RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta dissertação será disponibilizado somente a partir de 01/02/2026. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” (UNESP) INSTITUTO DE QUÍMICA DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E QUÍMICA ORGÂNICA NAIARA MAIA PEREIRA Desenvolvimento de filme transdérmico associado a peptídeos RGD e KTTKS para aplicação na cicatrização de tecidos. Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Instituto de Química, da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Biotecnologia. Orientador: Prof. Dr. Reinaldo Marchetto Araraquara 2024 P436d Pereira, Naiara Maia Desenvolvimento de filme transdérmico associado a peptídeos RGD e KTTKS para aplicação na cicatrização de tecidos / Naiara Maia Pereira. -- Araraquara, 2024 81 f. : il. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista (Unesp), Instituto de Química, Araraquara Orientador: Reinaldo Marchetto 1. Peptídeos. 2. Biocurativo. 3. Cicatrização. 4. Pele. 5. Regeneração tecidual dirigida. I. Título. Sistema de geração automática de fichas catalográficas da Unesp. Biblioteca do Instituto de Química, Araraquara. Dados fornecidos pelo autor(a). Essa ficha não pode ser modificada. IMPACTO POTENCIAL DESTA PESQUISA A proposição de um filme transdérmico para estimular a cicatrização tecidual pode melhorar a saúde de indivíduos com feridas de difícil cicatrização, além de favorecer sua qualidade de vida e reestabelecer sua autonomia. Este avanço pode auxiliar na redução de despesas e manejo do ferimento, minimizando a utilização de recursos médicos. POTENTIAL RESEARCH IMPACT The proposal of a transdermal film aiming to stimulate tissue healing can improve the health of individuals with wounds that are difficult to heal, improving their quality of life and reestablishing their autonomy. This advancement can help reduce expenses and wound management, minimizing the use of medical resources. DADOS CURRICULARES DADOS PESSOAIS Nome: Naiara Maia Pereira Nome em citações bibliográficas PEREIRA, Naiara Maia; PEREIRA, N.M.; PEREIRA NM. Endereço Profissional Rua Francisco Degni, 55 – Quitandinha – Araraquara/SP – CEP: 14800-060 Endereço Eletrônico: maia.pereira@unesp.br Formação Acadêmica/Titulação 2021- Mestrado em Biotecnologia Instituto de Química de Araraquara Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, Brasil Orientador: Prof. Dr. Reinaldo Marchetto Bolsista do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) Projeto de Pesquisa: Desenvolvimento de Hidrogel Formador de Filme com Peptídeos RGD e KTTKS para Aplicação na Cicatrização de Tecidos. 2017-2021 Graduação em Licenciatura em Química Instituto de Química de Araraquara Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, Brasil 2019-2021 Iniciação Cientifica Instituto de Química de Araraquara Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, Brasil Orientador: Prof. Dr. Reinaldo Marchetto Bolsista do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) Projeto de Pesquisa: Biocelulose funcionalizada com peptídeos para aplicação em processos de cicatrização 2009 - 2010 Curso técnico/profissionalizante em Técnico em Química. Escola Municipal "Adelino Bordignon". Bolsista do(a): Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, CNPq, Brasil. Iniciação Cientifica Júnior Instituto de Química de Araraquara Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, Brasil Orientador: Prof. Dr. Carlos de Oliveira Paiva Santos Bolsista do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) Programa de Iniciação Científica - Junior (PIBIC Jr) Projeto de Pesquisa: Desenvolvimento de uma metodologia de preparação de um padrão para análise quantitativa de fases de fármacos por difração de raios X. Formação Complementar 2023 Curso de Inverno - Temas Avançados de Bioquímica e Biologia Molecular, ministrado pelo Departamento de Bioquímica do Instituto de Química da Universidade de São Paulo. Disciplina tópico especial ”Special topics: Alternative methods to replace tests with mammals”, na modalidade Aluno Especial, oferecido pelo Curso de Pós-Graduação em Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Unesp – Campus de Araraquara-SP. Curso de Verão: A escrita acadêmica além do mal-estar: 50 estratégias para escrever teses, dissertações e monografias em tempo de crise política, ministrado pela Faculdade de Psicologia PUC-Minas. 2022 Curso de Extensão Universitária na modalidade de Difusão: Capacitação no Uso e Manejo de Animais de Laboratório, ministrado pelo Instituto de Ciências Biomédicas, da Universidade de São Paulo. Curso Preparatório para Exame de Proficiência TOEFL, ministrado pelo Centro de Línguas e Desenvolvimento de Professores (CLDP), da UNESP/IBILCE – Campus de São José do Rio Preto/SP. Minicurso CRISPR/CAS: Teoria e Prática, ministrado pela Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Unesp – Campus de Araraquara. Participação em Eventos Científicos Apresentação de pôster intitulado “Development of a Transdermal Film Containing RGD-KTTKS Peptides for Application in Tissue Healing.” No 52º Encontro anual da Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular (SBBq), ocorrido em Águas de Lindóia, SP, 2023 Participação e apresentação de pôster intitulado “Biocelulose funcionalizada com peptídeo adesivo RGD: um biomaterial promissor para aplicações biomédicas” na primeira e segunda fases o XXXIII Congresso de Iniciação Científica da UNESP, ocorrido no segundo semestre de 2021, na modalidade online. Participação e apresentação de pôster intitulado “Membranas de Biocelulose contendo peptídeos quiméricos para aplicação em processos de regeneração do tecido cutâneo” na primeira e segunda fases do XXXII Congresso de Iniciação Científica da UNESP, ocorrido no segundo semestre de 2020, na modalidade online. Prêmios/Menção Honrosa Menção Honrosa: Melhores trabalhos de Iniciação Científica, área Ciências da Vida - XXXII Congresso de Iniciação Científica da Unesp, 2020. DEDICATÓRIA Dedico este trabalho aos meus pais, Sonia e Oclair, minha fortaleza diante de todos os obstáculos da vida e minhas melhores companhias, sempre. Aos meus amigos que em tantos momentos entenderam as minhas ausências e me deram apoio para seguir. A Deus, Nossa Senhora Aparecida e Nanã, pela saúde, pela proteção aos meus e a mim, pelas vitórias e pelos aprendizados ao longo deste caminho de evolução espiritual. A todos os que contribuíram de alguma forma, para que eu pudesse chegar até aqui. AGRADECIMENTOS Não poderia começar esta seção sem novamente mencionar meus pais. Meu eterno agradecimento a eles, os amores da minha vida, por todo o suporte, todo amor e todo o apoio que eu poderia ter. Eu jamais teria chegado até aqui sem vocês. Aos meus queridos amigos, especialmente à Gabriela Zolin, minha metadinha e neurônio compartilhado, e Fauller Fonseca, um dos melhores amigos que eu poderia ter. Pela companhia de todos os dias, pelo riso sincero, por serem abrigo durante as tempestades que só a pós-graduação pode oferecer, pelo aprendizado e apoio incondicional - sem esquecer os incríveis cafezitos, obviamente. A Sabrina Okada, amiga, família e minha parceira de vida, que mesmo com o passar do tempo, com as mil voltas que a vida dá, sempre esteve e eu sei que sempre vai estar ao meu lado, aconteça o que acontecer. Eu sempre farei o mesmo por você. Ao meu querido namorado, Vitor Hage, pelo amor, incentivo e pela motivação a me tornar sempre a minha melhor versão. Ao meu querido médico, Dr. Silvio Rizzo, que por inúmeras vezes salvou a minha vida e me ajudou a ter saúde para seguir e bom humor para enfrentar as dificuldades. Aos demais amigos – e aqui merecem destaque especial a Beatriz Bolini, Camila Marcantonio e Renata Merlos - que tantas vezes me ouviram falar deste trabalho, das dificuldades às conquistas. Que torceram por mim, que me apoiaram nas dificuldades, que me ajudaram de todas as formas. Obrigada por serem os melhores que eu poderia ter. Ao meu orientador, Prof. Dr. Reinaldo Marchetto, pela confiança, pelo exemplo e pelos ensinamentos de química, bioquímica e da vida acadêmica. Aos professores que tive a oportunidade de conviver ao longo destes anos, por todo o conhecimento compartilhado. Uma parte de cada um está nas entrelinhas deste trabalho e, sem eles, nada disso teria sido feito. Aos funcionários do IQ, que direta ou indiretamente contribuíram, seja com um sorriso gentil ou uma conversa amigável em algum momento. Aos queridos Me. Fauller H. da Fonseca e Marcos William Gualque pelo auxílio no tratamento estatístico dos dados. Meu especial agradecimento à querida Prof. Dra. Cristiane Damas Gil e à Ma. Rebeca Silva, pelos ensinamentos e contribuição com a linhagem celular de queratinócitos, essenciais para a finalização deste trabalho. Aos colegas de pesquisa, alguns do grupo, alguns de outros grupos, que faço questão de nomear, um a um: Beatriz Sanches, Bruna Carolina, David Spressão, Jéssica Oliveira (Jéss), José Bedoya (Gregs), Karla Lima, Neide Felício, William Gualque, Jonatas Angelo, Marisa Polesi, Rodolfo, Angélica, Ana e Wlad. Todos contribuíram substancialmente para o meu aprendizado, compartilhando muito mais que seus conhecimentos com paciência e disposição às mil dúvidas que eu tive. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) por financiar este projeto através da Chamada/Edital: GM GD 2020 – Apoio a Projetos de Pesquisa Científica, Tecnológica e de Inovação – Bolsas de Mestrado, sob número 146999/2021-5. “É melhor acender uma vela do que praguejar contra a escuridão.” Adágio RESUMO Responsável pela proteção contra estímulos externos que podem provocar danos ao organismo por meio de rupturas de natureza física, química ou microbiológica, a pele é capaz de desencadear processos biologicamente complexos que visam a recuperação de sua integridade e capacidade funcional quando danificada. Problemas relacionados a estes processos podem levar a formação de feridas crônicas, em que há dificuldade de cicatrização e maior demanda de tempo para a recuperação do tecido. A literatura indica que peptídeos RGD e KTTKS apresentam potencial estímulo à Matriz Extracelular para adesão, proliferação celular e favorecimento à produção de colágeno. Além disso, estudos apontam para a utilização de filmes transdérmicos como uma possibilidade de rota alternativa à administração oral de fármacos, evitando processos metabólicos que levam a degradação dos compostos antes de sua efetiva ação, pela liberação direta à microcirculação. Neste sentido, o objetivo deste trabalho é associar um sistema transdérmico a peptídeos com potencial favorável aos processos de cicatrização, de modo a obter um produto que diminua o tempo necessário para a cicatrização do tecido cutâneo. Assim, foram desenvolvidos seis fragmentos de peptídeos compostos a partir da sequência nativa de fibronectina, que contem a sequência RGD, associados a um subfragmento de colágeno tipo I, contendo a sequência KTTKS. As sequências propostas apresentam regiões em comum e variações tais que permitiram avaliar comparativamente o seu desempenho, como a adição do ácido ε-amino hexanóico (Ahx) usado como espaçador inerte e região hidrofóbica nas sequências, bem como o uso de diferentes resinas para a síntese. Estes foram sintetizados pela metodologia de síntese de fase sólida, obtidos com elevado grau de pureza por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), identificados por espectrometria de massas e não apresentaram indícios de citotoxicidade nos testes realizados com linhagem celular de fibroblastos (MRC-5), em ensaio colorimétrico com MTT. Então, três sequências peptídicas foram selecionadas sob concentrações específicas, NMC (10 umol L-1), NMD (20 umol L-1) e NME (5 umol L-1), e adicionados a um filme de hidrogel, V3005, que foi selecionado a partir de outras sete composições celulósicas desenvolvidas inicialmente para uso como sistema transdérmico, compondo F-NMC, F-NMD e F-NME, que não apresentaram indícios de citotoxicidade frente as linhagens fibroblástica (MRC-5) e queratinocítica (HaCaT) utilizadas, em ensaio colorimétrico com MTT. Os sistemas estudados apresentaram ainda importantes resultados de proliferação celular e indicaram o favorecimento da biossíntese de colágeno tipo I após 72h, além de indicarem o potencial controle da atividade bacteriana para a espécie gram-positiva analisada, Staphylococcus aureus, em cerca de 90% para F-NME. Assim, os resultados obtidos se mostraram promissores acerca dos objetivos propostos e apresentam grande potencial para aplicação como produto que possa propiciar uma cicatrização mais rápida e eficaz. Palavras-chave: Peptídeos. Biocurativo. Cicatrização. Pele. Regeneração tecidual dirigida. ABSTRACT The skin is responsible for protecting the body against external stimuli that can cause physical, chemical, or microbiological damage. When damaged, the skin triggers biologically complex processes aimed at recovering its integrity and functional capacity. Problems related to these processes can lead to the formation of chronic wounds, which are difficult to heal and take longer for the tissue to recover. According to the literature, RGD and KTTKS peptides have the potential to stimulate the Extracellular Matrix in terms of adhesion, cell proliferation, and collagen production. Additionally, studies suggest that transdermal films may serve as an alternative route to oral drug administration, bypassing metabolic processes that can lead to compound degradation before their effective action, by directly releasing into the microcirculation. The objective of this study was to associate a transdermal system with peptides that promote healing processes, in order to reduce the time required for skin tissue to heal. Six peptide fragments were developed from the native fibronectin sequence, which contains the RGD sequence, associated with a type I collagen subfragment containing the KTTKS sequence. The proposed sequences have common regions and variations that allow for comparative assessment. For example, the addition of ε-amino hexanoic acid (Ahx) as an inert spacer and hydrophobic region in the sequences, as well as the use of different resins for synthesis, could affect their performance. The compounds were synthesized using solid-phase synthesis methodology. They were obtained with a high degree of purity through high-performance liquid chromatography (HPLC) and identified by mass spectrometry. In tests carried out on the fibroblast cell line (MRC-5) using a colorimetric assay with MTT, no signs of cytotoxicity were observed. Three peptide sequences, NMC (10 μmol L-1), NMD (20 μmol L-1), and NME (5 μmol L-1), were selected and added to a hydrogel film, V3005. The hydrogel film, V3005, was chosen from seven other cellulose compositions initially developed for use as a transdermal system. The resulting compositions, F-NMC, F-NMD, and F-NME, showed no signs of cytotoxicity against the fibroblastic (MRC-5) and keratinocytic (HaCaT) strains used in the MTT colorimetric assay. The studied systems yielded significant results in terms of cell proliferation and favored the biosynthesis of type I collagen after 72 hours. Additionally, they showed potential for controlling bacterial activity in the gram-positive species analyzed, specifically Staphylococcus aureus, with a reduction of around 90% for F-NME. The obtained results show promise in achieving the proposed objectives and have potential for use as a product that can promote faster and more effective healing. Keywords: Peptides. Biocurative. Wound Healing. Skin. Targeted tissue regeneration. LISTA DE FIGURAS Figura 1. Representação esquemática do processo de obtenção dos filmes V3005 e VetOH. ...................................................................................................................... 32 Figura 2. Esquema ilustrativo da síntese de peptídeo pela metodologia da fase sólida e estratégia Fmoc ( = representa um protetor de cadeia lateral de um resíduo de aminoácido trifuncional genérico) .............................................................................. 34 Figura 3. Curva analítica para quantificação de colágeno tipo I em solução. ........... 39 Figura 4. Filmes prepardos com base nas formulações de Patel et al. (2009) e Vijaya et al. (2015), obtidos após a etapa de secagem (identificados de A à E – Tabela 2) 45 Figura 5. Filmes V3005 (A) e VetOH (B) e os respetivos discos de 5 mm (C) dispostos de modo comparativo com as composições A,B,C,D e E. ........................................ 46 Figura 6. Estrutura primária da região 1511-1540 da fibronectina humana .............. 47 Figura 7. Perfis cromatográficos obtidos em escala analítica do peptídeo NMB antes (A) e após purificação (B). Coluna de fase reversa C18 Júpiter Phenomenex (250 x 4,6 mm; 5 μm; 300 Å). Gradiente linear de 5 a 95% de solvente B (A: água, 0,045% TFA; B: ACN, 0,036% TFA) em 30 min, fluxo de 1,0 mL.min-1 e detecção a 220nm 48 Figura 8. Ensaio de viabilidade celular para as células MRC-5, na presença dos peptídeos NMA a NMF, expressa em %, com tempo de incubação das amostras de 24 horas. ................................................................................................................... 50 Figura 9. Ensaio de viabilidade celular para as células MRC-5, na presença dos peptídeos NMA a NMF, expressa em %, com tempo de incubação das amostras de 48 horas. ................................................................................................................... 51 Figura 10. Ensaio de viabilidade celular para as células MRC-5, na presença dos peptídeos NMA a NMF, expressa em %, com tempo de incubação das amostras de 72 horas. ................................................................................................................... 52 Figura 11. Ensaio de viabilidade celular para as células HaCaT, na presença dos peptídeos NMC, NMD e NME, expressa em %, com tempo de incubação das amostras de 24 horas ............................................................................................................... 53 Figura 12. Ensaio de viabilidade celular para as células HaCaT, na presença dos peptídeos NMC, NMD e NME, expressa em %, com tempo de incubação das amostras de 48 horas ............................................................................................................... 54 Figura 13. Ensaio de viabilidade celular para as células HaCaT, na presença dos peptídeos NMC, NMD e NME, expressa em %, com tempo de incubação das amostras de 72 horas ............................................................................................................... 54 Figura 14. Ensaio de viabilidade celular para as células MRC-5, na presença dos filmes A, B, V3005 e VetOH, expressa em %, com tempo de incubação das amostras de 24, 48 e 72 horas. ................................................................................................ 61 Figura 15. Imagem comparativa de placa, após tratamento com MTT, na ausência de filme (A), na prepresença do filme C (B) e na presença do filme D (C). .................... 61 Figura 16. Imagem comparativa de placa após tratamento com MTT contendo o filme E sem células (A) e poços vazios que receberam o mesmo tratamento (B). ............ 62 Figura 17. Resultados do tratamento estatístico para o ensaio de viabilidade celular para as células MRC-5, na presença dos filmes A, B, V3005 e VetOH, expressa em %, com tempo de incubação das amostras de 24, 48 e 72 horas. ............................ 63 Figura 18. Análise da viabilidade celular de filmes modificados pela adição de peptídeos em linhagem de queratinócitos, para os períodos de 24, 48 e 72 horas. . 65 Figura 19. Padrões de difração de DRX dos filmes V3005 (azul) e V3005P (vermelho) com os respectivos picos assinalados ...................................................................... 73 Figura 20. Espectro vibracional na região do infravermelho obtido para os filmes V3005 (cinza) e V3005P (magenta) .......................................................................... 74 Figura 21. Micrografia de MEV do filme V3005 (A) e V3005 contendo o peptídeo NMB (B) ............................................................................................................................. 75 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Composições de referência utilizadas como base na elaboração dos filmes .................................................................................................................................. 29 Tabela 2. Composição dos filmes preparados .......................................................... 30 Tabela 3. Filmes produzidos a partir de adaptações das formulações propostas por Khan et al. (2015) e Vijaya et al. (2015) .................................................................... 31 Tabela 4. Estrutura primária dos peptídeos modelados e sintetizados ..................... 33 Tabela 5. Massas moleculares teóricas e obtidas por espectroscopia de massas. .. 49 Tabela 6. Quantidade de colágeno tipo I produzido após 24 h de tratamento com os diferentes peptídeos. C+: Células em meio de cultivo na ausência de peptídeo. ..... 55 Tabela 7. Quantidade de colágeno tipo I produzido após 48 h de tratamento com os diferentes peptídeos. C+: Células em meio de cultivo na ausência de peptídeo ...... 55 Tabela 8. Quantidade de colágeno tipo I produzido após 72 h de tratamento com os diferentes peptídeos. C+: Células em meio de cultivo na ausência de tratamentos. 56 Tabela 9. Conjunto de dados tratados estatísticamente, em porcentagem de colágeno tipo I produzido após 24 h de tratamento com os diferentes peptídeos. ................... 57 Tabela 10. Conjunto de dados tratados estatísticamente, em porcentagem de colágeno tipo I, produzido após 48h de tratamento com os diferentes peptídeos. .... 58 Tabela 11. Conjunto de dados tratados estatísticamente, em porcentagem de colágeno tipo I, produzido após 72 h de tratamento com os diferentes peptídeos. ... 59 Tabela 12. Valores de absorbância médios para o ensaio de viabilidade celular em linhagem celular HaCaT com filmes modificados ou não pela adição de peptídeos. C+: Células em meio de cultivo na ausência de tratamentos; C-: Meio de cultivo adicionado de filmes, sem células. .............................................................................................. 64 Tabela 13. Quantidade de colágeno tipo I, em µg.mL-1, produzido após 24 h, 48 h e 72 h de incubação com os diferentes filmes modificados, após o tratamento estatístico. C+: Células em meio de cultivo. ................................................................................ 66 Tabela 14. Determinação de Concentração Inibitória Mínima dos diferentes peptídeos em solução, sobre a Escherichia coli. C+: Microrganismos em meio de cultivo. C-: Meio de cultivo. .................................................................................................................. 68 Tabela 15. Determinação de Concentração Inibitoria Mínina dos diferentes peptídeos em solução, sobre a Staphylococcus aureus. C+: Microrganismos em meio de cultivo. C-: Meio de cultivo. .................................................................................................... 68 Tabela 16. Determinação de Concentração Inibitória Mínima dos diferentes peptídeos em solução sobre a Candida albicans (ATCC 90028). C+: Microrganismos em meio de cultivo; C-: Meio de cultivo. ................................................................................... 70 Tabela 17. Determinação de Concentração Inibitória Mínina dos diferentes peptídeos em solução sobre a Candida albicans (ATCC 10231). C+: Microrganismos em meio de cultivo; C-: Meio de cultivo. ................................................................................... 70 Tabela 18. Avaliação Concentração Inibitória Mínima dos diferentes filmes sobre Escherichia coli. ........................................................................................................ 71 Tabela 19. Avaliação Concentração Inibitória Mínima dos diferentes filmes sobre Staphylococcus aureus. ............................................................................................ 72 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS Ahx Ácido  -amino hexanóico ATCC American Type Culture Collection BCRJ Banco de Células do Rio de Janeiro CIM Concentração inibitória mínima CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute cP Unidade de medida centipoise DBF N-dibutilftalato DCM Diclorometano DIC Diisopropilcarbodiimida DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMF Dimetilformamida DMSO Dimetilsulfóxido DO Densidade ótica DRX Difratometria de Raios-x E15LV Polímero de hidroxipropilmetilcelulose de viscosidade de 15 cP EC Etilcelulose ESI-MS Espectrometria de Massas com Ionização por Electrospray EtOH Etanol FIOCRUZ Fundação Oswaldo Cruz Fmoc 9- Fluorenilmetiloxicarbonila FT-IR Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier HaCaT Linhagem celular de queratinócitos humanos HOBt 1-hidroxibenzotriazol HPMC Hidroxipropilmetilcelulose IL-1 Interleucina-1 INCQS Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde ISO International Standards Organization K100M Polímero de hidroxipropilmetilcelulose de viscosidade de 100.000 cP K4M Polímero de hidroxipropilmetilcelulose de viscosidade de 4000 cP LC/MS Cromatografia Líquida Acoplada ao Espectrômetro de Massas MBHA 4-metilbenzidrilamina MEC Matriz extracelular MET Metolose MetOH Metanol MEV Microscopia Eletrônica de Varredura MH Meio de cultivo Muller Hinton MHA Meio de cultivo Muller Hinton contendo ágar MM/z Razão entre massa e carga eletrônica do peptídeo MRC-5 Linhagem celular de fibroblastos fumanos MTT Brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil-tetrazólio PB Polímero base de Patel PBM Polímero base de Patel Modificado PBS Solução salina de fosfatos PBV Polímero base de Vijaya PBVK Polímero base de Vijaya Modificado com Khan PBVM Polímero base de Vijaya Modificado PEG Polietilenoglicol PEG 200 Polietilenoglicol de peso molecular médio de 200 g mol-1 PEG 400 Polietilenoglicol de peso molecular médio de 400 g mol-1 PG Propilenoglicol pH Potencial Hidrogeniônico RPM Rotações por minuto SD Desvio padrão SDA Caldo Sabouraud Dextrose contendo ágar SDB Caldo Sabouraud Dextrose t-Bu Terc-butílico TFA Ácido trifluoracético TIS Triisopropilsilano TNF-α Fator de necrose tumoral-alfa UFC Unidades formadoras de colônias UFLC Ultra Fast Liquid Chromatography VC Viabilidade Celular LISTA DE AMINOÁCIDOS Ala (A) Alanina Arg (R) Arginina Asn (N) Asparagina Asp (D) Ácido aspártico Glu (E) Ácido glutâmico Cis/Cys (C) Cisteína Gli/Gly (G) Glicina Gln (Q) Glutamina His (H) Histidina Ile (I) Isoleucina Leu (L) Leucina Lis/Lys (K) Lisina Met (M) Metionina Fen/Phe (F) Fenilalanina Pro (P) Prolina Ser (S) Serina Tir/Tyr (Y) Tirosina The/Thr (T) Treonina Trp (W) Triptofano Val (V) Valina SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ............................................................................................... 21 1.1. Hidrogéis formadores de filme .................................................................... 22 1.2. Peptídeos RGD e KTTKS e processos de cicatrização .............................. 24 1.3. Justificativa e hipótese ................................................................................ 26 2. OBJETIVOS ................................................................................................... 27 3. MATERIAIS E MÉTODOS .............................................................................. 28 3.1. Obtenção dos filmes ................................................................................... 28 3.2. Síntese Química dos Peptídeos .................................................................. 32 3.3. Ensaios com culturas celulares ................................................................... 35 3.3.1. Avaliação de viabilidade celular de peptídeos ......................................... 37 3.3.2. Avaliação da viabilidade celular em filmes .............................................. 38 3.3.3. Biossíntese de colágeno ......................................................................... 38 3.4. Avaliação da atividade antimicrobiana ........................................................ 40 3.4.1. Preparação do inóculo ............................................................................. 41 3.4.1.1. Avaliação da Concentração Inibitória Mínima para Bactérias (CBM) ...... 41 3.4.1.2. Avaliação da Concentração Inibitória Mínima em Leveduras (CIM) ........ 42 3.5. Caracterização dos Filmes .......................................................................... 43 3.5.1. Difratometria de Raios-X (DRX) .............................................................. 43 3.5.2. Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier (FT-IR) 43 3.5.3. Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) ........................................... 43 3.6. Cálculo estatístico ....................................................................................... 44 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................................... 45 4.2. Síntese e caracterização dos peptídeos ..................................................... 47 4.3. Ensaios com culturas celulares ................................................................... 49 4.3.1. Peptídeos livres ....................................................................................... 50 4.3.1.1. Avaliação da viabilidade celular em fibroblastos ..................................... 50 4.3.1.2. Avaliação da viabilidade celular em queratinócitos ................................. 53 4.3.1.3. Avaliação da biossíntese de colágeno .................................................... 55 4.3.2. Filmes e Filmes combinados com peptídeos ........................................... 60 4.3.2.3. Avaliação da biossíntese de colágeno .................................................... 66 4.4. Avaliação da atividade antimicrobiana ........................................................ 67 4.4.1. Peptídeos livres ....................................................................................... 67 4.4.1.1. Avaliação da concentração inibitória mínima para bactérias (CBM) ........ 67 4.4.1.2. Avaliação da concentração inibitória mínima para leveduras (CIM) ........ 69 4.4.2. Filmes ...................................................................................................... 71 4.4.2.1. Avaliação da concentração inibitória mínima para bactérias (CBM) ........ 71 4.5. Caracterização dos filmes ........................................................................... 72 4.5.1. DRX ......................................................................................................... 73 4.5.2. FT-IR ....................................................................................................... 74 4.5.3. MEV ......................................................................................................... 75 5. CONCLUSÕES .............................................................................................. 76 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................... 78 21 1. INTRODUÇÃO A pele constitui aproximadamente 20% da massa corpórea humana e é o órgão responsável pela permeabilidade, seletividade e proteção contra estímulos externos de natureza física, química e microbiológica (ALKILANI et al., 2015; LOPES, 2015; KATHE, KATHPALIA, 2017, PRZEKORA, 2020). Danos à integridade deste tecido levam a rupturas e formação de ferimentos que imediatamente desencadeiam processos dinâmicos e biologicamente complexos, dependentes de fatores locais e sistêmicos, para promover a regeneração tissular, para restaurar sua capacidade funcional, bem como sua aparência (BALBINO; PEREIRA; CURI, 2005; LOPES, 2015; LAUREANO, RODRIGUES, 2011, JAMES et al., 2009, PRATS, 2021). Estes processos ocorrem em quatro fases principais: a de coagulação/homeostase, a inflamatória, a proliferativa e a de remodelação. (BALBINO; PEREIRA; CURI, 2005, LAUREANO, RODRIGUES, 2011, PRZEKORA, 2020, PRATS, 2021, RAZIYEVA et. al, 2021). Variações nos mecanismos envolvidos nas diferentes fases podem desencadear o surgimento de feridas crônicas, que requerem entre outros, maior tempo para a recuperação dos danos e para a completa cicatrização, o que pode gerar sofrimento e diminuição na qualidade de vida dos afetados. (LAUREANO, RODRIGUES, 2011, AITCHESON et al. 2021). Ferimentos deste tipo, acometem milhares de pessoas todos os anos e ocorrem especialmente em membros inferiores de pessoas acometidas por doenças vasculares crônicas e diabéticas, ou em diferentes regiões do corpo, tais como aquelas que possuem limitações de movimento por longos períodos de hospitalização, levando a formação de úlceras por pressão (FERREIRA et al., 2006, VIEIRA, ARAÚJO, 2018, AITCHESON et al. 2021, RAZIYEVA et. al, 2021). No Brasil, a alta prevalência e incidência de feridas crônicas são apontadas principalmente para pessoas idosas hospitalizadas e aquelas residentes em instituições de vivência, porém dados estatísticos sobre o acometimento da população em geral ainda é escasso (VIEIRA, ARAÚJO, 2018). Destacam-se ainda, os fatores complicadores capazes de retardar ou dificultar o desenvolvimento do processo de cicatrização. Tais fatores podem ser inerentes às condições gerais de saúde da pessoa ferida, como a idade, estado nutricional, uso de medicamentos ou ainda a existência de patologias que, reconhecidamente 22 comprometem etapas importantes da cicatrização bem como diabetes e doenças imunossupressoras (TAZIMA et al., 2008; GUO, DI PIETRO, 2010, PRATS, 2021). Também existem os fatores de natureza externa como limpeza, contaminação fúngica e/ou bacteriana e a forma de tratamento a qual está submetida (TAZIMA et al., 2008, RAZIYEVA et. al, 2021). A presença de agentes contaminantes, especialmente bactérias, endotoxinas, fungos e biofilmes podem provocar aumento prolongado nos níveis de citocinas pró-inflamatórias como a interleucina-1 (IL-1) e o fator de necrose tumoral-α (TNF-α) e prolongar o processo inflamatório para além do ideal, desencadeando o estado crônico do ferimento (GUO, DI PIETRO, 2010, RAZIYEVA et. al, 2021). A inflamação persistente promove a permanência do excesso de células pró-inflamtórias por um período além do ideal - tais como leucócitos, monócitos, fatores de crescimento e quimiocinas - que além de promover os sinais característicos da inflamação como calor, rubor e dor, tornam o processo mais lento, doloroso e sucetível a contaminação por microorganismos (PRATZ, 2021, PRZEKORA, 2020, RAZIYEVA et. al, 2021). Em muitos casos, biomateriais, filmes ou curativos sintéticos, especialmente aqueles que funcionam como carreadores de fármacos e com alta biocompatibilidade, podem ser necessários para reduzir o tempo estimado ou para melhorar a taxa de sucesso da regeneração, bem como para reparar ou reconstruir um tecido danificado (JAMES et al., 2009, PRZEKORA, 2020). 1.1. Hidrogéis formadores de filme Sistemas de carreadores transdérmicos têm sido desenvolvidos (PATEL et al., 2009, MURTHY; HIREMATH, 2001, KATHE; KATHPALIA, 2017, FREDERIKSEN et al, 2015), como alternativa às rotas convencionais de administração, oral ou injetável, de forma que o fármaco possa ser utilizado em aplicação direta sobre a pele, favorecendo a diminuição da frequência de administração e otimizando a absorção pela microcirculação (ALKILANI et al., 2015). Filmes de hidrogéis e correlatos podem ser utilizados para a administração de fármacos, sendo geralmente transparentes, flexíveis e finos que, em contato com a pele, são capazes de promover a liberação prolongada e contínua do fármaco com ação local ou transdérmica (KATHE; KATHPALIA, 2017; FREDERIKSEN et al. 2015). Embora o tecido íntegro possa constituir uma barreira física contra micro e macromoléculas nesta via, devido à baixa permeabilidade conferida pela presença do 23 estrato córneo (KATHE; KATHPALIA, 2017; ALKILANI et al., 2015, PRZEKORA, 2020), há a possibilidade de que o fármaco penetre para as camadas profundas da derme e epiderme e torne-se disponível para a absorção sistêmica, evitando a atividade metabólica presente em outras vias, aumentando sua biodisponibilidade (ALKILANI et al., 2015). Além disso, considerando uma ferida complexa que apresenta dificuldades de cicatrização e contendo altas concentrações de células de defesa (PRATZ, 2021, PRZEKORA, 2020, RAZIYEVA et. al, 2021), a aplicação tópica de compostos que favoreçam a cicatrização e que possam controlar o processo inflamatório e proteger a superfície, mimetizando o tecido cutâneo íntegro, tal como um curativo, a absorção de peptídeos e fármacos poderia ser favorecida, além de diminuir o período de cicatrização do ferimento. Kathe e Kathpalia (2017) em seu artigo de revisão apresentam dados comparativos sobre a utilização de materiais adesivos transdérmicos e a absorção de fármacos. Descrevem que a liberação do medicamento pode ocorrer lentamente após sua aplicação, e sua absorção ocorre pelos capilares, de onde é transportado para a circulação sistêmica ou então, de acordo com sua formulação, pode penetrar na pele para atuar diretamente sobre o tecido alvo, em uma ação tópica. Afirmam ainda que para a administração sistêmica de fármacos, há a limitação de ação devido a fatores endógenos do organismo e em contrapartida, compostos film-forming tendem a favorecer a ação tópica e transdérmica (KATHE; KATHPALIA, 2017). Patel e colaboradores (2009) descreveram os benefícios da utilização de uma composição mista entre etilcelulose (EC) e hidroxipropilmetilcelulose (HPMC) utilizando propilenoglicol (PG) para a aplicação de furosemida por via transdérmica. Por meio dos filmes obtidos, em análises in vitro, descreveram melhorias na capacidade de entrega do medicamento via transdérmica (PATEL et al., 2009). A utilização destes polímeros são justificadas, devido as características não tóxicas, não alergênicas e não irritantes dos mesmos, associadas a boa capacidade de formação de filmes que, dada a baixa permeabilidade de EC, torna-se conveniente a adição de HPMC para aprimorar estas características (PATEL et al., 2009). Vijaya e colaboradores (2015), em um estudo de caracterização in vitro e utilização de HPMC para o desenvolvimento de filmes transdérmicos contendo amitriptilina, descreveram que uma combinação de HPMC de diferentes viscosidades - sendo a melhor delas a combinação de K4M e K100M numa proporção de 3:4 - apresentou os melhores resultados para a entrega deste fármaco (VIJAYA et al., 24 2015). Khan e colaboradores (2015) em seu trabalho sobre o desenvolvimento de filmes mucoadesivos para uso como carreadores de omeprazol em pacientes pediátricos, descreveram a utilização de hidrogéis compostos por metolose 1%, PEG 400 0,5% como agente plastificante, em composições contendo etanol 20% e L- arginina como estabilizador, na proporção 1:2, como os que oferecem as melhores características esperadas para um hidrogel, como transparência e flexibilidade, sendo essa a melhor combinação selecionada para investigações futuras do grupo (KHAN et al., 2015). Neste sentido, a utilização de filmes em associação a fármacos – ou peptídeos, como aplicado neste trabalho – que apresentem ação que favoreçam o processo de cicatrização, poderiam atuar como película protetora e flexível (KATHE; KATHPALIA, 2017), diminuindo a frequência de manipulação de curativos devido a sua flexibilidade e entrega prolongada dos mesmos (FREDERIKSEN et al. 2015). A vantagem da utilização de sistemas compostos por filmes e peptídeos sintéticos ao invés de métodos convencionais de substituição de tecidos por enxertos ou ainda pelo uso de compostos nativos da Matriz Extracelular (MEC) se dá pelo menor risco de reações imunológicas, desencadeadas pela presença de material exógeno extraído e purificado de outros organismos (BELLIS, 2011; HERSEL et al., 2003). 1.2. Peptídeos RGD e KTTKS e processos de cicatrização O trabalho de Balbino, Pereira e Curi (2005) descreve que o reparo de danos teciduais pode ocorrer pela “regeneração com recomposição da atividade funcional do tecido” ou pela “cicatrização com restabelecimento da homeostasia do tecido com perda da sua atividade funcional pela formação de cicatriz fibrótica”, sendo que as fases inerentes à cicatrização não ocorrem de forma isolada, mas simultaneamente. Descrevem ainda que as observações imediatas após o dano ao tecido como rubor, calor e dor são resultantes da ativação e sinalização celular e de fragmentos dos elementos que compõem a MEC, como colágenos, elastinas e fibronectinas, além do acúmulo de líquidos e a ação de mediadores inflamatórios, como os liberados por plaquetas e mastócitos. Além de tais fatores e alterações bioquímicas como a baixa tensão de O2, alteração de pH, produção de mediadores lipídicos e peptídicos, uma onda de ativação 25 celular tende a promover a migração de células epiteliais, queratinócitos e fibroblastos de regiões adjacentes para a região afetada (BALBINO; PEREIRA; CURI, 2005). Importante para este processo são os queratinócitos da camada basal, que exerce papel crucial acerca da resposta epidermal na cicatrização de ferimentos. Constituindo cerca de 95% da epiderme, ao se replicarem, favorecem a movimentação das células mais antigas, progressivamente em direção à superfície dos tecidos, alterando sua morfologia e firmando o epitélio escamoso estratificado e queratinizado. A ausência destas células em feridas recentes e enxertos de pele, tornam o tecido mais suscetível a traumas pela falta das projeções estruturais em que se organizam (GANTWERKER; HOM, 2011). Na tentativa de favorecer esses processos intrínsecos à atividade reparadora do tecido danificado, recorreu-se à literatura que descreve a sequência tripeptídica Arginina-glicina-ácido aspartico (RGD) como uma sequência peptídica que, entre outros, é capaz de estimular processos de adesão celular principalmente pela ativação de receptores de adesão celular das integrinas (HERSEL et al., 2003; PIERSCHBACHER; RUOSLAHTI, 1984). As integrinas compõem um grupo de receptores transmembrana capazes de se ligar a proteínas existentes na MEC, como fibronectinas e colágenos que apresentam grande importância inclusive em processos de embriogênese, diferenciação celular, resposta imunológica, cicatrização de feridas e hemostasia (PIERSCHBACHER; RUOSLAHTI, 1984; HERSEL et al., 2003). Analogamente, a sequência peptídica Lisina-treonina-treonina-lisina-serina (KTTKS) é descrita como a mínima sequência capaz de promover a síntese de compostos na MEC, como colágeno e fibroblastos. Esta sequência tem sido utilizada principalmente em compostos que objetivam a redução do envelhecimento da pele, dada a provável regulação positiva de fatores de crescimento celular e estímulos da fase fibroblástica, além da síntese de colágeno novo, sendo caracterizado como um peptídeo sinal (ABU SAMAH; HEARD, 2011). Alguns estudos sinalizam a dificuldade da permeabilidade desta sequência peptídica (ABU SAMAH; HEARD, 2011), porém, o comprometimento do estrato córneo em ferimentos, torna-o momentaneamente incapaz de atuar como barreira protetora, especialmente em feridas crônicas, (BALBINO; PEREIRA; CURI, 2005) o que pode favorecer a permeabilidade do peptídeo com foco na recuperação da integridade anatômica e funcional do tecido. Embora a literatura descreva peptídeos antimicrobianos como moléculas pequenas, naturalmente anfipáticas e positivamente carregadas contendo 26 considerável porção hidrofóbica em sua estrutura (ULLIVARRI et al., 2020; SILVA et al., 2022), a compreensão acerca da atividade antimicrobiana dos peptídeos que compõem este trabalho adquire relevância uma vez que infecções fúngicas e bacterianas compõem fatores complicadores em ferimentos e feridas crônicas (TRØSTRUP et al., 2013). A proposição de uso de sequências contendo peptídeos RGD e KTTKS, baseia- se na ideia de que com o início do processo inflamatório, tem-se entre outros, a fase fibroblástica que em consequência da migração e ativação de fibroblastos bem como sinalização de fatores de crescimento, há o consequente aumento no número de fibroblastos ativados para a produção de colágeno e formação de tecido conjuntivo mais forte e elástico (BALBINO; PEREIRA; CURI, 2005; LAUREANO; RODRIGUES, 2011). 1.3. Justificativa e hipótese Feridas complexas e crônicas representam um desafio significativo para os sistemas de saúde em todo o mundo, afetando milhões de pessoas e gerando um impacto substancial na qualidade de vida dos pacientes, embora esses dados não sejam adequadamente documentados. Essas feridas, além de representarem um transtorno para os indivíduos afetados, também exercem pressão sobre os recursos de saúde, demandando tratamentos especializados, terapias de longo prazo e intervenções multidisciplinares. Estudos anteriores apontam para o potencial favorecimento do processo de cicatrização pela utilização de peptídeos contendo as sequências RGD, em ensaios in vitro, associados a celulose bacteriana (HERSEL et al., 2003). Sua utilização combinada com a sequência KTTKS em um carreador de fármaco do tipo hidrogel formador de filme, pode promover o aumento da biossíntese de colágeno e a proliferação celular de linhagens fibroblásticas e queratinocíticas, importantes no processo de cicatrização de ferimentos. Assim, almeja-se que esse projeto propicie o desenvolvimento de um produto que possa oferecer a administração direta de peptídeos ao tecido danificado e que tornem o processo de cicatrização mais rápido e eficaz. 76 5. CONCLUSÕES Embora careçam os registros, feridas complexas e crônicas constituem um importante desafio para os sistemas de saúde globalmente, impactando milhões de indivíduos e acarretando considerável impacto negativo na qualidade de vida dos pacientes. Além de representarem um transtorno para as pessoas afetadas, também exercem pressão nos recursos de saúde, requerendo tratamentos especializados, terapias prolongadas e abordagens multidisciplinares. Nesse sentido, o presente trabalho visou a obtenção de filmes incorporados a peptídeos, cujo favorecimento à proliferação celular e a não-toxicidade os tornam potenciais tratamentos para uso em casos de feridas crônicas. A metodologia de síntese dos peptídeos em fase sólida mostrou-se eficiente para a obtenção dos seis diferentes peptídeos propostos, assim como o método de clivagem, extração e purificação que, por meio de cromatografia líquida de alta eficiência, propiciou a obtenção de todos os peptídeos com pureza acima de 95% e, por meio de espectrometria de massas, foi caracterizada e confirmada. Além disso, análises in vitro permitiram observar a não-toxicidade dos compostos em solução, bem como sua potencial atividade proliferativa e de favorecimento à biossíntese de colágeno quando imobilizados no filme V3005. A obtenção dos filmes levou ao desenvolvimento da melhor composição observada, V3005, que apresentou características como transparência, elasticidade e flexibilidade que eram almejadas no início deste trabalho. Outrossim, suas modificações pela adição dos peptídeos foram caracterizadas de forma satisfatória, garantindo a não-toxicidade dos compostos desenvolvidos quando avaliadas frente às linhagens celulares fibroblástica e queratinocítica, além de confirmar suas características essenciais de estrutura e composição pelos métodos de DRX, FT-IR e MEV. As composições propostas, F-NMC, F-NMD e FNME e o filme não modificado, V3005, apresentaram resultados importantes nas análises de biosíntese de colágeno tipo I, especialmente F-NMC, F-NMD e V3005 para o período de 72h de observação, o que pode favorecer o processo de cicatrização de uma ferida crônica ou complexa, diminuindo a possibilidade de intercorrências como quelóides e cicatrizes hipertróficas. A análise em queratinócitos apontou para o potencial favorecimento na proliferação celular, e, embora o ensaio tenha sido realizado com o propósito de 77 avaliar a toxicidade das combinações, os dados tornam ainda mais propícios o interesse nesses compostos e, portanto, estudos de proliferação celular devem ser mais aprofundados no futuro, uma vez que este tipo celular é de extrema importância na sinalização e fechamento de feridas nas fases intermediárias e finais da cicatrização. Ademais, a atividade antimicrobiana contra Staphylococcus aureus apresentou valores de inibição mínimos de cerca de 80%, tendo o valor máximo observado para a composição F-NME, com cerca de 90%, o que torna os compostos ainda mais promissores para o tratamento de feridas complexas, considerando que contaminação bacteriana compõe um dos fatores complicadores na cicatrização de feridas. Vale destacar ainda que, a esse respeito, a composição F-NME apresentou os melhores resultados de inbição também para Escherichia coli. A composição F-NMC apresentou resultados interessantes quando observada sua influência frente aos queratinócitos, além de apresentar bons resultados para os ensaios de inibição, tornando-se uma composição promissora para estudos futuros. Embora não tenha apresentado os resultados mais significativos para a biosíntese de colágeno tipo I, a composição F-NME apresenta grande potencialidade para utilização in-vivo, uma vez que o potencial favorecimento do controle bacteriano usado localmente pode oferecer condições para que o organismo possa restabelecer sua homeostase e propiciar a cicatrização adequada de um ferimento. Deste modo, pode-se concluir que, este projeto foi capaz de auxiliar no início do desenvolvimento de um biomaterial com potencialidade para oferecer a administração direta de peptídeos ao tecido danificado e que apresenta potencial para tornar o processo de cicatrização mais rápido e eficaz. Novos estudos ainda devem ser realizados para complementar as informações observadas e permitir avaliar outros aspectos importantes no processo de cicatrização de ferimentos. 78 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ABU SAMAH, N. H.; HEARD, C.M. Topically Applied KTTKS: A review. International Journal of Cosmetic Science, v. 33, n. 6, p. 483-90, 2011. AITECHESON, S. M.; FRENTIU, F.D.; HURN, S.E.; EDWARDS, K.; MURRAY, R.Z. Skin Wound Healing: Normal Macrophage Function and Macrophage Dysfunction in Diabetic Wounds. Molecules, vol. 26, n 16, p. 4917, 2021. ALKILANI, A.Z.; Mc CRUDDEN, M.T.C.; DONELLY, R.F. 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