JOSÉ GREGORIO MARTÍN BEDOYA Peptídeo-conjugados derivados da toxina ParE: Design, síntese e estudos biológicos Tese apresentada ao Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Biotecnologia. Orientador: Prof. Dr. Reinaldo Marchetto Araraquara - SP 2024 B412p Bedoya, Jose Gregorio Martin Peptídeo-conjugados derivados da toxina ParE : design, síntese e estudos biológicos / Jose Gregorio Martin Bedoya. -- Araraquara, 2024 83 f. : il. Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista (Unesp), Instituto de Química, Araraquara Orientador: Reinaldo Marchetto 1. Peptídeos. 2. DNA polimerases. 3. Antimicrobianos. 4. Toxinas bacterianas. 5. Antitoxinas. I. Título. Sistema de geração automática de fichas catalográficas da Unesp. Biblioteca do Instituto de Química, Araraquara. Dados fornecidos pelo autor(a). Essa ficha não pode ser modificada. II IMPACTO POTENCIAL DESTA PESQUISA A proposta de obtenção de peptídeo-conjugados como compostos antimicrobianos multifuncionais com atividades moleculares sinérgicas pode aliviar a situação crítica e atual da resistência microbiana, atendendo as necessidades urgentes da população, além de contrabalancear o peso financeiro exponencialmente crescente sobre os sistemas de saúde globais. POTENTIAL RESEARCH IMPACT The proposal of peptide-conjugates obtention as multifunctional antimicrobial compounds with synergic molecular activities could alleviate the critical and actual situation of microbial resistance, besides to counterbalancing the exponentially growing financial burden on global health systems. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA Câmpus de Araraquara Peptídeo-conjugados derivados da toxina ParE: Design, síntese e estudos biológicosTÍTULO DA TESE: CERTIFICADO DE APROVAÇÃO AUTOR: JOSÉ GREGORIO MARTÍN BEDOYA ORIENTADOR: REINALDO MARCHETTO Aprovado como parte das exigências para obtenção do Título de Doutor em Biotecnologia, pela Comissão Examinadora: Prof. Dr. REINALDO MARCHETTO (Participaçao Virtual) Departamento de Bioquímica e Química Orgânica / Instituto de Química - UNESP - Araraquara Prof. Dr. SAULO SANTESSO GARRIDO (Participaçao Virtual) Departamento de Bioquimica e Quimica Organica / Instituto de Quimica - UNESP - Araraquara Prof. Dr. EDUARDO FESTOZO VICENTE (Participaçao Virtual) Departamento Engenharia de Biossistemas-FCE/UNESP / Tupã/SP Prof. Dr. CLOVIS RYUICHI NAKAIE (Participaçao Virtual) Universidade Federal de São Paulo / UNIFESP / São Paulo Prof. Dr. WILTON ROGÉRIO LUSTRI (Participaçao Virtual) Departamento de Ciências Biológicas e da Saúde / Universidade de Araraquara - UNIARA - Araraquara Araraquara, 13 de março de 2024 Instituto de Química - Câmpus de Araraquara - Rua Prof. Francisco Degni, 55, 14800060, Araraquara - São Paulo http://www.iq.unesp.br/#!/pos-graduacao/biotecnologia/CNPJ: 48.031.918/0027-63. IV DADOS CURRICULARES 1. DADOS PESSOAIS Nome: José Gregorio Martín Bedoya Nome em citação Bibliográfica: Martín J. G. B. Filiação: María Rubiela Bedoya Data de nascimento: 03/08/1985, Bogotá-Co Estado civil: Solteiro Telefone: (16) 9967621728 E-mail: martins385@gmail.com 2. Resumo das Qualificações: Doutorando em Biotecnologia pela Universidade Estadual Paulista – Júlio de Mesquita Filho- UNESP, na área de síntese de peptídeos com ênfase no desenvolvimento compostos antimicrobianos. 3. FORMAÇÂO ACADÊMICA 2019 – Atual Doutorado em Biotecnologia. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, Instituto de Química- Araraquara. Título: Peptídeos derivados da proteína ParE: Design, síntese e estudos de atividade biológica. Orientador: Reinaldo Marchetto. Bolsa: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). 2017 – 2019 Mestrado em Biotecnologia. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, Instituto de Química - Araraquara. Título: Biomaterial a base de celulose bacteriana com aplicação na regeneração de tecido cutâneo. Orientador: Prof. Dr. Reinaldo Marchetto. Bolsa: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) V 2009 – 2012 Químico industrial Universidade Tecnológica de Pereira. Título: Evaluación de las actividades antibacteriana y alelopática del extracto en acetato de etilo y de algunas fracciones de Miconia caudata (Bonpl.) DC. Orientadora: Prof. Dr. Luz Stella Ramírez Aristizabal. Co-orientador: Francisco Javier Jiménez 4. ATUAÇÃO PROFISSIONAL Antek S.A.S. Laboratório de análises ambiental e Geoquímico. Analista químico. Análise de qualidade do ar em PST, PM10, PM2.5, NO2, SO2 e ozônio no ar. Isocinéticos, Material particulado, NO2 e SO2. Antek S.A.S. Laboratório de análises ambiental e geoquímico. Maio/2013 a Março/2015. Professor de química no ensino médio em Escolas do Estado de Risaralda-Co. colégio Liceo de Occidente, La Celia, Santo Domingo Savio, Balboa y Santa Ana, Guática. 100 horas. Chefe: Nancy Janeth Castillo Rodríguez, e-mail: nancycastillo@utp.edu.co., Agosto a Setembro de 2016. 5. PARTICIPAÇÃO EM EVENTOS 52ª Reunião Anual da SBBq, Águas de Lindóia, SP, 3 a 6 de junho de 2023. - Peptides Derived from ParE Protein: Design, Synthesis, Conjugation and Biological Activity. 1° Encontro Brasileiro de Biocelulose, Araraquara, SP, 4 e 5 de junho de 2018. - Bacterial Cellulose Membranes Modified with RGD Peptides for Skin Tissue Repair. 46ª Reunião Anual da SBBq, Águas de Lindóia, SP, 27 a 30 de junho de 2017. - Bacterial Cellulose Membranes Modified with RGD Peptides for Skin Tissue Repair VI 6. PRODUÇÃO BIBLIOGRÁFICA 6.1. Artigos completos publicados em periódicos Sanches BCP, Rocha CA, Bedoya JGM, Da Silva VL, Da Silva PB, Fusco- Almeida AM, Chorilli M, Contiero J, Crusca E, Marchetto R. Rhamnolipid-based liposomes as promising nano-carriers for enhancing the antibacterial activity of peptides derived from bacterial toxin-antitoxin systems. Int J Nanomed., v.16, p.925-936, 2021. RAMÍREZ, LSA., MONTES, AMO, MARTÍN, JGB., JIMÉNEZ, FJG. Allelopathic activity evaluation of ethyl acetate extract from Miconia caudata (BONPL.) DC. Cienc. Básicas., v. 13(2), p.100-104, 2017. 7. ATIVIDADES ACADÊMICAS RELEVANTES - Monitoria do Edital PROPG 17/2023, de acordo com a Estratégia 1, 2° semestre de 2023: Fundamentos de Bioquímica, CH 60 horas. - Estágio docência 2° semestre de 2022: Disciplina Bioquímica Geral e Experimental I, curso Bacharelado em Química, CH 45 horas. - Seminários Gerais do Programa de Pós-graduação em Biotecnologia VII AGRADECIMENTOS Aos meus familiares que me incentivaram e apoiaram imensamente para eu alcançar meus objetivos. Ao meu orientador Reinaldo Marchetto pela atenção, paciência, ensinamentos e pela oportunidade de realizar o presente trabalho e Edson Crusca por toda a ajuda com o projeto e amizade. Aos meus companheiros de “salinha de estudos”, Beatriz Sanchez, Naiara Maia, Jonatas Angelo, Carolina Zambom, Gabriela Zolin, Fauller Henrique, Jessica Allen, André Torres e o Prof. Dr. Saulo Santesso pela convivência diária, pela amizade, por todo seu apoio e colaboração. Aos demais professores, colegas e funcionários do Instituto de Química - UNESP pela atenção. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - código de financiamento 001. E a todos aqueles que de uma forma ou de outra participaram na realização desta pesquisa. VIII Resumo O desenvolvimento de novos fármacos com ação antibacteriana e antitumoral requer a identificação de um alvo celular específico. Um grupo de moléculas que se tornou alvo celular efetivo para agentes terapêuticos é o das topoisomerases. As topoisomerases, são enzimas essenciais para os processos de replicação e transcrição do DNA e, portanto, para a viabilidade celular. Inúmeros agentes antibacterianos atuam inibindo a atividade destas enzimas, como as quinolonas, cumarinas, microcinas e toxinas bacterianas, tais como ParE e CcdB. ParE inibe a síntese de DNA agindo diretamente na ação de duas topoisomerases: DNA girase e topoisomerase IV. Peptídeos derivados de ParE têm sido descritos como inibidores de topoisomerases bacterianas in vitro e, portanto, agentes antibacterianos em potencial. No entanto, a baixa capacidade destes peptídeos em permear a membrana plasmática bacteriana impede o uso dos mesmos para fins terapêuticos. Para contornar esta limitação, decidiu-se neste trabalho, projetar e sintetizar peptídeo-derivados de ParE, conjugados com fluoroquinolonas e moléculas contendo grupos cumarínicos, e avaliar a capacidade de inibir a atividade de diferentes topoisomerases bem como, em prevenir o crescimento bacteriano. Para isso, peptídeo- conjugados foram sintetizados pela metodologia de fase sólida, purificados e analisados por cromatografia líquida de alta eficiência e caracterizados por espectrometria de massas. Análise de dicroísmo circular revelou uma conformação predominante em folha- β nos peptídeos, e que as conjugações em ParELC3M não alteraram de forma significativa sua estruturação secundária. A capacidade de inibição destes compostos sobre a atividade das topoisomerases foi testada por ensaios de eletroforese em gel. Atividades antibacteriana e antifúngica avaliadas pelo método de microdiluição em caldo e a viabilidade celular pelo método de MTT. Um peptídeo derivado de ParE (ParELC3M) e seus conjugados CFX-ParELC3M, CICPOQ-ParELC3M, HOCAc-ParELC3M e CFXPip-ParELC3M foram obtidos e testados. Tentativa de expressão da proteína ParE também foi realizada, objetivando a obtenção da toxina para estudos comparativos. Em ensaios padrão de superenrolamento e relaxamento do DNA, o peptídeo ParELC3M e seus conjugados, não inibiram completamente a atividade da DNA girase de E. coli e S. pneumoniae, mas inibiram a DNA girase de M. tuberculosis em concentrações entre 50 e 12,5 µmol.L-1. Por outro lado, todos peptídeo-conjugados inibiram a reação de relaxamento catalisada pelo topo IV de E. coli e S. pneumoniae com valores de IC100 entre 50 e 25 µmol.L-1. Adicionalmente, os peptídeo-conjugados CFX-ParELC3M e CFXPip-ParELC3M inibiram a topo IA de E. coli e Topo II de levedura com valores de IC100 menores que 6,25 µmol.L-1 e 3,125 µmol.L-1, respectivamente. Somente CFXPip- ParELC3M foi capaz de inibir o crescimento bacteriano, com um valor de MIC de 25 µmol.L-1. Mas em relação à atividade antifúngica, os peptídeos-conjugados não apresentaram inibição de crescimento de C. albicans. Estes resultados indicam que a conjugação de grupos fluoquinolônicos a peptídeos inibidores de topoisomerases, tal como ParELC3M, podem facilitar sua passagem através da membrana bacteriana para atingir seu alvo intracelular, as topoisomerases. Além disso, os peptídeo-conjugados não demostraram toxicidade em células MRC-5. Os resultados indicam que os conjugados derivados de ParE representam uma estratégia promissora para o desenvolvimento de novos agentes antimicrobianos. Palavras chave: Peptídeos, DNA polimerases, Antimicrobianos, Toxinas bacteriana, Antitoxinas. IX Abstract The development of new drugs with antibacterial and antitumor action requires the identification of a specific cellular target. A group of molecules that has become an effective cellular target for therapeutic agents is the topoisomerases. Topoisomerases are enzymes essential for DNA replication and transcription processes, and therefore for cell viability. Numerous antibacterial agents act by inhibiting the activity of these enzymes, such as quinolones, coumarins, microcins, and bacterial toxins such as ParE and CcdB. ParE inhibits DNA synthesis by directly targeting the action of two topoisomerases: DNA gyrase and topoisomerase IV. Peptides derived from ParE have been described as inhibitors of bacterial topoisomerases in vitro and, therefore, potential antibacterial agents. However, the low capacity of these peptides to penetrate the bacterial plasma membrane prevents their use for therapeutic purposes. To circumvent this limitation, it was decided in this work, to design and synthesize peptide derivatives of ParE, conjugated with fluoroquinolones and molecules containing coumarin groups, and to evaluate their ability to inhibit the activity of different topoisomerases as well as to prevent bacterial growth. Therefore, peptide-conjugates were synthesized using solid-phase methodology, purified, and analyzed by high-performance liquid chromatography, and characterized by mass spectrometry. Circular dichroism analyses revealed a predominant β-sheet conformation in the peptide, and that the conjugations did not significantly alter their secondary structure. The inhibitory capacity of these compounds on topoisomerases activity was tested by gel electrophoresis assays. Antibacterial and antifungal activity were evaluated by broth microdilution method, and cell viability by MTT method. A peptide derived from ParE (ParELC3M) and its conjugates CFX-ParELC3M, CICPOQ-ParELC3M, HOCAc-ParELC3M, and CFXPip-ParELC3M were obtained and tested. Attempted expression of the ParE protein was also performed, aiming to obtain the toxin for comparative studies. In standard DNA supercoiling and relaxation assays, the ParELC3M peptide and its conjugates did not completely inhibit the activity of E. coli and S. pneumoniae DNA gyrase, but inhibited M. tuberculosis DNA gyrase at concentrations ranging 50 µmol.L-1 to 12.5 µmol.L-1. On the other hand, all peptide- conjugates inhibited the relaxation reaction catalyzed by E. coli and S. pneumoniae topoisomerase IV with IC100 values ranging from 50 to 25 µmol.L-1. Additionally, the peptide-conjugates CFX-ParELC3M and CFXPip-ParELC3M inhibited E. coli topoisomerase IA and yeast Topo II with IC100 values lower than 6.25 µmol.L-1 and 3.125 µmol.L-1, respectively. Only CFXPip-ParELC3M was able to inhibit bacterial growth, with an MIC value of 25 µmol.L-1. However, regarding antifungal activity, the peptide- conjugates showed no inhibition against C. albicans. These results indicate that conjugating fluoroquinolone groups to topoisomerase inhibitor peptides, such as ParELC3M, may facilitate their passage through the bacterial membrane to reach their intracellular target, the topoisomerases. Additionally, the peptide-conjugates showed no toxicity in MRC-5 cells. The results suggest that conjugates derived from ParE represent a promising strategy for the development of new antimicrobial agents. Keywords: Peptides, DNA polymerases, antimicrobials, Bacterial toxins, Antitoxins X LISTA DE FIGURAS Figura 1. Ilustração dos diferentes tipos de DNA topoisomerases .................................. 3 Figura 2. Mecanismo de um sistema TA. (a) manutenção da estabilidade do plasmídeo; (b) morte celular.......................................................................................................... 6 Figura 3. Estrutura primária de ParE e de ParD de E. coli (plasmídeo RK2). ................. 7 Figura 4. Abordagem de hibridização no desenvolvimento de antimicrobianos .............. 9 Figura 5. Esquema ilustrativo da síntese de peptídeo pela metodologia da fase sólida e estratégia Fmoc. ....................................................................................................... 11 Figura 6. Estruturas da ciprofloxacina (CFX), Ácido 7-cloro-1-ciclopropil-6-fluor- 1,4dihidro-4-oxoquinolona-3-carboxílico (CICPOQ) e Ácido 7-Hidroxicumarinil-4- acético (HOCAc) ....................................................................................................... 13 Figura 7. Esquema de síntese de Boc-CFX ................................................................. 13 Figura 8. Esquema de síntese dos peptídeo-conjugados CFX-ParELC3M, CICPOQ- ParELC3M e HOCAc-ParELC3M. ............................................................................. 14 Figura 9. Esquema de síntese do peptídeo-conjugado CFXPip-ParELC3M ................. 15 Figura 10. Espectros de DC mostrando o perfil característico das principais estruturas secundárias de peptídeos e proteínas: α-hélice, folha-β e randômica. ..................... 17 Figura 11. Mapa do vetor pSMT3 utilizado na clonagem de parE ................................ 19 Figura 12. Mapa do vetor pSUMOUlp1 utilizado na clonagem de parE .......................... 20 Figura 13. Diagrama de fita de ParE de E. coli. A α-hélice C-terminal e as três folhas beta, β2, β3 e β4, estão coloridas em vermelho, laranja, azul e magenta, respectivamente. ...................................................................................................... 30 Figura 14. (a) Estrutura primária de ParELC3M e b) diagrama de fita do peptídeo ParELC3M, a α-hélice no C-terminal e a folha β4, utilizada no desenho do peptídeo ................................................................................................................................. 31 Figura 15. Perfis cromatográficos obtidos em escala analítica do peptídeo ParELC3M antes (A) e após purificação (B). Condições gerais de análise (Materiais e Métodos): gradiente linear 30 a 90% de solvente B em 30 min, fluxo de 1 mL.min-1 e detecção a 220 nm. Figura inserida, espectro de massas ES+. .................................................. 33 Figura 16. Perfis cromatográficos obtidos em escala analítica do peptídeo-conjugado CFX-ParELC3M antes (A) e após purificação (B). Condições gerais de análise (Materiais e Métodos): gradiente linear 5 a 95% de solvente B em 30 min, fluxo de 1 mL.min-1 e detecção a 220 nm. Figura inserida, espectro de massas ES+. .............. 33 XI Figura 17. Perfis cromatográficos obtidos em escala analítica do peptídeo-conjugado CICPOQ-ParELC3M antes (A) e após purificação (B). Condições gerais de análise (Materiais e Métodos): gradiente linear 5 a 95% de solvente B em 30 min, fluxo de 1 mL.min-1 e detecção a 220 nm. Figura inserida, espectro de massas ES+. .............. 34 Figura 18. Perfis cromatográficos obtidos em escala analítica do peptídeo-conjugado HOCAc-ParELC3M antes (A) e após purificação (B). Condições gerais de análise (Materiais e Métodos): gradiente linear 5 a 95% de solvente B em 30 min, fluxo de 1 mL.min-1 e detecção a 220 nm. Figura inserida, espectro de massas ES+. .............. 34 Figura 19. Perfis cromatográficos obtidos em escala analítica do peptídeo-conjugado CFXPip-ParELC3M antes (A) e após purificação (B). Condições gerais de análise (Materiais e Métodos): gradiente linear 5 a 95% de solvente B em 30 min, fluxo de 1 mL.min-1 e detecção a 220 nm. Figura inserida, espectro de massas ES+. .............. 35 Figura 20. Espectros de CD obtidos para ParELC3M e seus conjugados em (A) solução aquosa, (B) TFE 60%, .............................................................................................. 36 Figura 21. Amplificação da ORF de parE por PCR HF a partir do vetor pETDuet-1, utilizando os primers específicos. (A) Marcador de peso molecular (GeneRuler 1 kb Thermoscientific), (B) produto amplificado, indicado pela seta. ................................ 38 Figura 22. Confirmação da clonagem pela clivagem do vetor pSUMOUlp1 mais inserto. (A) Marcador de peso molecular (GeneRuler 1 kb Thermoscientific), (B) Alíquota de clivagem, indicado pela seta em 311 pb. Revelado por electroforese em gel de agarose 1% e brometo de etídeo. ............................................................................. 38 Figura 23. Análise de SDS-PAGE da proteína ParE em E. coli origami. (1) Marcador molecular BlueClassic Prestained Protein Marker-Jena Bioscience.; (2) lavagem; (3) lavagem com imidazol 10 mmol.L-1; (4) imidazol 25 mmol.L-1;(5) imidazol 50 mmol.L-1; (6) imidazol 75 mmol.L-1; (7) imidazol 100 mmol.L-1; (8) imidazol 250 mmol.L-1; (9) imidazol 500 mmol.L-1; (10) imidazol 1000 mmol.L-1 em SDS-PAGE 15 %. A seta aponta onde estaria a banda da proteína expressa. ................................................. 39 Figura 24. Eletroforese em gel, para triagem inicial da ação dos produtos a. ParELC3M, b. HOCAc-ParELC3M, c. CICPOQ-ParELC3M, d. CFX-ParELC3M e e. CFXPip- ParELC3M, na concentração de 100 μmol.L-1, sobre a inibição da atividade da DNA girase de E. coli. C-: controle negativo (pBR322 relaxado); C+: controle positivo (pBR322 relaxado + 1U de DNA girase) ................................................................... 40 Figura 25. Eletroforese em gel, para triagem inicial da ação dos produtos a. ParELC3M, b. HOCAc-ParELC3M, c. CICPOQ-ParELC3M, d. CFX-ParELC3M e e. CFXPip- XII ParELC3M, na concentração de 100 μmol.L-1, sobre a inibição da atividade da DNA girase de S. pneumoniae. C-: controle negativo (pBR322 relaxado); C+: controle positivo (pBR322 relaxado + 1U de DNA girase). ..................................................... 40 Figura 26. Eletroforese em gel, para triagem inicial da ação dos produtos a. ParELC3M, b. HOCAc-ParELC3M, c. CICPOQ-ParELC3M, d. CFX-ParELC3M e e. CFXPip- ParELC3M, na concentração de 100 μmol.L-1, sobre a inibição da atividade da DNA girase de M. tuberculosis. C-: controle negativo (pBR322 relaxado); C+: controle positivo (pBR322 relaxado + 1U de DNA girase). ..................................................... 41 Figura 27. Eletroforese em gel para determinação de IC100 de a. ParELC3M, b. CFX- ParELC3M e c. CFXPip-ParELC3M sobre a atividade da DNA girase de E. coli. C -: controle negativo (pBR322 relaxado); C+: controle positivo (pBR322 relaxado + 1U de DNA girase). Os números em cada aplicação no gel representam a concentração do peptídeo ou conjugado em μmol.L-1. .................................................................... 42 Figura 28. Eletroforese em gel para determinação de IC100 para a. ParELC3M, b. HOCAc-ParELC3M, c. CICPOQ-ParELC3M, d. CFXPip-ParELC3M e e. CFX- ParELC3M sobre a atividade da DNA girase de M. tuberculosis. C-: controle negativo (pBR322 relaxado); C+: controle positivo (pBR322 relaxado + 1U de DNA girase). Os números em cada aplicação no gel representam a concentração do peptídeo ou conjugado em μmol.L-1. ............................................................................................ 43 Figura 29. Eletroforese em gel, para triagem inicial da ação dos produtos a. ParELC3M, b. HOCAc-ParELC3M, c. CICPOQ-ParELC3M, d. CFX-ParELC3M e e. CFXPip- ParELC3M, na concentração de 100 μmol.L-1, sobre a inibição da atividade da Topo IV de E. coli. C-: controle negativo (pBR322 superenrolado); C+: controle positivo (pBR322 superenrolado + 1U de Topo IV). ............................................................... 45 Figura 30. Eletroforese em gel, para triagem inicial da ação dos produtos a. ParELC3M, b. HOCAc-ParELC3M, c. CICPOQ-ParELC3M, d. CFX-ParELC3M e e. CFXPip- ParELC3M, na concentração de 100 μmol.L-1, sobre a inibição da atividade da Topo IV de S. pneumoniae. C-: controle negativo (pBR322 superenrolado); C+: controle positivo (pBR322 superenrolado + 1U de Topo IV). .................................................. 45 Figura 31. Eletroforese em gel para determinação de IC100 para a. ParELC3M, b. HOCAc-ParELC3M, c. CICPOQ-ParELC3M, d. CFX-ParELC3M e e. CFXPip- ParELC3M sobre a atividade da Topo IV de E. coli. C-: controle negativo (pBR322 superenrolado); C+: controle positivo (pBR322 superenrolado + 1U de Topo IV). Os XIII números em cada aplicação no gel representam a concentração do peptídeo ou conjugado em μmol.L-1. ............................................................................................ 46 Figura 32. Eletroforese em gel para determinação de IC100 para a. ParELC3M, b. HOCAc-ParELC3M, c. CICPOQ-ParELC3M, d. CFX-ParELC3M e e. CFXPip- ParELC3M sobre a atividade da Topo IV de S. pneumoniae. C-: controle negativo (pBR322 superenrolado); C+: controle positivo (pBR322 superenrolado + 1U de Topo IV). Os números em cada aplicação no gel representam a concentração do peptídeo ou conjugado em μmol.L-1. ....................................................................................... 47 Figura 33. Eletroforese em gel, para triagem inicial da ação dos produtos a. ParELC3M, b. HOCAc-ParELC3M, c. CICPOQ-ParELC3M, d. CFX-ParELC3M e e. CFXPip- ParELC3M, na concentração de 100 μmol.L-1, sobre a inibição da atividade da Topo IA de E. coli. C-: controle negativo (pBR322 superenrolado); C+: controle positivo (pBR322 superenrolado + 1U de Topo IA). ............................................................... 48 Figura 34. Eletroforese em gel para determinação de IC100 para a. ParELC3M, b. CFX- ParELC3M e c. CFXPip-ParELC3M sobre a atividade da Topo IA de E. coli. C-: controle negativo (pBR322 superenrolado); C+: controle positivo (pBR322 superenrolado + 1U de Topo IA). Os números em cada aplicação no gel representam a concentração do peptídeo ou conjugado em μmol.L-1. ........................................... 49 Figura 35. Eletroforese em gel, para triagem inicial da ação dos produtos a. ParELC3M, b. HOCAc-ParELC3M, c. CICPOQ-ParELC3M, d. CFX-ParELC3M e e. CFXPip- ParELC3M, na concentração de 100 μmol.L-1, sobre a inibição da atividade da Topo II de levedura. C-: controle negativo (pBR322 superenrolado); C+: controle positivo (pBR322 superenrolado + 1U de Topo II). ................................................................ 51 Figura 36. Eletroforese em gel para determinação de IC100 para a. ParELC3M, b. HOCAc-ParELC3M, c. CICPOQ-ParELC3M, d. CFX-ParELC3M e e. CFXPip- ParELC3M sobre a atividade da Topo II de levedura. C-: controle negativo (pBR322 superenrolado); C+: controle positivo (pBR322 superenrolado + 1U de Topo II). Os números em cada aplicação no gel representam a concentração do peptídeo ou conjugado em μmol.L-1. ............................................................................................ 52 Figura 37. Ensaio de viabilidade celular para as células MRC-5, na presença do peptídeo ParELC3M e seus conjugados, expressa em %, com tempo de incubação das amostras de 72 horas. As barras indicam o desvio padrão dos dados. .............. 56 XIV LISTA DE TABELAS Tabela 1. Pares de primers utilizados para clonagem em vetores de expressão heteróloga ................................................................................................................ 18 Tabela 2. Massas moleculares teóricas e obtidas por espectroscopia de massas. ...... 35 Tabela 3. Massa obtida de cada produto sintetizado, após o processo de purificação. 36 Tabela 4. Comparação da atividade inibitória do peptídeo ParELC3M e respectivos conjugados em topoisomerases bacterianas. ........................................................... 50 Tabela 5. Atividade antimicrobiana de ParELC3M e seus conjugados. ........................ 54 XV LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 1. Aminoácidos Ala (A) - alanina Arg (R) - arginina Asn (N) - asparagina Asp (D) - ácido aspártico Glu (E) - ácido glutâmico Gly (G) - glicina His (H) - histidina Ile (I) - isoleucina Leu (L) - leucina Lys (K) - lisina Met (M) - metionina Phe (F) - fenilalanina Pro (P) - prolina Ser (S) - serina Val (V) - valina 2. Outras ACN Ahx AMH ATCC ATP Boc Boc2O CLAE CSD CFX CICPOQ CIM CMH CPP DC Acetonitrila Acido ε-aminocapróico Ágar Mueller Hinton American Type Culture Collection Adenosina trifosfato t-Butiloxicarbonila Dicarbonato de di-terc-butila Cromatografia Líquida de Alta Eficiência Sabouraud Dextrose Ciprofloxacina 7-cloro-1-ciclopropil-6-fluor-1,4dihidro-4-oxoquinolona-3-carboxílico Concentração Inibitória Mínima Caldo Mueller Hinton Peptídeo de penetração celular (Cell Penetration Peptide) Dicroísmo circular XVI DCM DIC DIEA DMEM DMF DNA dNTP EDTA Fmoc HF HOBt HOCAc IC100 IPTG LB LC-MS MRC-5 MS MTT PCR PBS PSK ORF RNAs RPM SDP SDS-Page STEB SUMO TA TBE tBu TEA TFA TFE UV Diclorometano Diisopropilcarbodiimida N-Diisopropiletilamina Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium N, N-Dimetilformamida Ácido desoxiribonucleico Desoxinucleotídeo trifosfato Ácido Etilenodiaminotetracético 9-Fluorenilmetiloxicarbonila High Fidelity N-Hidroxibenzotriazol Ácido 7-Hidroxicumarinil-4-acético Concentração requerida para inibição completa da atividade enzimática Isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo Luria Bertani Cromatografia Líquida Acoplada a Espectrometria de Massas Medical Research Council cell 5 Espectroscopia de Massas Brometo de 3-4,5-dimethiltiazol-2,5-difeniltetrazolium Reação em Cadeia da Polimerase (Polymerase chain reaction) Phosphate Buffered Saline Morte pós-segregacional (postsegregational killing) Open Reading Frame Ácido ribonucleico pequeno Rotação por Minuto Sabouraud Dextrose Dodecil Sulfato de Sódio - Eletroforese em Gel de Poliacrilamida Carregador de DNA: Sacarose, Tris, EDTA e Azul de Bromofenol Pequeno modificador semelhante à Ubiquitina (Small Ubiquitin-like Modifier) Sistema Toxina-Antitoxina Tampão para eletroforese tris/borato/EDTA terc-butila Trietilamina Ácido Trifluoroacético Trifluoroetanol Ultra-Violeta XVII SUMÁRIO 1. Introdução .................................................................................................................. 1 1.1. Novos agentes antimicrobianos: um cenário preocupante ................................... 1 1.2. DNA topoisomerases: alvos estratégicos para novos agentes antimicrobianos ... 3 1.3. Sistemas toxina-antitoxina (TAs) ......................................................................... 5 1.4. Peptídeos conjugados ......................................................................................... 8 2. Objetivos Gerais ...................................................................................................... 10 3. Materiais e Métodos ................................................................................................. 11 3.1. Síntese de peptídeos ......................................................................................... 11 3.2. Peptídeo-conjugados ......................................................................................... 12 3.2.1. Síntese da Boc-CFX ...................................................................................13 3.2.2. Síntese dos peptídeo-conjugados .............................................................. 14 3.3. Purificação e Caracterização ............................................................................. 16 3.4. Dicroísmo Circular (DC) ..................................................................................... 17 3.5. Produção da Proteína ParE ............................................................................... 18 3.5.1. Amplificação por PCR de parE ................................................................... 18 3.5.2. Construção de vetores de expressão ......................................................... 21 3.5.3. Clonagem nos vetores pSMT3 e pSUMOUlp1 .............................................. 21 3.5.4. Transformação de parE-pSUMOUlp1 e parE-pSMT3 em E. coli Origami (DE3) 22 3.5.5. Purificação da proteína ParE ...................................................................... 22 3.6. Ensaios de inibição da atividade enzimática ...................................................... 23 3.6.1. Inibição da atividade da DNA girase ........................................................... 23 3.6.2. Inibição da atividade da Topoisomerase IV (Topo IV) ................................. 24 3.6.3. Inibição da atividade da topoisomerase IA de E. coli .................................. 25 3.6.4. Inibição da atividade da Topoisomerase II de levedura .............................. 25 3.7. Avaliação da atividade antimicrobiana ............................................................... 26 3.7.1. Preparação do inoculo ................................................................................ 26 3.7.2. Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) para bactérias ...... 26 3.7.3. Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) para fungos .......... 27 3.8. Ensaios de toxicidade ........................................................................................ 28 4. Resultados e Discussão ........................................................................................... 30 4.1. Design e síntese de peptídeo e peptídeo-conjugados ....................................... 30 4.2. Purificação e caracterização .............................................................................. 32 4.3. Dicroísmo Circular ............................................................................................. 36 4.4. Produção de ParE ............................................................................................. 37 4.4.1. Amplificação ............................................................................................... 37 4.4.2. Clonagem ................................................................................................... 38 XVIII 4.4.3. Expressão e purificação da toxina ParE em E. coli origami ........................ 39 4.5. Ensaios de inibição da atividade das topoisomerases bacterianas .................... 39 4.5.1. Ensaios de inibição da atividade de DNA girase ......................................... 40 4.5.2. Ensaios de inibição da atividade de topoisomerases IV.............................. 44 4.5.3. Ensaios de inibição da atividade de Topo IA de E. coli ............................... 48 4.5.4. Ensaios de inibição da atividade da Topo II de levedura ............................ 51 4.6. Avaliação da atividade antimicrobiana. .............................................................. 54 4.7. Ensaio de toxicidade .......................................................................................... 56 5. Conclusões .............................................................................................................. 58 6. Referências .............................................................................................................. 59 Introdução 1 1. Introdução 1.1. Novos agentes antimicrobianos: um cenário preocupante A descoberta e o uso clínico de antibióticos, como a penicilina, podem ser considerados uma das maiores conquistas da história da medicina. Apesar de seu valor essencial na medicina moderna, os antibióticos também pertencem a única classe de medicamentos que perdem sua eficácia com o uso em larga escala à medida que as bactérias desenvolvem resistência aos mesmos (GAYNES, 2017). A resistência, assim como a tolerância, é um fenômeno natural onde uma série de mecanismos bioquímicos auxilia os patógenos a escaparem dos efeitos letais dos antibióticos, ameaçando a capacidade de tratamento de doenças comuns (ALI, RAFIQ, RATCLIFFE, 2018). Apesar destes mecanismos variarem de patógeno para patógeno, a resistência é causada por alguns fatores básicos (ou combinações deles), como a inativação do antibiótico por alterações químicas, modificação do alvo que leva à perda de sensibilidade ao antibiótico, mudanças na bomba de efluxo e na permeabilidade externa da membrana e efluxo plasmidico, alterações nos genes que codificam as topoisomerases, entre outros (AKINWALE et al., 2018, CHANDRA et al., 2017; GUIMARÃES, MOMESSO, PUPO, 2010). Diferentemente da resistência que é baseada em mutação gênica e cria um processo ativo de defesa, a persistência é fundamentada na formação e manutenção de subpopulações metabolicamente pouco ativas (BALABAN et al., 2019). A persistência é um estado de tolerância transitório em que a tolerância ao antibiótico não é genética e persiste dentro de uma população suscetível. Apesar de células persistentes terem desvantagens óbvias a despeito do crescimento e divisão celular, elas são menos suscetíveis a situações de mudanças repetidas de ambiente que normalmente trazem agentes químicos e/ou físicos perigosos. Tais subpopulações possuem uma grande probabilidade de serem tolerantes a agentes estressantes por conta da inatividade de certos alvos metabólicos (HARMS, MAISONNEUVE, GERDES, 2016). Neste caso, as células persistentes não são resistentes, mas apenas tolerantes, ou seja, as células não crescem na presença de antibióticos, mas também não morrem (HELAINE; KUGELBERG, 2014; KEREN et al., 2004). A capacidade de as bactérias desenvolverem resistência aos antibióticos está bem documentada. Inicialmente, o arsenal de novos antibióticos era suficiente para superar a resistência observada e os antibióticos eram muitas vezes tidos como garantidos. No entanto, à medida que a oferta de novos antibióticos diminuiu, houve um aumento simultâneo e preocupante do fenômeno da resistência aos antibióticos Introdução 2 (DHINGRA et al., 2020). Nos últimos 40 anos, nenhuma classe importante de antibióticos foi introduzida no mercado, sendo que a nova classe mais recente de antibióticos foi descoberta na década de 1980 (MIETHKE et al., 2021). Embora agentes antimicrobianos como linezolida, daptomicina e retamolina tenham sido lançados na década de 2000, suas classes químicas foram suplantadas na década de 1950 (oxazolidinona, ácido lipopeptídeo e pleuromutilina, respectivamente), e estas são ativas apenas contra patógenos Gram-positivos (PICCONI et al., 2020, CHIN et al., 2023). Impulsionado pelo consumo excessivo e pelo uso imprudente de antibióticos clinicamente utilizados, e pela evolução e disseminação contínua de elementos de resistência genética móvel, um número crescente de patógenos bacterianos multirresistentes (MDR) e até mesmo extremamente resistentes a medicamentos (XDR) têm emergido. Estas bactérias MDR aumentam a morbidade, a mortalidade dos pacientes e os custos de saúde. (BANIN; HUGHES; KUIPERS, 2017). Isso tudo evidencia que novos candidatos a medicamentos são cada vez mais difíceis de serem identificados e levados ao mercado. Como resultado, há uma lacuna crescente entre a necessidade clínica e a inovação de medicamentos (URBAN-CHMIEL et al., 2022). Vários relatórios publicados pelas principais autoridades mundiais de saúde pública, como a OMS, o Centro Europeu de Prevenção e Controle de Doenças (CEPC) e os Centros de Controle e Prevenção de Doenças nos EUA (CCD), têm destacado a situação urgente e crítica da resistência antimicrobiana. Estima-se que pelo menos 700.000 pessoas em todo o mundo morrem todos os anos em consequência de infecções resistentes aos medicamentos, e este número poderá aumentar para 10 milhões até 2050 se o problema da resistência antimicrobiana não for resolvido (MIETHKE et al., 2021). Infelizmente, o dramático aumento mundial de bactérias resistentes a agentes antibacterianos não pode ser contrabalanceado pelo atual baixo ritmo de desenvolvimento de novos produtos terapêuticos incluindo aqueles com novos modos de ação (KIM et al., 2020). Assim, um investimento estratégico em novas opções terapêuticas para combater a resistência aos antimicrobianos é urgentemente necessário para atender às necessidades não satisfeitas dos pacientes e, além disso, para contrabalançar o peso financeiro exponencialmente crescente sobre os sistemas de saúde globais (MIETHKE et al., 2021). Introdução 3 Diante deste cenário, é urgente e de suma importância o desenvolvimento de novos e aprimorados agentes antibacterianos, mais potentes e menos susceptíveis aos diversos mecanismos de resistência bacteriana. (GAJDÁCS, 2019). 1.2. DNA topoisomerases: alvos estratégicos para novos agentes antimicrobianos As DNA topoisomerases constituem um grupo de enzimas que se tornou alvo efetivo para vários agentes terapêuticos. São enzimas que mantêm o nível estacionário de superenrolamento global e resolvem problemas topológicos do DNA (McKIE; NEUMAN; MAXWELL, 2021). O princípio catalítico comum consiste na clivagem de uma ou duas fitas de DNA, na manipulação da topologia e na vedação da lacuna nas fitas de DNA (SCHOEFFLER e BERGER, 2008). As enzimas são classificadas em topoisomerases tipo I e tipo II em relação ao número de fitas de DNA que são clivadas. Eles são ainda divididas em tipo IA, IB e IC de acordo com diferenças mecanísticas, e em tipo IIA e IIB de acordo com mecanismo e características estruturais das enzimas (Figura 1). Figura 1. Ilustração dos diferentes tipos de DNA topoisomerases Fonte: Elaborado pelo autor As topoisomerases do tipo I, também conhecidas como Topo I, cliva uma fita simples do DNA e não requer ATP para realizar essa clivagem. Especificamente, a subfamília IA das Topo I, é constituída pelas topoisomerases I e III bacterianas, topoisomerases III de eucariotos e girase reversa de arqueobactérias (CHAMPOUX, 2001). Estas enzimas são todas monoméricas, com exceção da girase reversa da bactéria Methanopyrus kandleri, a qual consiste em um heterodímero (KRAH et al., 1996). Elas requerem íons metálicos bivalentes (Mg+2 e Zn+2) e a exposição de uma Introdução 4 região de fita simples do DNA para realização da atividade catalítica. A clivagem de uma cadeia de DNA é acompanhada pela ligação covalente 5’-fosfotirosinil, formando uma ponte enzima/fita única com o DNA, permitindo assim a passagem da outra fita através da abertura gerada (MILLS; TSE-DINH; NEUMAN, 2018), o que resulta no relaxamento de superenrolamentos negativos do DNA (CHAMPOUX, 2002; TEREKHOVA et al., 2012). Em contraste, as topoisomerases tipo IB e tipo IC não requerem íons bivalentes para catálise e estão ligadas ao grupo 3'-fosfato no intermediário covalente. Não há sequência ou homologia estrutural entre as topoisomerases tipo IA, tipo IB e tipo IC (CORBETT e BERGER, 2004). Constituintes de todos os patógenos bacterianos, as topoisomerases tipo IA têm sido consideradas alvos potenciais para a descoberta de novos agentes antimicrobianos (TSE-DINH, 2009, 2015) porém, as Topo IA ainda não constituem alvos terapêuticos clínicos. Embora não existam medicamentos aprovados que utilizem topoisomerases do tipo IA como alvos celulares, pode-se argumentar que, uma vez que todas as topoisomerases tem um resíduo de tirosina no sítio ativo, para formar o intermediário covalente, também deve ser possível que um inibidor possa capturar e estabilizar o complexo covalente formado pelas topoisomerases do tipo IA (SEDDEK; ANNAMALAI; TSE-DINH, 2021). As topoisomerases do tipo II (Topo II), ao contrário das Topo I, são enzimas ATP dependentes que catalisam a clivagem simultânea de ambas as fitas da hélice de DNA (Figura 1), para gerenciar emaranhados e superenrolamentos do DNA (HIRSCH e KLOSTERMEIER, 2021). As Topo II alteram a topologia do DNA, gerando uma quebra transitória da fita dupla em um segmento de DNA, formando uma ligação covalente 5’- fosfotirosina, e permitindo que outro segmento passe pela abertura gerada (KENDRA; OVIATT; OSHEROFF, 2021). Em relação às subclasses das Topo II, as enzimas dos tipos IIA e IIB compartilham subunidades B homólogas que abrangem o sítio de ligação do ATP, mas possuem subunidades A não homólogas que catalisam a clivagem do DNA. As topoisomerases do tipo IIA são onipresentes em bactérias e eucariotos, enquanto os membros da família IIB estão presentes principalmente em archaea e plantas (JIAN e OSHEROFF, 2023). As topoisomerases do tipo IIA incluem a topoisomerase II eucariótica (Topo II) e as enzimas bacterianas topoisomerase IV (Topo IV) e DNA girase (HIRSCH e KLOSTERMEIER, 2021). Introdução 5 A DNA girase e a topoisomerase IV são topoisomerases bacterianas essenciais que controlam a topologia do DNA durante a replicação, transcrição e outros processos associados ao DNA (McKIE; NEUMAN; MAXWELL, 2021). A DNA girase introduz superenrolamentos negativos no DNA bacteriano através de um mecanismo dependente de ATP, enquanto a topoisomerase IV elimina principalmente os emaranhados de DNA que ocorrem durante a replicação do DNA. Ambas as enzimas são compostas por duas proteínas, codificadas pelos genes gyrA e gyrB para DNA girase, e pelos genes parC e parE no caso da topoisomerase IV (BUSH et al., 2020). Esses dois conjuntos de proteínas são compostos por quatro subunidades proteicas, formando complexos heterotetraméricos: A2B2 para DNA girase e C2E2 para topoisomerase IV. São alvos bem documentados para a terapia antimicrobiana, sendo as fluoroquinolonas conhecidas por possuírem um mecanismo de “direcionamento duplo” com a possibilidade de inibir ambas as enzimas simultaneamente. O duplo direcionamento é uma perspectiva atraente para a descoberta de medicamentos antimicrobianos, uma vez que a inibição de duas enzimas simultaneamente apresenta às bactérias um desafio significativo para a evolução da resistência (TSE-DINH, 2016). Assim, o estudo de sistemas toxina-antitoxina bacterianos (TAs), que exercem atividades importantes no contexto da resistência e persistência bacteriana (HARMS, MAISONNEUVE, GERDES, 2016; PATEL, 2016), podem não só ajudar a compreender o seu papel na disseminação e evolução da resistência bacteriana aos antibióticos, mas também servir de modelo para o desenho racional de moléculas tais como peptídeos derivados, com ação inibitória simultânea que resultem em atividades antimicrobianas específicas e, acima de tudo, que as exerçam através de mecanismos de ação alternativos aos antibióticos disponíveis (BELETE, 2019; PICCONI et al., 2020). 1.3. Sistemas toxina-antitoxina (TAs) Os TAs, originalmente vinculados a sistemas de manutenção de plasmídeos (OGURA e HIRAGA, 1983), são pequenos módulos genéticos encontrados em estruturas genéticas móveis bacterianas, como plasmídeos, bem como em cromossomos bacterianos. Os loci TA codificam sistemas de dois componentes que consistem em uma toxina estável cuja superexpressão mata a célula bacteriana ou interrompe o crescimento celular, e uma antitoxina cognata instável (YANG e WALSH, 2017). Em condições favoráveis ao crescimento celular a toxina é normalmente neutralizada pela antitoxina. Contudo, quando um plasmídeo que codifica o TA é perdido de uma célula ou sob condições de Introdução 6 estresse (tal como na escassez de nutrientes e presença de substâncias nocivas), as antitoxinas são rapidamente degradadas por proteases e RNases, tornando as toxinas livres para agir sobre os seus alvos com consequente interferência em processos celulares fundamentais, como a replicação do DNA, a transcrição, tradução de proteínas, síntese da parede celular e produção de ATP (Figura 2) e consequentemente no crescimento ou viabilidade celular (GERDES; RASMUSSEN; MOLIN, 1986, MASUDA; INOUYE, 2017). Figura 2. Mecanismo de um sistema TA. (a) manutenção da estabilidade do plasmídeo; (b) morte celular. Fonte: Adaptado de HERNÁNDEZ-ARRIAGA et al., 2016. Os TAs não são essenciais para o crescimento celular normal, mas participam de outros eventos celulares importantes, tais como a formação de biofilmes, proteção contra bacteriófagos, reparação do DNA cromossomal e resposta a condições adversas (BUSTAMANTE; IREDELL, 2017), além de estarem diretamente associados à persistência bacteriana (HALL; GOLLAN; HELAINE, 2017). Desta forma, os módulos TA podem ser compreendidos basicamente como entidades genéticas que regulam o crescimento celular em procariotos. Os TAs são classificados em oito grupos (tipo I a VIII), de acordo com a natureza molecular e o modo de ação pelo qual as antitoxinas neutralizam as toxinas (SONG e WOOD, 2020). Com exceção do tipo VIII recentemente descoberto, no qual as toxinas são RNAs, em todas as outras classes de TA, as toxinas são proteínas. As antitoxinas Introdução 7 são RNAs não codificantes (tipo I, III e VIII) ou pequenas proteínas (tipo II, IV, V, VI e VII) (HARMS et al., 2018, SONG e WOOD, 2020). O grupo mais amplamente estudado de todos os módulos TA são os módulos do tipo II, onde tanto a toxina quanto a antitoxina são pequenas proteínas (SINGH et al., 2021). Para a neutralização da toxina, a antitoxina forma um complexo com a toxina e atua como um inibidor de forte ligação (GOEDERS e VAN MELDEREN, 2013). Sob condições de estresse, como privação de nutrientes, perda de plasmídeo, alta temperatura, estresse oxidativo, infecção por bacteriófagos ou pressão de antibióticos, a célula garante a degradação proteolítica da antitoxina, diminuindo assim a concentração de antitoxina e liberando a toxina para sua ação tóxica (WANG e WOOD, 2011, CHUKWUDI e GOOD, 2015, COUSSENS e DAINES, 2016). As toxinas exibem toxicidade de várias maneiras. As toxinas MqsR, MazF, HigB e RelE atuam como endorribonucleases específicas de sequência (CHRISTENSEN e GERDES, 2003; HURLEY e WOYCHIK, 2009; ZHANG et al., 2003), enquanto as toxinas CcdB e ParE afetam a replicação do DNA inibindo o superenrolamento mediado pela DNA girase (DAO-THI et al., 2005; JIANG et al., 2002) O sistema ParDE, identificado pela primeira vez no plasmídeo RK2 de um amplo espectro de hospedeiros, está entre os primeiros sistemas TA identificados, e foi denotado como “Par” por seu papel no particionamento do plasmídeo através de um sistema de morte pós-segregacional (PSK) (AMES, et.al, 2019). Neste sistema, ParE (103 aminoácidos) é a toxina e ParD (83 aminoácidos) a antitoxina (Figura 3). ParD existe como um dímero em solução e se liga à forma dimérica da toxina ParE para formar um complexo tetramérico capaz de neutralizar a ação de ParE. A ação de ParE resulta no acúmulo de quebras de DNA, promovendo a letalidade em modelos de morte por segregação de plasmídeo (PSK) e, assim, invocando a resposta SOS in vivo (JIANG et al., 2002). Figura 3. Estrutura primária de ParE e de ParD de E. coli (plasmídeo RK2). 1MTAYILTTDAEADLRGIIRYTRKQWGTAQVRRYIARLEHGIADLAAGRGSFRDMSELFPELRMIHCEHHY VFCLPHGSAPALVVAIFHERMDLMARLSERLNIES105 ParE 1MSRLTIDMTDQQHQSLKALAALQGKTIKQYALERLFPGDADADQAWQELKTMLGNRINDGLAGKVSTKS VGEILDEELSGDRA83 ParD Fonte: Elaborado pelo autor Introdução 8 Estudos realizados com peptídeos derivados de ParE apresentaram resultados promissores em termos de inibição da atividade tanto da DNA girase quanto da topoisomerase IV in vitro, porém ensaios in vivo foram insatisfatórios, basicamente devido à baixa permeabilidade da membrana celular bacteriana a estes peptídeos (BARBOSA et al., 2012). Dada esta dificuldade, uma abordagem inovadora seria a hibridação destes peptídeos derivados de ParE, com uma segunda entidade funcional, tal como um antibiótico ou seu análogo que, de um lado, poderia facilitar a permeação e inserção intracelular do peptídeo, e de outro, melhorar a especificidade, promovendo um efeito sinérgico das moléculas conjugadas, na capacidade inibitória de diferentes topoisomerases. 1.4. Peptídeos conjugados Dentre a abordagem inovadora de desenvolvimento de medicamentos peptídicos, está a hibridação de um antibiótico ou seu análogo, com uma segunda entidade funcional, tal como um peptídeo, conectados por um ligante, formando os chamados conjugados antibiótico-peptídeo (APCs) que possam atuar como um antimicrobiano multifuncional (WANG et al., 2017). Estes conjugados podem ser agrupados em duas categorias principais (Figura 4). Na primeira (híbridos antimicrobianos), ambos os elementos funcionais do híbrido exercem atividade antimicrobiana (p.ex. peptídeo+antibiótico). Devido ao direcionamento duplo, o desenvolvimento da resistência pode ser significativamente prejudicado, as propriedades farmacocinéticas podem ser superiores em comparação às terapias combinadas com os antibióticos isolados, e a potência antibacteriana é frequentemente aprimorada de maneira sinérgica. Na segunda categoria (conjugados antimicrobianos), uma porção funcional controla o acúmulo da outra parte do conjugado, p.ex. mediando um transporte para a célula bacteriana ou bloqueando o efluxo (KLAHN; BRÖNSTRUP, 2017). O propósito destes híbridos é produzir um composto antimicrobiano multifuncional que induza atividades antibacterianas sinérgicas que ofereçam poucas possibilidades de que as bactérias desenvolvam resistência e melhorem as deficiências conhecidas dos antibióticos ou peptídeos, tais como a instabilidade sérica, citotoxicidade, hemólise e especialmente na penetração celular (AKINWALE et al., 2018; KLAHN; BRÖNSTRUP, 2017). Introdução 9 Neste contexto, peptídeos derivados de ParE, com reconhecida atividade inibitória da DNA girase, conjugados com antibióticos quinolônicos ou cumarínicos, bem como seus análogos, poderiam resultar em um APC, com atividades antibacterianas sinérgicas, grande capacidade de permeação e inserção intracelular, menor resistência antibacteriana e potencial inibitório de DNA topoisomerases. Figura 4. Abordagem de hibridização no desenvolvimento de antimicrobianos Fonte: KLAHN; BRÖNSTRUP (2017), modificado. Objetivos 10 2. Objetivos Gerais O objetivo principal deste trabalho foi a síntese química de estruturas moleculares obtidas pela conjugação de um peptídeo derivado da toxina ParE e derivados quinolônicos ou cumarínicos, que permeiem a membrana plasmática de microrganismos e atuem sinergicamente na inibição de diferentes topoisomerases. Objetivos Específicos 1. Sintetizar quimicamente, um peptídeo derivado da toxina ParE; 2. Conjugar antibióticos e seus análogos ao peptídeo projetado e sintetizado; 3. Obter a toxina ParE de E. coli por técnicas de expressão heteróloga; 4. Avaliar, comparativamente à toxina ParE, a capacidade inibitória dos peptídeo livre e peptídeo-conjugados, sobre a atividade de diferentes topoisomerases; 5. Verificar a atividade antimicrobiana dos peptídeo-conjugados, comparativamente a toxina ParE, por meio de ensaios de determinação da concentração inibitória mínima (CIM) e viabilidade celular; 6. Analisar o efeito citotóxico dos peptídeos livres e seus conjugados; Materiais e Métodos 11 3. Materiais e Métodos 3.1. Síntese de peptídeos Um peptídeo derivado de ParE, denominado ParELC3M, foi sintetizado quimicamente pelo método da fase sólida (AMBLARD et al., 2006), de acordo com o protocolo padrão que emprega o grupamento base-lábil Fmoc como protetor dos α-amino grupos, e derivados t-butílicos (t-Bu) para a proteção das cadeias laterais de resíduos de aminoácidos trifuncionais (BEHRENDT; WHITEB; OFFERC, 2016) em seringa de polipropileno de 10 mL, munida de um filtro de polietileno poroso, conectada a um sistema à vácuo com frasco coletor de resíduos (Figura 5). Figura 5. Esquema ilustrativo da síntese de peptídeo pela metodologia da fase sólida e estratégia Fmoc. Fonte: Elaborado pelo autor Foi inicialmente utilizado 1g de uma Rink amida MBHA com grau de substituição de 0,55 mmol.g-1, empregando DIC/HOBt (Diisopropilcarbodiimida/1-hidroxibenzotriazol) como agentes de condensação. Na etapa de acoplamento (Etapa 1 - Figura 5) de cada Materiais e Métodos 12 aminoácido, foi empregado um excesso molar de 3 vezes em relação à quantidade de resina de partida (1,65 mmol), tanto para o Fmoc-aminoácido quanto para os agentes de condensação, inicialmente em uma mistura Diclorometano (DCM):Dimetilformamida (DMF) (1:1), por um período de 2 horas. A desproteção dos grupos α-amínicos (remoção do grupo base lábil Fmoc), após a entrada de cada aminoácido, foi realizada empregando-se uma solução de 4-metilpiperidina 20% (v/v) em DMF (Etapa 2 - Figura 5). A eficiência das etapas de entrada de cada aminoácido foi monitorada pelo teste de ninidrina (KAISER et al., 1970) e, quando positivo (condensação incompleta), o processo foi repetido com 50% da quantidade inicial dos reagentes. Uma fração da peptidil-resina obtida (ParELC3M-Resina) foi separada para ser utilizada na preparação dos conjugados e o restante foi acetilada, empregando 10 equivalentes de anidrido acético, em DMF, por 45 min (Etapa 3 - Figura 5). A clivagem final do peptídeo da resina e a desproteção dos grupos protetores das cadeias laterais, após acetilação, foi efetuada pelo tratamento da peptidil-resina com uma solução de clivagem contendo TFA (93,0%), água deionizada (2,5%), etanoditiol (2,5%) e triisopropilsilano (2,0%), a 25ºC por 3 h (Etapa 4 - Figura 5). O peptídeo bruto (ParELC3M) foi precipitado, lavado com éter dietílico gelado (repetição de cinco vezes). A cada repetição o conteúdo era submetido à agitação e posteriormente centrifugação a 4500 rpm por 5 min, seguidos da retirada e descarte do sobrenadante. Ao final, o resíduo de éter foi evaporado e o conteúdo seco à vácuo. Para a extração do peptídeo, o produto seco obtido, foi solubilizado em uma solução de ácido acético 15% (v/v) seguida de centrifugação (4500 rpm por 5 min) por 5 vezes. Todo o sobrenadante proveniente desta etapa foi submetido a filtração simples em placa de polietileno porosa, seguido de rotoevaporação (aproximadamente 45 min) e liofilização por 24 h. Após essas etapas, o extrato bruto foi liofilizado, analisado, purificado e caracterizado, juntamente com os peptídeos conjugados obtidos. 3.2. Peptídeo-conjugados Na preparação dos peptídeo-conjugados, foram utilizados a ciprofloxacina (CFX), o Ácido 7-cloro-1-ciclopropil-6-fluor-1,4-dihidro-4-oxoquinolona-3-carboxílico (CICPOQ) e o Ácido 7-Hidroxicumarinil-4-acético (HOCAc) (Figura 6). O primeiro, um antibiótico do grupo das quinolonas, cujo mecanismo de ação envolve a inibição da síntese de DNA, especialmente em bactérias Gram-negativas, atuando na inibição da atividade da cadeia A (GyrA) da DNA girase; o segundo, um precursor da CFX contendo um átomo de cloro em substituição ao anel de piperazina na posição 7 do anel quinolônico; e o terceiro, uma Materiais e Métodos 13 cumarina substituída precursora da Novobiocina, um inibidor da cadeia B (GyrB) da DNA girase, especificamente da sua atividade de ATPase. Figura 6. Estruturas da ciprofloxacina (CFX), Ácido 7-cloro-1-ciclopropil-6-fluor-1,4dihidro-4-oxoqui- nolona-3-carboxílico (CICPOQ) e Ácido 7-Hidroxicumarinil-4-acético (HOCAc) Fonte: Elaborado pelo autor 3.2.1. Síntese da Boc-CFX Para a síntese do conjugado com ciprofloxacina, inicialmente foi necessário proteger o nitrogênio da piperazina com o grupo t-Butiloxicarbonila (Boc). Para isso, 2 mmol de CFX foram dissolvidas em 20 mL de uma mistura THF:água (1:1) contendo 4 mL de NaOH 2 mol.L-1. Em seguida, a solução foi resfriada a 0ºC e então, 3 mmol de dicarbonato de di- terc-butila (Boc2O) foram adicionados gota-a-gota. A reação foi então mantida a temperatura ambiente, por 48 horas, no escuro sob agitação constante. Ao final do período, o volume foi reduzido por rotaevaporação e a solução resultante, acidificada com HCl 2 mol.L-1, para eliminar o excesso de Boc2O. O precipitado formado foi filtrado, lavado com água ultrapura (2×50 mL), seco sob vácuo e caracterizado (Figura 7). Figura 7. Esquema de síntese de Boc-CFX Fonte: Elaborado pelo autor Materiais e Métodos 14 3.2.2. Síntese dos peptídeo-conjugados Em cada uma de 3 seringas de polipropileno de 5 mL, munidas de um filtro de polietileno poroso, foram adicionados 100 mg da ParELCM-resina (item 3.1) pré-solvatadas em DMF. Às duas primeiras foram adicionados 70 µmol de Boc-CFX e HOCAc, respectivamente, dissolvidos na mistura DCM:DMF (1:1). À terceira, foi adicionado 70 µmol de CICPOQ dissolvido apenas em DMF. A reação de condensação foi iniciada, adicionando a cada uma das seringas, a mesma quantidade de DIC e HOBt (70 µmol cada), e mantendo a reação por um período de 2 horas, no escuro, à temperatura ambiente. No caso da condensação de CICPOQ, foi necessário a repetição do processo para a negativação do teste de ninidrina. A clivagem final de cada peptídeo-conjugado da resina e a desproteção dos grupos protetores das cadeias laterais, foi efetuada pelo tratamento da peptidil-resina com uma solução de clivagem contendo TFA (93,0%), água deionizada (2,5%), etanoditiol (2,5%) e triisopropilsilano (2,0%), a 25ºC por 3 h (Figura 8). Figura 8. Esquema de síntese dos peptídeo-conjugados CFX-ParELC3M, CICPOQ-ParELC3M e HOCAc-ParELC3M. Fonte: Elaborado pelo autor Na síntese do peptídeo-conjugado CFXPip-ParELC3M (Figura 9), também foi utilizada 100 mg da ParELCM-Resina, porém acoplando-se inicialmente ácido Fmoc-ε- aminocapróico (Fmoc-Ahx), empregando DIC/HOBt como agentes de condensação, em DCM:DMF. Após a condensação, o grupo Fmoc foi removido empregando-se uma solução Materiais e Métodos 15 de 4-metilpiperidina 20% (v/v) em DMF, por 10 min à temperatura ambiente, seguida de lavagens com DMF. Para a preparação da bromo acetamida 4, adicionou-se à resina, 1,5 mL de uma mistura gelada de DIPEA:TEA (1:1) em DMF. Em seguida foram adicionados 1,5 mL de uma solução contendo 0,16 mmol de cloreto de bromoacetila em DCM gelado (QANDIL et al., 2014; MUSTAEV et al., 2014). Após agitação durante 15 min a 0º C, a reação foi mantida à temperatura ambiente por 8 h, sob agitação ocasional. A reação foi monitorada pelo teste de ninidrina, sendo necessária a repetição da reação por duas vezes, para obtenção da resina bromo acetamida funcionalizada 4 (Figura 9). Para a alquilação da amina do anel de piperazina da CFX, uma mistura contendo 0,065 mmol de CFX (21 mg), 0,065 mmol de KI (13,2 mg), 0,065 mmol de KHCO3 (6,6 mg) e 0,106 mmol de DIPEA (18,5 µL) em 1 mL de 2,2,2-Trifluoroetanol (TFE) e 2 mL de DCM, foi adicionada à resina 4, e a reação mantida por um período de 24 h, no escuro, em agitação constante à temperatura ambiente. A reação de alquilação foi repetida duas vezes. A clivagem final foi realizada com uma solução de TFA, como descrito no item 3.1, para resultar no conjugado 5 (Figura 9). Figura 9. Esquema de síntese do peptídeo-conjugado CFXPip-ParELC3M Fonte: Elaborado pelo autor Materiais e Métodos 16 3.3. Purificação e Caracterização Ao final de todo processo de síntese e obtenção dos peptídeo-conjugados, uma pequena quantidade de cada produto liofilizado (aproximadamente 1 mg) foi dissolvida em 1 mL de água ultrapura, filtrada e submetida à análise qualitativa por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), em um sistema Shimadzu Prominense, sob condições analíticas (coluna C18, Júpiter Phenomenex (250 x 4,6 mm); d=5 μm; 300 Å), empregando um gradiente de 30 a 90% (ParELC3M) e 5 a 95% (peptídeo-conjugados) de solvente B em 30 minutos (A: 0,045% TFA em H2O; B: 0,036% TFA em Acetonitrila), fluxo de 1 mL/minuto e comprimento de onda de 220 nm. A partir dos resultados de tempo de retenção e porcentagem de solvente obtidos nestas análises, foram definidas as condições relativas à concentração de solvente para purificação, em escala semi-preparativa (coluna C18, Zorbax Eclipse XDB (250 x 10 mm); d=10 μm; 300 Å), efetuada em um cromatógrafo Shimadzu LC-20AT/SPD-20A/CBM-20A. As condições de purificação foram idênticas para as amostras: gradiente de 5 a 95% de B em 30 minutos (A: 0,045% TFA em H2O; B: 0,036% TFA em Acetonitrila), fluxo de 2,5 mL/minuto e comprimento de onda de 220 nm. As frações provenientes do processo de purificação foram submetidas novamente a análises por cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (CLAE-FR) em modo analítico. O conteúdo dos tubos denominados puros foi reunido e liofilizado, com posterior análise por CLAE-FR para confirmação da pureza. A caracterização dos produtos foi realizada por determinação da massa molecular, calculadas aplicando a equação 1, a partir dos dados de razão massa molecular/carga (MM/z) obtidas em um sistema LC/MS constituído por UFLC Shimadzu acoplado a um espectrômetro de massas Bruker Amazon SL. Condições de ESI-MS: capilar: 3kV, cone: 37 kV, eletrospray modo de ionização positivo (ES+). 𝐌𝐌𝐚𝐦𝐨𝐬𝐭𝐫𝐚 = (MM . z) – (z . MMH +) Equação 1 Onde: MMamostra é a massa molecular do produto em análise; MM é a razão massa molecular/carga obtida por espectrometria de massas; z é o número de cargas que contém o peptídeo ou peptídeo-conjugado (z = 1, 2, 3,); MMH+ a massa molecular do íon hidrogênio, de valor 1,008 g.mol-1 Materiais e Métodos 17 3.4. Dicroísmo Circular (DC) A espectroscopia de DC é um poderoso método em biologia estrutural usado desde 1960 para examinar estruturas secundárias de proteínas e peptídeos em solução (WHITMORE e WALLACE, 2007). O fenômeno de dicroísmo circular se baseia no desvio da luz circularmente polarizada incidente em compostos opticamente ativos, onde o componente circularmente polarizado à direita é absorvido em diferente intensidade em relação ao polarizado à esquerda (KELLY; JESS; PRICE, 2005). Em peptídeos e proteínas, devido ao caráter de dupla ligação resultante da coplanaridade dos átomos CONH, a rotação ao redor da ligação peptídica é restrita, sendo permitida apenas na ligação entre o átomo de nitrogênio e o carbono alfa (HN-Cα), cujo ângulo de rotação é Ф (phi), e na ligação entre o átomo de carbono alfa e a carbonila (Cα- C=O), representado pelo ângulo de rotação Ψ (psi). A rotação dos ângulos específicos Ф e Ψ e a interação das cadeias laterais formarão, assim, as estruturas secundárias básicas das proteínas: α-hélice, folha-β e estrutura randômica (desordenada), responsáveis por espectros de DC característicos (Figura 10) Figura 10. Espectros de DC mostrando o perfil característico das principais estruturas secundárias de peptídeos e proteínas: α-hélice, folha-β e randômica. Fonte: Adaptado de WHITMORE e WALLACE (2007). Materiais e Métodos 18 Assim sendo, a análise da estrutura secundária de cada peptídeo foi feita pela técnica espectroscópica de DC, empregando em espectropolarímetro JASCO J-815, localizado no Instituto de Química de Araraquara - UNESP (equipamento multiusuário). Neste trabalho, os peptídeos foram estudados numa concentração de 60 μmol.L-1 em duas diferentes condições: solução aquosa e trifluoretanol (TFE) 60%. Foram utilizadas celas de 1 mm de caminho óptico, acúmulo de 7 varreduras nos comprimentos de onda entre 190 e 250 nm e temperatura de 25°C. Para todos os experimentos o tempo de integração foi de 3 segundos por ponto e a leitura foi feita a cada 0,2 nm. 3.5. Produção da Proteína ParE A sequência do gene parE foi obtida pela empresa GO (GenOne), isolada e amplificada por PCR (Polymerase Chain Reaction) a partir do DNA genômico de E. coli O157, sendo a ORF (Open Reading Frame) do gene clonado no vetor de expressão pETDuet-1 no sítio de multiclonagem 1 entre BamHI e SalI. 3.5.1. Amplificação por PCR de parE A sequência de DNA que codifica para ParE foi amplificada por PCR, utilizando como molde o vetor pETDuet-1 e foram desenhados os primers complementares às extremidades da ORF do gene (Tabela 1). Tabela 1. Pares de primers utilizados para clonagem em vetores de expressão heteróloga Nome do primer Sequências do primer Sítio de restrição BamHI_F 5’-ATATGGATCCATGACGGCGTACATCCTGAC-3’ BamHI EcoRI_R: 5’- AACAGAATTCACCTTTCAGACGGTCCG CCAG -3’ EcoRI EcoRI_TER_R 5’- AACAGAATTCTTAACCTTTCAGACGGTCCGCCAG -3’ EcoRI Fonte: Elaborado pelo autor Estes primers contém os sítios de restrição reconhecidos para as enzimas de restrição BamHI_F e EcoRI_TER_R para usar o vetor de expressão pSMT3 (Figura 11) e os primers para BamHI_F e EcoRI_R para o vetor de expressão pSUMOUlp1 (Figura 12). Sendo pSMT3 e pSUMOUlp1 vetores de expressão fusionada a proteína SUMO (Small Materiais e Métodos 19 Ubiquitin-like Modifier) e contém sítios de clivagem para trombina, Ulp1. O vetor pSMT3 expressa a proteína SUMO junto com uma cauda de 6xHis na porção N-terminal da toxina parE (BUTT et al., 2015), mas no vetor pSUMOUlp1, a proteína SUMO é expressa na porção N-terminal e a cauda de 6xHis é expressa na porção C-terminal, tornando possível sua purificação através da ligação com uma coluna de níquel (SHIMOKAWA-FALCÃO et al., 2017). Figura 11. Mapa do vetor pSMT3 utilizado na clonagem de parE Fonte: Adaptado de BUTT et al., 2015 Materiais e Métodos 20 Figura 12. Mapa do vetor pSUMOUlp1 utilizado na clonagem de parE Fonte: Adaptado SHIMOKAWA-FALCÃO et al., 2017 O protocolo de amplificação foi realizado com um volume final de 25 µL contendo 2,5 µL de buffer High Fidelity, 0,5 µL de dNTP, 0,5 µL de Taq High Fidelity Pol(Cellco®), 1,25 µL de cada primer (concentração final de 10 pmol/µL de cada primer), e aproximadamente 2 ng de DNA molde. Com isso, foi ajustado o volume final da reação de 25,0 µL com água. As reações de desnaturação foram realizadas em Termociclador Veriti (Applied Biosystems) na condição inicial de desnaturação a 95°C por 3 minutos, posteriormente 35 Materiais e Métodos 21 ciclos de 95°C por 1 minuto, 54°C por 1 minuto e 72°C por 7 minutos. Os produtos foram purificados utilizando o kit PCR (Cellco®). Os produtos de PCR foram analisados em gel de agarose 1%, corados com brometo de etídeo e visualizados sob luz UV. De acordo com a sequência de nucleotídeos de parE, foram desenhados e sintetizados primers complementares à extremidade da ORF do gene, os quais se ligam ao mesmo, servindo de ancoragem para a enzima Taq polimerase, responsável pela polimerização do DNA. 3.5.2. Construção de vetores de expressão Para a expressão heteróloga das ORF’s de parE foram utilizados os vetores de expressão pSMT3 e pSUMOUlp1. Os vetores e a sequência de parE foram clivadas com as mesmas enzimas de restrição BamHI e EcoRI os quais permitiriam a clonagem do gene no vetor de expressão pSMT3 e pSUMOUlp1. O produto purificado da reação de PCR foi utilizado para ligação nos vetores de expressão. Para a reação de ligação foram usados 100 ng do plasmídeo, 30 ng do produto amplificado purificado, 1 µL da enzima T4 DNA ligase 3 U.µL-1, 2 µL do tampão de reação 5x em um volume total de 20 µL. A reação de ligação foi mantida a 4°C overnight. 3.5.3. Clonagem nos vetores pSMT3 e pSUMOUlp1 A reação de ligação foi utilizada para transformar por choque térmico, células de E. coli DH5α quimio competentes. A transformação foi realizada adicionando 200 µL de células de E. coli DH5α a 10 μL de produto de ligação (construção de parE-pSUMOUlp1 e parE- pSMT3), em seguida cada solução foi incubada em banho-maria a 42°C por 1,5 minutos e novamente em gelo por 3 minutos. Após o choque térmico, foram adicionados 800 µL de meio Luria Bertani (LB) e incubado a 37°C por 1 h. Após esse período, 200 µL da cultura foi plaqueada em meio LB ágar contendo 25 µg.mL-1 de canamicina para parE-pSMT3 e cloranfenicol para pSUMOUlp1 e incubadas por 37°C por 16 h. Uma das colônias positivas foi repicada em 5 mL de meio LB contendo 25 µg.mL-1 de canamicina para parE-pSMT3 e cloranfenicol para parE-pSUMOUlp1. O DNA plasmidial foi extraído com o kit de mini-prep (Promega) utilizando o protocolo segundo fabricante. Posteriormente, esses plasmídeos foram utilizados para as reações de sequenciamento e clivagem com enzimas de restrição, com o intuito de confirmar a identidade da construção. O material extraído foi quantificado no nanodrop sendo obtidas aproximadamente para parE-pSMT3 99 ng.µL-1 e para parE-pSUMOUlp1 83,6 ng.µL-1 de DNA. Materiais e Métodos 22 3.5.4. Transformação de parE-pSUMOUlp1 e parE-pSMT3 em E. coli Origami (DE3) O mesmo procedimento de transformação de células competentes de E. coli foi utilizado com as construções parE-pSMT3 e parE-pSUMOUlp1, por choque térmico em células quimio competentes que, após transformação, uma das colônias foi repicada em um pré-inóculo de 5 mL de meio LB líquido contendo 25 µg.mL-1 de canamicina e cloranfenicol e incubadas por 37°C por 16 h a 250 rpm. Após esse período, foi realizada uma diluição de 1:100 de pré-inóculo em 500 mL de LB líquido com 25 µL.mL-1 dos mesmos antibióticos, e a cultura foi mantida nas mesmas condições de temperatura e agitação até chegar em sua fase logarítmica de crescimento (DO=0,5 e λ=600 nm). A produção de proteínas foi induzida pela adição de IPTG (isopropil β-d-1-tio-galactopiranósideo) na concentração final de 0,4 mmol.L-1 por 16 horas. A presença da proteína no sobrenadante foi verificada tomando alíquotas de 500 µL da cultura em intervalos de 1 hora para análise da expressão em SDS-PAGE 15%. Após o período de indução, o volume total da cultura foi submetido à centrifugação em centrífuga Sorvall RC5C plus rotor SLA15000 (3000 x g; 4°C por 10 min). O precipitado contendo as bactérias foi ressuspendido em 25 mL de tampão de lise (Tris 10 mmol.L-1, NaH2PO4 50 mmol.L-1 e NaCl 300 mmol.L-1, pH 8,0) por litro de cultura e submetido à sonicação com 8 pulsos de 1 minuto com 20% de potência, intercalados por pausas de 30 segundos, em sonicador Sonic Desmembrator 500 (Fischer Scientific), para lise celular. O lisado foi centrifugado em Sorvall RC5C plus rotor SS34 (3000 x g a 4°C por 10 min), para a separação das frações solúvel (sobrenadante) e insolúvel (precipitado). A fração solúvel foi filtrada a vácuo em filtro de 0,45 µm e a fração insolúvel foi ressuspendida em tampão de lise (50 mL por litro de cultura), sendo coletados 500 μL de sobrenadante e 500 μL do precipitado ressuspendido em 5 mL de tampão de lise pH 8,0, os quais foram utilizados para posterior análise em um teste de solubilidade em SDS-PAGE 15%. 3.5.5. Purificação da proteína ParE A presença da proteína (ParE-pSMT3 e ParE-pSUMOUlp1 contendo uma sequência de seis histidinas na região N-terminal e uma na região C-terminal) no sobrenadante foi verificada em SDS-PAGE 15%. A purificação foi realizada em cromatografia de afinidade em resina de níquel Ni-NTA superflow (Qiagen) a 4°C. A coluna foi pré-equilibrada, com 5 volumes de tampão de lise (pH 8,0), o sobrenadante da cultura induzida previamente filtrado foi adicionado. Após ligação da proteína à resina, foi realizada uma lavagem da coluna com Materiais e Métodos 23 3 volumes de tampão de lise e seguiu-se para eluição da proteína em tampão de lise contendo concentrações crescentes de imidazol (10, 25, 50, 75, 100, 250, 500 e 1000 mmol.L-1), sendo 2 volumes das soluções com 10 a 100 mmol.L-1 e 3 volumes da solução com 250 mmol.L-1 de imidazol. As amostras eluídas foram analisadas em SDS-PAGE 15% corado com azul de comassie. 3.6. Ensaios de inibição da atividade enzimática As DNA topoisomerases utilizadas nesse trabalho, com exceção da Topo IA de Escherichia coli, foram adquiridas comercialmente da Inspiralis Ltda (http://www.inspiralis.com) e fornecidas com os respectivos tampões e substratos. A Topo IA de Escherichia coli, foi adquirida comercialmente da New England Biolabs (https://international.neb.com), sendo fornecida também com o seu tampão de ensaio e substrato. Para todos os ensaios de inibição enzimática, inicialmente foram feitas triagens, utilizando ParELC3M e os peptídeo-conjugados sintetizados, em uma concentração inicial de 100 µmol.L-1, afim de avaliar o potencial de inibição frente a cada uma das enzimas. Posteriormente, aqueles com atividade inibitória nesta concentração, foram selecionados e testados em concentrações decrescentes, a fim de se determinar a mínima concentração que venha a inibir 100% da atividade da topoisomerase (IC100). 3.6.1. Inibição da atividade da DNA girase Os ensaios de inibição do superenovelamento do DNA (inibição da atividade da DNA girase) de Escherichia coli, Mycobacterium tuberculosis e Streptococcus pneumoniae, foram realizados incubando-se 1 unidade (U) da enzima com 0,5 μg de plasmídeo pBR322 relaxado em tampão de ensaio na presença do peptídeo ou peptídeo-conjugado de interesse em diferentes concentrações, em um volume de reação total de 30 μL, conforme protocolo da Inspiralis Ltda. A incubação foi feita a 37°C por 30 min no tampão de ensaio (descrito abaixo). Posteriormente a reação foi interrompida pela adição de 3 µL de SDS 2% e incubação por 5 minutos a 65ºC. Em seguida foram adicionados 15 μL de solução de STEB (sacarose 20%; Tris.HCl 0,05 mol.L-1, pH 8,0, EDTA 0,05 mol.L-1 e azul de bromofenol 0,5 mg.mL-1) e 60 μL da mistura clorofórmio:álcool isoamílico (24:1). Posteriormente as amostras foram centrifugadas por 3 min a 12.000 rpm e os sobrenadantes recolhidos e analisados por eletroforese em gel de agarose 1% em tampão TBE (Tris 89 mmol.L-1, ácido bórico 89 mmol.L-1; EDTA 2 mmol.L-1, pH 8,0), submetidas à tensão constante de 60 V a temperatura ambiente por 2 horas. Após a corrida, o gel foi Materiais e Métodos 24 corado durante 15 minutos com uma solução de brometo de etídio (1 μg.mL-1) em tampão de corrida TBE e analisado em um fotodocumentador Alpha Imager EP System da Alpha Innotech. Escherichia coli Tampão de diluição: Tris.HCl 50 mmol.L-1; KCl 100 mmol.L-1; DTT 2 mmol.L-1; EDTA 1 mmol.L-1; glicerol 50% (m/v); pH = 7,5; Tampão de ensaio (5x): Tris.HCl 35 mmol.L-1; KCl 24 mmol.L-1; MgCl2, 4 mmol.L-1; Espermidina 1,8 mmol.L-1; DTT, 2 mmol.L-1; ATP 1 mmol.L-1; glicerol 6,5% (v/v); Albumina 0,1 μg.mL-1; pH = 7,5; Streptococcus pneumoniae Tampão de diluição: Tris.HCl 50 mmol.L-1; KCl 100 mmol.L-1; EDTA 1 mmol.L-1; DTT 2 mmol.L-1; glicerol 50% (m/v); pH = 7,5; Tampão de ensaio (5x): Tris.HCl 35 mmol.L-1; KCl 24 mmol.L-1; MgCl2,4 mmol.L-1; DTT 2 mmol.L-1; ATP 1 mmol.L-1; Espermidina 1,8 mmol.L-1; Albumina 0,1 mg.mL-1; glicerol 6,5% (m/v) pH = 7,5; Mycobacterium tuberculosis Tampão de diluição: Tris.HCl 50 mmol.L-1; DTT 5 mmol.L-1; glicerol 30% (m/v); pH = 7,9. Tampão de ensaio (5x): HEPES.KOH 50 mmol.L-1; Acetato de magnésio 6 mmol.L-1; DTT 4 mmol.L-1; ATP 1 mmol.L-1; Glutamato de potássio 100 mmol.L-1; Espermidina 2 mmol.L-1; Albumina 0,05 mg.mL-1; pH = 7,9. 3.6.2. Inibição da atividade da topoisomerase IV (Topo IV) Os ensaios de inibição do relaxamento do DNA superenovelado pela atividade da Topo IV de E coli, e S. pneumoniae foram realizados incubando-se 1 unidade (U) da enzima com 0,5 μg de plasmídeo pBR322 superenovelado na presença do peptídeo-conjugado de interesse em diferentes concentrações, em um volume total de reação de 30 μL, conforme protocolo da Inspiralis Ltda. A incubação ocorreu a 37°C por 30 min no respectivo tampão de ensaio (descrito abaixo). Posteriormente as amostras foram tratadas, submetidas à análise de eletroforese em gel de agarose e analisadas em fotodocumentador, conforme descrito no item anterior. Escherichia coli Tampão de diluição: HEPES-KOH 40 mmol.L-1;DTT 1 mmol.L-1; EDTA 1 mmol.L-1; glutamato de potássio 100 mmol.L-1; glicerol 40% (m/v); pH = 7,6; Tampão de ensaio 5x: HEPES-KOH 50 mmol.L-1; glutamato de potássio 100 mmol.L-1; acetato de magnésio 10 mmol.L-1; DTT10 mmol.L-1; ATP 1 mmol.L-1; Albumina 50 μg.mL-1; pH=7,6; Materiais e Métodos 25 Streptococcus pneumoniae Tampão de diluição: HEPES-KOH 40 mmol.L-1; DTT 1 mmol.L-1; EDTA 1 mmol.L-1; glutamato de potássio 100 mmol.L-1; glicerol 40% (m/v); pH = 7,6; Tampão de ensaio (5x): Tris.HCl 40 mmol.L-1; NaCl 10 mmol.L-1; MgCl2 6 mmol.L-1; glutamato de potássio 200 mmol.L-1; DTT 10 mmol.L-1; ATP 1 mmol.L-1; Soroalbumina bovina 0,05 mg.mL-1; pH = 7,5; 3.6.3. Inibição da atividade da topoisomerase IA de E. coli Os ensaios de inibição do relaxamento do DNA superenovelado (inibição da atividade da topoisomerase IA de E. coli) foram realizados incubando-se 1 unidade (U) da enzima com 0,5 μg de plasmídeo pBR322 superenovelado na presença do peptídeo- conjugado de interesse em diferentes concentrações, em um volume total de reação de 30 μL, conforme protocolo da New England Biolabs A incubação foi feita a 37°C por 20 min no respectivo tampão de ensaio. Após o período de reação, a enzima foi inativada a 65°C por 20 min. Posteriormente as amostras foram tratadas, submetidas à análise de eletroforese em gel de agarose e analisadas em fotodocumentador, conforme descrito no item 3.5.1. Tampão de diluição: Tris.HCl 10 mmol.L-1; KCl 50 mmol.L-1; DTT 1 mmol.L-1; EDTA 0,1 mmol.L-1; (NH4)2SO4 35 mmol.L-1; glicerol 50% (v/v); pH = 7,5; Tampão de ensaio (10x): Acetato de potássio 50 mmol.L-1; Tris.Acetato 20 mmol.L-1, acetato de magnésio 10 mmol.L-1; Albumina 100 μg /mL; pH = 7,9; 3.6.4. Inibição da atividade da Topoisomerase II de levedura Os ensaios de inibição do relaxamento do DNA superenovelado (inibição da atividade da Topo II) de levedura foram realizados incubando-se 1 unidade (U) da enzima com 1 μL de ATP mais 0,5 μg de plasmídeo pBR322 superenovelado em tampão de ensaio na presença do peptídeo-conjugado de interesse em diferentes concentrações, em um volume total de reação de 30 μL, conforme protocolo da Inspiralis Ltda. A incubação foi realizada a 37°C por 30 min no tampão de ensaio. Posteriormente as amostras foram tratadas, submetidas à análise de eletroforese em gel de agarose e analisadas em fotodocumentador, conforme descrito no item 3.5.1. Tampão de diluição: Tris.HCl 50 mmol.L-1; NaCl 200 mmol.L-1; DTT 5 mmol.L-1; EDTA 1 mmol.L-1; glicerol 50% (m/v); pH = 7,5; Tampão de ensaio (5x): Tris.HCl 20 mmol.L-1; KCl 200 mmol.L-1; MgCl2, 10 mmol.L-1; glicerol 4% (v/v); pH = 7,9; Materiais e Métodos 26 3.7. Avaliação da atividade antimicrobiana Para a avaliação da atividade antimicrobiana dos peptídeo-conjugados sintetizados, visando a determinação das concentrações inibitórias mínimas (CIMs), foi utilizado o método de microdiluição, de acordo com o protocolo Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M7-A10, 2015 e M27-A3, 2008, com modificações. Foram utilizadas as cepas padrão de E. coli O153:H17 (ATCC 43895), S. aureus resistente (ATCC 14458) e Candida albicans (ATCC 90028), todas adquiridas do Laboratório de Microrganismos de Referência do Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde – INCQS da Fundação Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, Rio de Janeiro. 3.7.1. Preparação do inoculo Uma alíquota de cada microrganismo armazenadas a -80°C, foi descongelada e subcultivada em meio específico sendo Muller Hinton (MH) para bactérias e caldo Sabouraud Dextrose (SDB) para leveduras, em estufa, a 37°C, por 24 horas. Após o período de crescimento, os microrganismos foram semeados em placas contendo meio ágar específico, sendo ágar MH e SDB para as bactérias e levedura, respectivamente, e então incubadas em estufa de crescimento a 37ºC durante 24 h para as bactérias e 48 h para a levedura. A cultura-estoque assim obtida foi armazenada em geladeira, a 4°C, por no máximo 3 meses e após esse tempo, o processo descrito era repetido. Após o período de incubação e com auxílio de uma alça de platina, transferiu-se 3 a 5 colônias isoladas de cada cepa de microrganismo crescida em placa (cultura-estoque), para tubos de ensaio contendo 5 mL de meio específico estéril, incubando-os a 37°C sob agitação a 140 rpm por 18 horas, para crescimento. Em seguida, cada inoculo foi utilizado nos ensaios de determinação de concentração inibitória mínima. 3.7.2. Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) para bactérias Inicialmente, a concentração do inoculo foi ajustada espectrofotometricamente, de acordo com o padrão de turbidez McFarland 0,5 que obtém uma absorbância de 0,10 a 625 nm. Neste padrão, esta suspensão deve conter aproximadamente 1x108 UFC.mL-1, sendo que, para a utilização nos ensaios, foi diluída em meio MH, resultando em uma suspensão bacteriana de concentração final de 1x106 UFC.mL-1. A atividade de inibição foi determinada pela técnica de diluição em microplacas. Resumidamente, 20 µL de tampão PBS foram adicionados a cada poço de uma microplaca Materiais e Métodos 27 de 96 poços estéril. Alíquotas de 20 μL de cada peptídeo-conjugado foi diluído em série nos poços (100 até 0,39 µmol·L−1) seguidas de adição de 80 μL de meio de cultivo MH. Finalmente, foram adicionados 100 µL de suspensão bacteriana em cada poço da microplaca, totalizando um volume final de 200 μL por poço. As microplacas foram incubadas em uma estufa a 37°C por 24 horas e os testes foram realizados em duplicata. Como controles positivo e negativo do crescimento microbiano, foram empregados respectivamente, suspensão bacteriana e suspensão bacteriana contendo ciprofloxacina (Sigma N1628) nas mesmas concentrações utilizadas para os peptídeo-conjugados, em um volume final de 200 μL. Após o período de incubação, as placas foram submetidas à análise espectrofotométrica, utilizando um leitor de microplacas EPOCH da Biotek Instruments, em comprimento de onda de 595 nm. A porcentagem de inibição do crescimento bacteriano para cada uma das amostras foi determinada por uma análise comparativa com os controles utilizados. Os resultados da atividade antimicrobiana foram calculados e expressos em porcentagem de inibição de acordo com a equação 2. %𝑖𝑛𝑖𝑏𝑖çã𝑜 = [1 − ( 𝐷𝑂𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 − 𝐷𝑂𝑚𝑒𝑖𝑜 𝐷𝑂𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑒− − 𝐷𝑂𝑚𝑒𝑖𝑜 )] 𝑥100 Equação 2 Onde: DOamostra: representa as absorbâncias auferidas na leitura das amostras; DOcontrole: refere-se ao controle positivo; DOmeio: corresponde às leituras obtidas provenientes do meio de cultura. 3.7.3. Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) para fungos Para Candida albicans, a concentração foi ajustada espectrofotometricamente entre 0,10 e 0,15 de densidade ótica (DO), a 530 nm, sendo esta correspondente a uma concentração aproximada de 1x106 UFC.mL-1 (RODRÍGUEZ-TUDELA et al., 2001). Para a utilização nos ensaios, a suspensão foi diluída em SDB até a obtenção de uma suspensão de concentração final de 1x103 UFC.mL-1. A atividade inibitória dos peptídeo-conjugados foi determinada pela técnica de diluição em microplacas. Neste caso, 20 µL de meio de tampão PBS foram adicionados a cada poço de uma microplaca de 96 poços estéril. Alíquotas de 20 μL de cada peptídeo-conjugado foi diluído em série nos poços (200 até 0,39 µmol·L−1) seguidas da adição de 80 μL de meio Materiais e Métodos 28 de cultivo SDB. Foram adicionados então, 100 µL da suspensão padronizada de C. albicans, em cada poço, totalizando um volume final de 200 μL por poço. As microplacas foram incubadas em uma estufa a 37°C por 48 horas e os testes foram realizados em duplicata. Como controles positivo e negativo do crescimento microbiano foram empregados, respectivamente, suspenção de leveduras e suspensão de leveduras contendo fluconazol, nas mesmas concentrações utilizadas para os peptídeo-conjugados, em um volume final de 200 μL. Após o período de incubação, as placas foram submetidas à análise espectrofotométrica, utilizando um leitor de microplacas EPOCH da Biotek Instruments, em comprimento de onda de 595 nm. A porcentagem de inibição do crescimento do fungo para cada uma das amostras peptídicas foi determinada por uma análise comparativa com os controles utilizados. Os resultados da atividade antifúngica foram calculados e expressos em porcentagem de inibição, aplicando-se a equação 2, da mesma forma que na determinação da atividade antibacteriana. 3.8. Ensaios de toxicidade A análise de viabilidade celular foi realizada empregando o método colorimétrico de MTT (brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil-tetrazólio, Sigma), que se baseia na análise quantitativa dos cristais de formazana formados pela reação de redução do MTT por desidrogenases mitocôndrias. Desta forma, a redução do MTT a formazan é diretamente proporcional à atividade mitocondrial e à viabilidade celular (LOBNER, 2000; MOSMANN, 1983). Foram utilizadas células da linhagem MRC-5 (ATCC CCL-171), correspondente a fibroblastos de tecido pulmonar derivado de um embrião caucasiano humano, em meio Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM, Lonza), suplementado pela adição de 10% de soro fetal bovino inativado (Gibco), gentamicina a 4 mg.100 mL-1 de meio de cultura, estreptomicina a 1 μL.mL-1 de meio de cultura (denominado DMEM-C). Inicialmente as células foram lavadas com solução salina tamponada de fosfato (PBS), removidas da garrafa com auxílio de tripsina e ajustadas para uma concentração de 5x104 células.mL-1, com auxílio de uma Câmara de Neubauer. Posteriormente, 100 µL da cultura foram adicionados à uma placa de 96 poços e incubados a 37ºC por 24 horas com 5% de CO2. Como controle positivo de crescimento, foram utilizadas células em meio DMEM-C e como controle negativo de crescimento, apenas meio DMEM-C, sem células. Após o período, com as células já aderidas à placa, o Materiais e Métodos 29 meio de cultura foi removido e foram adicionados 100 μL de solução PBS estéril para lavagem. Logo após o descarte do sobrenadante, inoculou-se 100 µL de solução de peptídeo diluído em DMEM-C nas concentrações: 200, 100, 50 e 25 μmol.L-1 e mantidos em contato com as células durante 72 horas sob as mesmas condições de incubação. Após o período, a solução foi descartada e foram adicionados 100 μL de solução PBS estéril para lavagem. Em seguida, após descartar o sobrenadante, foram adicionados aos poços 180 μL de solução composta por DMEM e PBS estéril, na proporção de 1:4, e então 20 μL de solução de MTT a 1,0 mg.mL-1. Após, as placas foram incubadas por 4 horas a 37°C e 5% CO2. Após esse período, os sobrenadantes foram descartados e foram adicionados 100 μL de álcool isopropílico e DMSO na proporção de 1:1 para dissolver dos cristais de formazan formados. A absorbância foi determinada em espectrofotômetro de microplaca EPOCH da Biotek Instruments com filtro de 540 nm. Os testes foram realizados em triplicata, para os diferentes períodos e foram calculados e expressos em porcentagem de inibição de acordo com a equação 3. % 𝑉𝑖𝑎𝑏𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 = (𝐴𝑏𝑠𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎−𝐴𝑏𝑠(−)) 𝐴𝑏𝑠(+)− 𝐴𝑏𝑠(−) 𝑥100 Equação 3 Onde: Absamostra: representa a média da absorbância de cada amostra analisada; Abs(-), representa a média da absorbância do controle negativo de meio (DMEM); Abs(+) controle positivo de crescimento, média da absorbância do controle positivo, considerando-se como a maior viabilidade celular (100%) aquelas culturas celulares realizadas somente em presença de meio DMEM. Resultados e Discussão 30 4. Resultados e Discussão 4.1. Design e síntese de peptídeo e peptídeo-conjugados A sequência peptídica básica obtida e utilizada neste trabalho foi projetada tendo como base a estrutura primária da toxina bacteriana ParE (Figura 3), considerada um inibidor do processo de replicação, cujo alvo é a enzima DNA girase (JIANG et al., 2002). Algumas evidências têm indicado que a região C-terminal desta toxina (contendo uma α-hélice e três folhas β) é uma região crítica para sua estabilidade e toxicidade e, portanto, com maior probabilidade de estar envolvida na interação com a DNA girase (FIEBIG et al., 2010; DALTON e CROSSON, 2010; BARBOSA et al., 2010). A estrutura de ParE de E. coli predita por modelagem molecular (Figura 13) foi utilizada como base para o design de uma série de peptídeos derivados, os quais foram estudados quanto a capacidade de inibir a atividade de topoisomerases bacterianas, dentre eles ParELC3. Figura 13. Diagrama de fita de ParE de E. coli. A α-hélice C-terminal e as três folhas beta, β2, β3 e β4, estão coloridas em vermelho, laranja, azul e magenta, respectivamente. Fonte: BARBOSA et al., 2012. Resultados promissores foram obtidos com este peptídeo, sendo obtidos valores de IC100 (concentração necessária para inibição completa da atividade da topoisomerase) de 20 e 10 µmol.L-1 para DNA girase e topoisomerase IV, respectivamente (BARBOSA et al., 2012). No entanto, ParELC3 foi inativo contra bactérias devido à sua incapacidade de atravessar as membranas bacterianas. Para Resultados e Discussão 31 contornar essa limitação, decidiu-se por conjugar a este peptídeo, estruturas moleculares complexas, tais como antibióticos ou seus análogos, na tentativa de um lado, facilitar a permeação e inserção intracelular do peptídeo e, de outro, melhorar sua especificidade, promovendo um efeito sinérgico com as moléculas conjugadas e aumentar a capacidade inibitória sobre as diferentes topoisomerases. Nesse contexto, o peptídeo ParELC3M (Figura 14) foi projetado semelhantemente ao peptídeo ParELC3, que mantém uma das folhas beta (β4) e a alfa hélice C-terminal, substituindo o resíduo de arginina na posição 100 (R100) por Lisina (Figura 14). Esta substituição teve como objetivo a criação de um sítio intramolecular (N da Lisina) para a possível conjugação de outras estruturas moleculares não peptídicas, caso necessário. Figura 14. (a) Estrutura primária de ParELC3M e b) diagrama de fita do peptídeo ParELC3M, a α-hélice no C-terminal e a folha β4, utilizada no desenho do peptídeo (a) (b) Acetil-80PALVVAIFHERMDLMARLSEK100- NH2 Fonte: Elaborado pelo autor Assim, o peptídeo ParELC3M foi sintetizado, utilizando uma resina do tipo Rink- amida MBHA com grau de substituição inicial de 0,55 mmol.g-1, de acordo com a metodologia descrita no item 3.1. A síntese ocorreu sem maiores problemas, sendo necessários poucos reacoplamentos. Após o acoplamento dos aminoácidos, a massa de peptidil-resina obtida foi de 1.724 mg, das quais 1.200 mg foram armazenadas e o restante acetilado para obtenção de ParELC3M. O uso de Rink Amida MBHA resina e o procedimento de acetilação, foram necessários para mimetizar as ligações peptídicas nestas regiões, visto que nestes peptídeos, os resíduos das extremidades C- e N- terminais correspondem a um resíduo interno da sequência da toxina. As etapas de clivagem e extração também não apresentaram problemas e ocorreram com sucesso, resultando ao final 140 mg do peptídeo ParELC3M (Figura 14). Resultados e Discussão 32 Com o intuito de desenvolver novos inibidores peptídicos de DNA topoisomerases, decidiu-se por adotar uma abordagem que envolve a hibridação de ParELC3M com estruturas moleculares com ação antibiótica ou seus precursores, formando os denominados peptídeo-conjugados. Para a síntese de cada um dos peptídeo- conjugados, foram utilizados 100 mg de peptidil-resina previamente armazenada, e a quantidade correspondente de CFX, CICPOQ e HOCAc, empregando-se a metodologia descrita no item 3.2.2. As reações de condensação exigiram algumas alterações no sistema solventes habitualmente utilizados, devido a diferença de solubilidade dos componentes, mudanças nos agentes de condensação, além da necessidade de repetições nas reações de condensação, especialmente para o CICPOQ. No caso do conjugado CFX-ParELC3M, foi necessário promover a proteção do anel piperazínico, com o grupo Boc, antes da condensação com o peptídeo, a fim de se evitar reações cruzadas entre moléculas de CFX. As etapas de clivagem e extração não apresentaram problemas e ocorreram com sucesso após algumas adaptações, resultando ao final 84, 35 e 30 mg dos peptídeo-conjugados CFX-ParELC3M, CICPOQ-ParELC3M e HOCAc- ParELC3M, respectivamente, todos na forma denominada bruta ou impura. Para o peptídeo-conjugado CFXPip-ParELC3M, primeiramente