JULIANA ARRUDA RAMOS DESENVOLVIMENTO E ACEITAÇÃO DE PASTA DE ABACATE COM POTENCIAL PROBIÓTICO Botucatu 2018 JULIANA ARRUDA RAMOS DESENVOLVIMENTO E ACEITAÇÃO DE PASTA DE ABACATE COM POTENCIAL PROBIÓTICO Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agronômicas da Unesp Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de Doutor em Agronomia (Energia na Agricultura) Orientador: Rogério Lopes Vieites Coorientador: Ary Fernandes Junior Coorientadora: Alice Yoshiko Tanaka Botucatu 2018 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMEN- TO DA INFORMAÇÃO – DIRETORIA TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - UNESP – FCA – LAGEADO – BOTUCATU (SP) Ramos, Juliana Arruda, 1988- R175d Desenvolvimento e aceitação de pasta de abacate com potencial probiótico / Juliana Arruda Ramos. – Botucatu: [s.n.], 2018 119 p.: fots. color., ils. color., grafs. color.,tabs. Tese (Doutorado)- Universidade Estadual Paulista Fa- culdade de Ciências Agronômicas, Botucatu, 2018 Orientador: Rogério Lopes Vieites Coorientador: Ary Fernandes Junior; Alice Yoshiko Tanaka Inclui bibliografia 1. Abacate. 2. Compostos bioativos. 3. Probióticos. 4. Alimentos – Avaliação sensorial. I. Vieites, Rogério Lo- pes. II. Fernandes Junior, Ary. III. Tanaka, Alice Yoshi- ko. IV. Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (Câmpus de Botucatu). Faculdade de Ciências Agro- nômicas. V. Título. Elaborada por Ana Lucia G. Kempinas – CRB-8:7310 “Permitida a cópia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte” Aos meus amados pais, Eliana e Marcial (in memoriam), por todo o amor e dedicação Dedico. AGRADECIMENTOS Agradeço, A Faculdade de Ciências Agronômicas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus Botucatu, pela estrutura oferecida, em especial ao Departamento de Horticultura e seus funcionários pelo acolhimento e a secretaria da Seção de Pós-graduação pelo suporte acadêmico Ao Programa de Pós-graduação em Agronomia (Energia na Agricultura) pela oportunidade de cursar o doutorado, ao coordenador Prof. Dr. Adriano Wagner Ballarin e a secretária Débora Branco por toda simpatia no atendimento e auxílio durante o curso. A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoa de Nível Superior (CAPES), pela bolsa concedida. A empresa Jaguacy pelo fornecimento e entrega dos abacates. A empresa SACCO do Brasil pelo fornecimento dos Lactobacillus liofilizados, em especial, o Hans Knudsen pelas informações transmitidas. Ao Centro de Tecnologia das Radiações (CTR) do Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares (IPEN/USP) pelo uso do Irradiador Multipropósito de Cobalto-60. Ao meu orientador, Rogério Lopes Vieites, pela confiança, dedicação e orientação desde o Mestrado e pela amizade e compreensão em todo o tempo. Ao meu coorientador, Ary Fernandes Junior, pela paciência, aprendizado, dedicação e por me ajudar a entender um pouco sobre a microbiologia. A minha coorientadora, Alice Yoshiko Tanaka, que impulsionou as ideias para esse trabalho acontecer. A minha mãe, Eliana, por me dar oportunidade de continuar estudando, sempre me apoiar em tudo e dar o prazer de sua convivência sempre. Ao meu pai, Marcial, que mesmo não estando de corpo presente durante o curso de Doutorado, contribuiu durante toda minha vida pra chegar até aqui. A minha irmã, Mila e meu cunhado, Rafa, por me auxiliarem e aconselharem em muitos momentos difíceis, e por trazer o Caetano pra alegrar nossas vidas. A minha irmãzinha postiça, Isabella, por todo amor e companheirismo. Ao Gean, pelo companheirismo, por me apoiar durante todo esse período de Doutorado e aguentar meus estresses. A Flávia e o Maurício, por serem minha família botucuda, por me ajudarem em todas análises sensoriais, por me levar para irradiar minha pasta e todas as inúmeras ajudas e desabafos. A toda equipe do Laboratório de Pós Colheita, Prof. Regina, Negão, Giovanna, Priscilla, Cibelli, Eduardo, Renata, Mariana, em especial, a Karina e a Márcia pela amizade e por toda ajuda no experimento e nas análises. As meus amigos de sempre, Isabela, Nádia e Bibi, pelos momentos de ajuda e descontração. As orientadas do professor Ary, Mariana, Bruna, Ana Flávia, Fernanda e Polly pela colaboração nas análises microbiológicas e pela amizade. As minha amigas da ToaToa, pelo incentivo e compreensão de sempre, e, principalmente pelos momentos muito alegres. Muito obrigada! RESUMO O crescente interesse pelos alimentos funcionais tem impulsionado a pesquisa na elaboração de novos produtos. Os probióticos são microrganismos vivos capazes de trazer inúmeros benefícios aos consumidores, como ação imunomoduladora e anti- inflamatória sendo frequentemente utilizados em produtos à base de leite. O abacate é uma fruta rica em fitoquímicos e pode ser utilizada para elaboração de um produto com potencial probiótico. O objetivo desse trabalho foi desenvolver e avaliar sensorialmente pasta de abacate com potencial probiótico durante o período de armazenamento, verificando a viabilidade dos Lactobacillus rhamnosus e os compostos bioativos. Foi desenvolvida pasta de abacate com açúcar, cacau, lecitina de soja e ácido cítrico. A pasta foi dividida em potes plásticos opacos identificados por dias de análises e irradiada a 5kGy. Em metade da quantidade de pasta foi inoculado o Lactobacillus rhamnosus liofilizado. Logo após, foi armazenada em geladeira a 2 °C por 40 dias. A cada cinco dias foram avaliadas quanto a viabilidade do L. rhamnosus, contaminação por bolores e leveduras, microrganismos psicotróficos e mesófilos, análise sensorial, coloração, análises físico químicas, atividade antioxidante, compostos fenólicos e flavonoides. A presença dos probióticos não interferiu no pH, nos teores de umidade, cinzas, fibras, proteínas, compostos fenólicos, atividade antioxidante e nas notas dadas pelos provadores. Sendo que o período de armazenamento afetou todos os fatores analisados, com exceção da umidade e da concentração de proteína. A viabilidade do L. rhamnosus permaneceu constante, com média de 9,03x107 UFC g-1 durante os quarenta dias de avaliação, sem contaminação por bolores e leveduras e microrganismos psicotróficos e mesófilos. A pasta de abacate foi um substrato eficiente para viabilidade dos L. rhamnosus. Palavras-chave: Persea americana Mill. Cacau. L.rhamnosus. Irradiação. Compostos bioativos. ABSTRACT The growing interest in functional foods has driven research into new product innovation. Probiotics are living microorganisms capable of bringing countless benefits to consumers, such as immunomodulatory and anti-inflammatory action, they are more commonly used in milk-based products. Avocado is a fruit rich in phytochemicals and can be used to produce a product with probiotic potential. The objective of this work was to develop and evaluate sensorially avocado paste with probiotic potential during the storage period, besides analyzing the viability of the Lactobacillus rhamnosus and the bioactive compounds of the paste. Avocado paste with sugar, cocoa, soy lecithin and citric acid was developed. The paste was divided into opaque plastic pots identified by days of analysis and irradiated at 5kGy. In half the amount of paste, the lyophilized Lactobacillus rhamnosus was inoculated. Soon after, it was stored in a refrigerator at 2 °C for 40 days. Every five days the viability of L. rhamnosus, yeast and mold contamination, psychotrophic and mesophilic microorganisms, sensory analysis, coloration, physical chemical analyzes, antioxidant activity, phenolic compounds and flavonoids were evaluated. The presence of probiotics did not interfere in pH, moisture content, ash, fiber, protein, phenolic compounds, antioxidant activity and in the notes given by the tasters. The storage period affected all factors analyzed, except for moisture and protein concentration. The viability of L. rhamnosus remained constant, with a mean of 9.03x107 CFU g-1 during the forty days of evaluation, without contamination by molds and yeasts, and psychotrophic and mesophilic microorganisms. Avocado paste was an efficient substrate for L.rhamnosus viability. Keywords: Persea americana Mill. Cocoa. L.rhamnosus. Irradiation. Bioactive compounds. SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ................................................................................................. 15 2 REVISÃO DE LITERATURA ........................................................................... 17 2.1 Características nutricionais e funcionais do abacate ................................. 17 2.2 Ingredientes utilizados na elaboração da pasta de abacate ....................... 18 2.3 Probióticos ...................................................................................................... 20 2.4 Lactobacillus rhamnosus .............................................................................. 22 2.5 Radiação gama nos alimentos ...................................................................... 23 2.6 Conservação de alimentos pelo frio ............................................................. 24 2.7 Boas Práticas de Fabricação ......................................................................... 25 3 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................. 27 3.1 Matéria-prima e ingredientes ......................................................................... 27 3.2 Elaboração da pasta de abacate ................................................................... 28 3.3 Variáveis analisadas e preparo das amostras ............................................. 33 3.4 Análises físico-químicas e composição centesimal ................................... 34 3.5 Compostos bioativos ..................................................................................... 35 3.6 Análises sensoriais ........................................................................................ 37 3.7 Análises microbiológicas .............................................................................. 39 3.8 Cálculo da informação nutricional ................................................................ 40 3.9 Análise estatística .......................................................................................... 40 4 RESULTADOS E DISCUSSÕES ..................................................................... 42 4.1 Caracterização físico-química, compostos bioativos e coloração da polpa de abacate ............................................................................................ 42 4.2 Análises sensoriais preliminares .................................................................. 43 4.2.1 Análise sensorial da pasta de abacate com os diferentes tipos de produtos que conferem sabor doce ............................................................. 43 4.2.2 Análise sensorial da pasta de abacate com os diferentes concentrações de açúcar demerara ...................................................................................... 47 4.2.3 Análise sensorial da pasta de abacate com os diferentes concentrações de cacau ......................................................................................................... 49 4.3 Formulação e Informação Nutricional da pasta de abacate ...................... 54 4.4 Composição centesimal e análises físico químicas das pastas de abacate.......................................................................................................... 55 4.5 Compostos bioativos nas pastas de abacate............................................. 64 4.6 Análises microbiológicas das pastas de abacate ...................................... 68 4.7 Coloração ...................................................................................................... 71 4.8 Análises sensoriais das pastas de abacate durante o período de armazenamento ............................................................................................. 74 5 CONSIDERAÇÕES FINAIS ........................................................................... 94 6 CONCLUSÕES............................................................................................... 95 REFERÊNCIAS .............................................................................................. 96 APÊNDICE A – FICHA APLICADA NA ANÁLISE SENSORIAL REALIZADA PARA ENCONTRAR A MELHOR CONCENTRAÇÃO DE CACAU ............ 109 APÊNDICE B – FICHA APLICADA NA ANÁLISE SENSORIAL REALIZADA DURANTE A VIDA DE PRATELEIRA PARA AS PASTAS COM E SEM L.RHAMNOSUS ............................................................................................ 113 ANEXO A – ESPECIFICAÇÕES TÉCNICAS DA CULTURA LÁTICA LIOFILIZADA LYOFAST LRB....................................................................... 118 ANEXO B – COMPROVANTE DE APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA PARA REALIZAÇÃO DAS ANÁLISES SENSORIAIS .................................. 119 15 1 INTRODUÇÃO A crescente demanda social em conhecer as informações e composições dos alimentos tem impulsionado a inovação na elaboração de produtos funcionais, que além dos nutrientes como as vitaminas e minerais, possuem substancias bioativas que melhoram o bem-estar das pessoas, modulando o sistema imunológico e prevenindo o surgimento precoce de doenças degenerativas, podendo, com isso, aumentar a longevidade (THAMER; PENNA, 2006; MACEDO et al., 2008). Dentro desses alimentos funcionais, estão ressaltados o abacate, fonte de fitoquímicos (DING et al., 2007; WANG; BOSTIC; GU, 2010) e os probióticos, microrganismos vivos que auxiliam no perfeito funcionamento do intestino, além de possuir ações benéficas anti- inflamatórias e combatendo infecções (VRESE; SCHREZENMEIR, 2008). Normalmente as culturas probióticas são encontradas em produtos alimentícios à base de leite, mas com o aumento de consumidores de produtos probióticos não lácteos, como os veganos, intolerantes ou alérgicos à lactose, eles foram incorporados em bebidas e comercializados como suplementos na forma de cápsulas, comprimidos e preparações liofilizadas. Portanto, as frutas podem ser uma ótima opção, já que além de fornecerem vitaminas, minerais e fitoquímicos, não possuem alérgenos lácteos (YOON et al., 2006). O abacate é uma fruta rica nutricionalmente por fornecer ácidos graxos insaturados, fibras, vitaminas e compostos fitoquímicos como fenóis, glicosídeos terpenóides, derivados de anéis contendo furano, flavonoides e cumarina que apresentam efeitos benéficos, como, na prevenção de câncer (WANG; BOSTIC; GU, 2010). A ingestão de Lactobacillus rhamnosus mostra forte evidência de efeito benéfico na prevenção e tratamento de diarreia aguda, dermatite atópica e melhora do sistema imune (PESSI et al., 2000; FAO/WHO, 2002). Essa cepa se mostra resistente a um pH baixo quando utilizada em sucos de frutas (HEEHAN; ROSS; FITZGERALD, 2007; CHAMPAGNE; RAYMOND; GAGNON, 2008). O cacau, rico em polifenóis, pode auxiliar na prevenção de doenças cardiovasculares e modular o metabolismo lipídico (CRUZ, 2002; MATSUI et al., 2005; LECUMBERRI et al., 2007). Alimentos processados sem o uso do calor tendem a apresentar maior contaminação microbiológica. A irradiação é uma tecnologia limpa, sem deixar nenhum resíduo no produto, reduzindo ou até mesmo eliminando a contaminação 16 microbiológica, prolongando o tempo de armazenamento dos alimentos, e, além disso é rápida e segura (VIEITES, 2009; HUSSAIN et al., 2012). Nesse contexto, o desenvolvimento da pasta de abacate com potencial probiótico, contendo abacate e cacau, extremamente ricos em nutrientes e compostos bioativos e inoculado com cultura probiótica é uma alternativa bastante inovadora que tende a abranger um grande público consumidor. Diante disso, o objetivo desse trabalho foi desenvolver e avaliar sensorialmente a pasta de abacate com potencial probiótico durante o período de armazenamento, verificando a viabilidade dos Lactobacilos rhamnosus e os compostos bioativos da pasta. 17 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Características nutricionais e funcionais do abacate O abacate (Persea americana Mill.) se destaca entre as frutas, além se suas qualidades sensoriais, pelo alto teor de ácido oleico e β-sitosterol, gordura insaturada utilizada como coadjuvante no tratamento de hiperlipidemias, podendo reduzir os níveis de colesterol total, de triglicerídeos e de LDL-colesterol, sem alterar a concentração de HDL-colesterol do plasma (SALGADO et al., 2008). A principal forma de consumo, no Brasil, é em sobremesas com adição de açúcar, leite e limão; já em outros países é comum seu consumo em saladas, lanches, sopas, molhos e pastas (DAIUTO; VIEITES, 2008). O abacate possui evidente qualidade nutricional por conter elevada quantidade de vitaminas, como as vitaminas B e E, minerais e fibras, além do grande teor de ácidos graxos insaturados, que auxiliam na prevenção de doenças cardiovasculares. Contém níveis elevados de compostos fitoquímicos bioativos como os carotenoides, esteróis, compostos fenólicos, flavonoides entre outros. Por isso, esse fruto deve ser parte de uma dieta saudável (DING et al., 2007; DAIUTO et al., 2009). Estudos realizados sobre a composição e ação do consumo de abacates tem mostrado que eles contêm componentes lipofílicos anti-carcinogênicos como os carotenoides, que inibem o crescimento de células cancerígenas da próstata, induzem a apoptose de células cancerígenas na mama e suprime lesão hepática. Possui uma elevada capacidade antioxidante, com grande teor de fenólicos totais, principalmente de procianidina, que apresenta a maior concentração entre todos os fenólicos (WANG; BOSTIC; GU, 2010). Os benefícios na saúde que o abacate pode promover são devido a presença de vinte nutrientes essenciais e fitoquímicos que atuam potencialmente na prevenção de câncer. Esses componentes do metabolismo secundário do abacate podem ser divididos em fenóis, glicosídeos terpenóides, derivados de anéis contendo furano, flavonoides e cumarina. Estudos tem mostrado que esses fitoquímicos presentes no abacate tem funções de inibir o crescimento e induzir a apoptose em linhas celulares cancerosas e pré-cancerosas (DING et al., 2007). Partes não comumente consumidas do abacate também tem sido estudadas. A casca e a semente do fruto apresentam quantidades apreciáveis de minerais, elevada capacidade antioxidante com alto teor de compostos fenólicos e clorofila (DAIUTO et al., 2014; WANG; BOSTIC; GU, 2010). 18 2.2 Ingredientes utilizados na elaboração da pasta de abacate Os consumidores estão à procura de alimentos seguros, naturais, saudáveis e convenientes. A demanda é por alimentos com benefícios para saúde, qualidade nutricional e sensorial, além dos alimentos serem vistos como uma fonte de prazer e bem-estar (ZÚÑIGA; TRANCOSO, 2013). Ultimamente há uma maior procura por chocolates que contêm mais cacau em suas formulações e consequentemente, mais flavonoides, já que estes estão naturalmente presentes no cacau. Isso ocorre não somente pelo fato de ser mais saudável, mas também seu sabor tem sido cada vez mais apreciado pelos consumidores. Houve também um aumento da procura de chocolates com redução de açúcares e gorduras; misturas com frutas e com antioxidantes adicionados intencionalmente nesses produtos. Todo esse movimento dos consumidores segue a tendência em alimentos funcionais, ou seja, com outros benefícios à saúde além de nutrientes essenciais (NOGUEIRA, 2015). A obtenção do cacau em pó se dá através da moagem da torta resultante da prensagem do líquor ou massa de cacau, podendo conter ainda de 10 a 20 % de manteiga de cacau. Os principais parâmetros de qualidade avaliados no pó de cacau são a cor, o sabor e o pH. A porcentagem de lipídeos presentes no cacau em pó é de 24,5 %, enquanto que as proteínas e carboidratos representam 19,8 % e 37,9 % respectivamente. A quantidade de gordura pode variar de 9 a 23 % (MEURSING et al., 1994). Os principais constituintes polifenólicos do cacau são as leucocianidinas (50%), catequinas (37 %), e antocianinas (4 %) (CRUZ, 2002). A ingestão de cacau pode impedir a obesidade induzida por dieta de alto teor de gordura através da modulação do metabolismo de lipídios, especialmente, diminuindo a síntese de ácidos graxos e sistemas de transporte, melhora do mecanismo de termogênese no fígado e no tecido adiposo branco (MATSUI et al., 2005). O cacau pode prevenir o risco de doenças cardiovasculares, inibindo a ativação plaquetária, melhorando o perfil lipídico e reduzindo a peroxidação lipídica (REIN et al., 2000; LECUMBERRI et al., 2007). O açúcar demerara, também conhecido como raw sugar, se apresenta na forma granulada com cor amarronzada e textura firme. Isso porque na sua produção durante o processo de clarificação é usado apenas o leite de cal, enquanto que no açúcar cristal branco é também utilizado o anidrido sulfuroso. Por isso resta uma película de 19 mel da própria cana-de-açúcar envolta nos cristais (RAMOS, 2007; MACHADO, 2012). Açúcar demerara pode ser considerado mais rico nutricionalmente já que apresenta maiores teores de cinzas, compostos fenólicos, aminoácidos e cálcio do que açúcares cristal e refinado (FARIA, 2012). Também apresenta maior atividade antioxidante em comparação com os açúcares brancos (PHILLIPS, CARLSEN, BLOMHOFF, 2009). A lecitina é uma fonte rica e de baixo custo de fosfolipídios, tais como a fosfatidilcolina, a fosfatidiletanolamina e o fosfatidilinositol, que, por sua estrutura química pode ser solubilizada em soluções apolares e polares, o que provoca grande versatilidade para o uso deste ingrediente. Sua aplicação vem sendo utilizada como emulsificante em produtos alimentícios, entretanto os potenciais de utilização da lecitina em produções gastronômicas ainda são pouco estudados e desenvolvidos (MERTINS et al., 2008; PELAEZ; MORTIMER, 2011). A preservação da polpa de abacate é afetada principalmente pelo escurecimento enzimático catalisado pela polifenoloxidase (PPO) e pelas reações degradativas da peroxidase (POD). Portanto quando a fruta é amassada, cortada ou triturada essas reações ocorrem rapidamente provocando não só o escurecimento enzimático, mas também mudanças na qualidade nutritiva, funcional e alteração do sabor (LUÍZ; HIRATA; CLEMENTE, 2007). O ácido cítrico é um dos acidulantes mais utilizado pela indústria em alimentos, podendo atuar como redutor do pH ou como quelante do cobre da enzima polifenoloxidase. Os agentes acidulantes têm a função de manter o pH do meio abaixo do ótimo para a ação catalítica das enzimas em alimentos. O pH ótimo da polifenoloxidase e da peroxidase varia conforme a fonte e o substrato disponível (SILVA; ROSA; VILAS BOAS; 2009). O ácido cítrico também pode servir como antioxidante para inibir ou retardar a oxidação lipídica que causa alterações nutricionais como degradação de vitaminas lipossolúveis e ácidos graxos essenciais, levando a alterações de sabores e odores (RAMALHO; JORGE, 2006). A RDC n°45 de 2010 que dispõe sobre aditivos alimentares autorizados para uso segundo as Boas Práticas de Fabricação (BPF), legaliza todas essas funções descritas e define o ácido cítrico como acidulante, regulador de acidez e antioxidante, o qual tem Ingestão Diária Aceitável (IDA) não especificada ou não limitada estabelecida pelo Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives – JECFA 20 (Comitê FAO/OMS de Especialistas em Aditivos Alimentares). O uso desse aditivo nos alimentos está autorizado com limite quantum satis (q.s.), ou seja, quantidade suficiente para obter o efeito tecnológico desejado, desde que não alterem a identidade e a genuinidade do alimento (BRASIL, 2010). 2.3 Probióticos A palavra probiótico, de origem grega, quer dizer “para a vida”, e foi utilizada pela primeira vez por veterinários em 1965 para nominar substâncias produzidas por microrganismos capazes de estimular o crescimento de outros microrganismos (FERNANDES et al., 2008; COELHO; OLIVEIRA, 2009). Atualmente é definido como microrganismos vivos que atingem o intestino em estado ativo, em concentrações suficientes, são capazes de oferecer efeitos benéficos à saúde (MADUREIRA et al., 2005). Os efeitos dos probióticos muito bem estabelecidos são a prevenção e/ou redução da duração e queixas de diarreia induzida por rotavírus ou associada a antibióticos, bem como, alívio das queixas devido a intolerância a lactose (HUANG et al., 2002); redução da concentração de enzimas promotoras de câncer e/ou putrefativa (bacteriana) nos intestinos (REUTER, 1997); prevenção e alívio de reclamações inespecíficas e irregulares dos tratos gastrointestinais em pessoas saudáveis (DE VRESE et al., 2001); efeitos benéficos sobre inflamação e outras queixas em conexão com doenças inflamatórias do trato gastrointestinal (GIONCHETTI et al., 2000), infecção por Helicobacter pylori ou supercrescimento bacteriano (GOTTELAND et al., 2005); normalização de diarreias e consistência de fezes em pacientes com constipação e síndrome do colón irritável; prevenção e alívio de alergias e doenças atópicas em crianças (KANJANDER; KORPELA, 2006); prevenção de infecções do trato respiratório (resfriado comum, gripe) e infecções urogenitais (RIO et al., 2002). Existem evidências em relação à prevenção do câncer, efeito hipocolesterolêmico, melhora da flora bucal e prevenção de cárie, prevenção ou terapia de doenças cardíacas isquêmicas ou melhora de doenças autoimunes (por exemplo, artrite) (VRESE; SCHREZENMEIR, 2008). Os mecanismos pelos quais os probióticos exercem seus efeitos são em grande parte desconhecidos, mas podem envolver a modificação do pH do intestino, antagonizando os agentes patogênicos através da produção de compostos 21 antimicrobianos, competindo para a ligação de patógenos com seus sítios ativos, bem como disponibilidade de nutrientes e fatores de crescimento, estimulando células imunomoduladoras e produzindo lactase (PARVEZ et. al., 2006). Além das propriedades que promovem a saúde, os microrganismos probióticos nos alimentos devem cumprir muitas outras condições. Estes incluem uma estabilidade suficiente durante a produção e armazenamento, de modo que o conteúdo probiótico do alimento durante toda a vida útil não caia abaixo da concentração bacteriana necessária para um efeito probiótico (HELLER, 2001). De acordo com a legislação brasileira, a quantidade mínima viável para os probióticos deve estar situada entre 108 a 109 UFC na porção diária do produto. Menores valores que estes podem ser aceitos, desde que a empresa comprove sua eficiência. Também deve ser apresentado laudo de análise do produto que comprove a quantidade mínima viável do microrganismo até o prazo final de validade e teste de resistência da cultura utilizada no produto quanto à acidez gástrica e aos sais biliares (BRASIL, 2002). Em geral, a indústria de alimentos recomenda uma dose mínima de 106 UFC por grama do produto no momento do consumo (BOYLSTON et al., 2004). Os produtos probióticos devem ser consumidos regularmente para manter o efeito dos microrganismos na composição da microbiota intestinal (FARIA et al., 2006; SAULNIER et. al., 2009). O crescimento do segmento de alimentos probióticos tem sido notado na última década (SOUKOULIS et al., 2014). A cultura probiótica é encontrada comercialmente, em sua grande maioria, em produtos à base de leite como leites fermentados e iogurtes, mas também já são encontrados em produtos à base de cereais, fórmulas para alimentação infantil, sucos de frutas, sorvetes e produtos cárneos como salames e linguiças. Sendo que as principais culturas encontradas são os Lactobacillus e as Bifidobacterium (ERKKILÄ et al., 2001; VLIEG; HUGENHOLTZ, 2007; MACEDO et al., 2008; CRUZ et al., 2009). Alguns fatores devem ser analisados para utilização na indústria de alimentos das culturas probióticas, como, analise sensorial do produto, viabilidade e estabilidade do microrganismo durante o período de armazenamento. Com a avaliação do desempenho da cultura, o produto pode ser lançado com características organolépticas agradáveis e sem comprometer a viabilidade e funcionalidade dos probióticos (OLIVEIRA et al., 2002; CRUZ et al., 2009). 22 2.4 Lactobacillus rhamnosus O gênero Lactobacillus apresentam-se na forma bacilar ou cocobacilar, gram- positivos, sem flagelos, não formadores de esporos e aerotolerantes ou anaeróbios; produzem ácido lático através da fermentação dos carboidratos. Sendo que existem mais de 50 espécies desse gênero já reconhecidas e as mais utilizadas na indústria de alimentos são os L. acidophilus, L. rhamnosus e L. casei (FERNANDES et al., 2008). Os Lactobacillus rhamnosus são microrganismos com potencial promissor para suplementação em suco de abacaxi e suco de frutas a base de maçã durante mais de quatro semanas, mostrando sua boa resistência em pH baixo e possibilidade de uso em frutas. (SHEEHAN; ROSS; FITZGERALD, 2007; CHAMPAGNE; RAYMOND; GAGNON, 2008). Em um trabalho onde Lactobacillus rhamnosus foi adicionado em sobremesa de soja vegetariana congelada, eles sobreviveram durante o teste de armazenamento por 6 meses e níveis de população de 107 UFC g-1 ou superior (HEENAN et al., 2004). Os Lactobacillus podem conter bacteriocinas, que são peptídeos antimicrobianos sintetizados nos ribossomos. Há uma variedade de bacteriocinas que se diferem quanto a composição de aminoácidos, biossíntese, transporte e modo de ação. O objetivo do uso de bacteriocinas na indústria alimentícia é a substituição para o uso de conservantes químicos (OGAKI; FURLANETO; MAIA, 2015). As bacteriocinas produzidas pelas bactérias gram-positivas, como as ácido- láticas, tem um status GRAS (Generally Recognized as Safe), portanto possui potencialidade para ser usada como aditivo seguro na conservação de alimentos (OGAKI; FURLANETO; MAIA, 2015). São grandes os benefícios para a saúde do consumo dos L. rhamnosus. A administração perinatal de Lactobacillus rhamnosus GG (ATTCC 53103) diminuiu a ocorrência de eczema em crianças pela metade (ISOLAURI et al., 2000). Foi encontrada maior imunidade celular em adultos saudáveis em teste controlado com o uso dessa cultura probiótica (TOMIOKA et al., 1992). Também a suplementação de L. rhamnosus mostrou efeito anti-inflamatório em crianças com dermatite atópica, regulando as citocinas anti-inflamatórias, como a interleucina-10 (PESSI et al., 2000). A evidência mais forte de um efeito benéfico de cepas definidas de probióticos foi estabelecida usando Lactobacillus rhamnosus GG 23 e Bifidobacterium lactis BB-12 para prevenção e tratamento de diarreia aguda causada principalmente por rotavírus em crianças. Também foram notadas evidências de efeitos terapêuticos contra infecção por Clostridium difficile usando os L. rhamnosus GG (FAO/WHO, 2002). Estudos in vitro com L. rhamnosus GG e bifidobactérias e in vivo utilizando estirpes de L. rhamnosus GG e LC-705, bem como Propionibacterium sp. mostrou diminuição na disponibilidade de aflatoxina cancerígena no lúmen. O consumo de B. lactis HN019 e L. rhamnosus HN001 resultou em aumento mensurável de parâmetros imunes em idosos (FAO/WHO, 2002). 2.5 Radiação gama nos alimentos A radiação gama é uma tecnologia capaz de prolongar a vida útil, retardando o amadurecimento, inibindo a senescência e reduzindo a carga microbiana, além de evitar a utilização de agentes químicos para conservação (VIEITES, 2009; HUSSAIN et al., 2012). Esta tecnologia já está difundida pelo mundo, mas no Brasil ainda é pouco aplicada (SILVA; ROZA, 2010). Estudos tem mostrado que até mesmo profissionais da área de alimentos ainda não tem esse conhecimento totalmente elucidado (FRENZEN et al., 2001; SILVA et al., 2010). Também chamada de radiação ionizante, já que têm alta frequência capaz de quebrar ligações químicas quando absorvidas pelo alimento, podendo ocasionar a formação de íons; os raios gama entram em contato com o produto sem qualquer risco de contaminação radioativa (GAVA; SILVA; FRIAS, 2008). As doses de radiação são contabilizadas de acordo com o que o produto irradiado absorve de energia. Um quilojoule (kJ) por quilograma (kg) de produto irradiado absorvido corresponde a dose de 1 quilogray (kGy) (GLADON et al., 1997). As doses normalmente aplicadas aos alimentos situam-se entre 0,1 a 10,0 kGy, sendo que abaixo de 1 kGy é considerada uma baixa dose, utilizada para atraso no amadurecimento, inibição de brotamento, desinfestação de insetos e inativação de parasitas, doses intermediarias situam-se na faixa entre 1 e 10 kGy e reduzem o número de microrganismos e reduzem ou eliminam patógenos formadores de esporos e a irradiação de alta dose, acima de 10 kGy, reduzem os microrganismos ao ponto de esterilidade (GLADON et al., 1997; NEVES; MANZIONE; VIEITES, 2002). 24 Para uso comercial, apenas as fontes de Co60 e Cs137 são utilizadas, devido à produção de raios gama de energias adequadas, disponibilidade e custo, sendo que a fonte de Co60 tem maior aceitação por proporcionar maior segurança ambiental, já que se apresenta na forma metálica e é insolúvel em água (SILVA; ROZA, 2010). A radiação é produzida em um reator nuclear mediante bombardeamento de nêutron de Co60, emitindo raios gama com alto poder de penetração que são utilizados para alimentos a granel ou embalados (STEWART, 2001). A utilização dessa tecnologia de conservação de alimentos está essencialmente ligada a três principais fatores, tipo de alimento a ser irradiado, dose a ser aplicada e tempo de exposição do alimento à fonte irradiadora (VIEITES, 1998). No uso da irradiação em alimentos é fundamental avaliar os efeitos químicos e físicos provocados pela interação da radiação ionizante com o produto irradiado (LEAL et al., 2004). Na maioria dos estudos, proteínas, lipídeos, carboidratos e minerais não são afetados consideravelmente pela irradiação com doses baixas, sendo assim, não são detectáveis mudanças sensoriais na maioria dos produtos irradiados e suas características organolépticas mantidas (VIEITES, 2009). No entanto, pode ocorrer a auto-oxidação de lipídeos produzindo hidroperóxidos, que podem resultar em alterações desagradáveis no aroma e no sabor (GAVA; SILVA; FRIAS, 2008). 2.6 Conservação de alimentos pelo frio O objetivo da conservação de alimentos é inibir ou retardar possíveis alterações que irão inutilizar e reduzir a qualidade do produto. O efeito conservador do frio é baseado na paralização de microrganismos e retardo nas reações químicas e enzimáticas, aumentando com isso, a vida de prateleira do alimento. A preservação do alimento com o uso do frio tem a vantagem de diminuir reações que provocam alterações nutricionais e sensoriais do produto (LOPES, 2007; VASCONCELOS, MELO FILHO, 2010; EMBRAPA, 2012). A refrigeração é definida como processo de diminuição de temperatura dentro de um espaço fechado, que atende aos princípios de praticidade e conveniência (LOPES, 2007). A busca por alimentos refrigerados, pelos consumidores, se dá pela semelhança com produtos frescos e apresenta características sensoriais e higiênicas satisfatórias (NUVOLARI, 2017). É considerado um método oneroso, pois a baixa 25 temperatura deve ser mantida desde a colheita até o consumo do produto, obedecendo a denominada cadeia do frio, que pode ser comparado à uma rede de cooperação, onde todos envolvidos, produtor, comerciante e consumidor devem manter o produto refrigerado (LOPES, 2007; VASCONCELOS, MELO FILHO, 2010). A temperatura de refrigeração é entre 0 °C e 7 °C, por isso é um método brando dentro da conservação dos alimentos, alterando pouco as características organolépticas e podendo não aumentar tanto a duração do produto devido a contaminação microbiana. Com isso, normalmente, são utilizados métodos combinados para estender o prazo de validade (EMBRAPA, 2012). A durabilidade de cada alimento vai depender do binômio tempo e temperatura, sendo que as temperaturas de refrigeração devem ser escolhidas de acordo com cada tipo de alimento e condições de armazenamento (LOPES, 2007). Em temperaturas de 5 ou 6 ºC há um retardo na multiplicação dos microrganismos responsáveis pela intoxicação alimentar, com exceção do Clostridium botulinum tipo E. Há um aumento de até 3 vezes na velocidade de deterioração de produtos alimentícios a cada 10 °C de aumento na temperatura. Com isso, temperaturas adequadas retardam as reações metabólicas proporcionando menores perdas e maiores oportunidades de venda (FERREIRA NETO et al., 2004). 2.7 Boas Práticas de Fabricação A segurança alimentar tem sido foco de atenção em políticas públicas, uma vez que envolve a qualidade higiênico-sanitária dos alimentos e que as doenças transmitidas por alimentos são uma das principais causas de morbidade nos países da américa latina. Os maiores problemas advém do reaquecimento e refrigeração inadequados e preparação de alimentos com muita antecedência (AKUTSU et al., 2005). As doenças transmitidas pelos alimentos são provocadas, em sua maioria, por agentes microbiológicos. Os alimentos contaminados representam enormes perdas econômicas para as empresas e principalmente danos à saúde do consumidor (REGO et al., 2001). O principal meio para contaminação de alimentos é através dos manipuladores, que tem contato em toda cadeia produtiva de alimentos. Os autores citam que os manipuladores raramente lavam as mãos, sendo que quando elas são avaliadas a 26 contaminação microbiológica é sempre alta. Além disso, eles não seguem as normas para produção de alimentos corretamente, como uniformes limpos, sem barbas e bigodes, unhas curtas e ausência de adornos. Portanto, toda essa manipulação incorreta e o negligência com as regras higiênicas favorecem a contaminação pelos microrganismos patogênicos (MELLO et al., 2010). Afim de aumentar o controle da qualidade higiênico-sanitária dos produtos alimentícios que foram criadas, pelo Ministério da Saúde, as portarias que abrangem um conjunto de medidas que devem ser adotadas pelas indústrias de alimentos de modo que garanta a qualidade sanitária e a conformidade dos produtos alimentícios com os regulamentos técnicos, que são as Boas Práticas de Fabricação (BPF) e a aplicação do Sistema de Análise de Perigo e Ponto Crítico de Controle (APPCC) da empresa fabricante e de serviços de alimentos (BRASIL, 1997). As BPF são normas de procedimentos para atingir uma identidade e qualidade padrão dos produtos ou serviços na área de alimentos, e são como pré requisitos para implementação do APPCC; que por sua vez são procedimentos para minimizar os riscos de contaminação microbiana (AKUTSU et al., 2005). Dentro dessas normas, afim de evitar a contaminação, deve-se seguir muito bem a higiene operacional, dos manipuladores, de equipamentos e utensílios, dos alimentos e procedimentos de limpeza e desinfecção (BRASIL, 1997). 27 3 MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Matéria-prima e ingredientes Foram utilizados frutos de abacate, da variedade Hass, fornecidos pela empresa Jaguacy, localizada em Bauru/SP, cujas coordenadas geográficas são: latitude 22º19'18" S, longitude 49º04'13" W e 526m de altitude, distante 90km de Botucatu: latitude de 22°52'20" S, longitude 48°26'37" W e 815m de altitude. Os abacates foram colhidos no ponto de maturação fisiológica e imediatamente transportados para o Departamento de Horticultura, onde foram embrulhados em jornal até alcançar o amadurecimento completo (Figura 1A). O estádio de maturação fisiológica é quando acontecem as principais mudanças físicas e bioquímicas do fruto, produção de etileno e outros voláteis; mudanças na cor, na taxa respiratória, na permeabilidade dos tecidos e na textura e transformações químicas que atingem os açúcares, ácidos orgânicos, proteínas, fenólicos, pigmentos e pectinas; essas transformações determinam os índices de maturidade e qualidade nos frutos, podendo servir ainda como indicadores do ponto ideal de colheita para o armazenamento (SANTOS et al., 2002; CUNHA Jr et al., 2007). Depois de amadurecidos (Figura 1B), que é quando há uma diminuição da acidez e aumento da doçura juntamente com produção de odores e sabores característicos do fruto (CHITARRA; CHITARRA, 2005), os frutos foram levados ao Laboratório de Nutrição e Dietética do Instituto de Biociências da UNESP de Botucatu-SP, onde foram selecionados visando à homogeneização do lote quanto ao tamanho, cor e ausência de injúrias e defeitos. Após serem lavados em água corrente para retirada das sujidades, foram imersos em solução de hipoclorito de sódio com 2,5 % de cloro ativo (8 mL L-1) durante 15 minutos e, em seguida, dispostos sobre uma bancada forrada com papel toalha para retirada do excesso de água e secagem ao ar. Foi realizada a caracterização físico química e centesimal dos frutos, por meio das determinações de pH, sólidos solúveis, acidez, do teor de umidade, teor de cinzas (BRASIL, 2008), teor de proteína bruta, teor de fibra bruta, teor de matéria graxa (AOAC, 2005), açúcares (SOMOGYI, 1945; NELSON, 1944) e coloração (MINOLTA, 1998), assim como a atividade antioxidante (MENSOR et al., 2001), teor de compostos fenólicos (SINGLETON; ORTHOFER; LAMUELA, 1999) e flavonoides (SANTOS; BLATT, 1998; AWAD; JAGER; WESTING, 2000), com três repetições por análise. 28 O açúcar demerara, a lecitina de soja em pó e o cacau em pó foram adquiridos em loja de produtos para confeitaria. A cultura lática utilizada foi a Lyofast LR B, fornecida pela empresa Sacco do Brasil, que consiste em uma cepa de Lactobacillus rhamnosus produtora de bacteriocinas, é uma cultura bioprotetora inibindo bactérias indesejadas, bolores e leveduras (Anexo A). Figura 1 – A. Abacate variedade ‘Hass’ utilizado no experimento no ponto de maturação fisiológico B. Abacates maduros para preparo da pasta 3.2 Elaboração da pasta de abacate Os ingredientes utilizados para elaboração da pasta foram açúcar demerara, cacau em pó, lecitina de soja e ácido cítrico. Primeiramente foram testados três equipamentos afim de escolher a homogeneização mais uniforme do abacate, sendo estes o liquidificador, mixer e processador domésticos. Sendo que a homogeneização com processador foi a mais uniforme e adotada para as etapas seguintes (Figura 2). Antes de iniciar o preparo, também foi realizada a curva de acidificação (Figura 3) para estabelecer a quantidade correta de ácido cítrico a ser utilizado na pasta (ZAPATA; QUAST, 1975). Foram pesados 50 g de polpa de abacate em um erlenmeyer diluídos com 50mL de água destilada, e titulada com uma solução de ácido cítrico a 2 % e medido o pH a cada 0,5 mL de titulação. Considerando-se que o pH Foto: Juliana A. Ramos -2017 A B 29 ótimo para Lactobacillus varia de 5,5 a 5,8 (SIQUEIRA,1995), foram utilizados 0,30 g de ácido cítrico em 100 g de polpa de abacate. Figura 2 – Homogeneização da polpa do abacate nos diferentes utensílios utilizados: processador, mixer e liquidificador Figura 3 – Curva de acidificação da polpa de abacate ‘Hass’ Com o objetivo de alcançar um produto que melhor agrada o paladar dos consumidores, antes da inoculação do probiótico, foram realizadas três análises sensoriais com diferentes tipos de produtos que conferem sabor doce, concentrações de açúcar, concentrações de cacau. A primeira avaliação sensorial consistiu em alcançar o melhor sabor para o poder dulçor, portanto foram testados açúcar demerara, mel e melado. Já a segunda objetivou avaliar a melhor quantidade do 5 5,2 5,4 5,6 5,8 6 6,2 6,4 6,6 6,8 7 7,2 7,4 p H Titulação (mL ácido cítrico a 2 %) Foto: Juliana A. Ramos -2017 30 açúcar escolhido pelos consumidores, onde foram testadas concentrações de 15, 25 e 35 % de açúcar a partir do peso da polpa de abacate. E a última análise objetivou avaliar diferentes concentrações de cacau em pó, deste modo foram avaliadas quantidades de 4,5; 6,5 e 8,5 % de cacau sobre a massa da pasta de abacate. Depois de escolhidos, através das avalições sensoriais descritas, o melhor produto para adoçar (açúcar demerara), as melhores concentrações de cacau (8,5 %) e de açúcar (25 %), deu-se prosseguimento ao experimento (Figura 5). Os abacates foram higienizados, cortados e despolpados manualmente com auxílio de facas e colheres. O preparo iniciou-se pela trituração da polpa em processador (Figura 4A) juntamente com ácido cítrico por cinco minutos, em seguida, a lecitina de soja foi adicionada e batidos em batedeira doméstica (Figura 4B) durante cinco minutos, após isso, foram adicionados o cacau e o açúcar que se mantiveram na batedeira pelo mesmo período de tempo (Figura 4C). Todos os utensílios e equipamentos utilizados foram devidamente sanitizados antes do uso. Figura 4 – Equipamentos utilizados durante a elaboração das pastas de abacate com potencial probiótico Em seguida ao processamento das pastas de abacate, as mesmas foram imediatamente acondicionadas em potes plásticos opacos de polipropileno com permeação de O2 entre 1,3.103 e 6,4.103 cm3/m2.dia.1atm, permeação de CO2 entre 7,7. 103 e 21. 103 cm3/m2.dia.1atm e transmissão de vapor d´água entre 4 e 10 g.m- 2.dia.1atm, divididos por tratamento (com e sem probióticos) e dia de retirada com aproximadamente 1 Kg por dia de análise para cada tratamento. Em seguida ficaram mantidas em refrigeração em geladeira até o dia seguinte. Foto: Juliana A. Ramos -2017 Processador Batedeira A B A C A 31 Figura 5 - Fluxograma da elaboração das pastas de abacate com potencial probiótico 32 Depois de embalados, os potes foram transportados em caixas térmicas com gelo artificial reutilizável rígido para o Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares (IPEN) da Universidade de São Paulo (USP), Campus de São Paulo, onde foram submetidos a dose de radiação gama de 5 kGy com fonte de Co60 no Irradiador Multipropósito do Centro de Tecnologia das Radiações (CTR) (Figura 6). Figura 6 – Irradiador de Multipropósito do Centro de Tecnologia das Radiações (CTR) A decisão em submeter a pasta à irradiação foi devido ao primeiro ensaio, mesmo aplicando-se as boas práticas de fabricação, ocorreu contaminação de bolores e leveduras acima do que a legislação permite, até 104 UFC por grama do produto (BRASIL, 2000) (Figura 7). A partir desse resultado, efetuou-se a contagem de bolores e leveduras dos ingredientes, onde o cacau e a lecitina em pó já apresentaram contagem maior do que a legislação define. Figura 7 – Bolores e leveduras da pasta de abacate em placas com meio ágar batata dextrose antes da utilização da irradiação. Foto: Juliana A. Ramos -2017 33 A dose de 5 kGy foi escolhida pois era necessária uma dose intermediaria que reduzissem ou eliminassem os microrganismos e patógenos formadores de esporos e não causasse alterações organolépticas na pasta, como a oxidação de lipídeos formando hidroperóxidos, já que o abacate é rico em gordura. Após o procedimento de irradiação, a pasta com potencial probiótico recebeu a inoculação com uma dose (1011 UFC) de L.rhamnosus, cepa liofilizada e reidratada com 10 mL de água mineral previamente autoclavada por kg de pasta (Figura 8). A quantidade de cultura lática utilizada baseou-se no número de células viáveis presentes na cultura comercial liofilizada necessária para atingir na pasta o valor mínimo de 1 x 108 UFC por porção. As pastas foram armazenadas sob refrigeração durante todo o período de armazenamento em geladeira doméstica com temperatura de 2 ± 2 °C e umidade relativa de 45,5 ± 3 %. Figura 8 – Inoculação dos L. rhamnosus liofilizados diluídos em água e homogeneizados manualmente 3.3 Variáveis analisadas e preparo das amostras As análises foram realizadas a cada cinco dias em nove tempos de armazenamento, aos 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 dias. Para cada dia de avaliação, durante o período de armazenamento, as amostras foram devidamente acondicionadas para posteriores análises. As análises sensoriais, microbiológicas, potencial hidrogeniônico, sólidos solúveis, acidez titulável e coloração foram realizadas no mesmo dia de avaliação. Foto: Juliana A. Ramos -2017 34 Para determinação de açúcares totais e redutores, fibras, matéria graxa, proteína, umidade e cinzas, as amostras das pastas foram identificadas e guardadas em recipientes plásticos (5,5 cm x 5 cm) com tampa, armazenadas sob congelamento lento a -18 ºC para posteriores análises. Já para quantificação dos compostos bioativos (atividade antioxidante, compostos fenólicos e flavonoides) as amostras foram embaladas em papel alumínio, etiquetadas e congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas em freezer a -18 ºC. 3.4 Análises físico-químicas e composição centesimal  Potencial hidrogeniônico (pH): a leitura de pH foi realizada utilizando um potenciômetro digital DMPH – 2, conforme metodologia do Instituto Adolfo Lutz (BRASIL, 2008).  Sólidos solúveis: leitura refratométrica direta em °Brix, com amostra diluída (1:5) e homogeneizada, utilizando-se refratômetro de mesa tipo ABBE (marca Atago- N1) a 25°C (BRASIL, 2008).  Acidez titulável: obtida por titulometria com solução padronizada de hidróxido de sódio a 0,1 mol L -1, tendo como indicador o ponto de viragem com pH 8,2, utilizando-se 5 g de pasta homozeneizada diluída em 100 ml de água destilada. Acidez titulável foi expressa em gramas de ácido cítrico por 100 g de polpa, conforme metodologia recomendada pelo Instituto Adolfo Lutz (BRASIL, 2008).  Umidade: realizada de acordo com o método descrito pelo Instituto Adolfo Lutz (BRASIL, 2008), pesando entre 2 e 3 gramas da amostra e levado a uma estufa com aquecimento a 105 °C com ar forçado. Os resultados foram expressos em porcentagem.  Cinzas: Utilizando entre 2 e 3 gramas de amostra sendo queimado em Mufla a 550 a 570 °C (BRASIL, 2008), expresso em porcentagem.  Açúcares redutores e açúcares totais: a metodologia utilizada foi a descrita por Nelson (1944) e adaptada por Somogyi (1945). O aparelho utilizado para leitura foi o espectrofotômetro Micronal B-382, sendo a leitura realizada a 535 ηm. Os resultados foram expressos em porcentagem. 35  Matéria-graxa: foi determinada com o auxílio do extrator de máteria-graxa, o Soxleth, sendo utilizado cerca de 1,5 gramas de amostra e o resultado expresso por porcentagem (AOAC, 2005).  Fibra bruta alimentar: depois da amostra desengordurada com a análise de matéria-graxa, a fibra bruta alimentar foi determinada com digestão ácida e depois básica em bloco digestor de fibras e os resultados expressos em porcentagem (AOAC, 2005).  Proteínas: procedimento realizado por digestão ácida em tubo digestor com aproximadamente 1 grama de amostra. Os valores expressos em porcentagem (AOAC, 2005).  Coloração: analisada, em triplicata, com o colorímetro da marca Konica Minolta®, modelo Chroma Meter CR-400, com iluminante D-65 com determinação dos valores (L*, C, h). Onde L*, expresso em porcentagem, indica valores de luminosidade (0% = negro e 100% = branco), o ângulo Hue é o valor em graus correspondente ao diagrama tridimensional de cores (Figura 9) 0° (vermelho), 90° (amarelo) e 270° (azul). O °Hue possui variação de: 0 a 12° para a coloração vermelha, 13 a 41° para a coloração alaranjada, 42 a 69° para a coloração amarelo, 70 a 166° para verde, 167 a 251° para azul, 252 a 305° para violeta e 306 a 359° para vermelho, perfazendo 360°. C* é representado pelo Choma que define a intensidade da cor, que varia de 0 (cor menos intensa) a 60 (cor mais intensa) (MINOLTA, 1998). 3.5 Compostos bioativos  Flavonoides: foram pesados entre 0,1 e 0,2 gramas de amostra em tubo tipo Falcon, adicionados 4 mL de metanol acidificado (metanol 70 % + ácido acético 10 %) e homogeneizados em turrax com agitação. Em seguida, foram levados em banho ultrassônico por 30 minutos, adicionado 1 mL de solução de cloreto de alumínio a 5 % (peso/volume). Posteriormente, os tubos foram colocados no escuro por 30 minutos e, então, centrifugados por 20 minutos a 6000 rpm. O sobrenadante foi coletado e realizada a leitura em espectrofotômetro a 425 ɳm. Os resultados foram expressos em mg de rutina 100 g-1 de amostra (SANTOS; BLATT, 1998, AWAD; JAGER; WESTING, 2000). 36 Figura 9 – Diagramas para determinação de cromaticidade  Preparo do extrato: foram testados três tipos de extratores, metanol 50 %, metanol 80 % e acetona acidificada (acetona, água e ácido acético – 70:29, 7:0,3); três massas distintas, 0,1; 0,5; 1,0 g. E também foi realizada a varredura para estabelecer o correto comprimento de onda a ser utilizado na quantificação dos compostos fenólicos. Os melhores resultados se deram com a acetona acidificada e com peso de 0,1 g. O comprimento de onda utilizado para os compostos fenólicos foi 37 de 750 ɳm. Portanto para o preparo do extrato foi feito de acordo com Wang; Bostic; Gu (2010) com adaptações. Foram pesados 0,1 g de amostra em tubos tipo falcon e adicionados 10 mL de acetona acidificada, homogeneizado em turrax, colocado em banho ultrassônico por 15 min e realizada centrifugação a 6000 rpm por 20 minutos. O sobrenadante foi retirado e guardado, por no máximo três dias, em frascos âmbar para quantificação de compostos fenólicos e atividade antioxidante.  Compostos fenólicos: uma alíquota de 0,5 mL de sobrenadante foi colocada em tubo de ensaio, foram adicionados 2,5 mL de reagente Folin-Ciocalteau diluído em água (10:1 v/v), em seguida, ficaram em repouso por cinco minutos e adicionados mais 2 mL de carbonato de sódio a 4 %. Posteriormente ficaram no escuro por duas horas. A leitura espectrofotométrica, em triplicata, foi realizada a 750 ɳm. Para calibrar o aparelho, foi utilizado água destilada no lugar na amostra e adicionados os mesmos reagentes. Os resultados foram expressos em mg de ácido gálico por 100 g de amostra (SINGLETON; ORTHOFER; LAMUELA, 1999).  Atividade Antioxidante: foram pipetados 0,5 mL de sobrenadante com 3 mL de acetona adicionados de 0,3 mL de solução 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) (0,5 mM em acetona). Para descontar a cor da amostra foi feito o branco, onde ao invés da solução de DPPH foi adicionado acetona acidificada. As leituras foram realizadas em triplicata, na faixa de absorbância de 517 ɳm usando espectrofotômetro após 45 minutos de repouso ao abrigo da luz. A capacidade antioxidante foi expressa em % DPPH reduzido (MENSOR et al., 2001). 3.6 Análises sensoriais Todas as avaliações sensoriais, realizadas através de teste afetivo, foram aprovadas pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Medicina de Botucatu, CAAE n° 68983716.3.0000.5411 (Anexo B), os participantes assinaram um termo de consentimento livre e esclarecido também aprovado pelo CEP. Os benefícios do consumo da pasta de abacate também foram citados em todas as fichas, assim como perguntas para caracterização dos consumidores (faixa etária, sexo, prática de exercícios físicos, consumo de produtos pré treino, conhecimento e consumo de pasta de abacate). 38  Análises sensoriais com diferentes tipos de produtos que conferem sabor doce: foram avaliados três tipos de pastas, com mel, com melado e com açúcar demerara por 60 consumidores quanto a aparência, aroma, sabor, textura, doçura e modo global através de escalas hedônicas de 9 pontos (9 = gostei muitíssimo, 5 = indiferente e 1 = desgostei muitíssimo); verificação de sabor residual e intenção de compra (certamente não compraria até certamente compraria). As três amostras foram apresentadas em copos plásticos de 60 mL com aproximadamente 15 g cada identificados com três números aleatórios, disponibilizando-se água mineral entre as amostras (ABNT, 1998).  Análise sensorial com diferentes concentrações de açúcar: foram avaliadas assim como a análise descrita acima, com três diferentes concentrações (15, 25, 35 %) de açúcar demerara.  Análise sensorial com diferentes concentrações de cacau: as amostras com três diferentes concentrações de cacau (4,5; 6,5; 8,5 %) foram avaliadas como as duas sensoriais acima com acréscimo do quesito amargor na escala hedônica de nove pontos (Apêndice A).  Análises sensoriais durante a vida de prateleira: as duas amostras de pasta de abacate, com e sem L.rhamnosus, foram submetidas à avaliação sensorial por um grupo de 60 consumidores sem restrições quanto à idade, ao sexo, à classe social e frequência de consumo durante toda a vida de prateleira, totalizando nove avaliações. As pastas foram avaliadas quanto à aparência, aroma, sabor, textura, doçura e modo global por meio de escalas hedônicas de 9 pontos (9 = gostei muitíssimo, 5 = indiferente e 1 = desgostei muitíssimo); também quanto a intensidade de todos esses quesitos por meio de escala do ideal (muito mais intenso/firme/doce do que eu gosto, do jeito que eu gosto, muito menos intenso/firme/doce do que eu gosto); além de intensidade de outros fatores como cor, sabor ácido, amargo, ranço e fermentado (notas de 1= ausente até 10= muito); e também a intenção de compra, conforme ficha apresentada no apêndice B (ABNT, 1998). Foram servidas aproximadamente 15g de pasta de abacate em copos plásticos brancos de 60 mL, identificados com códigos de três números aleatórios. Para limpeza do palato foi disponibilizada água mineral para uso entre uma amostra e outra. 39 3.7 Análises microbiológicas  Preparo das amostras: o procedimento de preparo das amostras para as contagens microbiológicas foi realizado conforme a metodologia descrita por Siqueira (1995). Dando sequência aos procedimentos, 10 g de amostras, em duplicata, de cada tratamento, com e sem probiótico, foram diluídas em 90 mL de solução salina a 0,85 %, acondicionadas em sacos plásticos estéreis e homogeneizadas em homogeneizador stomacher por 30 segundos, executando-se diluições subsequentes, com 1 mL, até 10-5 em tubos de ensaio com 9 mL de solução salina.  Contagem dos Lactobacillus rhamnosus: para a contagem de células viáveis, as superfícies foram semeadas com 0,2 mL de cada diluição, em duplicatas em placas de Petri com meio de cultura Ágar MRS (DE MAN; ROGOSA; SHARPE, 1960; CARR; CHILL; MAIDA, 2002) a partir de diluições seriadas das pastas com probióticos. O período de incubação para contagem bacteriana foi de 35ºC/48h (SIQUEIRA,1995). As colônias de L. rhamnosus se mostravam circulares, uniformes, brancas e brilhantes. Para confirmação das colônias que cresceram nas placas com ágar MRS foi realizado esfregaço em lâmina e coloração pelo método de Gram para observação em microscópio (Figura 10).  Contagem de bolores e leveduras: Segundo a Resolução-RDC n°12, de 02 de janeiro de 2001, que determina padrões microbiológicos para alimentos, é necessária a contagem de bolores e leveduras para a pasta de abacate que se enquadrou na categoria 1) “FRUTAS, PRODUTOS DE FRUTAS e SIMILARES – e) purês e doces em pasta ou massa e similares, incluindo geleias, não comercialmente estéreis; doces em calda, não comercialmente estéreis (a granel)”. Para a contagem de UFC de bolores e leveduras, de cada uma das diluições foram retiradas e transferidas alíquotas de 0,2 mL para placas de Petri com o meio de cultura ágar batata dextrose acidificado com ácido tartárico para pH 3,5 (adaptado de SIQUEIRA,1995) e incubação a 25 °C por 7 dias.  Contagem padrão de bactérias aeróbias mesófilas: indica a qualidade higiênico-sanitária dos alimentos, possibilitando ideia sobre o tempo de conservação do produto. Em produtos onde elas são encontradas em grande número indica que as matérias-primas contaminadas, limpeza, desinfecção de superfícies e equipamentos inadequadas, higiene na produção inadequada e condições de tempo e temperatura inadequados durante a produção e/ou conservação dos alimentos. Para a contagem, 40 foram utilizados 0,2 mL das diluições seriadas em placas de Petri em Ágar Padrão para Contagem (PCA), incubando-se a 35 °C por 5 dias (SIQUEIRA,1995).  Contagem de microrganismos psicrotróficos: como a pasta ficou armazenada em geladeira a 2 ± 2 °C, também foi realizada a contagem de microrganismos psicrotróficos, que se multiplicam nessa temperatura independente da sua faixa de temperatura ótima para o crescimento e podem comprometer a qualidade do produto (SANTANA et. al., 2001). Alíquotas de 0,2 mL das diluições foram colocadas em placas de Petri em ágar padrão para contagem (PCA), incubados por 7 dias a 4 °C. Figura 10 – A. Lactobacillus rhamnosus em placas com meio ágar MRS e B. Lâmina corada pelo método de gram vista pelo microscópio 3.8 Cálculo da informação nutricional Para determinar a porção e a medida caseira da pasta de abacate foi utilizada a tabela de valores de referência para porções de alimentos e bebidas embalados para fins de rotulagem nutricional da RDC n° 359 de 2003, usando como parâmetro o item doces em pasta (BRASIL, 2003). Para o cálculo dos nutrientes da pasta, foi feita a soma dos nutrientes do cacau em pó, lecitina em pó e açúcar demerara que continham nos rótulos e para polpa de abacate foi utilizada a Tabela Brasileira de Composição dos Alimentos (UNICAMP, 2011) e regra de três para a porção recomendada. 3.9 Análise estatística O delineamento foi inteiramente casualizado em esquema fatorial 2 x 9 (tratamento x armazenamento) sendo os dados submetidos à análise de variância. Fez-se regressão polinomial. Foto: Juliana A. Ramos -2017 A B 41 Para as análises sensoriais preliminares e para proteínas, as médias foram comparadas por meio do teste de Tukey com 5 % de significância. E para a contagem de probióticos, foi feita análise de regressão. Os resultados gerados foram avaliados utilizando-se o sistema estatístico SISVAR (FERREIRA, 2005). 42 4 RESULTADOS E DISCUSSÕES 4.1 Caracterização físico-química, compostos bioativos e coloração da polpa de abacate Na caracterização dos frutos de abacate, o pH da polpa (6,88) e o teor de sólidos solúveis (8,75 °Brix) estão próximos ao encontrado por Vieites; Daiuto; Fumes (2012), pH 6,65 e sólidos solúveis 7 °Brix em abacates ‘Fuerte’ (Tabela 1). Para acidez titulável foi observado valor de 0,11 g de ácido cítrico 100g-1, próximo do encontrado por Vieites et al., 2014, com 0,8 g de ácido cítrico 100 g-1 em abacates ‘Hass’. A composição centesimal da polpa de abacate totalizou 98,4 %. A umidade (70,50 %), fibras (5,1 %), proteínas (1,2 %) e açúcares redutores (0,67 %) estão semelhantes dos encontrados por Daiuto et al. (2014) em pesquisa com abacate ‘Hass’, os autores citam umidade de 69,85 %, 3,81% de fibras, 1,27% proteínas e 0,26% açúcares redutores. Em abacate ‘Margarida’ também foi encontrada quantidade apreciável de fibra (4,85 %) (SALGADO et al., 2008), valor semelhante ao quantificado nesse estudo. Tabela 1 – Análises físico-químicas, centesimal, compostos bioativos e coloração da polpa de abacate Análises Abacate in natura pH 6,88 Sólidos solúveis 8,75 °Brix Acidez titulável 0,11 g de ác cítrico 100g-1 Umidade 70,50 % Cinzas 3,14 % Açúcar redutor 0,67 % Proteína 1,20 % Lipídeos 17,73 % Fibras 5,10 % Compostos fenólicos 92,42 mg de ác.gálico 100g-1 Atividade antioxidante (DPPH) 10,12 % Flavonoides 86,75 mg de rutina 100g-1 Luminosidade 68,55 % Chroma 35,64 Ângulo hue 108,76° A atividade antioxidante (10,12 %) foi menor do que em abacate ‘Fuerte’ (18 %) (VIEITES; DAIUTO; FUMES, 2012) e em avocados estudados no Estados Unidos (41 %) (FLOEGEL et al., 2011). Enquanto o teor encontrado para flavonoides (86,75 mg de rutina 100 g-1) foi maior do que o encontrado por Chun et al., 2005 em avocados 43 (33,62 mg de rutina 100 g -1). Porém a concentração de compostos fenólicos (58,27 mg de ác.gálico 100 g-1) encontrada por esses autores foi menor do que a quantificada pelo presente trabalho (92,42 mg de ác.gálico 100 g-1). As diferenças na quantificação dos compostos bioativos podem se dar devido as diferentes sazonalidades, temperaturas, disponibilidade hídrica, radiação ultravioleta, adição de nutrientes, poluição atmosférica, danos mecânicos e ataque de patógenos. Outro fator que pode interferir no teor dos compostos do metabolismo secundário é a informação genética, ou seja, a variedade do fruto (GOBBO-NETO; LOPES, 2007; LLORACH et al., 2008). Analisando juntamente a Luminosidade, o Croma e o ângulo Hue e seguindo o diagrama de cores de Minolta (1998), a polpa de abacate apresenta-se com cor verde luz. Quando comparada com a variedade Fuerte, os frutos do ‘Hass’ se mostram mais escuros, já que sua luminosidade é de 68,55 % em comparação com 89 % do ‘Fuerte’ (VIEITES; DAIUTO; FUMES, 2012). 4.2 Análises sensoriais preliminares 4.2.1 Análise sensorial da pasta de abacate com os diferentes tipos de produtos que conferem sabor doce Na Tabela 2 estão apresentadas as médias das notas do teste sensorial de 60 provadores não treinados utilizando escala hedônica ancorada em 9 pontos. Para os atributos sabor, dulçor e modo global as maiores notas foram observadas para a pasta adoçada com açúcar demerara, 7,4; 7,5 e 7,6; respectivamente. Tabela 2 - Médias das notas atribuídas pelos consumidores para o teste sensorial para os diferentes tipos de produtos que conferem sabor doce na pasta de abacate. Botucatu-SP. 2016. Produtos Aparência Aroma Sabor Textura Dulçor Modo global Melado 7,5 a 5,9 b 4,8 c 6,8 b 4,5 c 5,0 c Açúcar 7,8 a 6,9 a 7,4 a 7,7 a 7,5 a 7,6 a Mel 7,9 a 6,2 ab 6,0 b 7,2 ab 5,9 b 6,3 b C.V. (%) 17,1 29,9 31,3 21,5 32,7 29,9 Médias seguidas da mesma letra na coluna não diferem entre si, pelo teste de Tukey ao nível de 5% de significância. C.V. (%): coeficiente de variação. Para a textura da pasta e o aroma as maiores notas foram recebidas pela pasta processada com açúcar demerara (7,7 e 6,9), não diferindo estatisticamente da 44 adoçada com mel (6,0 e 6,2). Entretanto, a aparência não foi influenciada pelo tipo de ingrediente de dulçor, sendo observadas notas de 7,5 a 7,9. Através da pergunta sobre sabor residual, foi possível perceber que os consumidores sentiram menos sabor residual na pasta com açúcar demerara (20 % dos consumidores) em relação as pastas com mel (32 %) e com melado (55 %) (Figura 11). Os sabores mais pejorativos foram observados no produto adoçado com melado, azedo, amargo, gosto de ração de cachorro e gosto residual de adoçante (edulcorante). A intenção de compra, assim como nos outros atributos avaliados, obteve maior nota a pasta de abacate elaborada com açúcar demerara (3,8), significando possivelmente compraria, seguida da adoçada com mel (3,1), talvez compraria e de melado (2,2), possivelmente não compraria (Tabela 3). Tabela 3 - Médias das notas atribuídas pelos consumidores para intenção de compra para os diferentes tipos de produtos que conferem sabor doce na pasta de abacate. Botucatu-SP. 2016. Produtos Intenção de compra (notas) Melado 2,2 c Açúcar 3,8 a Mel 3,1 b C.V. (%) 36,7 Médias seguidas da mesma letra na coluna não diferem entre si, pelo teste de Tukey ao nível de 5% de significância. C.V. (%): coeficiente de variação. Segundo os resultados apresentados nos gráficos com a frequência das notas, a pasta com açúcar obtiveram mais notas 4 e 5, refletindo em “possivelmente compraria” e “certamente compraria”, respectivamente (Figura 12). De posse dos resultados do teste sensorial, sabor residual e intenção de compra decidiu-se utilizar o açúcar demerara como agente de dulçor da pasta de abacate para dar prosseguimento à próximas avaliações. 45 Figura 11 - Sabor residual detectado pelos consumidores para as formulações dos diferentes tipos de produtos que conferem sabor doce na pasta de abacate. Botucatu-SP. 2016. 0 2 4 6 8 10 12 A ç ú c a r A z e d o A m a rg o C ít ri c o R a p a d u ra R a ç ã o M a s c a v o M e la d o M e l C a c a u B a n a n a A b a c a te A d o ç a n te N ã o …% s a b o r re s id u a l Tipos de sabores residuais Melado 0 4 8 12 % s a b o r re s id u a l Tipos de sabores residuais Mel 0 4 8 12 % s a b o r re s id u a l Tipos de sabores residuais Açúcar demerara 46 Figura 12 - Frequência das notas (%) atribuídas pelos consumidores na intenção de compra da pasta de abacate elaborada com os diferentes tipos de produtos que conferem sabor doce. Botucatu-SP. 2016. 0 10 20 30 40 50 Certamente não compraria Possivelmente não compraria Talvez compraria Possivelmente compraria Certamente compraria F re q u ê n c ia n o ta s ( % ) Intenção de compra Melado 0 10 20 30 40 50 Certamente não compraria Possivelmente não compraria Talvez compraria Possivelmente compraria Certamente compraria F re q u ê n c ia d a s n o ta s ( % ) Intenção de compra Mel 0 10 20 30 40 50 Certamente não compraria Possivelmente não compraria Talvez compraria Possivelmente compraria Certamente compraria F re q u ê n c ia d a s n o ta s ( % ) Intenção de compra Açúcar demerara 47 4.2.2 Análise sensorial da pasta de abacate com os diferentes concentrações de açúcar demerara As médias das notas atribuídas por 60 consumidores utilizando escala hedônica com 9 pontos estão apresentadas na Tabela 4. Para os atributos aparência, aroma e amargor não houve diferença estatística entre as concentrações de açúcar demerara. Não houve diferença estatística entre as concentrações 25 e 35 % nos quesitos sabor e dulçor, ambos recebendo notas referentes a gostei regularmente. Entretanto essas versões diferenciaram da concentração com 15 % de açúcar que recebeu menores notas, sendo considerada indiferente para o sabor e gostei ligeiramente para o dulçor. De modo global as maiores notas foram recebidas pela versão com 35 % de açúcar demerara (6,77), não diferenciando da pasta com 25 % (6,7), ambas classificadas como gostei regularmente (Tabela 4). Tabela 4 - Médias das notas atribuídas pelos consumidores para o teste sensorial para a concentração de açúcar na pasta de abacate. Botucatu-SP. 2017. Tratamento Aparência Aroma Sabor Textura Dulçor Amargor Global 15% açúcar 6,73 a 5,67 a 5,41 b 7,16 a 5,74 b 6,08 a 5,88 b 25% açúcar 7,16 a 5,98 a 6,56 a 7,23 a 6,74 a 6,33 a 6,70 ab 35% açúcar 7,22 a 5,96 a 6,67 a 7,46 a 6,87 a 6,38 a 6,77 a C.V. (%) 24,0 33,2 29,5 19,9 27,6 33,8 30,5 Médias seguidas da mesma letra na coluna não diferem entre si, pelo teste de Tukey ao nível de 5% e significância. C.V. (%): coeficiente de variação. Para o sabor residual das diferentes formulações (Figura 13), observa-se na concentração 15 % o maior número de apontamentos pejorativos em relação a formulação, cacau (3,3 %), banana verde (4,9 %), abacate verde (1,6 %), amargo (3,3 %) e fruta oxidada (1,6 %), quando comparados as outras formulações. De modo geral a pasta com 25 % de açúcar obteve somente 8 % das respostas de sabor residual pelos consumidores quando comparada com a versão 15 % (15 % das notas) e 35 % (14 % das notas). Na Tabela 5 observam-se as médias das notas para a intenção de compra entre as formulações de pasta. As maiores notas foram atribuídas para as pastas com 25 e 35 % de açúcar demerara, 3,26 e 3,31, respectivamente, correspondendo a talvez compraria. Essas versões diferiram estatisticamente da pasta com 15 % de açúcar, apresentando as menores notas, 2,57 (possivelmente não compraria). 48 Figura 13 - Sabor residual detectado pelos consumidores para as formulações das diferentes concentrações de açúcar demerara na pasta de abacate. Botucatu-SP. 2016. 0 2 4 6 8 Cacau Banana verde Abacate verde Amargo Fruta oxidada % s a b o r re s id u a l Tipos de sabores residuais 15% de açúcar 0 2 4 6 8 Soja Cacau Ácido Abacate verde % s a b o r re s id u a l Tipos de sabores residuais 25% de açúcar 0 2 4 6 8 Soja Amargo Adoçante Abacate verde % s a b o r re s id u a l Tipos de sabores residuais 35% de açúcar 49 Tabela 5 - Médias das notas atribuídas pelos consumidores para intenção de compra para a concentração de açúcar na pasta de abacate. Botucatu-SP. 2017. Tratamento Intenção de compra (notas) 15 % açúcar 2,57 b 25 % açúcar 3,26 a 35 % açúcar 3,31 a C.V. (%) 41,3 Médias seguidas da mesma letra na coluna não diferem entre si, pelo teste de Tukey ao nível de 5% de significância. C.V. (%): coeficiente de variação. A Figura 14 mostra a frequência das notas para intenção de compra em cada concentração de açúcar utilizada. Observa-se que a maior porcentagem de certamente compraria (28 %) foi apontada para a versão com 35% de açúcar, seguida pela concentração de 25% (20 %) e a menor intenção de compra para a formulação com 15 %, 25 % para certamente não compraria. Diante dos resultados do teste sensorial, análise residual e intenção de compra as concentrações de 25 e 35 % poderiam ser utilizadas, contudo buscando reduzir o aporte calórico assim como aumentar a qualidade nutritiva da pasta de abacate optou-se por utilizar a concentração de 25% de açúcar demerara. 4.2.3 Análise sensorial da pasta de abacate com os diferentes concentrações de cacau Na Tabela 6 estão apresentadas as médias para a concentração de cacau da pasta de abacate. Os atributos aroma, sabor, dulçor e amargor não foram influenciados pelas concentrações de cacau. Para a textura e aparência as maiores notas foram atribuídas para a pasta elaborada com 6,5% de cacau (7,1 e 7,2) não diferenciando da concentração 8,5 % (6,9 e 7,1). Enquanto para o modo global observou maiores notas na pasta com 8,5 % de cacau (6,9) não diferindo estatisticamente do 6,5 % de cacau (6,6), apresentando diferença estatística para a versão 4,5 % (6,1). 50 Figura 14 - Frequência das notas (%) atribuídas pelos consumidores na intenção de compra da pasta de abacate elaborada com os diferentes concentrações de açúcar demerara. Botucatu- SP. 2016. 0 5 10 15 20 25 30 35 Certamente não compraria Possivelmente não compraria Talvez compraria Possivelmente compraria Certamente compraria F re q u ê n c ia d a s n o ta s ( % ) Intenção de compra 15% de açúcar 0 5 10 15 20 25 30 35 Certamente não compraria Possivelmente não compraria Talvez compraria Possivelmente compraria Certamente compraria F re q u ê n c ia d a s n o ta s ( % ) Intenção de compra 25% de açúcar 0 5 10 15 20 25 30 35 Certamente não compraria Possivelmente não compraria Talvez compraria Possivelmente compraria Certamente compraria F re q u ê n c ia d a s n o ta s ( % ) Intenção de compra 35% de açúcar 51 Tabela 6 - Médias das notas atribuídas pelos consumidores para o teste sensorial para a concentração de cacau na pasta de abacate. Botucatu-SP. 2017. Tratamento Aparência Aroma Sabor Textura Dulçor Amargor Global 4,5% cacau 6,3 b 5,6 a 6,1 a 6,4 b 6,4 a 6,0 a 6,1 b 6,5% cacau 7,2 a 5,8 a 6,5 a 7,1 a 6,8 a 6,1 a 6,6 ab 8,5% cacau 7,1 ab 6,0 a 6,9 a 6,9 ab 6,7 a 6,7 a 6,9 a C.V. (%) 26,9 29,0 29,4 23,2 27,6 33,6 28,3 Médias seguidas da mesma letra na coluna não diferem entre si, pelo teste de Tukey ao nível de 5% de significância. C.V. (%): coeficiente de variação. Para o sabor residual das formulações de pasta de abacate com diferentes concentrações de cacau (Figura 15) observam-se maiores apontamentos nas versões com 4,5 % e 6,5 %, considerando o produto como fermentado e com adstringência. Enquanto na versão com 8,5% foram detectados maiores menções para sabor de cacau e amargo, resultado já esperado, pois o cacau traz essas características, não podendo ser considerado com característica pejorativa ao produto. Para a intenção de compra das formulações com diferentes concentrações de cacau (Tabela 7), em média a melhor intenção de compra foi observada na formulação com 8,5 % de cacau, nota 3,5, não diferenciando da nota dada a formulação com 6,5 % (3,0), ambas com classificação talvez compraria. O produto com 4,5 % de cacau obteve nota em média de 2,8, representando possivelmente não compraria. Tabela 7 - Médias das notas atribuídas pelos consumidores para intenção de compra para a concentração de cacau na pasta de abacate. Botucatu-SP. 2017. Tratamento Intenção de compra (notas) 4,5 % cacau 2,8 b 6,5 % cacau 3,0 ab 8,5 % cacau 3,5 a C.V. (%) 41,2 Médias seguidas da mesma letra na coluna não diferem entre si, pelo teste de Tukey ao nível de 5% de significância. C.V. (%): coeficiente de variação. Através da frequência de intenção de compra, a maior intenção de compra foi observada na concentração de 8,5 % (40 % possivelmente compraria e 22 % certamente compraria) e as concentrações 4,5 % e 6,5 % tiveram mais respostas certamente não compraria (20 %) e possivelmente não compraria (22 %) do que a concentração 8,5 % de cacau (15 % certamente não compraria e 5 % possivelmente não compraria) (Figura 16). 52 Figura 15 - Sabor residual detectado pelos consumidores para as formulações das diferentes concentrações de cacau na pasta de abacate. Botucatu-SP. 2016. 0 5 10 15 20 % s a b o r re s id u a l Tipos de sabores residuais 4,5% de cacau 0 5 10 15 20 % s a b o r re s id u a l Tipos de sabores residuais 6,5% de cacau 0 5 10 15 20 Cacau Abacate Amargo Banana % s a b o r re s id u a l Tipos de sabores residuais 8,5% de cacau 53 Figura 16 - Frequência das notas (%) atribuídas pelos consumidores na intenção de compra da pasta de abacate elaborada com as diferentes concentrações de cacau. Botucatu-SP. 2016. 0 10 20 30 40 Certamente não compraria Possivelmente não compraria Talvez compraria Possivelmente compraria Certamente compraria F re q u ê n c ia d a s n o ta s ( % ) Intenção de compra 4,5% de cacau 0 10 20 30 40 Certamente não compraria Possivelmente não compraria Talvez compraria Possivelmente compraria Certamente compraria F re q u ê n c ia d a s n o ta s ( % ) Intenção de compra 6,5% de cacau 0 10 20 30 40 Certamente não compraria Possivelmente não compraria Talvez compraria Possivelmente compraria Certamente compraria F re q u ê n c ia d a s n o ta s ( % ) Intenção de compra 8,5% de cacau 54 4.3 Formulação e Informação Nutricional da pasta de abacate Os ingredientes utilizados no desenvolvimento da pasta de abacate com potencial probiótico e suas respectivas quantidades e porcentagens em relação a massa total estão apresentados na Tabela 8. Tabela 8 - Formulação utilizada na fabricação da pasta de abacate Ingredientes Quantidade (Kg) Quantidade (%) Polpa de abacate 11,5 74,21 Açúcar 2,87 18,55 Cacau 0,97 6,26 Lecitina de soja 0,035 0,74 Ácido cítrico 0,115 0,22 Foram utilizados 22 kg de abacates inteiros que renderam 11,5 Kg de polpa, portanto um rendimento de 52,27 %. Foram encontrados rendimentos semelhante (58, 71 %) e maior (67,5 %) do que o presente trabalho na mesma variedade utilizada (TANGO et al., 2004; DAIUTO et al., 2010). Através do cálculo da informação nutricional, a porção da pasta de abacate apresentou 35 Kcal por porção de 20 gramas (Tabela 9). Sendo considerado um produto com baixo teor em gorduras saturadas, possuindo ainda alto conteúdo de fibras e livre de sódio (BRASIL, 2012). Tabela 9 - Informação nutricional da pasta de abacate com potencial probiótico. INFORMAÇÃO NUTRICIONAL Porção de 20 g (1 colher de sopa) Quantidade por porção %VD (*) Valor energético 35 kcal/146kJ 1,74 % Carboidratos 4,80 g 1,6 % Proteínas 0,43 g 0,58 % Gorduras totais 1,59 g 2,89 % Gorduras saturadas 0,19 g 0,86 % Gordura trans 0 g ** Fibra alimentar 1,30 g 5,2 % Sódio 0 mg 0 % (*) % Valores Diários de referência com base em uma dieta com 2000kcal ou 8400kJ. Seus valores diários podem ser maiores ou menores dependendo de suas necessidades energéticas. ** Valores diários não estabelecidos. 55 4.4 Composição centesimal e análises físico químicas das pastas de abacate Os alimentos sofrem mudanças físicas, microbiológicas e bioquímicas que são marcadamente dependentes do tempo e da temperatura de armazenamento. Essas mudanças devem impactar na qualidade e afetar a segurança do produto (ZÚÑIGA; TRANCOSO, 2013), fato este verificado neste trabalho através das análises da pasta de abacate. Vários fatores interferem na estrutura, composição química e nutricional no alimento processado, assim como a pasta de abacate; entre eles, estão o oxigênio, umidade, pH do meio, luz, temperatura, íons metálicos e agentes redutores e oxidantes. Essas alterações podem ser negativas, como perda de nutrientes e alterações organolépticas, tanto como positivas, formando novos compostos desejáveis ou destruindo substancias inibidoras, fato observado através dos resultados das análises físico-químicas e sensoriais da pasta de abacate (CORREIA, FARAONI, PINHEIRO-SANT’ANNA, 2008). O potencial hidrogeniônico é muito importante para viabilidade dos probióticos, trabalhos mostram que maiores os pH de sucos de frutas melhor é a viabilidade dos Lactobacillus. A viabilidade de L.casei foi maior em suco de laranja com pH corrigido a 6,0 do que no suco com pH 3,85 (COELHO, 2009); o crescimento e o número de células viáveis de diferentes Lactobacillus foi maior em sucos de frutas com pH de 4,2 do que em sucos com pH entre 3,6 e 4,0 (CHAMPAGNE; GRADEN, 2008); L.casei apresentou ótimo crescimento em suco de caju com pH 6,5 (SILVEIRA, 2009). Por isso, o pH do presente trabalho, próximo a 6,0, se mostrou ótimo para viabilidade dos Lactobacillus. Entretanto não houve diferença entre as pastas de abacate com e sem adição de probióticos para o pH (Tabela 10), mostrando que a adição de L. rhamnosus não influenciou no pH durante quarenta dias de armazenamento refrigerado. O pH diminuiu com o passar dos dias de armazenamento, reduzindo de 5,8 para 5,4 (Figura 17), corroborando com a pequena elevação da acidez titulável nas pastas de abacate (Figura 18), já que o pH mostra o inverso da concentração de íons hidrogênio (CHITARRA; CHITARRA 2005). 56 Tabela 10 – Potencial hidrogeniônico (pH) em pastas de abacate com e sem adição de probióticos ao longo de 40 dias de armazenamento refrigerado (2 ± 2 °C e 45,5 ± 3%). Armazenamento (dias) Pasta de abacate Com probióticos Sem probióticos 0 5,89 5,79 5 5,56 5,76 10 5,80 5,74 15 5,70 5,73 20 5,59 5,53 25 5,42 5,51 30 5,56 5,44 35 5,57 5,55 40 5,40 5,43 Média 5,61 5,61 C.V. (%) 1,68 As médias do tratamento e interação não foram significativas entre si a 5% de significância pelo teste de Tukey. Figura 17 – Potencial hidrogeniônico (pH) em pastas de abacate com e sem adição de probióticos ao longo de 40 dias de armazenamento refrigerado (2 ± 2 °C e UR 45,5 ± 3 %). Diferentemente do que ocorreu no presente trabalho, muitos autores consideram que o declínio no pH ocorre devido à presença das bactérias ácido-láticas, não só na fermentação, mas também ao longo do armazenamento sob refrigeração. O pH de leite fermentado com L.casei reduziu em 28 dias de pH 4,50 para 4,15 (QUIZHOU et al., 2009). Outros pesquisadores em experimento com leite fermentado, a mesma cepa e o mesmo período de refrigeração mostrou diminuição ainda maior de pH 5,59 para 4,60 (GUO et al., 2009). Após 30 dias de refrigeração de leite de búfala com L.casei houve uma redução do pH de 4,72 para 4,45 (FARIA; BENEDET; 0 1 2 3 4 5 6 0 10 20 30 40 p H Período de armazenamento (dias) Y= 5,80 - 0,009x (R²=0,77) 57 GUERROUE, 2006). Segundo Oliveira, 2010, pequenas variações do pH durante o período de armazenamento mostra boa estabilidade microbiológica do produto, como na presente pesquisa (5,8 para 5,4). Para a acidez titulável (Figura 18) ocorreu diferença estatística entre os fatores estudados. Observou-se aumento dos teores nas pastas com e sem probióticos, entretanto a partir dos 15 dias a pasta com probiótico apresentou-se mais ácida, mantendo esse comportamento durante o período de 40 dias de armazenamento refrigerado. Essa resposta pode estar ligada à fermentação dos carboidratos, devido a produção natural de ácido lático pelos L. rhamnosus (FERNANDES et al., 2008) Ainda em relação ao aumento da acidez, segundo Daiuto et al., 2010, pode ser devido a fermentação dos carboidratos e a quebra de lipídeos em ácidos graxos durante o armazenamento. Em sorvetes enriquecidos com probióticos e diferentes tipos de fibras dietéticas, assim como neste trabalho, houve flutuação na acidez titulável durante o período de armazenamento (AKALI et al., 2018). Figura 18 – Acidez titulável (mg ácido cítrico 100 g-1) em pastas de abacate com e sem adição de probióticos ao longo de 40 dias de armazenamento refrigerado (2 ± 2 °C e 45,5 ± 3 %). Para o teor de sólidos solúveis (SS), houve interação do tratamento e dias de armazenamento (Figura 19). Na pasta com os L.rhamnosus, ocorreu diminuição no teor de SS nos primeiros 20 dias de armazenamento (31,6 para 29), provavelmente devido a fase de crescimento exponencial das bactérias, como pode ser comprovado na contagem dos Lactobacillus do presente trabalho, onde apresentou maiores valores no começo das avaliações (acima de LOG 8 UFC g-1). 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0 10 20 30 40 A c id e z t it u lá v e l (m g á c . c ít ri c o 1 0 0 g -1 ) Período de armazenamento (dias) Com probióticos y=0,37-0,002x+0,0003x²-0,000006x³ (R²=0,86) Sem probióticos y=0,36+0,002x (R²=0,87) C.V. (%) = 3,45 58 Figura 19 – Sólidos solúveis (°Brix) em pastas de abacate com e sem adição de probióticos ao longo de 40 dias de armazenamento refrigerado (2 ± 2 °C e 45,5 ± 3 %). Entretanto na pasta sem os probióticos, a diminuição ocorreu ao final do armazenamento, possivelmente, pela oxidação dos lipídeos (VIEITES, DAIUTO, FUMES, 2012). Diferentemente do presente trabalho, em purê de manga e geleiada de morango não houveram alterações no teor de sólidos solúveis durante a vida de prateleira (VASQUEZ-CAICEDO et al., 2007; MIGUEL, ALBERTINI, SPOTO, 2009). A umidade manteve-se sem diferença estatística significativa entre as pastas com e sem probióticos e durante o período de armazenamento (Tabela 11), provavelmente pelo uso da refrigeração. Tabela 11 – Umidade (%) em pastas de abacate com e sem adição de probióticos ao longo de 40 dias de armazenamento refrigerado (2 ± 2 °C e 45,5 ± 3 %). Armazenamento (dias) Pasta de abacate Com probióticos Sem probióticos 0 49,77 55,58 5 56,29 55,93 10 57,38 56,86 15 57,1 56,12 20 56,87 46,42 25 57,09 57,16 30 46,12 56,56 35 57,28 57,0 40 47,00 56,64 Média 53,88 55,36 C.V. (%) 14,54% As médias do tratamento e interação não foram significativas entre si a 5% de significância pelo teste de Tukey. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 0 10 20 30 40 S ó lid o s s o lú v e is ( °B ri x ) Período de armazenamento (dias) Com probióticos (Y=31,49-0,63x+0,038x²-0,0006 (R²= 0,57)) Sem probióticos (Y= 30,70+0,508x-0,033x²+0,0005x³ ( R² = 0,82)) C.V. (%)= 4,02 59 Foram observados valores de 46,17 a 57,38 %. Isso pode ser considerado um resultado positivo já que um dos fatores da duração na vida de prateleira é a suscetibilidade à perda de umidade (CHITARRA; CHITARRA, 2005). A inoculação de probióticos não interferiu no teor de cinzas, que é indicação do teor de minerais, na pasta de abacate (Tabela 12). Tabela 12 – Cinzas (%) em pastas de abacate com e sem adição de probióticos ao longo de 40 dias de armazenamento refrigerado (2 ± 2 °C e 45,5 ± 3 %). Armazenamento (dias) Pasta de abacate Com probióticos Sem probióticos 0 1,85 1,62 5 1,60 1,56 10 1,54 1,55 15 1,46 1,52 20 1,52 1,49 25 1,72 1,77 30 1,53 1,58 35 1,63 1,54 40 1,68 1,65 Média 1,59 1,61 C.V. (%) 6,88 As médias do tratamento e interação não foram significativas entre si a 5% de significância pelo teste de Tukey. Em média, para os teores de cinzas, foram observados valores de 1,46 a 1,77 %. Valores inferiores às médias (1,59 e 1,61 %) encontradas no presente trabalho, foram citados para polpa de abacate de 0,60 % (SALGADO et al., 2008), 0,90 % (CHAVES et al., 2013), 1,3 % (MORENO et al., 2003) e 1,5 % (FERARRI, 2015). Isso pode ser explicado pela adição de outros ingredientes à polpa de abacate, como o cacau que apresenta em torno de 7 % de cinzas (EDUARDO; LANNES, 2004). Durante o período de armazenamento da pasta de abacate (Figura 20) observou- se tendência de redução dos valores de cinzas durante os 40 dias de armazenamento, de 1,74 para 1,67 %, com discretas oscilações durante esse período. Mesmo comportamento ocorreu no trabalho com abacate ‘Hass’ em armazenamento refrigerado, aumento seguido de queda (VILLA-RODRÍGUES et al., 2011). 60 Figura 20 – Cinzas (%) em pastas de abacate com e sem adição de probióticos ao longo de 40 dias de armazenamento refrigerado (2 ± 2 °C e 45,5 ± 3 %). Verificou-se diferença significativa no teor de lipídeos na interação dos fatores estudados (Figura 21), contudo somente a pasta sem probióticos apresentou significância. Ocorreu diminuição no teor de lipídeos nessa formulação (14,28 para 12,26 %). Enquanto a versão da pasta de abacate enriquecida com probióticos manteve seus teores estatisticamente iguais durante o armazenamento. Vários fatores podem iniciar a decomposição oxidativa, como tratamentos térmicos, radiação ionizante, ou iniciação química através de íons metálicos. O principal efeito da oxidação no armazenamento que pode ter ocorrido na pasta de abacate é a peroxidação lipídica, já que o abacate é uma fruta rica em lipídeos (ALVES et al., 2010). Figura 21 – Lipídeos (%) em pastas de abacate com e sem adição de probióticos ao longo de 40 dias de armazenamento refrigerado (2 ± 2 °C e 45,5 ± 3 %). 0 0,5 1 1,5 2 0 10 20 30 40 C in z a s ( % ) Período de armazenamento (dias) Y= 1,72-0,033x+0,0017x²-0,000023x³ (R²=0,45) 8 9 10 11 12 13 14 15 0 10 20 30 40 L ip íd e o s ( % ) Perído de armazenamento (dias) Com probióticos (ns) Sem probióticos (Y=14,66-0,27x+0,005x² R²= 0,83)) 61 Outro fator que provavelmente aconteceu, segundo Villa-Rodrígues et al., 2011, é que após a colheita a produção de espécies reativas de oxigênio continua ocorrendo normalmente. Então essa redução no teor de lipídios poderia estar relacionada a proteção conferida contra reações oxidativas, não ocorrendo no produto com probiótico. Para o açúcar redutor (Figura 22) observou-se tendência de incremento dos teores até o vigésimo dia de armazenamento, de 8,71 para 11,84 % na pasta com probiótico e 8,05 para 11,17 % na versão sem probiótico, seguida de redução aos 40 dias de armazenamento. As bactérias láticas separam os dissacarídeos (sacarose) em monossacarídeos (açúcar redutor) para converte-los em ácido lático (KUIKMAN, O’CONNOR, 2015), como verificado no presente trabalho. Analisando as Figuras 22 e 23 é possível perceber que ocorreu diminuição da sacarose juntamente com aumento do açúcar redutor. Porém, essa mesma tendência aconteceu com a pasta de abacate sem probióticos, o que pode ser explicado pela quebra dos polissacarídeos em monossacarídeos com o período de armazenamento (CHITARRA; CHITARRA, 2005). A maior quantidade de sacarose, no início do período de armazenamento das pastas de abacate, em relação aos açucares redutores é consequência da adição de açúcar ao produto. Figura 22 – Açúcar redutor em pastas de abacate com e sem adição de probióticos ao longo de 40 dias de armazenamento refrigerado (2 ± 2 °C e 45,5 ± 3 %). 0 2 4 6 8 10 12 14 0 10 20 30 40 A ç ú c a r re d u to r (% ) Período de armazenamento (dias) Com probióticos (Y=8,45+0,31x-0,011x²+0,0001x³(R²=0,63)) Sem probióticos (Y=7,69+0,44x-0,02x²+0,00027x³ (R²=0,78)) 62 Nos teores de sacarose durante o período de armazenamento (Figura 23) observou-se redução da concentração até o vigésimo dia de armazenamento, em ambas as pastas de abacate, corroborando com os resultados dos teores de açúcar redutor (Figura 22), sugerindo quebra dos polissacarídeos em monossacarídeos. Em média a pasta sem probióticos apresentaram maiores teores de sacarose durante todo o período de prateleira, provavelmente devido a não adição de probióticos em sua formulação, que contribuem para a quebra dos açúcares. Figura 23 – Sacarose (%) em pastas de abacate com e sem adição de probióticos ao longo de 40 dias de armazenamento refrigerado (2 ± 2 °C e 45,5 ± 3 %). Os açúcares totais são a soma dos açúcares solúveis presentes no tecido vegetal (redutores e não redutores). A presença deles contribui para as características de “flavor” e conferência de sabor doce ao produto (CHITARRA; CHITARRA, 2005). As médias de 20 % de açúcares totais das pastas de abacate representa um produto doce, que tende a ser agradável para o paladar dos consumidores. Verificou-se interação das pastas de abacate com o período de armazenamento (Figura 24), portanto, a presença dos L.rhamnosus, assim como o tempo, interferiu na concentração de açúcar, apresentando incremento na pasta de abacate sem probiótico (18,86 para 22,09 %) e na enriquecida com probiótico (19,21 para 20,83 %). O aumento de açúcar total com o passar do tempo, pode ser devido a processos biossintéticos ou pela degradação de polissacarídeos (CHITARRA; CHITARRA, 2005). Em estudo de Mattietto; Lopes; Mezezes, 2007, houve diminuição de açúcares totais em néctar de cajá e umbu, ao contrário do ocorrido no presente trabalho. 0 2 4 6 8 10 12 14 0 10 20 30 40 S a c a ro s e ( % ) Período de armazenamento (dias) Com probióticos (Y= 11,11-0,62x+0,032x²-0,00042x³ (R²=0,48)) Sem probióticos (Y= 11,90-0,66x+0,036x²-0,00052x³ (R²=0,60)) 63 Figura 24 – Açúcar total (%) em pastas de abacate com e sem adição de probióticos ao longo de 40 dias de armazenamento refrigerado (2 ± 2 °C e 45,5 ± 3 %). Não observou-se influência no teor de fibras pela adição de probióticos na pasta de abacate e na interação dos fatores estudados (Tabela 13). Foram observados teores de fibras de 4,06 a 6,69 % na pasta de abacate. A presença de fibras na pasta de abacate é de extrema importância, já que ela não é digerida pela enzimas mas sim fermentada pela flora intestinal, servindo como alimento para os Lactobacillus, dessa forma, atuando como prebiótico (VRESE; SCHREZENMEIR, 2008). Tabela 13 – Fibras (%) em pastas de abacate com e sem adição de probióticos ao longo de 40 dias de armazenamento refrigerado (2 ± 2 °C e 45,5 ± 3 %). Armazenamento (dias) Pasta de abacate Com probióticos Sem probióticos 0 4,20 4,06 10 5,47 4,50 25 5,47 6,69 40 4,70 5,03 Média 4,96 5,07 C.V. (%) 17,29 As médias do tratamento e interação não foram significativas entre si a 5% de significância pelo teste de Tukey. Durante o período de armazenamento da pasta de abacate ocorreu um pequeno aumento na concentração dessas fibras (Figura 25). 0 5 10 15 20 25 0 10 20 30 40 A ç ú c a r to ta l (% ) Período de armazenamento (dias) Com probióticos (Y=20,15-0,34x+0,023x²-0,00033x³ (R²=0,48)) Sem probióticos (Y=20,22-0,25x+0,018x²-0,00028x³ (R²= 0,58)) 64 Figura 25 – Fibras (%) em pastas de abacate com e sem probióticos ao longo de 40 dias de armazenamento refrigerado (2 ± 2 °C e 45,5 ± 3 %). Para o teor de proteínas (Tabela 14) não houve diferença estatística para as pastas com e sem L.rhamosus, armazenamento e na interação (tratamento x armazenamento). Foram observados teores de proteínas de 2,43 a 2,46 % nas formulações de pasta de abacate. As frutas contém baixos teores de proteínas, não sendo nutricionalmente significativo, mas apresenta funções nos mecanismos metabólicos (CHITARRA; CHITARRA, 2005). Contudo houve um pequeno aumento em relação a polpa de abacate provavelmente pela adição do cacau e da lecitina. Tabela 14 – Proteínas (%) em pastas de abacate com e sem adição de probióticos ao longo de 40 dias de armazenamento refrigerado (2 ± 2 °C e 45,5 ± 3 %). Armazenamento (dias) Pasta de abacate Com probióticos Sem probióticos 0 2,43 2,45 40 2,46 2,45 Média 2,44 2,45 C.V. (%) 3,51 As médias do tratamento e interação não foram significativas entre si a 5% de significância pelo teste de Tukey. 4.5 Compostos bioativos nas pastas de abacate Para os teores de compostos fenólicos da p