RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta tese será disponibilizado somente a partir de 22/10/2021. PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA MOTRICIDADE (Biodinâmica da Motricidade Humana) CAROLINA CABRAL SANTOS PAPEL DO TOLL LIKE RECEPTOR 4 (TLR-4) NA RESPOSTA LIPOLÍTICA MEDIADA PELO EXERCÍCIO EXAUSTIVO AGUDO Presidente Prudente – SP 2021 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA Faculdade de Ciências e Tecnologia Campus de Presidente Prudente CAROLINA CABRAL SANTOS PAPEL DO TOLL LIKE RECEPTOR 4 (TLR-4) NA RESPOSTA LIPOLÍTICA MEDIADA PELO EXERCÍCIO EXAUSTIVO AGUDO Tese apresentada ao FCT- Universidade Estadual Paulista Campus de Presidente Prudente, para Defesa Pública de Doutorado em Ciências da Motricidade, área Biodinâmica da Motricidade Humana e linha de pesquisa em Fisiologia Endócrino-Metabólica e Exercício. Orientador: Prof. Dr. Fabio Santos de Lira Co-orientador: Prof Dr José Cesar Rosa Neto Presidente Prudente – SP 2021 C117p Cabral-Santos, Carolina Papel do Toll-like Receptor 4 (TLR-4) na resposta lipolítica mediada pelo exercício exaustivo agudo / Carolina Cabral-Santos. -- Presidente Prudente, 2021 64 p. : il., tabs., fotos, mapas Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista (Unesp), Faculdade de Ciências e Tecnologia, Presidente Prudente Orientador: Fabio Santos Lira Coorientador: Jose Cesar Rosa Neto 1. Toll like receptor 4. 2. Exercicios Fisicos. 3. Inflamação. I. Título. Sistema de geração automática de fichas catalográficas da Unesp. Biblioteca da Faculdade de Ciências e Tecnologia, Presidente Prudente. Dados fornecidos pelo autor(a). Essa ficha não pode ser modificada. AGRADECIMENTOS Agradeço aos meus familiares e amigos pelo incentivo e compreensão. Ao meu orientador Prof. Dr. Fábio Santos de Lira e Prof. Dr. José César Rosa Neto, que me concederam a oportunidade de ampliar a minha formação acadêmica, me auxiliando no processo desde a elaboração até a execução deste estudo. Aos doutorandos, mestrandos e ICs membros do LAFICE (FCT-UNESP) e do Laboratório de Imunometabolismo (ICB-USP), que participaram de forma direta ou indiretamente, pela disposição e ajuda nas coletas de dados, analises e demais processos que propiciaram a realização desse estudo. Agradeço a todo apoio prestado pela Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) sob o Processo n° 2015/26148-0, para o desenvolvimento dessa pesquisa e pela bolsa de estudos. Epígrafe “A mente que se abre a uma nova ideia jamais voltará a seu tamanho original” - Albert Einsten RESUMO O exercício exaustivo, realizado de maneira contínua em intensidade moderada, pode acometer em elevação nas concentrações de ácidos graxos livres, principalmente mediados pela resposta neuroendócrina. Concomitante a esta condição, foi postulado que a endotoxemia favorece a ativação da resposta inflamatória via receptores do tipo Toll-like receptor 4 (TLR-4) em diferentes tipos celulares, favorecendo a produção de citocinas como a Interleucina 6 (IL-6) e Fator de necrose tumoral alfa (TNF-α). Adicionalmente, especula- se que a ativação do TLR-4 durante exercício exaustivo pode favorecer o processo de lipólise no tecido adiposo aumentando assim a disponibilidade de ácidos graxos circulantes, no entanto, essa hipótese nunca foi testada. Frente a esta questão, o objetivo do presente projeto foi verificar a relação do TLR-4 e o processo de lipólise induzido pelo exercício exaustivo. Foram utilizadas duas linhagens de animais: Wild Type C57BL/6J e TLR-4 nocaute subdivididos em 4 grupos (n=8 por grupo), quais sejam: 1- grupo controle não exercitado (Rest); 2- grupo exercício exaustivo com eutanásia imediatamente após exercício (0h); 3- exercício exaustivo 2h após exercício (2h); 4- exercício exaustivo 6h após exercício (6h). A sessão de exercício consistiu de 50 minutos de corrida em esteira rolante a 60% da Velocidade Máxima, imediatamente seguida de incremento de 1m/min até a exaustão voluntária. Foram avaliados o perfil metabólico (concentrações de glicose, lactato e ácidos graxos livres) e inflamatório dos tecidos adiposos mesentérico e Retroperitoneal) para determinar o papel do TLR-4. O grupo Wild-Type apresenou uma diminuição nas concentrações de ácidos graxos livres circulantes 6h após o exercício (p=0,029; η2=0,136) que não foi observado no grupo TLR-4 nocaute. O grupo TLR-4 apresentou valores elevados no conteúdo de triacilglicerol muscular imediatamente após o exercício (p=0,0001; η2=0,370), com decaimento continuo até 6h (p=0,040; η2=0,142). Além disso, o grupo TLR- 4 nocaute não apresentou elevação nas concentrações de IL-10 após o exercício quando comparado com o grupo Wild-Type (p=0,002) no depósito mesentérico. Tomados em conjunto, nossos dados demonstram importante participação do TLR-4 sobre a utilização do substrato energético. Além disso, observou-se uma possível participação do TLR-4 atuando na liberação aguda das citocinas TNF-α e IL-10. Palavras chaves: Toll-like receptor 4, exercício, metabolismo, inflamação, fatores transcricionais. Abstract Role of Toll Like Receptor 4 in acute exhaustive exercise-mediated lipolytic response. The exhaustive exercise, carried out at moderate intensity, can affect elevations in free fatty acid concentrations, mainly mediated by the neuroendocrine response. Concomitant to this condition, it was postulated that endotoxemia favor the activation of the inflammatory response via Toll-Like Receptors (TLR), specifically TLR-4, in different cell types, favoring the production of cytokines such as interleukin 6 (IL-6) and Tumoral necrosis factor alpha (TNF-α). Additionally, it is speculated that the activation of TLR-4 during exhaustive exercise may favor the lipolysis process in adipose tissue thus increasing the availability of circulating fatty acids, however, this hypothesis has never been tested. In view of this, the objective of the present project will be to verify the relationship of TLR-4 and the process of lipolysis induced by the exhaustive exercise. To do this, the project will use two animal strains: C57BL/6J and TLR-4 knockout animal. For each animal lineage 4 subgroups will be formed, containing 8 animals in each one, namely: 1- sedentary control group (Rest); 2- exhaustive exercise group with euthanasia immediately after exercise (0h); 3- exhaustive exercise 2h after exercise (2h); 4- exhaustive exercise 6h after exercise (6h). The metabolic profile (glucose, lactate and free fatty acid concentrations) and inflammatory activity, as well as activity of lipolytic enzymes in the mesenteric and retroperitoneal adipose tissue, will be evaluated to determine the role of TLR-4. Saline group showed a decreased circulating free fatty acid concentration 6h after exercise (p=0.029; η2=0.136) that was not observed in the TLR-4 knockout group. The TLR-4 group showed high values in muscle-triacylglycerol content immediately after exercise (p=0.0001; η2=0.370), and that continuously decay until 6h (p=0.040; η2=0.142). Furthermore, the TLR-4 knockout group showed no increases in IL-10 levels after exercise when compared to Saline group (p=0.002) in the mesenteric deposit. In summary, our data demonstrate an important role of TLR-4 on substrate preferences. Furthermore, it was observed a possible participation of TLR-4 in the acute release role of the cytokines TNF-α and IL-10. Keywords: Toll-like receptor 4, exercise, metabolism, inflammation, transcriptional factors. LISTA DE FIGURAS Figura 1. Lipólise do tecido adiposo.........….......…………………………...…………...21 Figura 2. Concentrações de citocinas e liberação de glicerol PPAR-α ...…...…………...24 Figura 3. Desenho experimental ...……………………...…………...…………..............31 Figura 4. Histologia....…………..........……………………………………...…………...38 Figura 5. Efeito da deleção do TLR-4 sobre as concentrações sanguíneas de lactato, glicose, triacilglicerol e ácidos graxos livres de animais Wild Type e TLR-4 knockout após exercício exaustivo agudo……………………………………………………………...…39 Figura 6. Conteúdo de triacilglicerol no músculo gastrocnêmio após exercício exaustivo agudo…………………………………………………………………………………...…40 Figura 7. Dosagem da enzima lactato desidrogenase após exercício exaustivo agudo…..41 Figura 8. Conteúdo de glicogênio do músculo sóleo e do fígado em camundongos após exercício exaustivo..........………………………………………………………...……….42 Figura 9. Ensaio de lipólise basal ......................................................................................42 Figura 10. Efeito da deleção do TLR-4 sobre as concentrações de citocinas TNF-α, IL-6 e IL-10 de animais Wild Type e TLR-4 nocaute após exercício exaustivo agudo……………………...................................................................................................44 Figura 11. Figura esquemática das diferentes vias com participação na lipólise durante o exercício exaustivo ..........................................................................……………………...46 Figura 12. Concentrações sanguíneas de lactato, glicose, triacilglicerol e ácidos graxos livres de animais Wild Type tratados com beta-bloqueador adrenérgico (10mg/kg de peso de Propranolol) após exercício exaustivo agudo………………..……………………...…62 Figura 13. Concentrações de citocinas TNF-α, IL-6 e IL-10 de animais Wild Type tratados com beta-bloqueador adrenérgico (10mg/kg de peso de Propranolol) após exercício exaustivo agudo................................................................................……………………...63 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Parâmetros de composição corporal e de desempenho no exercício exaustivo das amostras……………….........................……………………………………......................36 Tabela 2. Parâmetros de composição corporal e de desempenho no exercício exaustivo do grupo Propranolol.........…………………………………………………….......................60 LISTA DE ABREVIAÇÕES AGL Ácidos graxos livres AMPK Proteína quinase ativada por AMP ATGL Lipase de triacilglicerol do adipócito ATP Adenosina trifosfato EROS Espécies reativas de oxigênio GLUT-4 Transportador de glicose 4 HSL Lipase hormônio sensível IL-6 Interleucina 6 IL-10 Interleucina 10 IL-1β Interleucina 1 beta IRS-1 Substrato do receptor de insulina 1 JNK Enzima c-Jun N-terminal quinase KOH Hidróxido de potássio LDH Lactato Desidrogenase LPL Enzima lipase de lipoproteína LPS Lipopolissacarídeos MGL Lipase Monoacilglicerol MEAT Tecido adiposo mesentérico MyD88 Gene de diferenciação mielóide de resposta primária 88 Na2SO4 Sulfato de sódio NF-κB Fator nuclear kappa B PDH Complexo piruvato desidrogenase PLIN1 Perilipinas PI3K Enzima Fosfatidilinositol-3-quinase PKA Proteina quinase A REAT Tecido adiposo retroperitoneal TLR-4 Toll Like Receptor 4 TNF-α Fator de Necrose Tumoral Alfa TRAF-6 Fator associado ao receptor de necrose tumoral 6 SUMÁRIO RESUMO ................................................................................................................................... 7 ABSTRACT .......................................................................................................................... 8 LISTA DE FIGURAS ......................................................................................................... 10 LISTA DE TABELAS ........................................................................................................ 12 LISTA DE ABREVIAÇÕES ............................................................................................. 13 1. INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 16 2. REVISÃO DE LITERATURA ...................................................................................... 20 3. OBJETIVOS ................................................................................................................... 29 3.1. Objetivos Gerais ................................................................................................ 29 3.2. Objetivos Específicos ........................................................................................ 29 4. MATERIAIS E MÉTODOS .......................................................................................... 29 4.1. Animais .............................................................................................................. 29 4.2. Desenho exeprimental ....................................................................................... 30 4.3. Protocolo de Velocidade Máxima ............................................................................ 31 4.4. Sessão de Exercício Exaustivo ................................................................................. 32 4.5. Análise Plasmática .................................................................................................... 32 4.6. Coleta Tecidual ......................................................................................................... 32 4.7. Ensaio de Lipólise .................................................................................................... 33 4.8. Histologia.................................................................................................................. 33 4.9. Conteúdo de Triacilglicerol Muscular ...................................................................... 34 4.10. Conteúdo de Glicogênio Hepático e Muscular ....................................................... 35 4.11. Análise Estatística................................................................................................... 35 5. RESULTADOS ...................................................................................................................... 36 5.1. Composição Corporal e Performance ............................................................... 36 5.2. Perfil Metabólico ...................................................................................................... 38 5.3. Conteúdo de Triacilglicerol Muscular ...................................................................... 40 5.4. Atividade da Lactato Desidrogenase ........................................................................ 41 5.5. Conteúdo de Glicogênio ........................................................................................... 41 5.6. Ensaio de Lipólise .................................................................................................... 42 5.7. Concentrações de citocina ........................................................................................ 43 6. DISCUSSÃO ................................................................................................................... 46 7. CONCLUSSÃO .............................................................................................................. 55 8. REFERÊNCIAS.............................................................................................................. 56 9. MATERIAL SUPLEMENTAR..................................................................................... 61 1. INTRODUÇÃO O exercício físico agudo promove perturbações no metabolismo e em mediadores lipídicos, induzindo a transcrição de genes e a síntese de proteínas que influenciam diretamente na produção de citocinas e adipocinas, levando à uma resposta inflamatória local e sistêmica (Teixeira et al., 2016) sendo estas secreções dependentes da intensidade, duração e quantidade de massa muscular envolvida no exercício físico. Durante a realização do exercício aeróbio com intensidade moderada de 65% a 85% do volume de oxigênio máximo (VO2máx), há o estimulo da atividade do sistema nervoso simpático e a liberação de catecolaminas circulantes, que aumentam linearmente com a duração do exercício. Este aumento nas concentrações de catecolaminas visa realizar ajustes cardiovasculares, tais como o aumento da frequência cardíaca e pressão sanguínea, e a disponibilização de substratos energéticos (Zouhal et al., 2008). A regulação da lipólise é mediada por fatores hormonais (como a insulina e o glucagon) e/ou fatores neurais e ativação das catecolaminas adrenalina e noradrenalina - liberadas na corrente sanguínea em resposta ao estresse físico, que estimulam os receptores β-adrenérgicos para que possam mobilizar ácidos graxos (AG) do tecido adiposo branco, para que ocorra a manutenção da atividade (Stallknecht et al., 2001). A ativação dos receptores adrenérgicos nos tecidos-alvos pelas catecolaminas resulta na interação entre as proteínas estruturais que recobrem as gotículas lipídicas, diferentes lipases e seus coativadores (Goodman, 2009). Assim, as proteínas estruturais conhecidas como perilipinas (PLIN1) pertencem à família de fosfoproteínas hidrofóbicas e atuam como uma barreira à ação das lipases. Quando são fosforiladas pela proteína quinase A (PKA), as PLIN1 perdem a sua capacidade de bloqueio, facilitando assim a ação das lipases em hidrolisar o TAG da gotícula lipídica e liberar as moléculas de AGL e glicerol (Nielsen et al., 2014) e disponibilizando esse substrato na corrente sanguínea. Desse modo, a fosforilação aumentada da lipase de triacilglicerol do adipócito (ATGL), por exemplo, inicia a lipólise hidrolisando o triacilglicerol (TAG) que resultará em diacilglicerol. Sequencialmente, o diacilglicerol é hidrolisado pela lipase hormônio sensível (HSL) em monoacilgricerol. Posteriormente, este monoacilgricerol é hidrolisado pela lipase de monoglicerideos (MGL) em glicerol (Mcgarr et al., 1976), sendo que cada um desses processos resulta na liberação de uma molécula AGL. O tecido adiposo branco é um tecido especializado, cuja principal função é a reserva de energia e armazenamento de gorduras, entretanto, observou-se que os adipócitos são células altamente secretoras - devido a sua capacidade de se comunicar com outros tecidos e o sistema imunológico por meio de secreção de peptídeos, lipídeos e miRNAs - e que a heterogeneidade dos seus depósitos contribui diferentemente tanto para a homeostase quanto a modulação da inflamação (Goodman, 2009; Kahn et al., 2019). Diante do exposto, Rosa- Neto et al (2009) observaram que após uma sessão de exercício exaustivo (corrida a 70% Vmáx por 50 min e incremento de 1 m/min a cada minuto até a exaustão) a expressão de mRNA e o conteúdo protéico de Interleucina 10 (IL-10) e a razão Fator de necrose tumoral alfa e IL-10 (IL-10/TNF-α) induziu um efeito anti-inflamatório nos músculos extensor longo dos dedos (EDL) e sóleo, especialmente nas fibras do tipo 2. Todavia, os autores observaram efeito pró-inflamatório das citocinas Interleucina 6 (IL-6) e TNF-α no tecido adiposo, as quais possivelmente contribuiriam para o aumento da lipólise, aumentando a disponibilidade de substrato para os músculos esqueléticos para a manutenção da atividade contrátil durante o exercício. Posteriormente, o mesmo grupo publicou um estudo demonstrando que, no tecido adiposo retroperitoneal, as concentrações de Toll-like receptor 4 (TLR-4), o gene 88 da resposta primária de diferenciação mieloide (Myd-88) e IkBα permaneceram elevadas até 2 horas após o exercício, enquanto que no tecido adiposo mesentérico o receptor 6 associado ao fator de necrose tumoral (TRAF-6) Myd-88 permaneceram elevados por até 6 horas em comparação com o grupo não exercitado, demostrando que o aumento da liberação de citocinas pró-inflamatórias nos tecidos adiposos poderia ser mediado via sinalização de TLR-4, levando a aumentos na atividade nuclear de fator de transcrição via fator nuclear kappa B (NF-κB). Neste contexto, destaca-se que os TLRs são receptores presentes na membra plasmática que desempenham papel crucial na defesa do hospedeiro contra os processos infecciosos e inflamatórios, na manutenção da homeostase e em diversas doenças. São responsáveis pelo reconhecimento dos padrões moleculares associados a patógenos expressos por um amplo espectro de agentes infecciosos, como bactérias gram-positivas e gram-negativas, vírus DNA e RNA, protozoários e fungos, e agem através da ativação da resposta imunológica pelos fatores de transcrição e a produção de citocinas pró-inflamatórias (Wu et al., 2015). Tem sido demonstrado que o LPS se acopla aos receptores TLR-4 ativando a produção de polipeptídeos com papel imunorregulatório - denominados citocinas pró-inflamatórias - principalmente o TNF-α (representado pela Figura 1) (Rosa Neto et al., 2009; Teixeira et al., 2016). Nesse contexto, foi demonstraram que camundongos nocaute para TLR4 ou com uma mutação inativadora no gene que codifica essa proteína, ficaram protegidos da resistência à insulina e a ativação das serinas quinases IKKβ e JNK, induzidas por uma dieta hiperlipídica, sugerindo que o TLR-4 seja provavelmente o modulador chave no cross-talk entre a via metabólica e inflamatória (Kim et al., 2007; Nguyen et al., 2007). Entretanto, Lira et al (2008) após protocolo de treinamento crônico (corrida em esteira 5 dias por semana a 55-65% do VO2max, durante 8 semanas) observou-se o aumento na concentração de IL-10 (1,5 vezes) e da razão IL-10/TNF-α no tecido adiposo mesentérico do grupo treinado quando comparado com os animais sedentários, sugerindo que esse efeito pró-inflamatório observado no tecido adiposo seria temporário. Os autores observaram ainda que esse efeito anti-inflamatório do treinamento físico estava associado ao recrutamento reduzido de macrófagos M1 e, consequentemente, redução de citocinas pró-inflamatórias no tecido adiposo de camundongos (Lira et al., 2008). Portanto, hipotetizamos que durante exercício, principalmente exaustivo, tais citocinas favoreceriam o processo lipolítico, aumentando a disponibilidade de ácidos graxos liberados para a corrente sanguínea e que podem ser captados com substrato à musculatura esquelética para manutenção da atividade contrátil, criando um “looping” imuno-metabólico contínuo. Além disso, o excesso de ácidos graxos livres circulantes podem induzir a resposta parácrina e a liberação de citocinas inflamatórias potencializando o processo de lipólise, uma vez que essas citocinas elevam a atividade da ATGL e HSL, contribuindo para o aumento de mais AGL e gerando assim o ciclo lipólise-inflamação (Teixeira et al, 2016). 54 7. CONCLUSÃO Além disso, para melhor responder nossos objetivos, a linhagem de animais C57BL/6J foi subdividida em dois tratamentos: 1) grupo Propranolol (Sigma Alderich®) - que recebeu 10 mg/kg de peso corporal de Cloridrato de DL-Propranol, bloqueador beta- adrenérgico pelo método de gavagem 30 minutos antes do protocolo de exercício; e 2) grupo Salina - que recebeu a mesma dosagem de salina (controle), conforme a Figura 4. 55 8. REFERÊNCIAS Al-Majed, A. A., Bakheit, A. H. H., Abdel Aziz, H. A., Alajmi, F. M., & AlRabiah, H. (2017). Propranolol. Profiles Drug Subst Excip Relat Methodol. 2017;42:287-338. doi: 10.1016/bs.podrm.2017.02.006. Brooks GA, Dubouchaud H, Brown M, Sicurello JP, Butz CE. Role of mitochondrial lactate dehydrogenase and lactate oxidation in the intracellular lactate shuttle. Proceedings of the National Academy of Sciences Feb 1999, 96 (3) 1129-1134; DOI: 10.1073/pnas.96.3.1129 Cawthorn WP, Sethi JK. TNF-alpha and adipocyte biology. 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Ensaio de Lipólise Amostras dos depósitos mesentérico e retroperitoneal do tecido adiposo dos animais foram incubadas em tampão Krebs/Riger/Fosfato pH7,4 contendo BSA (20mM) e glicose (5mM) por 30 minutos a 37ºC com a ausência (basal) ou presença do agonista β-adrenérgi... 4.8. Histologia O gastrocnêmio da pata direita foi coletado e fixado com OCT (Tissue ‐ Tek®; Sakura Finetek, CA) e Tragacanth (Sigma ‐ Aldrich, MO) na posição vertical e congelado em nitrogênio líquido. Cortes transversais (10 µm de espessura) foram obtidos em criost... Para investigação histológica, a captura de imagens de alta qualidade (2048 × 1536 pixels) obtidas do microscópio de luz Nikon Eclipse E800 deu-se por câmera digital (Evolution, Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD) e as áreas de perímetro do músculo... 4.9. Conteúdo de Triacilglicerol Muscular 4.10. Conteúdo de glicogênio hepático e muscular 4.9. Análise estatística 5. RESULTADOS 6. DISCUSSÃO 7. CONCLUSÃO 8. REFERÊNCIAS 9. 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