1 Michelle Cardoso Coimbra Produção de etanol utilizando cascas de banana e laranja por co-fermentação de Zymomonas mobilis e Pichia stipitis São José do Rio Preto 2015 2 Michelle Cardoso Coimbra Produção de etanol utilizando cascas de banana e laranja por co- fermentação de Zymomonas mobilis e Pichia stipitis Tese apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Engenharia e Ciência de Alimentos, junto ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia e Ciência de Alimentos, área de concentração - Ciência e Tecnologia de Alimentos, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto. Orientador: Prof. Dr. Crispin Humberto Garcia-Cruz São José do Rio Preto 2015 3 Coimbra, Michelle Cardoso Produção de etanol utilizando cascas de banana e de laranja por co-fermentação de Zymomonas mobilis e Pichia stipitis / Michelle Cardoso Coimbra. - São José do Rio Preto, 2015 125 f. : il. ; tabs. Orientador: Crispin Humberto Garcia-Cruz Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas 1. Biotecnologia. 2. Etanol - Indústria. 3. Resíduos industriais. 4.Biomassa. 5. Zymomonas mobilis. 6. Pichia stipitis. I. Garcia-Cruz, Crispin Humberto. II. Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas. III. Título. CDU - 661.722 Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca do IBILCE UNESP - Campus de São José do Rio Preto 4 Michelle Cardoso Coimbra Produção de etanol utilizando cascas de banana e laranja por co- fermentação de Zymomonas mobilis e Pichia stipitis Tese apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Engenharia e Ciência de Alimentos, junto ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia e Ciência de Alimentos, área de concentração - Ciência e Tecnologia de Alimentos, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto. Comissão Examinadora Prof. Dr. Crispin Humberto Garcia-Cruz UNESP – São José do Rio Preto Orientador Prof. Dr. Rodrigo Simões Ribeiro Leite UFGD – Dourados Prof. Dr. Marcos de Lucca Junior IFSP – Barretos Prof. Dr. Vanildo Luiz Del Bianchi UNESP – São José do Rio Preto Prof. Dr. Maurício Boscolo UNESP – São José do Rio Preto São José do Rio Preto 11 de setembro de 2015 5 Aos meus pais, Edna e Aristides, por todo apoio e confiança, dedico. 6 AGRADECIMENTOS Agradeço a Deus por me guiar, concedendo-me persistência, intuição e, sobretudo, sabedoria para compreensão do que quero, do que posso e do que consigo; Ao querido orientador, Prof. Dr. Crispin Humberto Garcia Cruz, pelo privilégio e oportunidade concedidos, e, sobretudo, pela confiança, orientação, amizade e apoio para realização deste trabalho; À Fapesp, pela concessão da bolsa de estudos no país (Proc. nº 2011/07147-1), pela bolsa de pesquisa no exterior (Proc. nº 2013/23525-1) e pela concessão de auxílio pesquisa (Proc. nº 2011/51128-1), que possibilitou a aquisição de muitos dos equipamentos indispensáveis para a execução deste trabalho; A todas as colegas do laboratório e companheiras nas pesquisas, em especial Juliana Guerra, Juliana Ferreira, Vidiany, pelo apoio nas análises; Aos professores e funcionários do Departamento de Engenharia e Tecnologia de Alimentos, com quem convivi durante o doutorado, pela constante demonstração de amizade; À Técnica do Laboratório, Tânia, pelo apoio, carinho, amizade e dedicação; A toda minha família, especialmente meus queridos pais, a quem tanto amo e me orgulho e sempre me deram muito carinho, estímulo e dedicação em todos os momentos da minha vida; Aos grandes amigos que conquistei na pós-graduação, Bruna, Crislene, Gisele, Juliana G., Juliana F., Lívia, Luana, Vanessa, Vidiany; Ao Rafael, que muito me ajudou, acompanhou e torceu em muitos momentos, tornando o caminho mais fácil; A todos os professores, técnicos e alunos do laboratório Ciemat (Madrid), em especial às professoras Mercedes Ballesteros e Paloma Manzanares, que tão bem me receberam e muito me ensinaram durante meu estágio; E e todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização deste trabalho. 7 SUMÁRIO RESUMO.............................................................................................................................16 ABSTRACT...........................................................................................................................17 1. INTRODUÇÃO.................................................................................................................18 2. OBJETIVOS......................................................................................................................20 2.1. Objetivo geral..............................................................................................................20 2.2. Objetivos específicos...................................................................................................20 3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA................................................................................................21 3.1. Crise energética e bioetanol........................................................................................21 3.2. Aplicações e vantagens do etanol...............................................................................22 3.3. Processo convencional de produção de etanol...........................................................24 3.4. Uso de biomassa para produção de etanol.................................................................25 3.4.1. Celulose....................................................................................................................28 3.4.2. Hemicelulose............................................................................................................29 3.4.3. Lignina......................................................................................................................30 3.5. Resíduos de banana e produção de bioetanol............................................................31 3.6. Resíduos de laranja e produção de bioetanol.............................................................32 3.7. Tratamento dos resíduos lignocelulósicos..................................................................33 3.7.1. Hidrólise ácida..........................................................................................................34 3.7.2. Hidrólise enzimática.................................................................................................35 3.7.3. Formação de compostos inibidores da fermentação...............................................36 3.8. Microrganismos utilizados para produção de bioetanol e co-culturas.......................38 4. MATERIAL E MÉTODOS..................................................................................................40 4.1. Preparo das cascas de banana e laranja......................................................................40 4.2. Pré-tratamento do substrato: hidrólise ácida.............................................................43 4.3. Hidrólise enzimática....................................................................................................44 4.4. Concentração e desintoxicação dos hidrolisados........................................................45 4.5. Fermentação...............................................................................................................46 4.5.1. Microrganismos........................................................................................................46 4.5.2. Meios de cultura......................................................................................................46 4.5.2.1. Meios de crescimento e manutenção das culturas..............................................46 8 4.5.2.2. Meio sintético para fermentação..........................................................................47 4.5.2.3. Meio de cascas de banana e meio de cascas de laranja para fermentação..........47 4.5.3. Condições de fermentação.......................................................................................47 4.5.3.1. Preparo do pré-inóculo.........................................................................................47 4.5.3.2. Pré-fermentação...................................................................................................48 4.5.3.3. Padronização do inóculo.......................................................................................48 4.6. Métodos analíticos......................................................................................................49 4.6.1. Construção da curva de calibração para determinação da concentração celular a partir de suspensões de Zymomonas mobilis CCT 4494..........................................49 4.6.2. Construção da curva de calibração para determinação da concentração celular a partir de suspensões de Pichia stipitis CCT 2617.....................................................50 4.6.3. Construção da curva de calibração para determinação da concentração celular a partir de suspensões de Z. mobilis CCT 4494 e P. stipitis CCT 2617.........................51 4.6.4. Coleta e preparo das amostras durante a fermentação..........................................51 4.6.5. Determinação do pH................................................................................................51 4.6.6. Determinação da concentração celular...................................................................51 4.6.7. Determinação de etanol...........................................................................................52 4.6.8. Determinação de açúcares totais (AT).....................................................................52 4.6.9. Determinação de açúcares redutores (AR) .............................................................52 4.6.10. Determinação dos teores de compostos fenólicos................................................53 4.7. Análise estatística........................................................................................................53 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................................................55 5.1. Ensaios de hidrólise ácida com a casca de banana......................................................55 5.2. Ensaios de hidrólise enzimática com a casca de banana.............................................56 5.3. Ensaios de hidrólise ácida com a casca de laranja......................................................57 5.4. Hidrólise enzimática com a casca de laranja...............................................................58 5.5. Desintoxicação dos hidrolisados.................................................................................59 5.6. Fermentação com o meio sintético.............................................................................62 5.6.1. Crescimento celular na fermentação com meio sintético........................................62 5.6.2. pH final do caldo na fermentação com meio sintético.............................................65 5.6.3. Produção de etanol na fermentação com meio sintético........................................67 5.7. Fermentação com o meio de cascas de banana..........................................................73 9 5.7.1. Crescimento celular na fermentação com meio de cascas de banana....................73 5.7.2. pH final do caldo na fermentação com meio de cascas de banana.........................77 5.7.3. Produção de etanol na fermentação com meio de cascas de banana.....................80 5.8. Fermentação com o meio de cascas de laranja..........................................................86 5.8.1. Crescimento celular na fermentação com meio de cascas de laranja.....................86 5.8.2. pH final do caldo na fermentação com meio de cascas de laranja.........................89 5.8.3. Produção de etanol na fermentação com meio de cascas de laranja.....................91 5.9. Fermentação com o meio sintético em biorreator.....................................................96 5.10. Fermentação com o meio de cascas de banana em biorreator..............................100 6. CONCLUSÕES................................................................................................................104 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................................................106 ANEXO..............................................................................................................................118 10 LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Principais aplicações do etanol e de seus produtos................................... 24 Figura 2 - Processo de produção convencional de etanol.......................................... 25 Figura 3 - Produção de etanol a partir de material lignocelulósico........................... 26 Figura 4 - Representação estrutural da fibra lignocelulósica..................................... 26 Figura 5 - Estrutura do polímero de celulose............................................................. 28 Figura 6 - Estrutura do polímero de hemicelulose..................................................... 29 Figura 7 - Estrutura da macromolécula de lignina..................................................... 30 Figura 8 - Representação esquemática da ação das celulases sobre a celulose........ 36 Figura 9 - Cascas de banana em bandeja de alumínio para serem secas ao sol..................................................................................................... 41 Figura 10- Cascas de laranja em bandeja de alumínio para serem secas ao sol......... 41 Figura 11 - Cascas de banana secas ao sol por aproximadamente 24 h...................... 42 Figura 12 - Cascas de laranja secas ao sol por aproximadamente 24 h....................... 42 Figura 13 - Frascos Erlenmeyer contendo as cascas de banana seca e o ácido sulfúrico 5%, antes da hidrólise ácida........................................................ 43 Figura 14 - Meio de casca de banana, com 50 g/L de açúcares totais, (a) antes e (b) depois da desintoxicação........................................................................... 61 Figura 15 - Valores de pH final do caldo depois de 24, 48 e 72 h de fermentação com meio sintético................................................................................ 66 Figura 16 - Valores de pH final do caldo depois de 24, 48 e 72 h de fermentação com meio de cascas de banana.............................................................. 79 Figura 17 - Valores de pH final do caldo depois de 24, 48 e 72 h de fermentação com meio de cascas de laranja.............................................................. 91 Figura 18 - Biorreator com o meio sintético após 24 h do início da fermentação....... 97 Figura 19 - Forma de coleta das amostras nos diferentes tempos de fermentação em biorreator de 5 L................................................................................... 98 Figura 20 - Cinética do consumo de açúcar total, produção de etanol e crescimento celular da co-cultura de Z. mobilis e P. stipitis apresentada na fermentação conduzida em biorreator com meio sintético...................... 100 11 Figura 21 - Cinética do consumo de açúcar total, produção de etanol e crescimento celular da co-cultura de Z. mobilis e P. stipitis apresentada na fermentação conduzida em biorreator com meio de cascas de banana... 103 12 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Uso do etanol como combustível em alguns países..................................... 23 Tabela 2 - Comparação entre a hidrólise ácida e enzimática....................................... 34 Tabela 3 - Dosagem recomendada, pH e temperatura de atuação das enzimas fornecidas pela Novozymes Latin America Ltda........................................... 45 Tabela 4 - Variáveis independentes, codificadas, estudadas para o meio sintético e meio de cascas de banana e meio de cascas de laranja................................ 54 Tabela 5 - Açúcares totais (AT) e redutores (AR) (g/L) liberados nos ensaios de hidrólise ácida das cascas de banana........................................................... 55 Tabela 6 - Açúcares totais (AT) e redutores (AR) (g/L), liberados pela hidrólise ácida seguida de hidrólise enzimática, das cascas de banana.............................. 56 Tabela 7 - Açúcares totais (AT) e redutores (AR) (g/L) liberados nos ensaios de hidrólise ácida das cascas de laranja.......................................................... 58 Tabela 8 - Açúcares totais (AT) e redutores (AR) (g/L), liberados pela hidrólise ácida seguida de hidrólise enzimática, das cascas de laranja.............................. 58 Tabela 9 - Compostos fenólicos (g/L) e açúcares totais (AT) (g/L) antes e depois da desintoxicação dos meios com concentrações de açúcar de 50, 150 e 250 g/L)........................................................................................................ 59 Tabela 10 - Compostos fenólicos (g/L) e açúcares totais (AT) (g/L) antes e depois da desintoxicação dos meios de cascas de laranja com teores de açúcar de 50, 150 e 250 g/L......................................................................................... 60 Tabela 11 - Médias das triplicatas das 8 combinações e das 3 repetições no ponto central obtidas a partir do delineamento fracionado 24-1, para a resposta da biomassa (g/L) depois de 24, 48 e 72 h de fermentação com meio sintético............................................................................................... 63 Tabela 12 - Estimativa dos efeitos principais e valor de p referentes ao delineamento fracionado 24-1, para a resposta da biomassa depois de 24, 48 e 72 h de fermentação com meio sintético............................................................ 64 13 Tabela 13 - Médias das triplicatas das 8 combinações e das 3 repetições no ponto central obtidas a partir do delineamento fracionado 24-1, para o pH final do caldo depois de 24, 48 e 72 h de fermentação com meio sintético........ 65 Tabela 14 - Médias das triplicatas das 8 combinações e das 3 repetições no ponto central obtidas a partir do delineamento fracionado 24-1, para a produção de etanol (g/L) depois de 24, 48 e 72 h de fermentação com o meio sintético................................................................................................ 67 Tabela 15 - Médias das triplicatas das 8 combinações e das 3 repetições no ponto central obtidas a partir do delineamento fracionado 24-1, para a concentração de AT no meio (g/L) depois de 24, 48 e 72 h de fermentação com o meio sintético.............................................................. 71 Tabela 16 - Estimativa dos efeitos principais e valor de p referentes ao delineamento fracionado 24-1, para a produção de etanol depois de 24, 48 e 72 h de fermentação com o meio sintético......................................................... 72 Tabela 17 - Médias das triplicatas das 8 combinações e das 3 repetições no ponto central obtidas a partir do delineamento fracionado 24-1, para a resposta da biomassa (g/L) depois de 24, 48 e 72 h de fermentação com o meio de banana.................................................................................................. 74 Tabela 18 - Estimativa dos efeitos principais e valor de p referentes ao delineamento fracionado 24-1, para a resposta da biomassa depois de 24, 48 e 72 h de fermentação com o meio de banana...................................................... 76 Tabela 19 - Médias das triplicatas das 8 combinações e das 3 repetições no ponto central obtidas a partir do delineamento fracionado 24-1, para o pH final do caldo depois de 24, 48 e 72 h de fermentação com o meio de banana.......................................................................................................... 78 Tabela 20 - Médias das triplicatas das 8 combinações e das 3 repetições no ponto central obtidas a partir do delineamento fracionado 24-1, para a produção de etanol (g/L) depois de 24, 48 e 72 h de fermentação com o meio de banana.................................................................................................... 81 14 Tabela 21 - Médias das triplicatas das 8 combinações e das 3 repetições no ponto central obtidas a partir do delineamento fracionado 24-1, para a concentração de AT no meio (g/L) depois de 24, 48 e 72 h de fermentação com o meio de cascas de banana......................................... 84 Tabela 22 - Estimativa dos efeitos principais e valor de p referentes ao delineamento fracionado 24-1, para a produção de etanol depois de 24, 48 e 72 h de fermentação com o meio de banana...................................................... 85 Tabela 23 - Médias das triplicatas das 8 combinações e das 3 repetições no ponto central obtidas a partir do delineamento fracionado 24-1, para a resposta da biomassa (g/L) depois de 24, 48 e 72 h de fermentação com o meio de laranja.................................................................................................. 87 Tabela 24 - Estimativa dos efeitos principais e valor de p referentes ao delineamento fracionado 24-1, para a resposta da biomassa depois de 24, 48 e 72 h de fermentação com o meio de laranja......................................................... 88 Tabela 25 - Médias das triplicatas das 8 combinações e das 3 repetições no ponto central obtidas a partir do delineamento fracionado 24-1, para o pH final do caldo depois de 24, 48 e 72 h de fermentação com o meio de laranja.................................................................................................... 89 Tabela 26 - Médias das triplicatas das 8 combinações e das 3 repetições no ponto central obtidas a partir do delineamento fracionado 24-1, para a produção de etanol (g/L) depois de 24, 48 e 72 h de fermentação com o meio de laranja..................................................................................................... 92 Tabela 27 - Médias das triplicatas das 8 combinações e das 3 repetições no ponto central obtidas a partir do delineamento fracionado 24-1, para a concentração de AT no meio (g/L) depois de 24, 48 e 72 h de fermentação com o meio de cascas de laranja............................................ 95 Tabela 28 - Estimativa dos efeitos principais e valor de p referentes ao delineamento fracionado 24-1, para a produção de etanol depois de 24, 48 e 72 h de fermentação com o meio de laranja........................................................... 96 15 Tabela 29 - Médias de pH, biomassa (g/L), etanol (g/L) e açúcares totais (AT) (g/L) da fermentação realizada com meio sintético em fermentador de 5 L nos tempos de 18, 24, 48, 72 e 96 h de processo............................................. 99 Tabela 30 - Médias de pH, biomassa (g/L), etanol (g/L) e açúcares totais (AT) (g/L) da fermentação realizada com meio de cascas de banana em fermentador de 5 L nos tempos de 18, 24, 48, 72 e 96 h de processo.............................. 101 16 RESUMO A geração de álcool combustível a partir de resíduos lignocelulósicos pode ser uma fonte alternativa e renovável de energia. O Brasil é um dos maiores produtores de frutas tropicais do mundo, com destaque para a laranja e banana. Em consequência disto, é capaz de gerar grandes quantidades de resíduos que podem ser utilizados como biomassa que, uma vez hidrolisada, libera pentoses e hexoses. A fim de se buscar uma maior produção de etanol, a utilização de co-culturas que metabolizem tanto pentoses quanto hexoses torna-se bastante interessante. Dentro desse contexto, o objetivo do presente trabalho foi estudar o efeito da hidrólise de cascas de banana e laranja para a produção de etanol por co-culturas de Zymomonas mobilis e Pichia stipitis. A hidrólise ácida foi feita com ácido sulfúrico 5% e 15 min em autoclave, para a hidrólise enzimática utilizou-se kit fornecido pela Novozymes em reação a 50°C durante 36 h. Após as hidrólises o meio foi desintoxicado com carvão ativado. Foram avaliados os efeitos da fermentação somente por Z. mobilis e por co-culturas de Z. mobilis e P. stipitis, do pH, da agitação e da quantidade de açúcares no meio. As hidrólises ácida e enzimática liberaram 64,97 e 134,75 g/L de açúcares totais das cascas de banana e 101,30 e 176,70 g/L de açúcares totais das cascas de laranja, respectivamente. A desintoxicação do hidrolisado resultou em remoção de 58% a 93% dos fenóis e 1,7% a 4% dos açúcares totais. Nas fermentações descontínuas com meio sintético o maior crescimento celular e máxima produção de etanol foram 1,52 e 11,29 g/L para a monocultura de Z. mobilis, e 8,00 e 77,02 g/L para a co-cultura, respectivamente. Para o meio com cascas de banana essas respostas foram 1,87 e 4,16 g/L para a monocultura, e 15,19 e 23,92 g/L para a co- cultura, respectivamente. Para o meio com cascas de laranja, as mesmas respostas foram 0,39 e 1,85 g/L para a monocultura, e 6,73 e 11,36 g/L para a co-cultura, respectivamente. Para todos meios avaliados, as co-culturas de Z. mobilis e P. stipitis foram mais eficientes na fermentação alcoólica do que a monocultura de Z. mobilis, apresentando maiores concentrações de biomassa e etanol. Palavras-chave: etanol, biomassa, co-fermentação, resíduos lignocelulósicos, banana, laranja. 17 ABSTRACT The generation of ethanol from lignocellulosic waste, such as fruit crops, can be an alternative and renewable energy source. Brazil is one of the largest producers of tropical fruits in the world, especially orange and banana. As a result, it is able to generate large amounts of waste that may be used as biomass, which once hydrolyzed, releases pentoses and hexoses. In order to get a higher ethanol yield, the use of co-cultures which metabolize both pentose and hexose becomes quite interesting. In this context, the objective of this work was to study the hydrolysis effect of banana and orange peels for ethanol production by co-cultures of Zymomonas mobilis and Pichia stipitis. The acid hydrolysis was performed with 5% sulfuric acid and 15 min in autoclave; for the enzymatic hydrolysis was used a commercial kit supplied by Novozymes, in reaction at 50°C for 36 h. After the hydrolysis the medium was detoxified with activated carbon. The effects of fermentation by Z. mobilis monoculture and Z. mobilis and P. stipitis co- cultures, pH, agitation and the initial amount of sugars in the middle were evaluated. The sequential acid and enzymatic hydrolysis released 64.97 and 134.75 g/L of total sugars from banana peels and 101.30 and 176.70 g/L of total sugars from orange peels, respectively. The detoxification of the hydrolysate resulted in a removal of 58% to 93% of phenol and 1.7% to 4% of the total sugars. In Erlenmeyer fermentations with synthetic medium, the largest cell growth and maximum ethanol production were 1.52 and 11.29 g/L for Z. mobilis monoculture, and 8.00 and 77.02 g/L for the co-culture, respectively. In the medium with banana peels, these responses were 1.87 and 4.16 g/L for monoculture, and 15.19 and 23.92 g/L for the co-culture, respectively. To the medium with orange peels, the same responses were 0.39 and 1.85 g/L for monoculture and 6.73 and 11.36 g/L for the co-culture, respectively. For all evaluated media, the Z. mobilis and P. stipitis co-cultures were more efficient in fermentation than the Z. mobilis monoculture, with higher concentrations of biomass and ethanol. Keywords: ethanol, biomass, co-fermentation, lignocellulosic residues, banana, orange. 18 1. INTRODUÇÃO A queima de combustíveis, além de ser fonte não renovável de energia, libera dióxido de carbono no meio ambiente, contribuindo para o aquecimento global. Ao contrário dos combustíveis fósseis, o etanol é uma fonte renovável de energia produzida pela fermentação de açúcares e sua obtenção de biomassa renovável vem ganhando muita popularidade. Hoje é possível encontrar muitas pesquisas em todo o mundo visando produzir etanol a partir de substratos regionais de baixo custo. No Brasil, a banana e a laranja estão entre as frutas mais produzidas, no entanto, geram uma grande quantidade de resíduos. Uma forma de aproveitamento que tem se mostrado bastante promissora refere-se ao uso dessa biomassa na produção do bioetanol. A geração de etanol a partir de biomassa lignocelulósica pode ser realizada seguindo basicamente as seguintes etapas: pré-tratamento físico e/ou químico do material lignocelulósico, hidrólise da celulose e hemicelulose e fermentação dos açúcares por microrganismos. Na etapa da hidrólise podem ser utilizados os processos com ácido e enzimas. O pré-tratamento ácido tem por objetivo promover uma quebra parcial da biomassa, abrindo as cadeias lignocelulósicas de forma a permitir a atuação das enzimas. A hidrólise enzimática visa liberar açúcares fermentescíveis a partir da celulose e hemicelulose tratadas com ácido. Entre os principais açúcares que podem ser liberados pela hidrólise dessa biomassa estão hexoses e pentoses, como a glicose e xilose. A levedura Saccharomyces cerevisiae, microrganismo tradicionalmente usado para a biossíntese de etanol, não metaboliza xilose. Assim, a utilização de culturas de microrganismos que fermentem esses dois tipos de açúcares pode gerar uma maior produção de etanol, uma vez que tanto as hexoses como as pentoses podem ser convertidas no produto. A bactéria Zymomonas mobilis metaboliza hexoses e é conhecida por seu potencial na produção de etanol. A levedura Pichia stipitis pode metabolizar pentoses com rendimentos e taxas de fermentação relativamente altos. Dentro do contexto apresentado, considerando o aproveitamento de diferentes resíduos lignocelulósicos para produção de biocombustíveis e o uso de co-culturas de microrganismos para uma fermentação mais eficiente, torna-se importante um estudo 19 da viabilidade da produção de bioetanol a partir de cascas de banana e laranja e co- fermentação por Zymomonas mobilis e Pichia stipitis, buscando os melhores parâmetros para o processo. 20 2. OBJETIVOS 2.1. Objetivo geral Avaliar a produção de etanol por co-culturas de Zymomonas mobilis e Pichia stipitis em hidrolisados de cascas de banana e laranja. 2.2. Objetivos específicos  Avaliar a influência da hidrólise ácida como pré-tratamento sobre a despolimerização das cascas de banana e de laranja;  Avaliar a eficiência do uso de diferentes enzimas comerciais sobre a despolimerização das cascas de banana e de laranja;  Verificar a produção de bioetanol por co-culturas de Zymomonas mobilis e Pichia stipitis, comparativamente à fermentação somente por Zymomonas mobilis;  Maximizar a produção de bioetanol utilizando cascas de banana e de laranja, pelo estudo dos efeitos dos parâmetros: microrganismos; pH, agitação e quantidade inicial de substrato;  Realizar ampliação da escala de produção de etanol por fermentação descontínua para reator de 5 L. 21 3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 3.1. Crise energética e bioetanol As crises de energia, juntamente com a carência de alimentos e a ameaça ao meio ambiente, constituem os principais problemas que afligem o homem moderno. Por mais que a indústria invista no desenvolvimento de equipamentos cada vez mais econômicos e por mais que os setores produtivos da sociedade se organizem na busca da chamada eficiência energética, a produção de energia terá de ser cada vez maior. Nos últimos 20 anos, o consumo de energia nos países mais pobres do mundo aumentou de forma espantosa, fenômeno que atinge também os países emergentes. Na Índia, o consumo dobrou em duas décadas. Em Bangladesh, o aumento foi de 150%, no Brasil, 250%. O consumo de energia per capita dos brasileiros equivale a apenas um terço do consumo per capita de espanhóis e coreanos (OINEGUE, 2009). Petróleo, gás natural e seus derivados representam 55% do consumo mundial de energia. São esses combustíveis que permitem a existência dos meios de transporte rápidos e eficientes e de boa parte das atividades industriais. Lamentavelmente, eles não vão durar mais do que algumas décadas: como combustíveis fósseis, suas reservas são finitas, a segurança de abastecimento é problemática para os países que os importam e seu uso é a principal fonte dos gases que provocam mudanças climáticas e o aquecimento global (NOGUEIRA et al., 2005). O aumento da demanda energética mundial e o uso indiscriminado das reservas de petróleo pela humanidade motivaram a busca por fontes renováveis de energia, especialmente por aquelas derivadas de materiais renováveis como a biomassa (SAXENA; ADHIKARI; GOYAL, 2009). Além disso, o esgotamento dos combustíveis derivados do petróleo, a preocupação mundial com o aumento das emissões dos gases de efeito estufa (GEE) na atmosfera e as consequentes mudanças climáticas decorrentes do aquecimento global encorajaram cada vez mais o uso de biocombustíveis, como o bioetanol (BUCKERIDGE; SANTOS; DE SOUZA, 2009). O fornecimento de energia de maneira sustentável é fundamental não apenas para o desenvolvimento econômico das nações, mas também para assegurar o bem estar do cidadão (ANDRIETTA; STECKELBERG; ANDRIETTA, 2006). A Agência Internacional de 22 Energia calcula que dentro de 20 anos aproximadamente 30% do total da energia consumida pela humanidade será proveniente das fontes renováveis, que hoje representam 14% da energia produzida no mundo, em que a biomassa tem 11,4%, na participação da oferta (CORTEZ; LORA; AYARZA, 2008). O bioetanol não só assegura reduções nos problemas de poluição ambiental devido ao seu elevado teor de oxigênio como reduz a dependência das importações de petróleo e alivia incertezas causadas pelas flutuações do preço deste (HUANG; RAMASWAMY; TSCHIRNER, 2008). Segundo estimativas da Empresa de Pesquisa Energética (EPE), em 2017 o consumo de etanol no Brasil irá saltar para 53 bilhões de litros anuais e esse volume representará cerca de 80% dos combustíveis líquidos consumidos por veículos leves e de pequeno porte no Brasil. No ano de 2008, as vendas de álcool foram 1,6% maiores que as da gasolina (OINEGUE, 2009). No mercado brasileiro a produção do bioetanol está diretamente ligada ao mercado internacional de açúcar. Quando a demanda por açúcar no mundo aumenta ou há uma quebra de produção, como ocorreu em 2009, a produção de bioetanol é prejudicada e o mercado se retrai na utilização desse biocombustível. Não é possível conduzir uma política de uso do bioetanol renovável sem utilizar novas fontes de matérias-primas que não estejam atreladas ao mercado mundial de commodities, como no caso do açúcar (LUZ JUNIOR et al., 2009). O dilema do uso de matérias-primas alimentícias ou não também exerce influencia sobre este mercado. A busca de novas matérias-primas ou processos está acontecendo. O uso de biomassa lignocelulósica para a produção de bioetanol é muito promissor e constitui uma opção para países que não produzem grãos. Materiais lignocelulósicos são baratos, abundantes e renováveis, e podem minimizar os efeitos da produção de bioetanol a partir de fontes alimentares (BALAT; BALAT, 2009). 3.2. Aplicações e vantagens do etanol O etanol foi inicialmente utilizado para a produção de bebidas alcoólicas, vinagres e conservas. Nas últimas décadas tem sido aplicado na indústria de fármacos, perfumes e cosméticos; na fabricação de corantes, materiais explosivos, seda artificial e materiais plásticos; e como matéria-prima de produtos da química fina. O etanol é 23 utilizado também em iluminação e aquecimento; na produção de éter para misturas com carburantes e na fabricação de borracha sintética (CRUEGER; CRUEGER, 1993). No entanto, sendo o etanol uma fonte líquida de energia facilmente estocável, com alto conteúdo de oxigênio (35%) e combustão limpa, tem seu maior potencial de aplicação na área dos combustíveis, sendo utilizado como alternativa a gasolina, como aditivo da mesma e/ou como insumo na produção de biodiesel (SOMAVILLA; GOMES NETO, 2011). Além de ser uma alternativa para superar a problemática econômica do mercado energético, especialmente de combustíveis fósseis, o álcool hidratado e a mistura etanol-gasolina apresentam diversas vantagens ambientais. Quando utilizado como combustível, comparado à gasolina, apresenta uma redução nas emissões de enxofre, CO2, particulados e outras substâncias poluentes. As reduções nas emissões de CO, hidrocarbonetos e NO atingem 57%, 64% e 13%, respectivamente (SOMAVILLA; GOMES NETO, 2011). A Tabela 1 aponta a porcentagem de uso do etanol como aditivo ou substituto para a gasolina em alguns países. Tabela 1 - Uso do etanol como combustível em alguns países. País Matéria-prima Porcentagem de etanol nas misturas com gasolina (%v/v) Brasil Cana-de-açúcar 20-25 Estados Unidos Milho 10 Canadá Milho, trigo, cevada 7,5-10 Colômbia Cana-de-açúcar 10 Suécia Trigo 5 Índia Cana-de-açúcar 5 Tailândia Mandioca, cana-de-açúcar, arroz 10 Fonte: Sanchez; Cardona 2008. Outras vantagens da utilização do etanol merecem destaque: é uma commodity de alta pureza; de fácil transporte e estocagem; facilmente miscível com água; apresenta baixo perigo de explosão; é um agente desinfetante; facilmente oxidável; e pode ser utilizado como substrato em processos biotecnológicos. Na Figura 1 são apresentadas as aplicações mais comuns para o etanol e alguns dos produtos derivados deste álcool, 24 assim como algumas das substancias obtidas por meio de biotransformação microbiana (OLIVEIRA, 2010). Figura 1 - Principais aplicações do etanol e de seus produtos. Fonte: OLIVEIRA, 2010. 3.3. Processo convencional de produção de etanol Desde os tempos antigos, o álcool foi produzido por meio de diversos processos artesanais de fermentação, principalmente, na produção de bebidas para o consumo humano. Posteriormente, com o desenvolvimento da microbiologia industrial, o álcool foi produzido em quantidades que permitiram seu uso como matéria-prima para diversos produtos químicos e como combustível. O etanol é obtido utilizando-se três vias: degradativa, fermentativa e sintética, sendo o processo de fermentação o mais utilizado por ser mais econômico A via degradativa não tem muita importância econômica no Brasil, o etanol é obtido por desidratação do aguardente de cana. Já pela via sintética, o etanol é obtido a partir de hidrocarbonetos não saturados, como o etileno, acetileno, gases de petróleo. (SCHMIDELL et al., 2001). O método atual de produção de etanol a partir da cana-de-açúcar é realizado pela extração e fermentação do caldo, que possui aproximadamente 15% de sacarose e 25 15% de fibras. O processo começa com a limpeza e trituração da cana, separando o suco do bagaço. O bagaço é destinado às caldeiras para geração de energia para a usina e o suco, levemente tratado e concentrado, segue para a fermentação, que ocorre por meio de linhagens selecionadas de leveduras Saccharomyces cerevisiae. Como produto é obtido um vinho, que resultará no etanol hidratado após a destilação (Figura 2). Este etanol hidratado pode ser estocado como produto final e comercializado ou é desidratado para a produção do álcool anidro (MACEDO; SEABRA; SILVA, 2008). Figura 2 - Processo de produção convencional de etanol. Fonte: MUSATTO et al., 2010. 3.4. Uso de biomassa para produção de etanol A produção de etanol a partir de biomassa lignocelulósica compreende resumidamente as seguintes etapas: pré-tratamento do material lignocelulósico por métodos químicos (álcalis, ácidos) e/ou físicos (temperatura, pressão), hidrólise enzimática da celulose e hemicelulose, fermentação dos açúcares, separação da lignina residual e, finalmente, recuperação e purificação do etanol até as especificações desejadas para o combustível (Figura 3) (ALVIRA et al., 2010). A biomassa lignocelulósica pode ser considerada como a massa orgânica de qualquer material vegetal, geralmente composto por celulose, hemicelulose, lignina, lipídeos, proteínas, açúcares simples, amido, água e cinzas sendo os três primeiros os principais constituintes (MOHAN; PITTMAN; STEELE, 2006). A Figura 4 mostra uma representação da fibra lignocelulósica que constitui a biomassa. Trata-se da quarta maior fonte de energia do mundo, logo após o carvão, petróleo e gás natural (SAXENA; 26 ADHIKARI; GOYAL, 2009). Estima-se que a produção global de biomassa seja da ordem de 146 bilhões de toneladas por ano, entre produção agropecuária, lixo orgânico, regeneração de hábitat, adensamento florestal e ciclagem bioquímica (DEMIRBAS, 2009). Figura 3 - Produção de etanol a partir de material lignocelulósico. Fonte: MUSATTO et al, 2010. Figura 4 - Representação estrutural da fibra lignocelulósica. Fonte: GRAMINHA et al., 2008. De acordo com Demirbas (2008) existem algumas vantagens na utilização de biomassa como matéria-prima para biocombustíveis, tais como: são fontes renováveis 27 que podem ser sustentavelmente desenvolvidas no futuro; apresentam propriedades ambientais muito positivas, como menor emissão de dióxido de carbono; além do potencial econômico promovido nos momentos de alta do preço dos combustíveis fósseis. O uso da biomassa de resíduos agroindustriais, além de representar uma fonte alternativa, ajuda a minimizar problemas ambientais que são causados por sua deposição (KALOGERIS et al., 2003). Além do aspecto ambiental, deve-se também considerar que o despejo indevido dos subprodutos agrícolas constitui desperdício de rendimento para o produtor, quando se consideram as quantidades geradas e a composição dos subprodutos (CEREDA, 2001). A biomassa é, dentre todas as fontes de energia renováveis, a única fonte de carbono capaz de ser convertida em combustíveis sólidos, líquidos e gasosos através de diferentes processos (OZBAY et al., 2001). Uma grande variedade de recursos de biomassa está disponível em nosso planeta para a conversão em bioprodutos. Dentre esses recursos podem-se incluir a madeira e seus resíduos, as safras agrícolas e seus subprodutos e resíduos, resíduos do processamento de alimentos, materiais de origem marinha (plantas aquáticas e algas), e os resíduos municipais e industriais (BALAT et al., 2009). O maior sistema de energia comercial de biomassa no mundo é mantido pela indústria da cana-de-açúcar, através da produção de etanol e do uso quase total de bagaço para geração de eletricidade. Vários estudos têm sido desenvolvidos visando o uso dos bagaços para a produção de etanol, reduzindo assim a sua queima. A obtenção deste produto, denominado de etanol de 2ª geração, tem sido avaliado mundialmente também a partir de outros tipos de resíduos lignocelulósicos, como por exemplo: madeira de eucalipto e resíduos de palha de trigo (BALLESTEROS et al., 2004), resíduos de fibra de milho (SCHELL et al., 2007), resíduos de uva (PRAMANIK, 2005), resíduos de frutas e vegetais (SAEED, 2005), extrato de bagaço de maçã (NOGUEIRA et al., 2005) Segundo Moreira (2005), os carboidratos estão entre os componentes mais abundantes desses resíduos. Praticamente todos os polissacarídeos naturais contêm cinco ou seis átomos de carbono, denominados pentoses e hexoses, respectivamente. Nas biomassas celulósicas, uma mistura complexa de celulose e hemicelulose, lignina e 28 uma pequena quantidade de outros compostos conhecidos como extratos fazem parte da estrutura física do vegetal. 3.4.1. Celulose Em geral, a celulose é a maior porção da biomassa vegetal e representa cerca de 40% a 50% do material, em massa. Trata-se um homopolissacarídeo linear que possui de 8.000 a 14.000 unidades de glicose (D-glucopiranose) unidas entre si por ligações glicosídicas β-(1-4). A parte final da cadeia de glicose apresenta um carbono anomérico não ligado a outro resíduo de glicose e é conhecida como extremidade redutora do polímero, a outra extremidade é chamada não redutora (SANDGREN; STAHLBERG; MITCHINSON, 2005). A análise conformacional da celulose indica que a celobiose (4-O-β- D-glucopiranosil-β-D-glucopiranose) seja a sua unidade básica (RAMOS, 2003), como apresentado na Figura 5. Figura 5 - Estrutura do polímero de celulose. Fonte: SANDGREN; STAHLBERG; MITCHINSON, 2005. As cadeias de celulose formam entre si ligações de hidrogênio intramoleculares e intermoleculares. Estas ligações conferem alta rigidez e ordenação à estrutura, criando as denominadas regiões cristalinas, responsáveis pela insolubilidade e pouca reatividade da celulose (LEMOS, 2001). Uma das maiores dificuldades para conversão biotecnológica da celulose é hidrolisar a molécula até obter os sacarídeos constituintes da fibra. A resistência à hidrólise é conferida pelas regiões cristalinas e pela barreira física gerada pela lignina presente nos materiais lignocelulósicos. No entanto, existem algumas regiões amorfas, ou não cristalinas, mais susceptíveis à hidrólise. Quando a celulose é hidrolisada em condições brandas é obtida, como unidade de repetição, a celobiose (BETANCUR, 2005). 29 3.4.2. Hemicelulose A quantidade de hemicelulose nas biomassas representa de 20% a 40% do material lignocelulósico. Na estrutura da hemicelulose participam pelo menos dois tipo de unidades de açúcar, formando cadeias entre 100 e 200 unidades de pentoses (xilose, ramnose e arabinose) e hexoses (glicose, manose e galactose) (Figura 6). A macromolécula de hemicelulose, que não apresenta regiões cristalinas devido ao seu alto grau de ramificação, está constituída majoritariamente por uma mistura de polissacarídeos de baixa massa molecular como xilanas, arabinanas e mananas, mas podem ser encontrados polissacarídeos mais complexos como arabinoxilanas, glucoarabinoxilanas, arabinogalactanas, arabinoglucouranoxilanas, glucomananas, arabinogalactanas, galactoglucomananas e galactomananas (MARTÍNEZ et al., 2005). Figura 6 - Estrutura do polímero de hemicelulose. Fonte: MUSATTO et al., 2010. A xilana é o componente majoritário do complexo hemicelulósico, constituindo entre 15% e 30% da massa seca. Em termos gerais, é um polissacarídeo de cadeia linear formada por unidades de xilose, as quais se encontram unidas por ligações β-(1,4) xilanopiranosil. Devido ao menor grau de cristalinidade e a menor estabilidade das ligações glicosídicas, comparando-se à celulose, os monômeros constituintes das xilanas podem ser recuperados com altos rendimentos utilizando ácidos diluídos (KATAPODIS; CHRISTAKOPOULOU; CHRISTAKOPOULOU, 2006). O aproveitamento eficiente da xilana é imprescindível quando se deseja utilizar a biomassa lignocelulósica para processos de fermentação alcoólica. 30 3.4.3. Lignina As partes remanescentes da biomassa são formadas predominantemente por lignina, principal componente não carboidrato. É a responsável pela rigidez da parede celular em vegetais, pela sua resistência ao impacto, compressão e dobra, sendo também um agente permanente de ligação entre as células (SANDGREN; STAHLBERG; MITCHINSON, 2005). Essa macromolécula tridimensional de origem fenilpropanóica é formada por polímeros aromáticos naturais (p-hidroxifenilpropano, guaiacilpropano e siringilpropano), com numerosas ligações cruzadas (aproximadamente 10 tipos diferentes), resultando em uma macromolécula hidrofóbica e opticamente inativa (Figura 7). A lignina também está covalentemente ligada à hemicelulose, através de ligações éster com a xilana, formando uma matriz que envolve as microfibrilas da celulose. Essa ligação cria um dos impedimentos para a hidrólise das estruturas polissacarídeas. Cabe ressaltar que os compostos derivados da lignina, quando liberados, dificultam os processos fermentativos (LEMOS, 2001). Figura 7 - Estrutura da macromolécula de lignina. 31 Por todo o contexto apresentado, tornam-se importantes estudos para uma maior utilização da biomassa de resíduos agroindustriais, como por exemplo, resíduos e subprodutos das culturas de frutas e vegetais. O Brasil é um dos maiores produtores de frutas tropicais e grandes quantidades destes alimentos se desperdiçam, gerando uma quantidade de biomassa considerável que poderia ser aproveitada (FAO, 2008). Diversos processos são desenvolvidos para transformação desses materiais em compostos químicos e produtos com alto valor agregado como álcool, enzimas, ácidos orgânicos, aminoácidos (PANDEY et al., 2000). 3.5. Resíduos de banana e produção de bioetanol A banana constitui o quarto produto alimentar mais produzido no planeta e o oitavo lugar em exportações. Em muitos países é a principal fonte de arrecadação e de geração de emprego e renda para uma parte expressiva da população. Nas últimas três décadas, essa cultura tem apresentado um aumento significativo (122%) no volume produzido (CEPA, 2010). Países como Brasil, Equador, Colômbia e Costa Rica, possuem uma cultura bananeira de grande importância no mercado nacional e internacional. O Brasil ocupa o terceiro lugar em produção com um total de 7 milhões de toneladas, e o décimo oitavo lugar em exportação com um total de 185 mil toneladas. A banana é a segunda fruta mais explorada no Brasil, sendo precedida somente pela laranja (FAO, 2008). A maior parte da produção brasileira de bananas é consumida in natura. As cascas de bananas consumidas geralmente são descartadas ou utilizadas na alimentação animal e na compostagem. São industrializados cerca de 3% da produção, sendo 33% desses produtos consumidos no mercado interno. O principal produto derivado da banana produzido no Brasil é o purê, correspondendo a 55% do total de produtos industrializados, sendo exportado para o Japão, Estados Unidos e Europa. Também são produzidos, em quantidades consideráveis, bananada (20%), banana-passa (13%), flocos (10%) e chips (2%). Além dos mencionados, diversos outros produtos podem ser obtidos da banana: fruta em calda, fruta cristalizada, balas, farinha, suco clarificado, néctar, vinho, vinagre, cerveja, aguardente, licor, etc. Como ingrediente, a banana pode ainda ser utilizada em formulações de tortas, bolos, biscoitos, cereais matinais, barras de fruta, 32 alimentos infantis e dietéticos, iogurtes, sorvetes, bombons, dentre outros (EMBRAPA, 2008). Pesquisas estimam que em torno de um quinto de toda a banana colhida é rejeitado, devido ao fato de que muitos destes frutos não chegam a ter os padrões de qualidade para sua exportação e pelo excesso produzido existente no mercado interno. Cada hectare de cultivo de banana gera, aproximadamente, 220 toneladas de resíduos constituídos principalmente de matérias lignocelulósicos. Considerando-se que a porcentagem da produção de banana que é industrializada neste país é de 3%, e que a casca da banana corresponde a 40% do seu peso tem-se uma geração de resíduo industrial anual de cerca de 83 mil toneladas de cascas de banana (EMBRAPA, 2008). A casca de banana apresenta alto teor de carboidratos, que são facilmente metabolizados por microrganismos devido à sua natureza orgânica, é uma rica fonte de amido (3%), lignina (6-12%), pectina (10-21%), celulose (7,6-9,6%) e hemicelulose (6,4- 9,4%) (MOHAPATRA; MISHRA; SUTAR, 2010). Esses fatores aliados ao seu baixo custo e alta disponibilidade tornam a casca de banana um interessante resíduo lignocelulósico que pode ser convertido em bioetanol (ESSIEN; AKPAN; ESSIEN, 2005). Hammond et al. (1996) avaliaram o potencial de produção de bioetanol a partir de bananas verdes e maduras. As fermentações foram conduzidas com Saccharomyces cerevisiae a 35°C e 72 h. Os resultados da produção de etanol em relação ao fruto inteiro foram de 0,082 L/kg para a polpa e 0,006 L/kg para a casca. Schulz (2010) realizou fermentações em biorreatores e atingiu uma produção de etanol na ordem de 7,88 e 7,15 g/L, a partir de cascas de banana com concentrações iniciais de açúcares de 19,51 e 12,24 g/L, respectivamente. 3.6. Resíduos de laranja e produção de bioetanol A laranja representa aproximadamente 49% da produção brasileira de frutas. Em 2007, a produção de laranja foi de 18 milhões toneladas e no ano de 2008 a safra ultrapassou 18.580.908 toneladas (IBGE, 2008). O Brasil produz em torno de 53% da produção mundial de suco de laranja sendo responsável por 80% do comércio internacional desse produto. Dentre os estados brasileiros que mais se destacam na produção de cítricos estão São Paulo, Rio de Janeiro, Minas Gerais, Sergipe, Rio Grande 33 do Sul, Paraná e Goiás (ABECITRUS, 2008). A casca da laranja contém 16,9% de açúcares solúveis, 9,21% de celulose, 10,5% de hemicelulose e 42,5% de pectina, como o componente mais importante. Os açúcares solúveis da casca de laranja são glicose, frutose e sacarose. A pectina e as hemiceluloses são ricas em ácido galacturônico, arabinose, galactose e pequenas quantidades de xilose, ramnose e glicose (GROHMANN; CAMERON; BUSLIG, 1995). A industrialização de citros para a produção de sucos gera grandes quantidades de resíduos, que equivalem a 50% do peso da fruta e tem uma umidade aproximada de 82%. Os resíduos da laranja são utilizados principalmente como complemento para ração animal (ABECITRUS, 2008), porém, devido à sua composição rica em carboidratos solúveis e insolúveis, esse subproduto apresenta grande potencial para ser utilizado em produtos de alto valor agregado obtidos através da hidrólise química ou enzimática e posterior conversão biológica (RIVAS et al., 2008). Albán e Freire (2009) estudaram a produção de bioetanol a partir de cascas de laranja hidrolisadas por diferentes linhagens de Aspergillus ssp. A fermentação foi realizada a 30°C e pH igual a 4, por Saccharomyces cerevisiae e Zymomonas mobilis. O rendimento em etanol foi de 30,32% e 18,05% para S. cerevisiae e Z. mobilis, respectivamente. 3.7. Tratamento dos resíduos lignocelulósicos A área da fermentação para a obtenção de biocombustíveis vem sendo explorada fortemente. Esta área se desenvolve em ritmo acelerado procurando alternativas para o aproveitamento dos resíduos da agricultura e da indústria de alimentos, dando-lhes valor de subproduto industrial (STEINER, 2006). Pesquisadores como Rajeev et al. (2009) e Wilkins (2009) mostraram que é possível obter etanol através do material hemicelulósico, como cascas de banana e de laranja. De forma geral as tecnologias para obtenção de etanol a partir de biomassa lignocelulósica envolvem a hidrólise dos carboidratos hemicelulose e celulose, produzindo seus respectivos açúcares fermentescíveis pentoses e hexoses, e posterior fermentação alcoólica dos açúcares livres para produção do bioetanol (ALVIRA et al., 2010). Para obter os açúcares da celulose, principalmente a glicose, e da hemicelulose, 34 principalmente a xilose, é preciso um pré-tratamento químico do material lignocelulósico para remoção da lignina (SÖDERSTRÖM et al., 2003). Na tabela 2 são comparadas as principais características da etapa ácida e enzimática. Propriedades como o tamanho, a forma, a porosidade, o grau de polimerização, a área superficial, a conformação molecular e a cristalinidade são fatores que influenciam na hidrólise da celulose, sendo que estes dependerão da origem e dos processos a que esse polissacarídeo for submetido (CHANG; HOLTZAPPLE, 2000). Tabela 2 - Comparação entre a hidrólise ácida e enzimática. Variável da hidrólise Hidrólise ácida Hidrólise enzimática Condições brandas Não Sim Altos rendimentos Não Sim Auto-inibição Não Sim Formação de inibidores Sim Não Baixo custo de catálise Sim Não Menor tempo Sim Não Fonte: Taherzadeh; Karimi (2007). 3.7.1. Hidrólise ácida A hidrólise ácida é utilizada no pré-tratamento da biomassa tanto para a quebra da hemicelulose e celulose como para proporcionar um tratamento inicial, facilitando uma posterior hidrólise enzimática da hemicelulose em hexoses (glicose, manose e galactose) e pentoses (xilose e arabinose) (ALZATE; TORO; SÁNCHEZ, 2006). O principal objetivo do tratamento ácido é solubilizar e hidrolisar a fração de hemicelulose da biomassa e tornar a celulose mais acessível às enzimas. A celulose é a última a ser hidrolisada devido à sua forte interação intermolecular, à completa ausência de água na estrutura da microfibrila e também ao fato das fibrilas estarem cobertas pela hemicelulose (AGUILAR et al., 2002; SUN; CHENG, 2002). Esse tipo de pré-tratamento pode ser realizado com ácidos diluídos ou concentrados, porém a utilização do ácido na forma concentrada induz a formação de maior número de compostos inibidores, sendo menos atrativa para o processo de produção de etanol (ALVIRA et al., 2010). 35 Quando realizada com ácidos diluídos, permite aumentar a susceptibilidade da celulose aos futuros processos de hidrólise sem afetar, notavelmente, sua estrutura base. Essa característica do processo permite a obtenção de hidrolisados com alto conteúdo de xilose em relação a outros glicídios. Durante a hidrólise ácida, os catalisadores liberam prótons que clivam as ligações heterocíclicas de éter entre os monômeros das cadeias poliméricas da hemicelulose e, no caso de ácidos concentrados, da celulose. Com a clivagem dos polímeros são liberadas diversas substâncias, sendo majoritário o conteúdo de xilose, glicose e arabinose. Entre os ácidos utilizados para este tipo de pré-tratamento, encontram-se: ácido sulfúrico, ácido fluorídrico e ácido acético (RODRIGUEZ-CHONG et al.,2004). 3.7.2. Hidrólise enzimática A hidrólise enzimática dos materiais lignocelulósicos é conduzida através de enzimas celulases, que são altamente específicas. Os três maiores grupos de celulases que estão envolvidos no processo de hidrólise são: endoglucanases, exoglucanases e β- glucosidases (SUN; CHENG, 2002). As endoglucanases atuam hidrolisando as cadeias aleatoriamente, atacando os polímeros internamente, resultando em uma rápida redução no grau de polimerização da cadeia. As exoglucanases atuam sobre a celulose a partir das extremidades redutoras e não redutoras removendo unidades de celobiose (dímeros de glicose). Finalmente, as β-glucosidases hidrolisam a celobiose e outras ciclodextrinas a glicose, liberando açúcares fermentescíveis, como ilustra a Figura 8 (LEITE et al., 2007). É importante ressaltar que as três enzimas deste complexo sofrem inibição pelos produtos finais da hidrólise. Como as endo- e exoglucanases são inibidas pela celobiose, a β-glucosidases desempenha um papel crucial na degradação da celulose, ao prevenir o acúmulo de celobiose. No entanto, esta enzima também sofre inibição pelo produto final da reação, no caso, a glicose (LEITE et al., 2007). Ao contrário do emprego de ácidos, a hidrólise enzimática é conduzida sob condições brandas, atingindo alta degradação da celulose; ainda, a ação das enzimas é específica pelo substrato, evitando a geração de compostos secundários que podem inibir a etapa de fermentação. No entanto, o uso de enzimas requer um tempo maior para que ocorra a hidrólise, além de maior custo. Alguns dos fatores que podem afetar a 36 sacarificação enzimática incluem o tipo de substrato, a atividade celulolítica, a temperatura, o tempo e o pH de reação (HAHN-HÄGERDAL et al., 2006). Figura 8 - Representação esquemática da ação das celulases sobre a celulose. Fonte: SANDGREN; STAHLBERG; MITCHINSON, 2005. Microrganismos incluindo bactérias, actinomicetos e fungos são capazes de produzir celulases, mas só um número limitado desses é capaz de produzir grandes quantidades desta enzima. Algumas das bactérias celulolíticas mais estudadas pertencem aos gêneros Celulomonas, Termobifida e Clostridium (ZHANG et al., 2005). 3.7.3. Formação de compostos inibidores da fermentação Durante a hidrólise ácida são formados inibidores do crescimento celular e da fermentação da xilose, como o ácido acético, furfural, hidroximetilfurfural, e compostos 37 fenólicos, variando suas concentrações de acordo com as condições nas quais estes hidrolisados são processados (BETANCUR, 2005). O ácido acético é gerado a partir dos grupos acetil presentes na estrutura hemicelulósica. O ácido, na forma não dissociada, pode difundir-se ao citoplasma da célula e reduzir o pH intracelular, gerando problemas para produção de energia e o transporte de diversos nutrientes, aumentando o requerimento energético da célula. A assimilação do ácido pelos microrganismos depende, principalmente, do pH e de sua concentração, fatores chave na dissociação do ácido, assim como do nível de aeração do meio. A presença de ácido acético no meio de fermentação provoca queda no rendimento, produtividade e consumo de açúcar (TOSETTO, 2008). O furfural é um aldeído de natureza aromática formado pela hidrólise de materiais lignocelulósicos que contêm pentoses (GUTIERREZ et al., 2002). Este tipo de substância reduz o crescimento celular, a formação de ATP e a produção de etanol. Dependendo do tipo de microrganismo, pode causar a morte da célula ao interferir na respiração e na fosforização oxidativa. (PALMQVIST; HAHN-HAGERDAL, 2000). O hidroximetilfurfural (HMF) é gerado pela degradação de hexoses durante o processo de hidrólise e apresenta um mecanismo de ação similar ao descrito para o furfural. O HMF é assimilado em taxas menores tendo o efeito de aumentar a fase lag de crescimento das células (PALMQVIST; HAHN-HAGERDAL, 2000). Os compostos fenólicos originam-se da degradação da lignina durante a etapa de pré-tratamento. Alguns exemplos encontrados são o ácido 4-hidroxibenzóico, seringaldeído, 4-hidroxibenzaldeído e os ácidos salicílico, vanílico, siríngico entre outros. Muitos dos mecanismos de ação desses compostos sobre o microrganismo no processo de fermentação alcoólica ainda não foram completamente estudados, mas já foi demonstrado que eles podem reagir com moléculas biológicas da célula (lipídeos, proteínas e ácidos nucléicos) ou ocasionar danos à membrana celular com consequente perda da seletividade, e ainda, inibir enzimas glicolíticas e fermentativas. Adicionalmente, tem sido reportada a inibição do consumo de xilose na presença de alguns compostos fenólicos de baixa massa molecular. De qualquer forma, estes compostos produzem efeitos negativos na fermentação por meio da redução da taxa específica de crescimento do microrganismo e da diminuição da produtividade de etanol (ROSSELL, 2006). 38 Diferentes processos têm sido propostos para diminuir a concentração de inibidores em hidrolisados hemicelulósicos. Os métodos para desintoxificação do hidrolisado variam de acordo com o tipo de inibidor presente. Entre os mais conhecidos encontram-se: mudanças de pH com óxido de cálcio, hidróxido de cálcio e ácido sulfúrico; utilização de carvão ativado, colunas de troca iônica, precipitação, extração com solventes orgânicos, evaporação, peneiras moleculares e até aplicação de enzimas (YADAV et al., 2011). 3.8. Microrganismos utilizados para produção de bioetanol e co-culturas Na fermentação alcoólica, as leveduras são os microrganismos comumente utilizados a nível industrial. Contudo, nas últimas décadas, a bactéria Zymomonas mobilis vem despertando muito interesse pelo seu potencial na produção de etanol, suportando concentrações de etanol três a quatro vezes maiores que Saccharomyces cerevisiae (ERNANDES; GARCIA-CRUZ, 2009). É um microrganismo anaeróbio facultativo, gram- negativo e mesófilo; as condições ideais para o crescimento desta bactéria são intervalos de temperatura de 30 a 36°C e intervalos de pH entre 5 e 7. A Z. mobilis apresenta como exigência nutricional a presença de glicose, sacarose ou frutose no meio de cultivo, gerando quantidades praticamente equimolares de etanol e CO2. Quando cultivadas em meio complexo, podem converter 98% da glicose presente em etanol, CO2, lactato e outros, seguindo um balanço metabólico simples (SWINGS; DE LEY, 1977). Segundo Doelle et al. (1993), Z. mobilis é uma bactéria única dentro do mundo microbiano, com crescimento, produção de energia e resposta as condições de cultura extremamente peculiares, causando grande interesse no meio cientifico, biotecnológico e industrial. Contudo, tanto S. cerevisiae quanto Z. mobilis não metabolizam pentoses, como a xilose. A descoberta de leveduras que fermentam pentoses tem atraído grande interesse, já que a produção de combustíveis líquidos a partir de materiais lignocelulósicos torna-se muito mais eficiente a partir da fermentação tanto das hexoses quanto das pentoses liberadas na etapa de hidrólise (HINMAN et al., 1989). A conversão de xilose em etanol, junto com a glicose, permite um maior rendimento em etanol na fermentação de materiais lignocelulósicos, já que assim quase todos os açúcares são 39 transformados em etanol, dessa forma, o emprego de co-culturas de microrganismo que metabolizem pentoses e hexoses torna-se bastante vantajosa. A xilose pode ser metabolizada por diferentes espécies de bactérias, fungos filamentosos e leveduras naturalmente ocorrentes e/ou recombinantes. Entretanto, as bactérias possuem baixa tolerância ao etanol e fungos filamentosos possuem baixas produtividades. Entre as leveduras, Pichia stipitis destaca-se por ser uma das melhores produtoras de etanol com taxa de fermentação e rendimentos relativamente altos (LAPLACE, 1991). Além disso, a levedura P. stipitis praticamente não requer a adição de vitaminas para a fermentação de xilose e é capaz de fermentar uma grande variedade de açúcares incluindo a celobiose (NIGAN, 2002). P. stipitis tem apresentado resultados promissores na conversão de xilose em etanol a partir de hidrolisados de biomassa lignocelulósica, tanto em monoculturas como em co-culturas com outros microrganismos (DELGENES et al., 1996; NIGAM, 2002; FU et al., 2009). Estudo com hidrolisado de palha de arroz mostrou que a produção de etanol foi de 7,5 g/L quando somente S. cerevisiae foi utilizada na fermentação, e aumentou para 12 g/L quando foram utilizadas co-culturas de Saccharomyces cerevisiae e Pichia stipitis (YADAV et al., 2011). 40 4. MATERIAL E MÉTODOS A parte experimental do presente trabalho foi desenvolvida no Laboratório de Biopolímeros, do Departamento de Engenharia e Tecnologia de Alimentos do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas - IBILCE - UNESP- Campus de São José do Rio Preto/SP. 4.1. Preparo das cascas de banana e laranja Os frutos maduros da banana nanica (Musa cavendischii) foram adquiridos em um supermercado da cidade de São José do Rio Preto entre os meses de fevereiro a maio de 2012. As cascas de banana foram separadas da polpa e as cascas foram cortadas manualmente, com auxílio de faca inox, em formato quadrado medindo cerca de 1 cm. Em seguida, foram distribuídas em bandejas de alumínio e secadas em ambiente externo por aproximadamente 24 h, até que ficassem quebradiças. Os frutos da laranja (Citrus sinensis) variedade pera rio foram adquiridos em supermercado da cidade de São José do Rio Preto entre os meses de fevereiro a abril de 2013. O suco dos frutos foi extraído e as cascas foram cortadas manualmente, com auxílio de faca inox, em formato quadrado medindo cerca de 1 cm. Em seguida foram distribuídas em bandejas de alumínio e secadas ao sol por aproximadamente 24 h, até que ficassem quebradiças. As Figuras 9 e 10 mostram as cascas de banana e laranja imediatamente após terem sido cortadas e distribuídas nas bandejas de alumínio; as Figuras 11 e 12 mostram as cascas de banana e laranja já secas, depois de 24 h expostas ao sol. Depois de secas as cascas foram trituradas em liquidificador doméstico e passadas em peneiras de 18 mesh. As cascas trituradas foram armazenadas em potes de vidro bem fechados e deixados em temperatura ambiente, até o momento das análises. Ao todo foram obtidos 900 g de cascas de banana e 900 g de cascas de laranja secas e trituradas. 41 Figura 9 - Cascas de banana em bandeja de alumínio para serem secas ao sol. Fonte: Autor Figura 10 - Cascas de laranja em bandeja de alumínio para serem secas ao sol. Fonte: Autor 42 Figura 11 - Cascas de banana secas ao sol por aproximadamente 24 h. Fonte: Autor Figura 12 - Cascas de laranja secas ao sol por aproximadamente 24 h. Fonte: Autor 43 4.2. Pré-tratamento do substrato: hidrólise ácida A hidrólise ácida foi feita de acordo com o método proposto por Sun e Cheng (2002) com algumas modificações. O mesmo método foi adotado tanto para as cascas de banana quanto para as cascas de laranja. Em frascos Erlenmeyer de 250 mL foram adicionados 10 g de casca seca e 50 mL de ácido sulfúrico a 5% (v/v) (Figura 13). Figura 13 - Frascos Erlenmeyer contendo as cascas de banana seca e o ácido sulfúrico 5%, antes da hidrólise ácida. Fonte: Autor Os frascos foram colocados em autoclave a 121°C e pressão de 1 atm durante 15 e 30 min (HA 15 e HA 30, respectivamente). A fim de avaliar somente o efeito do aquecimento, foram adicionados 10 g de casca seca e 50 mL de água destilada em frasco Erlenmeyer de 250 mL, sendo o frasco também levado à autoclave a 121°C e pressão de 1 atm durante 15 min (Branco). Após resfriamento em banho de gelo até temperatura ambiente, o pH dos hidrolisados foi ajustado para 6 com adição de NaOH, utilizando pHmetro Digmed modelo DM20. Para avaliar o efeito somente do ácido, sem aquecimento, em frasco Erlenmeyer de 250 mL foram adicionados 10 g de casca seca e 50 mL de ácido sulfúrico a 5% (v/v), o 44 frasco foi deixado a temperatura ambiente por 15 min e, após, o pH ajustado para 6 com adição de NaOH (HA 0). Todos os hidrolisados foram centrifugados a 6941 g, 4°C por 15 min e nos respectivos sobrenadantes foram determinadas as quantidades de açúcares totais e açúcares redutores, a fim de verificar a eficiência da hidrólise ácida em cada tratamento. O tratamento que proporcionou maior liberação de açúcares totais e redutores foi adotado para obtenção do meio de cascas de banana e meio de cascas de laranja utilizados na etapa de fermentação. 4.3. Hidrólise enzimática Para a hidrólise enzimática foram empregadas as enzimas comerciais: celulase (NS22086), xilanase (NS22083), β-glucosidase (NS22118), complexo enzimático (NS22119) contendo as enzimas arabinase, β-glucanase, celulase, hemicelulase, pectinase e xilanase; hemicelulase (NS22002) e glucoamilase (NS22035). As enzimas citadas fazem parte do “Novozymes’ Cellulosic Ethanol Enzyme Kit” e foram gentilmente fornecidas pela Novozymes Latin America Ltda. A Tabela 3 mostra as dosagens recomendadas e as faixas de pH e de temperatura de atuação das enzimas. Esses dados foram fornecidos por cada fabricante, juntamente com as enzimas. Todo o hidrolisado obtido no item 4.2 foi utilizado como substrato para a hidrólise enzimática. Em Erlenmeyer de 125 mL foram adicionados 10 g deste substrato, 10 mL de solução tampão ácido cítrico/citrato de sódio 0,1 M e as quantidades recomendadas das enzimas. Antes da adição das enzimas o pH da reação foi ajustado para 5, com auxílio do pHmetro. Todas as enzimas foram utilizadas juntas nas dosagens máximas recomendadas pelo fabricante, conforme Tabela 3. Os frascos Erlenmeyer foram, então, colocados em incubadora a 50°C e 150 rpm. A temperatura de 50°C e o pH de 5 foram definidos de modo que os seus valores estivessem dentro das faixas recomendadas pelo fornecedor das enzimas (Tabela 3), exceto para a enzima glucoamilase (NS22035) cuja faixa ótima de temperatura é alta e poderia inibir a ação das outras enzimas. Depois de 24 h a reação foi paralisada pela adição de 0,5 mL de NaOH 2 N e as quantidades de açúcares totais e redutores foram determinadas. 45 Tabela 3 - Dosagem recomendada, pH e temperatura de atuação das enzimas fornecidas pela Novozymes Latin America Ltda. Enzima pH Temperatura (°C) Dosagem (% p/p) NS22086 Celulase 5,0-5,5 45-50 1-5 NS22083 Xilanase 4,5-6,0 35-55 0,05-0,25 NS22118 β-glucosidade 2,5-6,5 45-70 0,2-0,6 NS22119 Complexo enzimático 4,5-6,0 25-55 0,05-0,4 NS22002 Hemicelulase 5,0-6,5 40-60 0,4-2 NS22035 Glucoamilase 4,5-5,5 60-70 0,01-0,06 4.4. Concentração e desintoxicação dos hidrolisados Após a hidrólise enzimática, os hidrolisados foram filtrados em papel filtro, colocados em béqueres de 1 L cada e concentrados em banho-maria a 80°C até atingirem o teor de açúcares totais de 150 e 250 g/L. O meio de cascas de banana com teor desejado de açúcares totais de 50 g/L não necessitou de concentração. Já para as de cascas de laranja, os meios com teores de açúcares totais de 50 e 150 g/L não necessitaram de concentração. Para a desintoxicação, os hidrolisados nas concentrações de açúcares totais de 50, 150 e 250 g/L foram adicionados de óxido de cálcio com agitação, até atingirem pH 10. Então, foram deixados em repouso por 30 min a 25°C, seguidos de centrifugação (3000 g por 20 min) e filtração. Após, o pH dos hidrolisados foi reduzido para 4 com adição de H2SO4 concentrado (CHANDEL et al., 2007). Os hidrolisados foram distribuídos em frascos Erlenmeyers, adicionados de 3,5% de carvão ativado e agitados a 200 rpm por 1 h. A mistura foi novamente centrifugada a 3000 g por 20 min e filtrada. Os hidrolisados tratados foram então utilizados como meio de cascas de banana e meio de cascas de laranja para a fermentação. 46 4.5. Fermentação Foram realizados 27 ensaios de fermentação em Erlenmeyer de 250 mL, sempre em triplicata: 9 ensaios com meio sintético (item 4.5.2.2), 9 ensaios com meio de cascas de banana (item 4.5.2.3) e 9 ensaios com meio de cascas de laranja (item 4.5.2.3). As mesmas condições de fermentação foram estudadas para os três meios avaliados. As fermentações em Erlenmeyer foram realizadas em shaker orbital com temperatura controlada, a 30°C por 72 h. O pH inicial do meio de fermentação foi ajustado no valor de 4,5; 5,5 ou 6,5. Foram avaliados três tipos de agitação: - agitação de 150 rpm durante 5 min ao dia, - agitação constante a 150 rpm nas primeiras 18 h seguida de fermentação estática até 72 h, - agitação constante a 150 rpm durante as 72 h de fermentação. Três tipos de inóculos também foram avaliados: - inoculação somente com a bactéria Z. mobilis, - inoculação com a levedura P. stipitis no início da fermentação e inoculação da bactéria Z. mobilis somente 24 h depois (a fim de evitar a inibição das células de P. stipitis pela Z. mobilis), - inoculação simultânea com Z. mobilis e P. stipitis no início da fermentação. 4.5.1. Microrganismos A bactéria Zymomonas mobilis CCT 4494 e a levedura Pichia stipitis CCT 2617 foram adquiridas da Coleção de Culturas Tropical (CCT) da Fundação André Tosello - Pesquisa e Tecnologia de Campinas, SP. 4.5.2. Meios de cultura 4.5.2.1. Meios de crescimento e manutenção das culturas A linhagem bacteriana de Zymomonas mobilis foi cultivada e mantida em tubos de ensaio contendo meio líquido denominado Zm e composto por (em g/L): glicose, 20; extrato de levedura, 10; peptona, 10. Após a inoculação as células foram mantidas em estufa a 30°C durante 24 h e, então, armazenadas em geladeira a 4°C. 47 A levedura Pichia stipitis foi mantida em tubos de ensaio a partir do cultivo de superfície em meio sólido inclinado (meio Ps) composto por (em g/L): glicose, 10; extrato de levedura, 3; extrato de malte, 3; peptona, 5; ágar-ágar, 20. Após o crescimento em estufa a 28°C durante 48 h as células foram armazenadas em geladeira a 4°C. Para melhor conservação ambos os microrganismos foram reativados mensalmente através de repiques em meio fresco. 4.5.2.2. Meio sintético para fermentação O meio sintético utilizado nas fermentações foi semelhante ao definido por Rodriguez e Callieri (1986), com algumas modificações, cuja composição (em g/L) foi: extrato de levedura, 5; KH2PO4, 1; (NH4)2SO4, 1; MgSO4.7H2O, 1; e a concentração desejada de açúcares. Três diferentes concentrações de glicose e xilose foram avaliadas conjuntamente: 25, 75 e 125 g/L, formando três meios sintéticos com concentração total de açúcares de 50, 150 e 250 g/L, respectivamente. As soluções de glicose e xilose foram esterilizadas separadamente a 121°C durante 15 min e, depois de resfriadas até temperatura ambiente, misturadas assepticamente no momento do preparo do meio de fermentação contendo os demais constituintes previamente dissolvidos em água destilada e esterilizados. O pH do meio foi ajustado para o valor desejado de 4,5; 5,5 ou 6,5 com adições de NaOH e/ou HCl 2N. 4.5.2.3. Meio de cascas de banana e meio de cascas de laranja para fermentação O meio de cascas de banana e o meio de cascas de laranja na concentração de açúcares totais de 50, 150 e 250 g/L, depois de desintoxicados (item 4.4), foram autoclavados a 121°C durante 15 min. Após, foram misturados assepticamente com o meio de sais (meio definido por Rodriguez e Callieri (1986), item 4.5.2.2, sem a fonte de açúcar), previamente dissolvido em água destilada e esterilizado. O pH de cada meio foi ajustado para 4,5; 5,5 ou 6,5 com adições de NaOH e/ou HCl 2N. 4.5.3. Condições de fermentação 4.5.3.1. Preparo do pré-inóculo A partir das culturas de Z. mobilis e P. stipitis armazenadas em geladeira foram feitos os pré-inóculos para reativação das células. Uma alíquota de 1 mL da cepa de Z. 48 mobilis armazenada foi inoculada em tubos de ensaio contendo 10 mL do meio Zm, conforme descrito no item 4.5.2.1 e estes foram incubados em estufa a 30°C por 24 h. Uma alçada da cepa de P. stipitis armazenada foi repicada por esgotamento em tubos inclinados contendo 10 mL do meio Ps, conforme descrito no item 4.5.2.1, e estes foram incubados em estufa a 28°C durante 48 h. 4.5.3.2. Pré-fermentação As pré-fermentações foram realizadas separadamente para cada microrganismo. Para a Z. mobilis, 10 tubos de ensaio com os pré-inóculos obtidos no item 4.5.3.1 foram transferidos para frascos Erlenmeyer de 250 mL contendo 50 mL do meio Zm, descrito no item 4.5.2.1. Os frascos foram incubados em shaker orbital com temperatura controlada, a 30°C, durante 24 h. Para a P. stipitis obteve-se, primeiramente, uma suspensão celular pela adição de 5 mL de água destilada estéril ao pré-inóculo obtido no item 4.5.3.1. As suspensões celulares obtidas de 3 tubos com pré- inóculos foram transferidas para frascos Erlenmeyer de 125 mL contendo 50 mL do meio Ps, descrito no item 4.5.2.1, sem a adição de ágar. Os frascos foram então incubados em shaker orbital com temperatura controlada, a 28°C, durante 24 h e 150 rpm. 4.5.3.3. Padronização do inóculo A padronização do inóculo foi feita de acordo com Vignoli (2003) para garantir que a concentração de inóculo inicial fosse igual para todos os ensaios de fermentação. As suspensões celulares de Z. mobilis e P. stipitis obtidas na pré-fermentação (item 4.5.3.2) foram centrifugadas separadamente a 6941g, 4°C durante 15 min e ressuspensas em água destilada estéril. Para a padronização utilizou-se espectrofotômetro. Em uma cubeta de vidro foram adicionados 3 mL de água destilada e gotas da cultura ressuspensa em água até atingir uma densidade ótica de 0,3 no comprimento de onda de 570 nm, para cada microrganismo. Por meio de uma regra de três foi possível calcular os volumes de inóculos iniciais de Z. mobilis e de P. stipitis a serem adicionados em cada frasco Erlenmeyer de 250 mL, de modo que o volume final de trabalho com a adição do meio sintético fosse 100 mL. O inóculo inicial foi calculado, então, por meio da Equação1: 49 Vo = y3 y100   Onde: Vo = volume do inóculo inicial, em mL; y = volume de cultura ressuspensa em água para atingir densidade ótica de 0,3, em mL. Para todos os experimentos realizados, o volume adicionado de células de Z. mobilis ressuspensas em água variou de 5 a 6 mL, enquanto que o volume de células de P. stipitis variou de 6 a 7 mL. De acordo com as curvas de calibrações construídas para cada microrganismo (Tabela 1.A e 2.A, e Figura 1.A e 2.A, no Anexo), o inóculo inicial em massa seca foi de 0,073 g/L para as fermentações realizadas somente com a bactéria Z. mobilis, e de 0,237 g/L para as fermentações com co-culturas de Z. mobilis e P. stipitis. 4.6. Métodos analíticos 4.6.1. Construção da curva de calibração para determinação da concentração celular a partir de suspensões de Zymomonas mobilis CCT 4494 Para construção da curva de calibração relacionando a absorbância com diferentes concentrações da suspensão celular foi utilizada cultura de células de Z. mobilis obtida de forma semelhante ao processo de pré-fermentação para este microrganismo, conforme descrito no item 4.5.3.1, sendo que para a construção da curva os frascos Erlenmeyer de 250 mL foram deixados na estufa a 30°C por 72 h. Um volume de 150 mL da cultura de Z. mobilis obtido foi centrifugado a 6941g, 4°C, durante 15 min e lavado duas vezes com água destilada. A massa celular úmida foi ressuspensa em 20 mL de água destilada e posteriormente foram preparadas diferentes diluições. Um volume de 7 mL de cada diluição preparada foi colocado em cadinhos de porcelana, previamente secos em estufa a 105°C e tarados. Os cadinhos foram, então, deixados na estufa a 105°C por 24 h. Findo o período, os cadinhos foram transferidos para um dessecador contendo cristais de sílica e mantidos até atingirem temperatura ambiente. Após o resfriamento, foram pesados em balança analítica, transferidos novamente para a estufa e, após 24 h, pesados de novo até a obtenção de massa 50 constante. A concentração celular de cada diluição preparada a partir da suspensão de células original foi determinada pela Equação 2: X =   V 1000MM 12  Onde: X = Concentração celular, em g/L; M1 = massa do cadinho vazio e tarado, em g; M2 = massa final do cadinho, em g; V = volume de amostra colocado no cadinho, em mL. Paralelamente, a absorbância das diferentes diluições preparadas a partir da suspensão de células original foi lida em espectrofotômetro, em comprimento de onda de 570 nm e, então, foi construída uma curva de calibração, relacionando a absorbância das diferentes diluições com a concentração celular (Tabela 1.A e Figura 1.A, no Anexo) 4.6.2. Construção da curva de calibração para determinação da concentração celular a partir de suspensões de Pichia stipitis CCT 2617 Para a curva de calibração relacionando a absorbância com diferentes concentrações da suspensão celular de P. stipitis foi utilizada uma cultura de células obtida de forma idêntica ao processo de pré-fermentação para este microrganismo, conforme descrito no item 4.5.3.1. Um volume de 50 mL da cultura de P. stipitis obtida foi centrifugado a 6941g, 4°C, durante 15 min e lavado duas vezes com água destilada. A massa celular úmida foi ressuspensa em 50 mL de água destilada e a partir daí foram preparadas diferentes diluições. Feitas as diluições, a curva de calibração para esta levedura (Tabela 2.A e Figura 2.A, no Anexo) foi construída utilizando a mesma metodologia descrita no item 4.6.1. 51 4.6.3. Construção da curva de calibração para determinação da concentração celular a partir de suspensões de Zymomonas mobilis CCT 4494 e Pichia stipitis CCT 2617 A cultura de células para construção da curva foi obtida a partir de um inóculo da bactéria Z. mobilis e um inóculo da levedura P. stipitis padronizados como descrito no item 4.5.3.3. Estes foram inoculados simultaneamente em frasco Erlenmeyer de 250 mL contendo 50 mL de meio sintético com concentração de açúcares de 50 g/L. O frasco foi, então, colocado em incubadora a 30°C e 150 rpm por 24 h. Um volume de 50 mL da cultura de Z. mobilis e P. stipitis obtido foi centrifugado a 6941g, 4°C, durante 15 min e lavado duas vezes com água destilada. A massa celular úmida foi ressuspensa em 50 mL de água destilada e a partir daí foram preparadas diferentes diluições. Feitas as diluições, a curva de calibração para a Z. mobilis e P. stipitis crescendo simultaneamente (Tabela 3.A e Figura 3.A, no Anexo) foi construída utilizando a mesma metodologia descrita no item 4.6.1. 4.6.4. Coleta e preparo das amostras durante a fermentação As amostras de cada ensaio de fermentação foram coletadas a cada 24 h em temperatura ambiente de 30°C. Primeiramente foi determinado o valor de pH do caldo fermentado e, em seguida, 10 mL do caldo foram centrifugados a 6941g, 4°C, durante 15 min, para a determinação da concentração celular em espectrofotômetro. O restante do caldo obtido foi centrifugado nas mesmas condições e o sobrenadante foi separado e congelado para as análises posteriores (determinação de etanol e açúcares totais). 4.6.5. Determinação do pH O pH foi determinado diretamente no caldo fermentado por potenciometria. 4.6.6. Determinação da concentração celular Após a centrifugação do caldo fermentado, a concentração celular foi determinada pela medição da absorbância de suspensões celulares diluídas em água destilada. As leituras foram feitas em espectrofotômetro em comprimento de onda de 570 nm para os dois microrganismos. A conversão da suspensão microbiana em concentração celular (massa de matéria seca por unidade de volume) foi obtida através das curvas de calibração da concentração celular de Z. mobilis (item 4.6.1) ou P. stipitis 52 (item 4.6.2) para os ensaios com somente um desses microrganismos e através da curva de calibração de Z. mobilis e P. stipitis (item 4.6.3) para os ensaios onde os dois microrganismo foram inoculados juntos. 4.6.7. Determinação de etanol O etanol foi determinado por cromatografia gasosa, após separação das células por centrifugação, utilizando cromatógrafo equipado com detector FID (Flame Ionization Detector), coluna – TR-WAX (30 m x 0,53 mm x 1,0 µm); temperatura do forno de 100°C (mantendo esta temperatura por toda corrida - isotérmica); tempo da corrida de 5 min; temperatura do injetor de 230°C; temperatura do detector de 270°C; injeção de 50 µl de vapor da amostra. As amostras foram deixadas em “dry block” em uma temperatura de 40°C (até atingir o equilíbrio). Para quantificação foi criada uma curva de calibração utilizando soluções de etanol absoluto em água como padrão, em concentrações de 7,89 a 78,90 g/L, nas mesmas condições descritas acima (Tabela 4.A e Figura 4.A, no Anexo). 4.6.8. Determinação de açúcares totais (AT) Os açúcares totais (AT) foram determinados pelo método fenol-sulfúrico, descrito por Dubois et al. (1956). Em um tubo de ensaio foram adicionados 500 µl da amostra, 500 µl de solução de fenol a 5% e 2,5 mL de ácido sulfúrico concentrado. A mistura foi levemente agitada e deixada em repouso, à temperatura ambiente, por 20 min. Após esse período, a coloração alaranjada produzida pela condensação do reagente fenol com os grupos aldeídos foi medida espectrofotometricamente, no comprimento de onda de 490 nm, e a absorbância utilizada para calcular o conteúdo de açúcares totais nas amostras. Para quantificação de AT foi utilizada curva de calibração obtida a partir de soluções aquosas de glicose nas concentrações de 0,02 a 0,10 g/L, nas mesmas condições descritas acima (Tabela 5.A e Figura 5.A, no Anexo). 4.6.9. Determinação de açúcares redutores (AR) Os açúcares redutores (AR) foram determinados pelo método do cuproarsenato, descrito por Somogyi (1952) e Nelson (1944). Em um tubo de ensaio foram adicionados 500 µl da amostra e 500 µl de reativo de Somogyi. A mistura foi deixada em banho-maria 53 por 10 min e, após esfriar, adicionada de 500 µl de reativo de Nelson e 3,5 mL de água destilada, com posterior agitação manual vigorosa. A coloração azul produzida pela redução do arsênio-molíbdico a óxido de molibdênio foi medida espectrofotometricamente, no comprimento de onda de 540 nm, e o valor da absorbância utilizada para calcular o conteúdo de açúcares redutores nas amostras. Para quantificação de AR foi utilizada curva de calibração utilizando soluções aquosas de glicose nas concentrações de 0,02 a 0,10 g/L, nas mesmas condições descritas acima (Tabela 6.A e Figura 6.A, no Anexo). 4.6.10. Determinação dos teores de compostos fenólicos Os compostos fenólicos totais foram determinados antes e depois da desintoxicação, nos meios contendo 50, 150 e 250 g/L de açúcares totais. A determinação foi feita pelo método de Folin-Ciocalteu, descrito por Chaovanalikit e Wrolstad (2004), no qual a mistura dos ácidos fosfowolfrámico e fosfomolíbdico em meio básico se reduz ao oxidar os compostos fenólicos, originando óxidos azuis de tungstênio e molibdeno. O reagente de Folin-Ciocalteau tem sua coloração alterada de amarela para azul na presença de compostos fenólicos e a intensidade da coloração azul segue a Lei de Lambert-Beer (KUSKOSKI et al., 2005). A reação foi composta por 500 µL do hidrolisado, 500 µL do reagente de Folin- Ciocalteu e 7,5 mL de água destilada. A mistura foi deixada em repouso por 10 min, na ausência de luz e em temperatura ambiente; e seguida acrescentou-se 1,5 mL de solução de carbonato de sódio 20% e após 20 min foi feita a leitura da absorbância em 755 nm. Para quantificação foi criada uma curva de calibração utilizando ácido vanílico como padrão, em concentrações de 0,05 a 0,25 g/L, nas mesmas condições descritas acima (Tabela 7.A e Figura 7.A, no Anexo). Os teores de compostos fenólicos totais foram expressos como g de equivalentes de ácido vanílico por L de hidrolisado. 4.7. Análise estatística Para as fermentações realizadas com meio sintético, meio de cascas de banana e meio de cascas de laranja foi empregado o planejamento experimental utilizando o software Minitab 14, a partir de um delineamento do tipo 24-1 (BOX; HINTER, 1978), 54 sendo necessários 8 experimentos e 3 repetições no ponto central, os 8 experimentos também foram realizados em triplicata. As variáveis independentes estudadas foram: X1 = microrganismo; X 2 = pH inicial; X3 = agitação e X4 = concentração inicial de açúcares. A Tabela 4 apresenta as variáveis independentes e seus respectivos níveis. A análise dos resultados e os efeitos principais e interações entre as variáveis do planejamento fatorial foram realizados através do programa computacional Minitab 14. Tabela 4 - Variáveis independentes, codificadas, estudadas para o meio sintético, meio de cascas de banana e meio de cascas de laranja. Variáveis Níveis -1 0 1 X1 - microrganismo Z. mobilis t=0 P. stipitis t=0 e Z. mobilis t=24 Z. mobilis e P. stipitis t=0 X2 - pH 4,5 5,5 6,5 X3 - agitação manual 5 min/dia 150 rpm até 18 h, depois estático 150 rpm X4 - concentração inicial de açúcares (g/L) 50 150 250 t = 0 - início da fermentação t = 24 - após 24 h de fermentação 55 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1. Ensaios de hidrólise ácida com a casca de banana No teste realizado para a hidrólise ácida, o emprego do aquecimento e do ácido diluído, simultaneamente, proporcionou maior liberação de açúcares do que a utilização destes fatores separadamente, conforme apresentado na Tabela 5. O emprego somente do aquecimento (Branco) ainda foi mais eficiente do que somente o ácido diluído (HA 0) na liberação de açúcares totais e redutores. Os hidrolisados com ácido obtidos após 15 e 30 min de aquecimento em autoclave (ensaios HA 15 e HA 30) apresentaram teores de açúcares totais de 75,40 e 76,47 g/L, respectivamente (Tabela 5), não apresentando diferença estatística (p < 0,05). Já para os açúcares redutores, o tempo de 15 min apresentou aproximadamente 4 g/L a mais do que o tempo de 30 min. Desta forma, foi adotado o tempo de 15 min em autoclave para a etapa de hidrólise ácida das cascas de banana e das cascas de laranja. Tabela 5 - Açúcares totais (AT) e redutores (AR) (g/L) liberados nos ensaios de hidrólise ácida das cascas de banana. Ensaios de hidrólise ácida* AT (g/L) AR (g/L) Branco 46,22 ± 6,11 b 38,73 ± 2,01 b HA 0 35,02 ± 1,17 c 9,51 ± 1,50 c HA 15 75,40 ± 6,01 a 43,90 ± 2,80 a HA 30 76,47 ± 2,92 a 40,20 ± 3,84 a Os resultados representam a média ± desvio padrão das análises realizadas em duplicata. a, b... (coluna) – médias seguidas de mesma letra minúscula não diferem pelo teste de Tukey (p < 0,05). *Branco - substrato aquecido (121°C, 15 min) sem adição de ácido; HA 0 - substrato em reação com ácido durante 15 min (sem aquecimento); HA 15 - substrato em reação com ácido a 121°C durante 15 min; HA 30 - substrato em reação com ácido a 121°C durante 30 min. A escolha se deve ao fato de que quanto menor for o tempo de aquecimento na hidrólise ácida, maior a economia do processo e, principalmente, menor a quantidade de compostos inibidores e tóxicos que poderão ser formados pela degradação dos açúcares e da lignina. Em altas temperaturas e pressões, glicose e xilose podem ser degradadas 56 em hidroximetilfurfural e furfural, respectivamente. Esses compostos, por sua vez, podem ser degradados formando ácido fórmico, que é tóxico para os microrganismos da fase de fermentação, inibindo seu metabolismo e interferindo negativamente no processo (FINGUERUT et al., 2008). Schulz (2010) testou os tempos de 15 e 30 min para a hidrólise da casca de banana nanica in natura, utilizando ácido sulfúrico a 1 e 2% e temperatura de 120°C. Para a concentração de ácido de 1%, os valores de açúcares totais foram de 7,95 e 7,21 g/L em 15 e 30 min de reação, respectivamente. Para a concentração de 2%, esses valores foram de 8,13 e 7,89 g/L, respectivamente. Como observado, os valores de açúcares totais obtidos pelo autor também foram próximos nos tempos de 15 e 30 min, porém inferiores aos encontrados neste trabalho. Apesar de tratar-se do mesmo resíduo, a casca de banana foi utilizada sem secagem prévia na pesquisa citada, o que pode acarretar menor concentração de açúcares. 5.2. Hidrólise enzimática com a casca de banana Após a realização da hidrólise enzimática todo o meio obtido foi filtrado e homogeneizado, a Tabela 6 apresenta as quantidades de AT e AR, liberadas por cada hidrólise, presentes nesse meio que foi utilizado nas fermentações. Lembrando que para as fermentações com quantidade inicial de açúcares de 50 g/L não houve concentração do meio; já para as fermentações com 150 e 250 g/L de açúcar, o meio obtido foi aquecido em banho-maria a 80°C, até atingir os respectivos teores de açúcares, isto é 150 e 250 g/L. Tabela 6 - Açúcares totais (AT) e redutores (AR) (g/L), liberados pela hidrólise ácida seguida de hidrólise enzimática, das cascas de banana. Hidrólise AT (g/L) AR (g/L) Ácida 64,97 ± 2,11 35,19 ± 1,42 Enzimática 134,75 ± 6,51 91,81 ± 5,27 Em sua pesquisa, El-Zawawy et al. (2011) realizaram a hidrólise enzimática de resíduos da bananeira previamente submetidos a explosão a vapor. Para a hidrólise 57 empregou-se um complexo de celulases produzidas por Trichoderma reesei ATCC 26921 (Sigma), a reação ocorreu a 50°C, pH de 4,7 e agitação de 75 rpm durante 4 dias. A maior quantidade de glicose liberada foi 8 g/L, depois de 3 dias de reação. A hidrólise enzimática de cascas de banana, previamente secas em estufa a 60°C, também foi realizada por Oberoi et al. (2011). Foram utilizadas proporções variadas das enzimas celulase, cedida pela empresa Novozymes, e pectinase, cedida pela empresa Sigma-Aldrich. A maior quantidade de glicose (32,7 g/L) foi liberada em 20 h de reação, pH 5,5 a 40°C e proporção de pectinase:celulase de 8:1. Schulz (2010) hidrolisou cascas de banana nanica in natura empregando o mesmo conjunto de enzimas utilizado no Ensaio I do presente trabalho e nas mesmas quantidades, porém a reação ocorreu a 45°C e pH de 4,5. A quantidade máxima de açúcares foi de 9,17 g/L, obtida depois de 2 h de reação. No mesmo trabalho, somente com a hidrólise ácida, o autor já havia encontrado 8,13 g/L de açúcar na casca de banana in natura e, dada a proximidade dos valores, não apontou como justificável o uso da hidrólise enzimática nos resíduos. Essa observação foi diferente da encontrada nesta pesquisa, onde, após a hidrólise enzimática, a quantidade de açúcares totais praticamente dobrou, justificando assim a realização dessa etapa. 5.3. Ensaios de hidrólise ácida com a casca de laranja Nos testes realizados para a hidrólise ácida, a Tabela 7 mostra que os hidrolisados obtidos depois de 15 e 30 min em autoclave apresentaram teor de AT de 101,30 e 101,07 g/L, e de AR de 65,89 e 65,05 g/L, respectivamente. Observa-se que somente o uso de aquecimento (HA branco) liberou maior quantidade de AT do que somente o uso do ácido (HA 0), mesmo assim, a adição de ácido sulfúrico juntamente com o aquecimento em autoclave mostrou-se mais eficiente para a liberação de AT e AR, sendo o tempo de 15 min mais vantajoso, da mesma forma como observado para as cascas de banana. Em estudo com cascas de laranja, Tejeda et al. (2010) também trataram esses resíduos com hidrólise ácida utilizando ácido sulfúrico a 5%. Após a hidrólise obtiveram 80 g/L de açúcares fermentescíveis, que produziram 13,9 g/L de etanol após fermentação com Sacc