UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA 

“JÚLIO DE MESQUITA FILHO” 
FACULDADE DE MEDICINA VETERINARIA 

CAMPUS ARAÇATUBA 
 
 

 
 
 

 
 

RELAÇÃO ENTRE PRESENÇA DE ANTICORPOS ANTI-
Leishmania spp. E CARGA PARASITÁRIA EM SANGUE 
DE CÃES DE ÁREA ENDÊMICA PARA LEISHMANIOSE 

VISCERAL  
 

 

 
 
 

Carolina Aparecida Carlin Beloti 
Médica Veterinária 

 

 

 

 

 

Araçatuba – SP 

2014 



UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA 

“JÚLIO DE MESQUITA FILHO” 
FACULDADE DE MEDICINA VETERINARIA 

CAMPUS ARAÇATUBA 
 

 

 

 
RELAÇÃO ENTRE PRESENÇA DE ANTICORPOS ANTI-
Leishmania spp. E CARGA PARASITÁRIA EM SANGUE 
DE CÃES DE ÁREA ENDÊMICA PARA LEISHMANIOSE 

VISCERAL  
 

 
Carolina Aparecida Carlin Beloti 

Orientadora Professora Adjunto Cáris Maroni Nunes 
Coorientador Prof. Dr. David Anthony Orin Courtenay 

 
Dissertação apresentada à Faculdade 

de Medicina Veterinária – Unesp, 

Campus de Araçatuba, como parte das 

exigências para a obtenção do título de 

Mestre em Ciência Animal (Medicina 

Veterinária Preventiva e Produção 

Animal). 
 

 

Araçatuba – SP 

2014



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  Catalogação na Publicação(CIP) 
  Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação – FMVA/UNESP 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                       Beloti, Carolina Aparecida Carlin 
 
B452r              Relação entre presença de anticorpos anti-Leishmania spp. e carga 

parasitária em sangue de cães de área endêmica para Leishmaniose 
Visceral / Carolina Aparecida Carlin Beloti. -- Araçatuba: [s.n], 2014. 

  56 f. il.; + CD-ROM 
 

 Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade 
de Medicina Veterinária, 2014. 
 

 Orientador: Profa. Adj. Cáris Maroni Nunes 
 Coorientador: Prof. Dr. David Anthony Orin Courtenay 
 
                                  

1. Ensaio de Imunoadsorção Enzimática. 2. Reação em Cadeia da 
                         Polimerase em Tempo Real. 3. Diagnóstico. 4. Teste rápido DPP® I. T. 
            
 
 
 

CDD 636.089444 
 



 



DADOS CURRICULARES DO AUTOR 

  

CAROLINA APARECIDA CARLIN BELOTI – nascida na cidade de São 

José dos Campos - SP em 14 de julho de 1988. Graduou-se em Medicina 

Veterinária pela Universidade Estadual “Júlio de Mesquita Filho” (UNESP), 

campus de Araçatuba, São Paulo, em dezembro de 2011. Realizou pesquisa 

em iniciação científica nas áreas de Parasitologia Veterinária no Departamento 

de Apoio, Produção e Saúde Animal (DAPSA), e de Anestesiologia Veterinária 

no Departamento de Clinica, Cirurgia e Reprodução Animal (DCCRA) na 

FMVA, UNESP, campus Araçatuba. Seu estágio curricular foi realizado no 

Centro de Controle de Zoonoses (CCZ) da prefeitura municipal de Americana, 

São Paulo, na disciplina de Planejamento em Saúde Animal da Faculdade de 

Medicina Veterinária e Zootecnia da UNESP de Botucatu, São Paulo, e no 

Laboratório de Epidemiologia e Bioestatística da Faculdade de Medicina 

Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo (USP) em São Paulo. 

Publicou um artigo em revista científica internacional, apresentou três trabalhos 

em congressos nacionais, e dois em congressos internacionais. Exerceu 

atividade de coordenação do banco de dados e dos trabalhos de campo de 

pesquisa realizada em colaboração com as Universidades de Warwick e Keele, 

da Inglaterra. 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

“Não confunda derrotas com fracasso nem vitórias 

com sucesso. Na vida de um campeão sempre haverá 

algumas derrotas, assim como na vida de um 

perdedor sempre haverá vitórias. A diferença é que, 

enquanto os campeões crescem nas derrotas, os 

perdedores se acomodam nas vitórias.” 

 

Roberto Shinyashiki



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 
 

“Dedico este trabalho a minha querida família, pela 

dedicação e confiança que sempre depositaram em 

mim, e que sem o seu apoio e paciência, eu não 

conseguiria, em hipótese alguma, concluir mais esta 

etapa da minha vida.” 



Agradecimentos  

 

 À minha querida família, minha mãe Carla, meu pai Adauto, minhas 

irmãs Amanda e Daniele, aos meus avós e à minha Tia Adenise. Por serem 

sempre a minha estrutura de apoio até chegar a esta vitória, pelo imenso 

carinho, dedicação, confiança e amor incondicional. 

 Aos amigos que sempre estiveram à disposição para estender as mãos 

em momentos de desespero, em especial Rafaela, Edivânia, Daiene, Bruna, 

Kleber, Yuri, Píer, Luis Henrique, Fernanda, Silvana, Dandara, Samuel, Igor, 

Leopoldo, Matheus, Carlos Alberto, Talita, Acácio, Augusto e Graziella. E aos 

demais amigos que batalharam junto a mim. 

 Aos doutores Suzanne Gookol, Erin Dilger e Orin Courtenay pelo apoio, 

ensinamentos e experiências compartilhadas. 

 À professora doutora Cáris Maroni Nunes pela oportunidade concedida, 

pela confiança, amizade, carinho, por ter sempre cuidado de mim não só no 

aspecto profissional, mas também pessoal, me “adotando” como filha, mas sem 

deixar de ensinar e cobrar, como um bom pai faz. 

 À Universidade Estadual Paulista, nas pessoas dos coordenadores de 

curso, chefes de departamento e outros representantes legais, pela 

receptividade, abertura e incentivo para os estudos. 

 A todos os professores que de maneira direta e indireta contribuíram 

neste período. 

 À Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – 

CAPES, pela bolsa de mestrado concedida. 

 



SUMÁRIO 

 

CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS .................................................. 12 

AGENTE BIOLÓGICO ................................................................................... 12 

CICLO BIOLÓGICO ....................................................................................... 13 

VETOR .......................................................................................................... 13 

RESERVATÓRIO .......................................................................................... 15 

IMUNIDADE E DIAGNÓSTICO NO RESERVATÓRIO CANINO................... 15 

VIGILÂNCIA E CONTROLE .......................................................................... 18 

OBJETIVO ........................................................................................................ 20 

REFERÊNCIAS ................................................................................................ 21 

CAPÍTULO 2 - PRESENÇA DE ANTICORPOS ANTI-Leishmania spp. E 
CARGA PARASITÁRIA EM CÃES DE ÁREA ENDÊMICA PARA 
LEISHMANIOSE VISCERAL ............................................................................ 34 

INTRODUÇÃO............................................................................................... 36 

MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................. 37 

ÁREA DE ESTUDO E AMOSTRAGEM...................................................... 37 

COLETA DE DADOS ................................................................................. 38 

SINAIS CLÍNICOS ...................................................................................... 38 

COLHEITA DE MATERIAL BIOLÓGICO.................................................... 38 

TESTE RÁPIDO DPP E EIE-ELISA BIOMANGUINHOS® .......................... 39 

AMPLIFICAÇÃO DE kDNA POR PCR EM TEMPO REAL (qPCR) ............ 40 

ANÁLISE ESTATÍSTICA ............................................................................ 40 

COMITÊ DE ÉTICA .................................................................................... 41 

RESULTADOS .............................................................................................. 41 

DISCUSSÃO.................................................................................................. 46 

CONCLUSÃO ................................................................................................ 49 

REFERÊNCIAS ................................................................................................ 49 
 



RELAÇÃO ENTRE PRESENÇA DE ANTICORPOS ANTI-Leishmania spp. E 
CARGA PARASITÁRIA EM CÃES DE ÁREA ENDÊMICA PARA 
LEISHMANIOSE VISCERAL 

 

RESUMO – As estratégias de controle da leishmaniose visceral (LV) no 

Brasil estão baseadas no diagnóstico e tratamento precoce de casos humanos, 

no controle dos vetores, através do uso de inseticidas e na triagem sorológica 

com posterior eutanásia de cães positivos para leishmaniose. Assim, o 

diagnóstico da leishmaniose visceral canina (LVC) deve ser capaz de identificar 

adequadamente o reservatório canino, garantindo a eficiência desta medida de 

controle. Considerando-se que a resposta imune humoral desenvolvida por 

cães à infecção natural por Leishmania spp. é dependente da carga parasitária, 

o objetivo desta pesquisa foi avaliar se o resultado dos testes diagnósticos 

atualmente utilizados em inquéritos soro epidemiológicos no Brasil (teste 

rápido-DPP BioManguinhos® e teste ELISA indireto EIE-ELISA 

BioManguinhos®) apresentam relação com a carga parasitária do sangue de 

cães. Para tal foram avaliadas amostras de 610 cães da região noroeste do 

Estado de São Paulo a qual é endêmica para LV. A positividade variou de 15,9 

a 68.4% acordo com as técnicas utilizadas, devido às diferenças na 

sensibilidade e especificidade dos testes. De modo geral, cães 

sorologicamente positivos apresentaram carga parasitária média maior que a 

dos cães negativos. Entretanto, a avaliação do potencial de transmissão dos 

cães sorologicamente negativos faz-se necessária. 

 

 

 

 

Palavras-Chave: Diagnóstico, Teste rápido DPP®, Ensaio de Imunoadsorção 

Enzimática, Reação em cadeia da polimerase em tempo real. 



RELATIONSHIP BETWEEN THE PRESENCE OF ANTI Leishmania spp. 
ANTIBODIES AND PARASITE LOAD IN DOGS FROM A VISCERAL 
LEISHMANIASIS ENDEMIC AREA  

 

SUMMARY – Visceral leishmaniasis (VL) control strategies in Brazil are 

based on the early detection and treatment of the patients, vector control by 

insecticide and the serological screening and euthanasia of positive dogs. Thus, 

canine visceral leishmaniasis (CVL) diagnosis must accurately identify canine 

reservoir hosts to ensure the efficiency of screening. Considering that the 

humoral immune response of dogs to natural Leishmania spp. infection is 

dependent on parasite load, our aim was to evaluate if outcomes of the 

diagnostic kits currently used in canine seroepidemiological surveys in Brazil 

(DPP-BioManguinhos™ rapid test and EIA-ELISA Indirect ELISA 

BioManguinhos™) could be related to the blood parasite loads in dogs. Six 

hundred and 10 dogs from the VL endemic region of Northwest São Paulo State 

were sampled for this evaluation. Positivity varied from 15.9 to 68.4% between 

diagnostic techniques, due to differences in test sensitivity and specificity. 

Overall, positive dogs had higher mean parasite loads than negative dogs. 

Nevertheless, the potential of transmission of the negative dogs shall be 

investigated.  

 

 

 
Key- words: Diagnosis, rapid test DPP™, Enzyme Linked Immunosorbent 

Assay, Real-time polymerase chain Reaction. 

 



12 
 

CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS 

 

A leishmaniose visceral (LV), doença crônica transmitida por vetor, 

potencialmente fatal se não tratada adequadamente, é considerada uma das 

doenças mais negligenciadas do mundo, ocorrendo principalmente em 

crianças, indivíduos subnutridos e pacientes imunocomprometidos de regiões 

pobres e subdesenvolvidas (BRASIL, 2006). Estima-se que 350 milhões de 

pessoas encontra-se em risco de contrair a doença e que 0,5 milhões de casos 

novos ocorrem anualmente no mundo, causando aproximadamente 50.000 

mortes anualmente (WHO, 2010).  

 Mais de 90% dos casos de LV estão distribuídos em seis países: 

Bangladesh, Brasil, Etiópia, Índia, Sudão e Sudão do Sul. Na América Latina há 

de 4.500 a 6.800 casos ao ano e a doença já foi descrita em pelo menos 12 

países, sendo que o Brasil representa 90% dos casos (ALVAR et al., 2012; 

BRASIL, 2006; TRAVI, 2014; WHO, 2010). 

 A leishmaniose visceral está distribuída em 21 dos 27 estados 

brasileiros, com aproximadamente 3.500 casos anuais e média de 277 óbitos a 

cada ano (MARTINS-MELO et al., 2014). Somente no Estado de São Paulo, 

em quatorze anos (de 1999 a maio de 2013) foram notificados 2.204 casos 

humanos da doença e 192 óbitos (SÃO PAULO, 2014). 

Desde a década de 80, a LV vem passando por processo de expansão e 

urbanização, muitas vezes associada à migração de casos humanos e de cães 

infectados para cidades de grande e médio porte. Assim, o ciclo que fora antes 

basicamente de áreas rurais, assumiu um caráter adaptativo urbano 

(GONTIJO;MELO 2004; HARHAY et al., 2011 ). 

 

AGENTE BIOLÓGICO 

 Esta zoonose é causada por espécies de protozoários 

tripanossomatídeos do gênero Leishmania, pertencentes ao complexo 

Leishmania donovani, sendo a espécie Leishmania infantum chagasi a mais 

comumente envolvida no Brasil (LAINSON; SHAW, 1987; GRAMICIA, 2011). 



13 
 

São parasitas intracelulares obrigatórios do sistema fagocítico mononuclear, 

assumindo forma amastigota, não flagelada, nos hospedeiros vertebrados e 

forma promastigota, flagelada, no tubo digestório do inseto vetor (BRASIL, 

2006; CHANCE;EVANS 1999; SÃO PAULO, 2006; READY, 2014). 

 

CICLO BIOLÓGICO 
A Leishmania spp. perpetua seu ciclo ao vetor ao fazer o repasto em um 

animal infectado, ingerindo macrófagos contendo a forma amastigota. No tubo 

digestório do vetor esses macrófagos se rompem, liberando as formas 

amastigotas, as quais passam por diferentes estágios de diferenciação e 

multiplicação no intestino (anterior e médio) do flebotomíneo (promastigota 

procíclica, neptômonas, leptômonas, haptômonas e metacíclica, forma 

infectante) e migram em direção às peças bucais dos flebotomíneos 

(GOSSAGE et al., 2003, KAMHAWAI, 2006). Ao se alimentarem em um 

hospedeiro susceptível, essas formas promastigotas descem pela peça bucal e 

adentram na derme deste animal, são fagocitados pelos macrófagos onde, na 

forma amastigota, se multiplicam até romperem o macrófago, infectando então 

novos macrófagos, continuando assim sua multiplicação, até que um novo 

inseto vetor se alimente em hospedeiro infectado e os adquira, perpetuando 

assim o ciclo (CHANCE; EVANS 1999, GOSSAGE et al., 2003). 

 

VETOR 
A principal forma de transmissão do protozoário para os hospedeiros 

mamíferos se dá por meio da picada de fêmeas de dípteros da família 

Psychodidae, sub-família Phebotominae, também chamados de flebotomíneos 

(KAMHAWAI, 2006; LAINSON; SHAW, 1987). 

No Brasil a Lutzomyia longipalpis é a principal espécie transmissora da 

Leishmania infantum chagasi, todavia a Lutzomyia cruzi tem sido registrada 

como vetor em algumas regiões do país (BRASIL, 2006; BRAZIL, 2013; 

SANTOS et al., 1998).  



14 
 

Estes flebotomíneos possuem o corpo coberto por pelos de coloração 

amarelada ou cor de palha, são de tamanho pequeno (1 a 3 mm), possuem vôo 

de baixo alcance, em pequenos saltos e ao repousarem permanecem com as 

asas semi-abertas ou eretas, sendo por essas características conhecidos por 

mosquito palha, asa-dura, cangalhinha ou Birigui (BRASIL, 2006; SÃO PAULO, 

2006). 

O processo reprodutivo destes insetos passa por quatro fases e dura 

aproximadamente de 30 a 40 dias. Os ovos são depositados em ambientes 

úmidos, sombreados, ricos em matéria orgânica, serrapilheira, bases de 

árvores, fendas de rochas ou locais onde se abrigam animais (BRASIL, 2006; 

BRAZIL et al., 2003; CASANOVA et al., 2013; FELICIANGELI, 2004; KILLICK-

KENDRICK, 1999; MAROLI et al., 1997; RUTLEDGE et al., 1975; SÃO PAULO, 

2006. As formas adultas (aladas), geralmente se abrigam próximo aos locais 

onde se desenvolvem as fases imaturas ou no peridomicício (SÃO PAULO, 

2006), mas possuem preferência por abrigo de animais, especialmente 

galinheiros, tanto para reprodução (CASANOVA et al., 2013) quanto para 

permanência (BRAY et al., 2010; QUINNELL et al., 1994). 

Machos e fêmeas necessitam de fontes de carboidratos para sua 

alimentação, porém as fêmeas obrigatoriamente apresentam hábito 

hematófago, pois necessitam de sangue para o desenvolvimento de seus ovos, 

alimentando-se de animais vertebrados “de sangue quente”, inclusive o homem 

(AFONSO et al., 2012; DIAS et al., 2003; MORRISON et al., 1993; OLIVEIRA 

et al., 2008). Seu hábito alimentício é predominantemente noturno, tendo início 

aproximadamente uma hora após o pôr do sol (CAMARGO-NEVES, 2004). 

A Lutzomyia longipalpis teve sua presença descrita pela primeira vez no 

Estado de São Paulo em 1970, em área rural, e em área urbana em 1997, na 

cidade de Araçatuba (COSTA et al., 1997). Desde então estes flebótomos vêm 

se disseminando pela região e se adaptando às áreas urbanas, resultando no 

processo de expansão da doença (DESJEUX, 2004; SÃO PAULO, 2006; 

GOMES et al., 2011). 

 



15 
 

RESERVATÓRIO 

O cão doméstico tem sido considerado o reservatório de maior 

importância para a transmissão da LV ao homem, dada a alta prevalência da 

doença na população canina e seu estreito convívio com o homem. Outros 

reservatórios da doença como as raposas, marsupiais, roedores, edentados, 

procionídeos, primatas, felinos e morcegos têm sido relatados como 

reservatórios potenciais (DANTAS-TORRES; BRANDÃO-FILHO, 2006; DE 

OLIVEIRA, 2012; LAINSON; RANGEL, 2005; RICHARD; ASHFORD, 1996; 

WHO, 2010;). 

Alguns autores levantam a hipótese da transmissão da doença entre os 

caninos através da picada ou ingestão de carrapatos infectados (COUTINHO et 

al., 2005; DANTAS TORRES et al., 2010), por mordedura (DUPREY et al., 

2006), transmissão venérea (SILVA et al., 2009a), por transmissão vertical 

(SILVA et al., 2009b), entre outros, porém não se conhece a importância 

epidemiológica destes na transmissão da doença aos humanos. 

 
IMUNIDADE E DIAGNÓSTICO NO RESERVATÓRIO CANINO 

A infecção por Leishmania infantum chagasi em cães susceptíveis, 

geralmente leva à uma infecção de evolução crônica que nem sempre resulta 

no desenvolvimento de sinais (PALTRINIERI et al., 2010). 

O sistema imune do cão infectado possui um papel fundamental para o 

desenvolvimento da doença, cães que apresentam resposta imune celular mais 

evidente e nenhuma, ou fraca resposta humoral, geralmente permanecem 

saudáveis, sem desenvolvimento de sinais. Já os que apresentam intensa 

atividade imune humoral e fraca ou nenhuma atividade celular apresentam-se 

intensamente enfermos (PINELLI et al., 1994). 

Os sinais clínicos mais frequentes na leishmaniose visceral canina são: 

emagrecimento progressivo, evoluindo para caquexia, onicogrifose, lesões 

cutâneas, alopecia, esplenomegalia, linfoadenopatia, ceratoconjuntivite, 

diarreia, hemorragias, paresia e edema de membros posteriores (BRASIL, 

2006, SOLANO-GALEGO et al., 2009). 



16 
 

O tempo de soroconversão, após infecção natural, em geral é maior 

quando comparado ao observado em infecção experimental. Em cães 

submetidos à infecção experimental, o tempo de soroconversão varia de 30 a 

150-180 dias (MORENO;ALVAR, 2002), ao passo que em infecção natural este 

período pode durar de um mês a quatro anos (KEENAN et al., 1984; LANOTTE 

et al., 1979).  

O diagnóstico clínico, isoladamente, não é recomendado no controle da 

enfermidade, pois de 40 a 60% dos cães soropositivos são assintomáticos 

(BRASIL, 2006) e mesmo sem sintomas clínicos podem apresentar grande 

quantidade de parasitos na pele, o que facilita a infecção do vetor (MONTEIRO 

et al., 1994). 

O diagnóstico laboratorial pode ser realizado por exames parasitológicos 

após punção aspirativa e esfregaço de medula óssea, linfonodo, baço, fígado, 

pele e sangue; por imunohistoquímica; pela detecção de anticorpos circulantes 

anti-Leishmania, ou por exames moleculares como a amplificação de DNA pela 

reação em cadeia pela polimerase (PCR) (LAURENTI, 2009; PEREIRA-

CHIOCCOLA, 2009).  

O exame parasitológico apresenta especificidade de 100% uma vez que 

se baseia na observação direta da forma amastigota do parasito, porém, a 

sensibilidade pode variar de 30 a 91%, dependendo do tipo de material colhido 

e do grau de parasitismo (FERRER, 1999; KOUTINAS et al., 2001). Portanto, 

em um animal assintomático, o diagnóstico se torna mais difícil e duvidoso, 

sendo baixo o valor preditivo negativo. 

O teste ELISA pode apresentar sensibilidade variando entre 80% e 

99,5% e especificidade entre 81% e 100%, dependendo do antígeno utilizado 

(MANCIANTI et al., 1995; 1996). A utilização de antígenos purificados ou 

recombinantes melhora a sensibilidade e especificidade desta técnica (COSTA 

et al., 1991; OZENZOY, 1998; SCALONE et al., 2002). Após o 

desenvolvimento do antígeno recombinante rK39 foi possível desenvolver 

testes rápidos para leishmaniose visceral que possuem um formato fácil e 

prático para se implementar em inquéritos caninos (GENARO et al.,1997; 



17 
 

METTLER et al., 2005; PATTABHI et al., 2010). O rK39 foi elaborado através 

de técnicas de clonagem e sua sequência codifica uma proteína 

imunodominante com epítopo repetitivo conservado entre as leishmanias do 

complexo donovani, mas especialmente entre a Leishmania infantum chagasi e 

Leishmania donovani, não apresentando reatividade cruzada com 

Trypanosoma cruzi. Assim, o antígeno recombinante rK39 apresenta grande 

especificidade e aplicabilidade no sorodiagnóstico da leishmaniose visceral 

(BURNS et al., 1993)  

O teste rápido com antígeno rK39 foi avaliado em cidades brasileiras 

endêmicas para leishmaniose, revelando sensibilidade de 92% e especificidade 

de 99,5% em cães (GENARO et al., 1997). 

 Embora o antígeno rK39 seja mais específico, resulta em baixa 

sensibilidade em animais em processo de cura ou recém infectados, possuindo 

assim maior sensibilidade em animais com doença ativa (BADARÓ et al., 

1996). Para minimizar este fato, novo antígeno recombinante foi desenvolvido 

através da fusão de poliproteínas compreendendo regiões haspb1 (do inglês, 

hydrophilic acylated surface protein b) de L. donovani (homólogo da K26 de L. 

infantum chagasi), cinesina de L. donovani (homólogo da K39 de L. infantum 

chagasi) e toda a sequência haspb2 de L. donovani (homólogo da K9 de L. 

infantum chagasi). A partir deste novo antígeno, denominado rK28, foi criado 

um novo teste rápido, de dupla plataforma (DPP), mais sensível e específico do 

que o utilizado com antígeno rK39, devido ao fato de poder detectar anticorpos 

circulantes contra os três componentes do antígeno e gerando um sinal mais 

forte (PATTABHI et al., 2010). 

Dentre os métodos diagnósticos moleculares para LV, a técnica de PCR 

convencional é uma técnica que, por amplificar exponencialmente o DNA do 

parasito, apresenta alta sensibilidade, mesmo se efetuado em amostras com 

baixa carga parasitária, sendo capaz de identificar o material genético do 

parasito nos cães antes mesmo da soroconversão (STRAUSS-AYALI et al., 

2004). Já a PCR em tempo real (qPCR) apresenta a vantagem de ser mais 

sensível e rápida, além de permitir a quantificação da carga parasitária em 



18 
 

indivíduos infectados (FRANCINO et al., 2006; CARSON et al., 2010; RAMOS 

et al. 2012), uma problemática existente no controle desta doença, uma vez 

que a carga parasitária do animal pode influenciar a chance de transmissão do 

agente etiológico para o vetor (COURTENAY et al., 2002; MICHALSKY et al., 

2007; SOARES et al., 2011) e, consequentemente, no risco para o ser humano. 

Alguns estudos mostram que a carga parasitária pode variar de acordo 

com o tecido e tempo de evolução da doença no cão (MANNA et al., 2006; 

QUARESMA et al., 2009) mas pouco se conhece, por exemplo, sobre o papel 

dos cães com diferentes cargas parasitárias na sua infectividade ao vetor.  

Amorim et al. (2011) realizaram estudo com cães naturalmente 

infectados e observaram que a carga parasitária de pele dos cães foi menor 

naqueles que eram não infectantes ao xenodiganóstico. Laurenti et al. (2013) 

não observaram relação entre a carga parasitária de pele de cães, sintomáticos 

ou assintomáticos, com a transmissibilidade do parasito ao vetor. 

 

VIGILÂNCIA E CONTROLE 
As estratégias de controle da LV no Brasil estão baseadas no 

diagnóstico e tratamento precoce de casos humanos, no controle dos vetores 

através do uso de inseticidas e na triagem sorológica com posterior eutanásia 

de cães positivos para leishmaniose (COSTA;VIEIRA, 2001; PALATNIK-DE-

SOUSA et al., 2001).  

A adoção da eutanásia como medida de controle de qualquer zoonose, 

em geral, não tem a adesão de grande parcela da população. Além do aspecto 

de proteção e bem-estar animal, há controvérsias no que diz respeito à 

eficiência da eutanásia de cães sorologicamente positivos como medida de 

controle da LV (COSTA, 2011; COURTENAY et al., 2002; GRIMALDI et al., 

2012), isto porque ainda existe a dificuldade em correlacionar soropositividade 

com infectividade em cães (ASHFORD et al., 1995), bem como pelo período de 

pré-patência, quando o animal infectado pelo protozoário ainda não apresenta 

soroconversão. 



19 
 

No ano de 2011 o Ministério da Saúde recomendou a utilização do teste 

rápido “Dual Path Platform- DPP” (Bio-Manguinhos®), com rK28 e ouro coloidal 

para triagem dos cães e confirmação dos positivos por meio do teste de ELISA 

com antígenos solúveis e purificados de Leishmania major like (EIE-ELISA, 

Bio-Manguinhos®) (BRASIL, 2011). Desde 2012 esta recomendação vem 

sendo paulatinamente introduzida. 



20 
 

OBJETIVO 

Considerando-se que a resposta imune humoral desenvolvida por cães à 

infecção natural por Leishmania spp. é dependente da carga parasitária, o 

objetivo do presente trabalho foi avaliar se o resultado dos testes diagnósticos 

atualmente utilizados em inquéritos soro epidemiológicos no Brasil (teste 

rápido-DPP BioManguinhos® e teste ELISA indireto EIE-ELISA 

BioManguinhos®) apresentam alguma relação com a carga parasitária em 

sangue de cães de área endêmica para leishmaniose visceral. 

 



21 
 

REFERÊNCIAS 

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34 
 

CAPÍTULO 2 - PRESENÇA DE ANTICORPOS ANTI-Leishmania spp. E 
CARGA PARASITÁRIA EM SANGUE DE CÃES DE ÁREA ENDÊMICA PARA 
LEISHMANIOSE VISCERAL* 

 
RESUMO - A identificação do reservatório canino da leishmaniose 

visceral (LV) é uma das medidas de controle desta zoonose e baseia-se na 

detecção de anticorpos anti-Leishmania em amostras de soro. Este estudo 

avaliou o desempenho relativo dos testes diagnóstico atualmente utilizados no 

Brasil para inquéritos soro-epidemiológicos (Teste rápido DPP e EIE-ELISA, 

BioManguinhos®), comparando-os aos resultados da carga parasitária avaliada 

por PCR em tempo real (qPCR). Foram utilizadas amostras de sangue e soro 

de 610 cães de 28 cidades da região noroeste do Estado de São Paulo, 

endêmica para LV. A positividade observada ao DPP foi de 33,8%, ao EIE-

ELISA 15,9% e à qPCR 68,4%, com sensibilidade de 33,1% ao DPP, 17,0% ao 

EIE-ELISA e 12,9% quando realizados em série, e especificidade de 64,8%, 

86,5% e 88,6% respectivamente. A concordância entre os resultados do DPP e 

EIE-ELISA foi sofrível (Kappa=0,37), e muito pobre entre qualquer um deles e a 

qPCR (Kappa<0,05). Observou-se diferença estatisticamente significante 

(p=0,0008) para os valores de carga parasitária entre os cães considerados 

negativos e positivos ao teste EIE-ELISA ou ao DPP (p=0,03), bem como 

quando se considerou o resultado dos dois testes em série (p=0,0008), 

indicando que a média da carga parasitária dos cães positivos é maior do que a 

dos negativos. Entretanto, a avaliação do potencial de transmissão dos cães 

sorologicamente negativos faz-se necessária. 

 
 
Palavras-Chave: Leishmaniose visceral, diagnóstico, teste rápido, ELISA, 

qPCR. 

 



35 
 

 

PRESENCE OF ANTI Leishmania spp. ANTIBODY AND PARASITE LOAD 
IN DOGS FROM A VISCERAL LEISHMANIASIS ENDEMIC AREA  
 

SUMMARY – The detection of antibodies in dogs, followed by 

euthanasia, is one of the measures used to control visceral leishmaniasis (VL) 

in Brazil. We’ve evaluated the relative performance of the diagnostic tests 

currently in use in Brazil for sero-epidemiological surveys (DPP rapid test and 

EIE-ELISA, BioManguinhos™) comparing them to real time PCR (qPCR) 

parasite load results. Blood and serum samples of 610 dogs from 28 endemic 

cities for VL in the northwestern region of São Paulo, were used. Positivity was 

33.8 % by DPP, 15.9% by EIE-ELISA and 68.4% by qPCR. Sensitivity was 

33.1% for DPP, 17.0% for EIE-ELISA and 12.9% when considering DPP and 

EIE-ELISA performed in serial, while specificity was 64.8%, 86.5%, and 88.6%, 

respectively. Agreement between DPP and EIE-ELISA results was considered 

fair (kappa=0.37), and very poor between any of the tests and qPCR 

(Kappa<0.05). There was a statistically significant difference on the parasite 

load (p=0.0008) between negative and positive dogs by EIE-ELISA or DPP 

(p=0.03), or when considering the outcome of the two tests in serial (p=0.0008), 

indicating that the mean parasite load of the positive dogs is higher than the 

negative ones. Nevertheless, the potential of transmission of the negative dogs 

shall be investigated.  

 

 

 

Key-words: Visceral leishmaniasis, diagnosis , rapid test , ELISA , qPCR. 

 



36 
 

INTRODUÇÃO 

A leishmaniose visceral (LV) é uma doença crônica grave com letalidade 

de até 10% em pacientes humanos, quando não tratados adequadamente. É 

considerada uma das zoonoses mais importantes no mundo, dada sua alta 

incidência e mortalidade (ALENCAR; DIETZE, 1991; BRASIL, 2006; DESJEUX, 

2004), principalmente em crianças, indivíduos subnutridos e em pacientes 

imunocomprometidos (BRASIL, 2006; MADALOSSO et al., 2012; SOUSA-

GOMES et al., 2011). 

As estratégias de controle da LV no Brasil estão baseadas no 

diagnóstico e tratamento precoce de casos humanos, no controle dos vetores 

por meio do uso de inseticidas e na triagem sorológica, com posterior eutanásia 

de cães positivos para leishmaniose (BRASIL, 2006; COSTA;VIEIRA, 2001; 

PALATNIK-DE-SOUSA et al., 2001). 

 Anualmente um grande esforço é empenhado pelo governo para se 

prevenir e controlar a leishmaniose visceral, através de ações como a 

eutanásia do reservatório canino, realizada com base nos resultados do teste 

imunocromatográfico (DPP-BioManguinhos®) seguido por confirmação pelo 

teste de ELISA (EIE-BioManguinhos®). Porém, esta ação é eficaz quando os 

testes diagnósticos apresentam a maior sensibilidade possível (PALATINIK-

DE-SOUSA et al., 2001; 2004), associada à realização da eutanásia dos cães 

infectados no menor tempo após diagnóstico e, quando os resultados se 

correlacionam com a infectividade dos cães (COURTENAY et al., 2002). 

A adoção da eutanásia como medida de controle de qualquer zoonose, 

em geral, não tem a adesão de grande parcela da população, devido à estima 

dos proprietários por seus animais, e por parte da comunidade científica 

particularmente pela dificuldade em correlacionar soropositividade com 

infectividade em cães e a eficácia desta medida no controle da leishmaniose 

visceral canina (LVC) (ASHFORD et al., 1995; COSTA, 2011; COURTENAY et 

al., 2002; GRIMALDI JÚNIOR et al., 2012b; OTRANTO; DANTAS-TORRES, 

2013). 



37 
 

Os cães são o principal agente na transmissão da LV não só pelo 

estreito relacionamento do cão com os humanos, mas também por sua 

incapacidade imunológica em responder à enfermidade com sucesso na 

maioria dos casos, onde apenas 15% dos cães infectados são capazes de 

impedir o estabelecimento da doença ou até mesmo curar espontaneamente 

(FISA et al., 1999). A resposta imune humoral é possivelmente desenvolvida de 

maneira dependente da carga parasitária (COURTENAY et al., 2002; MANNA 

et al., 2009). A infectividade ao vetor, por sua vez, pode ser influenciada pela 

carga parasitária, já demonstrada em medula óssea (COURTENAY et al., 

2002) e em linfonodo (LAURENTI et al., 2013) do animal infectado. 

Considerando-se que a resposta imune humoral desenvolvida por cães à 

infecção natural por Leishmania spp. é dependente da carga parasitária, o 

objetivo do presente trabalho foi avaliar se o resultado dos testes diagnósticos 

atualmente utilizados em inquéritos soro epidemiológicos no Brasil (teste 

rápido-DPP BioManguinhos® e teste ELISA indireto EIE-ELISA 

BioManguinhos®) apresentam relação com a carga parasitária circulante de 

cães de área endêmica para leishmaniose visceral. 

 

 
MATERIAL E MÉTODOS 
 

ÁREA DE ESTUDO E AMOSTRAGEM 

Este estudo transversal foi realizado em 28 cidades da região noroeste 

do Estado de São Paulo, Brasil, selecionadas por conveniência e segundo a 

classificação epidemiológica da época (GOMES et al., 2011), sendo 22 cidades 

com transmissão canina e humana de LV, cinco com transmissão canina 

somente e uma sem transmissão, porém, com presença do vetor e próximo a 

dois importantes eixos viários. 

A região noroeste do Estado de São Paulo apresenta clima tropical com 

invernos secos e verões chuvosos com a temperatura média do mês mais frio 



38 
 

maior ou igual a 18°C e a do mês mais quente maior ou igual a 22°C (ROLIN et 

al., 2007).  

Considerando distribuição normal, prevalência de LVC de 2% e erro de 

estimativa de 5%, o tamanho amostral foi calculado em 500. Optou-se por 

avaliar 610 cães de diferentes raças, sexo, idade, porte e pelagem, de 

domicílios selecionados intencionalmente por terem a presença de pelo menos 

uma galinha, hospedeiro que favorece a presença de flebotomíneos (AFONSO 

et al, 2012; CASANOVA et al., 2013; LAINSON; RANGEL, 2005; MOREIRA et 

al., 2003). A indicação do cão a ser avaliado foi feita pelo residente. 

 

COLETA DE DADOS 
 Os proprietários, após consentirem com a participação na pesquisa, 

responderam a um questionário que abrangia os dados de identificação do 

proprietário, número de cães que habitavam a mesma casa, número de 

galinhas coabitando com os cães, dados do cão avaliado (raça, idade e sinais 

clínicos), bem como dados do peridomicílio. 

 

SINAIS CLÍNICOS 
 Os cães foram avaliados para presença ou ausência de sinais clínicos 

que usualmente levariam o proprietário a encaminhar este animal a um médico 

veterinário: emaciação, lesões de pele (lesões ulcerativas, dermatite, 

hiperqueratose, alopecia), onicogrifose, conjuntivite, uveite, linfoadenomegalia, 

claudicação, palidez de mucosas e aumento de volume abdominal. 

 

COLHEITA DE MATERIAL BIOLÓGICO 
 Após consentimento e indicação do proprietário, o cão foi contido com 

focinheira e a colheita de sangue foi realizada pela veia cefálica ou jugular. 

Para a realização dos testes DPP e EIE-ELISA (BioManguinhos®) as amostras 

de sangue colhidas foram depositadas em tubos plásticos, sem anticoagulante, 

e mantidas em temperatura ambiente, por no máximo 12 horas, até serem 



39 
 

centrifugadas a 500g, durante 7 minutos, para separação da fração sérica, a 

qual foi armazenada em alíquotas, a -20°C. 

 Para a realização da PCR em tempo real a amostra de sangue foi 

distribuída homogeneamente sobre o campo delimitado de papel filtro FTA 

(Whatman®), o qual foi secado sob condições ambientais, overnight, 

acondicionado individualmente em embalagem plástica com sílica 

hermeticamente fechada (CORRAN et al., 2008), e armazenado em 

temperatura ambiente. 

 Os testes foram conduzidos em duplo cego, de modo a não possibilitar a 

identificação das amostras. 

 

TESTE RÁPIDO DPP E EIE-ELISA BIOMANGUINHOS® 
 Os testes sorológicos imunocromatográfico DPP-LVC e ELISA indireto 

EIE-LVC (BioManguinhos®), com o antígeno recombinante rK28 associado a 

ouro coloidal e antígenos solúveis e purificados de Leishmania major like 

obtidos a partir de cultura in-vitro, respectivamente, foram realizados de acordo 

com as recomendações do fabricante no Laboratório de Bioquímica e Biologia 

Molecular Animal – LBBMA da UNESP de Araçatuba. 

 As amostras foram classificadas, ao DPP, segundo a ausência de 

formação de uma linha (negativo) e presença de uma linha de intensidade 

variável (entre fracamente positiva, positiva e fortemente positiva), de acordo 

com as recomendações do fabricante. 

 Ao teste EIE-ELISA, as amostras foram testadas em duplicatas e foram 

consideradas positivas quando o valor da média das densidades ópticas era 

maior que 2,4 vezes a média da densidade óptica (D.O.) dos quatro controles 

negativos. Valores entre 2 e 2,4 vezes a média da D.O. dos controles negativos 

foram consideradas indeterminadas, de acordo com as recomendações do 

fabricante. Amostras consideradas indeterminadas após repetição do teste EIE-

ELISA, foram consideradas positivas para fins de análise. 

 



40 
 

AMPLIFICAÇÃO DE kDNA POR PCR EM TEMPO REAL (qPCR) 

 A qPCR foi realizada no Ecology and Epidemiology Laboratory (C123) 

da School of Life Science na Universidade de Warwick, Inglaterra, a partir de 

sangue total estabilizado nos cartões FTA (Whatman®), devido à facilidade de 

coleta de material e eficácia comprovada. O DNA foi extraído e purificado com 

o kit Chemagic Blood Spot Kit LH (PerkinElmer®), de acordo com as 

recomendações do fabricante. 

 Para amplificar uma região conservada do kDNA de Leishmania spp. de 

120pb, utilizaram-se os oligonucleotídeos iniciadores Leish1 

(AACTTTTCTggTCCTCCgggTAg), Leish2 (ACCCCCAgTTTTCCgCC) e sonda 

(6FAM-AAAAATgggTgCAgAAACCCCgTTC—BBQ), de acordo com Francino et 

al. (2006), com adaptações. 

 Em cada reação foram utilizados 900 nM de cada oligonucleotídeo 

iniciador, 250 nM de DNA, 6,5L de TaqMan® master mix (2X) (Applied 

Biosystems®), em um volume final de 15 L. As condições da qPCR foram de 

50°C por 2 minutos, 95°C por 10 minutos, seguido por 40 ciclos de 95°C, por 

15 segundos, e 60°C, por 60 segundos (Applied Biosystems® 7500 Fast Real-

Time PCR system). 

 A quantificação absoluta de Leishmania spp. foi feita com base na 

comparação dos valores dos limiares de fase exponencial (Ct-do inglês cycle 

threshold) com os obtidos na curva padrão, construída a partir de 10 séries de 

diluições (0,01 a 105 parasitos/mL) de DNA extraído de cultura de 

promastigotas de Leishmania infantum (ITAMP-263 DD8). Todas as amostras 

foram avaliadas em triplicata. 

 

ANÁLISE ESTATÍSTICA 
A concordância entre as técnicas diagnósticas foi avaliada por meio do 

coeficiente de concordância Kappa e interpretado de acordo com a 

classificação de Landis e Koch (1977). Para o cálculo da sensibilidade de cada 

teste considerou-se a qPCR como padrão ouro. 



41 
 

 A associação entre o resultado dos testes sorológicos e os resultados da 

qPCR (cargas nulas X cargas maiores que 0) foi realizada pelo teste de ² 

utilizando-se o programa BioEstat (5° edição). 

 Os valores de carga parasitária foram transformados para logaritmos de 

base 10, a fim de que obtivéssemos uma distribuição log normal dos dados, 

uma vez que a distribuição dos valores de carga parasitária apresentou-se 

assimétrica. Avaliou-se então a igualdade de variâncias dos valores de cargas 

parasitárias diferentes de zero, de acordo com os resultados de cada teste 

sorológico, utilizando-se o teste F. Diferenças nos valores médios de carga 

parasitária de resultados positivos e negativos em cada um dos testes 

sorológicos foram avaliados pelo teste t, ou teste t para variâncias não 

homogêneas. Esta etapa foi realizada utilizando-se um script desenvolvido 

localmente no programa R. Adotou-se nível de confiança de 95% em todas as 

análises estatísticas. 

 

COMITÊ DE ÉTICA 
 Esta pesquisa teve aprovação do Comitê de Ética em Experimentação 

Animal (CEUA) da UNESP, câmpus de Araçatuba (processo FOA - 01400-

2012). 

 

RESULTADOS 
 As residências avaliadas possuíam em média 2,4 cães e 45 galinhas. Os 

quintais não eram cimentados em 71% das residências, 64,4% foram 

considerados com condições propícias para o desenvolvimento de 

flebotomíneos. Setenta e nove por cento (449/568) dos moradores não 

realizavam quaisquer estratégias de prevenção da LVC. 

 Os cães apresentavam idade média de 40 meses, tendo o mais novo 

dois meses e o mais velho 240 meses; 52,4% (319/609) dos cães eram 

machos e 47,6% (290/609) fêmeas;  77,2% (437/566) dos animais não 

possuíam raça definida. Dos cães estudados, apenas 12,3% (68/552) 



42 
 

apresentavam sinais que poderiam induzir o proprietário a levar o animal ao 

veterinário.  

 A positividade para a presença de anticorpos anti-Leishmania observada 

ao DPP foi de 33,8% (206/610), ao EIE-ELISA 15,9% (97/610), ao DPP e EIE-

ELISA quando realizados em série 12,5% (76/610) e à qPCR foi de 68,4% 

(417/610). O DPP apresentou a maior sensibilidade, seguida do EIE-ELISA e 

DPP e EIE-ELISA quando realizados em série (Tabela 1). A maior 

especificidade foi observada ao realizar os testes DPP e EIE-ELISA em série, 

em seguida pelo teste EIE-ELISA e DPP (Tabela 1). 

 

Tabela 1- Sensibilidade e especificidade dos testes diagnósticos DPP, EIE-

ELISA e DPP seguido de EIE-ELISA quando realizados em série (DPP+EIE) e 

número de cães positivos para leishmaniose visceral canina de acordo com 

cada teste (n=610) 

Teste Sensibilidade(%) Especificidade(%) 
cães 

positivos (n) 

DPP 33,1 64,8 206 

EIE-ELISA 17,0 86,5 97 

DPP+EIE 12,9 88,6 76 

 

Grande parte dos cães que foram considerados positivos ao DPP 

apresentaram resultado negativo ao ELISA (63,1%), confirmando a 

característica de maior especificidade desta estratégia. Entretanto, de 97 cães 

considerados positivos ao EIE-ELISA somente 76 eram positivos ao DPP, ou 

seja, 21,7% dos cães eram falsos negativos ao teste de triagem, resultando em 

3,4% de cães possivelmente infectados que permanecem na população.  

A concordância entre os resultados do DPP e EIE-ELISA, foi 

considerada razoável (fair) (Kappa=0,37) (Tabela 2), pobre entre os resultados 

do DPP e qPCR (Kappa= -0,02) (Tabela 3) bem como entre os do EIE-ELISA e 



43 
 

qPCR (Kappa=0,03) (Tabela 4), ou entre os resultados do DPP e ELISA 

(realizados em série) e os da qPCR (Kappa=0,01) (Tabela 5). 

 Os resultados ao DPP estiveram significativamente associados aos do 

teste EIE-ELISA (p<0,0001), ao teste de ² para independência, porém, os 

resultados dos testes EIE-ELISA, teste rápido DPP ou DPP e EIE-ELISA 

(realizados em série) não apresentaram associação significativa com os 

resultados de positividade (carga parasitária >0) ou negatividade observados à 

qPCR (p>0,05). 

 

Tabela 2- Distribuição dos resultados do DPP de acordo com os do EIE-ELISA 

 

DPP 
EIE-ELISA 

Total 
POS % NEG % 

POS 76 12 130 21 206 

NEG 21 3 383 63 404 

Total 97 - 513 - 610 

 

 

 

Tabela 3- Distribuição dos resultados do DPP de acordo com os da qPCR 

 

DPP 
qPCR 

Total 
POS NEG 

POS 138 68 206 

NEG 279 125 404 

Total 417 193 610 



44 
 

Tabela 4- Distribuição dos resultados do EIE-ELISA de acordo com os da 

qPCR 

 

EIE-
ELISA 

qPCR 
Total 

POS NEG 

POS 71 26 97 

NEG 346 167 513 

Total 417 193 610 

 

 

 

Tabela 5- Distribuição dos resultados do DPP e EIE-ELISA quando realizados 

em série de acordo com os da qPCR 

 

DPP +  
EIE-ELISA 

qPCR Total 
POS NEG 

POS 54 22 76 
NEG 363 171 534 
Total 417 193 610 

 

 

 

 Considerando-se apenas os cães que apresentaram carga parasitária à 

qPCR, obtivemos uma distribuição não Normal, com mediana de 19,6 

parasitos/mL de sangue, variando de 0,04 a 2.370 parasitos/mL de sangue. Os 

cães negativos ao teste EIE-ELISA possuíam em média 18,3 parasitos/mL, 

(log10 2,9 parasitos/mL), e os animais positivos em média 44,7 parasitos/mL 

(log10 3,7 parasitos/mL) (Figura 1a). Os cães negativos ao DPP possuíam em 

média 18,6 parasitos/mL (log10 1,3 parasitos/mL) e os positivos em média 27,9 

parasitos/mL (log10 1,5 parasitos/mL) (Figura 1b). Já os cães considerados 

positivos ao teste DPP e ao teste EIE-ELISA (testes em série) apresentaram 



45 
 

em média 50,9 parasitos/mL (log10 1,7 parasitos/mL) ao passo que os negativos 

apresentaram em média 18,7 parasitos/mL (log10 1,3 parasitos/mL) (Figura 1c). 

 Observou-se que a carga parasitária média dos animais positivos aos 

testes DPP, EIE-ELISA ou DPP e EIE-ELISA (realizados em série) foi 

significantemente maior do que a dos negativos (p<0,05) ao teste t (Figura 1).  

 

 

 

 
FIGURA 1- Carga parasitária de cães de acordo com o resultado a) do teste 

EIE-ELISA; b) do teste DPP; c) dos testes EIE-ELISA e DPP realizados em 

série. Carga parasitária de Leishmania spp. avaliada por qPCR. 

 



46 
 

Observou-se forte associação entre presença de sinais observáveis 

pelos proprietários e o resultado sorológico positivo (p<0,0001) (Tabela 6); já a 

carga parasitária no sangue não se revelou estatisticamente associada à 

presença de sinais (p>0,05) (Tabela 7). 86% dos animais assintomáticos eram 

positivos à qPCR. 

 

Tabela 6- Distribuição dos resultados sorológicos de acordo com presença ou 

ausência de sinais clínicos 

 

Sinais 
Geral sorológico 

Total 
POS % NEG % 

Presente 19 28 49 10 68 

Ausente 48 72 436 90 484 

Total 67 100 485 100 552 

 

 

Tabela 7- Distribuição dos resultados do qPCR de acordo com presença ou 

ausência de sinais clínicos 

 

Sinais 
qPCR 

Total 
POS % NEG % 

Presente 52 14 16 9 68 

Ausente 320 86 164 91 484 

Total 372 100 180 100 552 

 
DISCUSSÃO 

Na presente pesquisa a presença de anticorpos anti-Leishmania spp. 

identificada pelos testes DPP e/ou EIE-ELISA e a carga parasitária foram 

avaliadas e relacionadas, com o intuito de melhor caracterizar o diagnóstico 

sorológico utilizado para identificação do reservatório canino no Brasil. 



47 
 

A concordância razoável observada entre os testes DPP e EIE-ELISA 

pode estar relacionada a diferentes sensibilidades e especificidades 

observadas em cada um dos testes que, juntamente com os valores baixos de 

sensibilidade e especificidade, contribuem para a  baixa eficácia da estratégia 

de inquéritos soro-epidemiológicos seguida de eutanásia recomendada pelo 

Programa de Vigilância e Controle da Leishmaniose Visceral (PVCLV) do 

Brasil. O sucesso dos programas de controle da doença depende diretamente 

de diagnóstico preciso, rápido e da eliminação do hospedeiro tão rápido este 

seja identificado (COURTENAY et al., 2002). Diagnósticos com baixa 

sensibilidade não são as melhores opções para os testes de triagem. Da 

mesma forma que testes com baixos índices de especificidade não são 

confirmatórios.  

A ausência de associação significante e baixa concordância entre os 

resultados sorológicos e os da qPCR observados corroboram com os de  

Risueño et al. (2012) que observaram fraca concordância entre os resultados 

de ELISA e os da qPCR, tanto em amostras de linfonodo, pele ou baço quanto 

nas de sangue. Laurenti et al. (2013) também não observaram correlação entre 

a carga parasitária avaliada por imunohistoquímica em pele e os níveis de 

imunoglobulinas. Já Mohammadiha et al. (2013) observaram concordância 

quase que perfeita entre o teste de aglutinação direta (títulos ≥ 1/80) e os 

resultados da qPCR em soro canino.  

A falta de associação e baixa concordância provavelmente se 

relacionam à natureza diferente das variáveis analisadas (anticorpos x DNA), 

sendo que a produção de anticorpos depende da resposta imune do 

hospedeiro, a qual pode ser predominantemente humoral ou celular 

(PALTRINIERI et al., 2010; PINELLI et al., 1994). Além disto, a resposta imune 

do cão é influenciada por outros fatores como seu estado nutricional, o estágio 

de evolução da doença e o tempo decorrido da infecção (MORENO; ALVAR, 

2002).  

Os testes DPP e EIE-ELISA apresentaram baixa sensibilidade 

comparando-se à sensibilidade da qPCR, muito provavelmente pelo fato dos 



48 
 

testes sorológicos dependerem da produção de anticorpos do hospedeiro para 

então serem detectados, ao passo que a qPCR pode detectar o parasito antes 

mesmo do desenvolvimento de resposta imune do animal, apresentando menor 

interferência do cão hospedeiro e detectando mais precocemente o parasito no 

cão (QUINNELL et al., 2001). Baneth e colaboradores (2008) demonstraram 

que, dentre todos os animais com leishmaniose visceral, apenas uma pequena 

parcela desenvolve sinais, uma parcela um pouco maior apresenta anticorpos 

anti-Leishmania spp. e, outra parcela maior que a anterior, apresenta 

resultados positivos à PCR. Grimaldi Júnior. et al. (2012a) também observaram 

baixa sensibilidade do teste rápido DPP (47%) utilizando o exame 

parasitológico como padrão ouro e sugeriram que, para maior eficiência do 

PVCLV do Brasil, um teste que possibilitasse a detecção de animais infectados 

o mais cedo possível deveria ser desenvolvido. Como a qPCR tem potencial 

para detectar a presença de DNA circulante mais precocemente que a 

presença de anticorpos, este seria um teste que resultaria em detecção eficaz 

do reservatório canino podendo contribuir ainda mais para o controle da LV 

(COURA-VITAL et al., 2011). 

A associação entre a presença de sinais clínicos e os resultados dos 

testes sorológicos também já foi observada por outros autores (BADARO et al., 

1996; GRIMALDI JÚNIOR et al., 2012a; LAURENTI et al., 2013; METLER et 

al., 2005; MOREIRA et al., 2007) e se relaciona ao fato de que um cão 

sintomático geralmente apresenta maior produção de anticorpos os quais 

favorecem o desenvolvimento da doença clínica, resultando em maior chance 

de detecção de imunoglobulinas pelos testes sorológicos (LAURENTI et al., 

2013; PALTRINIERI et al., 2010; PINELLI et al., 1994). Por outro lado, a 

presença de sinais não esteve significantemente associada à presença de 

carga parasitária, podendo favorecer a manutenção do reservatório canino na 

população, já que a presença de sinais clínicos poderia chamar a atenção dos 

proprietários a possivelmente levar seus cães para serem avaliados para a 

leishmaniose visceral. Laurenti et al. (2013) ao avaliaram a carga parasitária de 

linfonodo, baço e pele, por imunohistoquimica, não encontraram associação 



49 
 

com as alterações clinicas. Entretanto, Manna et al. (2009) observaram que há 

uma tendência dos cães com manifestações clínicas apresentarem maior carga 

parasitária à qPCR.  

Os cães sorologicamente positivos apresentaram carga parasitária 

significantemente maior que os negativos, podendo esta condição estar 

relacionada com seu potencial de transmissibilidade. Soares et al. (2011) e 

Laurenti et al. (2013) observaram que cães assintomáticos eram mais 

infectantes  aos flebotomíneos que os sintomáticos. Estudos sobre a influência 

que diferentes cargas parasitárias desempenham na resposta do hospedeiro e 

no seu potencial de transmissão são de suma importância para a interpretação 

do risco que este animal representa para o homem. 

 

CONCLUSÃO 

Não há associação entre a detecção de anticorpos anti-Leishmania spp. 

e a carga parasitária em cães de área endêmica para LV, embora cães 

sorologicamente positivos tenham carga parasitária média maior que os 

negativos. 

Outros estudos que avaliem a relação entre a carga parasitária do cão e 

a transmissão do parasito ao vetor são sugeridos a fim de se avaliar o potencial 

de transmissão dos cães sorologicamente positivos. 

 

REFERÊNCIAS 
 

AFONSO, M.M.S.; DUARTE, R.; MIRANDA, J.C.; CARANHA, L.; RANGEL, E. 

F. Studies on the feeding habits of Lutzomyia (Lutzomyia) longipalpis (Lutz & 

Neiva, 1912) (Diptera: Psychodidae: Phlebotominae) populations from endemic 

areas of American visceral leishmaniasis in Northeastern Brazil, J. Trop. Med., 
v. 2012, p. 1-5, 2012. 

 



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