RESSALVA Atendendo solicitação do autor, o texto completo desta dissertação será disponibilizado somente a partir de 17/12/2020. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE ENGENHARIA CAMPUS DE ILHA SOLTEIRA ALLAN DE MARCOS LAPAZ COMPORTAMENTO FISIO-BIOQUÍMICO DA SOJA EM RESPOSTA AO ENCHARCAMENTO DO SOLO ASSOCIADO AO EXCESSO DE FERRO Ilha Solteira 2019 PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA ALLAN DE MARCOS LAPAZ COMPORTAMENTO FISIO-BIOQUÍMICO DA SOJA EM RESPOSTA AO ENCHARCAMENTO DO SOLO ASSOCIADO AO EXCESSO DE FERRO Dissertação apresentada à Faculdade de Engenharia de Ilha Solteira – UNESP como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Agronomia. Especialidade: Sistemas de Produção. Prof.ª Dr.ª Ana Carolina Firmino Orientadora Prof.ª Dr.ª Liliane Santos de Camargos Coorientadora Prof. Dr. Rafael Simões Tomaz Coorientador Ilha Solteira 2019 FICHA CATALOGRÁFICA CERTIFICADO DE APROVAÇÃO AGRADECIMENTOS Aos meus pais, Marcos Antônio Lapaz e Maria de Fátima Rosseto, e a minha noiva, Camila Hatsu Pereira Yoshida, pelo apoio conferido a mim nessa jornada. A minha orientadora, Prof.ª Dr.ª Ana Carolina Firmino, e aos meus coorientadores, Prof.ª Dr.ª Liliane Santos de Camargos e Prof. Dr. Rafael Simões Tomaz, pelo conhecimento técnico repassado e pela confiança depositada em mim. Aos Profs. Drs. Paulo Alexandre Monteiro de Figueiredo, Carolina dos Santos Batista Bonini e Reges Heinrichs pelo conhecimento repassado. Ao apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001 e a Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP; processo: 2018 / 17380-4). A todos os meus amigos da graduação de Engenharia Agronômica e do programa de Pós-Graduação em Agronomia da UNESP, campus de Dracena e de Ilha Solteira, em especial ao doutorando Jailson Vieira Aguilar. A Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho" (UNESP), campus de Dracena e de Ilha Solteira e ao programa de Pós-Graduação em Agronomia, campus de Ilha Solteira, pela formação profissional conferida a mim até o presente momento. RESUMO O encharcamento do solo é um problema comum em algumas áreas agricultáveis, inclusive em regiões sob cultivo de soja (Glycine max). Em solos encharcados, ocorre a depleção de O2 do solo pelos microrganismos aeróbicos e plantas, afetando os processos metabólicos e fisiológicos das plantas após sofrerem anoxia no tecido radicular. Outro fator prejudicial neste contexto, é o aumento exponencial da disponibilidade de ferro (Fe) no solo, o que pode resultar na absorção excessiva do Fe pelas plantas. No primeiro experimento, o objetivo foi avaliar a vulnerabilidade do aparato fotossintético e produção de biomassa de duas cultivares de soja no estágio fenológico V2, sob condição hídrica adequada e diferentes níveis de encharcamento do solo associada a uma concentração moderada e duas concentrações tóxicas de Fe. No segundo experimento, o objetivo foi avaliar o comportamento fisiológico e bioquímico da soja cultivar Agroeste 3680 associado ao desenvolvimento das vagens (estágio fenológico R3) sob solo não encharcado e encharcado combinado com uma concentração moderada e duas concentrações tóxicas de Fe. No primeiro experimento, o aparato fotossintético das cultivares de soja responderam diferentemente ao encharcamento e à disponibilidade de Fe no solo. Ambas cultivares foram vulneráveis ao encharcamento de 100% em todas as concentrações Fe, o que resultou em danos acentuados às trocas gasosas, concentração de clorofilas e, consequentemente, levou à diminuição da biomassa seca da parte aérea e da raiz. O desempenho fotossintético e a produção de biomassa seca do Agroeste 3680 não foram afetados quando expostos a concentrações moderadas de Fe associadas ao encharcamento de 50%. A cultivar NS 6601 IPRO apresentou tolerância moderada ao Fe quando não cultivada em solo encharcado, uma vez que a taxa de assimilação de CO2, a eficiência instantânea da carboxilação e a concentração da clorofila a não foram afetadas. No segundo experimento, as trocas gasosas foram fortemente afetadas pelo encharcamento do solo. O excesso de Fe sem encharcamento do solo reduziu os pigmentos fotossintéticos e potencializou a redução quando associado ao encharcamento do solo. O acúmulo de amido e ureídeos no primeiro trifólio totalmente expandido podem ser considerados biomarcadores eficientes para indicar a fitotoxicidade causada pelo encharcamento do solo e excesso de Fe em plantas de soja. O comportamento da biomassa seca das vagens revelou que o desenvolvimento reprodutivo é bruscamente interrompido com a imposição dos estresses, principalmente sob efeito do encharcamento do solo, o que se deve em grande parte à diminuição substancialmente da A, ao bloqueio no transporte de carboidratos para os tecidos drenos e ao aumento de MDA. Palavras-chaves: Trocas gasosas. Clorofilas. Anoxia. Íon ferroso. Glycine max. ABSTRACT Soil waterlogging is a common problem in some agricultural areas, including regions under soybean (Glycine max) cultivation. In waterlogged soils, soil O2 depletion occurs due to aerobic microorganisms and plants, affecting the metabolic and physiological processes of plants after suffering anoxia in their root tissue. Another harmful factor of this situation is the exponential increase in the availability of iron (Fe) in the soil, which may result in excessive Fe uptake by plants. In the first experiment, the objective was to evaluate the vulnerability of the photosynthetic apparatus and biomass production of two soybean cultivars at the phenological stage V2, under optimal water condition and different levels of soil waterlogging, combined with one moderate and two toxic levels of Fe. While in the second experiment, the objective was to evaluate the physiological and biochemical behaviour of soybean cultivar Agroeste 3680, associated with the development of pods (at the phenological stage R3) in non-waterlogged and waterlogged soil, combined with one moderate and two toxic levels of Fe. In the first experiment, the photosynthetic apparatus of the two soybean cultivars responded differently to waterlogging and the availability of Fe in the soil. Both cultivars were vulnerable to waterlogging of 100% at all concentrations Fe, which resulted in damage to gas exchange and chlorophyll levels, and consequently, led to lower shoot and root biomass accumulation. The photosynthetic performance and dry biomass production of Agroeste 3680 were not affected when exposed to moderate levels of Fe associated with waterlogging of 50%. NS 6601 IPRO cultivar also showed a moderate tolerance to excess Fe when not waterlogged, since net photosynthetic rate, instantaneous carboxylation efficiency and chlorophyll a content were not affected. In the second experiment, gas exchange was strongly affected by soil waterlogging. Excess Fe without soil waterlogging reduced photosynthetic pigments, and potentiated this reduction when associated with soil waterlogging. Starch and ureides accumulated in the first newly expanded trifoliate leaves could be considered efficient biomarkers, indicating phytotoxicity caused by soil waterlogging and Fe excess in soybean plants. Thus, this finding can be used as a parameter to identify tolerable varieties to these abiotic conditions. The reproductive development was abruptly interrupted by the imposition of the stresses, leading to loss of pod dry biomass, particularly under soil waterlogging, which was largely due to the substantial decrease in A, the blockage of carbohydrate transport to sink tissues and an increase of MDA. Keywords: Anoxia. Ferrous ion. Starch. Ureides. Glycine max. LISTA DE FIGURAS CAPÍTULO I Descrevendo como o encharcamento do solo associado ao excesso de Fe podem ser prejudiciais às plantas CAPITULO II Comportamento fotossintético e produção de biomassa em resposta ao encharcamento do solo associado ao excesso de ferro na fase vegetativa da soja Figura 1 - Taxa de assimilação de CO2 expressa por área (A e B) e condutância estomática (C e D) em plantas de soja submetidas a três níveis de encharcamento (0 - sem encharcamento, 50 e 100%) e três concentrações de Fe (25, 125 e 500 mg dm-3), em duas cultivares (Agroeste 3680 e NS 6601 IPRO). De acordo com o teste de Tukey, letras maiúscula comparam os níveis de encharcamento entre as diferentes concentrações de Fe, letras minúsculas comparam os níveis de encharcamento dentro das mesmas concentrações de Fe e * expressa o valor significativamente maior entre as duas cultivares em cada condição testada. Barra na vertical representa o desvio padrão (n = 6 plantas) .................................................................................................... 26 Figura 2 - Eficiência instantânea da carboxilação (A e B) em plantas de soja submetidas a três níveis de encharcamento (0 - sem encharcamento, 50 e 100%) e três concentrações de Fe (25, 125 e 500 mg dm-3), em duas cultivares (Agroeste 3680 e NS 6601 IPRO). De acordo com o teste de Tukey, letras maiúscula comparam os níveis de encharcamento entre as diferentes concentrações de Fe, letras minúsculas comparam os níveis de encharcamento dentro das mesmas concentrações de Fe e * expressa o valor significativamente maior entre as duas cultivares em cada condição testada. Barra na NS 6601 IPRO vertical representa o desvio padrão (n = 6 plantas) .............................................................................. 27 Figura 3 - Transpiração (A e B) e eficiência do uso da água (D e C) em plantas de soja em plantas de soja submetidas a três níveis de encharcamento (0 - sem encharcamento, 50 e 100%) e três doses de Fe (25, 125 e 500 mg dm-3), em duas cultivares (Agroeste 3680 e NS 6601 IPRO). De acordo com o teste de Tukey, letras maiúscula comparam os níveis de encharcamento entre as diferentes concentrações de Fe, letras minúsculas comparam os níveis de encharcamento dentro das mesmas concentrações de Fe e * expressa o valor significativamente maior entre as duas cultivares em cada condição testada. Barra na vertical representa o desvio padrão (n = 6 plantas)............................................... 28 Figura 4 - Concentração de clorofila a (A e B), concentração de clorofila b (C e D) e concentração de clorofila total (E e F) em plantas de soja submetidas a três níveis de encharcamento (0 – sem encharcamento, 50 e 100%) e três concentrações de Fe (25, 125 e 500 mg dm-3), em duas cultivares (Agroeste 3680 e NS 6601 IPRO). De acordo com o teste de Tukey, letras maiúsculas comparam os níveis de encharcamento independente das concentrações de Fe e cultivares, letras minúsculas comparam as concentrações de Fe independente dos níveis de encharcamento e * expressa o valor significativamente maior entre as duas cultivares independente dos níveis de encharcamento. Barra na 30 vertical representa o desvio padrão (n = 6 plantas).................................. Figura 5 - Concentração de carotenoides (A e B) em plantas de submetidas a três níveis de encharcamento (0 - sem encharcamento, 50 e 100%) e três concentrações de Fe (25, 125 e 500 mg dm-3), em duas cultivares (Agroeste 3680 e NS 6601 IPRO). De acordo com o teste de Tukey, letras maiúsculas comparam os níveis de encharcamento independente das concentrações de Fe e cultivares, letras minúsculas comparam as concentrações de Fe independente dos níveis de encharcamento e * expressa o valor significativamente maior entre as duas cultivares independente dos níveis de encharcamento. Barra na vertical representa o desvio padrão (n = 6 plantas)................................................................ 31 Figura 6 - Biomassa seca da parte aérea (A e B) e biomassa seca da raiz (C e D) em plantas de soja submetidas a três níveis de encharcamento (0 - sem encharcamento, 50 e 100%) e três concentrações de Fe (25, 125 e 500 mg dm-3), em duas cultivares (Agroeste 3680 e NS 6601 IPRO). De acordo com o teste de Tukey, letras maiúscula comparam os níveis de encharcamento entre as diferentes concentrações de Fe, letras minúsculas comparam os níveis de encharcamento dentro das mesmas concentrações de Fe e * expressa o valor significativamente maior entre as duas cultivares em cada condição testada. Barra na vertical representa o desvio padrão (n = 9 plantas)............................................... 32 Figura S1 - Dados climáticos de temperatura média, temperatura máxima, temperatura mínima e umidade relativa registrados na casa de vegetação durante a condução experimental............................................ 37 CAPITULO III Um vislumbre comportamental da soja em resposta ao encharcamento do solo associado ao excesso de ferro no estágio reprodutivo Figura 1 - Taxa de assimilação de CO2 expressa por área (A), condutância estomática (B), taxa de transpiração (C), eficiência do uso da água (D) e eficiência instantânea da carboxilação (E) em plantas de soja submetidas a dois níveis de encharcamento do solo (sem encharcamento e com encharcamento) e três concentrações de Fe (25, 125 e 500 mg dm-3). De acordo com o teste de Tukey, letras maiúscula comparam os níveis de encharcamento entre as diferentes concentrações de Fe, enquanto letras minúsculas comparam os níveis de encharcamento dentro das mesmas concentrações de Fe. Barra na vertical representa o desvio padrão (n = 6 plantas).................................. 46 Figura 2 - Conteúdo de Clorofila a (A), clorofila b (B), clorofila total (C) e carotenoides (D) em plantas de soja submetidas a dois níveis de encharcamento do solo (sem encharcamento e com encharcamento) e três concentrações de Fe (25, 125 e 500 mg dm-3). De acordo com o teste de Tukey, letras maiúscula comparam os níveis de encharcamento entre as diferentes concentrações de Fe, enquanto letras minúsculas comparam os níveis de encharcamento dentro das mesmas concentrações de Fe. Barra na vertical representa o desvio padrão (n = 6 plantas)............................................................................................... 47 Figura 3 - Conteúdos de amido (A), sacarose (B) e carboidratos totais (C) em plantas de soja submetidas a dois níveis de encharcamento do solo (sem encharcamento e com encharcamento) e três concentrações de Fe 49 (25, 125 e 500 mg dm-3). De acordo com o teste de Tukey, letras maiúscula comparam os níveis de encharcamento entre as diferentes concentrações de Fe, enquanto letras minúsculas comparam os níveis de encharcamento dentro das mesmas concentrações de Fe. Barra na vertical representa o desvio padrão (n = 6 plantas).................................. Figura 4 - Conteúdos de ureídeos totais (A), ácido alantóico (B), alantoína (C), nitrato (D) e proteína (E) em plantas de soja submetidas a dois níveis de encharcamento do solo (sem encharcamento e com encharcamento) e três concentrações de Fe (25, 125 e 500 mg dm-3). De acordo com o teste de Tukey, letras maiúscula isoladas comparam os níveis de encharcamento, independente das concentrações de Fe, enquanto letras minúsculas isoladas comparam as concentrações de Fe, independente do encharcamento. Letras maiúscula comparam os níveis de encharcamento entre as diferentes concentrações de Fe, enquanto letras minúsculas comparam os níveis de encharcamento dentro das mesmas concentrações de Fe. Barra na vertical representa o desvio padrão (n = 6 plantas)................................................................................................. 51 Figura 5 - Peróxido de hidrogênio (A) e malondialdeído (B) em plantas de soja submetidas a dois níveis de encharcamento do solo (sem encharcamento e com encharcamento) e três concentrações de Fe (25, 125 e 500 mg dm-3). De acordo com o teste de Tukey, letras maiúscula isoladas comparam os níveis de encharcamento, independente das concentrações de Fe, enquanto letras minúsculas isoladas comparam as concentrações de Fe, independente do encharcamento. Barra na vertical representa o desvio padrão (n = 6 plantas)................................. 52 Figura 6 - Biomassa seca da parte aérea (A), biomassa seca das vagens (B), biomassa seca da raiz (C) e acúmulo de Fe na parte aérea (D), em plantas de soja submetidas a dois níveis de encharcamento do solo (sem encharcamento e com encharcamento) e três concentrações de Fe (25, 125 e 500 mg dm-3). De acordo com o teste de Tukey, letras maiúscula comparam os níveis de encharcamento entre as diferentes concentrações de Fe, enquanto letras minúsculas comparam os níveis de encharcamento dentro das mesmas concentrações de Fe. Barra na vertical representa o desvio padrão (n = 6 plantas para FEAS; n = 9 plantas para biomassa seca)...................................................................... 53 Figura 7 - Correlação de Pearson entre as características analisadas. Os quadrados que receberam a cor branca pertencem à categoria de valores não significativos. Taxa de assimilação de CO2 expressa por área (A), condutância estomática (gs), taxa de transpiração (E), eficiência instantânea do uso da água (EUA), eficiência da carboxilação (EiC), clorofila a (Ca), clorofila b (Cb), clorofila total (Ct), carotenoides (CAR), peróxido de hidrogênio (H2O2), malondialdeído (MDA), biomassa seca da parte aérea (BSPA), biomassa seca da vagens (BSV), biomassa seca da raiz (BSR) e acúmulo de Fe na parte aérea (AFePA)................................................................................................... 54 Figura S1 - Dados climáticos de temperatura média, temperatura máxima, temperatura mínima e umidade relativa registrados na casa de vegetação durante a condução experimental............................................ 61 LISTA DE TABELAS CAPITULO I Descrevendo como o encharcamento do solo associado ao excesso de Fe podem ser prejudiciais às plantas CAPITULO II Comportamento fotossintético e produção de biomassa em resposta ao encharcamento do solo associado ao excesso de ferro na fase vegetativa da soja Tabela S1 - Resumo da análise de variância (ANOVA) entre três níveis de encharcamento do solo (0, 50 e 100%), três concentrações de ferro (25, 125 e 500 mg dm-3) e duas cultivares (Agroeste 3680 e NS 6601 IPRO) para as características de taxa de assimilação de CO2 expressa por área (A), condutância estomática (gs), transpiração (E), eficiência da carboxilação (EiC), eficiência instantânea do uso da água (EUA), clorofila a (Ca), clorofila b (Cb), clorofila total (Ct), carotenoides (CAR), biomassa seca da parte aérea (BSPA) e biomassa seca da raiz (BSR)........................................................................................................ 36 CAPITULO III Um vislumbre comportamental da soja em resposta ao encharcamento do solo associado ao excesso de ferro no estágio reprodutivo Tabela S1 - Resumo da análise de variância (ANOVA) entre dois níveis de água no solo (sem encharcamento e com encharcamento), três concentrações de ferro (25, 125 e 500 mg dm-3) para as características de taxa de assimilação de CO2 expressa por área (A), condutância estomática (gs), transpiração (E), eficiência instantânea do uso da água (EUA), eficiência da carboxilação (EiC), clorofila a (Ca), clorofila b (Cb), clorofila total (Ct), carotenoides (CAR), amido, carboidratos totais, sacarose, ureídeos totais, alantoato, alantoína, amônia, nitrato, proteína, peróxido de higrogênio (H2O2), malondialdeído (MDA), acúmulo de ferro na parte aérea (AFEPA), biomassa seca da parte aérea (BSPA), biomassa seca das vagens (BSV), biomassa seca da raiz (BSR)........................................................................................................ 60 SUMARIO CAPITULO I Descrevendo como o encharcamento do solo associado ao excesso de Fe podem ser prejudiciais às plantas 1 INTRODUÇÃO...................................................................................... 14 1.1 REVISÃO DE LITERATURA.............................................................. 15 1.1.1 Históricos da soja e sua importância para o Brasil............................. 15 1.1.2 Disponibilidade do Fe sob efeito do encharcamento do solo.............. 16 1.1.3 Excesso de Fe e estresse oxidativo...................................................... 16 1.1.3.1 Efeito indireto (inclusão)........................................................................ 16 1.1.3.2 Efeito indireto (exclusão)....................................................................... 18 1.1.4 Fixação biológica do N em solos encharcados e não encharcados............................................................................................. 18 CAPITULO II Comportamento fotossintético e produção de biomassa em resposta ao encharcamento do solo associado ao excesso de ferro na fase vegetativa da soja 2 INTRODUÇÃO...................................................................................... 20 2.1 MATERIAL E MÉTODOS................................................................... 21 2.1.1 Local experimental................................................................................. 21 2.1.2 Delineamento e tratamentos experimentais......................................... 22 2.1.3 Condições de cultivo............................................................................... 22 2.1.4 Instalação e condução experimental..................................................... 22 2.1.5 Determinação dos atributos de trocas gasosas..................................... 23 2.1.6 Determinação do conteúdo de pigmentos fotossintéticos.................... 24 2.1.7 Produção de biomassa............................................................................ 24 2.1.8 Análise estatística................................................................................... 24 2.2 RESULTADOS....................................................................................... 24 2.2.1 Comportamento das trocas gasosas...................................................... 24 2.2.2 Concentração de pigmentos fotossintéticos.......................................... 29 2.2.3 Produção de biomassa............................................................................ 31 2.3 DISCUSSÃO........................................................................................... 32 2.3.1 Trocas gasosas: comportamento diferencial de cultivares de soja e efeito em resposta ao encharcamento do solo combinado com o excesso de ferro....................................................................................... 32 2.3.2 A concentração de pigmentos fotossintético reduziram no encharcamento de 100% e as cultivares apresentaram comportamento diferencial às concentrações de Fe............................ 34 2.3.3 Produção de biomassa: comportamento diferencial de cultivares de soja em resposta ao encharcamento do solo combinado com o excesso de ferro....................................................................................... 35 2.4 CONCLUSÕES...................................................................................... 35 MATERIAL SUPLEMENTAR............................................................ 36 CAPITULO III Um vislumbre comportamental da soja em resposta ao encharcamento do solo associado ao excesso de ferro no estágio reprodutivo 3 INTRODUÇÃO...................................................................................... 38 3.1 MATERIAL E MÉTODOS................................................................... 39 3.1.1 Local experimental................................................................................. 39 3.1.2 Delineamento e tratamentos experimentais......................................... 39 3.1.3 Condições de cultivo............................................................................... 40 3.1.4 Instalação e condução experimental.................................................... 40 3.1.5 Determinação dos atributos de trocas gasosas..................................... 41 3.1.6 Coleta de folhas no término da imposição dos estresses..................... 41 3.1.7 Análise dos pigmentos fotossintéticos................................................... 42 3.1.8 Análise dos compostos de C e N nas folhas.......................................... 42 3.1.9 Análise do peróxido de hidrogênio e peroxidação lipídica................. 43 3.1.10 Acúmulo de Fe na parte aérea e produção particionada de biomassa.................................................................................................. 44 3.1.11 Análise estatística................................................................................... 44 3.2 RESULTADOS....................................................................................... 44 3.2.1 Comportamento das trocas gasosas...................................................... 44 3.2.2 Conteúdo de pigmentos fotossintéticos................................................. 46 3.2.3 Metabolismo do carbono na folha......................................................... 47 3.2.4 Metabolismo do nitrogênio na folha..................................................... 49 3.2.5 Concentração de peróxido de hidrogênio e peroxidação lipídica...... 51 3.2.6 Acúmulo de Fe na parte aérea e produção particionada de biomassa.................................................................................................. 52 3.3 DISCUSSÃO........................................................................................... 54 3.3.1 As trocas gasosas foram fortemente afetadas pelo encharcamento do solo...................................................................................................... 54 3.3.2 O excesso de Fe sem encharcamento do solo reduziu os pigmentos fotossintéticos e potencializou a redução quando associado ao encharcamento do solo........................................................................... 55 3.3.3 Metabolismo de carbono e nitrogênio: o amido e os ureídeos se acumulam na folha em resposta ao encharcamento do solo e ao excesso de Fe........................................................................................... 56 3.3.4 Toxicidade e peso da biomassa particionada em resposta ao encharcamento do solo e ao excesso de Fe........................................... 57 3.4 CONCLUSÕES...................................................................................... 58 MATERIAL SUPLEMENTAR............................................................ 59 REFERÊNCIAS..................................................................................... 61 14 CAPÍTULO I Descrevendo como o encharcamento do solo associado ao excesso de Fe podem ser prejudiciais às plantas 1INTRODUÇÃO A soja [Glycine max (L.) Merrill] é uma cultura com alto valor econômico responsável pelo fornecimento de mais da metade do óleo vegetal e dois terços da farinha de proteína no mundo (DIVITO et al., 2015), motivo pelo qual é a leguminosa mais cultivada entre as demais (BORNHOFEN et al., 2015). A soja é utilizada como matéria-prima em muitos segmentos agroindustriais e de indústrias químicas e alimentícias (PIMENTEL ; PATZEK, 2005; VIANNA et al., 2013). O grão tem alto conteúdo proteico (cerca de 40%) (VIEIRA et al., 1999), além de ser fonte de vitaminas, fosfolipídio, mineral e de compostos bioativos (ACHOURI, et al., 2005; KIM, et al., 2012). O ferro (Fe) é um elemento extremamente importante para a vida (AMILS et al., 2007). Em particular, para as plantas, esse mineral é componente do grupo de proteínas ferro- enxofre (Fe-S) e heme, os quais exercem funções biológicas chaves para a manutenção da vida, como fotossíntese, respiração, fixação do nitrogênio (N), síntese de DNA e síntese de hormônios vegetais (BECANA et al., 1998; JEONG ; GUERINOT, 2009; BALK ; PILON, 2011). Solos pobres ou ricos em Fe apresentam problemas para o cultivo de culturas. Especificamente, concentrações elevadas de Fe associada a condições anaeróbicas tornam-no fitotóxico para a planta (FREI et al., 2016; MARANGUIT et al., 2017). Anteriormente, foi documentado toxicidade por Fe na soja devido ao encharcamento do solo, ocasionado pelo excesso de chuva forte em solo compacto com deficiência natural de drenagem (BATAGLIA ; MASCARENHAS, 1981). Uma vez o Fe2+ absorvido em excesso, esse metal pode deslocar o equilíbrio redox da célula para um estado pró-oxidante, afetando os mecanismos fisiológicos e causando alterações estruturais e ultraestruturais em função do estresse oxidativo (JUCOSKI et al., 2013; SIQUEIRA-SILVA et al., 2012). Os sintomas típicos nas folhas são bronzeamento e necrose, enquanto na raiz é flacidez, ausência de ramificação, aspecto mucilaginoso e escurecimento do ápice radicular; tanto a parte aérea como a raiz têm seu crescimento afetado (DA SILVA et al., 2017). Outro fator prejudicial em decorrência do encharcamento do solo é o preenchimento dos espaços dos macroporos do solo pela água, restringindo o fornecimento de O2 para a raiz 15 e nódulos (em leguminosas), categorizado pela ausência parcial de O2 (hipóxia) ou completa ausência de O2 (anoxia) (MOHANTY ; ONG, 2003). A escassez do O2 altera via da fosforilação oxidativa para glicólise e fermentação (MOHANTY ; ONG, 2003), como a eficiência energética dessa via é menor, consequentemente provoca declínio na fixação do N e na síntese de ATP (SOUZA et al., 2016). Portanto, no estágio fenológico V2, o objetivo foi avaliar a vulnerabilidade do aparato fotossintético e produção de biomassa de duas cultivares de soja no estágio fenológico V2, sob condição hídrica adequada e diferentes níveis de encharcamento do solo associada a uma concentração moderada e duas concentrações tóxicas de Fe. No estágio fenológico R3, o objetivo foi avaliar as trocas gasosas, conteúdo de pigmentos fotossintéticos, metabolismo do C e N, concentração de Fe na parte aérea e raiz e peroxidação lipídica na soja, a fim de associar essas respostas à produção de biomassa e ao desenvolvimento de vagens, o que proporcionará subsídios para o desenvolvimento de variedades toleráveis a essas condições abiótica 1.1. REVISÃO DE LITERATURA 1.1.1. Históricos da soja e sua importância para o Brasil A soja [Glycine max (L.) Merrill] é a principal cultura leguminosa do mundo (BORNHOFEN et al., 2015), sendo, respectivamente o USA, Brasil e Argentina os seus principais produtores (EMBRAPA, 2017). A utilização do grão da soja na dieta humana e animal em vários países decorre de seu valor nutricional, principalmente pelo alto conteúdo proteico, com cerca de 40% (VIEIRA et al., 1999), além de ser fonte de vitaminas, fosfolipídio, mineral e de compostos bioativos (ACHOURI, et al., 2005; KIM, et al., 2012). Ainda, o grão da soja, tem outros destinos no mercado mundial, como a produção de óleo vegetal, biocombustíveis, farinha, formulação de rações, entre outros (PIMENTEL ; PATZEK, 2005; VIANNA et al., 2013). Esta cultura foi domesticada a partir da soja selvagem (Glycine soja Sieb. e Zucc.), na China há 5.000 anos e, posteriormente, introduzida na Coréia e Japão há cerca de 2.000 anos. Por volta de 1765, chegou à América do Norte e, logo após, durante a primeira metade do século passado, chegou à América Central e do Sul (ZHOU et al., 2015). Por fim, no ano de 1919, começou a apresentar participação efetiva na produção mundial de grãos (SCHAUB et al., 1988). No Brasil, em 1901, foi realizado o primeiro cultivo de soja, registrado pela Estação Agropecuária de Campinas, fundada em 1887, pelo Imperador Dom Pedro II, atualmente 16 conhecida como Instituto Agronômico de Campinas (IAC). Somente em 1941, o cultivo de soja obteve registro estatístico no Anuário Agrícola do Rio Grande do Sul, apresentando um rendimento de aproximadamente 700 kg ha-1. Contudo, o aumento expressivo na produção de soja no Brasil aconteceu somente ao final da década de 70 (BARBOSA ; ASSUNÇÃO, 2001). Atualmente, no Brasil, a soja movimenta grande parte do agronegócio, sua área de cultivo corresponde a mais de 50% de toda área cultivada com grãos no país, sendo o segundo maior produtor, atrás apenas dos Estados Unidos. Na safra de (2016/2017) a produção nacional foi de 113,9 milhões de toneladas em uma área de 33,9 milhões de hectares com produtividade média de 3362 kg ha-1; enquanto que os EUA alcançaram 117,2 milhões de toneladas em uma área de 33,5 milhões de hectares com produtividade média de 3501 kg ha-1 ambos na safra de 2016/2017 (EMBRAPA, 2017). A perspectiva é de que em 2020 a produção brasileira de soja ultrapasse a produção dos EUA, tornando-se o maior produtor mundial dessa commodity, por meio do aumento de produtividade e a maior capacidade de cultivo em terras agricultáveis, já que os EUA se encontram limitados a exploração de novas áreas de cultivo, dependendo somente do aumento de produtividade (FREITAS, 2011). 1.1.2. Disponibilidade do Fe sob efeito do encharcamento do solo Em situações de encharcamento do solo, a estratégia 1 e 2 de absorção do Fe não são necessárias (HELL ; STEPHAN, 2003), pois é aumentado a disponibilidade do Fe no solo em decorrência das atividades realizados pelos microrganismos do solo. Mais precisamente, nesta situação, os microrganismos aeróbicos consomem todo o O2 molecular e morrem por falta deste. Os microrganismos remanescentes anaeróbicos facultativos e anaeróbicos então passam a atuar. Esses microrganismos utilizam aceptores de elétrons alternativos como NO3-, Mn4+, Fe3+ e SO4 2- para manter o seu metabolismo celular (MARANGUIT et al., 2017). Dessa maneira, os elétrons são transferidos dos compostos orgânicos para os oxidados, resultando em um ambiente de redução de pH e acúmulo de CO2 e alteração do potencial redox do solo (MARANGUIT et al., 2017), o que limita a disponibilidade de nutrientes no solo e causa o acúmulo de fitotoxinas (YIN ; KOMATSU, 2017). 1.1.3. Excesso de Fe e estresse oxidativo 1.1.3.1. Efeito indireto (inclusão) 17 Na resposta direta, ocorre o acúmulo de Fe2+ livre na planta, uma vez que há comprometimento do metabolismo celular. Nesta situação, o Fe2+ passa ser um potencial tóxico para as plantas, pois catalisa a decomposição do peróxido de hidrogênio (H2O2), formando os radicais de hidroxilas (HO•), conforme equação: 𝐹𝑒2+ + 𝐻2𝑂2 → 𝐹𝑒3+ + 𝐻𝑂• + 𝐻𝑂−, o qual são extremamente reativos, cuja reação é denominada de Fenton. O Fe3+, produto da reação de Fenton, pode ser reduzido de volta à Fe2+ pelo ânion superóxido (O2 •-), regenerando Fe2+ e permitindo que ocorra novamente a reação de Fenton, conforme equação: 𝐹𝑒3+ + 𝑂2 •− → 𝐹𝑒2+ + 𝑂2 (reação de Haber-Weiss (HELL; STEPHAN, 2003). Dentre as espécies reativas de oxigênio (EROs), os radicais de hidroxilas (HO•) são os mais prejudiciais para a planta, provocando a peroxidação lipídica, incluindo o colapso celular e, até mesmo, a deterioração do tecido. Além disso, provoca a oxidação dos açúcares, proteínas, ácido nucléicos e lipídios, interrupção do transporte de elétrons e inibição ou ativação enzimática (HELL ; STEPHAN, 2003; PEREIRA et al., 2013). Para conter o estresse oxidativo, as plantas dispõem de sistemas de defesa antioxidantes, dividido em compostos enzimáticos [superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e peroxidase (POD)]; e compostos não enzimáticas (glutationa, carotenóides, ascorbato, tocoferol, ubiquinol, ácido úrico e ácido lipóico) (JUCOSKI et al., 2013, KROHLING et al., 2016). Outra alternativa para evitar o estresse oxidativo, é a ligação do Fe na parede celular e a armazenação em proteínas chamadas ferritinas, as quais têm a capacidade de armazenar até 4500 átomos de Fe em seu núcleo. Estes processos visam a homeostase do Fe, a fim mantê-lo em um nível funcional ótimo para a planta, evitando que ele reaja com o O2 e gere EROs (NIKOLIC ; RÖMHELD, 2003; DARBANI et al., 2013). As ferritinas são encontradas principalmente nos cloroplastos e mitocôndrias (NOUET; MOTTE; HANIKENNE, 2011), locais estes quantitativamente mais importantes para uso do Fe (THOMINE ; VERT, 2013), embora também estejam presentes em plastídios da raiz e nos vacúolos (HELL ; STEPHAN, 2003). É aceito que, para a entrada do Fe no cloroplasto, é necessário que antes ocorra sua redução, reação catalisada pela proteína FRO7, enquanto a PIC1, pode ser um importador de Fe cloroplastidial; ambas proteínas estão localizadas no envelope interno do cloroplasto. Em relação a entrada do Fe na mitocôndria, a FRO8 parece estar envolvida na redução do Fe, porém ainda não está claro o importador específico do Fe (NOUET; MOTTE; HANIKENNE, 2011). 18 Especificamente para o Fe, os vacúolos exercem papel de armazenamento e sequestro, especialmente em sementes. Os transportadores NRAMP3 e NRAMP4 exportam o Fe para fora dos vacúolos, enquanto o transportador VIT1 exerce função na importação de Fe para o vacúolo (THOMINE ;VERT, 2013). O influxo do Fe para o vacúolo das células radiculares é mediado via transportador AtFPN2 (MORRISSEY ; GUERINOT, 2009). 1.1.3.2. Efeito indireto (exclusão) Por outro lado, indiretamente, o Fe2+ reage com oxigênio presente na raiz, formando um precipitado de hidróxido de ferro na superfície da raiz, de cor avermelhado regular e aspecto macio ou uma placa de revestimento irregular, o que altera a absorção de outros nutrientes (CHENG et al., 2014; KROHLING et al., 2016). É importante salientar, que mesmo a raiz em situação de anoxia, a falta de O2 pode ser suprida neste órgão, através da formação de extensos aerênquimas oriundos da parte aérea e de modificações anatômicas na raiz (CHENG et al., 2014), em consequência pode ocasionar a resposta indireta supracitada. 1.1.4. Fixação biológica do N em solos encharcados e não encharcados As plantas podem absorver as formas de N orgânico e inorgânico, porém a maior fonte de N para as plantas é o N inorgânico, o qual é principalmente absorvido na forma de nitrato (NO3 -) e amônio (NH4 +). Outra forma de absorção é fixação biológica do nitrogênio (FBN) em plantas simbióticas, onde o nitrogênio (N2) utilizado é oriundo da atmosfera (BLUMENTHAL et al., 1997; PELIZZARO et al., 2017). Especificamente, nas leguminosas, a forma predominante de absorção do N é via FBN, devido terem a capacidade de estabelecer simbioses com as bactérias do gênero Rhizobium para fixar o N2 atmosférico (OLDROYD, 2001, BALESTRASSE et al., 2006). A associação simbiótica das leguminosas com as bactérias fixadoras de N ocorrem, na pluralidade das espécies, no sistema radicular, formando os nódulos radiculares, onde ocorre a conversão do N2 atmosférico à NH3 +, pela ação da enzima nitrogenase (BALESTRASSE et al., 2006). A enzima nitrogenase é um complexo enzimático formado por duas subunidades (proteínas). Subunidade I, a nitrogenase ou Fe-proteína; subunidade II, a dinitrogênio redutase ou MoFe-proteína. A ferredoxina reduz a Fe-proteína, que logo em seguida, hidrolisa ATP e reduz a MoFe-proteina. A MoFe-proteína, sob condições normais, reage com N2 e H+, tendo como o produto o NH4 + (ANDREWS et al., 2009). 19 Essa interação simbiótica efetiva entre a planta e o rizóbio é apoiada por uma complexa rede de troca de nutrientes entre os dois parceiros (PELIZZARO et al., 2017). Em troca do NH3 +, as plantas fornecem carboidratos, como o malato, oriundo de seu processo fotossintético. Dentro dos nódulos, esses carboidratos são hidrolisados para a obtenção dos compostos intermediários da respiração e de compostos com poder redutor (BALESTRASSE et al., 2006; JUSTINO ; SODEK, 2013). O O2 é aceptor final dos elétrons provenientes da respiração do bacterióide, no entanto a enzima nitrogenase é sensível à sua presença, o que afeta a sua atividade (LUCIÑSKI, POLCYN ; RATAJCZAK, 2002). Em vista disso, visando a homeostase, a entrada do O2 no bacterióide é controlada por uma camada de células que circunda o córtex interno do nódulo ao redor da zona infectada, formando uma barreira de difusão ao O2 (JUSTINO ; SODEK, 2013). A proteína leghemoglobina também está diretamente relacionada ao controle do O2 dentro do hospedeiro, assim, por meio da sua alta afinidade com o O2, liga-se a este e armazena-o por alguns segundos, para transportá-lo até as células dos nódulos, o que garante a disponibilidade de grandes quantidades de O2, porém de maneira muito controlada (TAIZ et al., 2017). A partir desses recursos fisiológicos da planta, os níveis de O2 livre no hospedeiro são reduzidos, o que favorece a atividade da enzima nitrogenase. Quando o solo está encharcado, ocorre o preenchimento dos espaços dos macroporos do solo pela água, restringindo o fornecimento de O2 para a raiz e nódulos, categorizado em ausência parcial de O2 (hipóxia) ou a completa ausência de O2 (anoxia) (MOHANTY; ONG, 2003). Dessa forma, a escassez do O2 altera via da fosforilação oxidativa para glicólise e a fermentação (MOHANTY ; ONG, 2003), como a eficiência energética dessa via é substancialmente menor, ocorre declínio da fixação do N e da síntese de ATP (SOUZA, et al., 2016). 62 REFERÊNCIAS ACHOURI, A.; BOYE, J. I.; BELANGER D. Soybean isoflavones: efficacy of extration consition and an effect of food type on extractability. Food Research International, Barking, v.38, n 10, p. 1199-1204, 2005. ALEXIEVA, V.; SERGIEV, I.; MAPELLI, S.; KARANOV, E. The effect of drought and ultraviolet radiation on growth and stress markers in pea and wheat. Plant, Cell and Environment, Chichester, v. 24, n. 12, p. 1337-1344, 2001. 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