RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta tese será disponibilizado somente a partir de 08/04/2024. Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Instituto de Biociências Campus Botucatu Avaliação funcional das proteínas desacopladoras mitocondriais em Arabidopsis thaliana utilizando mutantes de inserção Rômulo Pedro Macêdo Lima . Botucatu – SP Março 2022 Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Instituto de Biociências Campus Botucatu Avaliação funcional das proteínas desacopladoras mitocondriais em Arabidopsis thaliana utilizando mutantes de inserção Rômulo Pedro Macêdo Lima Orientador/Supervisor: Dr. Ivan de Godoy Maia Tese apresentada ao Programa de Pós- graduação em Ciências Biológicas (Genética) do Instituto de Biociências de Botucatu, Universidade Estadual “Júlio de Mesquita Filho”, para obtenção do título de Doutor em Genética. Botucatu – SP Março 2022 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORM. DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CÂMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSANGELA APARECIDA LOBO-CRB 8/7500 Lima, Rômulo Pedro Macêdo. Avaliação funcional das proteínas desacopladoras mitocondriais em Arabidopsis thaliana utilizando mutantes de inserção / Rômulo Pedro Macêdo Lima. - Botucatu, 2022 Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", Instituto de Biociências de Botucatu Orientador: Ivan de Godoy Maia Capes: 20203004 1. Mutagênese insercional. 2. Expressão gênica. 3. Metaboloma. 4. Mitocôndrias. 5. Proteínas de desacoplamento mitocondrial. Palavras-chave: Duplo-mutante; Expressão gênica; Metaboloma; Mitocôndria; Proteína desacopladora. Agradecimentos À Deus, por minha vida, a de meus familiares e amigos. Ao meu orientador, Dr. Ivan de Godoy Maia, pela orientação, confiança, ensinamentos passados e imensurável contribuição neste trabalho. Aos colegas doutores Luís Fernando Rolim, Pedro Barreto e Douglas Domingues, pelas enormes contribuições e sugestões transmitidas no exame geral de qualificação. Aos amigos e colegas do Departamento de Ciências Químicas e Biológicas (Setor Genética), do Laboratório de Biotecnologia e Genética Molecular (BIOGEM), do Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Genética) e do Centro de Convivência Infantil (CCI) “Pertinho da Mamãe”, por todas as pessoas que passaram por mim e deixaram uma marca de aprendizado, incentivo e carinho aqui na cidade de Botucatu, em especial à Camila Baldin, Priscila Medeiros, Thársis Gabryel, Amanda Tanamachi, Erasmo Oliveira, Alessandra Nunes-Laitz, Cristiane Rosa, Ricardo Manoel, Maiara Cornacini, Marcelo Alcântara, Darlin Zaruma, Valdeir Carvalho, Rafael Mendonça, Carlos Barreira, dona Malvina, Zé, Simone Campos, Talita Aleixo, Rafael Nakajima, Bruna Jerônimo, Prof. Robson Carvalho, Jeferson Souza, Paula Freire, Sarah Cury, Silvana Melo e Vanessa Rafaela. Aos ex-colegas amigos e professores do Centro de Citricultura (CCSM) pelos anos de aprendizado e convivência, em especial ao Nicholas Vinícius, por todo conhecimento transmitido na parte de RNA-Seq e ciências “ômicas” da vida. A toda “galera da Bio”, amigos e professores da época de graduação na UESB, em especial ao professor Dr. Antonio Carlos de Oliveira, pelos encontros online durante esta pandemia e também nas idas para a Bahia, com conversas de motivação e descontração, obrigado mesmo por tudo, se hoje estou aqui vocês têm contribuído imensamente para esta formação. A todos os meus amigos da minha cidade natal (Poções-Bahia) e meus familiares da “Macedônia” e “Rocha Lima”, em especial a Wallas Meira e Lêda Cristina, conterrâneos e amigos queridos que carrego comigo aonde quer que eu vá. Aos amigos de Vitória da Conquista-Bahia, principalmente os familiares da minha esposa, em especial a minha sogra Eliane e meu sogro Gildásio, minhas cunhadas Elaine e Tamiris, minha sobrinha de coração Maria Fernanda, pelas palavras de incentivo, conforto e confiança, e a Aline (“Né”), por ter vindo com a gente para Botucatu e ter nos ajudado com os cuidados da minha filha Maria Liz logo no início do doutorado. A minha avó, Lacimi Caires, por todo amor e dedicação comigo, a minha mãe, Vanuza Macêdo, por todo suporte, paciência e amor incondicional transmitidos, e a meu pai (in memoriam), por sempre ter me dado forças e coragem para percorrer os obstáculos da vida. A minha família incrível que construí desde a Bahia com esta admirável e forte mulher, Jakeline Oliveira, que a cada devaneio e desânimo me fortaleceu com suas palavras de ajuda e força, pelas conversas sobre o meio acadêmico e também sobre genética. Você vai longe!!! A minha filhota linda e que sou completamente apaixonado, Maria Liz, muito obrigado pela ternura, amor e pelo conforto nos momentos mais difíceis. E a Kiara, nossa filhota felina que me acompanha desde o Mestrado, obrigado pelos inúmeros afagos e conforto durante esta caminhada. Amo vocês!!! Ao apoio financeiro essencial para a realização desta pesquisa, pela concessão das bolsas de estudo da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) – Código de financiamento 001, e da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), Processo nº 2018/19021-1. Obrigado!!! A todos que contribuíram de alguma forma para a realização deste trabalho. Epígrafe “Mas tu não deves esquecer. Tu te tornas eternamente responsável por aquilo que cativas.” Antonie de Saint-Exupéry Resumo As proteínas desacopladoras mitocondriais (UCPs) são proteínas especializadas no transporte mitocondrial capazes de dissipar o gradiente eletroquímico de prótons gerados na respiração independente da síntese de ATP. Essas proteínas fazem parte da família de carreadores aniônicos mitocondriais e desempenham um papel fundamental na manutenção da função mitocondrial. Em plantas, a importância das UCPs como componentes da tolerância celular ao estresse oxidativo já foi demonstrada em estudos prévios. Três genes codificando UCP já foram descritos em Arabidopsis thaliana (nomeados AtUCP1-3), sendo boa parte dos dados funcionais obtidos para a isoforma AtUCP1. Portanto, o papel desempenhado pelas demais isoformas é ainda pouco estudado. Diante disso, mutantes de inserção de arabidopsis foram empregados para investigar a existência de redundância funcional entre essas isoformas. Para tal, numa primeira abordagem, duplo-mutantes de inserção para diferentes combinações gênicas (atucp1/atucp2, atucp1/atucp3 e atucp2/atucp3) foram obtidos e analisados funcionalmente durante o desenvolvimento vegetativo e reprodutivo. Em uma segunda etapa foram empreendidas análises de metabólitos durante a fase vegetativa destes duplo-mutantes. Em paralelo, baseado em dados prévios da primeira abordagem que indicaram fenótipos mais evidentes na fase vegetativa do duplo-mutante atucp1/atucp3 em relação ao controle selvagem, o perfil global de expressão gênica deste duplo-mutante na fase vegetativa foi determinado usando RNA-Seq. Análises subsequentes de bioinformática com datasets encontrados na literatura foram empreendidas. Os dados obtidos na primeira etapa indicam que as três isoformas parecem atuar de forma complementar em diferentes processos associados ao crescimento e desenvolvimento de A. thaliana. As isoformas AtUCP1 e AtUCP2 atuariam de forma conjunta na manutenção da homeostase e função mitocondrial durante a fase reprodutiva. Por outro lado, as isoformas AtUCP2 e AtUCP3 teriam maior relevância funcional na atividade fotossintética, enquanto que a AtUCP1 atuaria na manutenção do aparato fotossintético. Além disso, as isoformas AtUCP2 e AtUCP3 atuariam em conjunto na manutenção do equilíbrio redox. Os dados indicam ainda que todas as três isoformas atuam em conjunto para a redução das espécies reativas de oxigênio (ERO) na mitocôndria. Cabe ressaltar que o duplo knockdown dos genes AtUCP1 e AtUCP3 foi o que promoveu as maiores alterações fenotípicas e de função mitocondrial na fase vegetativa. Curiosamente, uma maior atividade respiratória foi registrada no duplo-mutante atucp2/atucp3, o que pode ser justificado pela forte expressão compensatória do gene AtUCP1 sob condições normais. De maneira similar, uma forte expressão compensatória da isoforma não inativada foi detectada em todas as três combinações de duplo-mutantes crescidos em condições normais ou em presença de estresse (salino e osmótico), o sugerindo uma redundância parcial entre elas. As análises de metabólitos revelaram profundas alterações no teor de alguns metabólitos primários (açúcares, aminoácidos, ácidos orgânicos e componentes de ácidos nucléicos) e secundários nos três duplo- mutantes. Em consonância, diversos genes diferencialmente expressos associados ao cloroplasto, mitocôndria e à resposta aos estresses abióticos foram detectados no duplo-mutante atucp1/atucp3. As análises comparativas de RNA-Seq para validação com o dataset selecionado de A. thaliana tipo selvagem reforçam os impactos causados por toda a célula. Em conjunto, os resultados obtidos evidenciaram uma intensa reprogramação transcricional e metabólica em decorrência do duplo Knockdown de genes AtUCP1 and AtUCP3. As análises apontaram ainda para a existência de uma redundância funcional parcial entre as três isoformas, que atuariam ora de forma isolada, ora de maneira conjunta na manutenção da homeostase e função mitocondrial durante o crescimento e desenvolvimento de A. thaliana. Essas descobertas fornecem novos subsídios para fundamentar o papel desempenhado pelas diferentes isoformas e fornecem insights sobre a atuação in planta da isoforma AtUCP3 em associação com a AtUCP1. Palavras-chave: Proteína desacopladora, mitocôndria, duplo-mutante, expressão gênica e metaboloma. Abstract Mitochondrial uncoupling proteins (UCP) are specialized proteins involved in mitochondrial transport, which are able to dissipate the proton electrochemical gradient generated by respiration independent of ATP synthesis. These proteins belong to the mitochondrial anionic carrier family and play a key role in the maintenance of the mitochondrial function. In plants, their relevance as components of cell tolerance to oxidative stress has already been shown in previous studies. Three genes encoding UCP have been described in Arabidopsis thaliana (named AtUCP1-3), with most functional data being obtained for the AtUCP1 isoform. Therefore, the role played by the other isoforms is still poorly understood. In view of this, we decided to investigate the occurrence of functional redundancy between these isoforms using arabidopsis insertion mutants. For this, in a first approach, double-insertion mutants for different gene combinations (atucp1/atucp2, atucp1/atucp3 and atucp2/atucp3) were obtained and functionally analyzed during vegetative and reproductive development. In a second step, metabolome analysis was carried out during the vegetative phase of these double mutants. In parallel, based on previous data from the first approach indicating more evident phenotypes in the vegetative phase of the atucp1/atucp3 mutant compared with the wild-type (WT) control, the global gene expression profile of this double mutant in the vegetative phase was determined using RNA-Seq. Subsequent bioinformatics analyzes with datasets found in the literature were carried out. The data obtained in the first approach indicate that the three isoforms act in a complementary way in different processes associated with A. thaliana growth and development. The concerted action of the AtUCP1 and AtUCP2 isoforms seems to be required for maintaining homeostasis and mitochondrial function during the reproductive phase. On the other hand, our data suggest that the AtUCP2 and AtUCP3 isoforms have higher functional relevance in the photosynthetic activity, while AtUCP1 would act in favor of photosynthetic apparatus maintenance. In addition, a concerted action of the AtUCP2 and AtUCP3 isoforms seems to be required for maintaining the redox balance. All three isoforms are necessary to reduce reactive oxygen species (ROS) in mitochondria. Of note, the double knockdown of the AtUCP1 and AtUCP3 promoted the highest phenotypical changes and alterations in mitochondrial function in the vegetative phase. Interestingly, the atucp2/atucp3 mutant showed a higher respiratory activity, which can be explained by the strong compensatory expression of AtUCP1 under normal conditions. Similarly, a strong compensatory expression of the non-inactivated isoform was detected in all three double mutants grown under normal and stressed conditions (saline and osmotic), thus suggesting a partial redundancy between the isoforms. Additionally, the metabolome analysis revealed profound changes in the content of some primary (sugars, amino acids, organic acids and nucleic acid components) and secondary metabolites in all three double mutants. Accordingly, several differentially expressed genes associated with chloroplast, mitochondria and response to abiotic stresses were detected in atucp1/atucp3 double mutant plants. Comparative analysis of RNA-Seq for validation with the selected dataset of wild-type A. thaliana reinforce the impacts caused throughout the cell. Overall, these results indicate that an intense transcriptional and metabolic reprogramming occurs as a consequence of the double knockdown of AtUCP1 and AtUCP3 genes. Our data revealed the existence of a partial functional redundancy between the three isoforms, which would act either alone or in a concerted way for the maintenance of homeostasis and mitochondrial function during A. thaliana growth and development. These findings provide clues for the functionality of different AtUCP isoforms and give insights for the role played by the AtUCP3 isoform in association with AtUCP1 in the entire plant level. Keywords: Uncoupling protein, mitochondria, double mutant, gene expression and metabolome. Avaliação funcional das proteínas desacopladoras mitocondriais em Arabidopsis thaliana utilizando mutantes de inserção Rômulo Pedro Macêdo Lima Orientador: Dr. Ivan de Godoy Maia Sumário Introdução geral e justificativa .................................................................................................... 11 Objetivos ........................................................................................................................................... 19 Referências bibliográficas ............................................................................................................ 20 Capítulo I: The Double Knockdown of the Mitochondrial Uncoupling Protein Isoforms Reveals Partial Redundant Roles During Arabidopsis thaliana Vegetative and Reproductive Development ...................................................................................................................................... 23 Capítulo II: Effects of Mitochondrial Disturbances on Transcriptional and Metabolite Profiles of Arabidopsis ucp double mutant plants ....................................................................................... 60 Considerações Finais................................................................................................................... 171 19 Objetivos Objetivo geral O presente estudo teve por principal objetivo empreender a caracterização funcional de duplo-mutantes de inserção em diferentes combinações gênicas visando um melhor entendimento do papel funcional das isoformas AtUCP1-3 em arabidopsis. Objetivos específicos Na tentativa de elucidar o papel das UCPs no desenvolvimento vegetativo e reprodutivo, os seguintes objetivos específicos foram propostos: 1. Empreender a obtenção dos duplo-mutantes atucp1 atucp2; atucp1 atucp3 e atucp2 atucp3 e avaliar o fenótipo dos mesmos em condições normais e sob estresse; 2. Avaliar as alterações fisiológicas, de estado redox e metabólicas dos referidos duplo-mutantes de inserção; 3. Avaliar o grau de redundância funcional nos duplo-mutantes a partir de alterações no nível de expressão dos genes AtUCP1-3 em condições normais e sob estresse; 4. Avaliar as alterações transcricionais em duplo-mutantes, selecionados com base nas análises fenotípicas a partir de estágios específicos do desenvolvimento vegetativo em A. thaliana, usando a técnica de RNA-Seq e análises de bioinformática; 5. Avaliar o perfil de metabólitos dos duplo-mutantes durante a fase vegetativa. 20 Referências bibliográficas ALMEIDA, A.M.; JARMUSZKIEWICZ, W.; KHOMSI, H.; ARRUDA, P.; VERCESI, A.E.; SLUSE, F.E. Cyanide-resistant, ATP-synthesis-sustained, and uncoupling- protein-sustained respiration during postharvest ripening of tomato fruit. Plant Physiol., v.119, p.1323-1329, 1999. ARCURI, M.L.C.; NUNES-LAITZ, A.V.; LIMA, R.P.M.; BARRETO, P.; MARINHO, A.N.; ARRUDA, P.; MAIA, I.G. The Knockdown of Mitochondrial Uncoupling Proteins 1 and 2 (AtUCP1 and 2) in Arabidopsis thaliana Impacts Vegetative Development and Fertility. Plant Cell and Physiol., v.00, p.1-15, 2021. BARRETO, P.; DAMBIRE, C.; SHARMA, G.; VICENTE, J.; OSBORNE, R.; YASSITEPE, J.; GIBBS, D.J.; MAIA, I.G.; HOLDSWORTH, M.J.; ARRUDA, P. Mitochondrial retrograde signaling through UCP1-mediated inhibition of the plant oxygen-sensing pathway. Curr. Biol., v.32, p.1-9, 2022. BARRETO, P.; OKURA, V.; PENA, I.A.; MAIA, R.; MAIA, I.G.; ARRUDA, P. 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Diversos dos genes desregulados estão associados a vários compartimentos, processos e mecanismos internos por toda a célula, a exemplo de transcritos de genes mitocondriais, de cloroplastos, responsivos a estresses abióticos, bem como aqueles relacionados ao metabolismo de DNA e energético. Em concordância com as análises do transcriptoma de plantas ucp1 ucp3, as análises do metaboloma de plantas atucp duplamente mutantes revelaram distúrbios tanto no metabolismo primário, com mudanças importantes nas concentrações de aminoácidos, ácidos orgânicos, açúcares e componentes de ácidos nucléicos, quanto no secundário, com alterações de metabólitos vinculados às classes dos flavonoides, terpenos e alcaloides. Portanto, um importante ajuste metabólico se faz necessário para compensar a expressão reduzida dos genes AtUCP1-3. Os dados apresentados, além de fornecer subsídios importantes para melhor compreender as respectivas funções em plantas das referidas proteínas, poderão ser empregados em aplicações futuras visando a aquisição de tolerância a estresses. 060ac4b10348666fa89dc1302c6e60f8551531ba87c94048a39505e715361402.pdf ce51c7e5e8849001475746a929289f87e60260ce05997c6160d74dec6b88117c.pdf 10f9e8cbde6b726050212e1f71c488b0161a5baf20ac97cb878cd4ebc8981653.pdf 060ac4b10348666fa89dc1302c6e60f8551531ba87c94048a39505e715361402.pdf