UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA – UNESP CÂMPUS DE JABOTICABAL ACÚMULO DE CÁDMIO, CRÔMIO E NÍQUEL E ISOLAMENTO DE MICRO-ORGANISMOS POTENCIAIS PARA BIORREMEDIAÇÃO EM ÁREA AGRÍCOLA Guilherme Deomedesse Minari Tecnólogo em Biocombustíveis 2016 D I S S. / M I N A R I G. D. 2 0 1 6 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA – UNESP CÂMPUS DE JABOTICABAL ACÚMULO DE CÁDMIO, CRÔMIO E NÍQUEL E ISOLAMENTO DE MICRO-ORGANISMOS POTENCIAIS PARA BIORREMEDIAÇÃO EM ÁREA AGRÍCOLA Guilherme Deomedesse Minari Orientadora: Profa. Dra. Lucia Maria Carareto Alves Coorientadora: Profa. Dra. Luciana Maria Saran Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Unesp, Câmpus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Microbiologia Agropecuária 2016 FICHA CATALOGRÁFICA Minari, Guilherme Deomedesse M663 a Acúmulo de cádmio, crômio e níquel e isolamento de micro- organismos potenciais para biorremediação em área agrícola / Guilherme Deomedesse Minari. – – Jaboticabal, 2016 vi, 87 p. : il. ; 28 cm Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, 2016 Orientadora: Lucia Maria Carareto Alves Banca examinadora: Luciana Maria Saran, Mariana Carina Frigieri, David Luciano Rosalen Bibliografia 1. Contaminação do solo. 2. Distribuição Espacial. 3. Resistência. 4. Fitorremediação I. Título. II. Jaboticabal- Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias. CDU 576.8:631.461 Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação – Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - UNESP, Câmpus de Jaboticabal. CERTIFICADO DE APROVAÇÃO DADOS CURRICULARES DO AUTOR Guilherme Deomedesse Minari – nascido em Jaboticabal, estado de São Paulo, em 21 de novembro de 1991. Ingressou no curso de Tecnologia em Biocombustíveis em março de 2010 pelo Centro Paula Souza – Faculdade de Tecnologia (FATEC) de Jaboticabal, Jaboticabal – SP, obtendo o título de Tecnológo em Biocombustíveis em dezembro de 2012. Durante sua graduação foi estágiário dos Laboratórios de Nematologia e Saneamento Ambiental, Departamentos de Fitossanidade e Engenharia Rural, respectivamente, ambos da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, UNESP-Jaboticabal. Seu trabalho de conclusão de curso foi realizado no laborátio de microbiologia da FATEC Jaboticabal, tendo como objetivo avaliar o controle de contaminantes bacterianos na fermentação etanólica, adotando como antimicrobianos naturais óleo de orégano e extrato de lúpulo. Em agosto de 2013 ingressou no programa de Pós-Graduação, curso de Mestrado em Microbiologia Agropecuária, pela Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, UNESP Câmpus de Jaboticabal (FCAV/UNESP), sob orientação das Professoras Dra. Lucia Maria Carareto Alves e Dra. Luciana Maria Saran, ambas do Departamento de Tecnologia. “As nuvens mudam sempre de posição, mas são sempre nuvens no céu. Assim devemos ser todo dia, mutantes, porém leais com o que pensamos e sonhamos; lembre-se, tudo se desmancha no ar, menos os pensamentos”. Paulo Beleki Aos meus pais, Cristiano e Liliane, por me apoiarem e acreditarem em mim. Dedico AGRADECIMENTOS A Deus, em primeiro lugar, pois em todos os momentos Ele esteve ao meu lado, me capacitando. Aos meus pais, Cristiano e Liliane, por confiarem e acreditarem em mim. À minha orientadora Profa. Dra. Lucia Maria Carareto Alves, pela orientação, apoio e transferência de conhecimentos. À coorientadora Profa. Dra. Luciana Maria Saran, pelos ensinamentos, dedicação e acima de tudo pela amizade. Ao Dr. João Carlos Campanharo e ao José Carlos de Freitas, que atuam como Assistentes de Suporte Acadêmico II junto ao Departamento de Tecnologia da FCAV (UNESP), por não medirem esforços para colaborar no desenvolvimento da pesquisa. À equipe do Núcleo de Geomática e Agricultura de Precisão - NGAP, sob supervisão do Prof. Dr. David Luciano Rosalen. À Profa. Dra. Mara Cristina Pessôa da Cruz, por ter contribuído desde o início e por sempre estar disponível. A toda equipe da FEPE (Fazenda de Ensino Pesquisa e Extensão da FCAV/UNESP). Ao Prof. Dr. Wanderley José de Melo e ao técnico Danilo Olandino de Souza por todo suporte oferecido. Ao Prof. Dr. Jairo Osvaldo Cazetta por ter cedido seu laboratório para realização de algumas análises. À Profa. Dra. Eliana Gertrudes de Macedo Lemos, que juntamente com a Profa. Dra. Lucia Maria Carareto Alves cedeu o laboratório, equipamentos e reagentes para a realização de toda a pesquisa microbiológica. À Dra. Camila Cesário Fernandes, Dra. Silvana Pompeia do Val de Moraes e ao Dr. Luciano Kishi, por toda ajuda na parte de sequenciamento e interpretação dos dados de bioinformática e biologia molecular. Aos meus colegas do Laboratório de Bioquímica de Micro-organismos e Plantas e do Laboratório de Química Analítica e Ambiental: Amanda Schmidt Célico, Géssica Aparecida Silveira, Ruth Helena Giansante e Laís Postai Sacco, pelos momentos de companheirismo. Aos estagiários Leonardo de Freitas Zechin e Maria Rosa Soares, pelo apoio e dedicação na coleta e processamento dos dados experimentais. A toda minha família. À CAPES, pela concessão da bolsa de estudos. E por fim, a todos que de alguma forma fizeram parte deste trabalho. A vocês, meu singelo agradecimento! i SUMÁRIO Página SUMÁRIO......................................................................................................................i LISTA DE TABELAS ...................................................................................................iii LISTA DE FIGURAS....................................................................................................iv LISTA DE ABREVIAÇÕES...........................................................................................v CAPÍTULO 1 – Considerações Gerais ....................................................................... 1 1.1. Introdução ........................................................................................................ 1 1.2. REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................ 2 1.2.1. Solo e uso agrícola ....................................................................................... 2 1.2.2. Contaminação do solo por metais pesados ................................................... 4 1.2.3. Uso de bactérias para a diminuição do teor ou remoção de metais pesados 7 1.3 Referências ...................................................................................................... 9 CAPÍTULO 2 - Uso agrícola como fator de acumulação de metais pesados em Latossolo ................................................................................................................. 17 2.1 Introdução ...................................................................................................... 22 2.2 Material e métodos ......................................................................................... 24 2.2.1 Amostragem .................................................................................................... 24 2.2.2 Atributos químicos do solo .............................................................................. 25 2.2.3 Elaboração dos mapas de distribuição espacial .......................................... 26 2.2.4 Análise estatística ....................................................................................... 26 2.3 Resultados e discussão.................................................................................. 27 2.3.3 Análise de componentes principais ............................................................. 29 2.4 Conclusões .................................................................................................... 38 2.5 Referências .................................................................................................... 38 CAPÍTULO 3 – Isolamento e identificação de bactérias resistentes a cádmio, cromo e níquel com potencial para biorremediação ............................................................ 43 3.1 Introdução ...................................................................................................... 44 3.2 Metodologia .................................................................................................... 46 3.2.1 Amostras de solo ........................................................................................ 46 3.2.2 Determinação de Cd, Cr e Ni em amostras de solo..................................... 48 3.2.3 Isolamento de bactérias resistentes a Cd, Cr e Ni ....................................... 48 ii 3.2.4 Solubilização de fósforo .............................................................................. 49 3.2.5 Produção de ácido indolacético (AIA).......................................................... 49 3.2.6 Identificação de bactérias ............................................................................ 49 3.3 Resultados e discussão.................................................................................. 51 3.3.1 Características do solo ................................................................................ 51 3.3.2 Bactérias resistentes a metais pesados ...................................................... 53 3.3.3 Índice de solubilização de fosfato (MSP) e produção de AIA por bactérias resistentes a metais ................................................................................................. 55 3.3.4 Identificação dos isolados ........................................................................... 59 3.4 Conclusões .................................................................................................... 66 3.5 Referências .................................................................................................... 66 4 Considerações Finais ........................................................................................ 75 ANEXO .................................................................................................................... 76 iii LISTA DE TABELAS Tabela 1. Valores médios e desvio padrão da média para Cd, Cr e Ni nas diferentes sub-áreas que compõem a área experimental. ........................................................ 28 Tabela 2. Concentrações limites de Cd, Cr e Ni para qualidade do solo, de acordo com o CONAMA e a CETESB. ................................................................................ 28 Tabela 3. Valores das áreas classificadas segundo os critérios adotados para os metais pesados na área experimental ...................................................................... 29 Tabela 4. Valores dos componentes principais encontrados na respectiva análise. . 30 Tabela 5. Coordenadas plano-retangulares (Projeção UTM) ................................... 47 Tabela 6. Concentrações de níquel (Ni), cádmio (Cd) e cromio (Cr) nas amostras de solos utilizadas para isolar bactérias resistentes a metais pesados; número total de bactérias por grama de solo (UFC/ g solo) e número de isolados morfologicamente diferentes obtidos. .................................................................................................... 52 Tabela 7. Produção de ácido indolacético (AIA), índice de solubilização de fosfato e resistência a 5 mmol L-1 por 13 isolados bacterianos de solo agrícola. .................... 56 Tabela 8. Análise, comparação e identificação das sequencias do gene 16SrRNA. 60 iv LISTA DE FIGURAS Figura 1. Projeção espacial e biplot das componentes principais (Relação: variáveis/amostras). ................................................................................................. 31 Figura 2. Variabilidade espacial de matéria orgânica (MO) em Latossolo vermelho Eutroférrico. ............................................................................................................. 34 Figura 3. Variabilidade espacial de cadmio (Cd) em Latossolo vermelho Eutroférrico. ................................................................................................................................. 35 Figura 4. Variabilidade espacial de crômio (Cr) em Latossolo vermelho Eutroférrico. ................................................................................................................................. 36 Figura 5. Variabilidade espacial de níquel (Ni) em Latossolo vermelho Eutroférrico. 37 Figura 6. Número de isolados bacterianos resistentes às concentrações de 0,1; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 4,0 e 5,0 mmol L-1 de Cd, Cr e Ni em meio DYGS. ................ 53 Figura 7. Análise filogenética molecular pelo método Maximum Likelihood (baseado no modelo Tamura-3) com bootstrap de mil repetições e análises evolutivas realizadas no MEGA v.6. ......................................................................................... 62 v LISTA DE ABREVIAÇÕES E SÍMBOLOS pH: potencial hidrogeniônico MO: matéria orgânica MN: mata nativa PC: plantio convencional PL: plantio com lodo de esgoto PD: plantio direto Cd: cadmio Cr: cromo ou crômio Ni: níquel AIA: ácido indol acético mm: milímetro Mg: megagrama mg kg-1: miligrama por quilograma mL: mililitro ºC: grau Celsius min: minuto h: horas ha: hectare μL: microlitro g: grama mmol L-1: milimol por litro rpm: rotação por minuto nm: nanometro DNA: ácido desoxirribonucleico VR: valor de referência VRQ: valor de referência de qualidade VP: valor de prevenção CP: componente principal ACP: análise de componentes principais UFC: unidade formadora de colônias vi CaCl2: cloreto de cálcio HNO3: ácido nítrico H2O2: peróxido de hidrogênio HCl: ácido clorídrico NaCl: cloreto de sódio KH2PO4: dihidrogenofosfato MgSO4: sulfato de magnésio VI: valor de intervenção CV: coeficiente de variação UTM: universal transverso de mercator PCR: reação da cadeia da polimerase MSP: micro-organismos solubilizadores de fosfato PGP: plant growth promoting bacteria EPS: exopolissacarídeos 1 CAPÍTULO 1 – Considerações Gerais 1.1. Introdução Estima-se que a população mundial está em torno de 7,3 bilhões de pessoas com crescimento pré-determinado para 10 bilhões em 2050. Esse aumento populacional acentua a demanda por alimentos e, portanto, práticas agrícolas aplicadas sucessivamente nos solos e, de maneira errônea, têm causado severos danos aos ecossistemas (OLIVEIRA e PEREIRA, 2014). Um dos principais bens naturais, o ecossistema solo, exerce diversas funções como: proteger e manter o ciclo das águas subterrâneas; conservar nutrientes; possibilitar a prospecção de micro-organismos e fornecer condições necessárias para a produção de alimentos (CETESB, 2015). O solo deveria ser visto, pela sociedade, como um bem natural que fornece condições para sua existência; entretanto, devido ao uso impróprio está sendo local para descarte de contaminantes (CAI et al., 2015). Sua contaminação está relacionada à disposição inadequada de resíduos industriais e domésticos, produtos químicos, fertilizantes e insumos agrícolas, dentre outros (ANDRADE et al., 2013). No caso de áreas agrícolas, a área de solo destinada a agropecuária é estimada em cerca de 224 milhões de hectares (FOREIGN AGRICULTURAL SERVICE, 2011), sendo no Brasil aproximadamente 68 milhões de hectares (OLIVEIRA, 2012). A contaminação dos solos destinados à agricultura está relacionada à práticas agrícolas como o uso de fertilizantes minerais, agroquímicos e lodo de esgoto (COSTA et al., 2010; BONO et al., 2013; ENSINAS et al., 2014), sendo que o uso excessivo de qualquer um dos materiais citados afeta diretamente a qualidade do meio (FERREIRA, 2001). Um dos meios de contaminação do solo é a fertilização (MORTVEDT, 1996; RIBERIRO, 2013), sendo que, segundo Mortvedt e Beaton (1995), em alguns países, os fertilizantes fosfatados representam a principal fonte de contaminação dos solos por cádmio (Cd) e por outros elementos, como arsênio (As), cromo (Cr), chumbo (Pb), cobre (Cu), cobalto (Co), ferro (Fe), manganês (Mn), zinco (Zn) e níquel (Ni), que podem causar impactos negativos ao ambiente (AMARAL SOBRINHO et al., 2009). Esterco animal, lodo de esgoto e até mesmo fertilizantes 2 minerais, quando aplicados sucessivamente no solo, podem contaminá-lo com metais pesados (McBRIDE, 2003). Mediante ao exposto, o objetivo com este trabalho foi caracterizar e avaliar a distribuição espacial de Cd, Cr e Ni em solo agrícola submetido a atividades agrícolas consecutivas como: fertilização a base de aplicação de lodo de esgoto (por 17 anos) e aplicação de fertilizantes minerais (há 80 anos), bem como isolar, caracterizar e identificar bactérias resistentes a estes metais que possam ser úteis em processos de fitorremediação ou que tenham aplicação biotecnológica. 1.2. REVISÃO DE LITERATURA 1.2.1. Solo e uso agrícola O solo é constituído de matéria viva, partes sólidas, líquidas e gasosas, materiais minerais e orgânicos que ocupam a maior parte do manto superficial das extensões continentais do planeta. É formado por alteração da rocha-mãe, ocasionada pela interação de processos de natureza física, química e biológica que levam a degradação da rocha (SANTOS e BATISTA, 2015). Esse importante recurso ambiental tem como funções oferecer proteção e manter o ciclo das águas subterrâneas; conservar de nutrientes; possibilitar a prospecção dos micro- organismos e ainda, ser condição necessária para a produção de alimentos (CETESB, 2015). Os solos classificados como Latossolos são solos minerais, profundos, com coloração homogênea e apresentam distribuição mais ou menos uniforme de argila ao longo do perfil. São bem drenados, com baixa capacidade de troca de cátions, com textura média ou mais fina (argilosa, muito argilosa) e pouco férteis (KER, 1997). Práticas inadequadas de manejo causam diminuição dos estoques de matéria orgânica do solo, sendo a matéria orgânica de extrema importância para o fornecimento de nutrientes às plantas, retenção de cátions, complexação de elementos tóxicos e micronutrientes (COSTA et al., 2010; ENSINAS et al., 2014). O sistema convencional de manejo ou cultivo é responsável por provocar inversão da 3 camada arável do solo, sendo indicado quando há necessidade de incorporação de corretivos ou rompimento de camadas compactadas. Silva et al. (2000) relatam que áreas agrícolas com maiores perdas de solo são as que adotam manejo de sistema convencional, pois ele favorece a compactação do solo causada pelo tráfego de máquinas por ocasião da semeadura, tratos culturais, colheita e transporte. A diminuição da concentração de matéria orgânica tem sido observada em sistema convencional de cultivo que adota operações com intenso revolvimento do solo, sendo a taxa de saída de carbono e nitrogênio, normalmente, maior que a taxa de entrada, o que contribui na redução da fertilidade do solo (ENSINAS et al., 2014). Em seu estudo, Ensinas et al. (2014) relataram que solo sob vegetação nativa apresentou as maiores concentrações de carbono orgânico total e que sob plantio direto houve menor acificação do solo, e os maiores teores de cálcio, magnésio, potássio e fósforo. Relataram também que o sistema plantio direto promoveu aumento nos estoques de (C) do solo, o que indica aumento da concentração de matéria orgânica, sendo diferente do sistema convencional de manejo. O manejo por sistema de plantio direto proporciona melhor qualidade do solo, pois reduz a erosão, favorece a reciclagem de nutrientes, a atividade biológica e o manejo de resíduos culturais, além de contribuir para o aumento do teor de matéria orgânica (CERETTA et al., 2002). Este sistema consiste no não revolvimento do solo, mantendo-o coberto com resíduos vegetais e, segundo Smeda e Weller (1996), a ausência de revolvimento do solo e a cobertura morta podem eliminar a aplicação de herbicidas. Sistemas com aplicação de lodo de esgoto ainda não estão amplamente difundidos no Brasil, mas vários estudos comprovaram a eficácia da utilização deste resíduo em sistemas agrícolas (SILVA et al., 2002) e florestais (DE MARIA et al., 2007). Por ser rico em matéria orgânica e em nutrientes, principalmente nitrogênio (N) e fósforo (P), seu uso é direcionado, depois de devidamente tratado (MELO et al., 2001), para fertilização de culturas, proporcionando aumento na produtividade (TRANNIN et al., 2008). Entretanto, a possível presença de poluentes, como metais pesados, patógenos e compostos orgânicos persistentes são fatores que podem provocar impactos ambientais negativos (FYTILI e ZABANIOTOU 2008; LIMA, 2011). Os metais pesados presentes no lodo de esgoto podem movimentar-se no 4 perfil dos solos mediante processos físico-químicos ou biológicos, atingindo águas subterrâneas e superficiais. Tal movimento está relacionado ao equilíbrio entre as formas químicas encontradas no solo após a sua adição (FILIZOLA et al., 2006). Em área agrícola após aplicação de lodo de esgoto por sete anos consecutivos, Coscione et al. (2014) relataram a importância do efeito residual da degradação da matéria orgânica e que aplicações sucessivas de lodo de esgoto proporcionaram aumento de C e N no solo. 1.2.2. Contaminação do solo por metais pesados Metal pesado é todo elemento com alto caráter tóxico, densidade maior que 6 g cm-3 e que apresenta relação direta com poluição (SANTOS et al., 2015). Podem ser divididos em essenciais e não essenciais. Os essenciais estão presentes naturalmente em todos os organismos; porém, quando em concentrações elevadas podem ser tóxicos. Os considerados não essenciais são prejudiciais em concentrações mínimas e não apresentam efeitos benéficos aos organismos (CHANDRASEKARAN et al., 2015). Devido ao fato de metais pesados estarem presentes em fertilizantes e corretivos, estes, quando utilizados, favorecem a entrada de metais no solo, no qual eles permanecem por tempo indeterminado, evidenciando risco ao meio. Qualquer solo submetido a sistemas de cultivo por longos períodos tendem a apresentar concentrações mais elevadas de metais, já que fertilizantes minerais contêm metais pesados, sendo, portanto, fontes desses elementos para o ambiente (FILIZOLA et al., 2006). A forma e a ligação do metal nas superfícies reativas dos vários compostos do solo podem originar diferentes espécies com distintas energias de ligação. Os metais estão associados às frações do solo por meio de ligações mais fortes ou mais fracas, conforme a fração em que eles se encontram, podendo ser: solúveis; trocáveis; ligados aos carbonatos, à matéria orgânica, aos óxidos de Al, Fe e Mn ou aos silicatos (LIMA, 2011). Apesar da mobilização destes metais no solo, normalmente a região de maior concentração é o horizonte superficial, onde se encontra também a maior 5 concentração de matéria orgânica, que possibilita a formação de quelatos, deixando- os imobilizados (FILIZOLA et al., 2006). A água, o pH e a presença de ligantes orgânicos são fatores que propiciam a solubilização dos metais no solo, sendo estes os mais importantes em relação à disponibilidade e mobilidade desses elementos. O pH do solo é um dos seus atributos mais importantes no que se refere à capacidade de adsorção de metais, pois afeta diretamente a solubilidade (GARG et al., 2007; SANTOS e SANTOS, 2008; GARG et al., 2009). Portanto, contaminações ocorrem quando os metais pesados provenientes de atividades antrópicas somam-se aqueles de origem natural, causando efeitos adversos. Esses elementos interferem nos processos enzimáticos e, em consequência de sua baixa mobilidade, exercem efeitos acumulativos nos seres vivos. Isso faz com que provoquem alterações no metabolismo, podendo levar até mesmo a morte de organismos (SOUZA, 2014). A exposição do ser humano e dos animais a metais pesados pode ocorrer por diversas vias, especialmente pela cadeia alimentar (HARMANESCU et al., 2011). Alguns metais despertam grande interesse por serem prejudiciais à microbiota e aos seres humanos. Neste trabalho serão destacados o Cd, o Cr e o Ni. O Cd é encontrado naturalmente nos solos pelo desgaste da rocha de origem, sendo as rochas sedimentares as que apresentam o maior teor deste metal. É constituinte dos fertilizantes fosfatados, os quais são fontes de contaminação para solos agrícolas (RIBEIRO, 2013). Sua adsorção e mobilidade dependem do pH do solo, da matéria orgânica e dos óxidos de ferro e manganês (ATSDR, 2012). Nos seres humanos pode induzir à disfunção renal, hipertensão e até mesmo o câncer (HARMANESCU et al., 2011). Por outro lado, o cádmio pode causar danos irreversíveis às células bacterianas, pois se liga a proteínas respiratórias e produz oxigênio reativo, além de reduzir a taxa de crescimento, diminuir a densidade celular e, até mesmo, levar a morte (LEE et al., 2001). O Cr é encontrado nos solos associado com óxidos de elementos como Pb e Fe. Sua forma trivalente, Cr(lll), é a forma natural e mais estável no ambiente, enquanto que sua forma hexavalente, Cr(VI), provém de atividades antrópicas poluidoras sendo 500 vezes mais tóxica do que a forma trivalente (GUPTA et al., 2010; RIBEIRO, 2013). A oxidação de Cr(III) para Cr(VI) ocorre em função do pH, da 6 disponibilidade de óxidos de manganês, da presença de compostos orgânicos com baixa massa molecular e da presença de água no solo. Já a redução de Cr(VI) para Cr(III) dependerá de fatores físico-químicos como o pH, a presença de matéria orgânica e de íons ferrosos, e a quantidade de oxigênio no solo, além da ação microbiana que por meio da diminuição da concentração de oxigênio e do aumento da concentração de CO2 pode reduzir Cr(VI) à Cr(III) (CCME, 1999c).Algumas bactérias apresentam capacidade para reduzir Cr(VI) à Cr(III), forma menos tóxica (MAQBOOL et al., 2015). Em seres humanos, o Cr pode causar problemas na artéria tireóide, que é responsável por irrigar a glândula tireóide; policitemia sobre a produção de glóbulos vermelhos (hemácias) e danos na artéria coronária direita (KHAN et al., 2013) O Cr(VI) e suas formas reduzidas como o (III) podem causar, dentro de células bacterianas, ligação cromo-DNA (ligação do Cr com bases nitrogenadas ou grupamento fosfato, resultando em erros de pareamento de bases e de replicação). Pode também formar ligação cruzada entre proteínas-cromo-DNA, prejudicando a síntese protéica (CONCEIÇÃO, 2006). Um outro metal que desperta interesse é o Ni. Em solos, o teor de Ni tem aumentado muito devido a atividades antrópicas como descarte incorreto de resíduos, aplicação de fertilizantes e pesticidas agrícolas e aplicação de lodo de esgoto. Mesmo sendo considerado um micronutriente de plantas, devido ser constituinte do sítio ativo da enzima urease, que é responsável por hidrolisar ureia em amônia e bicarbonato, é considerado um poluente de solos (LOPEZ e MAGNITSKI, 2011). Porém, quando em quantidades excessivas pode causar em plantas, por exemplo, desenvolvimento insuficiente (SOUZA, 2014). Sua disponibilidade está diretamente relacionada com características de plantas e do solo, como: pH, potencial redox, textura, capacidade de troca catiônica (CTC), matéria orgânica e presença de outros metais pesados. A ingestão de Ni pode causar alguns problemas graves de saúde para humanos, incluindo erupções cutâneas, tonturas, parada cardíaca fatal, fadiga, dentre outros (KHAN et al., 2013). Em micro-organismos este íon pode provocar hipometilação (que aumenta a susceptibilidade à quebra dos cromossomos) ou hipermetilação (que causa instabilidade dos cromossomos) e inibe a transcrição e 7 síntese de novos compostos como proteínas. Portanto, a genotoxicidade deste metal pode ser devida a danos no DNA, formação de ligação cruzada de DNA-proteína e interações com proteínas da cromatina (proteinas histonas que envolvem o DNA favorecendo o seu enovelamento) (ROSSMAN, 1995; ANJUM et al., 2015). A compreensão da variabilidade dos metais no solo permite avaliar riscos ambientais, proporcionando uma gestão mais eficiente do uso de resíduos, como lodo de esgoto e agroquímicos para fins agrícolas (LIN et al., 2002). 1.2.3. Uso de bactérias para a diminuição do teor ou remoção de metais pesados Os metais pesados ocorrem naturalmente nos solos, sendo alguns necessários tanto para a manutenção do crescimento e desenvolvimento de plantas, como também para o crescimento microbiano. Entretanto, tanto elevadas como baixas concentrações de metais necessários limitam o crescimento e desenvolvimento tanto de plantas como de micro-organismos, por interferirem em processos metabólicos (ANJUM et al., 2015). Os metais considerados micronutrientes para plantas são: Cu, Fe, Mn, Mo, Ni e Zn (DECHEN e NACHTIGALL, 2006). Mesmo os metais pesados sendo altamente tóxicos para a maioria dos micro- organismos, existem bactérias resistentes a eles. Devido a vários mecanismos essas bactérias são capazes de transformar formas tóxicas do metal em produtos com menor toxicidade (SOTERO-MARTINS et al., 2014). Os mecanismos de resistência são codificados por genes cromossomais e incluem: bombas de efluxo, acúmulo e complexação do metal dentro da célula e redução química do contaminante a uma forma menos tóxica (ABDELATEY et al., 2011). Destaca-se que a resistência a metais pesados é devida aos mecanismos intrínsecos e a exposição prolongada a esses metais favorece a seleção e proliferação de micro-organismos tolerantes ao estresse causado por eles (HUTCHINSON e SYMINGTON 1997). Espécies bacterianas resistentes podem viver no solo independentemente dos níveis de contaminação. Algumas bactérias se adaptam a presença desses metais em concentrações superiores a 1 ppm, se proliferam e se tornam dominantes no ambiente (SOUZA, 2013). 8 Os micro-organismos resistentes a metais pesados são úteis como indicadores de contaminação. Os metais, portanto, podem atuar como importantes agentes seletivos influenciando a dinâmica da evolução das comunidades bacterianas de um solo (NITHYA et al., 2011). A capacidade dos micro-organismos em converter substâncias tóxicas em compostos menos nocivos é a base do processo conhecido como biorremediação. Este processo consiste na utilização de agentes biológicos na remoção de resíduos tóxicos ambientais (KRASTANOV et al., 2013). A biorremediação está fundamentada na capacidade de organismos vivos, principalmente dos micro- organismos, em degradar ou desintoxicar áreas contaminadas por transformação das substâncias poluentes em compostos não tóxicos (KUMAR et al., 2011). A utilização de organismos do próprio local, sem qualquer interferência de tecnologias ativas (biorremediação intrínseca ou natural), adição de agentes estimulantes como nutrientes, oxigênio e biossurfactantes (bioestimulação) e a inoculação de consórcios microbianos enriquecidos (bioaumento) são algumas das principais estratégias de biorremediação (TONINI et al., 2010). Dentre as técnicas de biorremediação pode-se citar a fitorremediação, que utiliza espécies vegetais tolerantes a metais pesados visando à remoção destes poluentes do solo. Vários estudos utilizam espécies vegetais tolerantes, em conjunto com bactérias capazes de sintetizar hormônios promotores de crescimento, auxinas, em especial o ácido indol acético (AIA); bactérias capazes de absorver metais, graças à produção de substâncias poliméricas extracelulares (EPS) ou bactérias capazes de solubilizar fosfato (WILSON et al., 2006; JACQUES et al., 2007; PAL e PAUL, 2008; OLIVEIRA et al., 2012). Dentre os hormônios promotores de crescimento sintetizados por bactérias encontram-se as auxinas, em especial o ácido indol acético (AIA). Este fitormônio atua no crescimento das raízes, que resulta no aumento do comprimento, do número de raízes laterais e de pêlos radiculares (FUENTES-RAMÍREZ et al., 1993; BASTIÁN et al., 1998). Este hormônio pode ser gerado pelos tecidos vegetais, por produção endógena ou por produção exógena, pela ação de micro-organismos, sendo esta última muito difundida entre bactérias do solo e bactérias associadas com plantas (BACA e ELMERICH, 2007). 9 A produão de EPS, por bactérias, está relacionada à resistência a metais pesados por meio da alta capacidade de adsorção de metais por estes compostos. Esta adsorção está associada aos grupos funcionais presentes nos EPS (SCOTT e PALMER, 1988; SAHOO et al., 1992; CRINI, 2005; GUPTA et al., 2006; WANG e CHEN, 2006; PAL e PAUL, 2008). Estes compostos são biodegradáveis, podem permanecer eficazes em condições extremas de pH, temperatura e salinidade, e apresentam grupos funcionais como: carboxila, hidroxila, amina e ácido urônico, que possibilitam a captura de metais por interação eletrostática. Portanto, essas propriedades conferem a estes compostos uma aplicabilidade em diversas áreas biotecnológicas, incluindo a biorremediação de áreas contaminadas com metais pesados (COLIN et al., 2013). O P é um elemento importante na nutrição das plantas, pois estimula o crescimento do sistema radicular, elevando a eficiência de absorção de água pelas plantas. Isso garante menores perdas e melhor utilização de outros nutrientes e promove maior sobrevivência das plantas durante períodos de estresse hídrico (SANTOS et al., 2013). O P também tem funções importantes em alguns processos metabólicos na planta, como: fotossíntese, transferência de energia, biossíntese de macromoléculas e respiração (KHAN et al., 2010). Embora em alguns solos o P total seja relativamente alto,a fração disponível é, de modo geral, pequena nos solos brasileiros. Os principais fatores que afetam a disponibilidade de P nos solos e interferem na sua absorção pelas plantas são: textura, teor de matéria orgânica, capacidade de tamponamento, cálcio, alumínio e ferro, o que leva à necessidade de aplicação de altas quantidades de adubos fosfatados, ocasionando acúmulo de metais pesados no solo (SANTOS et al., 2013). Como consequência de frequentes aplicações de fertilizantes fosfatados, obtêm-se formas inorgânicas deste elemento nos solos, principalmente em complexos de minerais insolúveis, que não podem ser absorvidas pelas plantas (RENGEL e MARSCHNER, 2005). 1.3 Referências ABDELATEY, L. M.; KHALIL, W. K. B.; ALI, T. A.; MAHROUS, K. F. Heavy metal resistance and gene expression analysis of metal resistance genes in Gram-positive 10 and Gram-negative bactéria present in egyptian soils. Journal of Applied Sciences in Environmental Sanitation, Surabaya, v.6, n.2, p. 201‒211, 2011. AMARAL SOBRINHO, N. M. B.; BARRA, C.M.; LÃ, O.R. XVI- Química dos metais pesados no solo. In: MELO, V.F.; ALLEONI, L.R.F. Química e mineralogia do solo. Viçosa: Ed. SBCS, 2009. ANDRADE, L. C. R.; FELICORI, T. C.; MARQUES, E. A. G.; CHAGAS, C. S. Avaliação da Qualidade do Solo na Bacia do Córrego Palmital, Viçosa – MG. Revista de Geografia, Juiz de Fora, v. 9, p. 7-22, 2013. ANJUM, N. A.; SINGH, H. P.; KHAN, M. I. R.; MASOOD, A.; PER, T. S.; NEGI, A.; BATISH, D. R.; KHAN, N. A.; DUARTE, A. C.; PEREIRA, E.; AHMAD, I. Too much is bad—an appraisal of phytotoxicity of elevated plant-beneficial heavy metal ions. Environmental Science Pollution Research, Heidelberg, v. 22, p. 3361–3382, 2015. ATSDR - Agency for Toxic Substances and Disease Registry. Toxicological profile for cadmium. Atlanta, 2012. p. 487f. BACA, B. E.; ELMERICH, C. Microbial production of plant hormones. In: ELMERICH, C.; NEWTON, W. E. (Ed.). Associative and endophytic nitrogen-fixing bacteria and cyanobacterial associations. Dordrecht: Springer, 2007. p. 113-143. BASTIÁN, F.; COHEN, A.; PICCOLI, P.; LUNA, V.; BARALDI, R.; BOTTINI, R. Production of indole-3-acetic acid and gibberellins A1 e A3 by Gluconacetobacter diazotrophicus and Herbaspirullum seropedicae in chemically-defined culture media. Plant Growth Regulation, Netherlands, v. 24, p. 7-11, 1998. BONO, J.A.M.; MACEDO, M.C.M.; TORMENA, C.A. Qualidade física do solo em um latossolo vermelho da região sudoeste dos cerrados sob diferentes sistemas de uso e manejo. Viçosa, MG. fev. 2012/ mar.2013. Disponível em: . Acesso em: 15 ago. 2013. CAI, L.; XU, Z.; BAO, P.; HE, M.; DOU, L.; CHEN, L.; ZHOU, Y.; ZHU, Y. Multivariate and geostatistical analyses of the spatial distribution and source of arsenic and heavy metals in the agricultural soils in Shunde, Southeast China. Journal of Geochemical Exploration, New York, v. 148, p. 189-195, 2015. doi: 10.1016/j.gexplo.2014.09.010 CCME - Canadian Council of Ministers of the Environment. Canadian soil quality guidelines for the protection of environmental and human health. Winnipeg, 1997. CERETTA, C.A.; BASSO, C.J.; FLECHA, A.M.T.; PAVINATO, P.S.; VIEIRA, F.C.B.; MAI, M.E.M. Manejo da adubação nitrogenada na sucessão aveia preta/milho, no sistema plantio direto. Revista Brasileira de Ciência do Solo, Viçosa, MG, v.26, p.163-171, 2002. 11 CETESB – Companhia Ambiental do Estado de São Paulo. Qualidade do solo Disponível em: . Acesso em: 8 ago. 2015. CHANDRASEKARAN, A.; RAVISANKAR, R.; HARIKRISHNAN, N.; SATAPATHY, K.K.; PRASAD, M.V.R.; KANAGASABAPATHY, K.V. Multivariate statistical analysis of heavy metal concentration in soils of Yelagiri Hills, Tamilnadu, India – Spectroscopical approach. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, Amsterdam, v. 137, p. 589-600, 2015. doi: 10.1016/j.saa.2014.08.093 COLIN, V. L.; CASTROA, M. F.; AMOROSOA, M. J.; VILLEGASA, L. B. Production of bioemulsifiers by Amycolatopsis tucumanensis DSM 45259 and their potential application in remediation technologies for soils contaminated with hexavalent chromium. Journal of Hazardous Materials, Amsterdam, v. 261, p. 577– 583, 2013. CONCEIÇÃO. D. P. Isolamento de bactérias resistentes a cromo hexavalente e purificação parcial da enzima redutora de cromo do Bacillus sp. ES29. 2006. 105f. Dissertação (Mestrado em Microbiologia Agrícola e do Ambiente) – Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, 2006. COSCIONE, A. R.; SILVA, L. F. M.; MARIA, I. C.; ANDRADE, C. A.; FERRACINI, V. L. Solução do solo e análise de componentes principais para monitoramento da aplicação de lodo de esgoto. Revista Brasileira de Ciência do Solo, Viçosa, MG, v. 38, p. 1654-1662, 2014. COSTA, F. X. X.; BELTRÃO, N. M. E. M.; SILVA, F. E. A. A.; FILHO, J. S. M. M.; SILVA, M. A. S. Disponibilidade de nutrientes no solo em função de doses de matéria orgânica no plantio da mamona. Revista Verde, Mossoró, v.5, p. 204 – 212, 2010. CRINI, G. Recent developments in polysaccharide-basedmaterials used as adsorbents in wastewater treatment, Progressin Polymer Science, Oxford, v. 30, p. 38–70, 2005. DE MARIA, I. C. ; KOCSSI, M. A.; DECHEN, S. C. F. Agregação do solo em área que recebeu lodo de esgoto. Bragantia, Campinas, v. 66, n. 2, p. 291-298, 2007. DECHEN, A.R.; NACHTIGALL, G.R. Elementos essenciais e benéficos às plantas superiores. In: Fernandes, M.S. (ed.) Nutrição mineral de plantas. Viçosa: Sociedade Brasileira de Ciência do Solo, 2006. p.1-5. ENSINAS, S.C.; MARCHETTI, M.E.; SILVA, E.F.; POTRICH, D.C.; MARTINEZ, M.A. Atributos químicos, carbono e nitrogênio total em latossolo submetido a diferentes sistemas de uso do solo. Global Science and Technology, Rio Verde, v. 7, p. 24- 36, 2014. 12 FERREIRA, M.E.; CRUZ, M.C.P.; RAIJ, B.V.; ABREU, C.A. Micronutrientes e elementos tóxicos na agricultura. Ribeirão Preto: Ed. Legis Summa, 2001. FILIZOLA, H. F.; MANOEL, D.; GOMES, M.A.F. Amostragem de solos para análises de metais pesados. Cap. 3. In: _____. Manual de procedimentos de coletas de amostras em áreas agrícolas para análise da qualidade ambiental: solo, água e sedimentos. Jaguariúna: Embrapa Meio Ambiente, 2006. FOREIGN AGRICULTURAL SERVICE - United States Department of Agriculture. July 2011. Disponível em: . Acesso em: 8 ago. 2013. FUENTES-RAMÍREZ, L. E.; JIMENEZ-SALGADO, T.; ABARCA-OCAMPO, I. R.; CABALLERO-MELLADO, J. Acetobacter diazotrophicus, an indoleacetic acid producing bacterium isolated from sugarcane cultivars of Mexico. Plant and Soil, The Hague, v. 154, p. 145-150, 1993. FYTILI, D.; ZABANIOTOU, A. Utilization of sewage sludge in EU application of old and new methods—A review. Renewable and Sustainable Energy Reviews, Amsterdam, v. 12 p. 116–140, 2008. GARG, U. K.; KAUR, M. P.; GARG, V. K.; SUD, D. Removal of hexavalent chromium from aqueous solution by agricultural waste biomass. Journal of Hazardous Materials, Amsterdam, v. 140, p. 60–68, 2007. GARG, U. K.; KAUR, M. P.; SUD, D.; GARG, V. K. Removal of hexavalent chromium from aqueous solution by adsorption on treated sugarcane bagasse using response surface methodological approach. Desalination, Amsterdam, v. 249, p. 475–479, 2009. GUPTA, V. K.; RASTOGI, A.; NAYAK, A. Adsorption studies on the removal of hexavalent chromium from aqueous solution using a low cost fertilizer industry waste material. Journal of Colloid and Interface Science, San Diego, v. 342 , p. 135–141, 2010. GUPTA, V. K.; RASTOGI, A.; SAINI, V. K.; JAIN, N. Biosorption of copper(II) from aqueous solutions by Spyrogyra species, Journal Colloid Interface Science, San Diego, v. 296, p. 59–63, 2006. HARMANESCU M; LIANA M.A.; DESPINA, M.B.; IOAN, G.; IOSIF, G. Heavy metals health risk assessment for population via consumption of vegetables grown in old mining area; a case study: Banat County,Romania. Chemistry Central Journal, London, v. 5, p.1-10, 2011. HUTCHINSON T.C.; SYMINGTON M.S. Persistence of metal stress in a forested ecosystem near Sudbury, 66 years after closure of the O’Donnell roast bed. Journal of Geochemical Exploration, New York, v. 58, p. 323-330, 1997. 13 KER, J. C. Latossolos do Brasil: Uma revisão. Geonomos, Pampulha, v. 5, n. 1, p. 17-40, 1997. JACQUES, R. J. S.; BENTOI, F. M.; ANTONIOLLI, Z. I.; CAMARGO, F. A. O. Biorremediação de solos contaminados com hidrocarbonetos aromáticos policíclicos. Ciência Rural, Santa Maria. v.37, p.1192-1201, 2007. KHAN, K.; LU, Y.; KHAN, H.; ISHTIAQ, M.; KHAN, S.; WAQAS, M.; WEI, L.; WANG, T. Heavy metals in agricultural soils and crops and their health risks in Swat District, northern Pakistan. Food and Chemical Toxicology, Oxford, v. 58, p.449–458, 2013. KHAN, M.S.; ZAIDI, A.; AHEMAD, M.; OVES, M.; WANI, P.A. Plant growth promotion by phosphate solubilizing fungi – current perspective. Archives of Agronomy and Soil Science, Abingdon, v. 56, p. 73–98, 2010. KRASTANOV, A.; ALEXIEVA, Z.; YEMENDZHIEV, H. Microbial degradation of phenol and phenolic derivatives. Engineering in Life Sciences, Weinheim, v. 13, n.1, p. 76-87, 2013. KUMAR, A.; BISHT, B. S.; JOSHI, V. D.; DHEWA, T. Review on bioremediation of polluted environment: A management tool. International Journal of Environmental Sciences, Jaipur, v.1, n.6, p. 1079-1093, 2011. LEE, S-W.; GLICKMANN, E.; COOKSEY, D. A. Chromosomal Locus for Cadmium Resistance in Pseudomonas putida Consisting of a Cadmium-Transporting ATPase and a MerR Family Response Regulator. Applied and Environmental Microbiology, Washington, v. 67, p. 1437–1444, 2001. LIMA, A.S.T. Variabilidade espacial de cádmio, chumbo, cobre, níquel e zinco em um Latossolo tratado como lodo de esgoto por treze anos consecutivos. 2011. 56f. Tese (Doutorado em Agronomia- Ciência do Solo)- Faculdadae de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista, Jaboticabal, 2011. LIN, Y.P.; CHANG, T.K.; SHIH, C.W.; TSENG, C.H. Factorial and indicator kriging methods using a geographic information system to delineate spatial variation and pollution sources of soil heavy metals. Environmental Geology, Berlin, v. 42, p. 900–909, 2002. LOPEZ, M. Á.; MAGNITSKI, S. Nickel: the last of the essential micronutrients. Agronomía Colombiana, Bogotá, v. 29, p. 49-56, 2011. MAQBOOL, Z.; ASGHAR, H. N.; SHAHZAD, T.; HUSSAIN, S. RIAZ, M.; ALI, S.; ARIF, M. S.; MAQSOOD, M. Isolating, screening and applying chromium reducing bacteria to promote growth and yield of okra(Hibiscus esculentus L.) in chromium contaminated soils. Ecotoxicology and Environmental Safety, Amsterdam, v. 114, p. 343–349, 2015. 14 McBRIDE, M.B. Toxic metals in sewage sludge-amended soils: has promotion of beneficial use discounted the risks. New York: Advances in Environmental Research, Elsevier Science, 2003. Disponível em: . Acesso em: 16 ago. 2015. MELO, W.J.; MARQUES, M.O.; MELO, V.P. O uso agrícola do biossólido e as propriedades do solo. In: TSUTIYA, M.T.; COMPARINI, J.B.; ALEM SOBRINHO, P.; HESPANHOL, I.; CARVALHO, P.C.T.; MELFI, A.J.; MELO, W.J.; MARQUES, M.O. (Ed.). Biossólidos na agricultura. São Paulo: Sabesp, 2001. p. 289-363. MORTVEDT, J.J. Heavy metal contaminants in inorganic and organic fertilizers. Fertilizer Research, The Hague, v.43. p.55-61, 1996. MORTVEDT, J.J.; BEATON, J.D. Heavy metal and radionuclide contaminants in phosphate fertilizers. In: TIESSEN, H. (Ed.). Phosphorus in the global environment. 1995. Disponível em: . Acesso em: 16 ago. 2015. NITHYA, C.; GNANALAKSHMI, B.; PANDIAN, S. K. Assessment and characterization of heavy metal resistance in Palk Bay sediment bactéria. Marine Environmental Research, New York, v. 71, p. 283-294, 2011. OLIVEIRA, A. G.; JUNIOR, A. F. C.; SANTOS, G. R.; MILLER, L. O.; CHAGAS, L. F. B. Potencial de solubilização de fosfato e produção de AIA por Trichoderma spp. Revista Verde, Mossoró, v. 7, n. 3, p. 149-155, 2012. OLIVEIRA, A. G.S.; PEREIRA, H. F. Proposta didática de conscientização ambiental em ambiente não formal. In: SEMINÁRIO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM EDUCAÇÃO PARA CIÊNCIAS E MATEMÁTICA, 2.; SEMANA DE LICENCIATURA, 11., 2014, Jataí. Anais...Disponível em: . Acesso em: 4 nov. 2015 OLIVEIRA, N. Área cultivada no Brasil cresce mais de 4% e chega a 68 milhões de hectares. 2012. Disponível em: . Acesso em: 9 ago. 2013. PAL, A.; PAUL, A. K. Microbial extracellular polymeric substances: central elements in heavy metal bioremediation, Indian Journal Microbiology, New Delhi, v. 48, p. 49–64, 2008. RENGEL, Z., MARSCHNER, P. Nutrient availability and management in the rhizosphere: exploiting genotypic differences. New Phytologist, London, v. 168, p. 305–312, 2005. 15 RIBEIRO, M. A. C. Contaminação do solo por metais pesados. 2013. 249f. Dissertação (Mestrado em Engenharia Ambiental) - Universidade Lusófona de Humanidades e Tecnologias, Lisboa, 2013. ROSSMAN TG. Metal mutagenesis. In: GOYER, R. A.; CHERIAN, G. C. (Ed.). Toxicology of metals. New York: Springer, 1995. p 373–430. SAHOO, D. K.; KAR, R. N.; DAS, R. P.. Bioaccumulation of Heavy Metal ions by Bacillus circulans, Bioresource Technology, Amsterdam, v. 41, p. 177–179, 1992. SANTOS, A. P. A; BATISTA, S. B. Isolamento e caracterização fenotípica de micro- organismos isolados de solo poluído por resíduos sólidos do bairro carrapicho município de Várzea Grande – Mato Grosso. Connection Line, Várzea Grande, v. 12, p. 29-43, 2015. SANTOS, A. L. F.; BORGES, L. O. S.; BOAVENTURA, G. R.; GONÇALVES, L. P. Metais pesados no ribeirão piancó, anápolis-go e suas implicações ambientais. Revista Mirante, Anápolis, v. 8, n. 1, jun. 2015. SANTOS, J. S.; SANTOS, M. L. P. Estudo da mobilização de metais e elementos traços em ambientes aquáticos do semiárido Brasileiro aplicando análises de componentes principais. Quimica Nova, São Paulo, v. 31, n. 5, p. 1107-1111, 2008. SANTOS, D. H.; TIRITAN, C. S.; FOLONI, J. S. S.; FABRIS, L. B. Effects of mineral and organic-mineral phosphate fertilizers on soil fertility parameters. Colloquium Agrariae, Presidente Prudente, v. 9, n.1, p. 10-17, 2013. SCOTT, J.A.; PALMER S. J. Cadmium bio-sorption by bacterial exopolysaccharide, Biotechnology Letters, London, v. 10, p. 21–24, 1988. SILVA, V. R.; REINERT, D. J.; REICHERT, J. M. Densidade do solo, atributos químicos e sistema radicular do milho afetados pelo pastejo e manejo do solo. Revista Brasileira de Ciência do Solo, Viçosa, MG, v. 24, p.191-199, 2000. SILVA, J.E.; RESCK, D.V.S.; SHARMA, R.D. Alternativa agronômica para o biossólido produzido no Distrito Federal – I: efeito na produção de milho e na adição de metais pesados em latossolo no cerrado. Revista Brasileira de Ciência do Solo, Viçosa, MG, v. 26, p. 487-495, 2002. SMEDA, R. J.; WELLER, S. Potential of rye (Secale cereale) for weed management in transplant tomatoes (Lycopersicon esculentum). Weed Science, Champaign, v. 44, p. 596-602, 1996. SOTERO-MARTINS, A.; VIANA, M. O.; CARVAJAL, E. Bioprospecção de bactérias com potencial tecnológico para biorremediação de ecossistemas impactados por mercúrio e cromo. Geochimica Brasiliensis, Rio de Janeiro, v. 28, p. 36-42, 2014. 16 SOUZA, A. F. C. Caracterização molecular e avaliação de resistência a chumbo e cádmio em bactérias isoladas de rizosferas de plantas coletadas em Santo Amaro (BA). 2013. 213f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) – Universidade Estadual de Feira de Santana, Feira de Santana, 2013. SOUZA, F. V. P. Crescimento, teores, acúmulo e disponibilidade de níquel em gramíneas forrageiras. 2014. 59f. Dissertação (Mestrado em Produção Vegetal) - Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, Diamantina, 2014. TONINI, R. M. C. W.; REZENDE, C. E.; GRATIVOL, A. D. Bacterial degradation and biorremediation of petroleum compounds: A review. Oecologia Australis, Rio de Janeiro, v. 14, n.4, p. 1027-1035, 2010. TRANNIN, I. C. DE B.; SIQUEIRA, J. O. ; MOREIRA, F. M. S. Atributos químicos e físicos de um solo tratado com biossólido industrial e cultivado com milho. Revista Brasileira de Engenharia Agrícola e Ambiental, Campina Grande, v. 12, n. 3, p. 223–230, 2008. WANG, J. L.; CHEN, C. Biosorption of heavy metals by Saccharomyces cerevisiae: a review, Biotechnology Advances, New York, v. 24, p. 427–451, 2006. WILSON, C.; BRIGMON, R. L.; KNOX, A.; SEAMAN, J.; SMITH, G. Effects of Microbial and Phosphate Amendments on the Bioavailability of Lead (Pb) in Shooting Range Soil. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, New York, v. 76, p. 392-399, 2006. 17 CAPÍTULO 2 - Uso agrícola como fator de acumulação de metais pesados em Latossolo RESUMO: A contaminação do solo pode ser decorrente do descarte inadequado de substâncias com potencial poluente ou do uso agrícola prolongado com aplicação de materiais corretivos de acidez, fertilizantes e defensivos. O objetivo deste estudo foi avaliar a distribuição espacial de cádmio (Cd), cromo (Cr) e níquel (Ni) em Latossolo sob plantio direto, convencional e convencional com aplicação de lodo de esgoto, em áreas com exploração agrícola há mais de 80 anos. As concentrações dos metais em 422 amostras de solo foram mensuradas por espectroscopia de absorção atômica com chama ar-acetileno, sendo os extratos obtidos por extração com HNO3, H2O2 e HCl em sistema aberto (USEPA-3050B). As variáveis pH e matéria orgânica também foram determinadas. Os mapas de distribuição espacial foram elaborados a partir do software Spring v. 5.2.7 e auxiliaram na visualização da dispersão dos metais na área de estudo, indicando níveis de contaminação. A análise estatística multivariada por componentes principais diferenciou as amostras de solo de mata nativa das que estão sob atividade agrícola, apontando a uma mesma fonte de contaminação para Cr e Ni, como também para a correlação da matéria orgânica com Cd. Conclui-se que a área estudada apresenta contaminação, em larga escala, por Cd e Cr, e contaminações pontuais por Ni, estando alguns valores dentro da faixa de intervenção. Palavras-chave: contaminação do solo, cádmio, cromo, níquel, distribuição espacial 22 ABSTRACT: Soil contamination may result from inappropriate use of substances with pollution potential or from the prolonged agricultural use with application of acidity corrective materials, fertilizers and pesticides. The aim of this work was to evaluate the spatial distribution of cadmium (Cd), chromium (Cr) and nickel (Ni) in latosol under no tillage, conventional tillage and conventional with sewage sludge application, in agricultural exploration areas for over 80 years. Metals concentration in 422 soil samples were measured by atomic absorption spectroscopy with acetylene-air flame, obtaining the extracts by extraction with HNO3, H2O2 e HCl in open system (USEPA-3050B). The variables pH and organic matter were obtained. Maps of spacial distribution were elaborated by software Spring v. 5.2.7 and assisted in the visualization of the metals dispersion in the study area, indicating contamination levels. The statistical multivariate by main components differentiated the native forest soil samples from those under agricultural activity, pointing to a same contamination source to Cr and Ni, and to the organic matter correlation to Cd as well. It can be concluded that the studied area presents contamination in large scale by Cd and Cr and pontual contamination by Ni, being some of the values into the intervention group. Keywords: soil contamination, cadmium, chromium, nickel, spacial distribution. 2.1 Introdução Metais pesados são componentes de ocorrência natural nos solos porque estão presentes no material de origem, as rochas. A concentração natural dos metais nos solos depende da natureza das rochas e de processos de adição e de perda que ocorrem durante a formação do solo. Em condições naturais, o principal processo de adição é a deposição atmosférica. A lixiviação e a erosão são os principais processos de perda, que resultam, na verdade, na transferência dos metais de um ponto da paisagem para outro. De acordo com Zhang et al. (2002), o material de origem é o principal fator que determina os teores de metais pesados nos solos, mas a vegetação e a atividade humana também interferem. No que diz respeito à relação entre atividade humana e entrada de metais pesados no solo, a exploração agrícola participa principalmente devido à aplicação de corretivos de acidez, fertilizantes e defensivos agrícolas. Calcários são rochas moídas e muitos fertilizantes são também produzidos a partir de rochas e, assim, contêm metais pesados. Nos calcários comercializados no Brasil a concentração de metais é pequena e, na maior parte das situações, está abaixo do que rege a legislação, no que diz respeito aos teores de Cd, Cr e Ni 23 (AMARAL SOBRINHO et al., 1992; CARVALHO, 2011; SOARES et al., 2015). Entre os fertilizantes, os fosfatados são os que têm merecido maior atenção devido às concentrações altas de Cd nas rochas fosfatadas. Essas rochas são consideradas a principal fonte de contaminação com Cd em solos agrícolas (JIAO et al., 2012). No entanto, a concentração de Cd é maior ou menor dependendo da natureza da rocha, se sedimentar ou ígnea. No Brasil, os fertilizantes fosfatados são produzidos principalmente a partir de rochas ígneas (CARVALHO, 2011), o que faz com que os teores de Cd sejam menores do que os relatados em outros países e torna o produto nacional mais seguro. Em avaliações feitas por Campos et al. (2005) os teores de Cd nos fertilizantes industriais fosfatados importados foram nove vezes maiores do que nos nacionais. Além dos fertilizantes, estercos animais, composto de lixo e lodo de esgoto, aplicados sucessivamente ao solo, podem contaminá-lo com metais pesados. A utilização agronômica destes resíduos é importante do ponto de vista da reciclagem de nutrientes, oferecendo oportunidade de autogestão com o seu uso na fertilização. Entretanto, a presença de metais pesados como Cd, Cr e Ni em sua composição é motivo de preocupação ambiental e de saúde pública, pois podem causar danos aos micro-organismos e seres humanos (McBRIDE, 2002; NOGUEIRA et al., 2008). A presença dos metais torna necessário o monitoramento do uso dos corretivos e fertilizantes, sem perder de vista alguns aspectos importantes: calcário e adubos (industriais e orgânicos) são imprescindíveis para manter ou aumentar a produção de alimentos; as quantidades de metais que chegam ao solo com uma única aplicação de ambos é muito pequena, de modo que alterações nos teores naturais devido à sua aplicação são observadas somente após décadas de uso (JIAO et al., 2012). A maior parte dos metais contidos nos calcários e fertilizantes, ao ser solubilizada, reage com a matriz do solo (particularmente óxidos de Fe e Al e matéria orgânica) e passa para formas não biodisponíveis; os metais têm baixa mobilidade no solo e tendem a acumular (ALI e MALIK, 2011). O último aspecto justifica particularmente a necessidade de acompanhamento da evolução dos teores de metais em solos adubados, de modo a que se assegure a qualidade do solo particularmente para a produção de alimentos. Há vários estudos na literatura relatando a presença de concentrações elevadas de metais em solos, agrícolas e 24 urbanos, com comprometimento da qualidade do solo (MICÓ et al., 2006; FAGBOTE e OLANIPEKUN, 2010; ZHENG et al., 2010; ALI e MALIK, 2011; GHREFAT et al., 2011; HARMANESCU et al., 2011; CHANDRASEKARAN et al., 2015). No entanto, não há trabalhos sobre o nível de poluição e fontes de Cd, Cr e Ni em solos agrícolas sob diferentes tipos de manejo no Brasil. O objetivo deste estudo foi avaliar a distribuição espacial de Cd, Cr e Ni em Latossolo sob plantio direto, convencional e convencional com aplicação de lodo de esgoto, em áreas com exploração agrícola há mais de 80 anos. 2.2 Material e métodos 2.2.1 Amostragem Foi realizada coleta de amostras de solo em uma área de 37 ha da Fazenda de Ensino, Pesquisa e Extensão (FEPE) da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – FCAV/UNESP, totalizando 422 pontos de coleta. A área amostral está localizada em torno da latitude de 21º14’47” S e da longitude de 48º17’00” W, com altitude e declividade médias de 560 m e 6%, respectivamente. O clima da região é tropical, com temperatura e precipitação médias nos últimos cinco anos de 22,64 ºC e 1.257,6 mm, respectivamente. O solo da área amostrada, Latossolo Vermelho Eutroférrico (LVef), é cultivado há mais de 80 anos, com parte destinada à pesquisa nos últimos 50 anos. As coletas foram realizadas no período de 19 a 21 de fevereiro de 2014, com trado holandês, na profundidade de 0 – 20 cm. A malha amostral possui um espaçamento de 30 m x 30 m. Sua locação em campo foi realizada com receptor GNSS Trimble R6 no método de posicionamento relativo cinemático em tempo real (Real Time Kinematic - RTK), adotando-se como estação base marco geodésico pertencente ao Sistema Geodésico Brasileiro - SGB. Destaca-se que esse método propicia qualidade de posicionamento planimétrico na ordem de centímetros (MONICO, 2008). As coletas foram realizadas em locais com cultivo de milho destinado à alimentação de animais sob os sistemas de plantio direto com aplicação de fertilizantes minerais e orgânicos (PD) há 25 anos; plantio convencional com aplicação de fertilizantes minerais (PC) há mais de 50 anos e plantio convencional 25 com aplicação de lodo de esgoto (PL) há 17 anos. O lodo de esgoto é procedente da Companhia de Saneamento Básico do Estado de São Paulo - SABESP, unidades de Barueri-SP, Monte Alto-SP e Franca-SP, e vem sendo aplicado anualmente nas doses de 0,0 Mg ha-1 (testemunha com fertilização mineral baseada na análise química do solo); 5,0 Mg ha-1; 10,0 Mg ha-1 e 20,0 Mg ha-1(base seca). Como referencial de solo não cultivado, portanto sem interferência antrópica direta, realizou-se amostragem de solo de mata nativa (MN) adjacente às áreas cultivadas. 2.2.2 Atributos químicos do solo Os solos amostrados foram secos ao ar e a sombra, destorroados e passados em peneira de 2 mm. Nas amostras, o valor de pH em CaCl2 e o teor de matéria orgânica (MO) foram determinados segundo Raij et al. (2001). Para a extração de Cd, Cr e Ni foi usado o método 3050B da USEPA (United States Environmental Protection Agency), em que são empregados HNO3, H2O2 e HCl, com aquecimento da amostra em sistema aberto (USEPA, 1996). Em béquer de 100 mL foram adicionados 4 g de solo e 10 mL de solução de HNO3 1:1. Vedou- se o béquer com vidro de relógio e aqueceu-se o mesmo em chapa, a 100°C durante 15 min. Na sequência, foram adicionados 10 mL de HNO3 concentrado e prosseguiu-se o aquecimento a 100ºC por mais 2 h. Subsequentemente foram adicionados 2 mL de H2O deionizada e 10 mL de solução de H2O2 a 30 % gradativamente (de 2 mL em 2 mL) com posterior aquecimento a 100ºC por 2 h. Após, foram adicionados 10 mL de HCl concentrado e dado prosseguimento ao aquecimento a 100ºC por mais 15 min. Os extratos obtidos foram quantitativamente transferidos para balões de 100 mL, cujo volume foi completado com H2O deionizada e a solução resultante foi filtrada em papel de filtro, sendo o filtrado armazenado em frascos de polietileno. Os metais foram quantificados nos extratos por espectroscopia de absorção atômica com chama ar-acetileno em espectrofotômetro GBC Avanta. As variáveis pH em CaCl2 e MO também foram determinadas segundo Raij et al., (2001). Os 26 resultados de pH, MO, Cd, Cr e Ni obtidos para cada ponto amostrado estão apresentados no ANEXO. 2.2.3 Elaboração dos mapas de distribuição espacial A malha amostral e seus respectivos resultados relativos às concentrações de MO, Cd, Cr e Ni foram inseridos no software Spring versão 5.2.7 (64 bits) para fins de elaboração da distribuição espacial desses elementos na área de estudo. A partir dos valores dos dados amostrais foi gerado um modelo digital de superfície para cada um dos elementos. O método de interpolação utilizado para a geração da superfície foi o Inverso do Quadrado da Distância (INPE, 2014). A partir dos modelos digitais de superfícies gerados, foi realizada a classificação dos teores nos mapas. Os teores de MO receberam a seguinte classificação: muito baixo, baixo, médio, alto e muito alto, segundo Lopes e Guilherme (1999). Para Cd, Cr e Ni a classificação adotada foi: teores de referência, de prevenção, de intervenção agrícola, solo contaminado e teores críticos e não críticos, de acordo com valores de prevenção do CONAMA (BRASIL, 2009). Todos os mapas de distribuição espacial foram elaborados utilizando o sistema de projeção Universal Transverso de Mercator - UTM (Fuso 22, Hemisfério Sul) e sistema de referência geodésico SIRGAS2000. 2.2.4 Análise estatística As variáveis pH, MO e teores de Cd, Cr e Ni foram submetidas à análise exploratória de dados por métodos de estatística multivariada, sendo a padronização de valores realizada com auxílio do software Statistica (STATSOFT, 2004), de acordo com a seguinte fórmula de padronização (Equação 1): Equação 1 27 Na equação 1: j = 1, 2, ..., p atributos; i = 1, 2, ..., n objetos; Zij é o valor padronizado de Xij; Xj e Sj são a média e o desvio padrão da coluna j, respectivamente. As variáveis assim padronizadas têm média nula e variância unitária. Para interpretar e identificar a relação entre as variáveis realizou-se a análise de componentes principais (ACP). Foram mantidas no sistema apenas as componentes relacionadas aos autovalores λi ≥ 1 (critério de Kaiser), ou seja, as combinações lineares que conseguem explicar pelo menos a quantidade de variância de uma variável original padronizada. 2.3 Resultados e discussão As concentrações médias de Cd, Cr e Ni nas 422 amostras de solo (Tabela 1) foram comparadas com as concentrações destes metais em solo de mata nativa; com Valores de Prevenção (VP) e de intervenção (VI) estabelecidos na resolução 420/2009 do Conselho Nacional do Meio Ambiente (CONAMA), assim como, com Valores de Referência de Qualidade (VRQ) para Cd, Cr e Ni estipulados pela Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental (CETESB), pois segundo o CONAMA cabe a cada estado da federação estipular os VRQs (BRASIL, 2009; CETESB 2014) (Tabela 2). O valor de referência de qualidade é a concentração de determinada substância que define a qualidade natural do solo e o valor de prevenção. Tanto segundo o CONAMA como de acordo com a CETESB, é a concentração máxima de determinada substância, acima da qual podem ocorrer alterações prejudiciais à qualidade do solo e da água subterrânea. O valor de intervenção é a concentração máxima de determinada substância no solo ou na água subterrânea, que quando ultrapassada ocasiona riscos potenciais, diretos ou indiretos à saúde humana (BRASIL, 2009; CETESB 2014). 28 Tabela 1. Valores médios e desvio padrão da média para Cd, Cr e Ni nas diferentes sub-áreas que compõem a área experimental. Sub-áreas Metais M.N P.C P.D P.L Cd (mg kg -1 ) 0,97±0,01 1,01±0,01 1,22±0,01 1,32±0,01 Cr (mg kg -1 ) 56,67±0,39 64,28±0,58 69,89±0,31 70,07±0,41 Ni (mg kg -1 ) 14,17±0,09 17,54±0,22 21,35±0,13 25,96±0,11 MN - solo de mata nativa; PC – solo sob plantio convencional com aplicação de fertilizantes minerais; PD – solo sob plantio direto com aplicação de fertilizantes minerais e orgânicos; PL – solo sob plantio convencional com aplicação de lodo de esgoto Tabela 2. Concentrações limites de Cd, Cr e Ni para qualidade do solo, de acordo com o CONAMA e a CETESB. METAIS CONAMA (mg kg -1 ) CETESB (mg kg -1 ) VP INVESTIGAÇÃO AGRÍCOLA VRQ VP INTERVENÇÃO AGRÍCOLA Cádmio 1,3 3 <0,5 1,3 3 Cromo 75 150 40 75 150 Níquel 30 70 13 30 70 VP – valor de prevenção; VRQ – valor de referência de qualidade. O coeficiente de variação (CV) para os metais Cd, Cr e Ni variou de 13 a 17 %. O CV para Cd foi o mais alto (17 %) dos três elementos, sugerindo que o Cd tem a maior variação entre as amostras de solo e apresentando, portanto, a maior possibilidade de ser influenciado por atividades humanas (CHEN et al., 2008; CAI et al., 2015). O menor CV foi para Cr (13 %), o que também foi encontrado por Cai et al. (2015) em 238 amostras de solos agrícolas da China. A Tabela 3 exibe os valores das áreas classificadas segundo os critérios adotados para os metais pesados na área experimental. Em uma área com 37 ha foi possível mensurar Cd, Cr e Ni em 34,7 ha (93,8 %); 34,7 ha (93,8 %) e 34,8 ha (94 %), respectivamente. Para Cd 1,9 % da área apresentaram valores dentro do VRQ; 81,1 % dentro do VP e 10,8 % apresentaram valores na faixa de intervenção. O Cr em 78,7% da área apresentou valores não críticos e em 15,1 % apresentou valores 29 críticos. Para Ni, 93,8 % da área apresentaram valores não críticos e 0,3 % valores críticos, sendo os valores não críticos concentrações de metais maiores ou iguais ao VRQ e menores ou iguais ao VP, enquanto que os valores críticos excedem o VP. Tabela 3. Valores das áreas classificadas segundo os critérios adotados para os metais pesados na área experimental Metal Referência Prevenção Intervenção Agrícola Total ---------------------------- (ha) ------------------------------ Cd 0,7 30,0 4,0 34,7 Cr Não Crítico Crítico ---------------------------- (ha) ------------------------------ 29,1 5,6 34,7 Ni 34,7 0,1 34,8 2.3.3 Análise de componentes principais A análise de componentes principais (ACP) foi utilizada para identificar as principais fontes de poluição do solo na área selecionada. Esta análise originou um novo conjunto de variáveis (Tabela 4) com dois autovetores (CP1 e CP2 que representam 57,41% da variância total dos dados), sendo os autovetores com valores discriminatórios os que apresentam coeficientes de seus atributos acima de 0,5 e - 0,5 (maior importância linear) e estes foram destacados. Vale ressaltar que em todos os autovetores foram destacados valores discriminatórios. O grupo obtido no CP1 (Tabela 4) que envolve as variáveis Ni e Cr também foi encontrado por Lado et al. (2008) em estudo de solos da Europa, que associou a ocorrência de atividades sísmicas e processos de mineralização ao aumento destes metais no solo. No presente estudo, a relação direta dos maiores pesos no CP1 (- 0,8796 e - 0,8227 para Ni e Cr, respectivamente) mostra que a fertilização mineral contribuiu da mesma forma que a fertilização com lodo de esgoto, para maior acúmulo de Ni e Cr no solo. A correlação observada na CP2 envolve as variáveis MO e Cd, e estas apresentam os maiores pesos negativos. Esta informação mostra que, quando há 30 aumento do teor de MO há também aumento da concentração de Cd, sendo esta interação explicada pela capacidade complexante da MO, que pode afetar a solubilidade, a biodisponibilidade e a mobilidade dos metais, retendo-os e diminuindo assim a mobilidade do poluente (QUENEA et al., 2009). O pH é uma importante variável quando se estuda metais pesados no solo porque quando há elevada acidez no meio, pode ocorrer solubilização desses elementos, disponibilizando-os para as plantas. Tal informação se faz importante à correção do pH do solo (MOURA et al., 2006). No entanto, neste estudo, a variável pH não apresentou importância discriminatória e não mostrou correlação com as demais variáveis (Tabela 4). Este fato pode estar associado ao extrator empregado que contém ácido em sua composição e é usado para obtenção de teores pseudototais, os quais não sofrem efeito do pH do solo. Tabela 4. Valores dos componentes principais encontrados na respectiva análise. Variáveis CP1 CP2 MO (g dm -3 ) 0,2018 -0,7276* pH CaCl2 0,1067 0,4476 Ni (mg kg -1 ) -0,8796* -0,0208 Cd (mg kg -1 ) -0,4753 -0,5934* Cr (mg kg -1 ) -0,8227* 0,2447 CP1 – componente principal 1; CP2 – componente principal 2; MO – matéria orgânica; *valores discriminatórios. O CP1 é característico por representar em 34,6 % a originalidade das amostras enquanto que o CP2 representa 22,8%, totalizando uma representatividade de 57,4 % da variabilidade original (Figura 1). 31 Figura 1. Projeção espacial e biplot das componentes principais (Relação: variáveis/amostras). 32 A dispersão estatística dos pontos (Figura 1) mostra distribuição heterogênea dos metais nas áreas sob diferentes manejos (PC, PL e PD). Esta dissipação é notada pelo posicionamento dos pontos no plano – pontos aglomerados a esquerda do eixo central e pontos aglomerados a direita do eixo central, indicando que o os tipos de manejo (PC, PL e PD) não diferiram na retenção dos metais no solo. Os pontos amostrados em área de mata nativa estão distribuídos de forma homogênea, pois se localizam a direita do plano e apresentaram elevados valores apenas para MO e para Cd quando comparado com os demais pontos. A elevada concentração de MO indica boa qualidade do solo, o que é justificável por esta área nunca ter sofrido atividades antrópicas (SOUZA et al., 2010), enquanto que a elevada concentração de Cd pode ser explicada pelo material de origem da área (CAI et al., 2015). Foi possível observar que 87 % da área apresentaram teores de MO classificados como médios e 13 % como baixos (Figura 2). Destaca-se que maiores teores de MO auxiliam no fornecimento de nutrientes às plantas, na complexação de elementos tóxicos e micronutrientes e na retenção de cátions (LIMA et al., 2009; COSTA et al., 2010). No presente estudo, os menores teores de MO foram encontrados em áreas com sistema convencional de cultivo. Cardoso et al. (2010) e Santos et al. (2008) relatam que em solos em plantio direto há maior concentração de MO na superfície, o que pode indicar maior acúmulo de carbono, do que em sistemas convencionais de cultivo, os quais adotam operações com intenso revolvimento do solo. A distribuição espacial dos metais Cd e Cr (Figuras 3 e 4) indica que a área de estudo aponta à poluição ambiental, pois apesar da maior parte da área apresentar faixa de concentração dos metais dentro do limite de prevenção, estes se acumulam no solo e ocasionam poluição (QUENEA et al., 2009). Também mostram que, em pequenas áreas, as concentrações de Cd, Cr e Ni já ultrapassaram os valores de prevenção, estando dentro da faixa de valores de intervenção agrícola e valores críticos, os quais indicam poluição. Esta contaminação tem como origem a acumulação destes elementos no solo por meio de práticas agrícolas intensivas, uma vez que fertilizantes fosfatados e lodo de esgoto são fontes de contaminação (MORTVEDT, 1996; NOGUEIRA et al., 2008; CAI et al., 2015). 33 As concentrações de Ni foram inferiores ao VP (Figura 5), o que significa que as entradas de metais pesados através do uso de calcário, fertilizantes e defensivos agrícolas foi baixa ao longo do período de exploração agrícola do solo. Destaca-se que a contaminação de áreas agrícolas por metais pesados apresenta grandes riscos à saúde e ao ambiente, pois estes componentes podem chegar ao ser humano através da ingestão de alimentos e águas contaminadas, visto serem absorvidos pelas plantas e poderem chegar aos lençóis freáticos (HARMANESCU et al., 2011). 34 Figura 2. Variabilidade espacial de matéria orgânica (MO) em Latossolo vermelho Eutroférrico. 35 Figura 3. Variabilidade espacial de cadmio (Cd) em Latossolo vermelho Eutroférrico. 36 Figura 4. Variabilidade espacial de crômio (Cr) em Latossolo vermelho Eutroférrico. 37 Figura 5. Variabilidade espacial de níquel (Ni) em Latossolo vermelho Eutroférrico. 38 2.4 Conclusões A área destinada a práticas agrícolas sob diferentes tipos de manejo apresentou, em larga escala, contaminação do solo por Cd e Cr e contaminação pontual por Ni. Mesmo o Cd apresentando concentração elevada em solo de mata nativa, podendo ser devida ao material de origem da área, este, também apresentou concentrações elevadas em área agrícola indicando sua acumulação. O Cr, metal com os maiores teores médios na área total, se encontra acumulado tanto em área com aplicação de lodo de esgoto, a qual o contém em sua composição, como também em área com aplicação de fertilizantes minerais. A análise de componentes principais (CP1) mostrou que tanto a fertilização mineral quanto a aplicação de lodo de esgoto contribuíram no acúmulo de Ni e Cr no solo (PC 235, PC 280 e PL 403A). Também mostrou que os manejos sob sistemas de plantio direto com aplicação de fertilizantes minerais e orgânicos, plantio convencional com aplicação de fertilizantes minerais e plantio convencional com aplicação de lodo de esgoto, em relação à retenção dos metais no solo, não apresentaram diferença. Uma das formas de remover e/ou reduzir quantidades de metais pesados em solos é o uso de técnicas de biorremediação, como a fitorremediação. 2.5 Referências ALI, S.M.; MALIK, R.N. Spatial distribution of metals in top soils of Islamabad City, Pakistan. Environmental Monitoring Assessment, Dordrecht, v. 172, p. 1-16, 2011. doi: 10.1007/s1066.1.010.1314.x AMARAL SOBRINHO, N. M. B.; COSTA, L. M.; OLIVEIRA, C.; VELLOSO, A. C. X. Metais pesados em alguns fertilizantes e corretivos. Revista Brasileira de Ciência do Solo, Viçosa, MG, v. 16, p. 271-276, 1992. BRASIL. Conselho Nacional do Meio Ambiente. Resolução 420, de 28 de dezembro de 2009. Brasília, DF: Conselho Nacional do Meio Ambiente, 2009. Disponível em: . Acesso em: 10 jul. 2015. CAI, L.; XU, Z.; BAO, P.; HE, M.; DOU, L.; CHEN, L.; ZHOU, Y.; ZHU, Y. Multivariate and geostatistical analyses of the spatial distribution and source of arsenic and heavy metals in the agricultural soils in Shunde, Southeast China. Journal of Geochemical 39 Exploration, Amsterdam, v. 148, p. 189-195, 2015. doi: 10.1016/j.gexplo.2014.09.010 CAMPOS, M. L.; SILVA, F. D.; FURTINI NETO, A. E.; GUILHERME L. R. G.; MARQUES. J. J.; ANTUNES, A. S. Determinação de cádmio, cobre, cromo, níquel, chumbo e zinco em fosfatos de rocha. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v. 40, p. 361-367, 2005. CARDOSO, E.L.; SILVA, M.L.N.; SILVA, C.A.; CURI, N.; FREITAS, D.A.F. Estoques de carbono e nitrogênio em solo sob florestas nativas e pastagens no bioma Pantanal. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v. 45, p. 1028-1035, 2010. CARVALHO, V. G. B. Teores de elementos tóxicos e micronutrientes em fertilizantes e corretivos comercializados no nordeste do Brasil. 2011. 68f. Dissertação (Mestrado em Ciência do Solo) - Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife, 2011. CETESB- Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental. Decisão de Diretoria nº 045-2014-E-C-I. São Paulo: Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental; 2005. Disponível em: . Acesso em: 10 jul. 2015. CHANDRASEKARAN, A.; RAVISANKAR, R.; HARIKRISHNAN, N.; SATAPATHY, K.K.; PRASAD, M.V.R.; KANAGASABAPATHY, K.V. Multivariate statistical analysis of heavy metal concentration in soils of Yelagiri Hills, Tamilnadu, India – Spectroscopical approach. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, Amsterdam, v. 137, p. 589-600, 2015. doi: 10.1016/j.saa.2014.08.093 CHEN, T.; LIU, X.M.; ZHU, M.Z.; ZHAO, K.L.; WU, J.J.; XU, J.M.; HUANG, P.M. Identification of trace element sources and associated risk assessment in vegetable soils of the urban–rural transitional area of Hangzhou, China. Environmental Pollution, Dordrecht, v. 151, p. 67-78, 2008. doi:10.1016/j.envpol.2007.03.004 COSTA, F.X.X.; BELTRÃO, N.M.E.M.; CRUZ, O.; SILVA, F.E.A.A.; FILHO, J.S. M. M.; SILVA, M.A.S. Disponibilidade de nutrientes no solo em função de doses de matéria orgânica no plantio da mamona. Revista Verde de Agroecologia e Desenvolvimento Sustentável, Mossoró. v.5, p.204-212, 2010. FAGBOTE, E.O.; OLANIPEKUN, E.O. Evaluation of the Status of Heavy Metal Pollution of Soil and Plant (Chromolaena odorata) of Agbabu Bitumen Deposit Area, Nigeria. American-Eurasian Journal of Scientific Research, v. 5, n. 4, p. 241-248, 2010. GHREFAT, H.A.; RUKAH, Y.A.; ROSEN, M.A. Application of geoaccumulation index and enrichment factor for assessing metal contamination in the sediments of Kafrain Dam, Jordan. Environmental Monitoring and Assessment, Dordrecht, v. 178, p. 95-109, 2011. doi: 10.1007/s.10661.010.1675.1 40 HARMANESCU, M.; LIANA, M.A.; DESPINA, M.B.; IOAN, G.; IOSIF, G. Heavy metals health risk assessment for population via consumption of vegetables grown in old mining area; a case study: Banat County,Romania. Chemistry Central Journal, London, v. 5, p. 1-10, 2011. doi: journal.chemistrycentral.com.content.5.1.64 INPE. SPRING (Sistema para Processamento de Informações Georeferenciadas), version 5.2.7. 2014. Disponível em: . Acesso em: 25 out. 2015. JIAO, W.; CHEN, W.; CHANG, A. C.; PAGE, A. L. Environmental risks of trace elements associated with long-term phosphate fertilizers applications: a review. Environmental Pollution, Oxford, v. 168, p. 44-53, 2012. LADO, L.R.; HENGL, T.; REUTER, H.I. Heavy metals in European soils: A geostatistical analysis of the FOREGS Geochemical database. Geoderma, Amsterdam, v. 148, p. 189-199, 2008. doi:10.1016/j.geoderma.2008.09.020 LIMA, R.L.S.; SEVERINO, L.S.; ALBUQUERQUE, R.C.; FERREIRA, G.B.; SAMPAIO, L.R.; BELTRÃO, N.E.M. Capacidade da cinza de madeira e do esterco bovino para neutralizar o alumínio trocável e promover o crescimento da mamoneira. Revista Brasileira de Oleaginosas e Fibrosas, Campina Grande, v.13, p.9-17, 2009. LOPEZ, M.Á.; MAGNITSKI, S. Nickel: the last of the essential micronutrients. Agronomía Colombiana, Bogotá, n. 9. v. 1, p.49-56, 2011. LOPES A. S.; GUILHERME, L. R. G. Interpretação de análise de solo. Conceitos e aplicação. Viçosa: ANDA, 2004. (Boletim Técnico, 2). MCBRIDE, M.B. Toxic metals in sewage sludge-amended soils: has promotion of beneficial use discounted the risks? Advances in Environmental Research, v. 8, p. 5-19, 2003. doi: 10.1016/S1093.0191.(02).00141.7 MICÓ, C.; PERIS, M.; SÁNCHEZ, J.; RECATALÁ, L. Heavy metal content of agricultural soils in a Mediterranean semiarid area: the Segura River Valley (Alicante, Spain). Spanish Journal of Agricultural Research, Washington, v. 4, p. 363-372, 2006. MONICO, J.F.G. Posicionamento pelo NAVSTAR – GPS. Descrição, fundamentos e aplicações. Presidente Prudente: UNESP, 2.ed., 2008. 480 p. MORTVEDT, J.J. Heavy metal contaminants in inorganic and organic fertilizers. Fertilizer Research, Dordrecht, v. 43, p. 55-61, 1996. MOURA, M.C.S.; LOPES, A.N.C.; MOITA, G.C.; NETO, J.M.M. Estudo multivariado de solos urbanos da cidade de Teresina. Quimica Nova, São Paulo, n. 29. v. 3, p. 429-435, 2006. 41 NOGUEIRA, T.A.R.; OLIVEIRA, L.R.; MELO, W.J.; FONSECA, I.M.; DE MELO, G.M.P.; DE MELO, V.P.; MARQUES, M.O. Cádmio, cromo, chumbo e zinco em plantas de milho e em latossolo após nove aplicações anuais de lodo de esgoto. Revista Brasileira de Ciência do Solo, Viçosa, MG, v. 32, p. 2195-2207, 2008. POLACCO, J. C.; MAZZAFERA, P.; TEZOTTO, T. Opinion – Nickel and urease in plants: Still many knowledge gaps. Plant Science, Leimerick, v. 199–200, p. 79–90, 2013. QUENEA, K.; LAMY, I.; WINTERTON, P.; BERMOND, A.; DUMAT, C. Interactions between metals and soil organic matter in various particle size fractions of soil contaminated with waste water. Geoderma, Amsterdam, v. 149, p. 217-223, 2009. doi:10.1016/j.geoderma.2008.11.037 RAIJ, B.V.; ANDRADE, J.C.; CANTARELLA, H.; QUAGGIO, J.A. Análise química para avaliação da fertilidade de solos tropicais. Campinas: Instituto Agronômico, 2001. SANTOS, H. P.; SPERA, S. T.; TOMM, G. O.; KOCHANN, R. A.; ÁVILA, A. EFEITO DE SISTEMAS DE MANEJO DE SOLO E DE ROTAÇÃO DE CULTURAS NA FERTILIDADE DO SOLO, APÓS VINTE ANOS. Bragantia, Campinas, v.67, n.2, p.441-454, 2008. SOARES, A. P.; WEBER, O. L. S.; ESPÍRITO SANTO, O. Metais pesados em calcários do Estado de Mato Grosso. Geociências, Rio Claro, v. 34, p. 465-474, 2015. SOUZA, E.D.; COSTA, SEVGA.; ANGHINONI, I.; CARVALHO, P.C.F.; OLIVEIRA, E.V.F.; MARTINS, A.P.; CAO, E.; ANDRIGHETTI, M. Soil aggregation in a crop- livestock integration system under no-tillage. Revista Brasileira de Ciência do Solo, Viçosa, MG, v. 34, p. 1365-1374, 2010. STATSOFT. STATISTICA (data analysis software system), version 7. 2004. Disponível em: . Acesso em: 25 maio 2015. USEPA. United States Environmental Protection Agency. 3050B. Revision 2. 1996. Disponível em: . Acesso em: 23 abr. 2015. ZHANG, X. P.; DENG, W.; YANG, X. M. The background concentrations of 13 soil trace elements and their relationships to parent materials and vegetation in Xizang (Tibet), China. Journal of Asian Earth Sciences, Amsterdam, v. 21, p. 167-174, 2002. ZHENG, L.G.; LIU, G.J.; KANG, Y.; YANG, R.K. Some potential hazardous trace elements contamination and their ecological risk in sediments of western Chaohu 42 Lake, China. Environmental Monitoring Assessment, Dordrecht, v. 166, p. 379- 386, 2010. doi: 10.1007/s.10661.009.1009.3 43 CAPÍTULO 3 – Isolamento e identificação de bactérias resistentes a cádmio, cromo e níquel com potencial para biorremediação RESUMO: Atividades antrópicas alteram a qualidade do solo e afetam a microbiota local, sendo a contaminação por metais pesados uma das atividades que mais causam danos ao solo. Visando a descontaminação, desintoxicação ou recuperação do solo contaminado, técnicas que associam plantas a micro-organismos, biorremediação, como a fitorremediação, vem sendo aplicadas. Portanto o objetivo desse trabalho foi isolar e identificar bactérias resistentes a cádmio (Cd), cromo (Cr) e níquel (Ni), bem como caracterizá-las para o uso em processos biotecnológicos e/ou biorremediação de solo contaminado com esses metais. Foram obtidos 592 isolados de 19 amostras de solo de área cultivada há 80 anos sob diferentes tipos de manejos. Todos os isolados foram submetidos a teste de resistência a cádmio, cromo e níquel. Os isolados resistentes a esses metais em maiores concentrações foram avaliados quanto à capacidade de solubilização de fosfato e produção de ácido indolacético (AIA). Os isolados foram identificados por sequenciamento do gene 16S rRNA. Os isolados 209/16, 395/8, 395/10 e 395/18 apresentaram resistência a Cr e Cd em concentrações de até 5 mmol L-1. Esses isolados foram identificados como Paenibacillus sp., Burkholderia sp. e os dois últimos como Cupriavidus sp. O isolado 185/9 foi identificado como Ensifer sp. e apresentou resistência a Cd, Cr e Ni, simultaneamente, na concentração de 2,5 mmol L-1. Todas as bactérias isoladas apresentam potencial para serem utilizadas em processos de biorremediação ou fitorremedição em amostras contaminadas com os metais pesados Cd, Cr e Ni, considerando suas características como solubilizadoras de fosfato e produtoras de ácido indolacético (AIA). Palavras-chave: Burkholderia sp., Cupriavidus sp., Ensifer sp., fitorremediação, Paenibacillus sp., resistência. 44 ABSTRACT: Anthropic activities change the soil quality and affect the local microbiota, being the contamination by heavy metals one of the activities that most damage soil. Aimed at contaminated soil descontamination, detoxification or regeneration, techniques that associate plants witch microorganisms, bioremediation, as phytoremediation, have been applied. However the objective of this work was to isolate and identify cadmium (Cd), chromium (Cr) and nickel (Ni) resistent bacteria, as well to characterize them to biotechnology process use and/or contamined soil bioremediation. From 19 soil samples were obtained 592 bacteria isolates from cropland cultivated during 50 years under different types of management. All isolates were submitted to resistence tests to Cd, Cr and Ni. The resistent isolates to Cd, Cr and Ni, at higher concentrations, were evaluated for ability to phosphate solubilization and indole-acetic-acid (IAA) production. The isolates were identified by 16S rRNA gene sequenciation. The isolates 209/16, 395/8, 395/10 and 395/18 presented resistence to Cr, and Cd at up 5 mmol L-1concentration. These isolates were identified as Paenibacillus sp., Burkholderia sp. and the last two as Cupriavidus sp. The isolate 185/9 was identified as Ensifer sp. and presented resistence to Cd, Cr and Ni, simultaneously, at 2,5 mmol L-1 concentration. All isolated bacteria presented potential to be used in bioremediation or phytoremediation process in contaminated samples with heavy metal, Cd, Cr and Ni, considering their phosphate solubilizing and IAA production characteristics. Keywords: Burkholderia sp., Cupriavidus sp., Ensifer sp., phytoremediation, Paenibacillus sp., resistence. 3.1 Introdução O solo é um dos principais componentes do ambiente, não sendo apenas um local para descarte de contaminantes, atua como tampão natural, controlando o transporte de substâncias e elementos químicos para atmosfera, biosfera, etc (CAI et al., 2015). Várias atividades humanas, especialmente as industriais e agrícolas, contribuem para a poluição de solos, principalmente a contaminação por metais pesados (CHEN et al., 2015). A presença, o comportamento e a distribuição de metais pesados no solo estão associados a diferentes fontes, como intemperismo, erosão de rochas-mães, mineração, fundição, agricultura intensiva, aplicação de lodo de esgoto, emissões veiculares, bem como incineração de resíduos urbanos e industriais, que aumentam a concentração de metais no ambiente e consequentemente no solo (GU GUANG et al., 2014; POLETTI et al., 2014; MUHAMMAD et al., 2011). 45 Os micronutrientes são normalmente estudados em solos, pois seus teores podem ser interpretados como índices confiáveis de fertilidade, concentrações necessárias para a manutenção das plantas, ou poluição ambiental, quando esses elementos estão presentes no solo em concentrações que podem impactar negativamente o ambiente. O elemento níquel (Ni) colabora com o desenvolvimento das plantas, porém sua escassez não é considerada um fator limitante, no entanto o seu excesso afeta o crescimento das raízes e parte aérea das plantas e também pode causar clorose (redução da produção de clorofila). Os elementos crômio (Cr) e cádmio (Cd) são considerados não essenciais e até mesmo tóxicos para plantas em quantidades mínimas (HARMANESCU et al., 2011; DE MOURA et al., 2006). Estes elementos também podem trazer riscos à saúde humana quando há ingestão de alimentos contaminados por tais metais. O Cd pode causar disfunção renal, hipertensão e até mesmo câncer. O Cr pode causar problemas na artéria que irriga a tireóide, policitemia sobre a produção de glóbulos vermelhos (hemácias) e problemas na artéria coronária direita. Já a ingestão de alimentos contaminados por Ni pode causar parada cardíaca fatal, erupções cutâneas, fadiga, dores de cabeça, problemas cardíacos, tonturas e doença respiratória (KHAN et al., 2013; MUHAMMAD et al., 2011). Os metais pesados são altamente tóxicos para a maioria dos micro- organismos, no entanto existem bactérias que possuem uma variedade de mecanismos de resistência que as tornam capazes de lidar com elevadas concentrações de metais pesados sendo utilizadas como agentes de absorção e adsorção para remoção de metais (CONGEEVARAM et al., 2007; GAYLARDE et al., 2005). Estes mecanismos de resistência, codificados por genes cromossomais incluem: bombas de efluxo, acúmulo e complexação do metal dentro da célula, redução do contaminante a uma forma menos tóxica e produção de exopolissacarídeos (ABDELATEY et al., 2011). A capacidade dos micro-organismos em converter substâncias tóxicas em compostos menos nocivos ou facilitar sua remoção de um local é à base do processo conhecido como biorremediação. Portanto, este processo consiste na utilização de agentes biológicos para transformação ou remoção de resíduos tóxicos ambientais (KRASTANOV et al., 2013). 46 Dentre as técnicas de biorremediação existentes podemos citar a fitorremediação; técnica utilizada na remoção de metais pesados do solo por vegetais. Essa técnica pode estar associada ao uso de micro-organismos. Algumas bactérias são capazes de sintetizar hormônios promotores de crescimento, auxinas, em especial o ácido indolacético (AIA) e capazes de solubilizar fosfato (ULLAH et al., 2015), tais características associadas aos vegetais podem acelerar o processo de fitorremediação. Portanto, o objetivo deste trabalho foi isolar e identificar bactérias resistentes a metais pesados como o cádmio, cromio e níquel de solo de área agrícola, além de caracterizar esses isolados quanto à capacidade de produção AIA e de solubilização de fosfato para utilização em processos de fitorremediação em solos contaminados. 3.2 Metodologia 3.2.1 Amostras de solo Foram coletadas dezenove amostras de solo, de áreas agrícolas, cultivado há mais de 80 anos com parte destinada à pesquisa nos últimos 50 anos. As coletas foram realizadas no período de 19 a 21 de fevereiro de 2014 com auxílio de trado holandês na profundidade de 0 – 20 cm, sendo os solos amostrados classificados como Latossolo Vermelho Eutroférrico (Lvef). Os manejos empregados no solo amostrado de três áreas usadas para plantio de milho são: plantio direto (PD) e aplicação de fertilizantes minerais há 25 anos; plantio convencional (PC) e aplicação de fertilizantes minerais há 50 anos e cultivo mínimo e aplicação de lodo de esgoto (PL) há 17 anos. O lodo de esgoto empregado é procedente da Sabesp (Companhia de Saneamento Básico do Estado de São Paulo), unidades de Barueri-SP, Monte Alto-SP e Franca-SP e foi usado nas doses de 0,0 Mg ha-1 (testemunha com fertilização mineral baseada na análise química do solo); 5,0 Mg ha-1; 10,0 e 20,0 Mg ha-1 (base seca). Solo controle foi coletado de uma área de mata nativa (MN). A área amostral, pertencente à Fazenda de Ensino Pesquisa e Extensão (FEPE) da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da UNESP de Jaboticabal - SP, localiza-se em torno da latitude de 21º14’47” S e longitude de 48º17’00” W, 47 com altitude e declividade médias de 560 m e 6 %, respectivamente. O clima da região é tropical com temperatura e precipitação média, ao longo de cinco anos, de 22,64ºC e 1257,6 mm, respectivamente. Os pontos de coletas foram georreferenciados com receptor GNSS Trimble R6 operado no método de posicionamento cinemático em tempo real (RTK), adotando-se como estação base marco geodésico pertencente ao Sistema Geodésico Brasileiro (SGB). As coordenadas plano-retangulares projetadas no sistema de projeção Universal Transversa de Mercator – UTM (Fuso 22, Hemisfério Sul) são exibidas na Tabela 5. Adotou-se como sistema de referência geodésico o Sistema de Referência Geocêntrico para as Américas – SIRGAS2000. Tabela 5. Coordenadas plano-retangulares (Projeção UTM) Pontos E (m) N (m) PC 184 782.389,13 7.647.906,75 PC 185 782.419,13 7.647.906,75 PC 279 782.149,13 7.648.026,75 PC 280 782.179,13 7.648.026,75 PC 356 781.999,13 7.648.116,75 PC 357 782.029,13 7.648.116,75 PC 368 782.359,13 7.648.116,75 PC 395 782.329,13 7.648.146,75 PC 209 782.389,13 7.647.936,75 PC 235 782.389,13 7.647.966,75 PC 384 781.999,13 7.648.146,75 PC 410 781.999,13 7.648.176,75 PC 191 781.849,13 7.647.936,75 PC 192 781.879,13 7.647.936,75 PC 75 781.969,13 7.647.786,75 PC 76 781.999,13 7.647.786,75 PD 378 781.819,13 7.648.146,75 PL 403A 781.806,69 7.648.185,94 MN 501 782.679,84 7.647.854,85 PC – Área sob sistema de plantio convencional com aplicação de fertilizantes minerais; PD - área solb sistema de plantio direto com aplicação de fertilizantes minerais; PL – área sob cultivo mínimo com aplicação de lodo de esgoto; MN - área de mata Nativa. 48 3.2.2 Determinação de Cd, Cr e Ni em amostras de solo Os solos amostrados foram secos ao ar e a sombra por 72 h em casa de vegetação, destorroados e peneirados utilizando peneira de 2 mm. Para mensurar a concentração dos metais Cd, Cr e Ni adotou-se metodologia 3050B da USEPA, United States Environmental Protection Agency (1996), sendo a quantificação dos metais nos extratos realizada por espectroscopia de absorção atômica com chama ar-acetileno em espectrofotômetro GBC Avanta. 3.2.3 Isolamento de bactérias resistentes a Cd, Cr e Ni Para isolar as bactérias do solo foi realizada diluição de 0,5 g de solo em 4,5 mL de NaCl 0,85 % (m/v) e, em seguida foram feitas três diluições seriadas de 10x (500 μL) em 4,5 mL de NaCl 0,85 % (m/v), inoculando, em triplicata, 100 μL da terceira e quarta diluição em placas petri com meio de cultura PGE sólido (0,5 g L-1 de KH2PO4; 0,2 g L-1 de MgSO4.7H2O; 0,1 g L-1 de NaCl; 1 g L-1 de extrato de levedura; 10 g L-1 de glicose; ágar 9 g L-1 e pH final de 6,8), com adição do antifúngico cicloheximida na proporção de 10 mL L-1, conforme descrito por Sacco (2013). Após o crescimento das colônias foram realizados cálculos de unidade formadora de colônia (UFC). As placas foram incubadas em estufa BOD a 30ºC por 72 h. As colônias isoladas obtidas foram coletadas em microtubos de 2 mL contendo meio PGE líquido e incubadas para cultivo por 24 h. Posteriormente, retirou-se 30 µL, que foram pré- cultivados em micro-placas com 96 poços contendo 1,2 mL de meio líquido PGE durante 72 h, a 30ºC e 150 rpm. Após esse período os isolados foram inoculados nas placas contendo meio DYGS (RODRIGUES NETO et al., 1986) com íons Cd2+, Cr3+ e Ni2+ nas seguintes concentrações 0,1; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 4,0 e 5,0 mmol L-1, obtidas a partir de soluções preparadas pela dissolução de CdCl2.H2O, CrCl3.6H2O e NiCl2.6H2O em água deionizada. As placas foram incubadas a 30ºC, por 72 h (Cd e Ni) e 120 h (Cr). A resistência dos isolados foi determinada pela capacidade de desenvolvimento dos mesmos nesses meios. 49 3.2.4 Solubilização de fósforo As bactérias que apresentaram maiores resistências aos metais foram inoculadas (10 μL) em placas com meio sólido NBRIP (NAUTIYAL, 1999) e incubadas a 30ºC por 96 h. A solubilização do fósforo foi avaliada pela formação de halo ao redor das colônias, sendo a eficiência de solubilização calculada pela razão entre o diâmetro do halo e o diâmetro das colônias (BERRAQUERO et al., 1976). 3.2.5 Produção de ácido indolacético (AIA) As estirpes bacterianas resistentes às maiores concentrações dos metais foram previamente cultivadas em meio PGE suplementado com 100 µg de L-tryptophan, aminoácido precursor para biosintese do AIA) por 24 h, a 30ºC e 150 rpm. Estas amostras foram centrifugadas durante 30 min a 10.000 xg a 4ºC. Foram coletados 500 μL do sobrenadante e este foi misturado vigorosamente com 1 mL de Reagente de Salkowski (GORDON e WEBER, 1950). A mistura foi incubada durante 30 min no escuro. A presença de auxina foi visualizada pela coloraç