RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta tese será disponibilizado somente a partir de 01/03/2028. Programa de Pós-graduação em Biologia Geral e Aplicada Instituto de Biociências de Botucatu / UNESP Rua Professor Doutor Antonio Celso Wagner Zanin, 250 - CEP 18618-689 - Botucatu - SP - Brasil Tel (14) 3880-0780 posgraduacao@ibb.unesp.br Campus de Botucatu UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Júlio de Mesquita Filho” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU CONTROLE POPULACIONAL DE ANIMAIS SINANTRÓPICOS: ASPECTOS MORFOLÓGICOS, FUNCIONAIS E BIOQUÍMICOS DA CONTRACEPÇÃO PROMOVIDA PELO USO DE NOVAS VIAS DE ADMINISTRAÇÃO DO DIMETANOSSULFONATO DE ETANO PARA RATOS MACHOS WISTAR JORGE WILLIAN FRANCO DE BARROS Tese apresentada ao Instituto de Biociências, Campus de Botucatu, UNESP, para obtenção do título de Doutor no Programa de Pós-Graduação em Biologia Geral e Aplicada, Área de concentração em Biologia Celular, Estrutural e Funcional. Orientadora: Dra. Wilma De Grava Kempinas BOTUCATU – SP 2024 1 JORGE WILLIAN FRANCO DE BARROS CONTROLE POPULACIONAL DE ANIMAIS SINANTRÓPICOS: ASPECTOS MORFOLÓGICOS, FUNCIONAIS E BIOQUÍMICOS DA CONTRACEPÇÃO PROMOVIDA PELO USO DE NOVAS VIAS DE ADMINISTRAÇÃO DO DIMETANOSSULFONATO DE ETANO PARA RATOS MACHOS WISTAR POPULATION CONTROL OF SYNANTHROPIC ANIMALS: MORPHOLOGICAL, FUNCTIONAL AND BIOCHEMICAL ASPECTS OF THE CONTRACEPTION PROMOTED BY NEW ROUTES OF ADMINISTRATION OF ETHANE DIMETHANESULFONATE TO MALE WISTAR RATS Tese apresentada ao Instituto de Biociências, Campus de Botucatu, UNESP, para obtenção do título de Doutor no Programa de Pós-Graduação em Biologia Geral e Aplicada, Área de concentração em Biologia Celular, Estrutural e Funcional. Thesis presented to the Institute of Biosciences, Campus of Botucatu, UNESP, to obtain the title of Ph.D. in the Graduate Program in General and Applied Biology, area of concentration in Cellular, Structural, and Functional Biology. Orientadora: Profa. Dra. Wilma De Grava Kempinas BOTUCATU – SP 2024 2 3 4 Dedicatória Dedico esse trabalho à pessoa que permitiu que esse trabalho ocorresse, e que me deu a oportunidade de seguir nele, Profa. Wilma De Grava Kempinas, um exemplo de luta, perseverança, e fonte de inspiração e motivação para mim e muitos outros. Os estudos com o dimetanossulfonato de etano avançaram fortemente graças à Sra., tenho muito orgulho de ter feito parte desse projeto e desse time. Aproveito para dedicar também este trabalho à minha família, que mesmo a todo momento perguntando quando eu vou voltar para casa, torcem para que eu alce voos cada vez mais altos. Vocês são minha base, e muito do que sou hoje é graças à educação que vocês me deram. “Nós somos aquilo que fazemos repetidamente. Excelência então não é um modo de agir, mas um hábito.” Aristóteles 5 Agradecimentos Primeiramente, a Deus, pelo dom da vida, e por todo o amparo nos momentos bons e ruins que passamos em nossa caminhada. Por ser um ponto de apoio e de luz, que nos auxilia a ir mais além nos momentos que nos desafiam. Aos ratos de laboratórios, cujas vidas foram utilizadas em prol do avanço da ciência. Neste projeto foram utilizados muitos ratos, e mesmo assim, ao longo desses quatro anos de curso e de atividades dentro do biotério, tentei ao máximo assegurar que nenhuma dessas muitas vidas sofresse, oferecendo condições dignas para cada um deles. Vocês foram essenciais para esse trabalho. À minha família, meus pais Marli Aparecida Franco de Barros e Jorge Luiz de Barros, e meus irmãos Patrick Jr Franco de Barros e Maicon Wellington Franco de Barros, por todo o apoio e por serem uma base muito sólida na minha vida. Obrigado por estarem comigo em todas as minhas decisões e por torcerem sempre para o meu crescimento. Sou muito grato por ter vocês em minha vida! “Quando as raízes são profundas, não há razão para temer o vento.” Provérbio Chinês À minha Orientadora, Profa. Wilma De Grava Kempinas, quem me abriu muitas portas de oportunidades, e confiou no meu trabalho durante esses oito anos. Acho que não cabe em palavras o quanto sou grato pelo crescimento que a Sra. me possibilitou nesses anos todos. Ainda não sei como a Sra. faz o seu dia render tanto com a correria do dia-a-dia, mas digo com certeza que a Sra. é uma guerreira que serve como fonte motivação. A Sra. é uma grande inspiração para todos nós, como amiga, professora, pesquisadora e como ser humano... “Um verdadeiro artista não é aquele que é inspirado, mas aquele que inspira os outros.” Salvador Dalí A cada um que passou pelo Laboratório ReproTox, pessoas muito trabalhadoras, e sem medo de se arriscar dentro da pesquisa, Lethícia Valencise, Thamiris Figueiredo, Ana 6 Flávia Lozano, Patrícia Villela, Cibele Borges, Karolina Tonon, Mayara Moura e Josiane Lima, sou muito grato e honrado por ter tido vocês como parceiros de trabalho. Não posso deixar de fora os alunos de iniciação científica que sempre estiveram comigo, dentro e fora do Laboratório, e sempre foram mais de parceiros de trabalhos, Raquel Brito, Gustavo Chavari, Taís Dinhani, Gabriela Teixeira e Isabella Guimarães. Todos vocês vão pra muito além disso, são amigos para a vida, que tornavam o dia sempre mais leve e davam o gás necessário para fazermos o trabalho com muita qualidade e sempre com alegria. Que o futuro de vocês seja brilhante e repleto de boas conquistas! "O prazer no trabalho aperfeiçoa a obra." Aristóteles To Dr. Gary R. Klinefelter, from the U.S. Environmental Protection Agency, for all the insights, knowledge, and advice necessary to evolve with the EDS project. Also, I thank Douglas Darr for all the consultancy regarding the experimental design of this study and its future applicability. To Dr. Jacques J. Tremblay, who open the doors of his Lab for me, during my period of internship abroad, in the Université Laval / Centre Hospitalier Universitaire de Québec (Quebec City, Canada). This was an amazing opportunity that I am so grateful for, and I thank you for all the knowledge, patience, and support before, during, and after my stay in Canada. To Dr. Tremblays’s Lab members, Kenley Joule Pierre, Karine de Mattos, and Nicholas Robert, who were very kind and patient with me during my internship, they spared no effort to make me feel part of the Lab, as well as they teach me so many things in molecular biology. They are such brilliant people as researchers and as friends. Ao Dr. Luis Octavio Regasini, do Laboratório de Antibióticos e Quimioterápicos (Departamento de Química e Ciências Ambientais, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas – IBILCE/Unesp), pelo apoio com a síntese do EDS. To Dr. Daniel Cyr and Mary Gregory, for all the advice and knowledge shared. Sadly, the pandemic led me to cancel my internship in your Lab, however, I am glad to see you again during the Conference in Boston. 7 Ao José Eduardo Bozano, técnico de Laboratório do Setor de Morfologia, por todo o apoio técnico, e especialmente por toda a amizade construída ao longo da nossa convivência, sempre com muita alegria. Ao Dr. Dijon Henrique Salomé de Campos, da Unidade de Pesquisa Experimental da Faculdade de Medicina de Botucatu (UNIPEX/FMB – Unesp), pelo suporte técnico com a formulação da ração contendo EDS. Ao Felipe Cantore, por esses anos todos de companheirismo, tenho muito orgulho de você e sou muito feliz por ter você em minha vida. Você não é só um excelente anatomista, professor e pesquisador, mas também um ser humano incrível!! “Quem em cada pouco põe tudo que é, merece ser feliz. E muito.” Tati Bernardi Às pessoas que estão comigo desde o ensino médio e a graduação, Natalia Almeida e Vanessa Fioravante. Aos amigos que fiz durante a pós-graduação, Caio Damasceno, Bruna Bologna, Gerson Almeida, Fernanda France. O apoio de vocês também foi peça chave para que eu pudesse chegar até aqui. Aos professores Ariane Rozza, Arielle Arena e Wellerson Scarano, por tantas oportunidades de atuar como professor nas disciplinas de Embriologia Humana, Embriologia Comparada, Embriologia dos Animais Domésticos, Morfologia Animal e Humana, e Fisiologia Animal e Humana, disciplinas que me fascinam a cada nova aula. Fico muito feliz, grato e honrado por terem contribuído com a minha formação didática. Ao Setor de Morfologia do departamento de Biologia Estrutural e Funcional, no Instituto de Biociências de Botucatu (Unesp) e seus funcionários, por permitirem o desenvolvimento deste trabalho, e por estarem sempre à disposição para nos auxiliarem desde a parte burocrática até a parte experimental da pesquisa. Aos membros titulares e suplentes da minha banca de qualificação do Doutorado, pela disponibilidade, aprendizados e contribuições para o aprimoramento deste trabalho. 8 Aos membros titulares e suplentes da minha banca de defesa do Doutorado, pela disponibilidade em participar desse momento tão importante para mim, bem como por todo conhecimento compartilhado e pelas contribuições para lapidação final da minha tese. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001., pelo apoio financeiro para desenvolvimento deste projeto, concedido na forma de Bolsa de Doutorado, durante os dois primeiros anos de curso. À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pelo apoio financeiro para desenvolvimento deste projeto, concedido na forma de Bolsa de Doutorado (Processo nº 2021/09882-2), durante os dois últimos anos de curso, bem como pelo apoio para a realização do intercâmbio para o Canadá, por meio da bolsa de estágio de pesquisa no exterior (BEPE, Processo nº 2022/16531-4). A Todos que de alguma forma contribuíram para o meu crescimento e para a minha formação como aluno, professor, cientista e ser humano, deixo aqui os meus sinceros agradecimentos. Muito obrigado! Thank you! Merci beaucoup! "Um cientista no seu laboratório não é apenas um técnico: é, também, uma criança colocada à frente de fenômenos naturais que impressionam como se fossem um conto de fadas." Marie Curi 9 Resumo A superpopulação de animais sinantrópicos e errantes cria um cenário caótico para a aplicação de estratégias eficazes de controle populacional. Esses animais, incluindo roedores, circulam livremente nos centros urbanos, reproduzem-se, além de contribuir para a transmissão de patógenos zoonóticos e causarem acidentes. Nesses casos, métodos de castração cirúrgicos são inviáveis, levando à prática de técnicas não humanizadas, que incluem a morte por envenenamento e armadilhas, o que contribui para o sofrimento dos animais, bem como para a causa de desequilíbrios ambientais e ecológicos. Nesse contexto, nosso Laboratório mostrou resultados promissores na indução de infertilidade em ratos de laboratório, após administração oral de dimetanossulfonato de etano (EDS), um agente com conhecida citotoxicidade seletiva em células de Leydig após gavagem e injeções intraperitoneais. Na sequência desses estudos, o presente projeto teve como objetivo avaliar detalhes adicionais do mecanismo de ação desta molécula in vitro, com células de Leydig imortalizadas (Experimento I); avaliar os aspectos morfofuncionais, bioquímicos e contraceptivos da infertilidade promovida pelo EDS, em ratos Wistar machos, utilizando vias alternativas de administração do composto (Experimentos II, III e IV), bem como testar sua possível aplicação em uma abordagem de “mundo real” com exposição simultânea de ratos machos e fêmeas com uma formulação de ração contendo EDS (Experimento V). No experimento I, as células de Leydig R2C e MA-10 foram cultivadas com o EDS, e os efeitos dessa molécula sobre promotores gênicos relacionados à função endócrina dessas células foram avaliados. A exposição ao EDS pode afetar a atividade dos promotores de Star, Insl3 e Gsta3 nessas células. No experimento II, com a administração única do EDS por injeções intratesticulares em ratos machos adultos, ocorreram reduções no ganho de peso na primeira semana após as injeções, bem como mostraram uma drástica queda na fertilidade após 4 semanas das injeções, a qual foi parcialmente revertida após 10 semanas. Além disso, parâmetros espermáticos e a morfologia do testículo e do epidídimo ainda estavam comprometidos mesmo após 11 semanas das injeções. No experimento III, o EDS foi administrado a ratos machos adultos por meio de implantes em tubos SilasticÒ, colocados cirurgicamente no interior do escroto ou subcutaneamente atrás do pescoço. Os resultados neste experimento mostram alterações mais sutis promovida pelo EDS, incluindo redução da motilidade espermática, alterações da morfologia e do tempo de trânsito espermático pelo epidídimo, sem o comprometimento da fertilidade e da estrutura testicular e epididimária. No experimento IV, após um ou duas injeções subcutâneas de EDS em ratos machos adultos, os 10 animais estavam inférteis após 4 ou 10 semanas dos tratamentos, e com 11 semanas, os parâmetros espermáticos, bem como a histologia testicular e epididimária estavam comprometidos. No experimento V, ratos machos e fêmeas receberam EDS na ração ad libitum, e nesta abordagem efeitos e imediatos e intergeracionais foram avaliados. Na geração F0, os ratos machos apresentaram comprometimento dos parâmetros espermáticos, peso dos órgãos reprodutivos, histologia testicular e epididimária e capacidade ejaculatória, enquanto as ratas apresentaram diminuição do peso ovariano e da imunomarcação da proteína StAR. A fertilidade em ratos F0 foi diminuída pelo EDS principalmente devido à exposição de ratos machos a esta molécula. A prole F1, F2 e F3 apresentaram comprometimento reprodutivo mais sutil principalmente nos ciclos estrais de ratas, indicando efeitos intergeracionais promovidos pela exposição parental ao EDS. Juntos, estes dados contribuem para o conhecimento sobre o mecanismo de ação do EDS nas células de Leydig, bem como comprovam seus efeitos anti- fertilidade por diferentes vias, podendo ser um possível candidato seguro, rápido, eficaz e reversível com efeitos contraceptivos em outras espécies sinantrópicas, errantes, selvagens, de estimação e de produção. 11 Abstract The overpopulation of synanthropic and stray animals creates a chaotic scenario for the application of effective population control strategies. These animals, including rodents, circulate freely in urban centers, reproduce, contribute to the transmission of zoonotic pathogens, and cause accidents. In these cases, surgical castration methods are not feasible, leading to the practice of non-humanized techniques, which include death by poisoning, and trapping, that contribute to the suffering of animals, as well as to the cause of environmental and ecological imbalances. In this context, our Laboratory showed promising results in the induction of infertility in laboratory rats, after oral administration of ethane dimethanesulfonate (EDS), an agent with known selective cytotoxicity in Leydig cells after gavage and intraperitoneal injections. Following these studies, the present project aimed to evaluate additional details of the mechanism of action of this molecule in vitro, with immortalized Leydig cells (Experiment I); evaluate the morphofunctional, biochemical, and contraceptive aspects of infertility promoted by EDS, in male Wistar rats, using alternative routes of administration of the compound (Experiments II, III and IV), as well as testing its possible application in a “real world” approach with simultaneous exposure of male and female rats with a chow formulation containing EDS (Experiment V). In experiment I, R2C and MA-10 Leydig cells were cultured with EDS, and the effects of this molecule on gene promoters related to the endocrine function of these cells were evaluated. Exposure to EDS can affect the activity of the Star, Insl3, and Gsta3 promoters in these cells. In experiment II, with a single administration of EDS by intratesticular injections in adult male rats, there were reductions in weight change in the first week after the injections, as well as a drastic drop in fertility after 4 weeks of injections, which was partially reversed after 10 weeks. Furthermore, sperm parameters and the morphology of the testis and epididymis were still compromised even 11 weeks after the injections. In experiment III, EDS was administered to adult male rats through implants in SilasticÒ tubes, surgically placed inside the scrotum or subcutaneously behind the neck. The results in this experiment show more subtle changes promoted by EDS, including reduced sperm motility, changes in morphology, and sperm transit time through the epididymis, without compromising fertility and testicular and epididymal structure. In experiment IV, after one or two subcutaneous injections of EDS in adult male rats, the animals were infertile after 4 or 10 weeks of treatments, and at 11 weeks, sperm parameters, as well as testicular and epididymal histology were compromised. In experiment V, male and female rats received EDS in the diet 12 ad libitum, and in this approach, immediate and intergenerational effects were evaluated. In the F0 generation, male rats showed compromised sperm parameters, weight of reproductive organs, testicular and epididymal histology, and ejaculatory capacity, while female rats showed decreased ovarian weight and StAR protein immunostaining. Fertility in F0 rats was decreased by EDS mainly due to exposure of male rats to this molecule. The F1, F2, and F3 offspring showed more subtle reproductive impairment, especially in the estrous cycles of rats, indicating intergenerational effects promoted by parental exposure to EDS. Together, these data contribute to the knowledge about the mechanism of action of EDS in Leydig cells, as well as proving its anti-fertility effects through different routes, making it a possible safe, fast, effective, and reversible candidate with contraceptive effects in other synanthropic, stray, wild, pet, and production animals. 13 Lista de abreviaturas e siglas 1F Folículo primordial e primário 2F Folículo secundário 3F Folículo terciário 8Br-cAMP Adenosina 3',5'-monofosfato 8-bromo-cíclico AC Adelinato ciclase AF Folículo atrésico AGD Distância anogenital ALT Alanina aminotransferase AMPc / cAMP Adenosina 3',5'-monofosfato cíclico ANOVA Teste de análise de variância AST Aspartato aminotransferase ATP Adenosina trifosfato Bi Bilateral bp Pares de bases BSA Albumina do soro bovino Cas Caspase CLu. Corpo lúteo Cyp17a1 / CYP17A1 Citocromo P450 17A1 (gene / proteína) DHT Di-hidrotestosterona DMSO Dimetilsulfóxido DNA Ácido desoxirribonucleico DSP Produção diária de espermatozoides EDS Dimetanossulfonato de etano Ep. Epitélio FADD Domínio Fas associado à morte celular FSH Hormônio folículo-estimulante GFP Proteína fluorescente verde GD Dia gestacional GnRH Hormônio liberador de gonadotrofina Gsta3 / GSTA3 Glutationa S-transferase a 3 (gene / proteína) HTF Fluido tubário humano 14 IHC Imuno-histoquímica I.T. Intratesticular In. Tecido intersticial Insl3 / INSL3 Fator semelhante à insulina 3 (gene / proteína) LC (Ing.) ou CL (Pt. Br.) Célula de Leydig LH Hormônio luteinizante Lu. Luz ou lúmen n Número amostral NCK Pescoço (Implante subcutâneo) PBS Tampão fosfato-salino PK Proteína quinase PND Dia pós-natal S.E.M. Erro padrão da média SCR Escroto (Implante intraescrotal) Star / STAR Proteína reguladora aguda da esteroidogênese (gene / proteína) Uni Unilateral W Semanas após o tratamento 15 Sumário Página Introdução ............................................................................................................. 16 Aspectos gerais da reprodução feminina .................................................... 16 Aspectos gerais da reprodução masculina .................................................. 17 Contracepção masculina animal: métodos e desafios ................................. 22 Dimetanossulfonato de etano ...................................................................... 25 Justificativa ........................................................................................................... 30 Objetivos ................................................................................................................ 31 Referências Bibliográficas .................................................................................... 32 Capítulo 1 ............................................................................................................... Ethylene dimethanesulfonate effects on gene promoter activities related to the endocrine function of immortalized Leydig cell lines R2C and MA-10 38 Capítulo 2 …………………………..………......................................................... Efficacy of anti-fertility effects of ethane dimethanesulfonate through intratesticular injections in adult rats: a candidate for a reversible male contraceptive 49 Capítulo 3 ……………………………………………………………...………… Ethane dimethanesulfonate effects on the reproductive function of adult male rats through intrascrotal and subcutaneous implants 77 Capítulo 4 ……………………………………………………………...………… Single or double subcutaneous injections of ethane dimethanesulfonate led to long-term infertility effects in adult male rats 102 Capítulo 5 ……………………………………………………………...………… Population control of synanthropic animals with ethane dimethanesulfonate through a chow formulation: a real-world approach in laboratory Wistar rats 125 Conclusão ............................................................................................................... 156 Apêndice ................................................................................................................ 157 Anexos .................................................................................................................... 160 Anexo 1: Certificado de aprovação da pesquisa pela Comissão de Ética no Uso de Animais ....................................................................................... 160 Anexo 2: Certificado de aprovação da pesquisa pela Comissão Ética no Uso de Animais (Emenda) ........................................................................... 161 16 Introdução Aspectos gerais da reprodução feminina Em mamíferos, o desenvolvimento inicial do sistema genital ocorre durante o período intrauterino. Como resultado da fecundação, tem-se a determinação do sexo cromossômico do indivíduo em formação, o qual dá início a uma cascata de eventos que levam à diferenciação sexual. O desenvolvimento e a diferenciação do sistema genital iniciam-se durante a vida intrauterina e seguem até o período pós-natal (LOHMILLER; SWING; HANSON, 2020; VUE et al., 2018). Em fêmeas, o sistema genital é constituído por um par de ovários, local onde são produzidos e maturados os gametas femininos; por um par de tubas uterinas, pelo útero, e pela vagina (CRISLER et al., 2020), conforme esquematizado na Figura 1. Figura 1. Estruturas anatômicas constituintes do sistema genital feminino, em ratos (vista ventral), modificado de Crisler et al. (2020). Ilustração criada com auxílio do aplicativo BioRender. Com a chegada à puberdade, a capacidade reprodutiva é estabelecida, evento que envolve alterações complexas de caráter morfológico, fisiológico e comportamental em fêmeas, Rim Corno uterino Ovário Glândula do clitóris Uretra Bexiga urinária Tuba uterina Clitóris Ureter Óstio da vagina Vagina 17 com destaque ao desenvolvimento ovariano e ao desenvolvimento de características relacionadas à maturidade sexual (CASTELLANO et al., 2018). Em roedores, a chegada à puberdade é observada por volta dos 30-40 dias de idade nas fêmeas (MAEDA; OHKURA; TSUKAMURA, 2000), por meio de sinais físicos externos, como a completa canalização da vagina, conhecida como abertura vaginal; e a observação de células epiteliais queratinizadas nessa região, caracterizando-se o primeiro estro e a primeira ovocitação (CASTELLANO et al., 2018; OJEDA; SKINNER, 2006). A partir da puberdade ocorre o início da capacidade reprodutiva, com a geração de descendentes, que pode ocorrer múltiplas vezes ao longo da vida de um indivíduo, e encerra- se na senescência reprodutiva, período conhecido como estropausa, em fêmeas não-primatas (VAN KEMPEN; MILNER; WATERS, 2011; YORK; PARKER; HABER, 2014). A capacidade reprodutiva em mamíferos ocorre de forma cíclica, por meio de ciclos menstruais, no caso dos primatas, ou ciclos estrais em roedores e nos demais mamíferos eutérios não primatas (BOYD et al., 2018). A ciclicidade reprodutiva envolve uma sequência de eventos que ocorrem nos ovários, no útero e sistemicamente nas fêmeas, guiadas pelas variações hormonais a cada ciclo. Os eventos cíclicos que ocorrem nos ovários estão relacionados com a maturação ovocitária, a foliculogênese, a ovocitação e a formação do corpo lúteo (BOYD et al., 2018; LOHMILLER; SWING; HANSON, 2020; MAEDA; OHKURA; TSUKAMURA, 2000). Já os eventos que ocorrem no útero ciclicamente envolvem principalmente o desenvolvimento e a regressão do endométrio e de suas glândulas (BOYD et al., 2018). Aspectos gerais da reprodução masculina O sistema genital masculino, em grande parte dos mamíferos, é constituído por um par de testículos, epidídimos e ductos deferentes, além de glândulas sexuais acessórias, a uretra, o pênis e o escroto (MAEDA; OHKURA; TSUKAMURA, 2000; MAYNARD; DOWNES, 2019; SETCHELL; BREED, 2006). Os constituintes do sistema genital masculino são ilustrados na Figura 2, com o seu arranjo anatômico observados em ratos, um dos modelos mais utilizados para estudos na área de biologia e toxicologia da reprodução (LOHMILLER; SWING; HANSON, 2020; MAEDA; OHKURA; TSUKAMURA, 2000; ZUPANIČ; KEIJER; TEERDS, 2018). A determinação e a diferenciação sexual ocorrem ainda durante o período intrauterino, com a expressão do gene Sry (sex-determining region on Y), presente no braço curto do cromossomo sexual Y, o qual conduz a diferenciação das gônadas, até então 18 bipotenciais, para originar os testículos (GARDINER; SWAIN, 2015). Ainda durante os períodos embrionário e fetal, células presentes no tecido intersticial dos testículos, as células de Leydig fetais, inicial a produção de hormônios androgênicos, os quais levam à diferenciação do ducto mesonéfrico no epidídimo, ducto deferente e em constituintes das glândulas sexuais acessórias. Além disso, a ação destes hormônios androgênicos, como a testosterona, também contribui para a diferenciação dos órgãos genitais externos, bem como para a diferenciação e maturação de outros tecidos, órgãos e sistemas (BHASIN; JASUJA, 2019). Figura 2. Estruturas anatômicas constituintes do sistema genital masculino, em ratos (vista ventral), modificado de Crisler et al. (2020). Ilustração criada com auxílio do aplicativo BioRender. A espermatogênese é um processo biológico complexo que ocorre no interior dos túbulos seminíferos, nos testículos para produzir o gameta masculino, o espermatozoide (Figura 3) (CHENG; MRUK, 2017; MAYNARD; DOWNES, 2019). Para isso, os hormônios produzidos pelo eixo hipotálamo-hipófise-gonadal precisam agir de forma síncrona (O’SHAUGHNESSY, 2014; SILVERTHORN et al., 2017). Nos mamíferos, a espermatogênese pode ser dividida em três fases distintas, de forma centrípeta, que são a fase espermatogonial, na qual ocorre a proliferação das espermatogônias; a fase dos espermatócitos, na qual ocorrem as divisões meióticas dos espermatócitos primários e secundários; e a fase espermiogênica, na qual ocorre a diferenciação celular das espermátides para formar o espermatozoide propriamente dito (FRANÇA; AVELAR; ALMEIDA, 2005). Rim Ureter Glândula seminal Glândula coaguladora (próstata anterior) Bexiga urinária Ducto deferente Epidídimo (Corpo) Glândula ampular Uretra Testículo Pênis Glândula bulbouretral Próstata ventral Epidídimo (Cabeça) Epidídimo (Cauda) Glândula prepucial 19 Figura 3. Organização estrutural do testículo e o processo de espermatogênese que ocorre no interior dos túbulos seminíferos. Adaptado de Silverthorn et al. (2017). O controle hormonal da espermatogênese inicia-se no hipotálamo que secreta, de forma pulsátil, o hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH), que estimula a produção dos hormônios luteinizante (LH) e folículo-estimulante (FSH) pela adeno-hipófise. Estas, por sua vez, atuam nos testículos de diferentes formas: o LH liga-se ao seu receptor nas células de Leydig, localizadas no tecido intersticial dos testículos, e estimula a esteroidogênese para a produção de testosterona; O FSH, por sua vez, liga-se ao seu receptor nas células de Sertoli, localizadas no interior dos túbulos seminíferos, as quais dão suporte de múltiplas formas para ocorrência da espermatogênese. A testosterona produzida pelas células de Leydig segue para os túbulos seminíferos, onde desempenha um papel crucial na ocorrência da espermatogênese, e também segue para a circulação sanguínea sistêmica, onde desempenha seu papel de retroalimentação negativa com o hipotálamo e a hipófise (MAEDA; OHKURA; TSUKAMURA, 2000; ROTH; PAGE; BREMNER, 2016). O processo esteroidogênico nas células de Leydig é estimulado principalmente pelo LH, que se liga ao seu receptor acoplado à proteína G causando um aumento na produção de AMP- Interstício Túbulo seminífero Célula de Leydig Células de Sertoli Célula de Leydig Espermatozoides Células germinativas 20 cíclico (AMPc), e levando à ativação de várias vias e fatores de transcrição, os quais ocasionam aumento na expressão de vários genes necessários para produção de enzimas e outras proteínas envolvidas na esteroidogênese (DE MATTOS; PIERRE; TREMBLAY, 2023; DE MATTOS; VIGER; TREMBLAY, 2022; LI; ZIRKIN; PAPADOPOULOS, 2018; TREMBLAY, 2015), como mostrado de forma resumida pela Figura 4. A partir da estimulação das células de Leydig, com a formação do AMPc e ativação de outras proteínas quinases (PKs), o colesterol é transportado da membrana mitocondrial externa para interna por intermédio da proteína reguladora aguda da esteroidogênese (StAR). No interior desta organela, o colesterol é convertido para pregnenolona por intermédio da enzima CYP11A1, e posteriormente segue para o retículo endoplasmático, onde por intermédio das enzimas HSD3b, CYP17A1 e HSD17b3 é convertido em testosterona. A testosterona produzida pode ainda ser convertida em di-hidrotestosterona (DHT) ou estrógenos, a partir da atividade das enzimas 5a-redutase e aromatase, respectivamente (AYAZ; HOWLETT, 2015; DE MATTOS; PIERRE; TREMBLAY, 2023; LI; ZIRKIN; PAPADOPOULOS, 2018; TREMBLAY, 2015). Além de seu papel crucial para a ocorrência da espermatogênese, a testosterona produzida pelas células de Leydig também será utilizada em processos pós-testiculares da fisiologia reprodutiva masculina. Os espermatozoides recém-formados nos túbulos seminíferos são maduros morfologicamente, mas não funcionalmente, e somente durante a sua passagem pelo epidídimo, um órgão constituído por um ducto único altamente enovelado, que ocorre o processo de maturação espermática, e os espermatozoides adquirem então a motilidade e a capacidade de fertilizar o gameta feminino (CORNWALL, 2018; DE GRAVA KEMPINAS; KLINEFELTER, 2018; SULLIVAN; BELLEANNÉE, 2018). A maturação espermática depende da interação dos espermatozoides com fatores extracelulares secretados pelas células epiteliais do epidídimo na luz do ducto epididimário (CORNWALL, 2018). Os processos transcricionais e traducionais destes fatores são altamente regulados pela ação da testosterona e do DHT diretamente sobre as células do epidídimo (ROBAIRE; HAMZEH, 2011; SULLIVAN; BELLEANNÉE, 2018). 21 Figura 4. Esquema geral sobre a estimulação da célula de Leydig pelo hormônio luteinizante (LH) para a esteroidogênese. Di-hidrotestosterona (DHT). Adaptado de Ayaz & Howlett (2015) e Tremblay (2015). Ilustração criada com auxílio do aplicativo BioRender. A avaliação histopatológica dos órgãos do sistema genital masculino em estudos pré- clínicos constitui um importante parâmetro na determinação da toxicidade de diferentes substâncias químicas a serem ou já comercializadas (WHITNEY; SUTTIE, 2018). A histoarquitetura geral do testículo e do epidídimo é ilustrada na Figura 5. No testículo são observados os túbulos seminíferos, contendo as células da linhagem germinativa e as células de Sertoli, células somáticas que desempenham múltiplas funções de suporte para a espermatogênese. Além disso, também é possível observar o compartimento intersticial do testículo, entre os túbulos seminíferos, contendo as células de Leydig, bem como células do tecido conjuntivo e vasos sanguíneos e linfáticos (CREASY, 1997, 2001; MAYNARD; DOWNES, 2019; SETCHELL; BREED, 2006; WHITNEY; SUTTIE, 2018). O epidídimo, por sua vez, é dividido anatomicamente em quatro regiões principais: o segmento inicial, a cabeça, LH Receptor de LH Hipófise Hipotálamo Mitocôndria Retículo endoplasmático Núcleo Colesterol STAR Colesterol Pregnenolona CYP11A1 Pregnenolona Retículo endoplasmático Pregnenolona Progesterona 17⍺-hidroxipregnenolona CYP17A1 HSD3β Androstenediona Testosterona DHT Estrógenos CYP17A1 HSD17β3 5⍺-redutase Aromatase AC AMPc PKA Enzimas esteroidogênicas Circulação sanguínea ATP 22 o corpo e a cauda. O ducto epididimário ao longo de toda sua extensão é constituído por um epitélio colunar pseudoestratificado no qual vários tipos de células estão presentes, sendo elas as células principais, células basais, células apicais, células estreitas, células claras, células halo e células dendríticas (DE GRAVA KEMPINAS; KLINEFELTER, 2015, 2018; MAYNARD; DOWNES, 2019; SULLIVAN; BELLEANNÉE, 2018; WHITNEY; SUTTIE, 2018). Figura 5. Representação da organização histológica do testículo e das diferentes regiões do epidídimo de rato macho adulto. Epitélio do túbulo seminífero ou do ducto epididimário (Ep.); Luz ou lúmen (Lu.); Tecido intersticial (In.). Ilustração criada com auxílio do aplicativo BioRender. Fotomicrografias do Laboratório ReproTox. Contracepção masculina animal: métodos e desafios Como a espermatogênese é um processo contínuo na vida dos machos e produz muito mais gametas do que a ovogênese nas fêmeas, torna-se um caminho mais eficiente para o desenvolvimento de métodos contraceptivos e controle populacional. Segundo Amory (AMORY, 2016), um método contraceptivo masculino deve levar em consideração a fisiologia da produção do espermatozoide e atuar de uma das seguintes formas: (1) agir como uma barreira e impedir o contato entre o espermatozoide e o ovócito; (2) matar ou inibir a função do Célula de Sertoli Espermatócito primário Célula de Leydig Espermátide alongada Espermátide redonda Espermatogônia Ep. Lu. In. Lu. Ep. In. Lu. Ep. In. Lu. Ep. In. Lu. Ep. In. Testículo Epidídimo Segmento inicial Cabeça Corpo Cauda 23 espermatozoide, para evitar o contato entre os gametas masculino e feminino; (3) impedir a produção de espermatozoides, por mecanismos hormonais e/ou não hormonais. A castração e outros métodos contraceptiovos apresentam como objetivo principal o controle da função reprodutiva (AURICH, 2018), e estão resumidos na Figura 6. Esses métodos devem ser seguros, rápidos e eficazes em promover efeitos anti-fertilidade, e também, em alguns casos, devem ser facilmente reversíveis (LIU, 2018). A castração cirúrgica, por meio da gonadectomia (orquiectomia em machos e ooforectomia em fêmeas) (HOULIHAN, 2017; REICHLER, 2009), e vasectomia (ligamento e remoção de uma parte dos ductos deferentes) (SHEYNKIN, 2009; VELEZ et al., 2021), são técnicas reconhecidas como as mais eficazes para o controle populacional de animais domésticos, experimentais e de produção (IBRAHIM et al., 2016; JANA; SAMANTA, 2007). No entanto, a esterilização cirúrgica não é eficaz no controle da população de animais sinantrópicos, como roedores e aves, bem como de animais errantes, como cães, gatos, bovinos e suínos errantes (SILVEIRA; COLLA; MESTIERI, 2021; SINGH et al., 2020). As espécies sinantrópicas correspondem a animais selvagens ou de vida livre que se beneficiam de alguma forma da ecologia compartilhada com os seres humanos. Os animais sinantrópicos podem ser nativos ou invasivos de uma região, enquanto os animais domesticados não são considerados sinantrópicos e sim errantes (ABDULKARIM; KHAN; AKLILU, 2021; KLEGARTH, 2017; SHOCHAT et al., 2006). Ambas as populações de animais sinantrópicos e errantes representam um problema de saúde pública, uma vez que são potenciais hospedeiros de patógenos zoonóticos, incluindo Brucella spp., helmintos gastrointestinais, Leishmania spp., Leptospira spp., Salmonella spp. e Toxoplasma spp. (LINDAHL; MAGNUSSON, 2020). A superpopulação de animais errantes e sinantrópicos cria um cenário caótico para o controle populacional. Tomando como exemplo a população canina, estima-se que 75% dos cães no mundo estejam livres para vagar, reproduzir-se e também disseminar patógenos zoonóticos, causar acidentes de trânsito e ataques às pessoas (MASSEI; MILLER, 2013). Assim, a aplicação massiva de métodos cirúrgicos para castração nesta espécie e em outros animais errantes ou sinantrópicos torna-se extremamente desvantajosa devido aos altos custos, demora, necessidade de cuidados pós-operatórios, local adequado e equipe veterinária para execução dos procedimentos (MASSEI; MILLER, 2013; SILVEIRA; COLLA; MESTIERI, 2021). Nesses casos, práticas alternativas e antiéticas são aplicadas, como mortes oriundas de envenenamento, iscas e armadilhas que causam dor e sofrimento desnecessários aos animais, além de levar a danos ambientais e ecológicos (BONBON; MACDIARMID; FUNES, 2018; ESKANDER, 2017; SHORE, 2017). 24 Figura 6. Resumo dos métodos de contraceptivos disponíveis para aplicação em espécies animais, com base em Aurich (2018) e Driancourt & Rhodes (2018). Em outros casos, os métodos contraceptivos de curto e médio prazo são de grande importância, como no caso de animais de produção, de estimação e até mesmo errantes, quando é necessário um método facilmente reversível, preferencialmente por manejo não-cirúrgico da fertilidade (ASA, 2018; DRIANCOURT; RHODES, 2018). Com esta abordagem, é possível controlar o comportamento agressivo e territorialista tipicamente masculino; melhorar a produção de carne (melhor ganho de peso e qualidade da carcaça) e de ovos (a presença do galo castrado nas granjas torna as galinhas mais calmas, o que melhora os sistemas de produção de ovos) (ODÉN, 2003); tratar doenças reprodutivas (câncer de próstata, neoplasia testicular), bem como controlar a função reprodutiva (AURICH, 2018; DRIANCOURT; RHODES, 2018). A técnica ideal para controle populacional e de fertilidade de animais sinantrópicos, domésticos e errantes deve ser baseada em um método contraceptivo de baixo custo, humanizado, eficaz, possivelmente reversível e que não cause impacto na saúde animal e no meio ambiente (JANA; SAMANTA, 2011; LIU, 2018). Considerando esses parâmetros para o desenvolvimento de métodos contraceptivos, o estudo de novos métodos requer a validação da eficácia e segurança de compostos químicos a serem testados como agentes contraceptivos em diferentes modelos in vitro e in vivo. Dessa forma, é possível estabelecer as capacidades contraceptivas de determinado composto, com o mínimo de efeitos adversos gerados por ele (BELL; LIECHTY; BERGIN, 2015). Métodos cirúrgicos Métodos não- cirúrgicos Gonadectomia (♂♀) Vasectomia (♂) Castração química (Injeções intratesticulares de cádmio, cloreto de cálcio, clorexidina, formalina, ácido lático...) Imunocastração (Vacina de GnRH) Hormônios exógenos (Injeções de análogos de GnRH, implantes de GnRH, progestinas, andrógenos...) Permanente Permanente ou reversível Permanente ou reversível Permanente ou reversível 25 Vários estudos com roedores têm mostrado resultados positivos com a identificação de diferentes alvos genéticos e agentes químicos capazes de promover a infertilidade e desempenhar um papel contraceptivo nesses modelos experimentais (ARCHAMBEAULT; MATZUK, 2014; BELL; LIECHTY; BERGIN, 2015; VAN DER SPOEL et al., 2002). O estudo de possíveis alvos e agentes contraceptivos em roedores permite uma maior compreensão da fisiologia reprodutiva masculina, além de permitir o estudo de dosagens pré- clínicas, estabelecer a segurança farmacológica dos agentes testados, bem como a identificação de mecanismos pelos quais esses agentes podem exercer seu papel contraceptivo (BELL; LIECHTY; BERGIN, 2015). Dimetanossulfonato de etano O composto químico de interesse para o desenvolvimento do presente estudo é o dimetanossulfonato de etano (do inglês Ethane dimethanesulfonate – EDS; Figura 7), um agente alquilante, com analogia estrutural ao quimioterápico bussulfano (KLINEFELTER et al., 1990). Esta molécula pode levar ratos machos adultos à esterilidade em cerca de sete dias após uma única injeção intraperitoneal (JACKSON, 1973). Figura 7. Fórmula estrutural e molecular do dimetanossulfonato de etano. Fórmula estrutural obtida a partir da plataforma PubChem, disponível em: << https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Ethylene- dimethanesulfonate >>. Acesso em 01 ago 2023. Existem poucos estudos sobre o metabolismo e a excreção do EDS. Apesar disso, estudos mostram que esse composto em modelo de roedor apresentou distribuição generalizada C4H10O6S2 Dimetanossulfonato de etano (EDS) 26 em tecidos reprodutivos e não reprodutivos, sem efeitos sobre as células sanguíneas, com longa vida in vivo e relativamente pouca metabolização (EDWARDS; CRAIG; JACKSON, 1969; EDWARDS; JACKSON; JONES, 1970). A maior porcentagem desse composto em camundongos e ratos é excretada inalterada, enquanto o restante é excretada na forma de ácido metanossulfônico, ambos na urina (EDWARDS; CRAIG; JACKSON, 1969). Sabe-se que o mecanismo de ação pelo qual o EDS pode levar à esterilidade masculina se dá pela depleção de andrógenos nos testículos, uma vez que esse agente alquilante age seletivamente nas células de Leydig, como um agente citotóxico (JACKSON, 1973; KLINEFELTER; LASKEY; ROBERTS, 1991; MOLENAAR et al., 1985). A redução dos níveis de testosterona também traz outros efeitos, como a redução de peso de outros órgãos dependentes de andrógenos do sistema genital, como a próstata, a glândula seminal e o epidídimo (MOLENAAR et al., 1985). Além disso, em estudos conduzidos por Klinefelter et al. (1990; 1997; 1991), o EDS também é eficiente em reduzir a fertilidade de ratos machos por efeitos diretos na função epididimária, comprometendo o processo de maturação espermática. Assim, estudos com EDS são muito promissores na compreensão dos processos reprodutivos dependentes de andrógenos (KLINEFELTER; LASKEY; ROBERTS, 1991). O mecanismo de ação da molécula de EDS está relacionado à via extrínseca de apoptose, ligada ao sistema Fas, no qual após exposição ao EDS, as células de Leydig passam a expressar mais a proteína de superfície Fas (FasR) e o seu ligante (FasL), com isso, seu domínio associado à morte celular (FADD) ativa a enzima caspase-8, que por sua vez ativa direta ou indiretamente a caspase-3, e acaba por levar a célula à apoptose (KIM; LUO; ZIRKIN, 2000; TAYLOR et al., 1999; TEERDS; RIJNTJES, 2007). Ao seu mecanismo de ação, também está atrelado o comprometimentos no nível de transcricional antes que a apoptose ocorra (LI et al., 2012), especialmente em elementos relacionados à esteroidogênese, como demonstrado por estudos in vitro, como a transcrição da proteína reguladora aguda da esteroidogênese (StAR) (DE BARROS et al., 2024), uma proteína que transporta o colesterol da membrana mitocondrial externa para a interna, onde a esteroidogênese é iniciada (TUGAEVA; SLUCHANKO, 2019). Ambos os mecanismos citados anteriormente estão resumidos na Figura 8. Além disso, estudos in vivo com o EDS e sua ação sobre as células de Leydig mostram que após a exposição de ratos a esse agente alquilante, a população de células de Leydig afetada pela molécula de EDS pode ser restabelecida em cerca de um mês após a exposição, com a retomada da produção de testosterona, o que denota um caráter reversível de infertilidade promovido pelo EDS (O’LEARY et al., 1986). 27 Figura 8. Mecanismos pelos quais o dimetanossulfonato de etano (EDS) age nas células de Leydig, para indução de apoptose pelo sistema Fas (via extrínseca de apoptose), e por modulação da transcrição de genes associados com a esteroidogênese. Domínio Fas associado à morte celular (FADD); Caspase (Cas). Ilustração criada com auxílio do aplicativo BioRender. Estudos recentes com dinâmica de células de Leydig de rato utilizam o EDS como modelo para a depleção dessa população celular no testículo, para induzir mitose nas células de Leydig tronco, levando assim ao processo de regeneração das células de Leydig adultas (MO et al., 2019). Isso representa um ótimo modelo para entender os fatores moleculares, bem como as características morfológicas e fisiológicas envolvidas na diferenciação das células de Leydig (DUAN et al., 2019; LI, 2019; MO et al., 2019; NI et al., 2019). Com isso, o processo de regeneração dessas células parece ser muito semelhante ao desenvolvimento dessa população de células durante a puberdade, o que torna esse modelo relevante para estudar eventos testiculares durante a puberdade masculina, mesmo com ratos na idade adulta (MO et al., 2019). Os efeitos do EDS não se restringem apenas a modelos de roedores, como ratos, é sabido por muitos estudos que o EDS pode afetar a função reprodutiva masculina, promovendo infertilidade por meio da depleção das células de Leydig, em quase todas as classes de vertebrados (TEERDS; RIJNTJES, 2007), conforme resumido na Tabela 1. Assim, é razoável pensar que esse composto químico possa exercer efeitos semelhantes e aplicáveis entre diferentes espécies de interesse econômico, social e de saúde pública, como animais domésticos, de produção e sinantrópicos. Em estudos recentes realizados em nosso Laboratório, cujos resultados promissores motivaram um pedido de patente (BORGES et al., 2022), verificamos que a exposição oral de ratos machos adultos ao EDS, na ração, também induz infertilidade nesses animais, mostrando EDS Morte celular Célula de Le ydig FasL FasR Cas8 FADDCas3 EDS 28 que esse composto também pode ser eficaz por outros vias de administração. No entanto, ainda não se sabe se a exposição ao EDS pode ser prejudicial a outros tecidos e funções não reprodutivas em ratos machos. Assim, estudos mais abrangentes para investigar os efeitos do EDS e sua potencial aplicação como composto contraceptivo são necessários para entender e caracterizar sua ação como promotor de infertilidade em roedores e, esperançosamente, ser usado para controle populacional de outros animais. Tabela 1. Sensibilidade das células de Leydig (CL) aos efeitos citotóxicos seletivos promovidos pelo EDS em diferentes espécies de vertebrados. Classe / Espécie Efeitos do EDS Referência(s) Osteichthyes Peixe teleósteo Sem efeito sobre a CL / Efeito positivo na atividade testicular (MINUCCI et al., 1992) Amphibia Sapo Efeito negativo sobre a CL (MINUCCI et al., 2000) Reptilia Lagarto Efeito negativo sobre a CL (MINUCCI et al., 1995) Aves Codorna japonesa Sem efeito sobre a CL / Efeito negativo sobre os espermatozoides (JONES; KOMINKOVA; JACKSON, 1972) Mammalia Rato Efeito negativo sobre a CL (KERR et al., 1987; KLINEFELTER et al., 1990; MOLENAAR et al., 1985; ROMMERTS et al., 2004) 29 Camundongo Efeito negativo sobre a CL (?) (KERR et al., 1987; ROMMERTS et al., 2004; TARKA- LEEDS et al., 2003) Porquinho-da-Índia Efeito negativo sobre a CL (KERR et al., 1987) Hamster chinês Sem efeito sobre a CL (TEERDS; RIJNTJES, 2007) Hamster siberiano Efeito negativo sobre a CL (KERR et al., 1987) Coelho Efeito negativo sobre a CL (LASKEY et al., 1994) Macaco Efeito negativo sobre a CL (SUMATHI et al., 1999) Javali Efeito negativo sobre a CL (TEERDS; RIJNTJES, 2007) Bode Sem efeito sobre a CL / Efeito negativo sobre o epitélio seminífero (ONYANGO; WANGO; WERNER, 2001) 156 Conclusão Com este estudo, concluímos que a exposição ao EDS pode surtir efeitos anti-fertilidade ou afetar parâmetros reprodutivos em vias de administração alternativas, como a intratesticular, pela inserção cirúrgica de implantes Silastic preenchidos com EDS, pela via subcutânea e pela via oral, embora efeitos colaterais tenham sido observados com relação ao ganho de peso e consumo alimentar na primeira semana após os tratamentos. Além disso, também é possível concluir que a infertilidade induzida pelo EDS pela via intratesticular tem caráter transitório, embora o tempo para reversão total do processo de reversão não tenha sido coberto pelo presente estudo. É importante ressaltar que a dose utilizada de EDS para indução de infertilidade também é um fator crucial para se entender a reversibilidade desse quadro. Com os estudos in vitro, concluímos que células de Leydig derivadas de rato, como a R2C, confirmam a ideia de maior susceptibilidade de ratos aos efeitos do EDS, embora as células derivadas de camundongo (MA-10) também apresentaram efeitos semelhantes. E ainda, podemos concluir que os efeitos citotóxicos do EDS incluem mecanismos relacionados à interferência a nível transcricional, afetando a atividade de promotores gênicos relacionados à atividade endócrina das células de Leydig. Adicionalmente, com a abordagem aqui chamada de “mundo real”, o EDS também exerce efeitos em parâmetros reprodutivos femininos, bem como pode afetar a reprodução de forma intergeracional, o que reforça a sua aplicabilidade para controle de taxas reprodutivas de roedores. Juntos, estes dados contribuem para o conhecimento sobre o mecanismo de ação do EDS nas células de Leydig, bem como comprovam seus efeitos anti-fertilidade por diferentes vias, podendo ser um possível candidato seguro, rápido, eficaz e reversível com efeitos contraceptivos em outras espécies sinantrópicas, errantes, selvagens, de estimação e de produção.