Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca do IBILCE Campus de São José do Rio Preto - UNESP Lopes Filho, Fernando César. Simulações por dinâmica molecular fine- e coarse-grained das interações intermoleculares entre peptídeos antimicrobianos da família Mastoparano e membranas modelo / Fernando César Lopes Filho. – São José do Rio Preto : [s.n.], 2012. 98 f. : il. ; 30 cm. Orientador: José Roberto Ruggiero Tese (doutorado)-Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas 1. Biologia molecular. 2. Biofísica. 3. Dinâmica molecular. 4. Peptídeos antimicrobianos. I. Ruggiero, José Roberto. II. Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas. III. Título. CDU - 577.32 FERNANDO CÉSAR LOPES FILHO Simulações por Dinâmica Molecular fine- e coarse-grained das interações intermoleculares entre peptídeos antimicrobianos da família Mastoparano e membranas modelo Tese apresentada para obtenção do título de Doutor em Biofísica Molecular, junto ao Programa de Pós-Graduação em Biofísica Molecular do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto. BANCA EXAMINADORA Prof. Dr. José Roberto Ruggiero Professor Adjunto UNESP – São José do Rio Preto Orientador Prof. Dr. Pedro Geraldo Pascutti Professor Assistente Doutor Universidade Federal do Rio de Janeiro Prof. Dr. José Maria Pires Professor Associado Universidade Federal do Espírito Santo Prof. Dr. Alexandre Suman de Araújo Professor Assistente Doutor UNESP – São José do Rio Preto Profa Dra. Sabrina Thais Broggio Costa Professor Associado FATEC - Taquaritinga São José do Rio Preto, 06 de julho de 2012. O que faz que os homens formem um povo é a lembrança das grandes coisas que fizeram juntos e a vontade de realizar outras. Ernest Renan À minha mãe, Liliana e ao meu irmão, Fabrício. AGRADECIMENTOS A minha gratidão a todos que deram a sua contribuição para que esta Tese fosse produzida. Tautologias e truísmos à parte, o desenvolvimento desta Tese não seria possível sem o auxílio e orientação do Prof. Dr. José Roberto Ruggiero, por isso, eu o agradeço sinceramente. Suas palavras forneceram críticas, conhecimentos e conselhos que foram úteis em situações que vão bem além deste trabalho. Ainda, é pertinente repetir um pensamento de William Shakespeare que dediquei a você em minha Dissertação de Mestrado: "A aprendizagem é um simples apêndice de nós mesmos; onde quer que estejamos, está também nossa aprendizagem". Onde quer que eu esteja, estará também seus ensinamentos, caro Professor. Agradeço aos Profs Drs Pedro Geraldo Pascutti, José Maria Pires, Alexandre Suman de Araújo e Sabrina Thais Broggio Costa pela correção e avaliação desta Tese. Por oportuno, agradeço aos Profs Drs Alexandre Suman de Araújo e Jorge Chahine pela leitura crítica de minha monografia e sugestões feitas durante o Exame Geral de Qualificação. Agradeço aos Profs Drs Jorge Chahine, Elso Drigo Filho e Marinônio Lopes Cornélio, pois, como Coordenadores do Programa de Pós-Graduação em Biofísica Molecular, prestaram relevantes serviços para a manutenção da qualidade do Programa e, dessa forma, tornaram possível a realização de meus trabalhos no Departamento de Física ao longo dos meus cursos de mestrado e doutorado. Pelo mesmo motivo, não poderia deixar de agradecer à totalidade do Corpo Docente. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq - pela bolsa concedida e à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP - pelos recursos que viabilizaram a aquisição de equipamentos. LISTA DE FIGURAS Figura 1. Formação de poro por peptídeos antimicrobianos....................................................... 15 Figura 2. Representação gráfica do peptídeo MP1..................................................................... 24 Figura 3. Representação gráfica dos lipídeos POPG e POPC..................................................... 26 IV. 1 Figure 1. Final configuration obtained after 250 ns of simulation………….................. 46 Figure 2. Radial distribution functions (RDF) of all lipid oxygen atoms around the cationic groups of the peptide (charges of the N-terminal and side-chains of the lysines 4, 5 and 11)………………………………………………………. 47 Figure 3. Projections of peptide MP1 obtained from the simulations…………………. 48 Figure 4. Analysis of the secondary structure of the peptide in time for the A) POPC and B) POPG simulations……………………………………………………. 49 Figure 5. Lipid order parameters as a function of the distance from the peptide’s center of mass for the POPG simulation…………………………………….. 50 Figure 6. Electron density of the phosphorous atoms as a function of the distance from the center of the membrane (x=0)……………………………………… 51 IV. 1 Material Suplementar Fig. S1. POPG membrane formation process………………………………………… 58 Fig. S2. Number of lipids bound to zero, one, two and three ions as a function of time…………………………………………………………………………... 59 Fig. S3. Area per lipid as a function of time for the POPG bilayer............................... 60 Fig. S4. Lipid order parameters as a function of the distance from the peptide’s center of mass for the POPC simulation……………………………………... 61 Fig. S5. Electron density of the phosphorous atoms as a function of the distance from the center of the POPC membrane (x=0)………………………………. 62 IV. 2 Figura 1. Configurações instantâneas......................................................................................... 84 Figura 2. Distribuições radiais de pares dos beads PO4 (“grupo fosfato”) em torno dos resíduos básicos dos peptídeos.................................................................................... 85 Figura 3. Densidades de massa como função do raio tomado no eixo z normal ao plano da membrana........................................................................................... 86 Figura 4. Parâmetros de ordem das cadeias hidrofóbicas dos lipídeos como função da distância do centro de massa do poro.......................................................................... 87 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Parâmetros de LJ e Coulomb presentes no campo de forças Berger para simular lipídeos................................................................................................. 22 IV. 1 Table 1 List of the simulations…………………………………………..…………… 45 IV. 2 Tabela 1. Características da estrutura primária dos peptídeos alvo deste estudo............. 81 Tabela 2. Lista das simulações......................................................................................... 82 Tabela 3. Valores de energias das interações peptídeo-peptídeo e peptídeo-membrana.. 83 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS PAMs Peptídeos antimicrobianos P/L Concentração peptídeo/lipídeo PC Fosfatidilcolina SM Esfingomielina PE Fosfatidiletanolamina PG Fosfatidilglicerol PS Fosfatidilserina CL Cardiolipina POPG palmitoyl-oleoyl-phosphatidylglycerol POPC palmitoyl-oleoyl-phosphatidylcholine LJ Potencial de Lennard-Jones FFT Transformação rápida de Fourier SCD Parâmetro de ordem do deutério DMPC/DMPG Dilauroil-fosfatidilcolina/dilauroil-fosfatidilglicerol RDF Função de Distribuição Radial TFE Trifluoroetanol NMR Ressonância Magnética Nuclear DOPC Dioleoil-fosfatidilcolina DOPG Dioleoil-fosfatidilglicerol DPPC Dipalmitoil-fosfatidilcolina PME Particle-Mesh Ewald RESUMO Peptídeos antimicrobianos são moléculas biologicamente ativas que, geralmente, tem as membranas fosfolipídicas como alvo primário. Resultados de diferentes técnicas experimentais têm sugerido que esses peptídeos permeabilizam as membranas pela formação de poros. Parte dos peptídeos caracterizados apresentam especificidade de disrupção para membranas de bactérias, em detrimento das membranas dos hospedeiros. Essa característica tem atraído a atenção da comunidade científica internacional, porque indica que estas moléculas podem ser modelos para o desenvolvimento de novos antibióticos, portanto o entendimento do mecanismo de ação, ou seja, do mecanismo de formação de poro, tem extrema importância. Simulações por Dinâmica Molecular foram produzidas para investigarmos o impacto que peptídeos antimicrobianos da família Mastoparano tem sobre membranas lipídicas modelo. Dois cenários foram explorados: (i) de baixa concentração peptídeo/lipídeo, P/L=1/128, que consistia de simulações fine-grained das interações de um peptídeo com uma bicamada pura de 128 lipídeos aniônicos (POPG) ou zwiteriônicos (POPC); (ii) de alta concentração, P/L=1/21, que abordava as interações de seis peptídeos com uma bicamada mista de 128 lipídeos POPC/POPG (1/1) usando uma modelagem coarse- grained. Tomando o peptídeo MP1 como caso paradigmático, verificamos que em baixo P/L é possível sugerir que sua característica seletiva surge da capacidade de coordenar e perturbar maior número de lipídeos em membrana aniônica comparada à neutra. Essa capacidade fica acentuada nas simulações com membrana mista, onde a atração dos lipídeos aniônicos pelos peptídeos catiônicos guiou a separação local e a formação de domínios de lipídeos aniônicos, o que facilitou o afinamento local da membrana e a formação de poro transmembrânico. Esses achados ajudam a explicar como peptídeos curtos, tal como o MP1, são capazes de formar poro em uma membrana cuja espessura é maior que o comprimento do peptídeo. Palavras-chave: peptídeos antimicrobianos catiônicos; membranas aniônicas; interações peptídeo-membrana; mastoparano; seletividade; simulações por dinâmica molecular. ABSTRACT Antimicrobial peptides are biologically active molecules that, usually, have the phospholipid membranes as a primary target. Results from different experimental techniques have suggested these peptides permeabilize membranes by the pore formation. Part of the characterized peptides have specificity of disruption for bacterial membranes, instead of host membrane. This feature has attracted the attention of the international scientific community, because it indicates that these molecules can be models for the development of novel antibiotics, so understanding the mechanism of action, ie, the mechanism of pore formation, is extremely important. Molecular dynamics simulations were performed to investigate the impact of antimicrobial peptides from the Mastoparano family have on model lipid membranes. Two scenarios were explored: (i) of low peptide/lipid concentration, P/L=1/128, which consisted of fine-grained simulations of the interactions of a peptide with a pure bilayer of 128 anionic (POPG) or zwitterionic (POPC) lipids; (ii) of high concentration, P/L=1/21, which addressed the interactions of six peptides with a mixed bilayer of 128 POPC/POPG (1/1) lipids, using a coarse-grained modeling. Taking the MP1 peptide as a paradigmatic case, we found that in low P/L is possible to suggest that its selective feature arises of its ability to coordinate and disturb large number of lipids in the anionic membrane compared to neutral one. This ability is accentuated in simulations with mixed membrane, where the attraction of the anionic lipids by the cationic peptides led to the local segregation and formation of POPG lipid domains, which facilitated the local thinning of the membrane and the formation of transmembrane pore. These findings help to explain how short peptides, such as MP1, are able of forming pores in a membrane whose thickness is larger than the length of the peptide. Keywords: cationic antimicrobial peptides; anionic membranes; peptide-membrane interactions; mastoparan; selectivity; molecular dynamics simulations. SUMÁRIO I. Introdução 13 Peptídeos antimicrobianos 13 Mecanismo de ação de peptídeos antimicrobianos: formação de poro 13 Seletividade de peptídeos antimicrobianos 15 II. Objetivos 18 III. Métodos 20 Simulações por Dinâmica Molecular 20 IV. Resultados e Discussão IV. 1 Selectivity and Membrane Thinning as the Effects of Interaction Between the Antimicrobial Mastoparan Peptide Polybia-MP1 and Phosphatidylglycerol or Phosphatidylcholine membranes 35 IV. 2 Indução de separação local de lipídeos por peptídeos antimicrobianos catiônicos em membranas compostas por lipídeos zwiteriônicos e aniônicos facilita a formação de defeitos e poros transmembrânicos 65 V. Conclusões 93 VI. Referências 95 13 I. Introdução O uso descontrolado ao lado do reduzido número de descobertas de novos antibióticos nas últimas décadas tem escancarado um sério problema que tem de ser enfrentado no século XXI, que é o aumento dramático do número de bactérias resistentes às multidrogas. "A crônica de um problema anunciado" vem desde o fim da II Guerra Mundial, quando Sir Alexander Fleming já alertava que o uso desapropriado da penicilina pressionaria a seleção de formas mutantes de Staphylococcus aureus. Poucos anos depois, estava confirmado: 50% das cepas eram resistentes àquela nova droga (Alanis 2005). Peptídeos antimicrobianos (PAMs) surgem como uma terapia alternativa para o combate de infecções bacterianas, pois como constituintes do sistema imune de vegetais e animais evoluíram mantendo características de cationicidade e de ação independente de receptor, o que torna as suas interações com membranas aniônicas de bactérias de uma natureza biofísica tão fundamental que parece muito difícil estas desenvolverem alguma resistência (Yeaman e Yount 2003; Papo e Shai 2003; Papo e Shai 2005; Brogden 2005). Peptídeos antimicrobianos Peptídeos antimicrobianos têm um grande espectro de alvos; em adição à ação antibiótica, esses peptídeos atacam vírus, fungos e células cancerosas. Portanto, drogas desenhadas para imitar PAMs teriam um grande número de aplicações médicas. PAMs pertencem à primeira linha de defesa do sistema imune inato e combatem micróbios por onde tentam entrar: pela pele, tecidos mucosos e outras superfícies. Essas moléculas podem ser encontradas em plantas, mamíferos, insetos e anfíbios. Alguns dos peptídeos mais estudados são: protegrins, extraídos de porcos; magaininas, sapos; indolicidins, bovinos; defensins, humanos; mastoparanos, vespas. Seus alvos primários são as membranas plasmáticas de micróbios (Zasloff 2002). Esses peptídeos matam micróbios por induzirem seletiva atividade lítica em membranas, portanto aumentando a permeabilidade membranar para íons ou moléculas maiores sem afetar a célula hospedeira (Ludtke et al. 1996). Peptídeos antimicrobianos são anfipáticos e contém resíduos carregados, tais como lisinas e argininas. Além destas características comuns, estas moléculas bioativas apresentam grande diversidade 14 em suas sequências (tipicamente de 10 a 40 resíduos de comprimento) e estruturas (hélice- , folha- e lineares), entretanto, ainda assim, exibem funções líticas similares. Mecanismo de ação de peptídeos antimicrobianos: formação de poro Enquanto muitos novos peptídeos têm sido identificados e caracterizados físico- quimicamente, ainda existe um grande quebra-cabeça de como esses peptídeos matam bactérias e outros micróbios. Ao contrário de antibióticos convencionais que inibem proteínas específicas em bactérias, PAMs atacam os invasores causando vazamento em suas membranas (Wade et al. 1990; Dathe et al. 1996). Muitos experimentos com membranas modelo têm mostrado um aumento na condutância voltaica através de membranas planas e vazamento de íons em vesículas (Dos Santos Cabrera et al. 2008a) quando peptídeos estão incubados com a membrana ou vesícula. Logo, tem sido proposto que o efeito lítico de PAMs está na sua habilidade de induzir poros em membranas (Zasloff 2002). De qualquer modo, observações diretas de poros em membranas permanecem como um desafio, e o mecanismo físico de como peptídeos antimicrobianos induzem a disrupção em membranas ainda é pouco claro. Para explicar isso, três mecanismos de disrupção de membranas tem sido sugeridos: barril, carpete e toroidal (Figura 1) (Bechinger 2004; Bechinger e Lohner 2006). De acordo com o modelo barril, peptídeos ligam-se à membrana, reconhecem-se, oligomerizam e inserem-se na região hidrofóbica da membrana formando um poro transmembrânico. A orientação dos peptídeos permite que a superfície hidrofóbica dos peptídeos fique em contato com a matriz hidrofóbica da membrana, enquanto a hidrofílica permanece voltada para o interior estruturando um poro hidrofílico. O modelo de poro toroidal sugere que peptídeos antimicrobianos inicialmente ligam-se à superfície da membrana alvo. A interação eletrostática entre o peptídeo e as cabeças polares dos lipídeos impõe tensão na membrana e a permeação é induzida localmente onde a concentração de peptídeos é mais alta que a concentração peptídeo/lipídeo (P/L) crítica típica da membrana. O poro transmembrânico formado a partir da transição de parte dos peptídeos da orientação paralela para a transmembrânica induz uma mudança de orientação dos lipídeos vizinhos, caracterizando uma estrutura de topologia toroidal. Similarmente, no modelo carpete, os peptídeos ligam-se e interagem com as cabeças lipídicas impondo uma tensão de curvatura na membrana, e a acumulação de peptídeos acima da concentração P/L crítica induz a quebra da membrana em Figura 1. Formação de poro poro toroidal e C) modelo ca Bechinger 2004. pedaços, um efeito da mic grandes canais. Huang (2000) propô (S) e um estado inserido (I no estado S, mas acima d quando o peptídeo está no estado I, os peptídeos estão inserção de peptídeos pode está na orientação dos lipíd poro é formado. Uma mud sugerir a formação de poro Seletividade de peptídeos a Uma característica distinguir células procariót por peptídeos antimicrobianos. A) modelo de po arpete de disrupção de membranas. Representaçã celização de lipídeos e peptídeos, o que ac ôs um modelo de dois estados que compreen ). É pensado que primeiro o peptídeo se ass e um certa concentração P/L, ocorre o vaza estado I. Dados de dicroísmo circular orienta o orientados perpendicularmente à bicamada ( e ser encontrada nos modelos barril e toroid deos. No modelo barril, os lipídeos não são dança na orientação lipídica quando o peptíd toroidal. antimicrobianos intrigante de peptídeos antimicrobianos ticas de eucarióticas. Embora existam model 15 oro barril; B) modelo de ão gráfica modificada de carreta a formação de nde o estado adsorvido socia com a membrana amento da membrana, ado mostram que neste (Huang e Wu 1991). A dal. A maior diferença perturbados quando o deo está inserido pode é sua habilidade de los que indicam como 16 os peptídeos atuam, a origem da seletividade para a disrupção de membranas ainda não é compreendida. A interação do peptídeo MP1 com vesículas PC (fosfatidilcolina) pura e PCC (PC-Colesterol 80:20) rendem P/L críticos de 1/67 e 1/31, respectivamente (Dos Santos Cabrera et al. 2008b), mostra como as diferenças na composição de vesículas influenciam a afinidade exibida pelo peptídeo antimicrobiano, o que indica que a composição de membranas deve ser considerada para o estudo da afinidade que PAMs têm por micróbios em detrimento das células hospedeiras. A monocamada externa de membranas celulares de mamíferos são compostas principalmente de fosfatidilcolinas (PC), esfingomielinas (SM), fosfatidil- etanolaminas (PE) e esteróis (tal como colesterol) que são eletricamente neutros em pH fisiológico (Han e Gross 2005). Em contraste, membranas de bactérias incluem quantidade substancial de fosfolipídeos negativamente carregados, tais como fosfatidilgliceróis (PG) e cardiolipinas (CL) (Murzyn et al. 2005). Além disso, em bactérias Gram-negativas, a monocamada externa é composta principalmente de lipopolissacarídeos, que é uma molécula polianiônica. A seletividade usualmente tem sido atribuída às cabeças polares, onde os lipídeos aniônicos seriam mais suscetíveis a ação de peptídeos catiônicos. A importância das interações eletrostáticas entre PAMs e lipídeos carregados tem sido demonstrado por meio de ensaios com magaininas mutantes e selvagens aos quais o aumento de atividade foi encontrado nos peptídeos modificados que tinham mais cargas positivas (Matsuzaki et al. 1997). Não obstante, interações eletrostáticas não constituem o único fator determinante que dita a seletividade de PAMs, como sugerido por Dos Santos Cabrera (2008b). Estes autores notaram que a curvatura característica da membrana tem um papel na sua permeabilização, pois a despeito de vesículas PCCL (PC-Cardiolipina 70:30) e PCPG (70:30) apresentarem a mesma densidade de cargas, os espectros de CD mostraram uma helicidade aumentada dos peptídeos em contato com vesículas PCCL, além de ser necessário quatro vezes mais peptídeo para ser alcançado a concentração P/L crítica comparado com a vesícula PCPG. 18 II. Objetivos Para investigar o impacto que peptídeos mastoparanos tem sobre membranas lipídicas modelo, produzimos simulações por Dinâmica Molecular com os objetivos específicos de: 1) investigar o papel que as interações eletrostáticas tem para a seletividade do peptídeo MP1, a partir da análise da perturbação e sua extensão causada por este peptídeo sobre membranas modelo aniônica POPG e neutra POPC e correlacioná-las com as interações intramoleculares no seu N-terminal; 2) caracterizar o efeito de separação local de fase lipídica induzida por peptídeos com diferentes números de lisinas representados pelo MP1 (+2), seu análogo N2-MP1 (+3), MK-578 (+4) e MP-B (+5); investigar os estados que os peptídeos estudados adotam ao longo das simulações, bem como avaliar como aquele efeito interfere na formação de poro transmembrânico. Os objetivos foram distribuídos de forma que os resultados e discussões subsequentes pudessem ser organizados em capítulos distintos. Os dois objetivos elencados estão apresentados respectivamente nos capítulos IV.1 e IV.2. Após algumas correções pertinentes, ambos os capítulos serão submetidos à publicação. 20 III. Métodos Simulações por Dinâmica Molecular A aproximação de Born-Oppenheimer Uma completa descrição mecânica-quântica de um átomo é feita pela hamiltoniana tendo onde H contém os operadores para a energia cinética de elétrons (massa m) e núcleos (massa MN), e para as interações elétron-elétron, elétron-núcleo e interações entre núcleos. A solução para este problema de N-corpos é transformá-lo em um problema de 2-corpos por meio da aproximação de Born-Oppenheimer. Muito simplificadamente, a dedução surge de uma constatação: sendo MN >> me (por ex., a massa do núcleo de hidrogênio é 1836 vezes maior que a do elétron), temos que , logo é considerado que os elétrons interagem com o núcleo como se este estivesse espacialmente inerte relativamente a aqueles, portanto os graus de liberdade eletrônicos se ajustariam instantaneamente a uma variação de configuração nuclear. Isso permite o desacoplamento dos movimentos eletrônico e nuclear. Assim temos a função de onda dos elétrons para posições nucleares fixas, : sendo , tendo tomado . Note que é o auto-valor de energia dos elétrons se movendo no potencial advindo de núcleos fixos e está em função de R (posições nucleares). Com os núcleos em movimento, podemos considerar: onde é a repulsão de Coulomb internuclear. A função de onda nuclear considera, por via reflexa, que núcleos interagem com elétrons por meio de um potencial de campo médio, sob esse entendimento, o núcleo interagiria com uma nuvem eletrônica e se moveria no potencial efetivo : (1) 21 onde ET é a energia total do átomo. Essa é a equação de Born-Oppenheimer. Como quase toda a massa do átomo está concentrada no núcleo, essa equação de Schrödinger efetiva do núcleo determina a posição do átomo como um todo. Dinâmica Molecular Clássica A equação de Born-Oppenheimer (Eq. 1) permite que os graus de liberdade eletrônicos possam ser embutidos em um potencial efetivo e a dinâmica dos átomos pode ser reduzida para a dinâmica clássica do núcleo neste potencial. Então, um sistema de N partículas pode ser descrito pela Hamiltoniana clássica: (2) com massas mi, posições xi(t) e momentos pi. U é escolhido tal que U(x1,...,xN) . A formulação Newtoniana da equação acima dá as equações de movimento de Newton: (3) onde é a aceleração. A força na i-ésima partícula é derivada do potencial U, (4) que depende das posições de todas as N partículas. Uma trajetória de dinâmica molecular clássica xN(t) (x1(t),..., xN(t)) é obtida integrando a eq. (3) com (4). A parametrização de U é chamada campo de forças. As deduções, equações e conceitos oriundos da Mecânica-Quântica apresentados foram baseados no estudo das seguintes fontes (entre outras) e das quais podem ser obtidos mais detalhes: Tully (2000), Doltsinis (2006) e Leach (2001). Descrição das moléculas: função potencial A função potencial U({xj}) deveria, a princípio, ser um potencial de muitos corpos, porém sua forma geral é uma versão simplificada criada a partir da adição de potenciais de pares para interações entre átomos não-ligados covalentemente e potenciais de interação de 2, 3 e 4-corpos para descrever interações entre átomos ligados. Uma forma tipicamente encontrada é (usada no GROMOS-96 e Martini): U=UNB+UB (5) onde no primeiro termo temos: 22 (6) onde , é a distância na qual o potencial de LJ vai a zero e a energia é a profundidade do poço em uma separação de equilíbrio 21/6 . é a constante dielétrica relativa. No nível clássico de descrição, os átomos não-ligados interagem via potencial eletrostático (Coulomb) e Van der Waals. O potencial de LJ foi usado para descrever as interações de VdW, pois além de considerar a atração dipolo induzido-dipolo induzido entre dois átomos neutros por meio de um termo atrativo , ainda embuti princípios oriundos da mecânica-quântica, tal como o princípio de exclusão de Pauli (Leach 2001). O efeito da exclusão entre elétrons de valência de dois átomos a uma distância é modelado por um potencial repulsivo de curto alcance . No segundo termo da Eq. 5 temos: (7) onde: Ub é o potencial harmônico que representa ligações covalentes, tendo como a distância de equilíbrio; Ua, o potencial angular que incorpora vibrações angulares harmônicas, sendo o ângulo de equilíbrio e . O campo de forças GROMOS-87 foi modelado usando um potencial harmônico mais simples: . Ud, potencial diedral, descreve as vibrações torsionais entre os planos e , onde , tal que , quando e estão na conformação cis e é o parâmetro que limita a torsão e é usado para para restringir a estrutura secundária do backbone de proteínas; Udi é o potencial usado para manter anéis aromáticos e a estrutura C CONHC planos, é o ângulo de equilíbrio; Kb, Ka, Kd, Kdi: são constantes de força. Uma outra forma para o potencial diedral é a função de Ryckaert-Bellemans, geralmente empregada em alcanos: . (8) 23 Campo de forças A função potencial (Eq. 5) requer um grande número de parâmetros para cargas parciais, Lennard Jones, valores de equilíbrio para ligações químicas, ângulos, diedrais e constantes de força. Muitos desses valores são obtidos experimentalmente ou por cálculos de mecânica-quântica. Em uma simulação, o conjunto de parâmetros escolhidos para proteínas, lipídeos, água e íons devem ser compatíveis e cuidado deve ser tomado quando se combina diferentes conjuntos de parâmetros. Proteínas Um dos campos de forças usado para descrever as interações de peptídeos foi o GROMOS-87 (van Gunsteren e Berendsen 1987). Este é um campo de forças átomo-unido, isto é, trata os átomos de hidrogênio não-polares como parte de um átomo maior; hidrogênios em anéis aromáticos e hidrogênios polares são tratados explicitamente. Nesse padrão de representação cada peptídeo MP1 foi modelado com 152 átomos (Figura 2A). GROMOS-87 usa os potenciais descritos acima (Eq. 6 e 7) e é otimizado com modelo de água SPC. O segundo campo de forças usado foi o MARTINI com parâmetros para proteínas (Monticelli et al. 2008). Este campo é baseado na filosofia de moléculas coarse-grained (granuladas) e segue um mapeamento 4:1, isso significa que quatro átomos pesados são representados por um simples sítio de interação, com exceção dos anéis aromáticos, pois seguem o mapeamento 2:1 e 3:1 para preservar suas especificidades. Na representação granulada, os peptídeos tinham 31-35 sítios (Figura 2B). Nesse campo de forças são consideradas apenas quatro principais tipos de sítios de interação: carregado (Q), polar (P), não-polar (N) e apolar (C). Para representar de maneira mais acurada a natureza química das estruturas atômicas correspondentes no mapeamento, tais subtipos também são considerados: i) com capacidade de ligação de hidrogênio: d (doador), a (aceitador), da (doador-aceitador) e 0 (nenhuma); ii) de 1 (baixa polaridade) até 5 (alta polaridade); todas as combinações (P1,...,P5, C1,...,C5, N0,Na,Nd,Nda, Q0,Qa,Qd,Qda) rendem 18 diferentes tipos de sítio de interação, portanto a matriz de interação tem 18x18 diferentes combinações. O potencial de LJ é o mesmo que o descrito na Eq. 6 (1º termo), exceto a aplicação de uma função shift que suaviza a convergência da energia a zero entre =0,9 e =1,2 nm, para que sejam evitados efeitos de raio de corte em . A cada par de sítios são assinalados, portanto, dois as combinações, exceto pa (hidrofóbicos), para os qu para interações entre sítios para interações entre grupo (2007). Do lado eletrostáti carga na representação fina que a soma é um número potencial de Coulomb, res adiante em Água e íons. Lipídeos Nas simulações fine (1997) que é baseado nos campo de forças átomo-un POPC é reduzido de 130 p campo de forças de Berger diedrais impróprios para o Figura 2. Re peptídeo MP1 grained de 15 grained de 32 parâmetros: e . A distância atribuída foi ara aquelas que envolvem sítios do tipo Q ais =0,62 nm. Para temos uma variação s polares e apolares imitando o efeito hidrof os carregados. A matriz completa é encontr co, a modelagem granulada transformou o q a, cujos átomos constituintes tinham assinalad inteiro, em um único sítio de carga 0, 1 o sta determinar a constante dielétrica relativ e-grained de lipídeos, usamos o campo de f campos de forças OPLS e GROMOS-87. A nido; nessa representação, o número de áto para 52 átomos, comparado a um modelo all- r emprega os parâmetros de ligações químic os átomos da região da cabeça polar obtidos 24 epresentação gráfica do 1. A) modelagem fine- 52 átomos; B) coarse- sítios. de 0,47 nm para todas Q (carregado) e C1/C2 que vai de 2,0 kJ/mol fóbico, até 5,6 kJ/mol ada em Marrink et al. que seria um grupo de das cargas parciais, tal ou -1. Concernente ao va, que será discutida forças de Berger et al. Aquele também é um omos em cada lipídeo -atoms (Figura 3A). O as, ângulos, diedrais e do GROMOS-87. Os 25 Tabela 1. Parâmetros de LJ e Coulomb presentes no campo de forças Berger para simular lipídeos. átomo Berger atomtype (nm) (kJ/mol) q/e1 N LNL 0,325 0,7113 -0,5 P LP 0,374 0,8368 1,7 O LO 0,296 0,8786 -0,6/-0,7 O LOM 0,296 0,8786 -0,8 O LOS 0,3 0,87914 -0,7/-0,8 C LC 0,375 0,4393 0,7/0,8 CH LH1 0,38 0,3347 0/0,3 CH2 LH2 0,3905 0,4937 0,3 CH2 LC2 0,38 0,4937 0,4/0,5 CH3 LC3 0,396 0,6067 0,4 *CH2 LP2 0,396 0,3808 0 *CH3 LP3 0,396 0,56895 0 * Valores ajustados para reproduzir o volume por lipídeo e calor de vaporização de pentadecanos (Berger et al 1997). Todos os outros parâmetros foram retirados do OPLS. 1 Cargas determinadas por cálculos de mecânica-quântica ab-initio por Chiu et al. (1995). diedrais das cadeias hidrocarbônicas são ajustados pelo potencial de Ryckaert-Bellemans (Eq. 8). Os parâmetros de LJ e cargas parciais estão na Tabela 1. Os parâmetros que descrevem as interações entre peptídeos e lipídeos (combinações entre GROMOS-87 e Berger ff) foram tomadas de derivações de Tieleman DP (disponível em http://moose.bio.ucalgary.ca/files/ lipid.itp). Na representação granulada, os lipídeos tinham 11 sítios, o que representa uma redução por um fator de ~5 para o número de átomos comparado ao modelo átomo-unido (Figura 3B). Lipídeo POPC foi modelado com sítio do tipo Q0 para o grupo colina; Qa para o grupo fosfato; Na, grupos éster-glicerol e C1 para as cadeias hidrofóbicas. No modelo de POPG, o grupo glicol teve assinalado um sítio do tipo P4; o resto da molécula é análogo ao POPC. Os detalhes para ligações, ângulos, diedrais estão na topologia disponível no site oficial Martini (http://md.chem.rug.nl/cgmartini/images/parameters/martini_v2.0_lipids.itp). Água e íons O modelo fino de água SPC consiste de um átomo de oxigênio com uma carga parcial negativa e um potencial de LJ e dois átomos de hidrogênios que interagem somente por meio de suas cargas parciais positivas. O ângulo HOH e comprimentos de ligação são rígidos e a Figura 3. Representação gráf falta de polarizabilidade é modelo granulado de água Isto é assinalado como um modelo reproduz a densid simulações com modelos parâmetros foram herdado íon sódio foi modelado pelo foi parametrizado de forma exemplo, íons em solução. blindagem eletrostática do dielétrica relativa. Para isso Algoritmos Para integrar as eq como gradiente do campo d derivadas são calculadas an Integração das equações d O algoritmo Verlet equações de movimento de fica dos lipídeos POPG e POPC. A) Fine-grained compensada por um momento de dipolo m corresponde ao centro de massa de quatro m sítio de tipo P4. Em temperatura ambiente a dade de 1g/cm3. Os parâmetros do íon só fine-grained também são provenientes do s pelo sucessor GROMOS-96. Em simulaç o tipo Qd (+1) e cloro por Qa (-1). Cada tipo a a ter uma camada de hidratação implicíta, Como o modelo de água granulado não tem os sítios carregados se dá explicitamente o, é apontado . quações de movimento (Eq. 3), as forças pr de forças (Eq. 4). Na formulação do campo d naliticamente. de movimento t (Verlet 1967) é um esquema simples e rob Newton 26 d; B) coarse-grained. maior do que o real. O oléculas de água reais. a 1 bar de pressão, este ódio empregados nas GROMOS-87. Esses ões coarse-grained, o de sítio carregado (Q) , tendo em mente, por m carga, nem dipolo, a através da constante recisam ser calculadas de forças (Eq. 6 e 7) as busto para integrar as (8) 27 Isso é derivado da expansão de Taylor de . O erro nas posições é da ordem de ; velocidades são menos acurados, mas são necessárias somente para calcular a energia cinética e portanto a temperatura. Este algoritmo tem boa estabilidade temporal e conservação de energia (Leach 2001). Integrador Leap-frog Uma variante do integrador Verlet aplicada é o algoritmo leap-frog (Hockney et al 1974), que define as velocidades em tempos na metade dos passos: e Isto fornece a atualização das posições e a atualização das velocidades é tomada do esquema Verlet (Eq. 8) Esta forma é equivalente ao esquema de Verlet e compartilha sua simplicidade e ainda tem a vantagem de exibir menores erros nas velocidades (Leach 2001). Constraints em ligações químicas O passo temporal t no esquema de integração depende dos movimentos mais rápidos do sistema. Para líquidos e biomoléculas em temperaturas biologicamente relevantes, estes movimentos advém das vibrações de ligações químicas. Se tratarmos ligações harmônicas como rígidas, o passo de integração pode ser aumentada por um fator 4 (Hess et al 1997). Ligações rígidas são implementadas com constraints, pois são forçadas após cada passo retornar o comprimento ao valor fixado. Para ligações em proteínas, o algoritmo LINCS (Hess et al 1997) foi aplicado, enquanto para o modelo de água rígida SPC foi utilizado o algoritmo SETTLE (Miyamoto e Kollman 1992). Eletrostática em condições periódicas de contorno O tamanho dos sistemas que são simulados com Dinâmica Molecular é ainda tão pequeno que a superfície de fronteira (parede ou simplesmente fronteira) é grande comparada 28 ao volume. Como estamos interessados no comportamento do volume, a superfície é eliminada pela repetição periódica da célula de simulação, conhecida como condições periódicas de contorno. Uma partícula que sai de um lado da célula entra pela face oposta com a mesma velocidade. Cuidado deve ser tomado quando interações não-ligadas são calculadas. Para interações de curto-alcance, que decaem mais rapidamente que um esquema de raio- de-corte é suficiente, onde as interações entre as partículas i e j são calculadas dentro de um raio Rcut quando . O raio-de-corte não pode ser maior que a metade da menor dimensão da célula de simulação. A interação de Coulomb (Eq. 5), de qualquer modo, tem longo alcance e em um arranjo periódico, contribuições de um infinito número de imagens de células vizinhas precisam ser consideradas. Seguindo as descrições de Deserno e Holm (1998), a energia eletrostática de um sistema periódico (caixa de comprimento L, periódica nas três dimensões n=(n1, n2, n3) podem ser reescritas como (9) onde a soma indica que para o termo deve ser omitido. A Eq. 9 é condicionalmente convergente, então seu valor depende do procedimento aplicado. A soma de convergência lenta pode ser dividida em duas de convergência rápida com base na identidade o primeiro termo da soma coleciona as interações de curtas distâncias com rápido decaimento, tal que os valores para um deve ser zero ou negligenciável, portanto o uso de raio- de-corte introduz erros extremamente marginais; o segundo, tem lento decaimento em grandes separações. A escolha de Ewald para o fator de convergência foi (10) que transforma as cargas pontuais em densidades de carga gaussianas, o que faz suas interações decaírem rapidamente com a distância. A energia eletrostática fica onde a contribuição do espaço real é (11) 29 do espaço recíproco (12) da auto-energia (13) e a correção de dipolo Onde é a transformada de Fourier da densidade de carga (14) A distribuição gaussiana de cargas da parte recíproca é avaliada em um espaço discreto a partir da localização das cargas em um grid regular (essa é a parte mesh do algoritmo PME conhecida como espalhamento de cargas). A densidade de cargas espalhadas (mesh density) sofre a transformação rápida de Fourier - FFT, equivalente à Eq. 14, e a energia U(K) do espaço recíproco é calculada (Eq. 12). Isso equivale a resolução da equação de Poisson naquele espaço. Então as forças provenientes das cargas espalhadas no espaço recíproco são calculadas e re-transformadas às posições das partículas originais para render a contribuição de Coulomb para a força total em uma partícula. Shan et al. (2005) enfatiza que o espalhamento de cargas não deve ser feito de modo a tentar reproduzir a distribuição de cargas original (aquela que existia antes de ser suavizada pela aplicação do fator de convergência gaussiano), mas sim para obtermos uma função de distribuição bem comportada, de modo que os cálculos sucessivos de energias e forças convirjam acuradamente. Aqueles autores fazem uma derivação detalhada da operação de espalhamento de cargas e entre as variáveis apontadas está a distância entre cada ponto da rede (grid-spacing; no Gromacs esse parâmetro recebe o nome de fourierspacing). Para que as cargas sejam assinaladas em um ponto da rede, geralmente são realizadas interpolações polinomiais; a mais empregada delas (e também no Gromacs) é a B-spline (a ordem do polinômio é determinada manualmente). Estas duas variáveis estão intrinsicamente relacionadas com (Eq. 11-13), que é um parâmetro que ajusta as contribuições dos espaços real e recíproco. Na prática, a dominância das contribuições entre espaços real e recíproco pode ser feita variando o raio-de-corte (RC), já que e p=10-5 (tolerância ao erro, em 30 Gromacs: ewald_rtol (determinado manualmente)). Aumentando RC, deixamos a maior contribuição no espaço real, diminuindo-o torna o espaço recíproco dominante. Para o pacote de simulação computacional Gromacs v. 4.5 foi observado que o desempenho em simulações paralelizadas é otimizado quando o custo dos cálculos no espaço recíproco é de 25 a 33% do tempo total gasto com o PME. Significa dizer que a maior contribuição para a energia eletrostática total é tomada do espaço real, para que isso seja alcançado, devemos aumentar o raio-de-corte (rc > 0,9 nm). Simultaneamente, podemos aumentar o grid-spacing, acelerando, dessa forma, os cálculos no espaço recíproco; quando isso é feito é recomendável aumentar a ordem de interpolação B-spline para não haver perda de acurácia. Os detalhes e maiores explicações sobre o método PME podem ser encontrados, por exemplo, em Deserno e Holm (1998), Gibbon e Sutmann (2002) e Shan et al. (2005). Temperatura e pressão constantes Os métodos de acoplamento conhecidos como esquemas de acoplamento fraco são conceitualmente simples e permitem fazer simulações em temperatura e pressão constantes, de forma que as trajetórias obtidas do Hamiltoniano (Eq. 2) conservem energia e o sistema possa ser descrito por uma amostragem NpT. Acoplamento de temperatura A temperatura T é calculada a partir das velocidades através da energia cinética do sistema inteiro: onde é o número de graus de liberdade, isto é, todos os graus de translação de átomos esféricos menos o número de constraints (ex: comprimentos de ligações limitados (constrained)) aplicados aos átomos e para remover o momento do centro de massa. Como descrito em van der Spoel et al. (2010), o algoritmo de acoplamento fraco de Berendsen (Berendsen et al. 1984) imita o acoplamento do sistema a um banho térmico com uma temperatura de referência T0. O efeito é uma lenta relaxação da temperatura do sistema de T para T0, de acordo com 31 Os desvios iniciais decairão exponencialmente com . O algoritmo muda a velocidade de partículas em cada passo por um fator , que é calculada como (15) CV é a capacidade calorífica em volume constante. No Gromacs são determinados manualmente. varia entre 1 (gás ideal, ) e ~3 para água. Por exemplo, nas simulações fine-grained, um tempo de decaimento de ps foi escolhido para influenciar minimamente a dinâmica do sistema . Acoplamento de pressão O acoplamento fraco de pressão reescala as coordenadas das partículas e os vetores da célula de simulação a cada passo (ou a cada passos) com uma matriz de escalonamento (16) é a constante de acoplamento e é uma estimativa para a compressibilidade isotérmica do sistema (é suficiente assumirmos que é o valor calculado para a água). Este esquema guia a uma relaxação exponencial Todas as simulações foram feitas com . Nas simulações fine-grained, foi determinado ps ( ). O algoritmo de atualização das posições Conforme van der Spoel et al. (2010) p. 39, temos o seguinte algoritmo de atualização com o integrador leap-frog (desconsiderando o uso de restrições ou constraints). Dado: Posições de todos os átomos no instante t velocidades de todos os átomos no instante Acelerações F/m em todos os átomos no instante t (onde ) 32 Energia cinética e virial em 1. calcula os fatores de acordo com (15) e (16) 2. atualiza e reescala as novas velocidades 3. calcula novas coordenadas 4. reescala as coordenadas e a caixa: 35 Fernando César Lopes Filho and José Roberto Ruggiero UNESP - São Paulo State University, Department of Physics, 15054-000, São José do Rio Preto, São Paulo, Brazil. Corresponding author: José R. Ruggiero (Tel 55 17 3221.2239, Fax 55 17 3221.2247, e-mail: zerug@ibilce.unesp.br) Mastoparans are membrane-active peptides extracted from the social wasp venom which exhibit mast cell degranulation and hemolytic activities and are especially interesting due to their strong antimicrobial action. Relatively few simulations and structural information of experimental sources are reported for these peptides. In order to investigate its impact on membranes, the first molecular dynamics simulations of the antimicrobial peptide Polybia- MP1 (IDWKKLLDAAKQIL-NH2), a cationic mastoparan highly selective for bacterial cells, interacting with anionic palmitoyl-oleoyl-phosphatidylglycerol (POPG) and neutral palmitoyl-oleoyl-phosphatidylcholine (POPC) bilayers are reported here. A membrane thinning was observed in the region where the interactions between the peptide MP1 and the POPG membrane led to the formation of a peptide-perturbed lipid cluster. The thinning and perturbation of the lipidic packing are the effects of electrostatic interactions and dynamics. In contrast, these effects drove to structural changes much smaller on the POPC membrane. The peptide’s ability due to its cationic residues to coordinate and perturb larger number of lipids, and hence to cause larger structural changes in the POPG membrane in comparison to POPC, suggest that its selective feature is a result of charge effects and it is correlated to the intramolecular interactions in its N-terminal (IDWKK). Since the thinning membrane, a result of lipid interdigitation, is the precursor step to the pore formation, the simulations also indicate which is the mechanism of action of the peptide Polybia-MP1, because thinning events fit the toroidal pore model and experimental observations. 36 Keywords: selectivity; cationic antimicrobial peptide; wasp venom mastoparan; peptide- membrane interactions; conformational analysis; molecular dynamics simulations. The search for alternative antibiotics has been a slow answer to the explosion in the prevalence of drug-resistant pathogens, which have created an emergency situation in health care throughout the world (Alanis 2005). In this sense, natural molecules produced by many tissues and cell types responsible for the innate immune defense system in a variety of invertebrate, plant and animal species as bioactive peptides, which display strong antimicrobial activity (Brogden 2005), have been extensively investigated for being good templates for the design of new antibiotics (Spratt 1994; Marr et al. 2006). These peptides interact with the cellular membrane in two ways: by disrupting the phospholipid arrangement and/or by target site mechanisms (Yeaman and Yount 2003; Papo and Shai 2003). Thus, in order to comprehend their mechanisms of action, one needs to understand how peptides interact with anionic lipids present in a large proportion in the outer layer of bacterial membranes. Several works discuss the interactions between peptides and membranes from a low peptide/lipid (P/L) ratio (e.g. 1/128), where no effect or the membrane thinning can be observed (Jang et al. 2006; Hsu and Yip 2007), up to high P/L ratios, where leakage or disruption of membranes or vesicles is observed and discussed according to barrel-stave, toroidal-pore, carpet, and detergent-like models (Bechinger 2004). Data obtained from dye leakage experiments and subsequent analyses of the flow-rate constant, apparent average pore number and P/L molar ratio allowed to conclude that the peptide Polybia-MP1, above the threshold P/L, lyses vesicles by the mechanism of pore formation and, different from other mastoparans, displayed a high selectivity for bacterial membranes, another desired characteristic for new antibiotics (dos Santos Cabrera et al. 2008). Thus, in order to enlighten our understanding about the impact and selective feature of action of the peptide MP1, we performed molecular dynamics simulations with neutral (POPC) or anionic (POPG) lipids. The self-assembling simulations of the lipid/water/peptide mixture provided the unbiased insertion mode of the peptide into the membranes (Esteban- Martín and Salgado 2007). After the formation and equilibration of the peptide/membrane complex, we evaluated by statistical analyses the numbers of lipids coordinated and perturbed 37 by the peptide, and through the analyses of order parameters, we obtained the radius of perturbation around the peptide. The results obtained from both environments are compared. Inside the area of perturbation the membrane thinning occurrence was verified in the POPG membrane; in contrast, in the POPC it was not possible to distinguish an area of perturbation, nor was the membrane thinning observed. Membrane thinning is the precursor step to the pore formation (Chen et al. 2003), which fits the toroidal pore model of the mechanism of action of antimicrobial peptides proposed by Matsuzaki, Shai and Huang (Matsuzaki et al. 1994; Gazit et al. 1996; Ludtke et al. 1996). This peptide’s ability to induce larger structural changes in model anionic membranes, model for the bacterial ones, as well as the characteristics of this peptide-induced structure provide a plausible explanation about its selective feature and mechanism of action of the antimicrobial mastoparan peptide Polybia-MP1. In the center of an 8 nm cubic box one peptide was placed with its axis aligned to z- axis and 128 POPC or POPG lipids were randomly distributed around it. A pool of eight different conformations of lipids was used and care was taken with an equal distribution of D and L chiralities in POPG lipids. Moreover, in POPG simulations, 126 Na+ counterions were introduced and initially distributed at distances of, at least, 0.4 nm of the oxygen atoms belonging to ester groups of the lipids. The addition of this amount of counterions was sufficient to ensure a null net charge of the system, as the peptide has a +2 charge. In POPC simulations, only 2 Cl- counterions were introduced. In addition, each box was filled with ~7,000 water molecules. After the construction of the unit cell of simulation, the energy system was minimized by the steepest descent method. A simulation of 50 ps with a restraining position of the peptide atoms and isotropic pressure coupling was performed. Finally, the system was submitted to production run with anisotropic pressure coupling. The POPG and POPC lipid topologies followed the models proposed by Zhao et al (2007), with the L and D chiralities discriminated in the case of POPG. The peptide Polybia- MP1 coordinates (IDWKKLLDAAKQIL-NH2) were generated in an alpha-helix conformation using RIBOSOME V1.0 program. The N-terminus and lysine side chains were protonated, carrying a NH3 + charged group, as well as the aspartate aminoacid residues were treated in their acid form with a COO- group, yielding a peptide net charge equal to +2. We 38 have used GROMOS87 force field (van Gunsteren and Berendsen 1987) for the peptide, SPC water molecules and Na+/Cl- counterions. The lipid parameters were taken from the OPLS- based force field of Berger et al. (1997). And the combinations between both force fields were considered using parameters from the lipid.itp file available at http://moose.bio.ucalgary.ca/ files/. Bond lengths were constrained using the LINCS algorithm (Hess et al. 1997), and the SETTLE algorithm (Miyamoto and Kollman 1992) was used for SPC water molecules allowing a 2 fs integration time step. Lennard-Jones interactions were cut off at 1.0 nm and electrostatic interactions were evaluated using the smooth particle mesh Ewald method (Darden et al. 1993), with a real space cut off of 1.0 nm, grid spacing of 0.12 nm, and a fourth-order spline interpolation. The neighbor-list was updated every 10 steps. The system was maintained at constant temperature of 310 K, and lipids, solvent (water and ions), and peptide were separately coupled with a coupling constant of 0.1 ps. The pressure was kept constant at 1 bar and a coupling constant of 1 ps was applied. Temperature and pressure were controlled using Berendsen coupling algorithms (Berendsen et al. 1984). All simulations and most of the analyses were performed using GROMACS suite of programs, version 3.3.3 (Lindahl et al. 2001). Averages are followed by standard deviations. Deuterium order parameters (SCD) were calculated for saturated sn-1 lipid chains. Trajectories were visualized and figures were rendered using the VMD program (Humphrey et al. 1996). We have applied the self-aggregation strategy known as the minimum bias method to obtain the insertion mode of the peptide inside the membrane (Esteban-Martín and Salgado 2007). This method was applied instead of molecular diffusion simulations of peptides in preformed membranes, as this occurs in nature, because the interactions among model POPG lipids via lipid-ion bridges has a high free-energy barrier (Zhao et al. 2007), which hinders an appropriated partitioning of the peptide in the lipid headgroups, in time scales less than 1 μs, as observations of our own initial simulations. The time scales of the simulations according to the alternative approach are less than a factor of four of that. A total of five independent simulations of self-assembling of POPG lipids, water molecules, and counterions were performed, one simulation without and four others containing one peptide, all with different lipid atomic positions to the initial configuration. To clarify the descriptions, this POPG case 39 will be characterized by the s1 simulation, because it presented representative characteristics about the insertion mode of the peptide and its interactions with the membrane (Table 1). To complete this study, one additional self-aggregation simulation with POPC lipids was performed to represent the POPC case. To know the details of the self-aggregation process of POPG lipids into bilayers, see the descriptions and figures of the Electronic Supplementary Material. Insertion mode of the peptide into the membrane: surface adsorbed peptide In both POPC and POPG cases the peptide/membrane complex was formed and equilibrated up to 120 ns, with the peptide adsorbed into lipid acyl chains lying parallel to the bilayer interface as shown in Figure 1. In both cases, the hydrophobic face of the amphipathic -helix peptide remained in close contact with lipid acyl tails, while longer hydrophilic side- chains of the lysines interacted with oxygen atoms of both the ester and phosphate groups, in the POPC and POPG cases, and with, oxygen atoms belonging to glycol groups, in the case of POPG. In contrast, in the latter case, the counterions showed a preferential interaction with ester groups as observed here and elsewhere (Böckmann and Grubmüller 2004; Zhao et al. 2007). Bechinger and Lohner (2006) and others have discussed from a more general point of view that linear amphipathic cationic antimicrobial peptides act on membranes essentially as detergents, therefore adsorbing in parallel orientation to the membrane surface, and the analysis from circular dichroism spectra along with the primary sequence indicates that the Polybia-MP1 is a perfect example of a peptide with those structural characteristics. In this context, experimental observations from different short cationic antimicrobial peptides support the toroidal pore model to which the peptides accumulate parallel to the membrane surface up to reach the threshold peptide/lipid (P/L) ratio driving a transition of part of the peptides for transmembrane orientation, thus exerting the biological activity by the pore formation. Specifically, Polybia-MP1 exhibits sigmoidal concentration dependence, which indicates that the accumulation of surface adsorbed peptide up to the threshold P/L ratio is required, when in a cooperative manner, it triggers the releasing of vesicles contents (dos Santos Cabrera et al. 2008). The study of the interaction of other mastoparan with membranes using solid-state 15N-NMR spectroscopy investigated the insertion and orientation of labeled peptides interacting with macroscopically oriented samples of DMPC/DMPG bilayers, and 40 observed that most of the peptides (90%) are oriented with their helix axis parallel to the membrane surface (Hori et al. 2001). Thus, the parallel orientation observed in the final configurations of the self-assembled complexes is consistent with available experimental data and theoretical models proposed to amphipathic cationic antimicrobial peptides. Charge interactions and conformational analysis The antimicrobial mastoparan peptide Polybia-MP1 is not hemolytic, but its analogue with aspartate 2 to asparagine substitution has shown high hemolytic activity (Souza et al. 2005; Leite et al. 2011). To explain the absence of the hemolytic activity, dos Santos Cabrera et al. (2008) have suggested the high-charge density (6 charges) and low hydrophobicity (- 0.108) have an interrelated role for the selective interaction of the peptide for the bacterial membranes, a discussion based on a theoretical model by Taheri-Araghi and Ha (2007). From an electrostatic and structural point of view, dos Santos Cabrera et al. have suggested the position of the Lys 4, Lys 5 and N-terminus charged groups in the helical structure would form a triangular arrangement with the Asp 2 approximately in the circumcenter, as observed in peptide-TFE/water simulations, which would create an electrostatic equilibrium. This arrangement would contribute to a partial neutralization of the charges and hence would cause a smaller screening and perturbation of the lipid headgroups on zwitterionic membranes. In model membranes with POPC, we observed the peptide’s charged residues were dispersed in the interfacial environment, and it was possible to observe that the interactions in which the Asp 2 and Asp 8 residues were involved formed nets of intermittent interactions with the nearest cationic residues in the form of triangles (Fig. 3A). On the other hand, in the case of POPG, the spatial dispersion of the charges in the environment was able to induce only a persistent bond, a salt bridge between Asp 2 and Lys 5 (Fig. 3B), allowing the other cationic residues free to interact with the bilayer. To study the impact of the intramolecular interactions in the peptide on the intermolecular interactions of the peptide with the membranes, we calculated the radial distribution functions (RDF) of the electronegative polar groups of the lipids around the cationic groups of the peptide (Fig. 2). In the case of POPG, the plot revealed a peak at r=0.257 nm indicating the formation of hydrogen bonds, and r=0.4 nm is the radius of the first interaction shell. Inside this shell, the peptide coordinated 22.7 ± 1.3 oxygen atoms belonging to seven lipids (average obtained between 200 and 250 ns). Moreover, it was found that the 41 charged groups of the N-terminus and lysines 4 and 11 coordinated, respectively, 4.8 ± 0.5, 8.9 ± 0.7, and 6.5 ± 0.7 oxygen atoms, while this number is only 2.5 ± 0.6 for the lysine 5, consequence of the salt bridge formation with Asp 2. The analysis of the RDF plot in the case of POPC showed that the charged groups of the N-terminus, lysines 4, 5, and 11 coordinated, respectively, 3.1 ± 0.2, 3.1 ± 0.4, 3.3 ± 0.7, and 5.8 ± 0.6 lipid oxygen atoms inside a shell of radius equal to 0.35 nm. It added 15.3 ± 1.1 oxygen atoms coordinated by the peptide belonging to five lipids. These numbers revealed that the peptide interacted electrostatically with 32.6% less oxygen atoms in a zwitterionic membrane in relation to an anionic one, which corresponds to a decrease of 28.6% of coordinated lipids. The explanation for this observation of the decrease of the screening by the POPC lipid headgroups must consider two components. The first one is related to the nature of the interactions, because charge-dipole interactions between the peptide and this environment are weaker than charge-charge interactions present in anionic membranes. The second and more important one is the role that the aspartates 2 and 8 have minimizing the electrical field due to the cationic charges in the N- terminal. According to the coordination numbers, it should be noticed that the averages obtained from the N-terminal, lysines 4 and 5, in the case of POPC, are equivalent statistically to the value obtained for Lys 5, which formed a salt bridge with Asp 2 in the case of POPG, evidencing the importance of the strategic position of those acidic residues for that minimization. With the substitution of the aspartate residue in the position 2 for an asparagine, a neutral amino-acid, it could not participate of those interactions, thus the peptide would be able to screen more oxygen atoms in the zwitterionic membrane starting to present hemolytic activity, which is in line with the experimental observations obtained from the analogue peptide. Simultaneously, the intra-side-chains and intermolecular interactions in the POPC membrane did not disturb the n-n+4 hydrogen bonds in the main chain, which stabilized the helical structure, as can be seen in Figure 4A. The high helical content observed is in agreement with previous membrane-mimicking TFE/water simulations (dos Santos Cabrera et al. 2008), as TFE/water solvent is a good mimicking of a zwitterionic membrane. In TFE/water solvent as well as in a model POPC membrane, it was found that the peptide was folded from the 3rd to the 13th residue; in the other membrane, the -helix was stable from the 3rd to the 12th residue (Fig. 4B). This ordered structure is required for lytic activity (dos Santos Cabrera et al. 2008; Leite et al. 2011). 42 Order parameters and membrane thinning Order parameters for sn-1 chains were calculated considering the lipids inside a circle of radius r measured from the peptide’s center of mass. For the POPG case, it should be noticed that the order parameters increase with the increasing radius (Fig. 5A). This means the ordering of the lipid chains near the peptide are more perturbed. Only for distances larger than 2.2 nm, the values of the order parameters converge to those obtained in the peptide-free simulation (s5). In the POPC membrane was not possible to observe a significant radial variation of the order parameter around the peptide, because the lipid tail anisotropy was almost uniform, therefore we could not distinguish an area of perturbation (Figure S4). The value of 2.2 nm for the radius of perturbation is in good agreement with the value of 2.0 nm obtained by Zemel et al. (2005) in simulations applying mean-field and chain- packing theories. The reference configuration studied by them is very similar to ours: an amphipathic cylinder represented the adsorbed peptide with its axes parallel to the membrane. Moreover, these authors described that the thinning is restricted to the peptide-free leaflet. In our results, however, the thinning is verified for both leaflets. This difference in results is possibly due to the absence of lipid correlations in the work of Zemel et al. Furthermore, a radius equal to 2.2 nm is also comparable to the value of 1.5 nm, measured from the peptide’s backbone, obtained from the interactions between 13-residue Indolicidin and pure DOPG membranes (Hsu and Yip 2007). Although this peptide being short and having four cationic residues as well as the Polybia-MP1, this comparison had to be made ignoring the disordered structure and the excess of tryptophans. Inside the 2.2 nm radius there were 25 lipids, evidencing that the peptide did not only perturb the ordering of the lipids inside the coordination shell (which contained seven lipids), but also lipids in layers beyond. Because the POPG lipids form a network through the hydrogen bonds and lipid-ion-lipid bridges, the orientational disordering of the lipids inside the coordination shell propagates throughout the net to the lipids non-coordinated by the peptide, an effect of lipid chain correlations. It indicates a large contribution of dynamic effects in addition to the electrostatic effects, which is in good agreement with experimental observations obtained by Hori et al (2001). Through NMR spectroscopy experiments with oriented lipid bilayers, these authors reported that the addition of mastoparan peptides lead to an increased motional averaging of the lipid headgroups, even of the acyl chains, turning the bilayer more fluid. In our data this increase of fluidity is revealed by the lower values of the 43 order parameters calculated over all lipids of the peptide-containing simulation (s1) in comparison to the peptide-free simulation (s5, Fig. 5B). In the region where the orientational disorder of lipid acyl chains in POPG bilayer was observed, it was also possible to notice the thinning of the membrane. Both leaflets showed a peptide-induced negative curvature (Fig. 1). In order to quantify the thinning, we plotted the electronic densities of the phosphorous atoms as a function of the distance of the center of the membrane for peptide-containing and peptide-free simulations (Fig. 6). From the peptide-free simulation (control simulation-s5), we obtained a membrane thickness of 4.4 nm, while from the peptide-containing simulation (s1), we obtained a value of 4.06 nm. Thus, the overall thinning was of 0.34 nm, comparable to the value of 0.41 nm observed of the Indolicidin peptide interacting with pure DOPG bilayers (Hsu and Yip 2007). Nevertheless, a little more pronounced displacement can be observed in the peptide-containing leaflet; compared to the control simulation s5, the peak of that leaflet shifted by 0.22 nm, while the other leaflet shifted by 0.12 nm. The disordered lipid tails near the peptide occupied the space below it and were interdigitated by the lipid tails of the other leaflet, being this conformation change the putative cause for the membrane thinning. The observation of the interdigitation of lipids and the consequent membrane thinning in the peptide-perturbed region has also been done by other previous experimental and computational studies (Ludtke et al. 1995; Mecke et al. 2005; Jang et al. 2006; Hsu and Yip 2007). The similarity of the results from independent simulations with POPG lipids indicates the results are reproducible, because all bilayers obtained from the self-assembling method are well equilibrated and the binding mode of the peptide into the complex is in agreement with experimental and theoretical descriptions. The insertion mode of the peptide inside the POPC membrane is consistent to POPG simulations, however the analyses of order parameters did not evidence a distinguishable radial variation from the peptide’s center of mass, nor was the membrane thinning observed. By contrast, in the anionic membrane, we demonstrated that dynamics and electrostatic interactions led to the formation of a peptide-perturbed lipid cluster revealed by the disordering of the acyl chains of the nearest lipids of the peptide, when compared to order parameters obtained from the peptide-free simulation. Moreover, in the 44 peptide-perturbed region, we observed the interdigitation of lipids between both leaflets and the membrane thinning. Others previous studies also observed the lipid interdigitation in the region influenced by the peptide and suggested that this is the cause for the thinning; our data can support the same conclusion. Experimentally, it had already been demonstrated that the single change of the aspartate for the asparagine in that position turned the hemolytic analogue, therefore eliminating its selectivity. We then mined statistical information about the molecular interactions and obtained evidences which allow us to attribute the different results between the POPG and POPC membranes to the peptide’s ability to coordinate and perturb a larger number of lipids in anionic membrane than in the zwitterionic one and to correlate these charge effects to the intramolecular interactions in the peptide’s N-terminal (IDWKK), especially with the role that aspartate 2 exercises reducing the electrical field of the neighboring lysines. As dye leakage experiments support the thesis of MP1 lyses vesicles as the toroidal pore model, and in this model the membrane thinning is the step that precedes the pore formation events involved in the lytic activity, our simulations provide, therefore, details at atomic level of the impact of the antimicrobial mastoparan peptide Polybia-MP1 on anionic membranes. This study was supported by grants provided by the Brazilian agencies São Paulo State Research Foundation-FAPESP (BIOprospecTA program 2006/57122-7) and the National Council of Technological and Scientific Development - CNPq (to JRR and fellowship to FCLF). 45 Table 1. List of the simulations. Simula -tion lipid Number of peptide Simulation time (ns) Final orientation of the peptide Lipids per leaflet (With/no peptide) s1 POPG 1 250 parallel 66/62 s2 POPG 1 250 parallel 66/62 s3 POPG 1 250 parallel 67/61 s4 POPG 1 250 parallel 67/61 s5 POPG 0 200 - 66/62 s6 POPC 1 250 parallel 61/67 46 Fig. 1 Final configuration obtained after 250 ns of simulation. This frame was taken from the POPG simulation s1; the insertion mode and orientation of the peptide is also representative for POPC simulation. White spheres in the peptide represent the hydrophobic residues; blue spheres, cationic residues; red spheres, anionic residues; and green spheres, polar residues. Brown spheres in the lipids represent phosphorous atoms and cyan lines represent lipid acyl chains. The white dashed lines are shown to guide the eyes along the membrane thinning. Parallel blue lines show the boundaries of the box simulation. 47 Fig. 2 Radial distribution functions (RDF) of all lipid oxygen atoms around the cationic groups of the peptide (charges of the N-terminal and side-chains of the lysines 4, 5 and 11). RDF calculated for the POPG and POPC cases (black and red lines, respectively). 48 Fig. 3 Projections of peptide MP1 obtained from the simulations. A) For the POPC simulation, it is possible to verify the formation of intermittent interactions between aspartates and lysines in the N-terminal region. B) For the POPG simulation, only a salt bridge formation between the Asp2 and Lys5 residues is verified. 49 Fig. 4 Analysis of the secondary structure of the peptide in time for the A) POPC and B) POPG simulations. 50 Fig. 5 Lipid order parameters as a function of the distance from the peptide’s center of mass for the POPG simulation; for the POPC case it is not shown, because no significant variation of the order parameter of the lipids coordinated by the peptide in relation to farthest lipids was verified (See Figure S4 in the supplementary material). (A) For the peptide-containing leaflet, order parameters are presented for distances from 0 to 0.8; 0 to 1.2; 0 to 1.6; 0 to 2.0; 0 to 2.2; 0 to 2.8; 0 to 4.77; and 2.2 to 4.77 nm. (B) Comparison of the lipid order parameters between peptide-free (empty squares) and peptide-containing simulations (filled squares). Such order parameters were calculated over all lipids. 51 Fig. 6 Electron density of the phosphorous atoms as a function of the distance from the center of the membrane (x=0). Grey line represents the density from the peptide-free simulation (s5). Black line represents the peptide-containing simulation (s1); the leaflet with the adsorbed peptide is represented on the left peak of this graph. As declared previously, a thinning on the POPC membrane was not visualized, therefore we did not include its density for comparison (See Fig. S5). 52 Alanis AJ (2005) Resistance to antibiotics: are we in the post-antibiotic era? Arch Med Res 36: 697-705. doi: 10.1016/j.arcmed.2005.06.009 Bechinger B (2004) Structure and function of membrane-lytic peptides. Crit Rev Plant Sci 23: 271-292. doi: 10.1080/07352680490452825 Bechinger B, Lohner K (2006) Detergent-like actions of linear amphipathic cationic antimicrobial peptides. 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Ruggiero (Tel 55 17 3221.2239, Fax 55 17 3221.2247, e-mail: zerug@ibilce.unesp.br) In the following section is presented the POPG membrane formation process and, for clarity of the descriptions, the main details are presented for the peptide-free simulation (s5) and other relevant details are also presented for the peptide-containing simulation (s1) (See Table 1 in the main text). 1 Membrane formation process All simulations (s1-s5) showed a similar process of aggregation and can be described in terms of the same stages described by Marrink et al (2001) and Esteban-Martín and Salgado (2007) for DPPC lipids and Bocchinfuso et al (2009) for POPC lipids, as is illustrated in Figure S1. Even the time scales of the events of the anionic POPG membrane formation are comparable to ones reported previously for zwitterionic membranes. In agreement with those previous studies, a rapid lipid aggregation and exclusion of the water molecules due to thermodynamics forces drove the formation of small lipid clusters (Fig. S1-A); and the subsequent fusion of these clusters into larger aggregates, reaching a lipid distribution in less than 10 clusters (Fig. S1-B), occurred within times of 200 ps and 3 ns, respectively. The fusion of the large aggregates or micelle-like groups into a bilayer-like structure, containing a large lipid pore filled with waters and ions, occurred after 10 ns of simulation. Within 15 ns the structure relaxed to contain 9-14 lipids, which is the minimum number of lipids which stabilized the pore (Fig. S1-C). After 85 ns that number decreased, when the pore closed 57 rapidly and spontaneously (Fig. S1-D). Subsequently, the number of connective interactions in the membrane plane increased (Fig. S2) and the area per lipid decreased smoothly until 120 ns (Fig. S3), when the bilayer was equilibrated and the thinning of the membrane is easily noticed by visual inspection of the trajectory (Fig. 1 in the main text). The equilibration times for the bilayers with peptide are equal or slightly smaller, as the peptide worked as a nucleation point for the lipids which composed the peptide-containing leaflet, accelerating the aggregation process, an event also described by another in silico study (Esteban-Martín and Salgado 2007). The pore lifetime of 60 ns is within of the range of 40-100 ns reported by Esteban-Martín and Salgado (2007) for DPPC bilayers. On the other hand, for the POPC ones, Bocchinfuso et al observed that in two of the three self-assembling simulations with trichogin GA IV peptide, the pore did not close spontaneously even after 100 ns, therefore they had to use an annealing protocol to eliminate it. However, in all our simulations the pore closed due to natural forces acting within each system, including the POPC simulation (s6). 58 Fig. S1 POPG membrane formation process. The simulation started with an aleatory mixture of lipids, waters and ions and in the center of the unit cell of simulation the peptide MP1 was placed. A) t=200 ps; B) 3 ns; C) 25 ns; D) 85 ns. The double arrow indicates the lipid pore filled with waters. Peptide is represented by blue (lysines), red (aspartates), green (glutamine), and white (hydrophobic residues) spheres. Brown spheres represent the lipid phosphorous atoms and cyan lines, the lipid acyl chains. Small red balls represent the oxygen atoms in the water molecules. The 126 Na+ counterions were omitted. 59 Fig. S2 Number of lipids bound to zero, one, two and three ions as a function of time. The numbers of lipids bound to zero and two lipids were fitted by exponential equations (red lines) with (0 ion)= 13 ns (R2=0.93) and (2 ions)=35.6 ns (R2=0.90), respectively. The bilayer reached the liquid-crystalline organization when a threshold number of connective interactions in the membrane plane were formed and the value incremented mainly when the number of lipids bound to two ions converged to the asymptotic value, which took place after 36 ns, including 68 (53%) of all lipids. As each lipid has two binding sites of ions (one ester group in each tail) and each ion often binds to more than one lipid, a large net of connected lipids through the ions was formed, and an average of 194 ± 5 connections between lipids and ions occurred per frame. These descriptions are in good agreement with those done by Zhao et al (2007) for a preformed pure POPG membrane. 60 Fig. S3 Area per lipid as a function of time for the POPG bilayer. An average taken from 120 ns showed the self-assembled membrane had the area per lipid stabilized at 0.531 nm2. Figure S4. Lipid order par mass for the POPC simula presented for distances from errors for the parameters f makes it difficult to distin parameters between peptid squares). Such order param rameters as a function of the distance from t ation. (A) For the peptide-containing leaflet, m 0 to 1.0; 0 to 2.0; and 2.5 to 4.8 nm. It sho for r<1.0 nm are within the margin of error nguish an area of perturbation. (B) Compari de-free (empty squares) and peptide-containi meters were calculated over all lipids. 61 the peptide’s center of , order parameters are ould be noticed that the r for r>2.5 nm, which ison of the lipid order ing simulations (filled Figure S5. Electron densit center of the POPC memb simulation (control simulat The position of the peaks in ty of the phosphorous atoms as a function of rane (x=0). Grey line represents the density tion). Black line represents the peptide-conta ndicate that there was virtually no thinning of 62 f the distance from the from the peptide-free aining simulation (s6). f the membrane. 63 2 References Bocchinfuso G, Palleschi A, Orioni B, Grande G, Formaggio F, Toniolo C, Park Y, Hahm K- S, Stella L (2009) Different mechanism of action of antimicrobial peptides: insights from fluorescence spectroscopy experiments and molecular dynamics simulations. J Pept Sci 15: 550-558. doi: 10.1002/psc.1144 Esteban-Martín S, Salgado J (2007) Self-assembling of peptide/membrane complexes by atomistic molecular dynamics simulations. Biophys J 92: 903-912. doi: 10.1529/biophysj.106.093013 Marrink SJ, Lindahl E, Edholm O, Mark AE (2001) Simulation of the spontaneous aggregation of phospholipids into bilayers. 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Tomando a simulação do MP1 como caso paradigmático, as análises dela permitem sugerir que a formação do poro foi facilitada pela atração de lipídeos aniônicos pelos peptídeos catiônicos agregados. Notamos que essa separação local de lipídeos, que deu origem a domínios de lipídeos aniônicos que interagem com o agregado, facilitou o afinamento local da membrana em 10 Å, enquanto o afinamento global dela foi de apenas 1 Å. A facilitação do afinamento local da membrana e consequente formação do poro pela formação de microdomínios de lipídeos aniônicos traz à tona um importante aspecto da seletividade e ajudam a explicar o mecanismo de ação de peptídeos catiônicos, especialmente os curtos como o MP1. Interações eletrostáticas dirigem a atração e adsorção de peptídeos catiônicos em membranas biológicas. Devido à natureza aniônica de membranas de bactérias e catiônica por parte de muitos peptídeos, a seletividade de interação tem sido explicada como um efeito de cargas. Investigações experimentais mostram que a seletividade, geralmente entendida como 66 uma maior afinidade de interação de peptídeos catiônicos por membranas aniônicas que por zwiteriônicas, não pode ser explicada somente com base nesse efeito, sendo que outras características das membranas deveriam ser consideradas, tal como sua capacidade de afinamento, que é influenciada pela organização de lipídeos PG e cardiolipinas (dos Santos Cabrera et al. 2008; Epand et al. 2008; Epand e Epand 2009). Adicionalmente, estudos experimentais e computacionais tem mostrado que peptídeos catiônicos adsorvidos são capazes de induzir em membranas mistas de lipídeos fosfatidil-colina/fosfatidil-glicerol (PC/PG) a formação de microdomínios de lipídeos aniônicos, que seria resultado de uma separação local de fase (Oreopoulos et al. 2010; Polyansky et al. 2010). Tal efeito também foi descrito por Hori et al. (2001) a partir de ensaios de RMN com o peptídeo Mastoparano (MP) e membranas PC/PG. Os estudos computacionais disponíveis sobre peptídeos antimicrobianos e membranas modelo desprezam o papel das interações carga-carga para a formação do poro com o uso de membranas neutras PC, pois hipotetizam que são os contatos hidrofóbicos que dirigem a inserção dos peptídeos na membrana e abertura do poro (Hallock et al. 2003; Leontiadou et al. 2006). Neste estudo, fazemos simulações a partir de uma configuração onde peptídeos estão inicialmente inseridos na região hidrofóbica de uma membrana POPC/POPG (1:1), para investigarmos o mecanismo de formação de poro e entendermos o papel das interações eletrostáticas nesse processo. A escolha de uma membrana mista POPC/POPG é uma melhor opção de modelo do que uma membrana pura PC quando se quer imitar membranas de bactérias, como por exemplo de Escherichia coli, pois estas são constituídas por lipídeos PC/PE e PG (Murzyn et al. 2005). A seleção de quatro peptídeos da família mastoparano para este trabalho foi propositadamente feita para termos peptídeos com cargas diferentes (diferentes números de resíduos de lisina) e com resíduos de lisina em diferentes posições ao longo da cadeia, para investigarmos também o efeito da variação dessas características na sua capacidade de perturbar a membrana, assim como feito por De Souza et al (2011). Mastoparanos são alvos deste estudo, pois apresentam potente ação antibiótica e anticancerígena (Wang et al. 2009; De Souza et al. 2011), e apesar da alta homologia de suas estruturas primárias entre os componentes dessa família, verifica-se que apresentam variado espectro de atividades biológicas. O entendimento dos mecanismos de ação dessas moléculas e a relação com suas estruturas pode contribuir para o desenvolvimento de novas moléculas 67 úteis em terapias alternativas, já que as atuais não estão contendo o avanço de patógenos resistentes. Parâmetros de simulação As simulações por Dinâmica Molecular e a maioria das análises foram produzidas pelo pacote de simulação GROMACS versão 4.5.4 (Hess et al. 2008). Em todas as simulações, o sistema foi acoplado a um banho de temperatura constante de 315 K pela aplicação do algoritmo V-Rescale (Bussi et al. 2007); lipídeos, peptídeos e solvente (água e contra-íons) foram separadamente acoplados com um tempo de relaxação de 0,3 ps. A pressão foi mantida constante em 1 bar com um tempo de relaxação de 3 ps, para isso o algoritmo de acoplamento de Berendsen (Berendsen et al. 1984) foi utilizado. Condições periódicas de contorno foram aplicadas para simular uma configuração de bulk. O passo de integração usado nas simulações foi de 30 fs, que corresponde a um tempo efetivo de 120 fs. Para interpretar os resultados obtidos com modelo coarse-grained, um fator padrão 4 é usado, pois corresponde ao fator de aceleração efetivo da difusão de um bead água comparado a água real (fine grained). O método Particle Mesh Ewald (PME, Darden et al. 1993) foi aplicado para considerar as interações eletrostáticas de longo alcance, com constante dielétrica relativa rel=15 e raio de corte do espaço real de 1,2 nm, grid spacing de 0,12 nm e interpolação spline de 4ª ordem. Um raio de 1,2 nm foi usado para se determinar a lista de vizinhos, que foi atualizada a cada 10 passos. As interações de Van der Waals foram calculadas usando a função Shift, com suave convergência da energia a zero entre os raios de 0,9 e 1,2 nm. Trajetórias foram visualizadas e figuras foram renderizadas usando o programa VMD (Humphrey et al. 1996). Construção da célula unitária de simulação Uma bicamada PC/PG (1:1) com 128 lipídeos foi montada a partir da replicação de dois lipídeos, um POPC e outro POPG, no plano x/y até que uma monocamada quadrada de 64 lipídeos com 5,12 nm de aresta fosse obtida. Uma réplica dessa monocamada foi apropriadamente rotacionada e transladada, assim compondo a bicamada contendo uma distribuição homogênea de lipídeos neutros e aniônicos. Em uma célula unitária de simulação, a bicamada foi solvatada por ~2270 beads W, o que corresponde a 9080 moléculas de água e 68 ~70 moléculas de água por lipídeo. Contra-íons foram adicionados para anular a rede de cargas do sistema (64 Na+ para anular as cargas dos 64 lipídeos PG e mais tantos Cl- e Na+ quantos foram os números de resíduos de lisina e aspartatos que os seis peptídeos possuíam). Uma simulação de 400 ns foi produzida para que esse sistema contendo apenas a bicamada fosse equilibrada. Após a equilibração, usando o Perl-script InflateGRO (Kandt et al. 2006) em um protocolo de 28 loops de aproximação dos lipídeos e peptídeos e minimização de energia, seis cópias de uma espécie de peptídeo foram espaçadamente inseridos, com os eixos das hélices alinhados ao eixo z, dentro da região hidrofóbica da membrana. Os peptídeos foram mutuamente dispostos de forma antiparalela. Com essa configuração, foi feita uma minimização de energia usando o método steepest-descent com uma iteração do método gradiente conjugado a cada 10 passos. Finalmente, o sistema (Fig. 1A) foi submetido a simulações de produção de 2 μs livres de qualquer restrição. Modelando os lipídeos e os peptídeos As topologias dos lipídeos zwiteriônico POPC e aniônico POPG foram tomadas do repositório de topologias do site oficial do campo de forças Martini (http://md.chem.rug.nl/cgmartini/). A partir delas, conforme sugestão de Rzepiela et al. (2010), reduzimos em um bead as cadeias acílicas das duas espécies de lipídeo, para assim eliminarmos a superestimação da espessura da membrana que ocorria com os parâmetros originais. A área por lipídeo, espessura da membrana e coeficiente de difusão lateral obtidos da simulação de controle, onde foi aplicada essa modificação, indicam que as propriedades típicas da membrana são preservadas. A estrutura primária dos peptídeos estudados está apresentada na Tabela 1. Todos os peptídeos foram estudados em conformação helicoidal do 3º ao 12º resíduo, conforme estudos de RMN e simulações indicam que os terminais de peptídeos mastoparanos possuem liberdade conformacional em ambientes membranares ou que mimetizam estes. Suas topologias foram obtidas usando o Perl-script seq2itp versão 1.1.5 (S. K. Kandasamy e M. J. Louhivuori, em: http://md.chem.rug.nl/cgmartini/index.php/ downloads/tools/62-seq2itp) com adaptações introduzidas no backbone. Partindo do N- para o C-terminal empregamos os seguintes atomtypes para os beads do backbone: Qd P5 Nd Nd N0 N0 N0 N0 N0 N0 Na Na P5 P5. As alterações seguiram a filosofia do campo de forças: beads em regiões de estrutura helicoidal foram assinalados como de baixa polaridade, Na, Nd ou 69 N0; sem estrutura secundária tiveram sua polaridade aumentada para P5 e N-terminal positivamente carregado recebeu o atomtype Qd. Campo de forças Na primeira série de simulações (s1-4, veja Tabela 2), temos uma simulação para cada um dos quatro peptídeos. Nessas simulações foi usado o campo de forças Martini coarse- grained model v2.1 (Monticelli et al. 2008), que descreveu as interações de todas as moléculas do sistema, já que este também contém parâmetros ajustados para a simulação de proteínas. Neste campo de forças, quatro moléculas de água são representadas pelo modelo de um bead do tipo (atomtype) P4, reduzindo substancialmente o tamanho do sistema, permitindo, portanto, a extensão dos tempos de simulação para 2 μs. A segunda série de simulações (s5-16) envolveu o estudo de um estado intermediário bem definido observado em duas das quatro simulações do primeiro conjunto. Um frame do estado intermediário das simulações s1 e s2, estado em que é observada a formação de poro transmembrânico, foi usado como ponto de partida nestas simulações. Este frame foi selecionado entre aqueles que possuíam o maior número de moléculas de água dentro do poro durante seu intervalo de tempo de vida. Para ser possível estudarmos essas estruturas em uma escala de tempo maior que a observada nas simulações s1 e s2, estabilizamos os poros através da restrição de posição dos beads do backbone dos peptídeos. Os campos de forças Martini e Martini com modelo de água polarizável (Yesylevskyy et al. 2010) foram usados e para cada um foram avaliados três valores para a constante de força de restrição: 50, 100 e 500 kJmol-1nm-2 (aplicado nas três direções). Simulações com campo elétrico externo Para completar o estudo, a configuração de poro obtida para os peptídeos MP1 (s1) e N2-MP1 (s2) e usadas na segunda série de simulações são também estudadas com a aplicação de um campo elétrico externo paralelo ao eixo normal à membrana, em um esquema parecido com um experimento de patch-clamp (simulações s17 e s18). Foi aplicada uma constante de força de 100 kJmol-1nm-2 para estabilizar o backbone dos peptídeos e assim verificarmos se a configuração determinada como poro também suporta a passagem de íons, assim como é observado em ensaios de patch-clamp durante o estado aberto. O campo de forças Martini 70 com modelo de água polarizável (Yesylevskyy et al. 2010) foi usado, pois é crucial o efeito de orientabilidade das moléculas de água dentro do poro devido ao campo elétrico. Análise: parâmetro de ordem orientacional O estado de organização lipídica como função da distância do centro de massa do poro foi avaliado por um parâmetro de ordem orientacional das cadeias acílicas, , definido como o valor médio do parâmetro de ordem instantâneo de cada lipídeo (SCD,i) que ocupa uma posição cuja distância em relação ao ponto de referência seja menor ou igual a r. Por sua vez, SCD,i = 1/2<3cos2 i-1>, onde i é o ângulo entre o eixo da cadeia S1 do lipídeo i e o eixo z, que é o eixo normal à membrana. O vetor que representa o eixo da cadeia S1 foi determinado pelos beads C1A e C3A. < > denota uma média obtida para cada frame da trajetória. Estados ocupados pelos peptídeos A primeira série de simulações (s1-4) mostrou que os quatro peptídeos ocuparam estados bem definidos ao longo das simulações. Os peptídeos MP1 e seu análogo N2-MP1 saíram da orientação inicial transmembrânica mutuamente paralelos e rapidamente (cerca de 20 ns) adotaram uma orientação desordenada dentro da membrana, com um peptídeo em orientação paralela a esta. Nessa configuração, observa-se a formação de um poro pelo qual mais de um