaniasis. 

14. Brasil. Ministério da Saúde. Estudo sobre carga de doença no Brasil: 

estado atual e perspectivas [Internet]. Brasília: Ministério da Saúde; 1998 [citado 

12 Jan 2018]. Disponível em: 

http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/Pesquisa_Saude/tela16_2.html. 

15. Gontijo B, Carvalho MDR. Leishmaniose tegumentar americana. Rev Soc 

Bras Med Trop. 2003;36(1):71-80.  

16. Lainson R, Shaw JJ. Evolution, classification and geographical 

distribution. In: Peters W, Killick-Kendrick R, editors. The leishmaniases in 

biology and medicine. London: Academic Press; 1987. p. 12-120. 

17. Cupolillo E, Medina-Acosta E, Noyes H, Momen H, Grimaldi Jr G. A 

revised Classification for Leishmania and Endotrypanum. Parasitol Today. 

2000;16(4):142-4. 



31 
 

18. Akhoundi M, Kuhls K, Cannet A, Votýpka J, Marty P, Delaunay P, et al. 

historical overview of the classification, evolution, and dispersion of Leishmania 

parasites and sandflies. PLoS Negl Trop Dis. 2016;10(3):1-40. 

19. Simpson L. The mitochondrial genome of kinetoplastid protozoa: genomic 

organization, transcription, replication, and evolution. Annu Rev Microbiol. 

1987;41:363-82. 

20. Shapiro TA, Englund PT. The structure and replication of kinetoplast DNA. 

Annu Rev Microbiol. 1995;49:117-43. 

21. David CV, Craft N. Cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis. 

Dermatol Ther. 2009;22:491-502. 

22. Real F, Vidal RO, Carazzolle MF, Mondego JMC, Costa GGL, Herai RH, 

et al. The genome sequence of Leishmania (Leishmania) amazonensis: 

Functional annotation and extended analysis of gene models. DNA Res. 

2013;20(6):567-81. 

23. Peacock CS, Seeger K, Harris D, Murphy L, Ruiz JC, Quail MA, Peters N, 

et al. Comparative genomic analysis of three Leishmania species that cause 

diverse human disease. Nat Genet. 2007;39(7):839-47. 

24. Brasil. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. 

Departamento de Vigilância Epidemiológica. Manual de vigilância e controle de 

leishmaniose visceral. Brasília: Ministério da Saúde; 2014.  

25. Bates PA. Transmission of Leishmania metacyclic promastigotes by 

phlebotomine sand flies. Int J Parasitol. 2007;37:1097-106. 

26. Kaye P, Scott P. Leishmaniasis: complexity at the host-pathogen interface. 

Nat Rev Microbiol. 2011;9(8):604-15. 

27. Galvis-Ovallos F, Da Silva MD, Da Silva Bispo GB, De Oliveira AG, 

Goncalves Neto JR, Malafronte RS, et al. Canine visceral leishmaniasis in the 

metropolitan area of Sao Paulo: Pintomyia fischeri as potential vector of 

Leishmania infantum. Parasite. 2017;24(2):1-10. 



32 
 

28. Brasil. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. 

Departamento de Vigilância Epidemiológica. Manual de vigilância da 

leishmaniose tegumentar. Brasília: Ministério da Saúde; 2017. 

29. Silveira FT, Lainson R, Corbett CEP. Clinical and immunopathological 

spectrum of American cutaneous leishmaniasis with special reference to the 

disease in Amazonian Brazil – a Review. Mem Inst Oswaldo Cruz. 

2004;99(3):239-51. 

30. Vries HJC, Reedijk SH, Schallig HDFH.  Leishmaniasis: Recent 

developments in diagnosis and management. Am J Clin Dermatol. 

2015;16(2):99-109. 

31. Brasil. Ministério da Saúde. Casos de Leishmaniose Tegumentar. Brasil, 

grandes regiões e unidades federadas. 1990 a 2016 [Internet]. Brasília: 

Ministério da Saúde; 2017 [citado 15 Jan 2018]. Disponível em: 

http://portalarquivos2.saude.gov.br/images/pdf/2017/setembro/14/LT-

Casos.pdf. 

32. Brasil. Ministério da Saúde. Coeficiente de detecção de casos de 

Leishmaniose Tegumentar por 100.000 habitantes. Brasil, grandes regiões e 

unidades federadas. 1990 a 2016 [Internet]. Brasília: Ministério da Saúde; 2017 

[citado 15 jan 2018]. Disponível em: 

http://portalarquivos2.saude.gov.br/images/pdf/2017/setembro/14/LT-Coef-

Deteccao.pdf. 

33. Brasil. Ministério da Saúde. Leishmaniose tegumentar americana (LTA). 

[Internet]. Brasília: MS; 2017 [citado 15 jan 2018]. Disponível em: 

http://portalms.saude.gov.br/saude-de-a-z/leishmaniose-tegumentar-americana-

lta. 

34. Rangel EF, Lainson R. Proven and putative vectors of American 

cutaneous leishmaniasis in Brazil: aspects of their biology and vectorial 

competence. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2009;104:937-54. 

35. Torres-Guerrero E, Quintanilla-Cedillo MR, Ruiz-Esmenjaud J, Arenas R. 

Leishmaniasis: a review. F1000 Res. 2017;6:750. 



33 
 

36. Barata RB. Cem anos de endemias e epidemias. Cienc Saude Colet. 

2000;5(2):333-45. 

37. São Paulo. Secretaria do Estado de São Paulo. Leishmaniose 

Tegumentar Americana [Internet]. São Paulo: Secretaria do Estado de São 

Paulo; 2017 [citado 20 Jan 2018]. Disponível em: 

http://www.saude.sp.gov.br/resources/cve-centro-de-vigilancia-

epidemiologica/areas-de-vigilancia/doencas-de-transmissao-por-vetores-e-

zoonoses/dados/lta/gve0717_not_res.htm. 

38. São Paulo. Secretaria do Estado de São Paulo. Leishmaniose 

Tegumentar Americana [Internet]. São Paulo: Secretaria do Estado de São 

Paulo; 2017 [citado 20 Jan 2018]. Disponível em: 

http://www.saude.sp.gov.br/resources/cve-centro-de-vigilancia-

epidemiologica/areas-de-vigilancia/doencas-de-transmissao-por-vetores-e-

zoonoses/dados/lta/10lta9817_casos_conf.pdf. 

39. Reithinger R, Dujardin JC, Louzir H, Primez C, Alexander B, Brooker S. 

Cutaneous leishmaniasis. Lancet Infect Dis. 2007;7(9):581-96.  

40. Membrive NA, Kazuma FJ, Silveira TGV, Teixeira JJV, Reinhold-Castro 

KR, Teodoro U. Disseminated cutaneous leishmaniasis caused by Leishmania 

braziliensis in Southern Brazil. Rev Inst Med Trop São Paulo. 2017;59:e37. 

41. Machado-Coelho GLL,  Caiaffa WT, Genaro Odair,  Magalhães PA,  

Mayrink W. Risk factors for mucosal manifestation of American cutaneous 

leishmaniasis. Trans R Soc Trop Med Hyg. 2005;99(1):55–61. 

42. Hossain F, Ghosh P, Khan MAA, Duthie MS, Vallur AC, Picone A, et al. 

Real-time PCR in detection and quantitation of Leishmania donovani for the 

diagnosis of Visceral Leishmaniasis patients and the monitoring of their response 

to treatment. PLoS One. 2017;12(9):e0185606. 

43. Savoia D. Decent updates and perspectives on leishmaniasis. J Infect Dev 

Ctries. 2015;9(6):588-96. 

44. Alvar J, Velez ID, Bern C, Herrero M, Desjeux P, Cano J, et al. 

Leishmaniasis worldwide and global estimates of its incidence. PLoS One. 

2012;7(5):e35671.  



34 
 

45. Organização Pan-Americana da Saúde. Informe Epidemiológico das 

Américas [Internet]. Washington: PAHO; 2018 [citado 15 Fev 2018]. Disponível 

em: 

http://iris.paho.org/xmlui/bitstream/handle/123456789/34857/LeishReport6_por.

pdf?sequence=1&isAllowed=y. 

46. Werneck GL. Controle da leishmaniose visceral no Brasil: o fim de um 

ciclo? Cad Saude Publica. 2016;2(6):eED010616. 

47. Santa Catarina. Diretoria de Vigilância Epidemiológica. Dive/SC orienta 

sobre medidas de prevenção da leishmaniose visceral [Internet]. Santa Catarina: 

Dive/SC; 2017 [citado 20 Jan 2018]. Disponível em: 

http://www.dive.sc.gov.br/index.php/arquivo-noticias/579-dive-sc-orienta-sobre-

medidas-de-da-leishmaniose-visceral. 

48. Brasil. Ministério da Saúde. Casos confirmados de Leishmaniose Visceral, 

Brasil, grandes regiões e unidades federadas. 1990 a 2016 [Internet]. Brasília: 

MS; 2017 [citado 20 Jan 2018]. Disponível em: 

http://portalarquivos2.saude.gov.br/images/pdf/2017/setembro/14/LV-Casos.pdf 

49. Brasil. Ministério da Saúde. Coeficiente de incidência de Leishmaniose 

Visceral, por 100.000 habitantes. Brasil, grandes regiões e unidades federadas. 

1990 a 2016 [Internet]. Brasília: MS; 2017 [citado 20 Jan 2018]. Disponível em: 

http://portalarquivos2.saude.gov.br/images/pdf/2017/setembro/14/LV-

Coef_Incidncia.pdf. 

50. Sevá ADP, Mao L, Galvis Ovallos F, Tucker Lima JM, Valle D. Risk 

analysis and prediction of visceral leishmaniasis dispersion in São Paulo State, 

Brazil. PLoS Negl Trop Dis. 2017;11(2):e0005353.  

51. Cardim MFM, Rodas LAC, Dibo MR, Guirado MM, Oliveira AM, 

Chiaravalloti Neto F. Introdução e expansão da leishmaniose visceral americana 

em humanos no Estado de São Paulo, 1999-2011. Rev Saude Publica. 

2013;47(4):691-700. 

52. São Paulo. Grupo de Vigilância Epidemiológica. Casos confirmados de 

Leishmaniose Visceral segundo LPI e ano de notificação, Estado de São Paulo, 

2014 a 2017 [Internet]. São Paulo: Grupo de Vigilância Epidemiológica; 2018 



35 
 

[citado 20 Fev 2018]. Disponível em: http://www.saude.sp.gov.br/resources/cve-

centro-de-vigilancia-epidemiologica/areas-de-vigilancia/doencas-de-

transmissao-por-vetores-e-zoonoses/dados/leish/lv1417_lpi.pdf. 

53. Ciaravolo RMC, Oliveira SS, Hiramoto RM, Henriques LM, Taniguchi HH, 

Junior AV, et al. Epidemiological classification of cities according to the program 

of surveillance and control of visceral leishmaniasis in the State of São Paulo. 

Updated in December 2014. BEPA. 2015;12(143):9-22. 

54. Santos SO, Arias J, Ribeiro AA, Hoffmann MP, Freitas RU, Malacco MAF. 

Incrimination of Lutzomyia cruzi as a vector of American Visceral Leishmaniasis. 

Med Vet Entomol. 1998;12:315-7. 

55. Missawa NA, Lima GBM. Distribuição especial de Lutzomyia longipalpis 

(Lutz & Neiva, 1912) e Lutzomya cruzi (Mangabeira, 1938) no estado de Moto 

Grosso. Rev Soc Bras Med Trop. 2006;39(4):337-40. 

56. Carvalho MR, Valença HF, Silva FJ, Pita-Pereira D, Araújo Pereira T, 

Britto C, et al. Natural Leishmania infantum infection in Migonemyia migonei 

(Franca,1920) (Diptera: Psychodidae: Phlebotominae) the putative vector of 

visceral leishmaniasis in Pernambuco State, Brazil. Acta Trop. 2010;116:108-10. 

57. Guimarães VC, Pruzinova K, Sadlova J, Volfova V, Myskova J, Brandão 

Filho SP, et al. Lutzomyia migonei is a permissive vector competent for 

Leishmania infantum. Parasit Vectors. 2016;9:159. 

58. Figueiró Filho EA, Uehara SNO, Senefonte FRA, Lopes AHA, Geraldo 

Duarte, Beitune PE. Visceral leishmaniasis (kala-azar) and pregnancy: a case 

report. Rev Bras Ginecol Obstet. 2005;27(2):92-7. 

59. Lindoso JAL, Cunha MA, Queiroz IT, Moreira CHV. Leishmaniasis–HIV 

coinfection: current challenges. HIV AIDS (Auckl). 2016;8:147-56. 

60. Dantas-Torres F, Brandão-Filho SP. Visceral leishmaniasis in Brazil: 

revisiting paradigms of epidemiology and control. Rev Inst Med Trop São Paulo. 

2006;48(3):151-6. 

61. Langoni H, Richini-Pereira VB, Scremin C, Troncarelli MZ, Camargo JB, 

Machado JG, et al. Detecção molecular de Leishmania spp. em material de 



36 
 

hemocultura, e diagnóstico sorológico para leishmaniose em cães procedentes 

do bairro da Conquista, São Manuel-São Paulo, Brasil. Vet Zootec. 

2015;22(4):580-90.  

62. Marcondes M, Rossi CN. Visceral leishmaniasis in Brazil. Braz J Vet Res 

Anim Sci. 2013;50(5):341-52. 

63. Baneth G, Koutinas AF, Solano-Gallego L, Bourdeau P, Ferrer L. Canine 

leishmaniosis – new concepts and insights on an expanding zoonosis: part one. 

Trends Parasitol. 2008;24(7):324-30. 

64. Palatnik-de-Sousa CB, Santos WR, França-Silva JC, Costa RT, Reis AB, 

Palatnik M, et al. Impact of canine control on the epidemiology of canine and 

human visceral leishmaniasis in Brazil. Am J Trop Med Hyg. 2001;65(5):510-7. 

65. Richini-Pereira VB, Marson PM, Hayasaka EY, Victoria C, da Silva RC, 

Langoni H. Molecular detection of Leishmania spp. in road-killed wild mammals 

in the Central Western area of the State of São Paulo, Brazil. J Venomous Anim 

Toxins Includ Trop Dis [Internet]. 2014;20:27 [citado 20 Fev 2018]. Disponível 

em:http://doi.org/10.1186/1678-9199-20-27 et al.  

66. Roque ALR, Jansen AM. Wild and synanthropic reservoirs of Leishmania 

species in the Americas. Int J Parasitol Parasit  Wildl. 2014;3(3):251-62. 

67. Faria AR, Andrade HM. Diagnóstico da Leishmaniose Visceral Canina: 

grandes avanços tecnológicos e baixa aplicação prática. Rev Pan-Amaz Saúde. 

2012;3(2):47-57.  

68. São Paulo. Centro de Vigilância Epidemiológica "Prof. Alexandre Vranjac". 

Coordenadoria de Controle de Doenças, Secretaria do Estado da Saúde de São 

Paulo. Manual de vigilância e controle da leishmaniose visceral americana do 

Estado de São Paulo. São Paulo: Centro de Vigilância Epidemiológica "Prof. 

Alexandre Vranjac; 2006.  

69. Paixao MS. Análise espacial e detecção de tripanosomatídeos em animais 

de produção de região endêmica para leishmaniose visceral [tese]. Botucatu: 

Faculdade de Medicina de Botucatu, Universidade Estadual Paulista; 2017. 



37 
 

70. Paiva-Cavalcanti M, Morais RCS, Pessoa-e-Silva R, Trajano-Silva LAM, 

Gonçalves-de-Albuquerque SC, Tavares DHC, et al. Leishmaniases diagnosis: 

an update on the use of immunological and molecular tools. Cell Biosci. 

2015;5(31):1-10. 

71. Srivastava P, Dayama A, Mehrotra S, Sundar S. Diagnosis of visceral 

leishmaniasis. Trans R Soc Trop Med Hyg. 2011;105(1):1–6.  

72. Laurenti MD. Correlação entre o diagnóstico parasitológico e sorológico 

na leishmaniose visceral americana canina. BEPA. 2009;6(67):13-23. 

73. Dietze R. Diagnóstico sorológico e parasitológico da Leishmaniose 

Visceral. In: Organización Panamericana de la Salud. Consulta de Expertos 

OPS/OMS sobre Leishmaniasis Visceral em las Américas. Rio de Janeiro: 

PANAFTOSA; 2006. p. 63-5. 

74. Barroso-Freitas AP, Passos SR, Mouta-Confort E, Madeira MF, Schubach 

AO, Santos GPL, et al. Accuracy of na ELISA and indirect immunofluorescence 

for the laboratory diagnosis of American tegumentary leishmaniasis. Trans R Soc 

Trop Med Hyg. 2009;103:383-9. 

75. Goto H, Lindoso JA. Current diagnosis and treatment of cutaneous and 

mucocutaneous leishmaniasis. Expert Rev Anti Infect Ther. 2010;8:419–33. 

76. Assis TSM, Braga ASC, Pedras MJ, Barral AM, Siqueira IC, Costa CHN, 

et al. Validação do teste imunocromatográfico rápido IT-LEISH® para 

diagnóstico da leishmaniose visceral humana. Epidemiol Serv Saude. 

2008;17(2):107-16. 

77. Sundar S, Rai M. Laboratory diagnosis of Visceral Leishmaniasis. Clin 

Diagn Lab Immunol. 2002;9:951-8. 

78. Brasil. Unidade Técnica de Vigilância das Doenças de Transmissão 

Vetorial. Nota Informativa – CGDT/DEVIT/SVS/MS [Internet]. Brasília: MS; 2014 

[citado 2 Fev 2018]. Disponível em: 

http://portalarquivos2.saude.gov.br/images/pdf/2016/dezembro/29/Nota-

Tecnica---teste-rapido-humano-IT.pdf. 



38 
 

79. Brasil. Departamento de Vigilância das Doenças Transmissíveis. Nota 

Informativa Nº 3/2018-CGLAB/DEVIT/SVS/MS. Esclarecimentos sobre a 

mudança na marca do teste rápido imunocromatográfico ofertado para o 

diagnóstico da leishmaniose visceral humana no Sistema Único de Saúde (SUS). 

Brasília: Ministério da Saúde; 2018. 

80. Moura AS, Lopes HM, Mourao MV, Morais MH. Performance of a rapid 

diagnostic test for the detection of visceral leishmaniasis in a large urban setting. 

Rev Soc Bras Med Trop. 2013;46(5):589-93. 

81. Horst R, Tefera T, Assefa G, Ebrahim AZ, Davidson RN, Ritmeijer K. Field 

evaluation of rK39 test and direct agglutination test for diagnosis of visceral 

leishmaniasis in a population with high prevalence of human immunodeficiency 

virus in Ethiopia. Am J Trop Med Hyg. 2009;80:929-34.  

82. da Silva MRB, Brandão NAA, Colovati M, de Sousa MMP, de Lima LC, 

Dorta ML, et al. Performance of two immunochromatographic tests for diagnosis 

of visceral leishmaniasis in patients coinfected with HIV. Parasitol Res. 

2017;117(2):419-27. 

83. Brasil. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde, 

Departamento de Vigilância das Doenças Transmissíveis. Nota Técnica conjunta 

nº1, de 29 de dezembro de 2011. Esclarecimento sobre substituição do protocolo 

diagnóstico da leishmaniose visceral canina (LVC). Brasília: Ministério da Saúde; 

2011.  

84. Martinez V, Quilez J, Sanchez A, Roura X, Francino O, Altet L. Canine 

leishmaniasis: the key points for qPCR result interpretation. Parasit Vectors. 

2011;4:57. doi: 10.1186/1756-3305-4-57. 

85. Lopes EG, Sevá AP, Ferreira F, Nunes CM, Keid LB, Hiramoto RM, et al. 

Serological and molecular diagnostic tests for canine visceral leishmaniasis in 

Brazilian endemic area: one out of five seronegative dogs are infected. Epidemiol 

Infect. 2017;145(12):2436-44. 

86. Boni SM, Oyafuso LK, Soler RdC, Lindoso JAL. Efficiency of noninvasive 

sampling methods (swab) together with Polymerase Chain Reaction (PCR) for 



39 
 

diagnosing American Tegumentary Leishmaniasis. Rev Inst Med Trop São 

Paulo. 2017;59:e38. 

87. Rolim F, Carvalho FLN, Bello GL, Gehlen M, Halon ML, Lemos RR, et al. 

Leishmaniose Visceral Canina: Detecção de DNA em Soro por PCR em Tempo 

Real. Rev Iniciaç Cient ULBRA. 2016;14:36-46. 

88. Pita-Pereira D, Souza GD, Pereira TA, Zwetsch A, Britto C, Rangel EF. 

Lutzomyia (Pintomyia) fischeri (Diptera: Psychodidae: Phlebotominae), a 

probable vector of American cutaneous leishmaniasis: detection of natural 

infection by Leishmania (Viannia) DNA in specimens from the municipality of 

Porto Alegre (RS), Brazil, using multiplex PCR assay. Acta Trop. 2011;120:273-

5. 

89. Souza NP, Almeida ABPF, Freitas TPT, Paz RCR, Dutra V, Nakazato L, 

et al. Leishmania (Leishmania) infantum chagasi em canídeos silvestres 

mantidos em cativeiro, no Estado de Mato Grosso. Rev Soc Bras Med Trop. 

2010;43(3):333-5. 

90. Akhoundi M, Downing T, Votýpka J, Kuhls K, Lukeš J, Cannet A, et al. 

Leishmania infections: molecular targets and diagnosis. Mol Aspects Med. 

2017;57:1-29. 

91. Charles M, Françoise F, Laurie L, Henri D. Quantification of Leishmania 

infantum DNA by a Real-Time PCR Assay with High Sensitivity. J Clin Microbiol. 

2004;42(11):5249-55. 

92. Fraga TL, Brustoloni YM, Lima RB, Dorval ME, Oshiro ET, Oliveira J, et 

al. Polymerase chain reaction of peripheral blood as a tool for the diagnosis of 

visceral leishmaniasis in children. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2010;105(3):310-3. 

93. Maurya R, Singh RK, Kumar B, Salotra P, Rai M, Sundar S. Evaluation of 

PCR for Diagnosis of Indian Kala-Azar and Assessment of Cure. J Clin Microbiol. 

2005;43(7):3038-41. 

94. Reithinger R, Dujardin J-C. Molecular diagnosis of leishmaniasis: current 

status and future applications. J Clin Microbiol. 2007;45(1):21-5.  



40 
 

95. Vitale F, Reale S, Vitale M, Petrotta E, Torina A, Caracappa S. TaqMan‐

based detection of Leishmania infantum DNA using canine samples. Ann N Y 

Acad Sci. 2004;1026(1):139-43. 

96. Bretagne S, Durand R, Olivi M, Garin J-F, Sulahian A, Rivollet D, et la.  

Real-time PCR as a new tool for quantifying Leishmania infantum in liver in 

infected mice. Clin Diagn Lab Immunol. 2001;8(4):828-31. 

97. Manna L, Reale S, Vitale F, Gravino AE. Evidence for a relationship 

between Leishmania load and clinical manifestations. Res Vet Sci. 2009;87:76-

8. 

98. Quaresma PF, Murta SM, Ferreira Ede C, Rocha-Lima AC, Xavier AA, 

Gontijo CM. Molecular diagnosis of canine visceral leishmaniasis: identification 

of Leishmania species by PCR-RFLP and quantification of parasite DNA by real-

time PCR. Acta Trop. 2009;111:289-94. 

99. Mary C, Faraut F, Lascombe L, Dumon H. Quantification of Leishmania 

infantum DNA by a real-time PCR assay with high sensitivity. J Clin Microbiol. 

2004;42(11):5249-55. 

100. Verma S, Kumar R, Katara GK, Singh LC, Negi NS, Ramesh V, et al. 

Quantification of parasite load in clinical samples of leishmaniasis patients: IL-10 

level correlates with parasite load in visceral leishmaniasis. PLoS One. 

2010;5(4):e10107. 

101. Bossolasco S, Gaiera G, Olchini D, Gulletta M, Martello L, Bestetti A, et al. 

Realtime PCR assay for clinical management of human immunodeficiency vírus 

infected patients with visceral leishmaniasis. J Clin Microbiol. 2003;41(11):5080-

4. 

102. von Zuben APB, Donalísio MR. Dificuldades na execução das diretrizes 

do Programa de Vigilância e Controle da Leishmaniose Visceral em grandes 

municípios brasileiros. Cad Saude Publica. 2016;32(6):e00087415. 

103. Sevá AP, Mao L, Galvis-Ovallos F, Tucker Lima JM, Valle D. Risk analysis 

and prediction of visceral leishmaniasis dispersion in São Paulo State, Brazil. 

PLoS Negl Trop Dis. 2017;11(2):e0005353.  



41 
 

104. São Paulo. Grupo de Vigilância Epidemiológica. Classificação 

epidemiológica para Leishmaniose Visceral dos municípios do Estado de São 

Paulo, 1999 a 2015 [Internet]. São Paulo: Grupo de Vigilância Epidemiológica; 

2017 [citado 21 Mar 2018]. Disponível em: 

http://www.saude.sp.gov.br/resources/cve-centro-de-vigilancia-

epidemiologica/areas-de-vigilancia/doencas-de-transmissao-por-vetores-e-

zoonoses/dados/leish/lv_mapas.pdf.  

105. Najar AL, Marques EC. Saúde e espaço: estudos metodológicos e 

técnicas de análise. Rio de Janeiro: Fundação Oswaldo Cruz; 1998. 

106. Müller EL, Cubas MR, Bastos LC. Georreferenciamento como instrumento 

de gestão em unidade de saúde da família. Rev Bras Enferm. 2010;63(6):978-

82. 

107. Hino P, Villa TCS, Sassaki CM, Nogueira JA, Santos CB. 

Geoprocessamento Aplicado à Área da Saúde. Rev Lat Am Enfermagem. 

2006;14(6):1-5. 

108. Medronho RA, Werneck GL. Técnicas de análise espacial em Saúde. In: 

Medronho RA, Carvalho DM, Bloch KV, Luiz RR, Werneck GL, editores. 

Epidemiologia. São Paulo: Atheneu; 2004. p. 427-46. 

109. Souza VAF, Cortez LRPB, Dias RA, Amaku M, Ferreira Neto JS, Kuroda 

RBS, et al. Space-time cluster analysis of American visceral leishmaniasis in 

Bauru, São Paulo State, Brazil. Cad Saude Publica. 2012;28(10):1949-64.  

110. Ortiz  RC, Anversa L. Epidemiology of visceral leishmaniasis in Bauru, São 

Paulo, Brazil, 2004-2012: a descriptive study. Epidemiol Serv Saude. 

2015;24:97-104.  

111. Vieira CP, Oliveira AM, Rodas LAC, Dibo MR, Guirado MM, Chiaravalloti 

Neto F. Temporal, spatial and spatiotemporal analysis of the occurrence of 

visceral leishmaniasis in humans in the City of Birigui, State of São Paulo, from 

1999 to 2012. Rev Soc Bras Med Trop. 2014;47(3):350-8.  

112. Margonari C, Freitas CR, Ribeiro RC, Moura ACM, Timbó M, Gripp AH, et 

al. Epidemiology of visceral leishmaniasis through spatial analysis, in Belo 



42 
 

Horizonte municipality, state of Minas Gerais, Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz. 

2006;101(1):31-8. 

113. Silva TAM, Coura-Vital W, Barbosa DS, Oiko CSF, Morais MHF, Tourinho 

BD, et al. Spatial and temporal trends of visceral leishmaniasis by mesoregion in 

a southeastern state of Brazil, 2002-2013. PLoS Negl Trop Dis. 

2017;11(10):e0005950. 

114. Camargo-Neves VLF, Katz G, Rodas LAC, Poletto DW, Lage LC, Spínola 

RMF, et al. Utilização de ferramentas de análise especial na vigilância 

epidemiológica de leishmaniose visceral americana – Araçatuba, São Paulo, 

Brasil, 1998-1999. Cad Saúde Pública. 2001;17(5):1263-7. 

115. Bavia ME, Carneiro DD, Gurgel HC, Madureira Filho C, Barbosa MG. 

Remote sensing and geographic information systems and risk of American 

visceral leishmaniasis in Bahia, Brazil. Parassitologia. 2005;47:165-9. 

116. da Silva JP, Werneck, GL, Macedo EC, Carvalho H, Cruz MSP. Factors 

associated with Leishmania chagasi infection in domestic dogs from Teresina, 

State of Piauí, Brazil. Rev Soc Bras Med Trop. 2012;45(4):480-4.  

117. Alvar J, Yactayo S, Bern C. Leishmaniasis and poverty. Trends Parasitol. 

2006;22(12):552-7. 

118. Figueiredo ABF, Werneck GL, Pires MS, Cruz MSP, Silva JP, Almeida AS. 

Uso e cobertura do solo e prevalência de leishmaniose visceral canina em 

Teresina, Piauí, Brasil: uma abordagem utilizando sensoriamento remoto orbital. 

Cad Saude Publica. 2017;33(10):e00093516. 

 

 

 

 

 

 

 



43 
 

 

 

 

 

 
 
 
 
 
 
 
 

Capítulo II 
 



44 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Artigo Científico 1 
 



45 
 

Comparison of different laboratory techniques for diagnosis of Leishmania 1 

spp. in human and canine samples from municipalities in the Center-West 2 

region of the state of São Paulo, Brazil. 3 

 4 

Livia Carla Ramos Augustoa,b, Bárbara Suares de Almeidab, Debora de Oliveira 5 

Losnakb, Kethlyn Magliani de Figueiredob, Luciana da Silva Ruizb, Laís Anversab, 6 

Samea Fernandes Joaquimc, Jose Eduardo Tolezanod, Diego Borin Nóbregae, 7 

Virgínia Bodelão Richini-Pereiraa,b. 8 

a Department of Tropical Diseases and Imaging Diagnosis, Botucatu Medical 9 

School, Paulista State University – UNESP Univ Estadual Paulista; District of 10 

Rubião Júnior s/n, Botucatu, SP 18618-000, Brazil.  11 

b Adolfo Lutz Institute, Regional Laboratory of Bauru, SP, Brazil, Rubens Arruda 12 

St., 6. Altos da Cidade, Bauru, SP 17015-110, Brazil.  13 

c Department of Veterinary Hygiene and Public Health, School of Veterinary 14 

Medicine and Animal Science, Paulista State University - UNESP, Cx. Postal 560, 15 

District of Rubião Júnior 11 s/n, Botucatu, SP 18618-000, Brazil.  16 

d Adolfo Lutz Institute, Center of Parasitology and Micology, São Paulo, SP, 17 

Brazil, Dr. Arnaldo Avenue, 355, São Paulo, SP, 01246-000, Brazil. 18 

e Department of Production Animal Health, Faculty of Veterinary Medicine, 19 

University of Calgary, 2500 University Drive N.W., Calgary, Alberta, Canada. 20 

*Author for correspondence: 21 

Virgínia Bodelão Richini Pereira (virichini@yahoo.com.br) 22 

Adolfo Lutz Institute, Regional Laboratory of Bauru 23 

Rubens Arruda St., 6. – Bauru – SP – Brazil, CEP: 17015-110 27  24 

Key words: leishmaniasis, diagnosis, polymerase chain reaction  25 

Periodical: Nº D-18-12556, Veterinary Parasitology (Qualis Medicina II – B1). 26 

 27 



46 
 

Abstract 28 

Leishmaniases are vector-borne diseases caused by obligate intracellular 29 

protozoan parasites of the genus Leishmania. The main diseases are: visceral 30 

(VL) and tegumentary (TL). Dogs are the major urban reservoirs of visceral 31 

leishmaniasis. The aims of the present study were to compare the conventional 32 

laboratory techniques used for the diagnosis of Leishmania spp. in human and 33 

canine blood samples with the molecular techniques and carry out the 34 

quantification of the parasite load.  Twenty-six human samples with clinical 35 

suspicion of VL were evaluated through direct parasitological in bone marrow 36 

aspirate, rapid immunochromatographic test (RT), indirect immunofluorescent 37 

antibody test (IFAT), polymerase chain reaction (PCR) and real-time PCR 38 

(qPCR). In addition, twenty-two human samples with clinical suspicion TL were 39 

selected for the accomplishment of IFAT, PCR and qPCR. The canine samples 40 

were obtained through serological investigations carried out in 4,725 dogs by the 41 

Center for Zoonoses Control (CCZ) in Bauru, and by means of the positivity in 42 

RT (RT-DPP®) was realized the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), 43 

PCR and qPCR. In the twenty-six human samples analyzed for VL, the positivity 44 

obtained in parasitological, RT, IFAT, PCR and qPCR were: 80.8%, 80.8%, 45 

73.1%, 84.6% and 84.6%. IFAT was the methodology that obtained less positivity 46 

and agreement with other methodologies. The parasite load was concentrated 47 

between 100 and 1,000 parasites/mL (68.2%) and there was no significant 48 

association with sex and age. In the twenty-two human samples analyzed for TL, 49 

the positivity obtained in the IFAT, PCR and qPCR were: 9.1%, 18.2 and 18.2%. 50 

The IFAT obtained lower positivity and negligible agreement with the molecular 51 

techniques and the parasite load of the samples were concentrated between 100 52 

and 1,000 parasites/mL (100%). In the canine samples, 11.5% (543/4,725) of 53 

positivity were obtained for both techniques (RT-DPP® and ELISA). In RT-DPP® 54 

positive dogs, positivity in ELISA, PCR and qPCR were: 64.9%, 63.9% and 65%. 55 

The agreement was excellent between ELISA and molecular techniques. The 56 

parasite load was concentrated between 1,000 and 10,000 parasites/ml (73.9%). 57 

Molecular techniques in blood samples consist in a less invasive diagnostic 58 

alternative for both VL and TL in humans and, in dogs, can be used both for 59 

diagnosis and to complement the serological results. 60 



47 
 

Highlights  61 

 Leishmaniases in humans and dogs represent an important public health 62 

problem. 63 

 Comparation the conventional laboratory techniques and molecular 64 

techniques. 65 

 Molecular techniques in blood samples consist in a less invasive 66 

diagnostic for leishmaniasis. 67 

 68 

1. Introduction  69 

Leishmaniases are vector-borne diseases caused by obligate intracellular 70 

protozoan parasites of the genus Leishmania (Kinetoplastida, 71 

Trypanosomatidae) (Gontijo and Carvalho, 2003). Leishmaniases are endemic in 72 

98 countries and approximately 12 million people are infected and 350 million 73 

people are at risk (Desjeux, 2004; PAHO, 2017). They represent an important 74 

public health problem, due to its constant geographic expansion and tendency 75 

towards urbanization, previously restricted to rural areas and, today, observed in 76 

large urban centers (Werneck, 2010). 77 

Leishmaniasis represents a group of distinct diseases, being the main 78 

ones: visceral leishmaniasis (VL) and tegumentary leishmaniasis (TL). In Brazil, 79 

the main species involved in VL is Leishmania infantum (syn. chagasi) and, in TL, 80 

Leishmania braziliensis, Leishmania guyanensis and Leishmania amazonensis 81 

(Ministério da Saúde, 2014; Ministério da Saúde, 2017a).  82 

According to the Ministry of Health, between 2000 and 2016, 398,103 83 

cases of TL and 58,300 cases of VL were confirmed in the country (Ministério da 84 

Saúde, 2017b; Ministério da Saúde, 2017c). In the state of São Paulo (2014 - 85 

2016), 1,128 cases of TL and 384 cases of VL, with 33 deaths, were confirmed, 86 

and only Bauru city, located in the Midwest, was responsible for 19% VL (Centro 87 

de Vigilância Epidemiológica do Estado de São Paulo, 2017a; Centro de 88 

Vigilância Epidemiológica do Estado de São Paulo, 2017b). Bauru city is 89 

considered a regional pole with an important role in the dissemination and 90 

expansion of VL (Cardim et al., 2013) and the high incidence of the disease in 91 



48 
 

the region indicates the need of studies that compare the different techniques 92 

used for diagnosis and evaluate inclusion of new methodologies. 93 

Dogs (Canis familiaris) are considered the main urban reservoirs of VL due 94 

to their great susceptibility to infection by the parasite, high parasitemia in the 95 

skin and close relationship with humans (Dantas-Torres and Brandão-Filho, 96 

2006). This animals are an important target for epidemiology and for VL control 97 

programs, since canine infection usually precedes human infection (Oliveira et 98 

al., 2001). The high prevalence of asymptomatic dogs in endemic areas can 99 

reach 60% to 80% of the infected population, requiring increasingly sensitive and 100 

specific methodologies for the correct identification of these animals, in order to 101 

obtain a more effective control of the disease (Marcondes et al. al., 2013). 102 

 The diagnosis of leishmaniasis is performed by an association of clinical, 103 

epidemiological and laboratory information. Conventional laboratory techniques 104 

used, as the parasitological and serological methods, have their limitations and, 105 

increasingly, molecular techniques are being explored and used as a 106 

complement and/or an accurate diagnostic alternative (de Paiva-Cavalcanti et al., 107 

2015; Ghasemian et al., 2016). 108 

Polymerase chain reaction (PCR) and real-time PCR (qPCR) are highly 109 

sensitive and specific methodologies and can be used for both diagnosis and 110 

treatment follow-up, in addition of being a useful tool for diagnosis in cases of low 111 

parasitic load, cases of HIV co-infection, relapsed and asymptomatic cases 112 

(Reithinger e Dujardin, 2007; Fraga et al., 2010; Lindoso et al., 2016; Houssain 113 

et al., 2017). Other advantages include the ability to identify the species involved 114 

and parasite quantification, important for the prognosis of the disease, choice of 115 

appropriate treatment and epidemiological analysis (Reithinger and Dujardin, 116 

2007). 117 

Considering that Bauru region is endemic for leishmaniasis, the present 118 

study aimed to compare the conventional techniques used for the diagnosis of 119 

Leishmania spp. in human and canine blood samples, with the molecular 120 

techniques and perform the quantification of the parasite load. 121 

 122 



49 
 

2 Material and methods 123 

2.1 Ethical statement 124 

The present study was approved by the Ethics Committee on the use of 125 

Animals (Comissão de Ética no Uso de Animais - CEUA) n. 10/2014 and 126 

Research Ethics Committee of Adolfo Lutz Institute (Comitê de Ética em 127 

Pesquisa do Instituto Adolfo Lutz - CEPIAL) n. 1.131.447. 128 

2.2 Area of study 129 

The Adolfo Lutz Institute (Instituto Adolfo Lutz - IAL) is a National 130 

Laboratory in Public Health, which focuses on diagnostic, sanitary and 131 

epidemiological surveillance. The IAL - Regional Laboratory of Bauru (IAL CLR-132 

Bauru) operates in 38 cities in the Midwest part of São Paulo state (Figure 1) and 133 

attends several programs such as the surveillance and control program for 134 

visceral leishmaniasis (Programa de Vigilância e Controle da Leishmaniose 135 

Visceral – PVCLV). 136 

 137 

 138 

Fig. 1. Map with the location of the 38 cities in the Midwest of the state of São Paulo 139 

served by Adolfo Lutz Institute, highlighted Bauru city, São Paulo, Brazil. 140 



50 
 

2.3 Human Samples 141 

 Human samples, forwarded to the IAL CLR-Bauru, were analyzed through 142 

a previous suggestive clinical condition of VL and TL. Patients with relapsed 143 

and/or HIV co-infection were not included in the study, only cases with suspected 144 

primary infection. Twenty-six human cases with clinical suspicion of VL were 145 

selected to perform routine laboratory techniques, direct parasitological in bone 146 

marrow aspirate, immunochromatographic test or rapid test (RT), and indirect 147 

immunofluorescent antibody test (IFAT), and molecular techniques as 148 

complementary methodologies, polymerase chain reaction (PCR) and real-time 149 

PCR (qPCR). In addition, twenty-two human cases with clinical suspicion of TL 150 

were selected to perform the routine laboratory technique, IFAT, and molecular 151 

techniques, such as complementary methodologies, PCR and qPCR (Figure 2). 152 

Fig. 2. Laboratory techniques performed in human cases through clinical suspicion of visceral 153 

(VL) and tegumentary leishmaniasis (TL). RT = rapid test; IFAT = indirect immunofluorescent 154 

antibody test. 155 

 156 

TL

n = 22

IFAT

n = 22

Molecular Techniques

n = 22

VL

n = 26

Direct Parasitological 

n= 26

RT

n =26

IFAT

n = 26

Molecular Techniques

n = 26



51 
 

 157 

2.4 Canine Sample 158 

The canine serological investigation, in Bauru city carried out by the 159 

Zoonoses Control Center (CCZ) of Bauru in 4,725 animals. RT (RT-DPP ® - Bio-160 

Manguinhos, Rio de Janeiro, Brazil) was performed as screening, detecting 837 161 

positive samples. Later, in the RT-DPP® positive samples, the immunoenzymatic 162 

test (ELISA Leishmaniasis Visceral Canine - Bio-Manguinhos, Rio de Janeiro, 163 

Brazil) was performed as confirmatory and, at IAL CLR-Bauru, the molecular 164 

techniques PCR and qPCR were performed (Figure 3). 165 

 166 

 167 

 168 

Fig. 3. Flowchart of the sequence of laboratory techniques performed on canine samples, from 169 

the serological investigations for the detection of canine visceral leishmaniasis. RT-DPP® (+) = 170 

positive rapid test; ELISA = immunoenzymatic assay. 171 

 172 

 173 

 174 

Serological Investigations  

n = 4725

RT-DPP® (+)

n = 837

ELISA

n = 837

Molecular Techniques

n = 837



52 
 

3. Diagnostic Methods  175 

3.1 Direct Parasitological Examination 176 

The direct parasitological was performed on bone marrow aspiration 177 

punction swabs, colored with giemsa. The slides were visualized in immersion oil 178 

with the objective of 100x, in the optical microscope, to confirm the presence of 179 

the amastigote forms in the tissue. 180 

 3.2 Indirect Immunofluorescent Antibody Test (IFAT) 181 

To perform IFAT it was used the human Leishmaniasis IFAT Kit (Bio-182 

Manguinhos, Rio de Janeiro, RJ, Brazil) for the detection of antibodies to 183 

Leishmania spp. in human serum, with clinical suspicion for both VL and TL, 184 

according to the manufacturer's recommendations. The slides were visualized in 185 

a fluorescence microscope (Olympus BX51, JPY). We considered indeterminate 186 

results titration equal to 40 and positive titration results from 80. 187 

3.3 Immunochromatographic Test or Rapid Test (RT) 188 

 The RT used in human serum samples was IT LEISH® (Biorad 189 

Laboratories, Marnes-la-Coquette, France), which uses the recombinant K39 190 

antigen to detect antibodies to Leishmania spp. The RT used for canine serum 191 

samples was RT-DPP® (Bio-Manguinhos, Rio de Janeiro, RJ), which uses a 192 

combination of recombinant K28 proteins from L. chagasi (syn. L. (L.) infantum) 193 

and protein A conjugated to colloidal gold to detect antibodies specific to 194 

Leishmania spp. in dogs. The tests were performed according to the 195 

manufacturer's recommendations. 196 

 197 

3.4 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 198 

To perform ELISA, the EIE Visceral Canine Leishmaniasis Kit (Bio-199 

Manguinhos, Rio de Janeiro, Brazil) was used, which consists of the reaction of 200 

antibodies present in serum or plasma of dogs with soluble and purified antigens 201 

of L. major-like, obtained from in vitro culture. Tests were performed according to 202 

the manufacturer's recommendations. The optical density was measured using a 203 

spectrophotometer with a 450nm filter. The values of the negative controls were 204 



53 
 

used to calculate the cut-off point. The result was considered positive when equal 205 

to or greater than the cut-off. 206 

 207 

3.5  Molecular Analyzes 208 

3.5.1 DNA extraction and quantification 209 

The DNA extractions from blood samples were performed using the Illustra 210 

blood genomic Prep Mini Spin Kit (GE Healthcare, Pittsburgh, USA), as instructed 211 

by the manufacturer. The quantification was evaluated in a spectrophotometer 212 

(Epoch-Biotek, USA). 213 

 214 

3.5.2 Polymerase chain reaction (PCR) 215 

The target sequence for analyzes of human and canine blood samples 216 

were for the ITS-1 (Internal Transcribes Spacer) region of ribosomal DNA, LITSR 217 

(5'CTGGATCATTTTCCGATG3') and L5.8S (5'TGATACCACTTATCGCACTT3'), 218 

were used for screening of  Trypanosomatidae family (El Tai et al., 2000).  PCR 219 

included positive controls from reference DNA strains L. infantum (MHOM / BZ / 220 

1982) and L. major (MHOM / BZ / 1982) from the Leishmanias Collection of the 221 

Oswaldo Cruz Institute (CLIOC FIOCRUZ) and, as a negative control, ultrapure 222 

sterile water. Reactions were under the following conditions: each 0.2mL 223 

microtube received reaction buffer 10mM Tris HCl pH 8.0, 50mM KCl, 1.5mM 224 

MgCl2, 0.2mM dNTP, 10pM of each primer, 0.2 units of Taq Platinum DNA 225 

polymerase (Invitrogen) and 10ng of genomic DNA. Thus, each tube had 11 μL 226 

of the MIX-PCR and 1 μL of the DNA extraction product. Incubation was 227 

performed on the gradient thermal cycler (Life Technologies®, Carlsbad, USA). 228 

 229 

3.5.3 Electrophoresis in agarose gel  230 

An aliquot of 8 μl of each amplified product was added to 2 μl of run buffer 231 

(0.25% bromophenol blue, 0.25% xylene cyanol, 30% glycerol, 70% Milli-Q 232 

water) and homogenized. As a molecular marker 4 μl of 100 bp ladder (Invitrogen, 233 

USA). The visualization of the amplified material was evaluated by the 234 

electrophoretic run on 1.5% agarose gel added with 0.1 μl/mL of SYBR Safe DNA 235 



54 
 

gel stain (Invitrogen, USA). The electrophoretic run was performed in a horizontal 236 

vessel containing 1X TBE (89 nM Tris-HCl, 89 mM boric acid and 20 mM EDTA) 237 

and 65V voltage for 60 minutes. After the end of the run, the amplified bands 238 

were visualized under ultraviolet light (296nm) and recorded using the 239 

transilluminator (Syngene, USA), and the image was captured by the digital 240 

documentation system. 241 

 242 

3.5.4 Real-time PCR (qPCR) 243 

To determine the parasitic load, the SYBR® Green system was used in the 244 

StepOne™ Plus Real Time PCR System (Life Technologies®, Carlsbad, USA). 245 

The standard curve was performed with the DNA samples from reference strains 246 

from the Leishmanias Collection of the Oswaldo Cruz Institute (CLIOC FIOCRUZ) 247 

at the decreasing concentrations of parasites/ml 105 104 103 102 101. The target 248 

sequence used was 70 kDa heat shock protein (hsp70), HSP70F (5' AGG TGA 249 

AGG CGA CGA ACG 3') and HSP70R (5' CGC TTG TCC ATC TTT GCT TC 3') 250 

(Hernández et al. 2014). The reactions were under the following conditions: 12.5 251 

μL of Power SYBR® Green PCR master Mix (Life Technologies®, USA), 5 μM of 252 

each primer, 8.5 μL ultrapure water and 2 μL of sample, totaling a final volume of 253 

25 μL. The amplification profile used was: 95°C for 10 minutes, followed by 40 254 

cycles of 95°C for 15 s, 60°C for 1 minute and one step for the dissociation curve 255 

of 95°C for 15s, 60°C for 1 minute and 95°C for 15s. The amount of DNA present 256 

in the samples was expressed in relation to the standard curve of each assay. 257 

 258 

3.5.5 Statistical analysis 259 

           The calculation of the Kappa (k) coefficient of agreement and their 260 

respective intervals with 95% of confidence were performed using R version 261 

3.4.1. Kappa coefficients were interpreted following Landis and Koch (1977): 262 

1.00-0.81 excellent, 0.80-0.61 good, 0.60-0.41 moderate, 0.40-0.21 weak and 263 

0.20-0.00 negligible agreement. Analysis of the categorical variables was used 264 

the Fisher exact test. 265 

 266 



55 
 

4 Results  267 

4.1 Visceral leishmaniasis in humans 268 

Of the 26 samples analyzed, 21 (80.8%) were positive in the direct 269 

parasitological in bone marrow aspirate, 21 (80.8%) were positive in the RT, 19 270 

(73.1%) were positive to the IFAT with titration equal to 80, six (23.1%) were 271 

indeterminate to IFAT with titration equal to 40 and 22 (84.6%) were positive for 272 

both molecular techniques (PCR and qPCR). The molecular techniques were the 273 

methodologies that obtained the highest positivity among the analyzed samples 274 

(Table 1). Despite the predominance of males (72.7%) and the age group 275 

between 11 and 30 years (36.4%) in the individuals with VL, no significant 276 

differences were observed (Table 2). 277 

  278 

Table 1. Positivity in different laboratory techniques for visceral leishmaniasis, performed in 279 
human samples.  280 

 
Number of samples (%) 

Negative  Indeterminate Positive  
Parasitologicala 5 (19.2) - 21 (80.8) 

    
RTb 5 (19.2) - 21 (80.8) 

    
IFATc 1 (3.8) 6 (23.1) 19 (73.1) 

    
PCRd 4 (15.4) - 22 (84.6) 

    
qPCRe 4 (15.4) - 22 (84.6) 

    
a parasitological = direct parasitological in bone marrow aspirate; b RT = Rapid Test (IT-LEISH®- 281 
Bio-Rad Laboratories); c IFAT = indirect immunofluorescent antibody Test (IFAT) (IFI Human 282 
Leishmaniasis - Bio-manguinhos); d PCR = polymerase chain reaction (LITSR / L5.8S); e qPCR = 283 
real-time PCR (hsp70). 284 
 285 

 286 

Table 2. Association of demographic data with visceral leishmaniasis in humans. 287 

Sex 
VLa positive 

n=22 (%) 
VLa negative  

n=4 (%) 
OR (95%CI) p-value 

Male 16 (72.7) 3 (75.0) 0.89 (0.01-13.98) 1 
Female 6 (27.3) 1 (25.0) - - 

      
Age Group        

0 to 10 years 6 (27.3) 1 (25.0) - - 
11 to 30 years 8 (36.4) 1 (25.0) 1.33 (0.01-117.57) 1 
31 to 50 years 4 (18.2) 1 (25.0) 0.67 (0.01-65.28) 1 
51 to 70 years 2 (9.1) - NA 1 

> 70 years 2 (9.1) 1 (25.0) 0.33 (0.01-39.14) 1 
a VL = visceral leishmaniasis; NA = not applicable. Fisher exact test 288 



56 
 

The level of agreement between the methodologies performed for VL was 289 

good and excellent between the parasitological, RT and molecular techniques. 290 

However, the IFAT was the methodology that obtained less positivity and 291 

moderate and weak agreement with the other methodologies, possibly due to the 292 

indeterminate results obtained (Table 3). 293 

 294 

Table 3. Kappa coefficient of agreement with 95% confidence interval, referring to the laboratory 295 
techniques performed for visceral leishmaniasis in humans. 296 

Laboratory techniques Kappa agreement (IC 95%) p-value 

RTa versus parasitologicalb 0.752 (0.427 - 1.000) < 0.001 
RT versus IFATc 0.426 (-0.461 -1.000) < 0.001 
RT versus PCRd 0.866 (0.611 - 1.000) < 0.001 
RT versus