(22) Data do Depósito: 05/11/2020 (43) Data da Publicação Nacional: 17/05/2022 (21) BR 102020022603-7 A2 Ministério da Economia República Federativa do Brasil Instituto Nacional da Propriedade Industrial *BR102020022603A2* INPI (54) Título: MÉTODO DE PREPARO E CARACTERIZAÇÃO DE NANOCARREADORES PROTEÍCOS PARA LIBERAÇÃO DE COMPOSTOS BOTÂNICOS POR ESTÍMULOS AMBIENTAIS E RESPECTIVAS FORMULAÇÕES (51) Int. Cl.: A01N 49/00; A01N 31/02; A01N 27/00; A01N 35/02; A01N 65/26; (...). (52) CPC: A01N 49/00; A01N 31/02; A01N 27/00; A01N 35/02; A01N 65/26; (...). (71) Depositante(es): UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JULIO DE MESQUITA FILHO; UNIVERSIDADE DE SOROCABA - UNISO; FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DO ABC - UFABC. (72) Inventor(es): LEONARDO FERNANDES FRACETO,; JHONES LUIZ DE OLIVEIRA; LUCAS BRAGANÇA DE CARVALHO; MARCELA CANDIDO CAMARA; PATRÍCIA LUIZA DE FREITAS PROENÇA; RENATA APARECIDA MONTEIRO; RENATA DE LIMA; MARIANA GUILGER CASAGRANDE; ESTEFÂNIA VANGELIE RAMOS CAMPOS. (57) Resumo: MÉTODO DE PREPARO E CARACTERIZAÇÃO DE NANOCARREADORES PROTEÍCOS PARA LIBERAÇÃO DE COMPOSTOS BOTÂNICOS POR ESTÍMULOS AMBIENTAIS E RESPECTIVAS FORMULAÇÕES. Trata-se de método de preparo e caracterização de nanocarreadores proteícos permitindo a aplicação agrícola no controle específico de uma determinada praga, reduzindo perdas e efeitos adversos para organismos não-alvo; dito método de preparo e caracterização das nanopartículas de zeína que contém mistura de diferentes compostos botânicos como geraniol, linalol, limoneno, cinamaldeído e nim e suas associações serem suscetíveis a ação enzimática da enzima tripsina. 1 /31    “MÉTODO  DE  PREPARO  E  CARACTERIZAÇÃO  DE  NANOCARREADORES  PROTEÍCOS  PARA  LIBERAÇÃO  DE  COMPOSTOS  BOTÂNICOS  POR  ESTÍMULOS  AMBIENTAIS  E  RESPECTIVAS FORMULAÇÕES”.  CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO  [001] A presente patente de invenção trata de método de preparo e caracterização de  nanocarreadores  proteícos  para  liberação  de  compostos  botânicos  por  estímulos  ambientais  como  a  degradação  enzimática  e  respectivas  formulações  permitindo  a  aplicação agrícola no controle específico de uma determinada praga, reduzindo perdas  e  efeitos  adversos  para  organismos  não‐alvo.  O  preparo  e  caracterização  de  nanopartículas de zeína contendo a mistura de diferentes compostos botânicos como  geraniol, linalol, limoneno, cinamaldeído e nim e suas associações compõe o presente  invento por se mostrarem suscetíveis a ação enzimática da enzima tripsina aliado ao  fato desses sistemas aumentarem a estabilidade e eficácia dos compostos naturais e,  também, realizarem a liberação controlada por estímulo enzimático.  HISTÓRICO DA INVENÇÃO  [002] O uso excessivo dos agrotóxicos em sistemas de produção intensivos, levam ao  aumento de concentrações residuais e da deriva dos agrotóxicos durante o processo de  aplicação dos produtos,  gerando assim grandes problemas ambientais,  aumento dos  custos  de  produção,  perdas  de  áreas  produtivas  e  também  danos  à  saúde  humana  (ALBUQUERQUE et al., 2016).   [003] Neste contexto, há a necessidade de uma nova revolução na agricultura por meio  da implementação da agricultura sustentável (CAIRA; FERRANTI, 2016). Neste modelo  agrícola  é  priorizado  a  diminuição  do  uso  de  agrotóxicos  e  o  emprego  de métodos  menos tóxicos a organismos não alvo para o controle de pragas, como por exemplo o  uso  de  compostos  naturais,  dentro  do  qual  podemos  destacar  o  uso  dos  pesticidas  botânicos (CAMPOS et al., 2016; DAR et al., 2014) e ainda combinação de pesticidas e  inimigos naturais ou também controle biológico através de microrganismos (CAMPOS et  al., 2018).   [004] Em  especial,  os  pesticidas  botânicos  são  produzidos  através  do metabolismo  secundário  das  plantas,  sendo  importante  na  defesa  contra  patógenos  e  pragas.  Petição 870200139534, de 05/11/2020, pág. 18/69 2 /31    Apresentam,  portanto,  várias  atividades  biológicas  incluindo  toxicidade  para  pragas  agrícolas  (ISMAN,  2017).  Visando  o  aumento  da  atividade  biológica  e  diminuição  de  resistência a combinação de compostos isolados de diferentes plantas mostra‐se uma  importante estratégia (CHEN et al., 2018). No entanto, apesar de suas vantagens frente  os inseticidas sintéticos, esses compostos naturais apresentam baixa estabilidade o que  dificulta  a  sua  utilização  efetiva  em  aplicações  agrícolas  (PANT;  DUBEY;  PATANJALI,  2016).  [005] A encapsulação de  compostos  botânicos  tem  sido uma  importante estratégia  para melhorar a estabilidade e eficiência desses compostos naturais. Com o avanço das  pesquisas na área, foi possível também o desenvolvimento de sistemas “inteligentes”  que  ao  receberem  estímulos  apresentam  uma  resposta  ativa  e  liberam  a  molécula  carreada  para  o  meio  circundante  (KAMALY  et  al.,  2016).  Dentre  esses  estímulos  empregados para induzir a liberação estão: as alterações de parâmetros bioquímicos,  como por exemplo a modulação da concentração e/ou a presença de uma enzima, pH,  temperatura,  luz entre outros. A utilização desse  tipo de sistemas é uma  importante  estratégia a fim de aumentar a efetividade, seletividade, além de um controle espaço‐ temporal  da  liberação  de  compostos  ativos  (CAMARA  et  al.,  2019).  Esses  sistemas  podem serem produzidos por diversas matrizes, a exemplo da zeína (DE OLIVEIRA et al.,  2014).   ANÁLISE DO ESTADO DA TÉCNICA  [006] Em pesquisa realizada em bancos de dados especializados  foram encontrados  documentos referentes à encapsulação de compostos botânicos, tal como, apresentado  no documento de nº. US20150004102 que trata do preparo e caracterização de uma  formulação  baseada  em nanopartículas  de  zeína  para  a  encapsulação  de  compostos  bioativos, podendo também ser utilizada para pesticidas botânicos. No método descrito  pelos inventores é realizado a mistura de zeína e propilenoglicol a fim de produzir uma  formulação estável para diversas aplicações. Supracitado documento não revela sobre  a liberação mediada através de estímulo.  [007] O documento de nº. CA2805581 descreve, também, um método para a obtenção  de nanopartículas de zeína, baseado na utilização de tensoativos como estabilizantes.  Petição 870200139534, de 05/11/2020, pág. 19/69 3 /31    Os  inventores  descrevem  a  capacidade  de  encapsulação  de  diferentes  compostos  biologicamente  ativos  sendo  tanto  solúveis  em  água  ou  lipossolúveis.  Na  presente  invenção,  são  apresentados  o  preparo  e  caracterização  de  mistura  de  compostos  botânicos encapsulados em nanopartículas de zeína as quais são responsivas a enzima  tripsina.  São  encontradas  inúmeros  documento  como  de  nº.  CA3022928A1,  US20180092845A1, EP3003281B1 e US9539338 que descrevem o desenvolvimento de  nanopartículas  responsivas  a  diferentes  estímulos,  quais  sejam,  enzimático,  pH,  temperatura entre outros.   [008] O documento  de  nº.  CN103813786A  descreve  o  preparo  de  nanopartículas  a  base de zeína para aplicações biomédicas. Os inventores também descrevem também a  possibilidade  de  resposta  mediada  a  diferentes  estímulos  pelo  sistema  produzido,  podendo ser para liberação mais específicas dos ativos e direcionamento no tratamento  de tumores, no entanto, não com o foco para controle de pragas em agricultura.  [009] O documento de nº. CA3022928 se refere a métodos e produtos associados com  medições de atividade de protease in vitro e in vivo e perfil de enzima. Alguns aspectos  da  presente  divulgação  se  referem  à  medição  da  atividade  de  protease  acionada  remotamente. Em particular, a divulgação se refere a métodos de processamento in vivo  de  moléculas  exógenas,  seguido  pela  detecção  de  moléculas  de  assinatura  como  representativas da presença ou ausência de enzimas  ativas  associadas  a doenças ou  condições. A divulgação também se refere a produtos, kits e bancos de dados para uso  nos métodos da divulgação.  [010] Em  comparação  com  o  estado  da  arte  aqui  mencionado  a  inventividade  da  presente proposta encontra‐se nas misturas de diferentes compostos botânicos como  geraniol,  linalol,  limoneno, cinamaldeído e nim e suas associações por se mostraram  suscetíveis  a  ação  enzimática  da  enzima  tripsina  aliado  ao  fato  desses  sistemas  aumentarem a estabilidade e eficácia dos compostos naturais e também realizarem a  liberação controlada por estímulo enzimático.  OBJETIVOS DA INVENÇÃO  [011] A presente invenção tem por objetivo o preparo desses sistemas para aumentar  a  estabilidade  e  eficácia  dos  compostos  naturais  e  também  realizar  a  liberação  Petição 870200139534, de 05/11/2020, pág. 20/69 4 /31    controlada por estímulo enzimático. Ademais a presente invenção abre caminho para  aumentar  a  seletividade  e  controle  espaço‐temporal  da  liberação  dos  ativos  para  o  manejo mais eficiente e sustentável de pragas agrícolas.  [012] Os sistemas produzidos na presente invenção contêm a misturas de diferentes  compostos  botânicos  como  geraniol,  linalol,  limoneno,  cinamaldeído  e  nim  e  suas  associações e mostram‐se suscetíveis a ação enzimática da enzima tripsina, a qual está  também presente no midgut de insetos.   [013] A  presente  invenção  apresenta  vantagens  em  relação  as  formulações  convencionais, uma vez que aumenta a eficácia dos produtos naturais. Além de fornecer  uma formulação que é responsiva a estímulo enzimática, fazendo com que ocorra uma  liberação mais específica contribuindo para redução no impacto ambiental.  DESCRIÇÃO DAS FIGURAS  [014] A  complementar  a  presente  descrição  de  modo  a  obter  uma  melhor  compreensão das características do presente invento e de acordo com uma preferencial  realização  prática  do  mesmo,  acompanha  a  descrição,  em  anexo,  um  conjunto  de  figuras, onde, de maneira exemplificada, embora não limitativa, se representou:  [015] as  figuras  revelam gráficos onde:  figura 1A revela Caracterização do diâmetro  médio das nanopartículas sem (NP CTL) e com os ativos (NP LIM + CVC); figura 1B mostra  índice de polidispersão das nanopartículas NP CTL E NP LIM + CVC ambos em função do  tempo de armazenamento. Variações significativas entre os grupos são representados  como: a – comparação com o tempo zero, b – comparação com 7 dias, c‐ comparação  com  14  dias,  d  –  comparação  com  21  dias,  e  –  comparação  com  30  dias  após  esse  período  não  houve  variação  significativa.  Os  valores  representam  média  de  três  determinações.  Para os  gráficos  figura  1C  e  figura  1D  representam a  intensidade do  tamanho em relação ao tempo de armazenamento de 0 a 120 dias para ambas (NP CTL  e NP LIM + CVC). Foi considerado significância de p<0,05 (ANOVA);  [016] as figuras mostram gráficos da distribuição de tamanho para as formulações de  nanopartículas contendo a mistura de compostos botânicos onde a figura 2A Controle e  figura 2B Nim+LNL após 120 dias, e figura 2C GRL+CND após 60 dias, analisados pelo  DLS;  Petição 870200139534, de 05/11/2020, pág. 21/69 5 /31    [017] as  figuras  revelam  gráficos  da  caracterização  das    nanopartículas  de  zeína  controlem (NP CTL) e carregadas com os ativos limoneno e carvacrol  (NP LIM + CVC),  sendo:  figura  3A Análise  de  distribuição  de  tamanho  pela  técnica  de NTA;  figura  3B  Análise de concentração de partículas por NTA; figura 3C Análise de potencial zeta por  microeletroforese;  figura  3D  Análise  de  pH  e  figura  3E  Análise  de  eficiência  de  encapsulação.  Variações  significativas  entre  os  grupos  são  representados  como:  a  –  comparação com o tempo zero, b – comparação com 7 dias, c‐ comparação com 14 dias,  d – comparação com 21 dias, e – comparação com 30 dias após esse período não houve  variação  significativa.  Os  valores  representam  média  de  três  determinações.  Foi  considerado significância de p<0,05 (ANOVA);  [018] as  figuras  mostram  gráficos  da  caracterização  das  nanopartículas  de  zeína  controle  e  carregadas  com  a  mistura  dos  ativos  botânicos  nim+linalol  e  geraniol+cinamaldeído, sendo: figura 4A Análise do potenical zeta; figura 4B Análise do  índice de polidispersão; figura 4C Análise da concentração de partículas pela técnica de  NTA;  [019] as  figuras  ilustram a micrografia das nanopartículas de  zeína  com LIM + CVC,  realizadas pelo AFM onde figura 5A imagem topográfica e a figura 5B imagem em 3D  das nanopartículas e figura 5C gráfico de tamanho médio das nanopartículas, tratado  pelo software Gwyddion;  [020] a  figura mostra  a  micrografia  das  nanopartículas  de  zeína  com  Nim  +  LNL  e  GRL+CND,  realizadas  pelo  AFM  onde  a  figura  6A  revela  a  imagem  topográfica  da  formulação  de Nim+LNL;  figura  6B  imagem  topográfica  da  formulação  de GRL+CND;  figura 6C gráfico de tamanho médio das nanopartículas contendo Nim+LNL e figura 6D  gráfico  de  tamanho  médio  das  nanopartículas  contendo  GRL+CND,  tratado  pelo  software Gwyddion;  [021] a  figura 7  ilustra  gráficos de espectros de  infravermelho para  as  amostras de  zeína, pluronic F‐68, óleo essencial de carvacrol (CVC), óleo essencial de limoneno (LIM),  nanopartículas controle (NP CTL) e nanopartículas carregadas com limoneno e carvacrol  (NP LIM+ CVC);  [022] a  figura  8  representa  gráficos  de  termogramas  de  Calorimetria  Diferencial  Petição 870200139534, de 05/11/2020, pág. 22/69 6 /31    Exploratória para o surfactante Pluronic, Zeína pura, NP CTL e NP LIM + CVC;  [023] a  figura  9  ilustra  imagens  fotográficas  de  vasos  com  as  plantas  de  feijão  nos  tratamentos onde: (A) Pluronic, (B) Água, (C) Zeína, (D) Plantas tratadas com NP CTL; D‐ 1 : 0,25 g/mL; D‐2 1,25 g/mL;  D‐3 : a 2,5 g/mL; D‐4: 3,75 g/mL; D‐5: 5 g/mL.  (E)  Plantas tratadas com NP LIM + CVC E‐1 0,25 g/mL; E‐2:   1,25 g/mL; E‐3: a 2,5 g/mL;  E‐4:  a 3,75 g/mL; E‐5: 5 g/mL. Considerando a significância de p<0,05 (ANOVA);  [024] a figura 10 mostra gráfico das medições de feijão da parte aérea e da raíz das  plântulas. Considerando a significância de p<0,05 (ANOVA);  [025] as  figuras  revelam gráficos onde  figura 11A Análise de clorofila  ‘a’;  figura 11B  Análise  clorofila  ‘b’;  figura  11C  Carotenóides  em  plantas  de  feijão.  Foram  realizadas  analises de significância através da ANOVA p> 0,5 %;  [026] as  figuras mostram gráficos da avaliação da  fitotoxicidade pós‐emergente em  feijão  tratados  com  nanoformulaçõees  sem  ativo  (CTL)  e  com  Zeína/Nim+LNL  em  diferentes concentrações. Em figura 12A estão representados o comprimento do caule  e raiz, figura 12B massa seca das plantas, figura 12C teor de clorofila A, B e carotenoides,  e em figura 12D comparação das plantas tratadas com nanopartículas de zeína sem ativo  (CTL) e tratadas com Nim+LNL. Os dados foram submetidos a análise de variância (one‐ way  ANOVA)  com  pós  teste  de  Duncan,  onde  foi  considerado  nível  de  significância  p<0,005. * indicam diferença significativa relativo ao tratamento água;  [027] a figura 13 mostra um gráfico do efeito de diferentes pH na atividade da tripsina  em temperatura de 37ºC;  [028] as figuras representam gráficos onde: figura 14A Análise do tamanho das NP LIM  + CVC, figura 14B Polidespersão das NP LIM + CVC figura 14C Potencial zeta das NP LIM  + CVC pela técnica de DLS figura 14D Análise de tamanho e concentração das NP LIM +  CVC através da técnica de NTA (para ambos gráficos). Análises em função do tempo de  contato  com a  enzima,  sem adição  e  com a enzima nos  tempos  0,  15,  30,  60  e  120  minutos;  [029] a figura 15 ilustra imagem fotográfica de formulação baseada em nanopartículas  de zeína expostas à enzima tripsina e monitoradas por um período de 2 horas, seguida  de curvas de absorbância obtidas para as  formulações produzidas com 20% de zeína  Petição 870200139534, de 05/11/2020, pág. 23/69 7 /31    marcada com Fluoresceína;  [030] as  figuras  revelam  gráficos  da  análise  da  degradação  das  nanopartículas  contendo a mistura dos compostos linalol e nim pela enzima tripsina, sendo figura 16A  Absorção da fluoresceína e figura 16B Concentração das nanopartículas analisado por  NTA;  [031] a  figura  17  compreende  SDS‐PAGE  em  gel  poliacrilamida,  iniciando  com  o  marcador de peso molecular seguindo com as formulações: Tripsina; zeína; NP LIM +  CVC (sem a enzima); formulação de NP LIM+CVC + tripsina incubada nos tempos 0; 15;  30; 60 e 120 minutos.  DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO  [032] Com  referência  aos  desenhos  ilustrados,  a  presente  patente  de  invenção  se  refere  à  “MÉTODO  DE  PREPARO  E  CARACTERIZAÇÃO  DE  NANOCARREADORES  PROTEÍCOS  PARA  LIBERAÇÃO  DE  COMPOSTOS  BOTÂNICOS  POR  ESTÍMULOS  AMBIENTAIS E RESPECTIVAS FORMULAÇÕES”, mais precisamente trata‐se de método  de  preparo  e  caracterização  de  nanocarreadores  proteícos  permitindo  a  aplicação  agrícola no controle específico de uma determinada praga, reduzindo perdas e efeitos  adversos para organismos não‐alvo.  [033] Segundo  a  presente  invenção,  o  método  de  preparo  e  caracterização  das  nanopartículas de zeína que contém mistura de diferentes compostos botânicos como  geraniol, linalol, limoneno, cinamaldeído e nim e suas associações são suscetíveis a ação  enzimática da enzima tripsina aumentando a seletividade e controle espaço‐temporal  da liberação dos ativos para o manejo mais eficiente e sustentável de pragas agrícolas.  [034] Dito método  de  preparo  das  nanopartículas  de  zeína  apresenta  as  seguintes  etapas:  i) As  nanopartículas  de  zeína  são  preparadas  pelo método  de  precipitação  por  antissolvente  descrito  por  Hu  e Mc  Clements  (2014).  A  zeína  (2% m/v)  é  dissolvida  overnight (durante o período de 24 horas) numa solução hidroetanólica (85:15, v/v);  ii) Na  sequência  essa  solução,  é  submetida  a  centrifugação  à  4500  rpm  por  30  minutos, seguido de tratamento térmico a 75°C por 15 minutos e filtração em filtros de  seringa (0,45 µm ‐ Millipore);  Petição 870200139534, de 05/11/2020, pág. 24/69 8 /31    iii) Separadamente é preparada uma solução aquosa de Pluronic F‐68 (2% m/v) e o  pH da solução ajustado para 8. Com a solução de zeína previamente tratada (10 mL) são  adicionados 150 mg  de cada ativo sendo: Mistura de limoneno e carvacrol (1:1), Mistura  de geraniol e cinamaldeído (1:1 v:v) e Mistura de nim e linalol (1:1 v:v) agitando para  completa  dissolução dos óleos. Posteriormente a solução orgânica contendo os ativos  foi injetada a solução aquosa de surfactante (30 mL) sob agitação magnética;  iv) A  dispersão  coloidal  resultante  é  rotaevaporada  para  evaporação  do  etanol,  sendo se necessário adição de água a pH 8 para o volume perdido em excesso;  v) Uma partícula controle é preparada sem a adição dos ativos;   vi) A solução final de cada formulação contendo a mistura dos compostos botânicos  contém a concentração de 5 mg/mL de ambos ativos.  [035] Dito  método  de  caracterização  físico‐química  das  nanopartículas  de  zeína  apresenta as seguintes etapas:    i) as formulações preparadas são caraterizadas pelo seu diâmetro hidrodinâmico,  índice de polidispersão, potencial zeta, concentração, pH e eficiência de encapsulação.  A  técnica  de  espectroscopia  de  correlação  de  fótons  (espalhamento  de  luz)  foi  empregada para a determinação do diâmetro hidrodinâmico e o índice de polidispersão  (PDI), já para o potencial a técnica de microeletroforese foi realizada;   ii) Para  ambas medidas,  as  nanopartículas  foram  diluídas  (1:200,  v:v)  com  água  deionizada sem ajuste de pH e analisadas utilizando o ZetaSizer ZS 90 (Malvern®).   iii) A  técnica  de  rastreamento  de  nanopartículas  (NTA)  é  empregado  para  determinar a concentração e tamanho das nanopartículas. Para realização desta análise  utilizou‐se uma célula NanoSight LM 10 (laser verde, 532 nm), uma câmera sCMOS e  ‘software’ NanoSight (versão 3.2);  iv) As  diluições  das  suspensões  de  nanopartículas  foram  realizadas  em  água  deionizada (1:6000, v:v). Onde são realizados 5 vídeos de 60 segundos em temperatura  ambiente (25°C), compreendendo uma leitura de aproximadamente 100 partículas por  frame;  v) O monitoramento do pH é  realizado utilizando um potenciômetro  (OHAUS®),  calibrado com soluções tampão em pH 4,0 e 7,0 e controle de temperatura. Para cada  Petição 870200139534, de 05/11/2020, pág. 25/69 9 /31    amostra  são  realizadas  três medidas  e  o  resultado  foi  expresso  como média  dessas  determinações;  vi) Já a eficiência de encapsulação dos compostos botânicos nas nanopartículas de  zeína é determinada pelo método de ultrafiltração/centrifugação, o qual é submetida a  suspensão  de  nanopartículas  a  centrifugação  utilizando  dispositivos  de  celulose  regenerada com poro de exclusão 10 kDa (Microcon‐Millipore®) em uma centrífuga (NT  805)  por  15  minutos  à  24.0000  g.  Sendo  o  compostos  filtrado  quantificado  por  cromatografia líquida de alta eficiência CLAE. (PEREIRA, A E.S. et al., 2014).  ‐ Análise morfológica das nanopartículas     [036] Através  da  técnica  de  microscopia  de  força  atômica  (AFM),  obteve‐se  uma  imagem topográfica e assim pode‐se analisar a morfologia dessas nanopartículas, além  do tamanho. As análises morfológicas foram feitas por um microscópio de força atômica  (Nanosurf® Easy Scan 2 Basic AFM – Pattern BT02217, Switzerland), onde as suspensões  das nanopartículas foram diluídas, gotejadas em um suporte de silício e mantidas em  dessecador até a secagem das amostras. As análises foram realizadas operando‐se em  modo de não‐contato, com cantilever TapAl‐G (BudgetSensors®, Bulgária) com uma taxa  de varredura de 90 Hz. As imagens foram tratadas pelo software Gwyddion e o ImageJ.  Sendo realizado a contagem e medições de 150 nanopartículas para determinação da  média apresentada no gráfico de distribuição (NEČAS; KLAPETEK, 2011).  ‐ Análise Estrutural  [037] A análise estrutural dos sistemas produzidos foi avaliada através da técnica de  espectroscopia de infravermelho com transformadas de Fourier (FTIR) e também pela  técnica  de  calorimetria  diferencial  exploratória  (CDE).  Para  as  análises  de  FTIR  as  nanopartículas  foram centrifugadas para formação de pellets e posteriormente secas  em  dessecador.  A  análise  foi  realizada  através  de  pastilhas  de  KBr,  produzidas  pela  prensagem do macerado de KBr contendo 1,5% de amostra. As amostras oleosas foram  medidas  através  de  um  disco  de  KBr  gotejado  com  amostra.  Para  obtenção  dos  espectros  foi  utilizado  um  equipamento  FTIR‐410  equipado  com  acessórios  para  medidas de transmitância, onde foi utilizado o método de reflexão difusa por KBr, em  faixa de 400 a 4000 cm‐1, empregando 64 varreduras por amostra com resolução de 8  Petição 870200139534, de 05/11/2020, pág. 26/69 10 /31    cm‐1  (SOLOMONS  et.  al,  2001).  Já  para  as  análises  de  CDE  as  suspensões  de  nanopartícula  foram  centrifugadas  por  15  minutos  à  24.000  g  por  3  vezes,  para  a  formação do pellet, e posteriormente foram colocadas para secagem em um dessecador  pelo  período  de  7  dias.  As  análises  foram  feitas  utilizando  um  calorímetro  TA  Instruments DSC Q20 equipado  com  sistema de  refrigeração,  utilizando um  fluxo de  nitrogênio de 50 mL/min, com variação de temperatura 0 ºC com uma rampa de 10 ºC  à 300 °C/min. Os resultados foram expressos em forma de termogramas.     ‐ Ensaio de Fitotoxicidade em Plantas  [038] Para  o  ensaio  com  plantas,  sementes  foram  plantadas  em  vasos  de  9,3  cm  preenchidos  com  600  g  de  substrato  Carolina  Soil  (turfa  sphagnum,  vermiculita  expandida,  calcário  dolomítico,  giz  agrícola  e  fertilizante  NPK).  Os  tratamentos  consistiram  nas  formulações  de  nanopartículas  carregadas  com  os  compostos  botânicos, bem como os controles com pluronic, água e zeína. Ambos os tratamentos  foram testados em diferentes concentrações (0,250, 1,25, 2,5, 3,75 e 5 g/mL).   [039] Para os  tratamentos de pós emergência,  foi  utilizado um volume de 5 mL da  formulação, qual foi pulverizada nos vasos 15 dias após a germinação das sementes. Os  vasos foram mantidos em casa de vegetação sob condições naturais de  iluminação e  temperatura. Assim após 7 dias, foi realizada as coletas das plantas e feito a medição  dos  comprimentos  da  parte  aérea  da  planta  e  das  raízes.  Os  tratamentos  foram  realizados em triplicata (n =3) (CAMPOS et al., 2018; PEREIRA, A. E. S. et al., 2017).  [040] Além disso, foi realizado a determinação das clorofilas a e b e caratenóides, para  cada um dos tratamentos. Foram coletados dois discos de 5 mm das folhas das plantas  e  inseridas em ependorff contendo 1 mL de DMSO, os frascos foram envolvidos com  papel  alumínio  para  que  desta  forma  estivessem  protegidos  da  luz  e  foram  então  armazenados  na  geladeira  pelo  período  de  24  horas.  As  medidas  foram  feitas  em  espectrofotômetro    UV‐Vis  (Cary  50,  Varian)  nos  comprimentos  de  onda  de  665  (equação 1), 649 nm (equação 2) e 480 nm (equação 3) para determinar a clorofila a,  clorofila b e carotenóides, respectivamente (WELLBURN, 1994). Onde Chl a é a “colorofila  a”,  Chl  b  é  a  “clorofila  b”  e  A  o  valor  de  absorbância  obtido  para  os  determinados  comprimentos de onda (WELLBURN, 1994).  Petição 870200139534, de 05/11/2020, pág. 27/69 11 /31    𝐶ℎ𝑙 𝑎 12,19 𝑥 𝐴665 3,45 𝑥 𝐴649        (equação 1)    𝐶ℎ𝑙 𝑏 21,99 𝑥 𝐴649 5,32 𝑥 𝐴665 (equação 2) Carotenóides , , equação 3 ‐ Análise de degradação enzimática através de DLS, NTA e SDS – PAGE  [041] Antes da avaliação da degradação enzimática das nanopartículas produzidas, foi  realizado a avaliação da atividade enzimática. A análise realizada usando BApNA (Na‐ Benzoil‐L‐arginina‐p‐nitroanilida)  como  substrato  específico  para  tripsina,  de  acordo  com  Patankar et al. (2001) com pequenas modificações. O ensaio foi realizado com a  adição de 300 µL da solução de enzima, preparada em HCL 0,001 M, em 2 mL de BApNA  e 700 µL de tampão Tris HCL pH 8 para solução final de 3 mL. A reação foi mantida em  banho  à  37  °C  por  20 minutos.  A  reação  foi  pausada  com  ácido  acético  à  30%,  e  a  formação  de  p‐nitroanilina,  que  é  o  produto  da  reação,  foi  quantificado  por  espectrofotômetro  (Varian  Cary  50)  a  410  nm.  Como  controle  foi  preparada  uma  amostra substituindo a enzima por Tris HCl 0,001 M, pH 8,0. A análise dos dados  foi  realizada utilizando metodologia descrita por Akbar et al. (2017b). Através da técnica de  espectroscopia  de  correlação  de  fótons,  foi  realizado  a  determinação  do  diâmetro  hidrodinâmico,  índice  de  polidispersão  e  potencial  zeta,  em  amostras  de  950 L  de  nanopartículas contendo os compostos botânicos (em concentração de 5 g/mL) em 50  L  de  água,  como  controle  sem  a  adição  da  enzima  e  amostra  de  950  L  de  nanopartículas contendo os compostos botânicos em 50 L de enzima tripsina (com a  concentração de 0,20 g/mL) em tempos de 0, 15, 30, 60, 120 minutos de contato com a  enzima. Os resultados foram determinados a partir de uma média de três resultados  obtidos na técnica. Com as mesmas amostras foi possível determinar a polidispersão e  o potencial zeta das nanopartículas.  [042] Também  foi  realizada  análises  de  degradação  das  nanopartículas  em  contato  com a enzima pela  técnica de NTA, onde as  1750 L  da  amostra das nanopartículas  foram  previamente  diluídas  em  250  L  da  enzima  tripsina  e  posteriormente  foram  Petição 870200139534, de 05/11/2020, pág. 28/69 12 /31    retiradas  10 L  dessa  amostra  e  foi  diluída  em  20 mL  de  água.  Para  o  controle  foi  utilizada a mesma diluição descrita acima, no entanto utilizando apenas água. Foram  realizadas análises de 5 vídeos de 60 segundos em temperatura ambiente (25°C).  [043] Para realizar a comparação entre os resultados, também foi aplicada a técnica  de  SDS‐PAGE,  onde  o  ensaio  foi  realizado  em unidade  eletroforese  vertical  (Bio‐Rad  Mini‐Protean ®Tetra System) baseado na metodologia de Chowdhury et al. (2014). O  gel  de separação foi preparado em 1,25 mL de tampão Tris SDS 1,5 M e pH 8,8, mediante  adição de 2 mL de acrilamida/bis‐acrilamida, 1,72 mL de água, 25 µL de persulfato de  amônio 0,44 M e 7 µL de TEMED. O gel de concentração foi preparado em 750 µL de  tampão Tris SDS 0,5 M e pH 6,8, mediante adição de 500 µL de acrilamida/bis‐acrilamida,  1,73 mL de água, 15 µL de persulfato de amônio 0,44 M e 5 µL de TEMED. Uma solução  para receber a amostra foi preparada a partir de 1,875 mL de tampão Tris‐HCL 0,5 M e  pH 6,8, 7,5 mL de solução aquosa de glicerol 50% (v/v), 0,150 mL de azul de bromofenol,  3 mL de  solução aquosa de  SDS 10%  (m/v)  e  2,475 mL de  água.  Para  avaliar  a  ação  proteolítica nas nanopartículas, 50 µL de solução de tripsina foram adicionados a 50 µL  de formulação de nanopartículas de LIM + CVC, previamente diluídas a 33% (v/v) em  solução tampão glicina HCL 0,2 M e pH 8. As amostras controle consistiram em uma  solução  de  tripsina,  nanopartículas  de  zeína  com  LIM  +  CVC  sem  tripsina  e  solução  hidroetanólica de  zeína 0,5%  (m/v). Às  formulações de nanopartículas de  LIM + CVC  incubadas  com  tripsina  foram adicionados  47,5  µL  do  tampão de  amostra  contendo  bromofenol e 2,5 µL de 2‐mercaptoetanol nos tempos de 0, 15, 30, 60 e 120 min, para  paralisar  a  reação. As amostras  foram aquecidas por 10 min a 95  °C e  centrifugadas  durante  1  min  a  11500  x  g.  Foi  utilizado  o  marcador  de  peso  molecular  BLUeye  prestained protein ladder. 10l das amostras centrifugadas foram pipetados nos poços  do gel de concentração e iniciada a corrida de eletroforese em 40 mA/200 V. Ao término  da corrida, os géis foram lavados em água ultrapura e mantidos por 15 min em 35 mL  de solução fixadora (45% metanol e 10% ácido acético). A coração foi feita mantendo os  geis  overnight  em  solução  corante  coomassie  blue  e  a  revelação  feita  em 85 mL  de  solução descorante (5% ácido acético, 10% metanol).  ‐ Resultados  Petição 870200139534, de 05/11/2020, pág. 29/69 13 /31    [044] A figura 1 traz os resultados de análise de diâmetro hidrodinâmico (DLS) (Figura  1A), índice de polidispersão (Figura 1B) e a distribuição de tamanho (Figura 1C e D) para  as partículas contendo a mistura dos compostos limoneno e carvacrol (NP LIM+CVC) e a  respectiva  formulação  controle  (NP CTL). A  formulação NP CTL  apresentou diâmetro  médio inicial de 117 ± 1 nm, após 7 dias de armazenamento observou‐se que o diâmetro  médio permaneceu estável durante todo o período de armazenamento até os 120 dias,  em que  foram analisadas,  obtendo assim o diâmetro médio de 116 ± 2 nm. Para as  nanopartículas  contendo  os  ativos  NP  LIM+CVC,  inicialmente  o  diâmetro  médio  foi  encontrado  em  111  ±  1  nm  e  permanecendo  estáveis  ao  longo  do  período  e  uma  diminuição significativa no diâmetro médio com 120 dias, atingindo 87 ± 0,4 nm. Já para  os valores de índice de polidispersão (Figura 1‐B), as NP CTL mostraram um índice de  polidispersão inicial de 0,180 ± 0,013, após 120 dias foi observado uma diminuição no  índice de polidispersão 0,139 ± 0,012. Para a formulação de NP LIM + CVC foi observado  um  valor  inicial  de  índice  de  polidispersão  de  0,277  ±  0,006,  após  os  120  dias  de  armazenamento houve uma diminuição no índice, mas sem alterações significativas, o  valor  encontrado  foi  de  0,234  ±  0,008.  A  estabilidade  das  nanopartículas  pode  ter  ocorrido  pela  presença  de  aminoácidos  presente  na  zeína,  permitindo  que  os  grupamentos hidrofílicos ficassem expostos na superfície aumentando a estabilidade do  sistema  em  solução.  A  Figura  4C  e  D  apresentam  a  distribuição  de  tamanho  para  nanopartículas controle e os ativos LIM + CVC, respectivamente. Os resultados mostram  que  não  ocorreu  o  surgimento  de  novas  populações  corroborando  com  os  demais  gráficos apresentados.  [045] A figura 2 traz a distribuição de tamanho analisado por DLS para as formulações  contendo a mistura dos compostos Nim+Linalol e Geraniol+Cinamaldeído. Os resultados  mostraram que o diâmetro médio da formulação controle (Figura 2A) não apresentou  mudanças  substanciais  no  diâmetro médio  para  o  período  analisado,  com  diâmetro  inicial de 101 nm para 116 nm após 120 dias. A  formulação contendo a mistura dos  ativos  geraniol  e  cinamaldeído  (Figura  2C),  também  não  apresentou  alterações  significativas ao longo do período avaliado, sendo de um diâmetro médio inicial de 139  nm e atingindo 148 nm com 60 dias. Já a formulação contendo a mistura de dos ativos  Petição 870200139534, de 05/11/2020, pág. 30/69 14 /31    Nim + LNL apresentou um diâmetro médio inicial de 148 nm, e pode‐se observar, pela  Figura  1‐B,  que  houve  um  aumento  no  diâmetro  das  nanopartículas  no  decorrer  do  tempo analisado, passando para 256 nm. Estes resultados corroboram com trabalhos  encontrados  em  literatura.  (PASCOLI  et  al.,  2019),  por  exemplo  desenvolveram  nanopartículas de zeína contendo óleo de nim e obtiveram um diâmetro médio de 288  nm.  Já  (OLIVEIRA,  et  al.,  2019)  reportam  diâmetro  de  253  nm  após  obterem  nanopartículas de zeína contendo GRL+CND.  [046] A  figura  3  traz  os  demais  dados  de  caracterização  para  as  formulações  de  nanopartículas  contendo  a  mistura  dos  dos  compostos  limoneno  e  carvacrol  (ZPN  LIM+CVC) e seu respectivo controle (NP CTL). O diâmetro médio analisado pela técnica  de NTA é apresentada na Figura 3‐A. As nanopartículas sem ativos apresentaram um  diâmetro  inicial  de  120  ±  5  nm,  após  120  dias  apresentaram  um  aumento  não  significativo  de  146  ±  1  nm.    Já  para  a  formulação  com  os  ativos  (NP  LIM  +  CVC)  apresentaram um diâmetro inicial de 125 ± 2 nm, após 120 dias de armazenamento não  houve diferença estatística no diâmetro apresentando 123 ± 3 nm. Apesar da diferença  no diâmetro médio das formulações analisadas por ambas as técnicas (DLS e NTA), é  possível  observar  que  em  ambas  as  partículas  se  mantiveram  estáveis  ao  longo  do  tempo. A concentração também foi um dos parâmetros analisados (Figura 3B) é possível  observar que para a formulação controle não foi observado diminuição significativa da  concentração em função do tempo apresentando concentração  inicial de 3,52x1012 ±  1,51x1011 partículas/mL, após 120 dias 5,05x1012 ± 1,07x1011 partículas/mL. Já para NP  LIM+CVC  foi  observado  uma  diminuição  significativa  na  concentração,  partindo  de  4,69x1012 ± 1,32 x1011 partículas/mL inicialmente e chegando a 1,96x10¹² ± 9,08x1011  partículas/mL com 120 dias.  [047] O potencial zeta das nanopartículas estão apresentando na Figura 3C. As NP CTL   apresentaram um potencial zeta inicial de ‐30 ± 1 mV e até a leitura de 120 dias onde  apresentou potencial zeta de  ‐24 ±1 mV, não havendo alterações significativas. Para a  NP LIM+CVC, apresentaram o potencial zeta  inicial de – 25 ± 2 mV, que permaneceu  relativamente estável, sem grandes alterações pelo período de tempo acompanhado,  apresentando  o  valor  de  ‐22  ±  1  mV  em  120  dias  de  armazenamento.  O  pH  das  Petição 870200139534, de 05/11/2020, pág. 31/69 15 /31    nanopartículas  foi  monitorado  durante  120  dias  (Figura  3D).  A  formulação  de  nanopartículas sem ativos apresentaram pH inicial de 8,27 ± 0,02, e com 120 dias de  armazenamento  o  pH  reduziu  para  7,69  ±  0,01.    As  nanopartículas  com  os  ativos  apresentou pH inicial de 8,30 ± 0,02, sem alterações significativas até os 120 dias, entre  os valores iniciais e finais, mantendo o pH em torno de 7,66 ± 0,02. As nanopartículas  deste estudo foram produzidas com todos as soluções envolvidos em pH 8, para que  resultasse  em  uma  formulação  já  no  pH  estipulado  para  o  trabalho  e  não  fosse  necessário  fazer  ajustes  de  pH  na  suspensão  pronta.  Com  a  realização  deste  ensaio  mostrou‐se que os resultados se assemelham aos obtidos por outros autores quando se  trata do pH e  temperatura para atividade ótima da enzima. Também foram testadas  outras temperaturas (25, 30, 35 ‐ 37 e 40°C) onde foi observada atividade máxima em  temperatura  de  37°C.  Alterações  de  pH  em  partículas  de  zeína  podem  resultar  em  diferentes tamanhos de partículas e também interfere no potencial zeta. Partículas de  zeína com pH acima de 10 podem se tornar instáveis pois a zeína é solúvel em soluções  alcalinas (pH acima de 11) (SPASOJEVIĆ et al., 2019)  [048] A  eficiência  de  encapsulação  dos  ativos  e  LIM  e  CVC  foi  analisada  e  está  representada na figura 3E. O limoneno apresentou eficiência de encapsulação de 99,9 ±  0,004  %,  sendo  que  após  120  dias  de  armazenamento  a  eficiência  foi  de  99,8  %  aproximadamente. O carvacrol no tempo inicial teve eficiência de 91,0 ± 0,14 %, e após  120  dias  de  armazenamento  a  eficiência  foi  de  72,8%,  redução  de  20,0  %.  Perdas  durante o processo de armazenamento podem estar ligadas a liberação dos ativos bem  como a volatilidade e a solubilidade como demonstrado por Oliveira et al. (2019).   [049] As  formulações contendo a mistura dos compostos geraniol e cinamaldeído e  nim e linalol também foram caracterizadas além das análises de tamanho. Os resultados  mostraram que as partículas apresentaram eficiência de encapsulação de 96,9% para o  CND, 97,2% para o GRL, 98,4% para o LNL e 99% para o Nim, sendo que ao longo do  tempo  não  foram  observadas  diferenças  significativas  nos  valores  (dados  não  mostrados).  A  figura  traz  os  resultados  de  potencial  zeta,  índice  de  polidispersão  e  também  concentração  para  essas  partículas.  Observa‐se  que  o  controle  e  as  formulações  de  Nim+LNL  apresentaram  potencial  zeta  de  ‐30  mV  e  ‐26  mV,  Petição 870200139534, de 05/11/2020, pág. 32/69 16 /31    respectivamente, sem grandes mudanças no decorrer dos 120 dias analisados (Figura  4A),  principalmente  devido  a  estabilização  estérica  fornecida  pelo  Pluronic‐F68,  que  aumenta a estabilidade das partículas. Os  resultados obtidos estão em concordância  com os trabalhos de (OLIVEIRA et al., 2014; PASCOLI et al., 2019; ZHANG et al., 2014). Já  as  formulações  contendo  a  mistura  GRL+CND  apresentou  potencial  zeta  de  +5  mV,  sofrendo  alterações  no  decorrer  do  tempo.  No  entanto  destaca‐se  que  apesar  das  alterações  não  foi  observado  precipitação  da  formulação,  possivelmente  devido  também  a  estabilidade  pelo  tensoativo.  Estando  os  valores  de  acordo  com  trabalho  descrito por (PASCOLI et al., 2019). Para os resultados de índice de polidispersão (Figura  4B), a formulação contendo Nim+LNL foi o que apresentou maior PDI, indicando que as  partículas não são monodispersas. No entanto ocorreu uma diminuição nestes valores  ao longo do período de armazenamento. Já as demais formulações apresentam índice  de polidispersão por volta de 0,2 mantendo estável. Diferentes autores reportam que  nanopartículas obtidas a partir de matrizes de origem natural, como a zeína, apresentam  uma distribuição polidispersa (CHUACHAROEN; SABLIOV, 2016; OLIVEIRA et al., 2018;  PASCOLI  et  al.,  2019).  As  análises  de  concentração  de  nanopartículas  mostram  que  inicialmente a formulação controle, a contendo a misturam de nim e linalol e mistura de  geraniol e cinamaldeído apresentaram concentração de 3,2x1012, 6,8x1012 e 9,6x1012  partículas/mL,  respectivamente.  Em  função do  tempo observa‐se  que  apenas  para  a  formulação controle foram observadas diminuições intensas na concentração, sendo as  demais formulações mantiveram‐se praticamente estáveis ao longo do período.  ‐ Análise da morfologia das nanopartículas através de AFM   [050] Foram  analisadas  através  da  técnica  de  microscopia  de  força  atômica  a  morfologia e o tamanho das nanopartículas. A figura 5 traz a imagem topográfica bem  como os gráficos de distribuição de tamanho para as nanopartículas carregadas com a  mistura de LIM+CVC, apresentando morfologia esférica. O gráfico de tamanho médio  das nanopartículas  foi  obtido pelo  tratamento da  imagem  topográfica pelo  software  Gwyddion  no  qual  apresenta  um  tamanho  médio  em  torno  de  151  ±  52  nm  corroborando com outras técnicas.  [051] Já  a  figura  6  apresenta  a  morfologia  das  nanopartículas  contendo  a  mistura  Petição 870200139534, de 05/11/2020, pág. 33/69 17 /31    Nim+LNL e GRL+CND. É possível observar que para essas nanopartículas a morfologia  também  foi  esférica. No  caso das  formulações  contendo a mistura Nim+LNL nota‐se  ainda  que  as  partículas  estão  unidas,  indicando  que  houve  uma  aglomeração  das  partículas,  corroborando com dados apresentados anteriormente. O diâmetro médio  calculado a partir das micrografias do AFM usando o software Gwyddion, mostraram  um tamanho de 363,7 nm para a formulação de Nim+LNL e 185 nm para de GRL+CND.  Estruturas  esféricas  das  nanopartículas  de  zeína  foram  reportadas  previamente  por  (LUO; TENG; WANG, 2012; PASCOLI et al., 2019; ZHANG et al., 2014).  ‐ Análise Estrutural  [052] Com o  intuito de verificar as  interações entre as nanopartículas e os ativos as  técnicas de infravermelho, bem como de calorimetria diferencial exploratória utilizadas.  A  Figura  7  traz  os  espectros  de  infravermelho  para  as  nanopartículas  controle  e  as  contendo a mistura de LIM + CVC, sendo também realizada a comparação com as bandas  características  de  zeína  e  o  surfactante  pluronic,  encontrados  na  literatura  (SEEMA,  DATTA, 2014; TORKAMANI et al., 2018).  [053] Para  a  zeína,  a  banda  de  absorção  centrada  em  3320  cm‐1  corresponde  aos  estiramentos de O‐H e N‐H presentes na estrutura da proteína, e na faixa de 2961 a 2873  cm‐1 ocorrem as vibrações de alongamento C‐H de grupos alifáticos. A banda em 1661  cm‐1 é atribuída às vibrações de alongamento de C=O, de amida I, enquanto que a banda  em 1532 cm‐1 é atribuída às vibrações de alongamento de C‐N, de amida II. Em 1444 cm‐ 1 ocorre a banda referente à combinação de deformações angulares de N‐H e de ‐CH2  adjacente à carbonila. E a banda de absorção em 1235 cm‐1, relacionada às deformações  axiais de C‐O de grupo funcional éter.   [054] O  tensoativo  Pluronic  possui  banda  de  absorção  centrada  em  2889  cm‐1  referente às vibrações de alongamento de C‐H alifáticos, em 1468 e 1348 cm‐1 ocorrem  as bandas de deformação angulares de ‐CH2 e ‐CH3, respectivamente, e em 1110 cm‐1 a  banda de absorção atribuída às deformações axiais de ligação éter (C‐O).   [055] Para  o  composto  botânico  carvacrol  foram  observadas  bandas  específicas  iniciando  com  uma  banda  larga  centrada  em  3400  cm‐1  atribuída  às  vibrações  de  alongamento  O‐H,  seguida  da  banda  em  3025  cm‐1  referente  às  vibrações  de  Petição 870200139534, de 05/11/2020, pág. 34/69 18 /31    alongamento C‐H de composto aromático. A faixa de vibração entre 2961 e 2873 cm‐1  refere‐se às bandas atribuídas às vibrações de alongamento C‐H de alifáticos e de 1621  a 1428 cm‐1 são bandas de absorção atribuídas às vibrações C=C de núcleos aromáticos.  As bandas de absorção em 1356 e 1308 cm‐1 são atribuídas às deformações angulares  de ‐CH3 e em 1251 cm‐1 atribuída à deformação axial da ligação C‐O de fenol. Em 858 e  818  cm‐1  ocorrem  bandas  de  absorção  referentes  à  deformação  angular  de  C‐H  presentes no anel aromático.   [056] Para o composto  limoneno, a banda  larga de baixa  intensidade em 3427 cm‐1  pode estar associada às vibrações de alongamento O‐H de água residual adsorvida na  interface oleosa. Em 3081 cm‐1 ocorre a banda de absorção atribuída às vibrações de  alongamento C‐H de alceno, enquanto a  região de 2961 a 2873 cm‐1 às vibrações de  alongamento  C‐H  alifáticos.  A  banda  em  1645  cm‐1  é  atribuída  às  vibrações  de  deformação axial C=C de alceno e em 1444 e 1372 cm‐1 ocorrem as bandas atribuídas às  deformações angulares de ‐CH2 e ‐CH3, respectivamente. Por fim, a banda em 882 cm‐1  refere‐se à deformação angular C‐H fora do plano.    [057] Comparando  os  espectros  obtidos  para  a  nanopartícula  controle  e  nanopartículas  carregadas  com  LIM + CVC é  observado o  surgimento das  bandas  de  absorção  em  1356  e  1309  cm‐1  atribuídas  ao  composto  CVC.  Além  dessas,  não  foi  observado  o  aparecimento  de  novas  bandas  de  absorção,  no  entanto  o  perfil  proporcional  de  intensidade  das  bandas  de  absorção  na  região  atribuída  aos  estiramentos C‐H de carbonos alifáticos e em 1251 cm‐1  atribuída à deformação axial O‐ H de composto fenólico indicam a ocorrência de incorporação dos ingredientes ativos  LIM e CVC na matriz proteica. Tais resultados corroboram com estudos encontrados na  literatura (BOUGHENDJIOUA et al., 2017; ELZEY, et. al., 2016).  [058] NPNPNPA  análise  de  calorimetria  exploratória  diferencial,  pode  também  ser  aplicada para   comprovar a encapsulação de um composto, pelas modificações em picos  de  fusão,  cristalização,  deslocamento  entre  outras  transições  térmicas,  podendo  mostrar  interações que ocorreram entre os diferentes  compostos. A  figura 8  traz os  termogramas (fluxo de calor (W/g) em função da temperatura (oC)) para os compostos  analisados.  O  surfactante  Pluronic,  por  ser  composto  de  estruturas  cristalinas,  Petição 870200139534, de 05/11/2020, pág. 35/69 19 /31    apresentou  um  pico  endotérmico  em  52  °C  correspondente  ao  ponto  de  fusão.  As  proteínas  apresentam  características  relacionadas  às  suas  diferentes  estruturas  tridimensionais,  como o  processo  de  desnaturação,  sendo  avaliada  sua  temperatura  através de análises térmicas como apresenta a literatura (MOTHÉ; et. al., 2005). O pico  endotérmico  da  zeína  foi  apresentado  em  83  °C  podendo  estar  relacionada  a  evaporação da água presente no polímero, assim como relatado na literatura descrita  por Luo et al. (2011b) onde o termograma apresentou o pico endotérmico de 73,2 °C.  Para as NP  LIM+CVC o apresentaram o mesmo perfil  do  termograma obtido para as  nanopartículas de zeina. Tal fato demonstra uma provável interação entre os ativos e a  proteína, que por serem interações hidrofóbicas reduz o teor da água (PROENÇA, 2018).  As nanopartículas sem ativo (NP CTL), apresentaram um pico endotérmico em torno de  40 °C a 70 °C, provavelmente devido a  interação com o pluronic e suas propriedades  cristalinas, demonstrando que a mesma não possui uma boa composição o que faz com  que  esta  seja menos  estável  que  as  contendo os  ativos,  conforme demonstrado  em  resultados anteriores.  ‐ Ensaio de Fitotoxicidade em Plantas  [059] Visando  a  aplicação  destas  formulações  em  plantas  adultas,  foram  também  conduzidos  experimentos  para  avaliação  do  efeito  fitotóxico  das  nanopartículas  contendo a mistura dos compostos botânicos em plantas de feijão. As figuras 9, 10 e 11  trazem os resultados para a formulação contendo a mistura dos compostos botânicos  limoneno e carvacrol e seus respectivos controles. As formulações foram testadas em  diferentes concentrações (0,25, 1,25, 2,5, 3,75 e 5 g/mL). A figura 9 traz a imagem das  plantas de feijão que foram submetidas ao ensaio de fitotoxicidade. A figura 10 traz os  resultados para as medidas de parte aérea e raiz. Observa‐se em ambas as figuras que  não  ocorreu  diferença  significativa  entre  os  tratamentos  analisados,  sendo  que  as  plantas de feijão tratadas com diferentes concentrações não apresentaram alterações  no seu desenvolvimento.  [060] A  fim  de  investigar  também  a  coloração  das  folhas  e  os  fatores  de  atividade  fotossintética foram medidos os níveis de clorofila a e b e carotenóides apresentados na  figura 11. Os valores determinados para a clorofila a e b em folhas de Phaseolus vulgaris  Petição 870200139534, de 05/11/2020, pág. 36/69 20 /31    (Figura 11 – A e B) não apresentaram diferenças significativas entre os tratamentos com  as  nanopartículas,  carregadas  ou  não  com  os  compostos  ativos,  e  os  tratamentos  controle (água, zeína e pluronic). No entanto, as nanoformulações carregadas ou não  com os  ingredientes ativos apresentaram alterações no teor de carotenoides quando  comparadas aos tratamentos controles realizados com água, Pluronic e zeína (Figura 11  –  C).  Os  carotenoides  desempenham  função  do  pigmento  para  absorção  de  luz  e  proteção contra efeitos oxidativos, e o aumento observado nos tratamentos efetuados  com as  nanopartículas  deve  estar  relacionado  à  estratégia  adotada  pela  planta  para  combater os radicais livres gerados sob estresse pelas nanopartícuals de zeína (Singh et  al., 2006). Assim, a planta pôde elevar a tolerância ao estresse oxidativo e manteve seu  desenvolvimento  normal.  As  medidas  observadas  indicam  que  esse  tipo  de  nanobiopesticida  é  passível  de  aplicação  na  agricultura  sem  ocasionar  injúrias  às  espécies vegetais.   [061] Portanto, os  resultados  indicam que não ocorreu nenhum fator que  indicasse  toxicidade dessas formulações para as plantas de feijão, pois não ocorreram diferenças  nos  pigmentos  fotossintetizantes  que  identificasse  clorose.  Além  disso  não  ocorreu  diferenças significativas no desenvolvimento da planta (expresso pelo tamanho de parte  aérea e a raiz).    [062] Já a Figura 12 traz os resultados de comprimento de raíz e parte aérea (Fig.12A),  massa seca (Fig. 12‐B), clorofila A e B, e carotenoides (Fig. 12C) para as formulações de  nanopartículas  contendo  a  mistura  dos  compostos  nim  e  linalol  e  seus  respectivos  controles  (nanopartícula  vazia,  água  e  pluronic)  em  diferentes  concentrações  (0,25,  1,25,  2,5,  3,75  e  5  g/mL).  É  possível  observar  pelos  gráficos  que  em  todas  as  concentrações testadas, a mistura de Nim+LNL influenciou positivamente o crescimento  da  raiz,  sendo  que  o  crescimento  do  caule  ficou  ligeiramente  menor  do  que  o  tratamento  com  água.  Na  formulação  controle  (sem  ativo),  nenhuma  mudança  significativa foi observada quando comparado com o tratamento com água (Figura 12A).  Com  relação  a  massa  seca,  os  nanoformulados  não  apresentaram  nenhum  efeito  fitotóxico significativo para as concentrações testadas (Figura 12B).   [063] O tratamento pós‐emergente causou pouco ou nenhum efeito nos pigmentos  Petição 870200139534, de 05/11/2020, pág. 37/69 21 /31    fotossintéticos  (Figura 12C). Para os  teores de clorofila a  e b, não  foram observados  nenhum  efeito  significativo  entre  os  tratamentos  testados,  com  exceção  para  o  tratamento controle na concentração mais alta, onde o teor de clorofila a foi mais baixo.  Quanto ao teor de carotenoides, também não foi observado efeito significativo entre os  nanoformulados, apenas ouve diferença quando comparado o CTL com o tratamento  contendo apenas água, em que os  teores de carotenoides  foram maiores. As Figuras  12D mostram as plantas obtidas após o ensaio, tratadas com nanopartículas de Zeína  sem ativos e com a mistura de Nim+LNL.  [064] Assim como observado para as formulações contendo a mistura dos compostos  ativos carvacrol e limoneno, as formulações contendo a mistura de linalol e nim também  não  apresentaram  efeitos  fitotóxicos  para  as  plantas  de  feijão.  Tais  resultados  demonstram que o encapsulamento pode ajudar a proteger as plantas de algum efeito  fitotóxico  dos  compostos  botânicos,  uma  vez  que  o  ativo  não  está  totalmente  disponível.  Apesar  dos  pesticidas  botânicos  serem  obtidos  a  partir  de  plantas,  os  compostos  purificados  e  concentrados  podem  apresentar  efeitos  adversos  quando  aplicado  diretamente  nas  plantas.  Synowiec  et  al.  (2017),  por  exemplo  avaliaram  o  potencial fitotoxicos de 12 tipos de óleos essenciais, em três culturas diferentes, Avena  sativa, Brassica napus e Zea mays e verificaram que além das concentrações, a cultura  também influencia na toxicidade dos óleos, pois algumas espécies mostraram‐se mais  sensíveis.  ‐ Degradação enzimática das nanopartículas  [065] A capacidade de degradação enzimática das nanopatículas de zeína pela tripsina  foi investigada por diferentes técnicas. Inicialmente a atividade enzimática da tripsina  foi realizada em diferentes pH variando de 6 a 12, uma vez que o pH possui um papel  importante  para  a  atividade  ótima  da  enzima.  A  figura  13  traz  o  resultado  para  a  atividade enzimática da tripsina em diferentes pH. É possível observar que na condição  experimental analisada a máxima atividade enzimática encontrada foi em pH 8,0 a 37  ºC. Os resultados obtidos nesta invenção, podem ser comparados aos encontrados na  literatura, onde os autores autores relatam atividade ótima para tripsina, encontrada  em 50 e 60ºC (6,7 U) e para a quimiotripsina (5,68 U) ambos na mesma temperatura  Petição 870200139534, de 05/11/2020, pág. 38/69 22 /31    (AKBAR; SHARMA, 2017b) e o pH ótimo foi encontrado na faixa de 8 a 10. De Araújo et  al.  (2013)  encontrou  atividade  máxima  proteolítica  da  tripsina  em  pH  8,5  em  temperatura de 55°C.  [066] Para  o  ensaio  de  degradação  das  nanopartículas  contendo  a  mistura  dos  compostos limoneno e carvacrol (NP LIM+CVC), foram realizadass análises do diâmetro  médio,  polidispersão,  potencial  zeta  e  também  concentração.  Os  ensaios  foram  realizados com e sem a adição da enzima, sendo que após a adição da enzima foram  investigados diferentes tempos de incubação (0, 15, 30, 60, 90 e 120 minutos). A Figura  14  traz  o  resultado  para  os  parâmetros  analisados.  As  análises  de  diâmetro  hidrodinâmico por DLS (Figura 14‐A) mostram quem a  intensidade da distribuição de  tamanho  das  nanopartículas  diminuiu  em  função  do  tempo  de  exposição  da  nanopartícula  com  a  enzima. Mudanças  na  intensidade  da  distribuição  de  tamanho  indicam  que  está  ocorrendo  alterações  na  distribuição  de  tamanho,  muito  provavelmente pela degradação das nanopartículas. A enzima tripsina é uma enzima  digestiva  capaz  de  realizar  a  degradação  de  proteínas  em  várias  unidades  de  aminoácidos para absorção (PAWAR et al., 2014), o que pode estar ocorrendo no caso  da zeína.  [067] A figura 14B traz os valores de índice de polidispersão, o qual apresentou valores  de 0,246 ± 0,013 sem adição da enzima e ao primeiro contato com a enzima no tempo  0 minutos, 0,343 ± 0,015 ocorrendo um aumento em um período de 120 minutos (0,575  ±  0,125).  Tais  resultados  corroboram  com  os  demonstrados  anteriormente,  pois  o  aumento no  índice de polidispersão evidencia alterações na distribuição de tamanho  das nanopartículas, ocasionado pela ação enzimática. Na figura 14‐C são apresentados  os valores de potencial zeta, observa‐se que sem a adição da enzima  o valor foi de ‐11,4  mV e em função do tempo de contato com a enzima, diminuiu para  ‐3,4 ± 0,59 mV ao  longo de 120 minutos, indicando que as partículas sofreram alterações ao longo deste  período.   [068] Já a figura 14D, apresenta os gráficos (3D e em barras) para a concentração das  nanopartículas  analisado  pela  técnica  de  NTA.  Observa‐se  que  a  concentração  encontrada sem a adição de enzima foi de 2,31 x 10¹² ± 5,36 x10¹¹ partículas/mL. Já com  Petição 870200139534, de 05/11/2020, pág. 39/69 23 /31    a presença da enzima este valor foi para 1,96 x10¹² ± 1,08 x10¹¹ partículas/mL, sendo que  com 120 minutos de  incubação o valor atingiu 3 x10¹¹ ± 1  x10¹0 partículas/mL. Desta  forma, pela técnica de NTA, foi possível observar que houve uma diminuição significativa  na concentração das nanopartículas em função do tempo de exposição. Tais resultados  corroboram com os encontrados anteriormente e evidenciam que a enzima tripsina está  degradando a zeína. A ação da enzima na ruptura e degradação das nanopartículas de  zeína pode ser evidenciada visualmente pela redução da opacidade do meio contendo  a  formulação na presença da enzima,  como mostrado na  fotografia  com o meio em  ordem crescente ao período de contato de 2 horas, concomitante ao decaimento de  absorbância (Figura 15).  [069] Destaca‐se  ainda  que  ao  longo  de  todo  o  ensaio  a  atividade  enzimática  foi  monitorada (240 minutos) e a mesma se apresentou ativa dentro o tempo analisado,  em T0 minutos a atividade encontrada foi de 2,3 ± 0,2 U/mL e após 240 minutos 2,4 ±  0,3 U/mL. Tais resultados indicam que as nanopartículas bem como os componentes e  ativos não foram capazes de inativar a atividade desta enzima.  [070] As  nanopartículas  contendo  a  mistura  dos  compostos  linalol  e  nim  também  foram investigadas segundo a ação da enzima tripsina. Inicialmente foram preparadas  nanopartículas contendo o marcador fluoresceína, sendo posteriormente realizado os  ensaios  de  incubação  e  degradação.  A  figura  16  traz  os  resultados  da  análise  de  absorbância para essas formulações bem como as análises de concentração realizado  pela técnica de NTA. Através dos resultados (Figura 16A) é possível observar a redução  da intensidade de fluoresceína captada com o passar do tempo, indicando que a enzima  está em atividade e que as nanopartículas estão sendo degradadas pela tripsina. Esses  dados  também  corroboram  com  os  demonstrados  na  Figura  16B,  onde  as  nanopartículas foram encubadas com a solução de tripsina e amostras foram analisados  por  NTA.  É  possível  observar  uma  redução  expressiva  na  concentração  de  nanopartículas  após  60 min,  passando  de  9,1x10¹¹  para  1,0  x10¹¹  partículas/mL.  Tais  resultados  corroboram com os  também apresentando para  as  partículas  contendo  a  mistura  de  limoneno  e  carvacrol,  indicando  que  a  enzima  tripsina  tem  atuado  na  degradação das nanopartículas de zeína.  Petição 870200139534, de 05/11/2020, pág. 40/69 24 /31    [071] Outro  ensaio  realizado  para  confirmação  da  ação  da  enzima  tripsina  para  degradação das nanopatículas,  foi através das análises de eletroforese em condições  desnaturantes. A figura 17 mostra o gel de poliacrilamida com as formulações testadas  iniciando pelo marcador, em sequência: enzima tripsina, formulação de nanopartícula  de limoneno e carvacrol sem a adição da enzima tripsina, a formulação com a adição de  enzima tripsina, nos tempos 0, 15, 30, 60 e 120 minutos de incubação.  [072] A  enzima  tripsina  apresenta  unidades  com massa  de  23,3  a  66  kDa  (AKBAR;  SHARMA,  2017a;  SIGMA‐ ALDRICH,  2019)  e  a  zeína  possui massa  entre  20  a  21  kDa  (SIGMA‐ ALDRICH, 2019). A análise de eletroforese comprova que quando a formulação  contendo LIM + CVC, entra em contato com a enzima tripsina, inicia‐se imediatamente  a degradação das nanopartículas conforme mostra a figura 17.  [073] Estudos realizados por outros autores corroboram com resultados apresentados  nesta invenção. Nanoesferas de zeína contendo três tipos de óleos essenciais: orégano,  tomilho vermelho e  cássia  (óleo 100% puro)  foram  investigadas  segundo a  liberação  sustentada  desses  óleos  em  sistemas  digestivos.  Os  autores  observaram  através  de  análise  de  eletroforese  a  hidrólise  nas  nanoesferas  de  zeína  de  forma  lenta  para  o  intestino delgado e mais rápida no intestino grosso, o que sugere que o sistema pode  ser útil para administração de materiais biológicos (PARRIS; COOKE; HICKS, 2005).   [074] O desenvolvimento  de  nanopartículas  inteligentes,  ou  seja,  com  liberação  de  ativos  promovida  por  estímulos  é  uma  área  de  pesquisa  recente  e  inovadora,  principalmente voltado para a agricultura. A liberação de ativos promovido por quebra  enzimática da matriz protetora ainda está na fase  inicial de estudos, e cientistas têm  usado essa estratégia no controle de  fitopatógenos  (LIU et al., 2015), ervas daninhas  (LIANG  et  al.,  2017),  insetos  e  nematoides  (GUO  et  al.,  2015;  KAZIEM  et  al.,  2018).  Camara et al. (2019) descreveram por exemplo que formulações responsivas a enzimas  apresentam  vantagens  consideráveis  para  a  área  agrícola,  pois  os  ativos  só  serão  liberados na presença das enzimas, o que aumenta a eficácia e segurança da aplicação,  além de mitigar os efeitos ao meio ambiente e aos organismos não‐alvo, e que podem  diminuir  consideravelmente  a  quantidades  de  produtos  químicos  empregues  comparadas aos métodos comuns.  Petição 870200139534, de 05/11/2020, pág. 41/69 25 /31    [075] É certo que quando o presente  invento  for  colocado em prática, poderão  ser  introduzidas  modificações,  sem  que  isso  implique  afastar‐se  dos  princípios  fundamentais que estão claramente substanciados no quadro reivindicatório,  ficando  assim entendido que a terminologia empregada não teve a finalidade de limitação.    Referências    AGUEROS,  Bazo Maite et  al. Zein  nanoparticles  for  encapsulation  of  compounds,  the  production  and  uses  thereof  .  [S.l:  s.n.].  Disponível  em:  . Acesso em: 22 mar. 2018.  ,  19 jan. 2012  AKBAR,  Shaik  Mohammad;  SHARMA,  Hari  Chand.  Alkaline  serine  proteases  from  Helicoverpa armigera: potential candidates for industrial applications. Archives of Insect  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acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender as seguintes etapas: i) as nanopartículas de zeína são preparadas pelo método de precipitação por antissolvente; a zeína (2% m/v) é dissolvida overnight durante o período de 24 horas numa solução hidroetanólica (85:15, v/v); ii) na sequência essa solução, é submetida a centrifugação à 4500 rpm por 30 minutos, seguido de tratamento térmico a 75°C por 15 minutos e filtração em filtros de seringa; iii) separadamente é preparada uma solução aquosa de Pluronic F-68 (2% m/v) e o pH da solução ajustado para 8; com a solução de zeína previamente tratada (10 mL) são adicionados 150 mg de cada ativo sendo mistura de limoneno e carvacrol (1:1 v:v), mistura de geraniol e cinamaldeído (1:1 v:v) e mistura de nim e linalol (1:1 v:v) agitando para completa dissolução dos óleos, sendo posteriormente a solução orgânica contendo os ativos foi injetada a solução aquosa de surfactante (30 mL) sob agitação magnética; iv) a dispersão coloidal resultante é rotaevaporada para evaporação do etanol, sendo se necessário adição de água a pH 8 para o volume perdido em excesso; v) uma partícula controle é preparada sem a adição dos ativos; vi) a solução final de cada formulação contendo a mistura dos compostos botânicos contém a concentração de 5 mg/mL de ambos ativos. 3) “MÉTODO DE CARACTERIZAÇÃO”, de acordo com a reivindicação 1, Petição 870210021529, de 05/03/2021, pág. 6/8 2 / 3 caracterizado por método de caracterização físico-química das nanopartículas de zeína apresenta as seguintes etapas: i) as formulações preparadas são caraterizadas pelo seu diâmetro hidrodinâmico, índice de polidispersão, potencial zeta, concentração, pH e eficiência de encapsulação; a técnica de espectroscopia de correlação de fótons (espalhamento de luz) é empregada para a determinação do diâmetro hidrodinâmico e o índice de polidispersão (PDI), já para o potencial a técnica de microeletroforese; ii) para ambas medidas, as nanopartículas são diluídas (1:200, v:v) com água deionizada sem ajuste de pH e analisadas; iii) a técnica de rastreamento de nanopartículas (NTA) é empregado para determinar a concentração e tamanho das nanopartículas; para realização desta análise utiliza-se uma célula NanoSight LM 10 (laser verde, 532 nm), uma câmera sCMOS e ‘software’ NanoSight; iv) as diluições das suspensões de nanopartículas são realizadas em água deionizada (1:6000, v:v); onde são realizados 5 vídeos de 60 segundos em temperatura ambiente (25°C), compreendendo uma leitura de aproximadamente 100 partículas por frame; v) o monitoramento do pH é realizado utilizando um potenciômetro, calibrado com soluções tampão em pH 4,0 e 7,0 e controle de temperatura; para cada amostra são realizadas três medidas e o resultado foi expresso como média dessas determinações; vi) a eficiência de encapsulação dos compostos botânicos nas nanopartículas de zeína é determinada pelo método de ultrafiltração/centrifugação, o qual é submetida a suspensão de nanopartículas a centrifugação utilizando dispositivos de celulose regenerada com poro de exclusão 10 kDa em uma centrífuga (NT 805) por 15 minutos à 24.0000 g. 4) “MÉTODO DE PREPARO E CARACTERIZAÇÃO DE NANOCARREADORES PROTEÍCOS PARA LIBERAÇÃO DE COMPOSTOS BOTÂNICOS POR ESTÍMULOS AMBIENTAIS”, de acordo com as reivindicações 1, 2 e 3, caracterizado por a condição para a atividade ser preferencialmente de pH 8,0, 37°C e 22 U/mL tripsina. 5) “MÉTODO DE PREPARO E CARACTERIZAÇÃO DE NANOCARREADORES PROTEÍCOS PARA LIBERAÇÃO DE COMPOSTOS BOTÂNICOS POR ESTÍMULOS Petição 870210021529, de 05/03/2021, pág. 7/8 3 / 3 AMBIENTAIS”, de acordo com as reivindicações 1, 2 e 3, caracterizado por incorporação de bioativos oleosos em uma matriz proteica compor a dispersão aquosa dos mesmos. 6) “FORMULAÇÕES”, de acordo com a reivindicações 1, 2, 3, 4 e 5, caracterizado pelo fato da formulação conter a mistura dos compostos Nim+Linalol e Geraniol+Cinamaldeído. 7) “FORMULAÇÕES”, de acordo com a reivindicações 1, 2, 3, 4 e 5, caracterizado pelo fato das formulações de nanopartícula conter compostos ativos de limoneno e carvacrol (ZPN LIM+CVC) e seu respectivo controle (ZPN). 8) “FORMULAÇÕES”, de acordo com a reivindicações 1, 2, 3, 4 e 5, caracterizado pelo fato da formulação conter a mistura dos compostos geraniol e cinamaldeído e nim e linalol. Petição 870210021529, de 05/03/2021, pág. 8/8 1 /1 7 FIG. 1AFIG. 1A FIG. 1C FIG. 1D FIG. 1B Petição 870200139534, de 05/11/2020, pág. 52/69 2/17 FIG. 2A FIG. 2B FIG. 2C Petição 870200139534, de 05/11/2020, pág. 53/69 3/17 FIG. 3A FIG. 3B FIG. 3DFIG. 3C FIG. 3E Petição 870200139534, de 05/11/2020, pág. 54/69 4 /1 7 FIG. 4A FIG. 4B FIG. 4C Petição 870200139534, de 05/11/2020, pág. 55/69 FIG. 5A FIG. 5B FIG. 5C 5/17 Petição 870200139534, de 05/11/2020, pág. 56/69 6 /1 7 FIG. 6A FIG. 6B Petição 870200139534, de 05/11/2020, pág. 57/69 FIG. 7 7/17 Petição 870200139534, de 05/11/2020, pág. 58/69 FIG. 8 8/17 Petição 870200139534, de 05/11/2020, pág. 59/69 FIG. 9 9 /1 7 Petição 870200139534, de 05/11/2020, pág. 60/69 FIG. 10 10/17 Petição 870200139534, de 05/11/2020, pág. 61/69 FIG. 11B FIG. 11C 11 /1 7 FIG. 11A Petição 870200139534, de 05/11/2020, pág. 62/69 FIG. 12A FIG. 12B FIG. 12C FIG. 12C 12/17 Petição 870200139534, de 05/11/2020, pág. 63/69 FIG. 13 13/17 Petição 870200139534, de 05/11/2020, pág. 64/69 FIG. 14A FIG. 14B FIG. 14C FIG. 14D 14/17 Petição 870200139534, de 05/11/2020, pág. 65/69 FIG. 15 15/17 Petição 870200139534, de 05/11/2020, pág. 66/69 FIG. 16A FIG. 16B 1 6 /1 7 Petição 870200139534, de 05/11/2020, pág. 67/69 FIG. 17 17/17 Petição 870200139534, de 05/11/2020, pág. 68/69 1 / 1    RESUMO  “MÉTODO  DE  PREPARO  E  CARACTERIZAÇÃO  DE  NANOCARREADORES  PROTEÍCOS  PARA  LIBERAÇÃO  DE  COMPOSTOS  BOTÂNICOS  POR  ESTÍMULOS  AMBIENTAIS  E  RESPECTIVAS FORMULAÇÕES”.  Trata‐se  de  método  de  preparo  e  caracterização  de  nanocarreadores  proteícos  permitindo  a  aplicação  agrícola  no  controle  específico  de  uma  determinada  praga,  reduzindo perdas e efeitos adversos para organismos não‐alvo; dito método de preparo  e  caracterização  das  nanopartículas  de  zeína  que  contém  mistura  de  diferentes  compostos  botânicos  como  geraniol,  linalol,  limoneno,  cinamaldeído  e  nim  e  suas  associações serem suscetíveis a ação enzimática da enzima tripsina.  Petição 870200139534, de 05/11/2020, pág. 69/69 Folha de Rosto Relatório Descritivo Reivindicações Desenhos Resumo