RESSALVA _ Atendendo solicitação do autor, o texto completo desta dissertação será disponibilizado somente a partir de 29/01/2027. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS – RIO CLARO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS (BIOLOGIA CELULAR, MOLECULAR E MICROBIOLOGIA) IMPACTOS DE SYNCEPHALASTRUM EM COLÔNIAS DE FORMIGAS-CORTADEIRAS RAPHAEL AFFONSO PEREIRA DA SILVA Rio Claro – SP 2025 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS – RIO CLARO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS (BIOLOGIA CELULAR, MOLECULAR E MICROBIOLOGIA) IMPACTOS DE SYNCEPHALASTRUM EM COLÔNIAS DE FORMIGAS-CORTADEIRAS RAPHAEL AFFONSO PEREIRA DA SILVA Rio Claro – SP 2025 Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências do Câmpus de Rio Claro, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas (Biologia Celular, Molecular e Microbiologia). Orientador: Dr. André Rodrigues Coorientadores: Dr. Odair Correa Bueno Dra. Amanda Aparecida de Oliveira S586i Silva, Raphael Affonso Pereira da Silva Impactos de Syncephalastrum em colônias de formigas-cortadeiras / Raphael Affonso Pereira da Silva Silva. -- Rio Claro, 2025 46 p. : tabs., fotos Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista (UNESP), Instituto de Biociências, Rio Claro Orientador: André Rodrigues Coorientador: Odair Correa Bueno, Amanda Aparecida de Oliveira 1. Mutualismo. 2. Oportunismo. 3. Entomopatógeno. 4. Attina. 5. Mucorales. I. Título. Sistema de geração automática de fichas catalográficas da Unesp. Dados fornecidos pelo autor(a). IMPACTO POTENCIAL DESTA PESQUISA Este estudo demonstrou os efeitos do fungo Syncephalastrum sp. quando esporos foram aspergidos em colônias de formigas-cortadeiras. Colônias completas (i.e., contendo crias, operárias e rainha) e em diferentes estágios de desenvolvimento apresentaram diminuição no corte de folhas e redução no volume do jardim de fungo, sugerindo que Syncephalastrum sp. apresenta um potencial para o controle desses insetos. Este estudo também demostrou que o fungo está presente nas colônias desde a coleta em campo e que Syncephalastrum sp. pode atuar como um oportunista em momentos de instabilidade das colônias. Além disso, este estudo contempla os Objetivos de Desenvolvimento Sustentável (ODS) da Organização das Nações Unidas (ONU), enquadrando-se nos objetivos número dois (fome zero e agricultura sustentável), nove (indústria, inovação e infraestrutura) e número 12 (consumo e produção sustentáveis). O controle biológico das formigas-cortadeiras é desafiador, mas este estudo motiva a realização de bioensaios utilizando Syncephalastrum sp. em consórcio com agentes que desestabilizem as colônias, sejam eles consórcios bacterianos, fúngicos ou com extratos naturais. POTENTIAL IMPACT OF THIS RESEARCH This study showed the effects Syncephalastrum sp. fungal spores when sprayed on leaf-cutting ant colonies. Whole colonies (i.e., containing brood, workers, and queen) at different stages of development showed a decrease in leaf-cutting and a reduction in the volume of the fungus garden, suggesting that Syncephalastrum sp. has potential for the control of these insects. We also showed that Syncephalastrum sp. is present in field collected colonies and that it can act as an opportunist during colony instability. This study is in line with the United Nations (UN) Sustainable Development Goals (SDGs), under goals number two (zero hunger and sustainable agriculture), nine (industry, innovation and infrastructure) and number 12 (sustainable consumption and production). Biological control of leaf-cutting ants is challenging, but this study motivates bioassays using Syncephalastrum sp. in consortium with agents that destabilize the colonies, whether bacterial, fungal or natural extract consortia. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA Câmpus de Rio Claro Impactos de Syncephalastrum em colônias de formigas-cortadeiras: perspectiva de controle biológico TÍTULO DA DISSERTAÇÃO: CERTIFICADO DE APROVAÇÃO AUTOR: RAPHAEL AFFONSO PEREIRA DA SILVA ORIENTADOR: ANDRÉ RODRIGUES COORIENTADOR: ODAIR CORREA BUENO COORIENTADORA: AMANDA APARECIDA DE OLIVEIRA Aprovado como parte das exigências para obtenção do Título de Mestre em Ciências Biológicas (Biologia Celular, Molecular e Microbiologia), área: Diversidade Biológica e Biologia Ambiental pela Comissão Examinadora: Prof. Dr. ANDRÉ RODRIGUES (Participaçao Virtual) Departamento de Biologia Geral e Aplicada / Unesp - IB Rio Claro Profa. Dra. KARINA DIAS AMARAL (Participaçao Virtual) Universidade Federal de Viçosa Prof. Dr. ITALO DELALIBERA JÚNIOR (Participaçao Virtual) Departamento de Entomologia e Acarologia / USP Rio Claro, 29 de janeiro de 2025 Instituto de Biociências - Câmpus de Rio Claro - Avenida 24 A, 1515, 13506900 https://ib.rc.unesp.br/#!/pos-graduacao/secao-tecnica-de-pos/programas2546/ciencias-biologicas-biologia-celular-molecular-e-microbiologia/CNPJ: 48.031.918/0018-72. Italo Delalibera Júnior Assinado de forma digital por Italo Delalibera Júnior Dados: 2025.01.29 17:46:34 -03'00' Unesp Máquina de escrever Título alterado para: IMPACTOS DE SYNCEPHALASTRUM EM COLÔNIAS DE FORMIGAS-CORTADEIRAS AGRADECIMENTOS Agradeço à minha mãe Leila e meu pai Dorival, por não medir esforços para proporcionar as melhores condições possíveis durante meu processo de formação desde a escola, graduação e pós-graduação, sem vocês isso não seria possível. À minha irmã Lisandra, por sempre estar ao meu lado e sempre enxergar o melhor de mim. À minha namorada Natalia, por toda a parceria durante esses anos, sempre acompanhando de perto minha caminhada acadêmica, me ajudando e, por vezes, indo ao laboratório comigo. Aos amigos do Laboratório de Ecologia e Sistemática de Fungos, pelo bom convívio, pelas sugestões que agregaram muito para este trabalho e também pelas risadas que sempre tornaram os dias mais leves. Ao Mateus Cruz, pela receptividade no momento em que entrei no laboratório, pelos ensinamentos de técnicas de microbiologia, por toda a ajuda com a manutenção das culturas fúngicas e também pela amizade e risadas diárias. Ao Aryel Goes e Diego Assis pelos ensinamentos e ajuda com as análises estatísticas de glmm, binomiais e clmm. Aos membros da manutenção do Laboratório de Formigas-Cortadeiras, Eduarda, Rayane e Raul pelos cuidados com as colônias utilizadas nos experimentos. Ao Danilo Azevedo e Matheus Muller, pela amizade construída desde a graduação, pelas risadas compartilhadas, pelos conselhos valiosos e por seguirem comigo nesta jornada da pós-graduação. À Bianca Nogueira pelos conselhos no início de minha jornada científica e ajudas iniciais com as análises das curvas de sobrevivência. À minha coorientadora e amiga Amanda Oliveira, pela ajuda com ideias, discussões, realizações de experimentos e parceria. Ao meu coorientador Odair Correa Bueno por aceitar a coorientação e disponibilizar toda a estrutura do laboratório de formigas-cortadeiras. Ao meu orientador André Rodrigues, por aceitar orientar um trabalho com enfoque em controle biológico, pelos ensinamentos, ajuda, conselhos e vivências que sempre levarei comigo. À Universidade Estadual Paulista, pela estrutura e ensino. O presente trabalho foi realizado com apoio da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), Brasil. Processo nº 2023/05135-3. As opiniões, hipóteses e conclusões ou recomendações expressas neste material são de responsabilidade do(s) autor(es) e não necessariamente refletem a visão da FAPESP. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Código de Financiamento 001. RESUMO As formigas-cortadeiras mantêm uma relação de mutualismo com o fungo Leucoagaricus gongylophorus, o principal alimento da colônia. Devido à grande quantidade de material vegetal cortado para suprir o fungo, esses insetos são considerados pragas em ambientes antropizados, causando prejuízos econômicos. Esforços para desenvolver métodos de controle biológico desses insetos são cruciais, devido aos impactos do controle químico no ambiente. Além do fungo mutualista, diversos microrganismos ocorrem nas colônias das formigas-cortadeiras, dentre eles, Syncephalastrum sp., um fungo filamentoso, cujo impactos em colônias de Acromyrmex e subcolônias de Atta já foram descritos. No presente estudo, descrevemos o impacto de Syncephalastrum sp. em operárias de Atta sexdens, bem como em colônias que apresentam todos os elementos da eussocialidade. Filtrados obtidos a partir do cultivo de diferentes isolados de Syncephalastrum sp., quando combinados em dieta artificial, provocaram mortalidade significativa de operárias. No geral, testes de atratividade demonstraram que os filtrados adicionados em flocos de arroz não apresentaram diferença de carregamento pelas operárias, sugerindo que as formigas não reconhecem os filtrados como repelentes. Observou- se também mortalidade de operárias quando expostas aos esporos, no entanto, não foi possível verificar uma associação direta ao fungo. Quando esporos de Syncephalastrum sp. foram aspergidos em colônias jovens e adultas de A. sexdens, houve uma diminuição significativa no corte de folhas, das condições gerais da colônia, bem como um aumento da quantidade de jardim de fungo removido e descartado no lixo. Nenhuma colônia que recebeu esporos de Syncephalastrum sp. morreu durante os 21 dias de experimento. Fragmentos do lixo coletados de colônias jovens mostraram uma elevada incidência do fungo, mesmo antes da aspersão dos esporos, sugerindo que Syncephalastrum sp. está presente em colônias desde o campo. Foi possível observar o crescimento de Syncephalastrum sp. no jardim de colônias debilitadas com baixas dosagens de sulfluramida (um inseticida) e aspergidas com os esporos. Os impactos causados por Syncephalastrum sp. em colônias completas corroboram o conhecimento de que esse fungo é um patógeno para a colônia, no entanto, nossos resultados sugerem que este atue como um oportunista, aproveitando de momentos de instabilidade da colônia. Tal fato abre oportunidades para combinar a aplicação desse fungo, com outros compostos, de modo a avaliar seu potencial como um agente de controle biológico. Palavras-chave: Mutualismo; Oportunismo; Entomopatógeno; Attina; Mucorales. ABSTRACT Leaf-cutting ants maintain a mutualistic relationship with the fungus Leucoagaricus gongylophorus, which they cultivate for food. Due to the large quantities of plant material they forage to nourish the fungus, these insects are considered pests in human-modified environments, often causing significant economic damage. Efforts to develop biological control methods are crucial, given the environmental impact of chemical control measures currently in place. In addition to the fungus cultivar, leaf-cutting ant colonies host a complex microbiota, including the filamentous fungus Syncephalastrum sp. The impacts of this fungus on Acromyrmex colonies and Atta subcolonies have already been documented. Building on previous research, this study evaluated the impacts of Syncephalastrum sp. on Atta sexdens workers and on whole colonies exhibiting all the elements of eusociality. Culture filtrates from different Syncephalastrum sp. isolates, when incorporated into an artificial diet, caused significant worker mortality. Attractiveness assays revealed no significant difference on how workers handled the filtrates when added to rice flakes, suggesting that the ants do not perceive the filtrates as repellent. Worker mortality was also observed when they were exposed to spores, though it remains unclear a direct association with the fungus. Spraying Syncephalastrum sp. spores onto healthy, young and adult A. sexdens colonies led to a reduction in leaf cutting, a decline in the general health of the colonies, and an increased amount of fungus garden material being discarded as waste. However, no colonies treated with Syncephalastrum sp. spores died during the 21-day experiment. Fragments collected from the waste piles of young colonies revealed a high incidence of the fungus even before the spores were sprayed, suggesting that Syncephalastrum sp. may already be present in field colonies. Growth of Syncephalastrum sp. was observed in the fungus gardens of colonies weakened by sulfluramid (an insecticide), both in colonies sprayed with spores and in those that did not receive the spore suspension. These findings support previous research that Syncephalastrum sp. may act as a pathogen to the colony. However, our data suggest that the fungus is more likely an opportunist, taking advantage of instability within the colony. This study opens up promising windows for research into combining Syncephalastrum sp. with other compounds to assess its potential as a biological control agent. Keywords: Mutualism; Opportunism; Entomopathogen; Attina; Mucorales. Title in english: Impacts of Syncephalastrum on leaf-cutting ant colonies. LISTA DE FIGURAS Figura 1. Syncephalastrum sp. LESF 127. A: Macro morfologia da colônia. Cultivo em meio Ágar Malte 2% a 25 C, durante cinco dias, no escuro. B: Esporangióforo, estrutura assexuada de reprodução, compreendendo uma vesícula recoberta por merosporângios (seta). Cada merosporângio contém merósporos (esporos assexuados). ...................................................... 14 Figura 2. Sobrevivência de operárias de Atta sexdens após 21 dias de exposição a suspensão de esporos dos isolados de Syncephalastrum sp. LESF 127 e MOC 27. ................................. 25 Figura 3. Operária de Atta sexdens colonizada pelo crescimento do isolado de Syncephalastrum sp. MOC 27, após exposição a suspensão de esporos. Operária foi mantida em câmara úmida durante 5 dias, a 25 C, no escuro. Setas indicam os esporangióforos do fungo. ........................................................................................................................................ 25 Figura 4. Sobrevivência de operárias de Atta sexdens alimentadas com dietas, durante 21 dias, suplementadas com filtrados de cultivo de diferentes isolados de Syncephalastrum sp. (filtrados obtidos com sete dias, sob 105 RPM de rotação). A: Concentração de 50%. B: Concentração de 25% de filtrado. Valores de p foram obtidos pelo teste de Kaplan-Meier. .............................. 26 Figura 5. Sobrevivência de operárias de Atta sexdens alimentadas com dietas, durante 21 dias, suplementadas com filtrados de cultivo de Syncephalastrum sp. LESF 127, nas concentrações de 50% e 25% (filtrados obtidos com sete dias, sem rotação). Valore de p foi obtido pelo teste de Kaplan-Meier. ...................................................................................................................... 27 Figura 6. Quantidade de flocos de arroz coletados por operárias de Atta sexdens na segunda combinação. Os flocos continham filtrados de cultivo de diferentes isolados de Syncephalastrum sp .................................................................................................................. 28 Figura 7. Variação nos escores de corte de folhas de colônias jovens e adultas de Atta sexdens aspergidas com esporos de Syncephalastrum sp. LESF 127 e MOC 27. Escores 0: 100% das folhas carregadas e incorporadas; 1: 75% das folhas carregadas e incorporadas; 2: 50% das folhas carregadas e incorporadas; 3: 25% das folhas carregadas e incorporadas; 4: 0% das folhas carregadas e incorporadas. ........................................................................................................ 29 Figura 9. Variação no escores de condição do sauveiro de colônias jovens e adultas de Atta sexdens aspergidas com esporos de Syncephalastrum sp. LESF 127 e MOC 27. Escores 0: Colônia com todas as atividades normais; 1: Colônia com redução nas atividades de corte e incorporação; 2: Colônia com redução no corte e sem incorporação; 3: Colônia sem corte e incorporação; 4: Jardim de fungo morto com poucas ou nenhuma operária viva. ................... 30 Figura 9. Variação no escore de jardim de fungo novo descartado no lixo de colônias jovens e adultas de Atta sexdens aspergidas com esporos do fungo Syncephalastrum sp. LESF 127 e MOC 27. Escores: 0: Sem alteração em relação ao controle; 1: 25% de fragmentos novos de jardim descartados; 2: 50% de fragmentos novos de jardim descartados; 3: 75% de fragmentos novos de jardim descartados; 4: 100% do jardim descartado no lixo. ..................................... 31 Figura 10. Fragmentos de lixo de colônias jovens e adultas de Atta sexdens aspergidas com esporos de Syncephalastrum sp. LESF 127 e que apresentaram crescimento do fungo. Controle não recebeu esporos. ................................................................................................................. 32 Figura 11. Fragmentos de lixo de colônias jovens e adultas de Atta sexdens aspergidas com esporos de Syncephalastrum sp. MOC 27 e que apresentaram crescimento do fungo. Controle não recebeu esporos. ................................................................................................................. 33 Figura 12. Colônias de Atta sexdens debilitadas pela aplicação de iscas com sulfluramida e aspersão do isolado Syncephalastrum sp. MOC 27. A: Colônia no dia em que recebeu as iscas. B: Colônia com cinco dias após a aplicação das iscas. Note a coloração acinzentada do jardim, devido a presença de merosporângios do fungo. ...................................................................... 34 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Descrição dos isolados de Atta sexdens e Acromyrmex lundii utilizados no estudo. .................................................................................................................................................. 16 Tabela 2. Descrição dos escores de cada parâmetro avaliado nas colônias de Atta sexdens, nos bioensaios com colônias sadias e debilitadas com sulfluramida. ............................................. 23 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 11 2 OBJETIVOS .......................................................................................................................... 15 2.1 Geral ................................................................................................................................... 15 2.2 Específicos .......................................................................................................................... 15 3 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................... 15 3.1 Manutenção das colônias da saúva-limão .......................................................................... 15 3.2 Cultivo e manutenção dos fungos ....................................................................................... 16 3.3 Obtenção dos filtrados ........................................................................................................ 17 3.4 Sobrevivência de operárias expostas aos esporos de Syncephalastrum sp. ........................ 18 3.5 Bioensaio de sobrevivência das operárias .......................................................................... 19 3.6 Bioensaio de atratividade dos filtrados para operárias ....................................................... 20 3.7 Avaliação do impacto de Syncephalastrum sp. em colônias sadias ................................... 21 3.8 Oportunismo de Syncephalastrum sp. em colônias desestabilizadas com sulfluramida .... 23 4 RESULTADOS ..................................................................................................................... 24 4.1 Sobrevivência de operárias expostas aos esporos de Syncephalastrum sp. ........................ 24 4.2 Sobrevivência de operárias alimentadas com filtrados de Syncephalastrum sp. ................ 26 4.3 Atratividade dos filtrados de Syncephalastrum sp. para operárias ..................................... 27 4.4 Impacto de Syncephalastrum sp. em colônias de Atta sexdens .......................................... 28 4.5 Oportunismo de Syncephalastrum sp. em colônias desestabilizadas com sulfluramida .... 33 5 DISCUSSÃO ......................................................................................................................... 35 6 CONSIDERAÇÕES .............................................................................................................. 38 REFERÊNCIAS ....................................................................................................................... 40 APÊNDICE .............................................................................................................................. 45 11 1 INTRODUÇÃO Formigas-cortadeiras do gênero Atta Fabricius, 1804 pertencem a subtribo Attina (as atíneas), que reúne formigas que cultivam fungos para alimentação (Ward et al., 2015). As formigas-cortadeiras são polimórficas, ou seja, as operárias apresentam diferenças morfológicas associadas às diferentes tarefas que desempenham na colônia. O formato das mandíbulas, por exemplo, está relacionado com o tipo de material forrageado para cultivar o fungo e, consequentemente, com o número de tarefas necessárias para o processamento desse substrato (Hölldobler; Wilson, 1990; Camargo et al., 2016;). As formigas dos gêneros Atta, Acromyrmex Mayr, 1865 e Amoimyrmex Cristiano, 2020 formam um grupo monofilético (Barrera et al., 2022). As espécies deste grupo utilizam flores e folhas frescas como substrato para nutrir o fungo, sendo considerado o grupo mais derivado de Attina. Nesta subtribo, também estão as formigas chamadas de atíneas basais ou menos derivadas (Brandão; Mayhé-Nunes; Sanhudo, 2011). Por característica, essas atíneas apresentam colônias menores em comparação com as formigas-cortadeiras, construindo ninhos pouco visíveis no solo, ou em troncos de árvores, alimentando o fungo mutualista com diferentes substratos (Brandão; Mayhé-Nunes; Sanhudo, 2011). O cultivo de fungo pelas atíneas é caracterizado como um mutualismo obrigatório (Weber, 1972). Neste, as formigas dependem do fungo (como estômago externo) para degradar o substrato que coletam, para nutrirem-se das hifas. Por sua vez, o fungo é transportado pelas operárias de uma colônia parental para filha, além de receber proteção das formigas (Little et al., 2003). Tal mutualismo originou-se há 66 milhões de anos atrás, no período cretáceo, após a queda do asteroide que dizimou parte dos dinossauros (Schultz et al., 2024). A grande quantidade de matéria orgânica disponível propiciou um ambiente em que as formigas nutriam o fungo com matéria orgânica que, em contra partida, era metabolizada e compartilhada com as operárias (Schultz et al., 2024). O fungo Leucoagaricus gongylophorus (Möller) Singer (1986) (Basidiomycota: Agaricales: Agaricaceae) é o cultivar fúngico das formigas do gênero Atta (Branstetter et al., 2017; Schultz; Brady, 2008). Estima-se que essa relação originou-se há 8 a 12 milhões de anos, moldando o hábito do corte de material vegetal fresco para o cultivo fúngico (Schultz; Brady, 2008; Schultz, 2022). A alimentação das formigas se dá por estruturas específicas produzidas por esse fungo, os gongilídeos. Através de processos de autofagia do conteúdo citoplasmático, o fungo produz vesículas na extremidade das hifas, chamadas de gongilídeos (Leal-Dutra et al., 12 2023). Estes são organizados em agrupamentos semelhantes a cachos (estáfilas), estruturas ricas em nutrientes, sendo utilizadas para a alimentação (Mueller et al., 2001). A necessidade de alimentar o fungo mutualista com material vegetal fresco, faz com que as formigas-cortadeiras consumam mais vegetação do que qualquer outro herbívoro. Tal característica as coloca como os herbívoros dominantes do Neotrópico (Wirth et al., 2003). O corte massivo de folhas, faz com que essas formigas adquiram o status de pragas, principalmente, quando ocorrem em ambientes antropizados, causando grandes prejuízos financeiros nas monoculturas (Della Lucia; Gandra; Guedes, 2014). Como as espécies cultivadas nas monoculturas não são nativas do Neotróprico, ou seja, essas não coevoluíram com as formigas-cortadeiras, sendo então vulneráveis aos ataques desses insetos (Montoya- Lerma et al., 2012). Costa et al. (2008) estimou que as formigas-cortadeiras podem consumir cerca de 558,1 kg de folhas frescas em um hectare, correspondendo aproximadamente a 15% do material vegetal produzido na área de estudo. Projeções realizadas no ano de 1997 mostram que o prejuízo causado às culturas pode atingir valores de 60 milhões de dólares ao ano, quando considerada a presença de apenas uma colônia de formiga-cortadeira por hectare em cultivo de cana-de-açúcar, limitando a produtividade da área (Della Lucia; Souza, 2011; Della Lucia; Gandra; Guedes, 2014). Portanto, o impacto econômico das formigas-cortadeiras exige métodos de controle para mitigar danos nas plantações. Existem diversos métodos de controle, incluindo controle mecânico, físico, cultural, biológico e químico, com o controle manual sendo o menos usado e o químico o mais comum para as formigas-cortadeiras (Boaretto; Forti, 1997). Dentre os métodos que empregam substâncias químicas, o mais utilizado é a aplicação de iscas formicidas, compostas por ingredientes ativos e atrativos (Oliveira et al., 2011). Os ingredientes ativos são responsáveis por causar a morte das operárias, sendo a sulfluramida e o fipronil, os mais empregados como ingredientes ativos; como atrativo, costuma-se utilizar a polpa cítrica desidratada, composta por laranja (Boaretto; Forti, 1997). Outros atrativos, como o farelo de soja e a farinha de trigo também podem ser utilizados (Boaretto; Forti, 1997). Entretanto, a sulfluramida e o fipronil causam sérios danos ao ambiente, sendo que o último pode permanecer no solo durante 12 anos (Britto et al., 2016). Neste cenário, uma das metas do Plano Nacional de Implementação do Brasil, para a Convenção de Estocolmo sobre Poluentes Orgânicos Persistentes, é encontrar alternativas ao uso da sulfluramida, segundo o Ministério do Meio Ambiente (Brasil, 2023). Uma alternativa aos meios tradicionais de controle de pragas e doenças é o controle biológico. Este consiste na utilização de um predador natural para reduzir a população de 13 pragas, sem causar sua erradicação, de modo que o predador continue presente no agrossistema (Lemes; Zanuncio, 2021). Os agentes biológicos são classificados como predadores, parasitoides e patógenos. Os últimos incluem bactérias, fungos, nematoides, protozoários e vírus, que são denominados de entomopatógenos, quando causam a morte dos insetos (Khan et al., 2012; Lemes; Zanuncio, 2021). Os fungos entomopatógenos mais utilizados para o controle biológico de insetos são: Metarhizium anisopliae (Metschn.) Sorokīn (1883) e Beauveria bassiana (Bals.-Criv.) Vuill. (1912) (Boaretto; Forti, 1997; Montoya-Lerma et al., 2012). A aplicação de fungos e de outros microrganismos formulados em bioinsumos apresenta resultados promissores, exemplos são a formulação de inseticidas orgânicos utilizando B. bassiana e Bacillus thuringiensis Berliner (1915) para controle do Percevejo-Bronzeado (Thaumastocoris peregrinus) Carpintero & Dellapé (2006) e de lagartas, respectivamente (Lemes; Zanuncio, 2021; Soliman et al., 2019); utilização de M. anisopliae para controle da cigarrinha da cana-de-açúcar, Mahanarva fimbriolata (Stål, 1854) (Filho et al., 2003; Lemes; Zanuncio, 2021). O controle microbiológico de formigas-cortadeiras ainda é desafiador por diversos fatores. Dentre eles, o principal são as estratégias desenvolvidas pela eussocialidade desses insetos, como o reconhecimento de substâncias químicas prejudiciais às operárias e ao fungo mutualista (Oliveira et al., 2011). Além disso, esses insetos apresentam diferentes respostas higiênicas, desde comportamentos de limpeza até o uso de secreções das glândulas metapleurais com atividade antimicrobiana, que compõem a imunidade social dessas formigas, para eliminar microrganismos indesejáveis às suas colônias (Currie; Stuart, 2001; Fernández-Marín et al., 2015; Yek; Mueller, 2011). No presente estudo, investigamos o potencial de fungos do gênero Syncephalastrum J. Schröt. (1886) (Mucoromycota: Mucorales) como possível agente de controle de A. sexdens. Syncephalastrum sp. é um fungo filamentoso que pode ser encontrado em amostras clínicas de pacientes imunodeprimidos, em fezes de animais e no solo, como um saprotrofo (i.e., degradador de matéria orgânica, Figura 1) (Souza et al., 2017; Lima et al., 2020; Kabtani et al., 2024) . Estudos demonstraram que Syncephalastrum racemosum Cohn ex J. Schröt. (1886) apresenta potencial biotecnológico, por ser utilizado na obtenção de biosurfactantes, durante a bioconversão de substratos de baixo custo (Bione et al., 2022), ou na produção de quitosana com baixo nível de acetilação (Amorim et al., 2006). Espécies de Syncephalastrum também são encontradas habitando colônias de A. sexdens. Rodrigues et al. (2005) notaram uma elevada incidência do fungo em colônias de laboratório tratadas com inseticidas. Barcoto et al. (2017) mostraram que Syncephalastrum sp. 14 é um patógeno para as colônias de A. sexdens por preencher os postulados de Koch, além de apresentar a capacidade de inibir o crescimento do fungo mutualista em testes de co-cultivo (Bizarria et al., 2018). Syncephalastrum sp. afetou negativamente subcolônias de A. sexdens, principalmente na ausência da rainha, diminuindo a taxa do corte de folhas pelas operárias (Barcoto et al., 2017). Ao ser aplicado em colônias de Acromyrmex subterraneus Forel, 1893, Syncephalastrum sp. também acarretou uma diminuição na taxa do corte de folhas, principalmente nas subcolônias sem rainhas (Bautz et al., 2023). Goes et al. (2022) demonstraram que as operárias de colônias aspergidas com esporos de Syncephalastrum sp. apresentaram maiores respostas higiênicas, em comparação com M. anisopliae e Escovopsis J.J. Muchovej & Della Lucia (1990). O último considerado um antagonista do fungo cultivado pelas formigas-cortadeiras (Jiménez-Gómez et al., 2021). O efeito de Syncephalastrum sp. pode ter sido amplificado pelo uso de subcolônias no estudo de Barcoto et al. (2017), uma vez que Bautz et al. (2023) mostraram que, em colônias completas de A. subterraneus, Syncephalastrum sp. apresentou baixo impacto nas condições gerais das colônias. Figura 1. Syncephalastrum sp. LESF 127. A: Macro morfologia da colônia. Cultivo em meio Ágar Malte 2% a 25 C, durante cinco dias, no escuro. B: Esporangióforo, estrutura assexuada de reprodução, compreendendo uma vesícula recoberta por merosporângios (seta). Cada merosporângio contém merósporos (esporos assexuados). Fonte: Elaborado pelo autor. O presente estudo determinou os efeitos de diferentes isolados de Syncephalastrum sp. em operárias e em colônias de A. sexdens. Nosso interesse em avaliar operárias advêm do fato da maioria dos estudos demostrar os efeitos de Syncephalastrum no fungo cultivado ou em subcolônias, porém nada se sabe se pode afetar indiretamente as operárias. Para tanto, foram 15 realizados bioensaios para determinar a mortalidade de operárias frente aos filtrados de cultivo dos isolados fúngicos e seus esporos, bem como testes de atratividade dos filtrados. Além disso, foram realizados experimentos com colônias jovens e maduras, nas quais foram aspergidos esporos de Syncephalastrum sp. para saber se afetam negativamente colônias contendo todos os elementos da eussocialidade e também a aplicação de esporos em colônias que receberam iscas formicidas, para avaliar o impacto causado pelo fungo em colônias debilitadas. 38 6 CONSIDERAÇÕES Este trabalho mostrou que Syncephalastrum sp. pode não somente causar a mortalidade de operárias de A. sexdens pela ingestão de filtrados de cultivo do fungo, mas também de 39 impactar negativamente as condições de colônias jovens e adultas, com todos os elementos da sociedade. No entanto, ao expor as operárias aos esporos do fungo, não podemos comprovar a ação entomopatogênica deste. A presença do fungo em colônias que não foram previamente inoculadas com esporos sugere que este habita as colônias no campo. Por motivos ainda não compreendidos, esse fungo permanece nas colônias durante a manutenção no laboratório, sendo que nossos resultados sugerem que colônias iniciais sejam mais afetadas por Syncephalastrum sp. O crescimento de Syncephalastrum sp. em colônias debilitadas com sulfluramida suporta a ideia de que que esse fungo seja um oportunista. O controle biológico de formigas-cortadeiras é desafiador, mas considerando a necessidade de desenvolvimento de métodos alternativos de combate, estudos futuros poderiam considerar o emprego de Syncephalastrum sp. em iscas não peletizadas, juntamente com outros fungos prejudiciais às formigas. Alternativamente, tais iscas poderiam conter um composto natural, com ação inseticida, que desestabilize o equilíbrio da colônia, assim possibilitando o crescimento oportunista de Syncephalastrum sp. 40 REFERÊNCIAS AMORIM, R. V. S. et al. Chitosan from Syncephalastrum racemosum using sugar cane substrates as inexpensive carbon sources. 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