UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA 
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO” 

 
INSTITUTO DE QUÍMICA – CÂMPUS DE ARARAQUARA 

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA 

 

 

 

 

 

Cristiane Garcia Paulino 

 

 

 

 

 

“Análise da expressão dos fatores de crescimento FGF, VEGF e TGF 
associados ao reparo dérmico estimulado pelo látex natural (Hevea 

brasiliensis) e seu efeito na taxa de pulsação em Lumbriculus variegatus” 

 

 

 

 

 
 
 
 
 
 
 
 
 

Araraquara 
2022 



 

 

 

CRISTIANE GARCIA PAULINO 

 

 

 

 

 

“Análise da expressão dos fatores de crescimento FGF, VEGF e TGF 
associados ao reparo dérmico estimulado pelo látex natural (Hevea 

brasiliensis) e seu efeito na taxa de pulsação em Lumbriculus variegatus” 

 

 

 

Tese apresentada ao Instituto de Química, 
Universidade Estadual Paulista, como parte 
dos requisitos para obtenção do título de 
Doutor em Biotecnologia. 
 

 

 

 

                                            Orientador: Prof. Dr. Rondinelli Donizetti Herculano 

 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Araraquara 
2022 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

 

                                             UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA 

                                                                        Câmpus de Araraquara  

                        CERTIFICADO DE APROVAÇÃO  

 TÍTULO DA TESE: “Análise da expressão dos fatores de crescimento FGF, VEGF e TGF                                                                     

associados ao reparo dérmico estimulado pelo látex natural (Hevea 
brasiliensis) e seu efeito na taxa de pulsação em Lumbriculus 
variegatus”  

AUTORA: CRISTIANE GARCIA PAULINO  

ORIENTADOR: RONDINELLI DONIZETTI HERCULANO  

 

Aprovada como parte das exigências para obtenção do Título de Doutora em 
Biotecnologia, pela Comissão Examinadora:  

 
Prof. Dr. RONDINELLI DONIZETTI HERCULANO (Participaçao Virtual)  
Departamento de Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia / Faculdade de 
Ciencias Farmaceuticas - UNESP - Araraquara  

Prof. Dr. RICARDO JOSÉ MENDONÇA (Participaçao Virtual)  
Departamento de Ciências Biológicas / Universidade Federal do Triangulo Mineiro - UFTM – 
Uberaba  

Dr. CASSAMO USSEMANE MUSSAGY (Participaçao Virtual)  
Pontifícia Universidade Católica - PUC - Valparaíso, Chile  

Prof. Dr. CARLOS FREDERICO DE OLIVEIRA GRAEFF (Participaçao Virtual)  
Departamento de Fisica / Faculdade de Ciências - UNESP - Bauru  

Profa. Dra. AMANDA DOS SANTOS OLIVEIRA (Participaçao Virtual)  
Unidade de Emergência / Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto 
- HC-FMRP - Ribeirão Preto  

Araraquara, 16 de dezembro de 2022 

Instituto de Química - Câmpus de Araraquara - 
Rua Prof. Francisco Degni, 55, 14800060, Araraquara - São Paulo  

http://www.iq.unesp.br/#!/pos-graduacao/biotecnologia/CNPJ: 48.031.918/0027-63. 
 



 

 

 

DADOS CURRICULARES 

Cristiane Garcia Paulino 

2018 – 2022   Doutorado em Biotecnologia 
Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, 
São Paulo, Brasil 
Título: Análise da expressão dos fatores de crescimento FGF, 
VEGF e TGF associados ao reparo dérmico estimulado pelo látex 
natural Hevea brasiliensis) e seu efeito na taxa de pulsação 
em Lumbriculus variegatus 
Orientador: Prof. Dr. Rondinelli Donizetti Herculano 
 

2011 - 2013    Mestrado em Biotecnologia 
Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, 
São Paulo, Brasil 
Título: Análise prospectiva do padrão de metilação nos genes 
associados a doenças cardíacas SCN5A e MTR para aplicação 
na genética forense 
Orientadora: Profª Drª Regina Maria Barreto Cicareli 

 
2007 - 2008     Técnico em Química 
                        Colégio Técnico Santa Giulia, Taquaritinga, São Paulo, Brasil 
 
2002 - 2006     Graduação em Ciências Biológicas 
                        Universidade de Araraquara, Araraquara, São Paulo, Brasil 
 
Artigos publicados em periódicos 

Cesar, M.B., Borges, F.A., Bilck, A.P., Yamashita,F., Paulino, C.G., Herculano, 

R.D. Development and Characterization of Natural Rubber Latex and 

Polylactic Acid Membranes for Biomedical Application. J Polym Environ 28, 

220–230 (2020) 

J.F. Floriano, V.S. Chao, L.F.C. Bolognesi, N.R. de Barros, M. C.R. Miranda, F.A. 

Borges, AL.D. Chagas, C.G. Paulino, B.C. Garms, M.Y. Marcelino, J.A.S. 

Pereira, A.G. dos Santos, A.M.Q. Norberto, C.F. O. Graeff, R.D. Herculano. 

Physical, Chemical and Biological Characterization of Natural Rubber Latex 

Membranes Loaded with Cordia verbenacea DC. Extract. Current Traditional 

Medicine, Volume 4(2), p. 140 – 154, 2018. DOI: 

10.2174/2215083804666180427113645 

 

 
 
 
 

 



 

 

 

DEDICATÓRIA 

Não poderia dedicar essa conquista a não ser para as pessoas que mais amo, 

respeito e admiro. Por isso, dedico... 

Aos meus pais, José Carlos e Aparecida pelo amor, carinho, apoio e por tudo 

que sempre fizeram por mim em todos os momentos da minha vida. 

Ao meu irmão Leandro e minha cunhada Gedaique, pelo incentivo, paciência e 

dedicação, onde novamente o tempo era tão curto e minha expectativa tão 

grande. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                            dedico este trabalho de modo especial,  

aos meus filhos Lana e João Carlos por sempre  

                                               incentivarem-me através de seus sorrisos e nunca 

me deixar desanimar. Agradeço ainda mais, por 

                                                   me compreenderem e por me ensinarem todos 

                                                   os dias a ser mais feliz, mais paciente, mais  

                                                   forte...mais Mãe. 

Amo vocês 



 

 

 

AGRADECIMENTOS 

Neste período, aprendi que uma tese ou qualquer outro trabalho é a extensão da 

vida do(a) autor(a). Então, para que algo de valor seja produzido, deve-se 

primeiro criar algo de valor em si. Por este motivo, agradeço sincera e 

profundamente a todas as pessoas que muito me encorajaram e me ajudaram a 

produzir algo de valor em minha vida. 

 

A Deus, em sua onipresença, por me permitir explorar o mundo, me acolhendo, 

encorajando, enchendo-me de esperanças, colocando pessoas excepcionais em 

meu caminho e guiando meus passos até aqui. 

 

Ao meu orientador, Professor Dr. Rondinelli Donizetti Herculano, pela dedicação, 

paciência, compreensão e por destinar seu tempo a inspirar os seus alunos a 

serem profissionais melhores. 

 

Aos professores Dr. Guilherme Ferreira Caetano e Dr. Ricardo José Mendonça 

por toda a atenção e por aceitarem a participar da Banca de Qualificação, 

proporcionando discussões e sugestões que serviram para aprendizado, 

crescimento e incentivo à pesquisa. 

 

Aos professores da Banca de Defesa, Prof. Dr. Ricardo José Mendonça, Prof. 

Dr. Cassamo Ussemane Mussagy, Prof. Dr. Carlos Frederico de Oliveira Graeff 

e Profa. Dra. Amanda dos Santos Oliveira por toda atenção e pertinentes 

sugestões que agregaram muito conhecimento e foram essenciais para que este 

trabalho fosse concluído satisfatoriamente. 

 

Aos meus amigos da pós-graduação, que sempre estiveram presentes. 

Obrigada por todas as novas amizades. 

 

Em especial ao Felipe Borges, obrigada pelo tempo que se dedicou as minhas 

perguntas e me ensinou sobre a técnica de cultivo celular e a Giovana Pegorin, 



 

 

 

por toda ajuda nos testes de atividade antioxidante, fenóis e plotagem dos 

gráficos no Origin. Mais uma vez, muito obrigada! 

 

À secretaria de Pós-Graduação em Biotecnologia, em especial a Wennia, 

Robson e Ana Paula, por sempre me ajudarem prontamente.  

 

Ao apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – 

Brasil (CAPES) – Código de Financiamento 001. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

“A persistência é o caminho do êxito.”  

Charles Chaplin 



 

 

 

RESUMO  

Estudos recentes revelam a eficácia do uso do látex natural, extraído da 

seringueira Hevea brasiliensis, como agente cicatrizante e como uma matriz 

carreadora de diversos produtos com efeitos farmacológicos. Por ser um evento 

sistêmico, a cicatrização abrange uma gama de fatores que precisam interagir 

entre si para que haja uma evolução de forma eficiente. Tendo em vista a 

capacidade angiogênica e cicatrizante do látex, esta pesquisa investigou através 

de análises moleculares a expressão dos fatores de crescimento FGF, VEGF e 

TGF presentes no látex, em cultura de fibroblastos 3T3. Dentre os fatores de 

crescimento que influenciam o crescimento dérmico, podemos destacar o fator 

de crescimento do endotélio vascular (VEGF), fator de crescimento 

transformador beta (TGF-β) e o fator de crescimento fibroblástico (FGF), que 

estimulam a proliferação celular, a produção de colágeno e de outros elementos 

da matriz celular, favorecendo o processo de cicatrização. Conforme as análises 

de FTIR, os componentes identificados presentes na membrana de látex, na 

fração F1 e no soro foram identificados pertencentes ao isopreno, principal 

constituinte do látex, como para os grupos funcionais. A amostra do soro 

apresentou maior discrepância evidenciando que a parte proteica pode estar 

agindo como indutor de angiogênese. O ensaio hemolítico das amostras, fração 

F1, soro e a membrana de látex não apresentaram um alto grau de hemólise 

significativa no período observado, demonstrando assim ser um biomaterial 

hemocompatível. Nas condições experimentais utilizadas, evidenciou-se baixo 

teor de fenóis e capacidade antioxidante da fração F1, soro e membrana de látex. 

Os resultados obtidos nos ensaios com os Blackworms indicam que as frações 

F1, soro e membrana de látex, nas concentrações testadas, tiveram efeito no 

sistema circulatório alterando a taxa de pulsação dos Blackworms. A fração F1 

e o soro do látex, na concentração de 0,01%, no cultivo de fibroblastos e 

macrófagos apresentaram melhor viabilidade celular no período de 72h de 

incubação. A membrana de látex apresentou viabilidade celular superior em 

todos os períodos de incubação quando comparados ao controle, porém seus 

resultados foram mais satisfatórios no intervalo de 72h. Os resultados 

encontrados da análise de expressão gênica confirmaram que houve aumento 

significativo nas expressões dos genes VEGF, FGF e TGF na membrana e nas 

frações F1 e soro do látex quando comparadas ao controle, evidenciando o 

potêncial angiogênico dessas amostras. Este mecanismo de Engenharia 

Tecidual pode ser um dos procedimentos para regeneração dérmica no futuro.  

 

Palavras-chave: Látex. Reparo dérmico. Fatores de crescimento. Expressão 
gênica. Lumbriculus variegatus. 

 
 



 

 

 

ABSTRACT 
 

Studies prove the effectiveness of using natural latex, extracted from the rubber 

tree Hevea brasiliensis, as a healing agent and as a carrier matrix for various 

products with pharmacological effects. As it is a systemic event, healing 

encompasses a range of factors that need to interact with each other so that there 

is an efficient evolution. In view of the angiogenic and healing capacity of latex, 

the purpose of this research will be to investigate, through molecular analysis, the 

expression of growth factors FGF, VEGF and TGF present in latex, in culture of 

3T3 fibroblasts. Among the growth factors that influence dermal growth, we can 

highlight the vascular endothelial growth factor (VEGF), transforming growth 

factor beta (TGF-β) and fibroblastic growth factor (FGF), which stimulate cell 

proliferation, the production of collagen and other elements of the cellular matrix, 

favoring the healing process. According to the FTIR analyses, the identified 

components present in the latex membrane, in the F1 fraction and in the serum 

were identified belonging to isoprene, the main constituent of latex, as for the 

functional groups. The serum sample showed greater discrepancy, showing that 

the protein part may be acting as an angiogenesis inducer. The hemolytic assay 

of the samples, F1 fraction, serum and the latex membrane did not show a 

significant high degree of hemolysis in the observed period, thus demonstrating 

that it is a hemocompatible biomaterial. Under the experimental conditions used, 

a low phenol content and antioxidant capacity were found in the F1 fraction, 

serum and latex membrane. The results obtained in the tests with the 

Blackworms indicate that the F1 fractions, serum and latex membrane, in the 

tested concentrations, had an effect on the circulatory system, altering the 

pulsation rate of the Blackworms. The F1 fraction and the latex serum, at a 

concentration of 0.01%, in the culture of fibroblasts and macrophages showed 

better cell viability in the period of 72 hours of incubation. The latex membrane 

showed superior cell viability in all incubation periods when compared to the 

control, but its results were more satisfactory in the 72h interval. The results found 

from the gene expression analysis confirmed that there was a significant increase 

in the expressions of the VEGF, FGF and TGF genes in the membrane and in 

the F1 fractions and latex serum when compared to the control, evidencing the 

angiogenic potential of these samples. This Tissue Engineering mechanism may 

be one of the procedures for dermal regeneration in the future. 

 

Keywords: Latex. Dermal repair. Growth factors. Gene expression. 

Lumbriculus variegatus 

 

 



 

 

 

LISTA DE FIGURAS 

Figura 1- Kits de cuidados médicos antigos: a-) Germoplast® (em destaque) e b-) seis 

curativos de primeiros socorros vintage. 

 

18 

Figura 2- Fracionamento do látex (Hevea brasiliensis) através da centrifugação de alta 

rotação F1 (fase superior, contendo partículas de borracha), F2 (fase intermediária, sendo 

o soro do látex) e F3 (fase de fundo, contendo os lutóides) 

23 

Figura 3- Evolução da cicatrização da úlcera através da aplicação da membrana de látex: 

A - Aspecto inicial da ferida apresentando grande quantidade de tecido fibroso necrosado; 

B - Aplicação da membrana de látex natural; C - Ferida apresentando redução do tecido 

fibroso necrosado; D - Ferida em estágio avançado de cicatrização 

26 

Figura 4- Defeitos ósseos preenchidos com coágulo de sangue autógeno (A), membrana 

de látex cobrindo o terço médio da tíbia (B), e radiografia do defeito ósseo na tíbia (C) 

 

28 

Figura 5- Aparência visual da avaliação da toxicidade de soro de látex em larvas de G. 

mellonella em três concentrações (3, 5 e 10 mg/kg) após 11 dias 

 

31 

Figura 6- Mecanismos de comunicação celular promovido por fatores de crescimento 33 

Figura 7- Mecanismo do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) na cicatrização 

de feridas 

 

35 

Figura 8- Detalhamento das fases de cicatrização, com fatores de crescimento e linhagens 

celulares. 

 

44 

Figura 9- Imagem de seção transversal lateral dos Blackworms para verificação das ondas 

de pulsações.                                                 

48 

Figura 10- Reflexões de vôo dos Blackworms 49 

Figura 11- Desenho experimental 52 

Figura 12-Extração de Látex da seringueira (Hevea brasiliensis) para produção das 
membranas 

53 

Figura 13- Hemólise identificada em uma amostra de sangue centrifugada caracterizada 
através da intensidade da cor avermelhada do plasma. 

55 

 
Figura 14- Mudança da coloração do radical livre (DPPH) antes e depois da reação com 
um composto antioxidante (A-H). 
 

 
58 

Figura 15- Dosagem de fenóis totais empregando o reagente Folin 59 
 
Figura 16- Taxa de pulsação do vaso sanguíneo dorsal de Lumbriculus variegatus em 
amostras de látex natural. A exposição a longo prazo das amostras, aumentaram a 
frequência de pulsação (B) 

 
67 

 

 

 

 

 

 



 

 

 

Figura 17- Pulso peristáltico do vaso sanguíneo dorsal indicado por uma seta preta 76 

Figura 18- Ramificação dos vasos contráteis laterais indicado por uma seta preta 80 

Figura 19- Viabilidade celular. Porcentagem de viabilidade de fibroblastos e macrófagos 

em cultura por 24 h, com membrana, fração F1 e soro de látex em concentrações de 

0,01%, 0,1% e 1%. Valores representam médias de resultados em triplicata 

81 

Figura 20- Viabilidade celular. Porcentagem de viabilidade de fibroblastos em cultura por 

48horas, com membrana, fração F1 e soro de látex em concentrações de 0,01%, 0,1% e 

1%. Valores representam médias de resultados em triplicata  

82 

Figura 21- Viabilidade celular. Porcentagem de viabilidade de fibroblastos em cultura por 

72h, com membrana, fração F1 e soro de látex em concentrações de 0,01%, 0,1% e 1%. 

Valores representam médias de resultados em triplicata   

83 

Figura 22- Eletroforese em gel de agarose 1,5% evidenciando a integridade do RNA total 

na concentração de 2μg. As amostras 1 a 3 correspondem a fração F1, soro e membrana 

do látex, respectivamente 

84 

  

  

  

  

  

  

  

  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

 

LISTA DE TABELAS 

Tabela 1- Reagentes e respectivos volumes utilizados na reação de transcrição reversa 63 

Tabela 2- Primers desenhados para os genes de interesse 65 

Tabela 3- Taxa de hemólise (média ± desvio padrão) em diferentes concentrações da fração 

F1 e soro (15%, 30% e 50%) e membrana de látex 

71 

Tabela 4- Dosagem de fenóis nas amostras F1 e Soro do látex em diferentes concentrações 
(média ± desvio padrão) 

75 

Tabela 5- Resultado obtido da reação “in sílico” dos genes VEGF, FGF e TGF, mostrando 

a localização e tamanho do fragmento amplificado pelos primers 
85 

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

 

 

 

 

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

LISTA DE EQUAÇÂO 

 

Equação 1- Fórmula para o cálculo da hemólise expresso em porcentagem                           

 

  

56 

Equação 2- Fórmula para inibição do DPPH expresso em porcentagem 57 

Equação 3- Expressão empregada na normalização dos dados obtidos nos ensaios de 
MTT 
 
Equação 4- Fórmula para cálculo de eficiência da PCR                                          

61 

 
66 

  

  

  

  



 

 

 

LISTA DE GRÁFICOS 

 

Gráfico 1- Espectros de FTIR da membrana, fração F1 e soro do látex de Hevea brasiliensis 70 

Gráfico 2- Valor médio da atividade antioxidante do Soro do látex 73 

Gráfico 3- Valor médio da atividade antioxidante da fração F1 do látex 74 

Gráfico 4- Resultados do tratamento com a membrana do látex e frações F1 e soro do látex 
no período de 15 minutos. 

77 

Gráfico 5- Resultados do tratamento com a membrana do látex e frações F1 e soro do 

látex no período de 30 minutos 

78 

Gráfico 6- Resultados do tratamento com a membrana do látex e frações F1 e soro do 

látex no período de 1 hora 

79 

Gráfico 7- Quantificação normalizada da expressão dos genes VEGF, FGF e TGF nos 

tratamentos com a membrana e nas frações F1 e Soro do látex de Hevea brasiliensis 
86 

  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

 

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 

  

BML  Biomembrana de látex natural 

DMSO-  Dimetilsulfóxido 

DPPH  2,2-difenil-1-picrilhidrazilo 
 

FGF  Fator de crescimento de Fibroblasto 

FTIR 
 

Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier 

Hb  Hemoglobina 

H. brasiliensis      Hevea brasiliensis 

HIF     Fator induzido por hipóxia 

IgE    Imunoglobina E 

LN Látex Natural 

MTT Brometo de 3-(4,5 dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazólio 

PCR    Reação em cadeia da polimerase 

qPCR    Reação em cadeia da polimerase em tempo real 

RNA  Ácido ribonucleico 

TGF  Fator de crescimento transformador 
 

UV  Radiação Ultravioleta 

VEGF  Fator de crescimento do endotélio vascular 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

 

SUMÁRIO 

1 INTRODUÇÃO 18 
2 REVISÃO DA LITERATURA 20 
2.1 Impacto financeiro das feridas nos sistemas de saúde 20 
2.2 Definição e Tipos de Biomateriais 21 
2.3  Látex Natural (LN) 22 
2.4 Aplicações biomédicas do LN 25 
2.5 Engenharia tecidual no reparo de lesões cutâneas 30 
2.6 Angiogênese e Fatores de Crescimento 31 
2.7 Fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) 34 
2.8 Fator de Crescimento fibroblástico (FGF) 37 
2.9 Fator de crescimento transformante alfa (TGF-α) e fator de crescimento 

transformante beta (TGF-β1) 
38 

2.10 Fisiopatologia da reparação tecidual 39 
2.10.1 Fase de inflamação  40 
2.10.2 Fase de proliferação 41 
2.10.3 Fase de maturação 43 
2.11 Mecanismos Antioxidantes 44 
2.12 Importância da avaliação da hemocompatibilidade e citocompatibilidade   45 
2.13 PCR Quantitativo em Tempo Real (qPCR) para análise da expressão dos 

genes em estudo 
46 

2.14 Testagem de novos biomateriais em animais alternativos 46 
2.15 Características gerais dos Blackworms (Lumbriculus variegatus) 48 
3 OBJETIVOS 51 
3.1 Objetivos Gerais 51 
3.2 Objetivos Específicos 51 
4 MATERIAIS E MÉTODOS 52 
4.1 Desenho Experimental 52 
4.2 Preparação das Membranas de Látex Natural  52 
4.3 Obtenção do Soro e Fração F1 do Látex Natural 53 
4.4 Caracterização físico-química e biológica do material 54 
4.4.1 Análise por Espectroscopia no infravermelho (FTIR) 54 
4.4.2 Ensaio de hemólise 54 
4.4.3 Ensaio de Atividade Antioxidante 56 
4.4.3.1 Determinação da atividade Antioxidante através do método de sequestro 

de radicais livres (DPPH) 
56 

4.4.3.2 Preparo das soluções de quercetina para obtenção da curva analítica 56 
4.4.3.3 Preparo das amostras F1 e Soro do látex para avaliação da atividade 

antioxidante 
57 

4.4.4 Dosagem de fenóis 58 
4.4.5 Cultura celular 59 
4.4.6 Viabilidade celular 60 

4.4.7 Avaliação da expressão gênica dos fibroblastos 61 

4.4.7.1 Extração de RNA 61 

4.4.7.2 Quantificação de RNA 62 

4.4.7.3 Gel desnaturante para análise de RNA 62 
4.4.7.4 Síntese de cDNA 63 
4.4.7.5 Desenho de primers 64 
4.4.7.6 Expressão gênica e Análise estatística 65 
4.4.7.7 Curva de eficiência de ampliação das amostras e do gene referência 66 
4.4.8 Influência da membrana e das frações F1 e Soro do látex nas taxas de 

pulsações em Blackworms (Lumbriculus variegatus) 
66 
 

4.4.9 Análise estatística 68 
5 RESULTADOS e DISCUSSÃO 69 
5.1 Espectroscopia de Infravermelho (FTIR) 69 
5.2 Ensaio de Hemólise 71 
5.3 Ensaio de atividade antioxidante (AA) 72 
5.4 Dosagem de fenóis 75 



 

 

 

5.5 Taxas de pulsações em Blackworms (Lumbriculus variegatus) 76 
5.6 Viabilidade celular 81 
5.7 Gel desnaturante para análise de RNA 84 
5.8 Desenho de primers 85 
5.9 Expressão gênica 85 
6 CONCLUSÕES 88 
7 
8 
9 

DIFICULDADES ENCONTRADAS 
PERSPECTIVAS 
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 

89
90 
91 

 



 

18 

 

1. Introdução 

Os seres humanos, assim como os demais animais, são compostos por 

tecidos celulares, muitos deles frágeis e com necessidade de restabelecimento, 

cura e/ou cicatrização quando traumatizados (Marques; Suzuki; Marques, 2017). 

O tratamento das feridas vem evoluindo desde 3.000 anos A.C., onde as feridas 

hemorrágicas eram tratadas com cauterização. O uso de torniquetes é descrito 

em 400 A.C. e a sutura é documentada desde o terceiro século A.C. (Guia de 

Feridas, 2011). Similarmente, Queen (2004) descreveu que o tratamento de 

feridas começou nos tempos egípcios, com bandagens de gaze embebidas em 

graxa – com pouca atenção ao tratamento de feridas. Entretanto, ao longo dos 

séculos, esses cuidados tornaram-se um pouco mais sofisticados (Figura 1). Da 

mesma forma, os curativos tiveram uma maior repercussão no século retrasado, 

devido os procedimentos de primeiros socorros iniciados em 1859 pelo suíço 

Jean Henry Dunant. Este projeto foi apoiado pelo Napoleão III de França, que 

tinha o intuito de instruir pessoas das comunidades locais, principalmente 

aquelas que viviam em estado de guerra (Soares, 2013).  

             

 Figura 1. Kits de cuidados médicos antigos: a-) Germoplast® (em destaque) e b-) seis 

curativos de primeiros socorros vintage.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Fonte: James, 1954 

 

O cirurgião francês Ambroise Paré, em 1585 orientou o tratamento de 

feridas quanto à necessidade de desbridamento, aproximação das bordas e 

curativos. Lister, em 1884, introduziu o tratamento antisséptico. No século XX, 

vimos a evolução da terapêutica com o aparecimento da sulfa e da penicilina. 

 



 

19 

 

Nos últimos cem anos, o conhecimento a respeito do reparo das lesões 

tem evoluído significativamente devido principalmente às descobertas da ciência 

em relação a eventos fisiológicos e moleculares do organismo e 

desenvolvimento de novos produtos (Broughton; Janis; Attinger, 2006). Os 

avanços na pesquisa com células tronco (CT) e na engenharia de tecidos com o 

uso de substitutos da pele e outros fatores associados são exemplos desse 

progresso (Chua et al., 2016; Marques; Suzuki; Marques, 2017). 

Atualmente existem muitas opções para o tratamento das lesões, tais 

como curativos com vários tipos de cobertura existentes no mercado, 

desbridamento de tecidos desvitalizados, revascularização, aplicação local de 

fatores de crescimento, oxigenoterapia e derme humana (dermagraft) (Haddad, 

2005).  

Por fim, o anseio no desenvolvimento de novos tipos de curativos justifica-

se devido principalmente ao custo elevado do tratamento hospitalar ou 

ambulatorial. Por exemplo, o gasto médio anual nos Estados Unidos dedicado 

ao tratamento do pé diabético é de US$ 18,7 bilhões, devido a isso, muitos 

pesquisadores e Centros de Pesquisa buscam estratégias para acelerar a 

cicatrização de feridas, de uma forma viável, barata e sustentável (Barros et al., 

2021).  

 

 



 

20 

 

2. REVISÃO DA LITERATURA 

 

2.1 Impacto financeiro das feridas nos sistemas de saúde 

O tratamento das feridas crônicas representa um grande gasto para a 

saúde pública. Considerando à necessidade de tratamento prolongado com 

utilização de produtos com preços significativos, os gastos apresentam muitas 

vezes uma barreira para adesão correta ao tratamento. 

O desenvolvimento de novas alternativas para a saúde humana é 

importante, tais como stents, curativos, próteses, implantes etc. Por exemplo, 

somente nos EUA, as feridas dérmicas requerem cuidados intensivos e de longo 

prazo, resultando altos custos para os sistemas públicos de saúde, com um custo 

anual estimado de US$ 28 bilhões e US$ 32 bilhões em produtos para tratamento 

de feridas (Pegorin et al., 2020).  Trabalho recente no País de Gales usando um 

banco de dados integrado mostrou que 6% da população têm feridas crônicas e 

consomem quase £ 330 milhões por ano, o que equivale a 5,5% do orçamento 

do Serviço Nacional deste país (Philips et al., 2016). No Reino Unido foi estimado 

que anualmente 412 mil pessoas desenvolvem uma nova úlcera de pressão (UP) 

e a variação do custo para cura foi de £1,064 (Categoria I) até £10,551 

(Categoria IV)(Bennett et al., 2004). Em Portugal, €9 milhões foram direcionados 

para tratamento das UP na Macronésia (Arquipélagos de Açores, Madeira, 

Canárias e Cabo Verde), no ano de 2006. Esse custo correspondeu a 4,5% da 

despesa pública da saúde dos Açores (Grupo Investigação Científica em 

Enfermagem, 2008). Outro estudo, realizado na Irlanda, para estimar o custo de 

UP categoria IV, mostrou que €119 mil são gastos ao longo de um período de 

cinco meses por paciente. Ainda nesse estudo os autores estimam que €250 

milhões são gastos por ano para gerir as UP em todos os locais de atendimento 

da Irlanda (Gethin et al., 2005). No Brasil, foram identificados estudos que 

estimaram o custo médio, por paciente, das UP com variação de R$98,90 a 

R$180,00 por dia com aumento proporcional ao aumento do grau de destruição 

tecidual (Lima, 2011). Outro estudo realizado em Minas Gerais, identificou gasto 

mensal que variou de R$915,75 a R$36.629,95. Os gastos anuais estimados 

foram de R$445.664,38 desconsiderando gastos com recursos humanos (Costa 

et al., 2015). Cortez et al., 2019, avaliaram os custos do tratamento de lesões 



 

21 

 

cutâneas na atenção primária à saúde e concluíram que os custo do tratamento 

com coberturas avançadas foi, aproximadamente, sete vezes inferior quando 

comparado à modalidade com coberturas convencionais, representando uma 

economia de mais de R$ 85.000,00, ressaltando que o tempo de tratamento na 

modalidade com coberturas avançadas foi menor que o curativo com coberturas 

convencionais e permitiu  o retorno mais breve dos pacientes a suas atividades 

laborais. Essa opção terapêutica ainda proporcionou maior disponibilidade de 

tempo dos profissionais, visto que os curativos não são realizados diariamente. 

Os resultados desse estudo subsidiam a decisão da gestão municipal na adoção 

de práticas mais eficazes e menos dispendiosas no cuidado de pessoas com 

lesões cutâneas. 

Vale ressaltar que o Conselho Internacional de Enfermagem considerou 

que algumas tecnologias são capazes de reduzir os custos, frente ao aumento 

na eficiência e efetividade dos cuidados. Portanto, é importante investir no 

desenvolvimento de estudo de feridas como um campo interdisciplinar a fim de 

diminuir os gastos com esse tipo de tratamento, ajudar a gerenciar a saúde 

pública e melhorar a qualidade de vida dos pacientes. 

 

2.2. Definição e Tipos de Biomateriais 

Park e Lakes, 2007 definem que biomaterial é qualquer material 

empregado na fabricação de dispositivos para substituir uma parte ou função do 

corpo de forma segura, confiável, econômica e fisiologicamente aceitável. Trata-

se de uma definição geral, mas clara e coerente.  Já Hench (1980), definiu que 

biomateriais tinham a finalidade de atingir uma combinação adequada das 

propriedades físicas do material com a do tecido reimplantado, com mínima 

toxicidade ao hospedeiro. Por fim, Williams (2009) conceituou biomateriais como 

qualquer substância que tenha sido engenheirada de modo que, sozinha ou em 

sistemas complexos, seja empregada para conduzir, por meio do controle de 

interações com componentes de sistemas vivos, o curso de determinada terapia 

ou diagnóstico médico.  

Pires et al (2015) relata que há cerca de 300 mil produtos utilizados na 

área de saúde que são biomateriais nesta última década. Dentre eles, estão os 

curativos, dispositivos para a liberação de medicamentos (na forma de adesivos, 



 

22 

 

partículas ou transdérmicos), materiais implantáveis (como suturas, placas, 

substitutos ósseos, tendões, telas ou malhas, válvulas cardíacas, lentes, 

dentes), dispositivos biomédicos (como biossensores, tubos de circulação 

sanguínea, sistemas de hemodiálise), órgãos artificiais (como coração, rim, 

fígado, pâncreas, pulmões, pele) e etc.   

Os biomateriais podem ser classificados em quatro classes de acordo 

com a compatibilidade que apresentam com os tecidos adjacentes: biotoleráveis, 

bionertes, bioativos e bioreabsorvíveis. Enquanto à natureza, os biomateriais são 

classificados como: metálicos, poliméricos, cerâmicos e compósitos. Além disso, 

a biocompatibilidade, biofuncionalidade e bioadesão são fundamentais, quanto 

trata-se estes biomateriais como dispositivos médicos (Herculano, 2009). 

Resumidamente, os biomateriais são produzidos de modo a facilitar a 

interface entre sistemas biológicos, buscando tratar ou substituir um órgão ou 

tecido lesionado. Estes podem ser empregados de diferentes formas, variando 

de acordo com o uso terapêutico, seja como scaffolds ou arcabouços, 

facilitadores do crescimento celular ou associados à compostos que promovam 

a liberação sustentada em um alvo específico, por exemplo.   

 

2.3. Látex Natural (LN) 

Dentre as plantas produtoras de látex, a mais conhecida e explorada 

comercialmente é a seringueira (Hevea brasiliensis), uma planta originária da 

Amazônia brasileira, porém que vem sendo cultivada principalmente no sudeste 

Asiático (Blackley, 1997). 

O LN da seringueira é composto por uma complexa mistura de diferentes 

componentes, incluindo macromoléculas. Um dos componentes majoritários do 

látex é o cis e/ou trans poli-isopreno. Outros constituintes presentes no látex  

relatados em estudos fitoquímicos são: polissacarídeos, flavonóides, lipídios, 

fosfolipídios e proteínas. Comprovou-se também a existência de alcanos, 

cetonas triterpênicas, triterpenóides, açúcares e ácidos graxos (Uzabakiliho et 

al.,1987). Sabe-se que o poli-isopreno é um dos componentes de todas as 

espécies laticíferas, porém a elucidação dos outros constituintes necessita de 

estudos mais aprofundados (Nascimento, 2006). O látex amoniacal ao ser 

submetido a um processo de ultracentrifugação, se divide em três fases distintas 



 

23 

 

(Figura 2), com os percentuais aproximados, em massa/massa do látex e com a 

indicação dos principais constituintes em cada fase (Blackley, 1997):  

• F1 – Fase superior, contendo as partículas de borracha (35 %): 

elastômero, fosfolipídios e proteínas;  

• F2 – Fase intermediária, sendo o soro do látex (55 %): água, proteínas, 

componentes protoplasmáticos, não protoplasmáticos e eletrólitos;  

• F3 – Fase de fundo, contendo lutóide (10 %): proteínas, lipídios, 

carotenos e íons metálicos. 

 

Figura 2. Fracionamento do látex (Hevea brasiliensis) através da centrifugação de alta rotação 

F1 (fase superior, contendo partículas de borracha), F2 (fase intermediária, sendo o soro do 

látex) e F3 (fase de fundo, contendo os lutóides) 

 

 

 

 

 

 

 

 

Fonte: Autoria própria 

 

As partículas de borracha natural contêm centenas de moléculas de 

hidrocarbonetos que são envolvidas por um filme de proteínas e fosfolipídios, 

que lhe confere carga negativa promovendo estabilidade coloidal das partículas. 

O diâmetro das partículas de borracha pode variar de 5 nm até 3.000 nm, 

chegando em alguns casos até a 5.000 nm ou 6.000 nm (Wisniewski, 1983). 

Aproximadamente 27% do conteúdo total de proteínas no látex recém coletado 

estão adsorvidas na superfície das partículas de borracha e acredita-se que 

parte das proteínas estejam no interior das partículas (Rippel, 2005). Esta 

camada de proteínas adsorvidas confere estabilidade as partículas de látex 

estabilizado com amônia, devido a sua carga negativa.  



 

24 

 

A presença de longas cadeias de hidrocarbonetos nas moléculas de 

fosfolipídios faz com que tenha forte atividade de superfície, sendo fortemente 

adsorvidos na superfície das partículas de borracha: as cadeias de 

hidrocarbonetos ficam ancoradas na borracha e os grupos de cabeça polar na 

fase aquosa. Assim é possível explicar a forte adsorção de proteínas na 

superfície das partículas considerando que os fosfolipídios têm carga positiva, 

enquanto as proteínas têm carga negativa, levando a associação iônica entre 

dois tipos de moléculas (Rippel, 2005). 

Os lutóides formam o segundo componente principal do látex de Hevea 

brasiliensis. Eles são constituídos de proteínas (solúveis e insolúveis), 

fosfolipídios e sais minerais, ligados ou circundados por membranas e são, na 

média, muito maiores em tamanho do que as partículas de borracha. Eles têm 

de 2.000 a 5.000 nm de diâmetro, ligados por uma membrana de cerca de 8 nm 

de espessura também com carga negativa (Blackley, 1997).  

O conteúdo dos lutóides é chamado soro B, contém vários cátions, 

principalmente cálcio, magnésio, potássio, cobre e proteínas catiônicas que tem 

ação floculante muito rápida sobre partículas de borracha no látex, resultando na 

formação de microflocos. Os lutóides dissolvem quando o látex recém coletado 

é estabilizado com amônia, de tal forma que temos no látex amoniacal um 

sistema de duas fases, constituindo das partículas de borracha e do soro 

(Sethuraj e Mathew, 1992). 

O soro do látex natural tem densidade de 1,020 g/cm3 e contém diferentes 

espécies químicas como carboidratos, eletrólitos, proteínas e aminoácidos. 

(Blackey, 1997). Estes elementos são absorvidos do solo, transportados na seiva 

e participam de reações que envolvem a biossíntese do látex (Pierre e Jean-Luc, 

2003). 

O látex é fonte de matéria-prima para a fabricação de vários produtos 

incluindo luvas, bexigas, preservativos entre outros, e mesmo sendo uma 

borracha natural, o látex pode causar alergias graves. A alergia ao látex é uma 

reação do sistema imunológico, mediada por Imunoglobina E (IgE) às proteínas 

(Hev b 1 a 14) encontradas no látex de borracha natural (Pierre e Jean-Luc, 

2003).  



 

25 

 

A partir do ponto em que se estabelece a relação entre as proteínas e os 

processos alérgicos, iniciam-se pesquisas por tratamentos de várias formas 

visando reduzir ou eliminar os efeitos alergênicos das proteínas do látex. As 

formas testadas utilizam tratamentos com enzimas proteolíticas que hidrolisam 

ou segmentam as proteínas em resíduos menores e, ao mudar a forma química 

e/ou a conformação estrutural da proteína, a inativam para suas reações 

específicas como os processos alérgicos. Também são realizados tratamentos 

químicos com surfactantes ou detergentes que lavam no todo ou em parte as 

proteínas do sistema, e com reagentes alcalinos para saponificar as proteínas, 

o que também pode ter efeito positivo para extinguir ou atenuar o efeito adverso 

das proteínas. Os processos físicos como a centrifugação, mencionada 

anteriormente, é realizada para reduzir as proteínas por arraste no soro aquoso.  

Algumas manifestações alérgicas, não são causadas pelo látex, mas 

pelos aditivos químicos, como enxofre, tiurams, carbamatos, mercapto 

benzatiazoles, aminas e tiocarbonatos utilizados para fabricação de alguns 

materiais, como por exemplo, as luvas de procedimento comumente utilizadas 

na área da saúde (Raulf, 2014 e Gawchik, 2011). Estes aditivos não são 

utilizados na confecção das biomembranas para fins curativos, assim como as 

amostras desse estudo que foram preparadas com o látex de borracha natural 

não vulcanizado, apropriado para aplicação biológica.  

 

2.4 Aplicações biomédicas do LN 

Desde sua descoberta como biomaterial, as membranas de borracha 

natural, tem sido objeto de vários estudos, sendo suas propriedades físicas e de 

biocompatibilidade determinadas inicialmente em modelos animais (Frade et al., 

2001). Atualmente algumas membranas com este material têm sido empregadas 

como próteses e enxertos médicos, devido às suas características de 

biocompatibilidade e estímulo natural à angiogênese (Guryanov et al., 2016). 

De acordo com a literatura, o látex da seringueira possui propriedades 

indutoras de regeneração tecidual, as quais foram constatadas em diferentes 

estudos, tais como: cicatrização de feridas em tecidos cutâneos (Frade, 2003), 

reconstituição de membrana timpânica, regeneração de ossos (Herculano et al., 



 

26 

 

2009; Ereno et al., 2010; Martins et al., 2010) e substituição de alvéolo dental de 

ratos (Balabanian et al., 2006). 

O LN apresenta baixo custo, sem risco de transmissão de patógenos e de 

grande aplicabilidade clínico-social (Frade et al., 2001). Tais propriedades 

elevam o potencial de reparação tecidual proporcionando considerável 

diminuição no tempo do tratamento e recuperação tecidual (Mrué, 2000; Mrué, 

1996). Frade et al., 2001, realizaram um estudo de grande impacto social 

utilizando membranas de látex natural como material indutor da cicatrização de 

úlceras diabéticas. A Figura 3 mostra uma ferida em estágio avançado de 

cicatrização após dois meses de uso contínuo da membrana de látex natural. 

 

Figura 3. Evolução da cicatrização da úlcera através da aplicação da membrana de látex: A - 

Aspecto inicial da ferida apresentando grande quantidade de tecido fibroso necrosado; B - 

Aplicação da membrana de látex natural; C - Ferida apresentando redução do tecido fibroso 

necrosado; D - Ferida em estágio avançado de cicatrização 

 

 

 

 

 

 

 

Fonte: Frade et al. (2001) 

 

Frade et al. (2010) pesquisaram possíveis reações alérgicas ao látex e 

demonstraram que a biomembrana de látex é segura como curativo para úlceras 

cutâneas, uma vez que não foi observada a indução de reações de 

hipersensibilidade entre os voluntários de baixo e alto risco submetidos ao “patch 

test”, nem entre os pacientes ulcerados usuários da biomembrana. Herculano et 

al. (2009), Ereno et al. (2010) e Romeira et al. (2012), referem que o látex natural 

é um material biocompatível com inúmeras aplicações, além de apresentar alta 

resistência mecânica e baixo custo. Atrelado a estas vantagens Alves (2003), 

mostrou que o látex possui a propriedade de formação de novos vasos 



 

27 

 

(angiogênese). Embasada nessas razões, Romeira et al. (2012) consideram que 

o látex da H. brasiliensis é um excelente material a ser utilizado como matriz 

sólida para o sistema de liberação prolongada.   

O efeito das membranas de látex natural foi avaliada por Spin (2018)  

sobre feridas em palato originadas da remoção de enxerto gengival em 

humanos, os resultados obtidos neste estudo não demonstraram diferenças 

estatística entre o grupo controle e o látex, porém no período de 3 dias pode se 

observar nas bordas das feridas do grupo látex, um halo esbranquiçado, o que 

caracteriza um processo comum em fechamento de feridas, onde existe 

proliferação epitelial na região da injúria, fato que pode estar relacionado com a 

capacidade angiogênica do látex. 

Chagas (2020), estudou as propriedades cicatrizantes de dois 

biomateriais: o látex natural e o colágeno, criando uma biomembrana alternativa 

para o tratamento de úlceras por pé diabético e concluiu que as membranas de 

látex e látex com colágeno apresentaram características que definem um bom 

curativo e não causaram danos às células humanas.  

Almeida (2019), relatou que o hidrogel de gengibre amargo é utilizado 

para a cicatrização de úlceras por pé diabético, evitando a amputação, pois une 

propriedade anti-inflamatórias, analgésicas e vasodilatadoras.  

Pesquisadores também desenvolveram membranas que uniram as 

propriedades cicatrizantes e antimicrobianas da nanocelulose com as 

propriedades de desbridamento da bromelina, uma protease encontrada no 

abacaxi (Ataide et al., 2017). 

Trabalhos científicos realizados com a biomembrana natural de látex com 

polilisina 0,1% em cães com defeito palatino, tornaram conhecidas suas 

propriedades de favorecimento e aceleração do processo cicatricial, de 

estimulação da neovascularização, de crescimento tecidual organizado em 

diferentes órgãos e tecidos e de biocompatibilidade. Silva e Maniscalco, 2013, 

avaliaram a aplicação da biomembrana de látex em cães com defeito provocado 

no palato e concluíram que a mesma foi um fator de aceleração do processo de 

reparo, visto que os animais do grupo controle demoraram mais tempo para ter 

o defeito totalmente fechado em relação ao grupo controle. 



 

28 

 

Em outro estudo Carlos, 2017, utilizou a membrana de látex sobre o 

defeito ósseo, envolvendo a tíbia e protegendo o coágulo sanguíneo autógeno 

(Figura 4) e concluiu que a utilização das membranas de látex aumentou o 

volume ósseo neoformado na região do defeito. 

 

Figura 4. Defeitos ósseos preenchidos com coágulo de sangue autógeno (A), membrana de 

látex cobrindo o terço médio da tíbia (B), e radiografia do defeito ósseo na tíbia (C). 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Fonte: Carlos, 2017 

 

Ainda sobre a aplicação biomédica do LN estudos recentes têm 

demonstrado que este material, tornou-se alvo de grande interesse no estudo e 

desenvolvimento de sistemas de liberação controlada de substâncias de 

interesse farmacológico, sendo possível ser empregado como em próteses e 

enxerto devido a suas características de compatibilidade biológica e ligado ao 

estímulo natural de promover angiogênese (Garms et al., 2017). A incorporação 

de compostos terapêuticos nas matrizes de curativo pode proporcionar a 

liberação sustentada e localizada para a área da lesão (Guerra, et al., 2021)  

 Herculano, 2011 e Murbach, et al. (2014) estudaram a utilização do látex 

natural como matriz sólida na liberação sustentada de metronidazol e 

ciprofloxacina, respectivamente.  

Borges, et al. (2014) e Floriano et al. (2018) estudaram a liberação de 

extrato natural da Casearia sylvestris e do cetoprofeno incorporado à matriz de 

látex natural, respectivamente. Na literatura existem muitos estudos sobre o látex 

com resultados satisfatórios que permitem a avaliação do seu emprego 



 

29 

 

experimental em diferentes tecidos, devido as suas propriedades de indução da 

neovascularização. Existem evidências que sugerem o aumento da 

vascularização local e a reepitelização das feridas devido a presença de 

proteínas no látex, conforme relataram Frade et al. (2001).  

O trabalho desenvolvido por Silva et al. (2014) ilustra o potencial da 

membrana de látex em aplicações de produtos inovadores. Neste trabalho eles 

desenvolveram uma membrana feita de látex e própolis, um conhecido agente 

com propriedades antimicrobianas, antioxidantes e anti-inflamatórias (Banskota 

et al., 2001). Os resultados mostraram que a incorporação de própolis nas 

membranas de látex conservou as características mecânicas compatíveis com 

os curativos, mostrando efetividade para aplicações biomédicas. 

Miranda et al. (2018) avaliaram a incorporação e a liberação de peptídeos 

utilizando a membrana de látex natural. A análise da solução da liberação 

mostrou novos compostos, indicando a degradação do peptídeo por enzimas 

contidas no látex. Foi avaliado também a liberação de peptídeo com sequências 

menores e a degradação não foi observada. Os resultados encontrados 

indicaram que o uso da membrana natural de látex como matriz sólida de sistema 

de liberação de peptídeos são dependentes das sequências e devem ser 

avaliados para cada sequência. 

Floriano et.al. (2017), utilizaram membranas de látex para liberação de 

cetoprofeno, um analgésico com potente atividade anti-inflamatória. Os 

resultados constataram que houve liberação de 60% do cetoprofeno incorporado 

em 50h, concluindo ser um sistema promissor de liberação de medicamentos 

que pode ser utilizado para minimizar os efeitos colaterais adversos da alta dose 

da entrega de drogas sistêmicas. 

O extrato de barbatimão foi testado por Borges et al. (2015), usando a 

membrana de látex como sistema de liberação, sendo possível concluir que a 

liberação dependeu da concentração final da solução do extrato.  

Outro estudo realizado por Marcelino et al. (2018), elaboraram 

membranas de látex com fluconazol incorporado, afim de estudar sua interação, 

liberação e suscetibilidade antifúngica contra cândida albicans. Os resultados 

mostraram que a membrana foi capaz de liberar o fluconazol e inibir o 

crescimento de C. albicans. 



 

30 

 

Tanaka et al. (2021), desenvolveram um curativo a base de sulfadiazina 

de prata e látex natural. O curativo mostrou-se biocompatível, aumentando a 

proliferação celular e liberando 32,4% da sulfadiazina em 192 h. 

Um adesivo natural de látex e glicerol foi desenvolvido por Barros et al. 

(2019), para a diminuição da dor e das fissuras no mamilo durante a lactação. O 

material desenvolvido apresentou alta capacidade de umidade e densidade de 

poros e biocompatibilidade nos testes realizados com cultura celulares. 

Outro teste realizado por Borges et al. (2022) com potencial para reparo 

de feridas, demonstraram o uso do látex incorporado com o antibiótico 

metronidazol e nanopartícula de ouro, promissor para aplicações dérmicas. 

 

2.5. Engenharia tecidual no reparo de lesões cutâneas  

A engenharia de tecidos é um dos campos da medicina regenerativa que 

utiliza métodos para promover o crescimento de células através da manipulação 

de biomateriais, artificiais ou naturais, que forneçam o suporte para o 

crescimento controlado em diferentes tipos de tecido. Fundamentalmente, os 

biomateriais devem fornecer um ambiente que favoreça a interação celular; 

corresponder a uma matriz permeável que permita difusão de nutrientes, gases 

e metabólitos; e ainda, suporte mecânico, para a reposição e regeneração do 

tecido (Serpooshan et al., 2010).  

Os biomateriais devem exibir características como a biocompatibilidade, 

biodegradabilidade, capacidade de formatação, nenhuma reação imunogênica e 

força estrutural adequada. Vários biomateriais vêm sendo empregados como 

alternativas para o reparo tecidual e nesta terapêutica estão os polímeros, os 

quais merecem destaque, os de origem naturais. Alguns exemplos de 

biomateriais naturais incluem os polipeptídios, hidroxiapatita, ácido hialurônico, 

glicosaminoglicanas, fibronectina, colágeno, gelatina, metacrilato de gelatina 

(GelMA), quitosana e alginato.  

Esses materiais têm a vantagem de ser de baixa toxicidade e baixa 

resposta inflamatória e podem ser combinados em compósitos com outro 

material natural ou material sintético, podendo ser degradados naturalmente 

pelas enzimas (Chen et al., 2004). Como já descrito, o látex e/ou suas frações 

vem sendo aplicado na medicina como constituinte de biomateriais para o uso 



 

31 

 

terapêutico e em 1998, a biomembrana de látex (BML) surgiu como elemento 

promissor, pois além do baixo custo de obtenção, a BML possui características 

físico-químicas que auxiliam na cicatrização. Especificamente, Pegorin et al. 

(2022) caracterizou o soro látex natural por técnicas físico-químicas e investigou 

a biocompatibilidade por ensaios toxicológicos e teste de segurança em larvas 

de Galleria mellonella. Além disso, os pesquisadores observaram um efeito 

proliferativo pronunciado em células de fibroblastos que pode ser explicado pela 

presença do fator de crescimento de fibroblastos (FGF) como proteína revelada 

pelo teste de Western blot (Pegorin et al., 2022). A Figura 5 mostra a aplicação 

do soro do látex em diferentes concentrações nos animais alternativos, em 

diferentes dias, onde esse aparato é interessante para triagem de novos 

biomateriais.  

 

Figura 5. Aparência visual da avaliação da toxicidade de soro de látex em larvas de G. 

mellonella em três concentrações (3, 5 e 10 mg/kg) após 11 dias. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Fonte: Pegorin et al. (2022) 

 

 

2.6. Angiogênese e Fatores de Crescimento  

A formação de novos vasos se dá através da vasculogênese ou da 

angiogênese. Na primeira, a formação de novos vasos surge a partir de 

hemangioblastos, células percursoras das células endoteliais, a segunda 

decorre de vasos sanguíneos pré-existentes, ocorrendo por quatro mecanismos 

diferentes: brotação, intussuscepção (divisão de estrutura vascular pré-



 

32 

 

existente), elongação/ampliação e por incorporação das células precursoras das 

células endoteliais nas paredes dos vasos sanguíneos. Sua regulação ocorre por 

meio de moléculas pró-angiogênicas e anti-angiogênicas (Chung, 2011). Como 

exemplo destas moléculas temos a angiopoetina (Angpt-1), através da interação 

com seu receptor (Tie-2), neutraliza a vaso dilatação enquanto a angiopoetina 2 

(Angpt-2) desestabiliza a matriz extracelular através da degradação parcial, bem 

como a ativação proteolítica de fatores de crescimento (Carmeliet, 2000).   

A indução da angiogênese se deve a fatores como hipóxia, ph ácido, 

estímulos hormonais entre outros, resultando na síntese de fatores de 

crescimento e citocinas que são liberados na matriz extracelular migrando em 

direção às células endoteliais (Chung, 2011).  

Fatores de crescimento são proteínas produzidas por células do tecido e 

são responsáveis pelo fenômeno conhecido por “Comunicação Celular” 

promovendo a proliferação, diferenciação e quimiotaxia, induzindo a migração 

de variadas células. Graças a esta “comunicação química” existente entre as 

células que o tecido desempenha a sua função.  

Essas proteínas regulam direta e externamente o ciclo celular, ligando-se 

a receptores localizados na membrana plasmática de células epiteliais, tais como 

os macrófagos, fibroblastos e queratinócitos, provocando uma cascata 

bioquímica que além de produzirem os fatores de crescimento também são 

ativadas por eles, atuando assim de forma autócrina ou parácrina (Vermolena et 

al., 2006; Balbino et al., 2005).  

Muitos fatores de crescimento existem em várias isoformas, com diversos 

tipos de receptores presentes nas feridas, o que aumenta a complexidade de 

suas funções. Os fatores de crescimento são capazes de induzir efeitos em 

múltiplos tipos de células e provocam uma série de funções biológicas em 

diversos tecidos.  

O efeito sinérgico de diferentes fatores tem uma consequência positiva na 

cicatrização (Metha e Fitzpatrick, 2007). De acordo com Lorenz e Longaker 

(2006), o fator de crescimento (Figura 6), tem efeito benéfico no processo de 

cicatrização acelerando as taxas de cura em feridas normais ou, em alguns 

casos, em feridas de difícil cicatrização, como as feridas diabéticas (Man; 

Winland; Plosker, 2001). 



 

33 

 

 

 

Figura 6. Mecanismos de comunicação celular promovido por fatores de crescimento 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Fonte: Cesaretti (1998) 

 

Os fatores de crescimento se depositam na matriz extracelular de tecidos 

normais na forma latente. Quando ocorre a lesão e a matriz é destruída, os 

fatores são liberados na forma ativada e, assim, ajudam no início e na regulação 

do processo de reparo, portanto a importância, também, da matriz extracelular 

na regeneração das feridas (Marx, 2004).  

Através do envelhecimento e por decorrência de algumas doenças, a 

produção de fatores de crescimento é diminuída e, com ela, a fisiologia do tecido.  

Vários peptídeos com papel de fator de crescimento relacionados à 

angiogênese já foram purificados, entre eles o fator ácido de crescimento de 

fibroblastos (aFGF), o fator básico de crescimento de fibroblastos (bFGF), a 

angiogenina, o fator endotelial II derivado das plaquetas (PD-ECGF), o fator 

induzido por hipóxia (HIF-1), o fator de transformação do crescimento α e β (TGF-

α e TGF-β), o fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF), o fator de 

necrose tumoral α (TNF-α), o fator de crescimento epidérmico (EGF), a 

interleucina 1 (IL-1), a interleucina 2 (IL-2), o fator de cicatrização/fator de 

crescimento do hepatócito (SF/HGF) e o fator de permeabilidade vascular (VPF), 



 

34 

 

atualmente chamado de fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) 

(Paques, 1997). 

Um dos principais fatores responsáveis pela angiogênese, com 

importante ação na proliferação, sobrevivência e migração celular, além de 

mediar a permeabilidade vascular é o fator de crescimento endotelial vascular 

(VEGF) e seus receptores (Pinho, 2005). 

 

2.7. Fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) 

O VEGF foi um dos primeiros fatores angiogênicos a serem identificados 

e acredita-se ser o principal regulador da angiogênese, com ação específica para 

células endoteliais.  

Em 1983, Harold Dvorak e colaboradores foram os primeiros a identificar 

esta glicoproteína por meio da purificação de células tumorais, ao perceberem 

que esta melhorava a permeabilidade celular, sendo chamada de fator de 

permeabilidade vascular (VPF). Posteriormente, em 1989, Ferrara e Henzel 

identificaram a mesma proteína da qual Ferrara já tinha purificado e sequenciado 

em meio condicionado com células pituitárias bovinas e relataram que ocorreu a 

proliferação das células endoteliais vasculares. Em 1990, ficou claro que as duas 

proteínas eram a mesma, passando a ser denominada fator de crescimento 

endotelial vascular (VEGF) (Roskoski, 2007). 

Como um potente fator de permeabilidade, o VEGF promove 

extravasamento do fibrinogênio plasmático, levando a formação de escadas de 

fibrina (Figura 7) que facilita a migração celular durante invasão. Como um fator 

de crescimento endotelial, o VEGF estimula a proliferação de células endoteliais, 

induzindo o brotamento de novos vasos sanguíneos (Kaseb, 2009). 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

35 

 

Figura 7. Mecanismo do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) na cicatrização de 

feridas 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Fonte: Philip, 2009 

 

A formação de novos vasos sanguíneos é iniciada por condições de 

hipóxia ou isquemia. Os baixos níveis de oxigênio levam ao acúmulo de Fatores 

Induzidos por Hipóxia (HIF-1) que estimulam a expressão de fatores de 

crescimento angiogênico (Lee et al., 2001). A família VEGF é composta de sete 

glicoproteínas; VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF-F e o fator 

de crescimento placentário. São mediados por três receptores transmembrana 

tirosina quinase, conhecidos como VEGFR (receptor do fator de crescimento 

endotelial vascular) denominados: VEGFR-1 (fms-like tyrosine kinase 1 ou Flt1), 

VEGFR-2 (fetal liver kinase, Flk1 ou KDR), VEGFR-3 (fms-like tyrosine kinase 4 

ou Flt4) (Ferrara, 2003). Os dois primeiros são expressos predominantemente 

em células endoteliais vasculares e o VEGFR-3 é expresso principalmente em 

células endoteliais linfáticas. As neutrofilinas 1 e 2 (NRP- 1 e 2) também agem 

como receptores para alguns membros da família do VEGF (Capp, 2009). 



 

36 

 

A função principal que ambos os receptores (VEGFR-1 e VEGFR-2) 

possuem no desenvolvimento do sistema vascular foi demonstrada em cobaias, 

em estudos desenvolvidos no Instituto Samuel Lunenfeld em Toronto, no ano de 

1995. Através dessas pesquisas, pode-se observar que a eliminação dos genes 

relacionados a ambos os receptores Flt-1 ou Flk-1 em cobaias resultou em 

letalidade embrionária (Ferrara, 2002). 

Os vários membros da família VEGF tem diferentes afinidades de ligação 

com cada receptor. O VEGF-A é o fator chave na indução da angiogênese, que 

através da ligação ao receptor VEGFR-2 leva ao aumento da permeabilidade 

vascular (Miyazawa, 2007). 

O VEGF-B é expresso no coração e musculatura esquelética, acredita-se 

que seja importante no desenvolvimento cardíaco além de regular a 

biodisponibilidade do VEGF-A competindo pelo receptor VEGFR-1 e NRP-1, ao 

qual se liga (Roskoski, 2007).  

O VEGF-C se liga com o VEGFR-3 e com o VEGFR-2, promovendo 

também a angiogênese (Miyazawa, 2007). 

O VEGF-D também se liga ao receptor linfático VEGFR-3, induzindo a 

linfangiogênese. Além disto, promove a disseminação de células tumorais para 

os linfonodos (Young, 2008).  

O VEGF-E conecta-se com o VEGFR-2, in vitro estimulando a quimiotaxia 

e mitose celular, in vivo induz a angiogênese e aumenta a permeabilidade 

vascular (Roskoski, 2007). O fator de crescimento mais recentemente 

descoberto é o VEGF-F, proveniente do veneno de cobra, este fator se liga 

somente com o VEGFR-2 e aumenta em até cinco vezes a permeabilidade 

vascular (Matsunaga, 2009). 

O VEGF, como citado previamente, poder ser induzido por vários fatores, 

sendo a concentração celular de oxigênio um dos principais. Na vigência de 

hipóxia, ocorre o aumento da quantidade de VEGF, de glóbulos vermelhos e 

fornecimento de oxigênio (Roskoski, 2007). A hipóxia induz a síntese de VEGF 

através do fator indutor de hipóxia (HIF). HIFs são fatores de transcrição 

heterodimérico composto por duas subunidades, α e β. A subunidade HIF-1α é 

regulada pelos níveis teciduais de oxigênio, sendo mantido em baixa quantidade 

em condições normais (Chung, 2011). 



 

37 

 

A formação de vasos sanguíneos requer uma ativação coordenada de 

vários mediadores, no entanto a hiper expressão do VEGF-A resulta em vasos 

anormais, tortuosos, frágeis, com propensão a sangramento e exsudação 

(Bondke, 2011). 

Além da hipóxia, vários fatores regulam a expressão do VEGF, entre eles, 

os fatores de crescimento PDGF (Muniz, 2009), o EGF (Raiser et al., 2009), o 

TGF-β e também prostaglandina E (Simo, 2008). 

 

2.8. Fator de Crescimento fibroblástico (FGF) 

Os fatores de crescimento fibroblásticos (FGF – fibroblast growth fator) 

regulam uma infinidade de processos no desenvolvimento, incluindo o 

desenvolvimento embriológico, homeostase e processos regenerativos (Marie, 

2003). 

A família dos FGF é composta de 22 membros estruturalmente 

relacionados (Ornitz, Itoh, 2001). Os FGFs possuem como característica a 

interação destes com a heparina e proteoglicanos que os estabiliza da 

desnaturação térmica, proteolítica e limita a sua difusibilidade. Esta interação é 

ainda essencial para a sinalização de seus receptores (Ornitz, 2000). 

Dentre todos os FGFs, aqueles que vem demonstrando maior 

potencialidade de participação no processo de reparo são FGF1, FGF2, FGF4, 

FGF7 e o FGF10 (Abraham, Klagsbrun, 1996). Em lesões por queimaduras em 

ratos, foi detectada a imunorreatividade na regeneração da epiderme para o 

FGF2, acompanhada de formação de tecido de granulação e renovação capilar 

(Kibe et al., 2000). Este fator foi também detectado nas margens de queimaduras 

em humanos.  

Diferentemente do VEGF, o FGF-2 tem ação pleiotrópica, estimulando o 

crescimento tanto de células endoteliais, como de células da musculatura lisa, 

fibroblastos e células tumorais (Folkman, 1992). Além de estimular o 

crescimento, esse fator pode degradar a membrana basal pela ativação de 

colagenases, gelatinases e proteases (Mignatti, 1989). 

A demonstração da participação do FGF7 no processo de reparo foi feita 

por Guo et al. (1996). Posteriormente, foi verificado que seu RNAm era 



 

38 

 

predominantemente detectado em fibroblastos da derme e em tecido de 

granulação de humanos e de camundongos (Marchese et al., 1995). 

Os FGFs se ligam e ativam 4 tipos de receptores tirosino Kinase (Givol, 

Yayon, 1992), designados como receptores de alta afinidade ao FGF (FGFRs). 

O gene de cada um dos quatro FGFRs (FGFR 1 - 4) pode sofrer splicing 

alternativo, dando origem a uma série de possíveis isoformas de FGFRs, com 

afinidade variadas pelos vários FGFs. 

 

2.9. Fator de crescimento transformante alfa (TGF-α) e fator de crescimento 

transformante beta (TGF-β1) 

O fator de crescimento transformador alfa (TGF-α) é secretado pelas 

plaquetas, macrófagos e células epidérmicas e é responsável pela angiogênese 

e epitelização (Campos, 2007). O fator de crescimento transformador beta (TGF-

β) constitui a superfamília de mediadores locais que regulam a proliferação e as 

funções das células, sendo produzidos por plaquetas e macrófagos. O TGF-β é 

responsável pela ativação dos fibroblastos a produzirem colágeno e a 

transformarem-se em miofibroblastos que promovem a contração da ferida 

(Abegão, 2014). Em mamíferos, a subfamília TGF-β é composta por três 

isoformas, denominadas TGF- β1, TGF- β2 e TGF- β3. 

Dos fatores transformadores de crescimento, TGF- β1 é o mais importante 

fator envolvido na reparação, pois é regulado pelas células recrutadas para o 

sítio da injuria. Juntamente com algumas citocinas antiinflamatórias, o TGF- β1 

estimula subunidades de integrinas que facilitam a migração das células que vão 

iniciar a diferenciação celular relacionadas com o reparo do tecido afetado 

(Bernabeu, 2009). 

A importância do TGF- β1 na manutenção da homeostasia tecidual foi 

demonstrada por D’Souza et al. (1990), em um estudo empregando 

camundongos knockout para este fator de crescimento. Uma vez adultos, pôde 

ser observada nos dentes destes animais a presença de inflamação e necrose 

difusas tanto em um tecido como em outro, além de um desgaste por atrição 

acentuado. 

Todos os membros da família TGF- β se ligam a receptores de superfície 

celular tipo I e II (TBRI e TBRII) que por sua vez formam complexos 



 

39 

 

heteroméricos na presença de ligantes dimerizadores. São descritos sete TBRI, 

também nomeados ALKs (activin-like receptor kinases), bem como cinco TBRII 

(Shi e Massague, 2003). Os ligantes solúveis se ligam primeiramente ao TBRII, 

que é constitutivamente ativo. Em seguida, ocorre a incorporação de TBRI com 

sua consequente fosforilação formando um complexo ligante-receptor ativado 

(Kang et al. 2009). Na sequência, o TBRI ativado fosforila moléculas efetoras 

downstream denominadas Smads. Esta família de proteínas é responsável pela 

sinalização intracelular de TGF- β. Os membros desta família são bem 

conservados e classificados em três grupos: (i) R-Smads (Smads associadas a 

Receptor), (ii) Co-Smads (Smads Cooperadoras) e (iii) I-Smads (Smads 

inibitórias) (Huminiecki et al., 2009). 

 

2.10 Fisiopatologia da reparação tecidual  

A reparação tecidual é um processo complexo, que envolve a organização 

de células, os sinais químicos e a matriz extracelular. Com o rompimento da 

integridade tecidual, logo se inicia o processo de reparo, que compreende uma 

sequência de eventos moleculares e celulares que objetivam restaurar o tecido 

lesado. Só durante a fase fetal o reparo de lesões se dá sem a formação de 

cicatriz, ocorrendo perfeita restauração do tecido pelo processo de neoformação 

tecidual. Após o nascimento, o organismo se torna limitado, e em algumas 

situações, desencadeia a formação da cicatriz após o reparo (Mendonça e 

Coutinho-Netto, 2009).  

Os mecanismos da cicatrização em sequência ordenada de eventos 

foram descritos por Carrel em 1910, e divididos posteriormente em cinco 

elementos principais: inflamação, proliferação celular, formação do tecido de 

granulação, contração e remodelamento da ferida (Balbino & Pereira, 2005).  

Há trabalhos que dividem as fases de cicatrização em três ou quatro 

fases. Recentemente, Clark reclassificou esse processo em três fases divididas, 

didaticamente, em: fase inflamatória, fase de proliferação ou de granulação e 

fase de remodelamento ou de maturação (Campos et al., 2007), descritas a 

seguir. 

 



 

40 

 

2.10.1 Fase de inflamação  

Após a ocorrência do ferimento, inicia-se a fase inflamatória, com o 

extravasamento sanguíneo que preenche a área lesada com plasma e 

elementos celulares, principalmente plaquetas (Werner e Grose, 2003). As 

lesões capazes de atingir profundamente o tecido cutâneo desencadeiam um 

reflexo axônico que leva a vasoconstrição transitória com oclusão dos vasos 

injuriados. Passados alguns minutos, ocorre a vasodilatação e exsudação dos 

componentes plasmáticos não celulares através dos espaços entre as células 

endoteliais.  

O principal componente desse fluído é a fibrina, que tem a função de 

preencher os espaços teciduais, formando um tampão na tentativa de controlar 

a hemorragia (Peacock, 1984) e formar uma barreira contra a invasão de micro-

organismos. O coágulo estabiliza as bordas da ferida e organiza uma matriz 

provisória necessária para a migração celular (Raiser, 2000; Werner e Grose, 

2003). Essa matriz servirá também, como reservatório de citocinas e fatores de 

crescimento que serão liberados durante as fases seguintes do processo 

cicatricial (Werner e Grose, 2003). 

A resposta inflamatória, que perdura cerca de três dias, na qual ocorre a 

migração sequencial das células para a ferida é facilitada por mediadores 

bioquímicos que aumentam a permeabilidade vascular, favorecendo a 

exsudação plasmática e a passagem de elementos celulares para a área da 

ferida. Os mediadores bioquímicos de ação curta são a histamina e serotonina e 

os mais duradouros são a leucotaxina, bradicinina e prostaglandina. A 

prostaglandina é um dos mediadores mais importantes no processo de 

cicatrização, pois além de favorecer a exsudação vascular, estimula a mitose 

celular e a quimiotaxia de leucócitos. Os primeiros elementos celulares a 

alcançar o local da ferida são os neutrófilos e os monócitos, com a função de 

desbridar as superfícies da ferida e fagocitar as partículas antigênicas e corpos 

estranhos. O pico de atividade dos polimorfonucleares ocorre nas primeiras 24-

48 horas após o trauma, seguindo-se por maior aporte de macrófagos durante 

os dois a três dias seguintes.  

O macrófago ativado é a principal célula efetora do processo de reparo 

tecidual, degradando e removendo componentes do tecido conjuntivo danificado, 



 

41 

 

como colágeno, elastina e proteoglicanas. Além desse papel na fagocitose de 

fragmentos celulares, os macrófagos também secretam fatores quimiotáticos 

que atraem outras células inflamatórias ao local da ferida e produzem 

prostaglandinas, que funcionam como potentes vasodilatadores, afetando a 

permeabilidade dos microvasos (Emining et al., 2007).  Os macrófagos 

produzem vários fatores de crescimento, tais como o PDGF, o TGF-β, o fator de 

crescimento de fibroblastos (FGF) e o VEGF, que se destacam como as 

principais citocinas necessárias para estimular a formação do tecido de 

granulação e ativam os elementos celulares das fases subsequentes da 

cicatrização tais como fibroblastos e células endoteliais (Mencia-Huerta, 1993). 

 

2.10.2 Fase de proliferação 

A fase de proliferação e reparo é caracterizada pelo aumento de 

fibroblastos que migram para o interior do ferimento para sintetizar e depositar 

colágeno, elastina e proteoglicanos. Esta fase inicia-se por volta do 3º dia após 

a lesão, perdura por 2 a 3 semanas e é o marco inicial da formação da cicatriz. 

Compreende: reepitelização, que se inicia horas após a lesão, com a 

movimentação das células epiteliais oriundas tanto da margem como de 

apêndices epidérmicos localizados no centro da lesão; fibroplasia e 

angiogênese, que compõem o chamado tecido de granulação responsável pela 

ocupação do tecido lesionado. Os fibroblastos produzem a nova matriz 

extracelular necessária ao crescimento celular, enquanto os novos vasos 

sanguíneos carreiam oxigênio e nutrientes necessários ao metabolismo celular 

local (Singer, Clark, 1999). 

A necessidade de oxigênio para movimentação, migração celular e 

síntese proteica é responsável pelo brotamento e crescimento neovascular da 

periferia para o centro da ferida (Raiser, 2000).  

A rede vascular se mantém quiescente, porém com a capacidade de 

iniciar a angiogênese, principalmente durante a cicatrização (Li et al., 1999). A 

angiogênese está presente em todo o processo de reparação, independente do 

tecido acometido pela injúria. É reconhecido como um fenômeno de grande 

importância para a reparação dos tecidos. Os principais fatores estimuladores 



 

42 

 

envolvidos são fatores de crescimento de células endoteliais e alguns fatores 

quimiotáxicos (Mrué, 2000).  

A indução da angiogênese foi inicialmente atribuída ao FGF (Fator de 

crescimento Fibroblástico) e subsequentemente, muitas outras moléculas foram 

identificadas como angiogênicas, incluindo o VEGF, o TGF-β, a angiogenina, a 

angiotropina e a angiopoetina-1. Além disso, a baixa tensão de oxigênio e 

elevados níveis de ácido lático e aminas bioativas, ativam o macrófago para a 

produção de fatores de crescimento, estimulando a angiogênese.  Estudos 

revelam que tecidos isquêmicos e acometidos pela hipoxemia arterial, ou seja, 

baixa concentração de O2 no sangue apresentam atraso no processo de 

cicatrização. Dessa forma, a hipóxia tecidual controlada na superfície da ferida 

parece ser fundamental para a angiogênese e, consequentemente, para uma 

cicatrização efetiva. Muitos autores demonstraram que o fator indutor de hipóxia 

1-alfa (HIF-1 α), é um importante componente para a fechamento das feridas 

cutâneas. (Garret et al., 1990) 

Muitas proteínas parecem induzir a angiogênese de forma indireta, 

estimulando a produção de FGF e VEGF por macrófagos e células endoteliais, 

indutores diretos da angiogênese (Mendonça e Coutinho-Netto, 2009).  

A nova rede vascular expande-se para o centro da lesão, dando à 

cavidade lesional uma aparência rosada, chamada de tecido de granulação. À 

medida que o fluxo sanguíneo e a oxigenação são restabelecidos, o principal 

fator desencadeador da angiogênese é reduzido e os vasos neoformados 

começam a diminuir (Neto, 2003).  

O tecido de granulação consiste primariamente em vasos sanguíneos 

invasores, fibroblastos e produtos de fibroblastos, incluindo o colágeno fibrilar, 

elastina, fibronectina, glicosaminoglicanos sulfatadas e não sulfatadas, e 

proteases. O tecido de granulação é produzido três a quatro dias após a lesão, 

como um passo intermediário entre o desenvolvimento da malha formada por 

fibrina e fibronectina e a síntese e reestruturação de colágeno.   

 

 

 

 



 

43 

 

2.10.3 Fase de maturação  

A última fase do processo cicatricial é a maturação que começa entre duas 

e três semanas após a lesão. Nela está envolvida uma série de fatores, como a 

contração da ferida e a remodelação da matriz de colágeno. Uma vez que a 

superfície provisória de células epiteliais é formada, a migração epitelial é 

interrompida devido à inibição por contato (Raiser, 2000).  

O fechamento ocorre por contração das paredes que margeiam a lesão. 

Essa ação é realizada pelos fibroblastos ativados, os quais se diferenciam para 

miofibroblastos, que aproximam as margens da ferida, forçando as fibras de 

colágeno a se sobrepor e se entrelaçar e, desta maneira, conferem o suporte 

para a diminuição da lesão, que é influenciado pelo tamanho inicial da ferida, 

formato, espessura dos tecidos circunvizinhos e forças externas, como 

movimento (Bojrab, 1982). Caso, o volume ou integridade tecidual sejam 

reduzidos, a contração pode ser insuficiente para fechar a ferida, resultando em 

granulação exuberante ou em superfície epitelial prematura. Nesses casos, 

deve-se lançar mão do uso de enxertos ou implantes, para orientar as bordas da 

ferida e facilitar a cicatrização (Neto, 2003). 

Muitas variáveis tanto de ordem geral como de ordem local também 

podem influenciar esse longo e complexo processo cicatricial. Dos fatores gerais, 

interferem a idade, o estado nutricional, alterações cardiovasculares e utilização 

de drogas sistêmicas. Dos fatores locais podem interferir: o ambiente mais ou 

menos contaminado no qual ocorre a ferida, infecção sistêmica concomitante, 

uso de drogas imunossupressoras tópicas e ressecamento do leito da ferida 

(Mandelbaun et al., 2003). 

Por fim, Sun et al. (2014) descreveu os avanços na enxertia de pele e 

tratamento de feridas cutâneas, na qual relata que as fases de proliferação são 

divididas em quatro estágios: Hemóstase, inflamação, proliferação e 

modelagem. A Figura 8 mostra as fases da cicatrização, as linhagens celulares 

e os fatores de crescimento. 

 

 

 

 



 

44 

 

Figura 8. Detalhamento das fases de cicatrização, com fatores de crescimento e linhagens 

celulares. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Fonte: Sun et al. (2014) 

 

2.11 Mecanismos Antioxidantes 

Estudos para determinação da capacidade antioxidante são cruciais para 

avaliação de produtos naturais bem como para o entendimento das interações 

entre oxidantes e espécies reativas de oxigênio. Muitos estudos têm avaliado o 

potencial antioxidante de compostos fenólicos, os quais se destacam em relação 

a outras classes de produtos naturais por neutralizar os danos oxidativos. Os 

danos podem ocorrer quando há um desbalanço entre a produção de espécies 

reativas de oxigênio e sua eliminação através dos sistemas antioxidantes. Esse 

desequilíbrio pode ocorrer quando ocorre a depleção dos sistemas antioxidantes 



 

45 

 

de defesa, resultando em lesões oxidativas a macromoléculas e diversas 

estruturas celulares que, se não forem reparadas, alteram a funcionalidade das 

células, tecidos e órgãos (Cotinguiba et al., 2013).  

As propriedades antioxidantes de substâncias de origem natural 

apresentam várias perspectivas relacionadas ao cuidado da saúde humana. 

Embora não seja comum a utilização de plantas medicinais como 

antioxidantes, suas propriedades terapêuticas podem ser em parte devido a 

capacidade que elas apresentam de neutralizar as espécies reativas de oxigênio 

envolvidas no desenvolvimento de enfermidades para as quais as plantas são 

indicadas (Desmarchelier et al., 1999). 

Espécies vegetais podem apresentar uma ampla variedade de moléculas 

capazes de inativar radicais livres, tais com compostos fenólicos (ácidos 

fenólicos, flavonóides, quinonas, cumarinas, taninos, etc), compostos 

nitrogenados (alcalóides, aminas), vitaminas (E, C), terpenóides (carotenóides), 

bem como muitos outros metabólitos endógenos que exercem ação antioxidante. 

Existe uma relação direta entre a atividade antioxidantes e o conteúdo de 

substâncias fenólicas em plantas (Velioglu et al., 1998). 

Heim et al. (2002), sugerem que a capacidade antioxidante de compostos 

fenólicos é induzida principalmente por causa da localização de radicais hidroxila 

e de ligações duplas. 

 

 

2.12 Importância da avaliação da hemocompatibilidade e 

citocompatibilidade   

Os ensaios de citocompatibilidade e hemocompatibilidade são 

ferramentas essenciais na determinação da segurança associada ao uso de um 

determinado biomaterial em diferentes tecidos ou órgãos.  

A integração com os tecidos e a capacidade de funcionalização com 

diferentes ambientes biológicos são características importantes para os 

dispositivos biomédicos, pois minimizam efeitos adversos. Avaliar as relações 

entre as propriedades dos materiais e as reações que elas induzem, podem 

ajudar a prever respostas precoces e efeitos a longo prazo. Com essa finalidade 

são realizados ensaios in vitro por meio de cultura celular utilizando os 



 

46 

 

biomateriais. Por meio da cultura celular é possível avaliar parâmetros como 

citocompatibilidade, toxicidade, adesão, proliferação celular, dentre outros. 

Ensaios com sangue (avaliação de hemocompatibilidade) e bactérias também 

ajudam a realizar uma melhor caracterização dos biomateriais, pois estão 

diretamente relacionados a outros efeitos indesejados como a formação de 

trombos e colonização de microrganismos na superfície desses materiais 

(Pulyala et al., 2017). 

 

2.13 PCR Quantitativo em Tempo Real (qPCR) para análise da expressão 

dos genes em estudo 

A reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR) está sendo 

amplamente utilizada para investigação biológica, sendo extremamente útil na 

determinação da expressão gênica. Os crescentes estudos de análise de 

expressão gênica, em diversas espécies sob condições experimentais 

específicas, vêm propiciando o acúmulo de informações que permitem o melhor 

entendimento de processos celulares e fisiológicos. A qPCR distingue-se dos 

outros métodos disponíveis para a expressão do gene em termos de precisão, 

sensibilidade e resultados rápidos, sendo estabelecido como o padrão ouro para 

a análise de expressão gênica. Essa tecnologia pode ser aplicada para estudos 

além da expressão gênica, como: microRNAs, análise de SNPs, mutações 

pontuais relacionadas a doenças, mecanismos imunes e de processos 

metabólicos dos organismos em geral. Dessa forma as frações F1 e soro do 

látex, em estudo, foram avaliadas por meio de análise de expressão dos genes 

associados à angiogênese. 

 

2.14 Testagem de novos biomateriais em animais alternativos  

Apesar de todos os esforços na busca de métodos alternativos ao uso de 

animais para experimentação, os testes in vivo ainda apresentam importância 

para determinar a segurança da aplicação de biomateriais, desde que 

executados respeitando os preceitos e normas vigentes para experimentação 

animal. 

Dadas as discussões a respeito de diretrizes e da legislação sobre 

animais de experimentação, o Brasil aprovou a Lei no 11.794 de 8 de outubro de 



 

47 

 

2008, conhecida como “Lei Arouca” que regulamenta o uso de animais em 

pesquisas científicas no país. Contudo, no Brasil como em outros lugares, um 

dos maiores desafios para os formuladores de políticas públicas é a 

harmonização das disposições legais, sem prejudicar a pesquisa (FILIPECKI et 

al., 2011). 

Desta forma, ratos (utilizados geralmente para se investigar o sistema 

imunológico), coelhos (submetidos a testes cutâneos e oculares, além de outros 

procedimentos), gatos (que servem sobretudo às experiências cerebrais), cães 

(normalmente destinados ao treinamento de cirurgias), rãs (usadas para testes 

de reação muscular e principalmente, na observação didática escolar), macacos 

(para análises comportamentais, dentre outras coisas), porcos (cuja pele 

frequentemente serve de modelo para o estudo da cicatrização), cavalos (muito 

utilizados no campo da sorologia), pombos e peixes (que se destinam, em regra, 

aos estudos toxicológicos), dentre outras várias espécies, são animais que 

servem como modelo experimental do homem. Outro organismo utilizado em 

testes para estudar o sistema circulatório e os efeitos colaterais das drogas, são 

os Blackworms (Lumbriculus variegatus), uma espécie de verme Oligoqueta. 

Os oligoquetas aquáticos têm uma longa história de uso em bioensaios, 

pois provavelmente foram os organismos coletados por Aristóteles e os primeiros 

a serem utilizados, por ele, em testes de toxicidade, quando bioensaios 

rudimentares foram conduzidos para verificar o efeito da água salgada nesses 

organismos (Chapman, 2001). A utilização desse grupo em estudos de avaliação 

de impacto ambiental cresceu muito e já nas últimas décadas, com o 

aprimoramento da ecotoxicologia, esses animais passaram a ter grande 

potencial para serem utilizados como organismos testes. 

 Seeley et al. (2021) usaram L. variegatus: como um novo organismo de 

invertebrado (in vivo) para estudos farmacológicos, onde ensaios 

comportamentais foram realizados para medir o efeito de drogas sobre a 

capacidade de movimentação dos Blackworms. Adicionalmente, Ryan e Elwess 

(2017) também examinaram a influência de fármacos nas taxas de pulsações 

desses organismos em diferentes níveis de concentrações (Figura 9), além de 

duas novas formas de avaliar os Blackworms ao microscópio.  

 



 

48 

 

Figura 9. Imagem da seção transversal lateral dos Blackworms para verificação das ondas de 

pulsações  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Fonte: Ryan, 2017 

 

 

De acordo com Warren et al. (1998), Chironomidae e Oligoqueta são os 

táxons mais indicados para se avaliar os efeitos de contaminantes no ambiente, 

pois sua exposição a produtos químicos não se dá apenas pela coluna d’água, 

mas também pela ingestão do sedimento. 

 

2.15 Características gerais dos Blackworms (Lumbriculus variegatus) 

Os Blackworms (Lumbriculus varigatus) são animais 

invertebrados pertencentes ao filo Annelida, subclasse Oligoqueta e família 

Lumbriculidae. Eles são encontrados na América do Norte, na Europa e norte da 

Ásia. A espécie também foi introduzida na África do Sul, Austrália e Nova 

Zelândia. Mais recentemente, foi encontrado na Patagônia, Argentina, onde 

diversas outras espécies exóticas se estabeleceram (Marchese et al., 2015). 

No Brasil, ela foi introduzida no estado de Minas Gerais. Entretanto, a sua 

introdução e estabelecimento nos locais brasileiros em que foram encontrados 

ainda não são totalmente compreendidos. A hipótese defendida por Marchese et 

https://www.wiki.pt-pt.nina.az/%C3%81frica_do_Sul.html
https://www.wiki.pt-pt.nina.az/Austr%C3%A1lia.html
https://www.wiki.pt-pt.nina.az/Nova_Zel%C3%A2ndia.html
https://www.wiki.pt-pt.nina.az/Nova_Zel%C3%A2ndia.html
https://www.wiki.pt-pt.nina.az/Patag%C3%B3nia.html
https://www.wiki.pt-pt.nina.az/Argentina.html
https://www.wiki.pt-pt.nina.az/Minas_Gerais.html


 

49 

 

al. (2015), é de que sua introdução se deu a partir de lojas de peixes e aquários, 

uma vez que diversos oligoquetas são usados como alimento para peixes.  

A espécie tem preferência por habitats rasos em margens de lagoas, 

lagos, riachos e rios. Seus microhabitats favoritos incluem folhas e troncos em 

decomposição, bem como sedimentos na base de vegetações emergentes e 

musgos (Marchese et al., 2015). Em seu habitat, os Blackworms usam a cabeça 

para perfurar sedimentos e detritos moles, enquanto que a parte caudal é 

mantida próxima à superfície (Figura 10) formando um ângulo reto que quebra a 

tensão superficial da água, essa postura conhecida como reflexos de vôo, parece 

promover trocas gasosas mais intensas entre o ar e o vaso sanguíneo dorsal. 

 

Figura 10.  Reflexos de vôo de Blackworms 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Fonte: Autoria própria 

 

Os Blackworms apresentam reprodução sexuada (o que é extremamente 

raro) e assexuada por fragmentação com rápida capacidade de regeneração. A 

cabeça e a cauda são translúcidas, mas facilmente distinguíveis. Não possuem 

coração, o sangue é distribuído por contrações rítmicas do vaso sanguíneo 

dorsal que pulsa o sangue ao longo do corpo, segmento por segmento, da cauda 

até a cabeça. São animais triblásticos, possuem ectoderme, endoderme e 

mesoderme. Como outros anelídeos, os Blackworms têm sistema circulatório 

fechado e possuem dois grandes vasos sanguíneos, um dorsal e um ventral. A 

https://www.wiki.pt-pt.nina.az/Habitat.html
https://www.wiki.pt-pt.nina.az/Micro-habitat.html


 

50 

 

maioria dos segmentos do corpo dos Lumbriculus possuem pares laterais de 

vasos pulsáteis, cuja pulsação é coordenada com a do vaso dorsal. Pulsações 

ao longo do vaso sanguíneo dorsal (DBV) impulsiona o sangue através do 

sistema circulatório. A parede do corpo do Blackworm é transparente, sendo 

possível visualizar a pulsação do DBV usando microscopia de luz (Lesiuk & 

Drews, 1999). Esses vermes não possuem olhos, mas as estruturas sensoriais 

presentes na parede corporal dos Lumbriculus incluem células fotossensíveis 

primitivas, capazes de detectar a passagem de uma sombra.  

São excelentes organismos para estudar a regeneração, regulação das 

atividades reflexas, bioacumulação, ecotoxicidade, toxicidade de poluentes 

ambientais e regulamentação de pulsações dos vasos sanguíneos (Drewes e 

Fourtner, 1990).  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

https://pt.frwiki.wiki/wiki/Yeux


 

51 

 

 

3. OBJETIVOS 

3.1 Objetivos Gerais 

Investigar a expressão e a ação biológica do látex sobre a atividade dos 

fatores de crescimento FGF, VEGF e TGF em cultura de fibroblastos 3T3 e sua 

biocompatibilidade em Blackworms (Lumbriculus variegatus). 

 

3.2 Objetivos Específicos 

- Identificar a presença de grupos funcionais presentes nas amostras de 

látex utilizando a análise da espectroscopia no infravermelho por transformada 

de Fourier (FTIR). 

- Avaliar da capacidade hemolítica da membrana de látex e das frações 

F1 e soro do látex em hemácias. 

- Avaliar a capacidade antioxidante e o teor de fenóis totais da fração F1 

e soro do látex. 

- Avaliar a influência das frações F1 e soro e membrana do látex nas taxas 

de pulsações em L. variegatus. 

- Avaliar a citotoxicidade da membrana de látex e das frações F1 e soro 

do látex em cultura de fibroblasto 3T3 e macrófagos J774. 

- Desenhar as sequências de primers para serem utilizadas como 

iniciadores na amplificação espécie-específica por qPCR.  

- Padronizar o método PCR Quantitativo em Tempo Real (qPCR) para 

análise da expressão dos genes em estudo. 

- Avaliar os mecanismos envolvidos na cultura celular tratadas 

topicamente com o látex natural da seringueira Hevea brasiliensis.  

- Verificar a expressão de FGF, VEGF e TGF (importantes fatores de 

crescimento) durante a cultura de fibroblastos 3T3. 

 

  



 

52 

 

4 MATERIAIS E MÉTODOS 

4.1 Desenho Experimental 

O desenho experimental, apresentado na Figura 11, foi desenvolvido para 

fins de ilustrar as etapas do projeto e facilitar a compreensão das análises 

realizadas. 

                          Figura 11. Desenho experimental 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Fonte: Autoria própria 

 

4.2 Preparação das Membranas de Látex Natural  

O Látex Natural (LN) foi obtido da BDF Comércio de Produtos Agrícolas 

Ltda, Guarantã/SP e estabilizado com hidróxido de amônia 0,7% (v/v de 

borracha) para fornecer um pH 10, seguido de centrifugação a 8.000 rpm para 

fornecer uma solução de 60% (v/v) de borracha e reduzir as proteínas presentes 

no látex natural relacionadas à reação alérgica (Garms et al., 2017).  



 

53 

 

As membranas de borracha natural foram preparadas a partir da solução 

líquida de látex natural estabilizada com hidróxido de amônio, conforme Figura 

12. Na preparação das membranas foram utilizadas placas de Petri de 9,5 cm 

de diâmetro interno e de fundo reto, para obter filmes de espessura uniforme e 

controlada. Foi depositado 1mL da solução de látex sobre a placa de Petri e 

deixada em temperatura ambiente por 24 horas para completa coagulação 

(Tanaka et al., 2021). 

 

Figura 12. Extração de Látex da seringueira (Hevea brasiliensis) para produção das 

membranas 

 

 

 

 

 

 

 

Fonte: Autoria própria 

 

4.3 Obtenção do Soro e Fração F1 do Látex Natural 

O soro e a fração F1 foram gentilmente cedidas pelo Prof. Dr. Ricardo 

José de Mendonça do Instituto de Ciências Biológicas e Naturais (ICBN) da 

Universidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM) seguindo o protocolo 

proposto por Mendonça (2008).  

Basicamente, o soro do látex teve seu pH corrigido para 9,0 e aplicado 

diretamente na coluna cromatográfica à temperatura ambiente e eluído com 

tampão bicarbonato de amônio 0,01 M em gradiente descontínuo e crescente de 

NaCl (0 M; 0,15 M; 0,25 M e 1,5 M de NaCl), com o fluxo empregado de 7 mL/min 

e monitorado em espectrofotômetro a 280 nm.  

Por fim, as amostras soro e fração F1 foram diluídas em água nas 

concentrações de 0,01%, 0,1% e 1% (v/v) e armazenadas em freezer - 20ºC, 

para posterior utilização. 

 

 



 

54 

 

4.4 Caracterização físico-química e biológica do material 

 

4.4.1 Análise por Espectroscopia no infravermelho (FTIR) 

A caracterização da composição química da membrana, da fração F1 e 

Soro do látex foi realizada utilizando um equipamento de FTIR Bruker® Tensor 

27 (Karlsruhe, Alemanha) operando na região entre 4000-400 cm-1, fonte de 

laser HeNe e detector DLaTGS com resolução 4 cm-1 e 32 varreduras. Para as 

análises foi utilizado o método ATR, equipado com um cristal de diamante. 

 

4.4.2 Ensaio de hemólise 

A hemólise é definida como o rompimento da membrana da hemácia, 

causando a liberação da hemoglobina (Hb) e de outros componentes 

intracelulares para o plasma (Figura 13). A Hb livre, por exemplo, apresenta alta 

absorbância em comprimentos de onda que variam entre 415 nm e 570 nm. 

Dessa forma, a sua liberação como resultado da ocorrência de lise dos eritrócitos 

provoca elevação aparente na concentração dos analitos medidos nessa escala 

de comprimento de onda, devido ao aumento da absorbância medida dessas 

amostras (Burns e Yoshikawa, 2002; Ismail e cols., 2005; Lippi e cols., 2005; 

Rother e cols., 2005).  

A Hb contém outros componentes que também podem interagir ou 

competir com os reagentes do ensaio, bem como elevar a quantidade do analito 

dosado, tais como proteínas estruturais, enzimas, lipídios e carboidratos 

presentes no plasma ou soro analisado (Lippi e cols., 2005). 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

55 

 

Figura 13.  Hemólise identificada em uma amostra de sangue centrifugada caracterizada 

através da intensidade da cor avermelhada do plasma. 

 

 

 

 

 

 

 

 

                                              Fonte: Autoria própria 

 

 

A interação da membrana, da fração F1 e do soro do látex com as 

hemácias foram estudadas por meio de ensaios hemolíticos, de acordo com 

Borges et al. (2015) e Cesar et al. (2019), com algumas modificações. Neste 

experimento, 3 mL de células sanguíneas de ovelha (NEW PROV®, código: 

1189, Paraná, Brasil) foram usados com 3,8% (m/v) de citrato de sódio (Sigma-

Aldrich®, EUA) como anticoagulante (na proporção de 9:1, sangue: citrato). A 

mistura foi lavada duas vezes com solução salina 0,9% (p/v) e centrifugada a 

1000 rpm por 10 min, descartando-se o sobrenadante. 

As amostras da fração F1 e soro foram preparadas em três concentrações 

(50%, 30% e 15%) a partir da solução estoque a 1% (v/v), em seguida 500 μL 

das amostras e 500 μL da solução de eritrócitos a 5% (v/v) em solução salina 

0,9% (p/v) foram incubados a 37ºC por 24 h. Membranas de 5mm de diâmetro 

foram incubadas em contato direto com 1mL de solução 5% eritrócitos. As 

amostras foram centrifugadas a 1000 rpm por 10 min e alíquotas de 100 μL do 

sobrenadante foram pipetadas em microplacas de 96 poços. 

O controle negativo foi determinado com 500 μL de solução salina 0,9% 

(hemólise 0%), enquanto o controle positivo foi usado com 500 μL de Triton X-

100 1% (v/v) em solução salina 0,9% (hemólise 100%). 

A análise foi medida em leitor de microplacas (PowerWave Epoch2, 

BioTek Instruments®, EUA) a 540 nm. Valores menor que 5% de hemólise, foram 



 

56 

 

considerados não tóxicos nos experimentos. O experimento foi realizado em 

triplicata e a taxa de hemólise (%) foi calculada usando a Equação 1.  

 

Equação 1- Fórmula para o cálculo da hemólise expresso em porcentagem 

 

𝑇𝑎𝑥𝑎 𝑑𝑒 ℎ𝑒𝑚ó𝑙𝑖𝑠𝑒 (%) =  
(𝐴𝐵𝑆𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 − 𝐴𝐵𝑆𝑛𝑐)

(𝐴𝐵𝑆𝑝𝑐 − 𝐴𝐵𝑆𝑛𝑐)
𝑥100 

 

onde ABS é a absorbância das amostras, ABSnc é a absorbância do controle 

negativo e ABSpc é a absorbância do controle positivo. 

 

4.4.3. Ensaio de Atividade Antioxidante  

 

4.4.3.1 Determinação da atividade Antioxidante através do método de sequestro 

de radicais livres (DPPH)  

Para determinação da atividade antioxidante foi utilizado o método de captura 

do radical livre 2,2- difenil-1-picril-hidrazila, DPPH (Brand-Williams et al., 1995).  Para 

o preparo da solução de DPPH foi dissolvido 7,8 mg de DPPH em 100 mL de metanol 

absoluto, que foi homogeneizado e transferido para um frasco mantido sob 

refrigeração e protegido da luz. 

 

4.4.3.2 Preparo das soluções de quercetina para obtenção da curva analítica 

A determinação da curva da quercetina foi realizada a partir do preparo da 

solução estoque onde foi solubilizado 10,00 mg de quercetina em 10 mL de metanol.  

Em seguida foram preparadas diluições seriadas, em triplicatas, nas concentrações 

de 10 μg/mL, 5 μg/mL, 2,5  μg/mL, 1,25 μg/mL, 0,625 μg/mL e 0,3125 μg/mL, utilizando 

balões volumétricos de 5 mL. A curva de calibração foi construída a partir dos valores 

de absorbância a 517 nm de todas as soluções, utilizando como "branco" 1mL de 

metanol.  

 

 

 



 

57 

 

4.4.3.3 Preparo das amostras F1 e Soro do látex para avaliação da atividade 

antioxidante 

As amostras F1 e soro foram preparadas em triplicatas a partir da solução 

estoque 1% (m/v) e diluídas para as concentrações de 0,03 µg/mL, 0,06 µg/mL, 0,125 

µg/mL, 0,25 µg/mL e 0,5 g/mL. 500μL das amostras foram adicionados em tubos de 

ensaio juntamente com 500μL da solução de DPPH, cobertas com papel alumínio e 

deixadas no escuro à temperatura ambiente. Após 30 minutos, foi medida a 

absorbância a 517 nm em espectrofotômetro de UV-VIS. Para cada amostra foi 

realizado um teste “branco” consistindo do volume da amostra (500 µL) e metanol (500 

µL). O controle negativo, contendo 500 µL de metanol e 500 µL de DPPH, foram 

medidos após o mesmo período de incubação no escuro (30 minutos). O porcentual 

de inibição do DPPH (ou a % da atividade antioxidante) foi calculado utilizando a 

equação 2 (Burda; Oleszek, 2001). 

 

Equação 2- Fórmula para inibição do DPPH expresso em porcentagem 

 

% 𝑑𝑒 𝑖𝑛𝑖𝑏𝑖çã𝑜 𝑑𝑜 𝐷𝑃𝑃𝐻 =  
𝐴𝑐𝑛 − 𝐴𝑎

𝐴𝑐𝑛
𝑥100 

                                                                                                  

onde Acn é a absorbância do controle negativo e Aa é a absorbância da 

amostra/padrão. 

A Figura 14 mostra a estrutura do DPPH antes e depois da reação com um 

composto antioxidante (A-H). 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

58 

 

Figura 14. Mudança da coloração do radical livre (DPPH) antes e depois da reação com um 

composto antioxidante (A-H). 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Fonte: Rufino (2007); Rezende(2010). 

 

 

4.4.4 Dosagem de fenóis 

A quantificação de compostos fenólicos por espectrofotometria presentes nas 

amostras envolve a redução do reagente Folin-Ciocalteau com formação de complexo 

azul. Tal coloração permite a determinação da concentração das substâncias 

redutoras, como pode ser visto na Figura 15. 

As concentrações para a determinação de fenóis totais foram realizadas a partir 

da adição de 100 µL das amostras que foram inicialmente preparadas através de uma 

diluição seriada, obedecendo a uma ordem decrescente das concentrações (0,5, 0,25, 

0,125, 0,06 e 0,03 µg/mL), sendo posteriormente adicionados 500 µL do reagente 

Folin - Ciocalteau a 10% e 6 mL de água deionizada. A solução foi homogeneizada e 

após 3 minutos, 1,5 mL de carbonato de sódio a 20% (p/v) foi adicionado e o volume 

completando 10 mL com água destilada. As amostras permaneceram incubadas (120 

minutos) a temperatura ambiente e sem a presença de luminosidade. Após esse 

período as absorbâncias das amostras foram lidas a 765 nm utilizando como branco 

água deionizada. Como padrão para o teste foi utilizado o ácido gálico (AG) a fim de 



 

59 

 

que seus valores sirvam de comparação para a determinação dos compostos 

fenólicos presentes nas soluções, expressos a partir da quantidade de AG presentes 

em cada miligrama da amostra em estudo (Singleton et al., 1999). A média das leituras 

dos testes foram obtidas através dos resultados expressos em microgramas de AG 

por miligramas da amostra. 

Figura 15. Dosagem de fenóis totais empregando o reagente Folin 

 

 

 

 

 

 

 

Fonte: Autoria própria 

 

4.4.5 Cultura celular  

Foram selecionadas duas linhagens para realização da cultura celular: 

fibroblastos (3T3, Mus musculus) e macrófagos (J774, Mus musculus) obtidas 

do Banco de Células do Rio de Janeiro – BCRJ/UFRJ. 

Sob condições estéreis, as linhagens 3T3 e J774 foram descongeladas 

em banho-maria à 37 ºC e as células foram ressuspensas em 9mL do meio 

DMEM incompleto em Falcon de 15 mL para retirada do DMSO do meio de 

congelamento. O tubo foi centrifugado a 1200 rpm por 7min e o sobrenadante foi 

descartado, vertendo o tubo, e o pellet foi ressuspenso em 10 mL de meio de 

cultura DMEM suplementado com 10% de soro bovino fetal e 1% de solução de 

antibiótico/antimicótico (penicilina 10.000 U, estreptomicina 10.000 µg e 25 µg 

de anfotericina B) (Sigma-Aldrich®, Estados Unidos). Em seguida as células 

foram transferidas para a garrafa de cultivo celular de 75cm2. As células foram 

mantidas em estufa úmida a 37ºC e 5% de CO2.  

Após atingir 80% de confluência, a monocamada foi ressuspensa em 

solução de tripsina (Sigma-Aldrich®, Estados Unidos), incubada a 37ºC durante 

2 minutos, seguida pela paralisação da reação pela adição de DMEM completo. 

O volume da garrafa foi plaqueado novamente, representando a segunda 



 

60 

 

passagem, para continuação do cultivo celular. Após a tripsinização, as células 

foram contadas em Câmara de Neubauer para utilização nos testes de 

viabilidade celular. 

 

4.4.6 Viabilidade celular  

O teste de viabilidade celular foi realizado por contato direto com as 

linhagens 3T3 (fibroblastos) e J774 (macrófagos). Essas linhagens foram 

plaqueadas em microplacas de 24 poços, aproximadamente na densidade de 

4x103 células/poço, com volume de 400 µL de meio de cultura completo, em 

triplicata. As placas foram incubadas à 37°C, em estufa com 5% de CO2, 

perman