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Letícia do Nascimento Andrade de Almeida Rego 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 
 

 

LETÍCIA DO NASCIMENTO ANDRADE DE ALMEIDA REGO 

Tese apresentada para obtenção do título de 

Doutor em Genética  

São José do Rio Preto - SP 
2012 

 

ESPERMATOGÊNESE DE ZAPRIONUS INDIANUS E 
ZAPRIONUS SEPSOIDES (DIPTERA: 

DROSOPHILIDAE): CARACTERIZAÇÃO 
CITOQUÍMICA, ESTRUTURAL E 

ULTRAESTRUTURAL 

 



2 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

    

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Tese apresentada para obtenção do título de Doutor 
em Genética, junto ao Programa de Pós-Graduação 
em Genética do Instituto de Biociências, Letras e 
Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista 
“Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do 
Rio Preto 

São José do Rio Preto - SP 
2012 

 

Orientadora: Profª Drª Lilian Madi-Ravazzi 

Co-orientadora: Profª Drª Maria Tercília Vilela de Azeredo-Oliveira 

ESPERMATOGÊNESE DE ZAPRIONUS INDIANUS E 
ZAPRIONUS SEPSOIDES (DIPTERA: 

DROSOPHILIDAE): CARACTERIZAÇÃO 
CITOQUÍMICA, ESTRUTURAL E 

ULTRAESTRUTURAL 

 

LETÍCIA DO NASCIMENTO ANDRADE DE ALMEIDA REGO 



3 

 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 

 

    
 

 

Rego, Letícia do Nascimento Andrade de Almeida. 

Espermatogênese de Zaprionus indianus e Zaprionus sepsoides 
(Diptera: Drosophilidae): caracterização citoquímica, estrutural e 

ultraestrutural / Letícia do Nascimento Andrade de Almeida Rego. - São 

José do Rio Preto : [s.n.], 2012. 

103 f. : il. ; 30 cm. 

 

Orientador: Lilian Madi-Ravazzi 

Co-orientador: Maria Tercília Vilela Azeredo-Oliveira 

Tese (doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de 

Biociências, Letras e Ciências Exatas 

            

1. Meiose.  2. Zaprionus indianus.  3. Zaprionus sepsoides. 4. 

Espermatogênese. 5. Citoquímica. I. Madi-Ravazzi, Lilian.  II. Azeredo-
Oliveira, Maria Tercília Vilela. III. Universidade Estadual Paulista, 

Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas.  IV. Título. 
 

   CDU – 576.354 

 
 

Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca do IBILCE 
 Campus de São José do Rio Preto - UNESP 

 

   
 
 
 

 



4 

 

 
LETÍCIA DO NASCIMENTO ANDRADE DE ALMEIDA REGO 

 
 

 
Espermatogênese de Zaprionus indianus e Zaprionus sepsoides (Diptera: Drosophilidae): 

caracterização citoquímica, estrutural e ultraestrutural. 
 
 
 
 
 
Tese apresentada para obtenção do título de 
Doutor em Genética, junto ao Programa de Pós-
Graduação em Genética do Instituto de 
Biociências, Letras e Ciências Exatas da 
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita 
Filho”, Campus de São José do Rio Preto. 

 
 
BANCA EXAMINADORA 
 

 
Profª Drª Lilian Madi-Ravazzi 
Professor Assistente Doutor 
UNESP – São José do Rio Preto 
Orientador 
 
_________________________________ 
 
Profª Drª Blanche Christine Pires de Bitner-Mathé Leal 
Professor Assistente Doutor 
Universidade Federal do Rio de Janeiro 
 
_________________________________ 
 
Profª Drª Maria Izabel Camargo Mathias 
Professor Titular 
UNESP – Rio Claro 
 
_________________________________ 
 
Profª Drª Hermione Elly Melara de Campos Bicudo 
Professor Emérito 
UNESP – São José do Rio Preto 
 
_________________________________ 
 
Profª Drª Patrícia Vilamaior  
Professor Assistente de Suporte Acadêmico 
UNESP – São José do Rio Preto 
 
_________________________________ 
 
 
 
 
 

São José do Rio Preto, 24 de Agosto de 2012 

 



5 

 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Este trabalho foi realizado no Laboratório de Genética, Ecologia e Evolução de 
Drosophila, no Laboratório de Biologia Celular, no Laboratório Multiusuário de 
Microscopia e Microanálise do Departamento de Biologia do Instituto de Biociências, 
Letras e Ciências Exatas, IBILCE, Universidade Estadual Paulista, UNESP de São 
José do Rio Preto, e também no Centro de Microscopia da Faculdade de Medicina 
da USP de Ribeirão Preto, com auxílio financeiro da CAPES. 

 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
  

 
 
 

 

 



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Dedico este trabalho, 

ao meu avô Zé Francisco (in memoriam),  

à Olivia minha afilhada,  

e ao Gabriel, meu primeiro sobrinho. 

 



7 

 

AGRADECIMENTOS 
 

 

 

À Profª Drª Lilian Madi-Ravazzi pela orientação, por confiar no meu trabalho, pelo 

incentivo, dedicação, respeito, ajuda incondicional, muita paciência e pelo carinho. Sem sua 

ajuda não conseguiria  ter ido até o fim, uma vez que, tive um doutorado um tanto quanto 

“conturbado”, com várias “quase-desistências”, momentos difíceis, com troca de orientador, 

de cidade e de Projetos de Pesquisa. MUITO OBRIGADA LILIAN! 

 

À Profª Drª Maria Tercília Vilela de Azeredo-Oliveira por abrir seu laboratório, pelas dicas, 

sugestões, aprendizado, pelo carinho, generosidade, por confiar em meu trabalho e em meu 

potencial, por sempre me incentivar e não deixar que eu desistisse de alcançar meus 

objetivos. 

 

À Drª Rosana Silistino de Souza, pois sem ela grande parte prática do trabalho não teria sido 

realizada e ainda por cima, de maneira muito caprichosa. Obrigada pela paciência, total 

disposição, aprendizado, incentivo, carinho e apoio incondicional, além das várias boas 

conversas, científicas ou não, que tivemos ao longo do trabalho.  

 

Ao Prof. Dr. Sebastião Roberto Taboga pela disponibilidade do Laboratório Multiusuário de 

Microscopia e Microanálise e ao técnico José Augusto Maulim pelo auxílio na captura de 

imagens no Centro de Microscopia da Faculdade de Medicina da USP de Ribeirão Preto. 

 

À Profª  Drª Mary Massumi Itoyama por ter sido a primeira a ter me aberto as portas desta 

Instituição e pelo incentivo, além das sugestões feitas durante meu Exame Geral de 

Qualificação do Doutorado. 

 

Aos membros da banca examinadora, pela contribuição e sugestões para melhorar este 

trabalho. 

 

A todos os funcionários do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas de São José do 

Rio Preto (UNESP/IBILCE) e, em particular, aos funcionários do Departamento de Biologia 

que sempre possibilitam, direta ou indiretamente, a realização das pesquisas científicas. 

Agradecimentos especiais ao técnico Sebastião Dias Barbosa, à Simone Carvalho Fernandes, 

 



8 

 

à Jucimara Colombo, ao Luís Roberto Faleiros e à Damaris de Freitas por serem sempre 

muito solícitos. Agradecimentos especiais também aos funcionários da Biblioteca e aos 

funcionários da Seção de Pós-graduação.  

 

Agradeço, também, aos meus amigos de laboratório Emiliyn, Maria Clara, Priscila 

Pasquetto, Ana Letícia, Caio e Leiza por fazerem parte desta jornada. 

 

Ao órgão de Fomento CAPES pela bolsa concedida. 

 

Aos meus pais, Bimbo e Lila, por todo amor e dedicação. Vocês são meus maiores 

incentivadores, meus pilares, minha vida. Agradeço por terem batalhado tanto para que 

pudessem me deixar a melhor herança de todas: a educação e o caráter. Jamais terei 

palavras suficientes para expressar a minha gratidão e o tamanho do meu amor por vocês, 

por isso, digo apenas: muito obrigada sempre e por tudo. Saibam que tudo que faço em 

minha vida é dedicado a vocês. Quero que se orgulhem de mim sempre, e estou em busca 

disso a todo o momento. 

 

Aos meus amados irmãos Felipe, Hugo, Mariana e Vitor pelo amor, carinho, amizade, por 

serem parceiros, pelos conselhos, por me apoiarem na ‘alegria e na tristeza, na saúde e na 

doença’. Ao Felipe por ser meu conselheiro ‘master’, meu biólogo preferido, meu irmão mais 

velho incentivador, meu ‘co-orientador’ informal, meu orgulho. Ao Hugo por sempre ser tão 

amável, prestativo, disponível e disposto, também super conselheiro, carinhoso, por me 

animar sempre e ser um exemplo de generosidade. Ao Vitor meu irmãozinho esebano 

querido, por ser tão legal, fofo, parceiro e amigo. À Mariana, minha irmã gêmea, meu 

‘confessionário’, literalmente, minha alma gêmea, te amo! 

 

À minha primeira orientadora científica, mãezona e incentivadora Sandra Morelli e à 

Alessandra, minha primeira co-orientadora ‘informal’ do Laboratório de Citogenética 

Animal da Universidade Federal de Uberlândia (UFU). 

 

Aos amigos da minha turma de graduação em Biologia da UFU que até hoje mantenho 

contato e quero ter sempre perto de mim: Ritinha Carneiro, Alexandre Bonder, Clarissa, 

Letícia Sueiro, Luisa Domingues e Lucas Zimon. 

 

 

 



9 

 

Aos amigos de Londrina por, de certa forma, fazerem parte dessa trajetória acadêmica e por 

serem inesquecíveis: Renata Bottós, Carolzinha Cainelli, Letícia Tartaglia, Lívia Bottura, 

Priscila Mary, Mariana Nardy, Thiaguim, Thiago Ribers. 

 

Aos amigos de Uberlândia, minha cidade natal, Mari Carneiro, Fredão, Deh e Philipim, 

Dani e Humberto, Ricardo, Tiago, Juninho e principalmente à Stela, minha melhor amiga! 

 

Aos amigos de São José do Rio Preto, Priscila Samara, Fabi Guchi, Adalgisa, Zé, Nayara, 

Maiara, Japa e André. 

 

Aos meus familiares queridos de Uberlândia e do Rio de Janeiro, em especial à vovó 

Placidina e à vovó Marise, Tia Susa e Carol e à madrinha Tia Regina. 

 

À minha cunhada querida Deisi e prima/cunhada/comadre também muito querida Beatrix. 

 

 

 

 

 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 

 



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“Science knows no country… 

Knowledge belongs to humanity… 

It’s the torch that illuminates the world.” 

 

                                             Louis Pasteur 



11 

 

RESUMO 

 

Zaprionus indianus é um drosofilídeo nativo da região Afrotropical que 

colonizou o continente Sul Americano, apresentando uma ampla distribuição 

geográfica enquanto Z. sepsoides é restrita a algumas regiões africanas. As duas 

espécies diferem em relação ao tamanho dos testículos e dos espermatozoides que 

é maior em Z. indianus do que em Z. sepsoides. Com o intuito de conhecer aspectos 

da biologia e o grau de diferenciação destas espécies, o presente estudo avaliou a 

espermatogênese de machos de diferentes idades (1, 3, 5 e 8 dias) de ambas as 

espécies por meio de técnicas de coloração convencional e de ultraestrutura. A 

espermatogênese e ultraestrutura dos espermatozoides foram semelhantes nas 

espécies em que foi confirmado o número diploide de cromossomos com 2n = 12. 

Entretanto, foi observada uma quantidade maior de espermatozoides em machos 

jovens (1 a 3 dias de idade) em Z. indianus do que em Z. sepsoides, o qual 

apresentou maior frequência de estágios iniciais da espermatogênese nestas 

idades. A porção da cabeça dos espermatozoides foi fortemente marcada nas duas 

espécies pela coloração por prata (AgNOR), orceína lacto-acética e pela reação de 

Feulgen. Quando submetidos à reação de P.A.S., os testículos de Z. sepsoides e Z. 

indianus apresentaram grânulos de glicogênio. As espécies possuem a mesma 

ultraestrutura flagelar, em que o axonema mostra um arranjo de 9+9+2 microtúbulos, 

com a presença de dois derivados mitocondriais de diferentes tamanhos e o número 

de 64 espermatozoides por feixe, em ambas as espécies. A grande semelhança 

observada no padrão do arranjo de microtúbulos do axonema e nos derivados 

mitocondriais com diferentes tamanhos nas espécies de Zaprionus, comparadas 

com outras espécies de Drosophila, é indicativa da conservação destas estruturas 

na família Drosophilidae. As diferenças observadas nos machos jovens de Z. 

indianus e Z. sepsoides quanto a quantidade de espermatozoides e frequência de 

células em fases iniciais da espermatogênese são características que podem 

interferir no sucesso reprodutivo e adaptativo destas espécies e estar relacionadas 

ao maior potencial invasivo de Z. indianus. 

 

Palavras-chave: Zaprionus indianus, Zaprionus sepsoides, espermatogênese, 

citoquímica, ultraestrutura, meiose. 

 

 
 



12 

 

ABSTRACT 
 
 

      Zaprionus indianus is a drosophilid native to the Afrotropical region that has 

colonized South America. Z. indianus exhibits a wide geographical distribution, 

whereas Z. sepsoides is restricted to certain African regions. The two species differ in 

the size of their testes, which are larger in Z. indianus than in Z. sepsoides. To better 

understand the biology and the degree of differentiation of these species, the current 

study evaluated spermatogenesis in males of different ages (1, 3, 5 and 8 days old) 

from both species by conventional staining techniques and ultrastructural analysis. 

Spermatogenesis and the ultrastructure of spermatozoa were similar in the two 

species, for which the diploid number was confirmed to be 2n = 12 chromosomes. 

However, a greater number of spermatozoa were observed in young Z. indianus 

males (1-3 days old) than in young Z. sepsoides males, which showed a higher 

frequency of cells at the early stages of spermatogenesis at this age. A portion of the 

head of the sperm was strongly marked in both species by silver staining (AgNOR), 

lacto-acetic orcein and the Feulgen reaction. Additionally, when submitted to P.A.S. 

reaction, the testes of both Z. sepsoides and Z. indianus exhibited glycogen 

granules. The two species also presented the same flagellar ultrastructure, in which 

the axoneme includes a 9+9+2 arrangement of microtubules, two mitochondrial 

derivatives of different sizes are present and the number of spermatozoa per bundle 

is 64. The great similarity in the pattern of microtubule arrangement in the axoneme 

and in the mitochondrial derivatives of the species Zaprionus, as compared with 

other species of Drosophila, indicates that these structures are preserved in the 

family Drosophilidae. The differences observed between the young males of Z. 

indianus and Z. sepsoides, including the number and frequency of sperm cells in the 

early stages of spermatogenesis, are features that may interfere with reproductive 

success and may be related to the invasive potential of Z. indianus. 

 

Keywords: Zaprionus indianus, Zaprionus sepsoides, spermatogenesis, 

cytochemistry, ultrastructure, meiosis. 

 

 

 

 



13 

 

 

SUMÁRIO 
 

 
 
 
 
 

1 INTRODUÇÃO 14 

1.1 Gênero Zaprionus 16 

1.2 Aspectos biológicos de Zaprionus indianus 17 

1.3  Espermatogênese em Drosophilidae 17 

1.4 Morfologia do testículo em Drosophilidae 20 

1.5  Evolução do tamanho do espermatozoide e tamanho do testículo 22 

1.6 Aspectos citogenéticos e comportamento nucleolar 23 

1.7 Aspectos ultraestruturais dos espermatozoides 25 

2 OBJETIVOS 28 

3 MATERIAL E MÉTODOS 29 

4 RESULTADOS 31 

5 DISCUSSÃO 55 

6 CONCLUSÕES 60 

7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 62 

8 ARTIGO  Spermatogenesis of the Zaprionus indianus and 

Zaprionus sepsoides (Diptera: Drosophilidae): cytochemical, 

structural and ultrastructural characterization  

71 

 

 

 



14 

 

1. INTRODUÇÃO 

 

O gênero Zaprionus é dividido em dois subgêneros biogeograficamente separados: 

subgênero Anaprionus Okada, com cerca de 10 espécies na região Oriental e o subgênero 

Zaprionus, com cerca de 50 espécies na região Afrotropical (OKADA; CARSON, 1983; 

YASSIN et al., 2008). Filogeneticamente é um gênero muito próximo ao gênero Drosophila 

(YASSIN et al., 2007, 2008, 2010; YASSIN; DAVID, 2010).  

A espécie Zaprionus indianus (GUPTA, 1970) é original do continente africano e foi 

identificada pela primeira vez no Brasil em 1999, sendo considerada uma espécie invasora 

que tem atacado plantações de figo (VILELA, 1999; TIDON et al., 2003). Após as coletas de 

1999, Z. indianus foi detectada em diferentes localidades do Brasil (TONI et al., 2001; 

CASTRO; VALENTE, 2001; SANTOS et al., 2003; KATO et al., 2004; MATTOS-

MACHADO et al., 2005; DAVID et al., 2006), no Uruguai (GOÑI et al., 2001) e, em 2005, Z. 

indianus foi registrado na Flórida (EUA) (VAN DER LINDE et al., 2006) e Argentina (SOTO 

et al., 2006).  

Alguns estudos que têm examinado o potencial invasivo de Z. indianus incluem o 

ciclo de vida (AMOUDI et al., 1991; STEIN et al., 2003), competição larval (AMOUDI et al., 

1993a) e componentes do valor adaptativo (AMOUDI et al., 1993b; SETTA; CARARETO, 

2005) em linhagens de origem da Arábia Saudita. Estudos de aloenzimas indicam que a 

plasticidade na distribuição da frequência alélica do lócus da Est-3, também pode ter 

contribuído para o sucesso da dispersão desta espécie pelo continente americano (GALEGO; 

CARARETO, 2007, 2010). No entanto, há poucos estudos sobre aspectos da biologia e 

reprodução (ARARIPE et al., 2004), bem como de outras espécies de Zaprionus (YASSIN et 

al., 2007; YASSIN; DAVID, 2010; YASSIN et al., 2010) 

Das 49 espécies do gênero Zaprionus, somente três tornaram-se invasivas, Z. indianus, 

Z. tuberculatus e Z. ghesquierei (CHASSAGNARD; KRAAIJEVELD, 1991). Dentre estas 

 

 



15 

 

espécies Z. indianus é a que tem se dispersado pelos quarto continentes e é considerado um 

drosofilídeo com alta diversidade ecológica (YASSIN et al., 2007; YASSIN; DAVID, 2010; 

YASSIN et al., 2010). O hábito generalista desta espécie pode ser um dos principais fatores 

do sucesso de ocupação nos quatro continentes (LACHAISE; TSACAS 1983; SCHMITZ et 

al., 2007). Entretanto, outros fatores da história de vida (traits of life, incluindo aqui aspectos 

de sua reprodução e da espermatogênese), ecologia e adaptação desta espécie também devem 

estar envolvidos neste processo de invasão. 

Caracteres masculinos que podem influenciar a habilidade competitiva do 

acasalamento e sucesso da fertilização são parâmetros reprodutivos que também podem 

interferir no potencial adaptativo das espécies. Assim, o número de espermatozoides e seu 

período de desenvolvimento também são fatores que podem contribuir para o potencial 

reprodutivo da espécie (GARCIA-GONZÁLEZ; SIMMMONS, 2007; AMITIN; PITNICK, 

2007).  

O estudo da espermatogênese efetuado no presente trabalho, de duas espécies com 

dinâmica ecológica bem diferenciada, uma invasora, Z. indianus, a outra com distribuição 

restrita, Z. sepsoides, com morfologia testicular e tamanho de espermatozoides diferentes, 

evidenciou diferenças na fase de maturação dos espermatozoides, entre estas espécies, as 

quais poderiam causar uma diferenciação adaptativa favorecendo Z. indianus a explorar novos 

ambientes. Assim, o presente trabalho analisou a espermatogênese e a ultraestrutura dos 

espermatozoides de uma linhagem geográfica de Z. indianus e uma de Zaprionus sepsoides 

(DUDA, 1939). Z. sepsoides é restrita a algumas regiões do leste africano e não é considerada 

uma espécie invasora; além disto, apresenta tamanho testicular e do espermatozoide diferentes 

de Z. indianus.  

 

 



16 

 

1.1. Gênero Zaprionus Coquillett (1902) 

 

A filogenia molecular sugere que o gênero Zaprionus é original do Oriente e invadiu a 

África (YASSIN et al., 2008, 2010). Durante o século XX, três espécies Afrotropicais 

invadiram a região Paleártica: Z. indianus, Z. tuberculatus e Z. ghesquieri. Dessas, somente Z. 

indianus invadiu as Américas, constituindo uma das espécies do gênero com maior sucesso de 

colonização (CHASSAGNARD; KRAAIJEVELD, 1991). 

 Após as coletas de Vilela (1999) no Estado de São Paulo, Z. indianus foi detectada em 

Santa Catarina (TONI et al., 2001), Rio Grande do Sul (CASTRO; VALENTE, 2001) e 

Uruguai (GOÑI et al., 2001), além de ter sido registrada em diferentes localidades de Minas 

Gerais (KATO et al., 2004). Em 2002 foi encontrada em vários estados do Nordeste 

(MATTOS-MACHADO et al., 2005), com registros em Tocantins e no norte do Brasil em 

2003 (SANTOS et al., 2003). Nesse mesmo ano de 2003 houve registros da espécie no 

Panamá (América Central) e, em 2005, Z. indianus foi registrado na Flórida (EUA) (VAN 

DER LINDE et al., 2006) e Argentina (SOTO et al., 2006). Essa dispersão geográfica ampla e 

rápida é indicativa da grande facilidade com a qual Z. indianus pode colonizar novos 

ambientes (KARAN et al., 1999; TIDON et al., 2003; ARARIPE et al., 2004).  

A questão das invasões biológicas é de interesse crescente para o campo de genética 

evolutiva. Vermeij (1996) classificou o processo de invasão em três etapas: chegada, 

estabelecimento e integração. Em muitos casos de invasões biológicas a primeira etapa tem 

sido facilitada pelo homem, direta ou indiretamente, através do transporte de passageiros e 

mercadorias. As últimas duas etapas, no entanto, dependem de características intrínsecas da 

espécie invasora e assumem que esta esteja respondendo a um regime seletivo e, mais ainda, 

esteja se tornando parte desse regime por sua interação com outras espécies da comunidade.  



17 

 

A partir daí, estudos acerca da invasão de Z. indianus no Brasil tornaram-se interessantes 

e nos levam a questionar quais as características biológicas e reprodutivas que contribuem 

para o sucesso de sua colonização e expansão geográfica.  

 

1.2. Aspectos biológicos de Zaprionus indianus 

 

O adulto de Z. indianus mede de 2-3 mm de comprimento, apresentando na cabeça e no 

corpo faixas longitudinais brancas bordejadas de estreitas faixas negras, que contrastam 

fortemente com as áreas castanhas adjacentes (GUPTA, 1970).  

O trabalho de Araripe et al. (2004) avaliou que a tolerância térmica de Z. indianus, medida 

por meio de limites de temperatura, induz a esterilidade do macho. Os machos desta espécie 

são mais tolerantes ao frio e levam o mesmo tempo para recuperar a fertilidade, tanto quando 

submetidos a um estresse de temperatura baixa quanto a um estresse de temperatura alta. 

Assim, foi visto que temperaturas próximas a 25ºC são ótimas para o desenvolvimento de Z. 

indianus (de ovo a adulto), permitindo curto tempo de desenvolvimento e alta viabilidade 

(KARAN et al., 1999; STEIN et al., 2003; SETTA; CARARETO, 2005; NAVA et al., 2007). 

Além disso, aspectos como ciclo de vida (AMOUDI et al., 1991; STEIN et al., 2003), 

competição larval (AMOUDI et al., 1993a) e componentes do valor adaptativo (AMOUDI et 

al., 1993b; SETTA; CARARETO, 2005) em linhagens de Z. indianus de origem da Arábia 

Saudita ajudam a explicar o potencial invasivo dessa espécie de Drosophilidae. 

 

1 . 3 .  Esp e rmat ogên es e  e m D ros oph i l ida e  

 

A espermatogênese é um processo biológico de modificação gradual de células 

germinativas em espermatozoides dentro dos testículos. Esse processo envolve proliferação 



18 

 

celular por repetidas divisões mitóticas, duplicação das cromátides, divisão reducional por 

divisão meiótica para produzir espermátides haploides, e diferenciação terminal das 

espermátides em espermatozoides.   

Assim, a espermatogênese pode ser dividida em: proliferação, divisões reducional e 

equacional (na meiose) e diferenciação. Essas fases também são associadas com tipos de 

células germinativas específicas, isto é, espermatogônias, espermatócitos e espermátides.  

A organização dos testículos e o processo da espermatogênese de Drosophila 

melanogaster e de outros drosofilídeos são conhecidos em detalhes (COOPER, 1950; 

HARDY et al., 1979; LINDSLAY; TOKUYASU, 1980; FULLER, 1993; BARREAU et al., 

2008)  

A primeira etapa da espermatogênese envolve a divisão de uma célula tronco 

espermatogonial (linhagem germinativa) e a divisão de duas células tronco somáticas 

(SCHARER et al., 2008). 

No ápice do testículo da drosófila, há dois tipos de células tronco, linhagem germinativa 

de células tronco (“germinative stem cells”-GSCs) e linhagem somática de células tronco 

(“somatic stem cells”- SSCs; são também conhecidas como células progenitoras do cisto). 

Essas células são responsáveis por produzir células germinativas diferenciadas e células 

somáticas do cisto, respectivamente. Cada uma das células GSCs, é unida a células somáticas 

de sustentação, chamadas em conjunto de células “hub” por possuírem forma de cubo. Essas 

células cúbicas estão ancoradas no ápice testicular por extensões da lâmina basal e as células 

tronco (SSC) estão firmemente atadas em um arranjo radial ao redor dessas células cúbicas 

(HARDY et al., 1979; LINDSLEY; TOKUYASU, 1980; FULLER, 1993; GÖNCZY et al., 

1997; TULINA; MATUNIS, 2001; LI; XIE, 2005; SCHARER et al., 2008). 

Durante essas divisões as células mães permanecem ligadas às células somáticas “hub” 

(células cúbicas) e as células filhas juntas formam um cisto, no qual as duas células somáticas 



19 

 

se juntam e se fecham para formar uma nova célula germinativa (células em trânsito). O 

restante da espermatogênese ocorre dentro de cada cisto (Figura 1). 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

À medida que o desenvolvimento ocorre, esses cistos são deslocados do ápice pela 

contínua geração de estágios anteriores nessa região do testículo (COOPER, 1950; 

LINDSLAY; TOKUYASU, 1980; GÖNCZY; DINARDO, 1996; MAINES; WASSERMAN, 

1997; GÖNCZY et al., 1997; HARDY et al., 1979; FULLER, 1993; LI; XIE, 2005; 

SCHARER et al., 2008).  

Durante a proliferação, as células primordiais dos testículos, diploides, aumentam em 

quantidade por mitoses consecutivas e formam as espermatogônias. Cada espermatogônia 

passa por quatro divisões mitóticas gerando 16 espermatogônias. Um pequeno aumento no 

volume do citoplasma das espermatogônias as converte em espermatócitos de primeira ordem, 

também chamados espermatócitos primários ou espermatócitos I, também diploides e que se 

diferenciam dentro de um cisto. Cada um desses 16 espermatócitos passam por divisões 

Figura 1. Organização do ápice testicular de Drosophila melanogaster. 

Esquema adaptado de SCHARER et al., 2008. 



20 

 

meióticas, resultando num cisto de 64 espermátides circulares haploides. A divisão reducional 

corresponde ao período de ocorrência das meioses nos espermatócitos primários e 

secundários. A diferenciação corresponde à espermiogênese, processo que converte as 

espermátides em espermatozoides (COOPER, 1950; BAIRATI, 1968; MEYER, 1974; 

HARDY et al., 1979; LINDSLAY; TOKUYASU, 1980; FULLER, 1993; JOLY; BRESSAC, 

1994; GÖNCZY; DINARDO, 1996; GÖNCZY et al., 1997; MAINES; WASSERMAN, 1997; 

REX, 1999; TULINA; MATUNIS, 2001; BARREAU et al., 2008; CHENG; MRUK, 2010). 

Assim, espécies dentro do gênero Drosophila e de outras espécies da família 

Drosophilidae, como do gênero Zaprionus, são um modelo atrativo para estudo de 

espermatogênese, além de que muitos mecanismos envolvidos na espermatogênese de 

mamíferos são preservados nas moscas (WHITE-COOPER, 2009).  

O estudo de características da espermatogênese das espécies do gênero Zaprionus, 

pode elucidar aspectos de sua reprodução e de seu desenvolvimento, além de observações 

acerca dos aspectos evolutivos do espermatozoide, podendo auxiliar na construção de 

hipóteses para o sucesso de Z. indianus desde as etapas iniciais de invasão. 

 

1.4. Morfologia do testículo em Drosophilidae 

 

Na família Drosophilidae o desenho básico dos órgãos reprodutivos internos do macho 

é muito simples comparando com as partes externas do trato reprodutivo (DAVEY, 1985). 

Tipicamente, cada par de testículos abre em um ducto espermático, parte do qual é dilatado 

para formar a vesícula seminal (COOPER, 1950) (Figura 2).  

 

 

 



21 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 2. Testículos de Zaprionus indianus (A e B) e Zaprionus sepsoides (C e D). B = 

Esquema adaptado de ARARIPE et al., 2004; C = Esquema adaptado de YASSIN; 

DAVID, 2010. Barras correspondem a 0.5 mm. 



22 

 

1.5. Evolução do tamanho do espermatozoide e tamanho do testículo 

 

Na família Drosophilidae o desenho básico dos órgãos reprodutivos internos do macho 

é muito simples comparando com as partes externas do trato reprodutivo (DAVEY, 1985). 

Tipicamente, cada par de testículos abre em um ducto espermático, parte do qual é dilatado 

para formar a vesícula seminal (COOPER, 1950). A vesícula seminal, então, conecta-se com 

o ducto ejaculatório. As diferenças consideráveis no comprimento dos testículos das espécies 

dessa família (JOLY; BRESSAC, 1994; JOLY et al., 2004) estão correlacionadas 

positivamente com o comprimento dos espermatozoides (JOLY; BRESSAC, 1994; PITNICK; 

MARKOW, 1994b; PITNICK, 1996; PITNICK; MILLER, 2000) que varia desde 77 µm em 

D. persimilis (SNOOK, 1997) a 6 cm em D. bifurca (PITNICK et al., 1995), bem como o 

tamanho do espermatozoide em relação ao tamanho do receptáculo da fêmea.  

A variação nas fêmeas envolve órgãos e estruturas internas que recebem e manipulam 

o espermatozoide, mais que aquelas envolvidas com a mecânica e a física da liberação do 

espermatozoide durante a cópula. Espermatozoides continuam a sofrer pressões seletivas e/ou 

competitivas dentro do trato reprodutivo feminino, e essa interação com o ambiente feminino 

pode ser uma grande força seletiva agindo nos tratos reprodutores femininos e masculinos 

(JOLY; SCHIFFER, 2010). 

Amitin e Pitnick (2007) sugeriram que a evolução da escolha feminina por 

determinado espermatozoide baseia-se em seu tamanho e, assim, espermatozoides longos 

apresentariam maior custo em serem produzidos em Drosophila, mas possuiriam vantagem 

competitiva na fertilização sobre espermatozoides menores. Essa hipótese de que 

espermatozoides grandes poderiam aumentar o potencial competitivo de um ejaculado ou 

promover a escolha feminina, poderia ser porque espermatozoides grandes, entre outras 

razões, se movimentariam mais rápido, sendo mais efetivo no deslocamento dentro do trato 



23 

 

reprodutivo da fêmea. O tamanho da espermateca feminina, então, influenciaria o padrão da 

seleção, podendo direcionar o tamanho do espermatozoide (SNOOK, 2005).  

García-González et al. (2007) estudaram o papel da variação natural no tamanho do 

espermatozoide e seu sucesso de fertilização no besouro Onthophagus taurus. Descobriram 

que o sucesso de fertilização foi maior em machos com espermatozoides relativamente 

pequenos. Mas essa seleção no tamanho do espermatozoide foi dependente da morfologia do 

trato reprodutivo feminino.  

Dessa forma, o tamanho do testículo envolve a resposta à demanda na produção de 

espermatozoides pela competição espermática e a maquinaria do testículo pode reagir a 

diferentes demandas de produção espermática, uma mudança que pode refletir no tamanho do 

testículo (SCHARER et al., 2008; VARRED et al., 2011). Assim, a evolução do tamanho do 

espermatozoide representa o resultado da seleção sexual pós-copulatória, mais 

especificamente de uma complexa interação entre competição espermática e escolha críptica 

da fêmea. Então, é possível que a seleção sexual possa influenciar a arquitetura testicular, 

quando está relacionada à seleção do tamanho do espermatozoide ou ao número de 

espermatozoides produzidos. Como consequência da variação na seleção sexual, o testículo 

não somente produz diferentes números de células, mas também células de alta complexidade 

e variação morfológica, significando que o testículo está sob variadas e rápidas mudanças da 

pressão seletiva (SCHARER et al., 2008). 

 

1.6. Aspectos citogenéticos e comportamento nucleolar 

 

Apesar da grande importância ecológica e evolutiva do gênero Zaprionus, estudos 

citogenéticos em cromossomos não politênicos têm sido negligenciados neste grupo, uma vez 

que somente o número cromossômico foi estudado em poucos casos, evidenciando o número 



24 

 

diploide de 12 cromossomos (10A+XY) para as seguintes espécies: Z. vittiger, Z. ghesquieri, 

Z. multistriatus, Z. sepsoides, Z. argentoistriatesus e Z. tuberculatus (ver em GUPTA; 

KUMAR, 1987). Já aspectos citogenéticos e moleculares relacionados a cromossomos 

politênicos de espécies de Zaprionus são mais frequentemente analisados (GUPTA; KUMAR, 

1987; HATCH; JEFFERY, 1992; SU et al. 1992; ANANINA et al., 2007; CAMPOS et al., 

2007). 

Estudos citogenéticos de cromossomos politênicos no gênero Zaprionus mostraram 

que o padrão de cinco longos cromossomos e um sexto cromossomo menor correlacionados 

com cinco pares de cromossomos acrocêntricos e um par menor de cromossomos são 

características das poucas espécies estudadas do gênero Zaprionus (SCIANDRA et al., 1973; 

SU et al., 1992; HATCH; JEFFERY, 1992). 

O nucléolo é uma estrutura dinâmica que está relacionada com a compartimentalização 

das funções do núcleo (HERNADEZ-VERDUN, 1991), sendo considerado um 

subcompartimento nuclear altamente organizado, não envolto por membrana, apresentando 

número, forma e tamanhos variáveis, de acordo com a atividade celular e é onde ocorre a 

síntese de RNA ribossômico (GERBI et al., 2003). Dessa maneira, o nucléolo se forma ao 

redor de grupos de repetições do gene de RNA ribossômico (RNAr) durante o final da 

telófase, persiste em intérfase e se desfaz assim que a célula entra em divisão (LAM et al., 

2005). Algumas atividades celulares estão ligadas ao nucléolo como síntese e processamento 

de RNAr e RNA transportador, reparo no dano de DNA, captura e liberação de proteínas 

envolvidas em silenciamento gênico e regulação da estabilidade proteica (OLSON et al., 

2002; LAM et al., 2005; PEDERSON, 2010). O nucléolo interfásico encontra-se organizado 

ao redor de regiões cromossômicas denominadas Regiões Organizadoras de Nucléolos 

(RONs) ou NORs (do inglês Nucleolar Organization Regions), que são regiões do DNA 

responsáveis pela transcrição de RNA ribossômico e podem ser identificadas, de forma 



25 

 

indireta, pela técnica de impregnação pelo nitrato de prata.  Nesta técnica são coradas as 

proteínas residuais que permaneceram aderidas às NORs, após as atividades transcricionais 

desta região para a formação do nucléolo, sendo uma das mais empregadas em estudos 

citogenéticos (MILLER, 1977).  

Sabe-se que o tamanho e o número de nucléolos e corpos pré-nucleolares dependem 

das características funcionais das células e podem refletir, então, diferenças metabólicas e 

funcionais.  

 

1.7. Aspectos ultraestruturais dos espermatozoides em Drosophilidae 

 

Os espermatozoides são células geralmente pequenas, compactadas e altamente 

especializadas na fertilização do óvulo. São otimizadas para transferir o material genético 

paterno para o óvulo, processo essencial na transmissão da hereditariedade e posterior 

desenvolvimento do organismo. Caracterizam-se por serem células dotadas de um flagelo, 

cujo papel principal é impulsioná-las através do meio fluido. É uma célula altamente 

complexa e tem passado por diversas modificações morfológicas ao longo dos processos 

evolutivos (BACCETTI; AFZELIUS, 1976). 

O espermatozoide de Drosophila possui forma filiforme e núcleo alongado, seguido de 

uma longa cauda (PEROTTI, 1969). Embora alguns constituintes dos espermatozoides variem 

em forma e posição, a estrutura geral do espermatozoide na família Drosophilidae é 

relativamente bem conservada entre as espécies. Em contraste, o tamanho dos núcleos e da 

cauda são altamente variáveis entre espécies. O comprimento total do espermatozoide mede 

3.7 mm em Zaprionus tuberculatus, cerca de 2 mm em Drosophila melanogaster e 1.2 mm 

em D. simulans, (JOLY et al., 2004). Já em D. hydei o espermatozoide mede 23 mm e em D. 

bifurca chega a 58.29 mm (PITNICK et al., 1995b). 



26 

 

As observações realizadas nos flagelos de espermatozoides de diferentes espécies de 

Drosophila contribuíram para o estudo da organização estrutural do axonema (Ax) desse 

grupo de dípteras (PEROTTI, 1969; KIEFER, 1970; DALLAI; AFZELIUS, 1991). A 

estrutura e organização do espermatozoide em Drosophila é caracterizada pela presença de: 

acrossoma localizado lateralmente ao núcleo, cromatina nuclear bastante compactada, 

centríolo, dois derivados mitocondriais de tamanhos diferentes preenchidos por material 

paracristalino e um axonema com o arranjo 9+9+2 de microtúbulos, que é o arranjo usual de 

9+2 microtúbulos circundados por nove microtúbulos acessórios adicionais, ou seja, um par 

de microtúbulos centrais, nove microtúbulos duplos periféricos (formados por fibrila A e 

fibrila B) e nove microtúbulos acessórios (PHILLIPS, 1970; BACCETTI, 1972; JAMIESON 

et al., 1999). 

Na maioria dos insetos o padrão organizacional do axonema segue o arranjo 9+9+2. Em 

algumas espécies de insetos há variação nos elementos centrais do axonema, como em 

mosquitos é comum o arranjo 9+9+1, enquanto na ordem dos efemerópteros (libélulas), 

predomina o esquema 9+9+0 (PHILLIPS, 1970). No entanto, os microtúbulos duplos 

periféricos parecem ser uma característica conservada em todas as caudas de espermatozoides 

de dípteras (DALLAI et al., 1993). 

Durante a espermatogênese as mitocôndrias assumem diferentes morfologias e em insetos, 

a regularidade nas formas da mitocôndria é notável (PHILLIPS, 1970). No decorrer da 

espermatogênese as mitocôndrias sofrem mudanças morfológicas, onde a estrutura típica da 

mitocôndria é completamente modificada. Logo após a meiose há o início de uma série de 

fusões e rearranjos das mitocôndrias formando o complexo mitocondrial que é 

frequentemente denominado “Nebenkern”, especialmente em trabalhos mais antigos 

(PHILLIPS, 1970; BACCETTI, 1972). No decorrer da espermatogênese, ocorre a divisão do 

complexo mitocondrial em dois derivados mitocondriais, que no processo de alongamento do 



27 

 

espermatozoide posicionam-se bilateramente em relação ao axonema (LINDSLEY; 

TOKUYASU, 1980). 

A diferenciação mitocondrial resultando em um ou dois derivados mitocondriais de 

tamanhos diferentes varia de espécie para espécie. Em algumas ordens como Trichoptera 

somente um derivado mitocondrial é encontrado (PHILLIPS, 1970). Em espermatozoides de 

dípteros da família Drosophilidae, dois derivados mitocondriais de diferentes tamanhos são 

característicos e em outros dípteros como os das famílias Culicidae e Simullidae são 

encontrados dois derivados mitocondriais de tamanhos iguais (PHILLIPS, 1970).  

Durante o processo de diferenciação, os derivados mitocondriais são preenchidos ao longo 

de sua extensão por uma estrutura de natureza proteica, organizada num padrão paracristalino, 

e muitas espécies de insetos acumulam estas estruturas nas mitocôndrias durante a 

espermiogênese (PHILLIPS, 1970). Esta estrutura paracristalina é formado por uma proteína 

rica em prolina (BACCETTI et al., 1977). Várias são as funções sugeridas aos derivados 

mitocondriais dos espermatozoides de insetos, podendo participar no controle e regulação da 

forma do movimento flagelar e estando relacionados com o processo de estocagem e liberação 

de energia necessária para a motilidade flagelar (PHILLIPS, 1970).  

As diferenças observadas nos machos jovens de Z. indianus e Z. sepsoides quanto a 

quantidade de espermatozoides e frequência de células em fases iniciais da espermatogênese 

são características que podem interferir no sucesso reprodutivo e adaptativo destas espécies e 

estar relacionadas ao maior potencial invasivo de Z. indianus.  

 

 

 

 

 



28 

 

2. OBJETIVOS 

 

2.1. Objetivo Geral 

 

Ampliar os estudos sobre a biologia de Z. indianus e Z. sepsoides por meio da 

espermatogênese e espermiogênese e identificar características que possam ajudar a 

entender o alto poder de adaptação de Zaprionus indianus a vários ambientes, refletida 

pelo sucesso de sua invasão em diferentes continentes.  

 

2.2. Objetivos Específicos 

 

a) Descrever as fases da espermatogênese de ambas as espécies, utilizando técnicas 

citoquímicas de coloração com orceína lacto - acética, coloração com azul de 

toluidina, reação de P.A.S. e reação de Feulgen, em machos de diferentes idades. 

b) Avaliar o comportamento nucleolar durante a espermatogênese, por meio da técnica de 

impregnação pelo nitrato de prata. 

c) Analisar por meio de microscopia eletrônica de transmissão, os aspectos da 

espermiogênese e a ultraestrutura dos espermatozoides das espécies estudadas. 

 

 

 

 

 

 

 

 



29 

 

3. MATERIAL E MÉTODOS 

 

Procedência dos insetos  

 

 Foram utilizadas uma linhagem de Zaprionus indianus procedente de Ubatuba/SP, 

Brasil, e uma linhagem de Zaprionus sepsoides procedente da África, região do Congo, 

cedida pelo Prof. Dr. Jean David (CNRS/Gif-sur-Yvette/França).  

 

 Medidas dos testículos 

 

 Medidas lineares de um total de 24 testículos de cada espécie foram feitas onde os 

pares de testículos foram obtidos de 12 pares de machos adultos, com oito dias de idade, de Z. 

indianus e Z. sepsoides. Para medir de maneira linear foi necessário desenrolar os testículos 

dos indivíduos de Z. indianus, já que os mesmos possuem forma de espiral. 

  

 Preparação das lâminas e técnicas citoquímicas 

 

 Nestas análises os testículos das duas espécies foram retirados de machos com 

diferentes idades (de 1 a 8 dias), corados com orceína lacto - acética de acordo com De Vaio 

et al. (1985) e impregnados com nitrato de prata de acordo com Howel e Black (1980), 

modificado. Após o preparo usual das lâminas, o procedimento para as duas espécies para a 

Reação de Feulgen foi seguido de acordo com Mello e Vidal (1980), com modificações. 

 A análise estrutural e ultraestrutural foi feita de acordo com Cotta-Pereira et al. (1976), 

com modificações. Os testículos de adultos de Z. indianus e Z. sepsoides foram retirados 

desses insetos em diferentes fases de desenvolvimento (1, 3, 5 e 8 dias de vida) e foram 

fixados em solução de paraformaldeído 4% e glutaraldeído a 2,5% em tampão fosfato a 0,2M, 



30 

 

pH 7,4. Após a fixação inicial por 4 horas em geladeira, o material foi lavado três vezes em 

tampão fosfato 0,1M, pH 7,4, durante 15 minutos, e, em seguida, pós-fixado em tetróxido de 

ósmio 1%, no mesmo tampão, por 2 horas em geladeira e em frasco escuro vedado. Após esse 

procedimento, o material foi lavado três vezes em água destilada, durante 5 minutos em cada 

banho. Posteriormente, iniciou-se o processo de desidratação do material em sequência 

crescente de soluções de acetona (acetona 30%, 50%, 70% e 90% por 15 minutos em cada 

solução; na sequência, acetona 95% e 100%, três vezes, por 15 minutos, cada vez). Após a 

desidratação, o material foi embebido em uma mistura de resina (Araldite®) e acetona 100% 

(1:1), e deixado overnight à temperatura ambiente. Em seguida retirou-se a mistura 

Araldite®/acetona 100% (1:1) e depois ocorreu a inclusão em resina na estufa a 37º C por 2 

horas. Depois os testículos foram retirados dos frascos contendo a resina pura e iniciou-se o 

processo de inclusão no molde. Em seguida, colocou-se a placa contendo o molde em estufa a 

60ºC por 72 horas (processo de polimerização).  

 Os cortes semifinos de 0,5μm foram corados com de azul de toluidina 1% e analisados 

em microscópio de luz; os cortes ultrafinos de 70nm foram contrastados com acetato de 

uranila e citrato de chumbo e analisados em microscópio eletrônico de transmissão.  

 Para a reação de P.A.S., após o preparo das lâminas para a análise estrutural, o 

seguinte procedimento foi seguido para as duas espécies (MELLO; VIDAL, 1980, com 

modificações): foram gotejadas sobre os cortes semi-finos de 0,5 μm, uma solução de ácido 

periódico a 0,5% em estufa a 60ºC, por 14 minutos e, em seguida, elas foram lavadas em água 

destilada corrente por 5 minutos. Adicionou-se o reativo de Shiff em placas de Petri 

protegidas da luz em estufa a 60ºC, por 45 minutos. Daí por diante, foram dados três banhos 

com água destilada, por 5 minutos cada um. Em seguida, as lâminas foram secas ao ar, 

montadas em verniz cristal e analisadas em microscópio de luz.  



31 

 

 O material submetido às técnicas citoquímicas e citogenéticas convencionais foi 

analisado por meio de observação das lâminas ao microscópio de luz (Olympus BX40), com 

sistema analisador de imagem Axiovision LE, Versão 4.8 para Windows, do laboratório de 

Biologia Celular (IBILCE-UNESP-São José do Rio Preto). O material submetido às técnicas 

histológicas foi analisado e fotografado em microscópio eletrônico de transmissão-JEOL 1011 

operado a 80kv, da Central de Microscopia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP. 

 

4. RESULTADOS 

  

4.1. Morfologia dos testículos de Zaprionus indianus e Zaprionus sepsoides 

Os testículos de Z. indianus e Z. sepsoides apresentaram uma coloração amarela (Figuras 

2A e 2C, respectivamente). Em Z. indianus são formados por dois tubos enovelados com 

cerca de 5 mm de comprimento cada um (Figura 2A). Em Z. sepsoides os testículos são dois 

tubos de aparência reniforme com cerca de 2 mm de comprimento cada um (Figura 2C).  

 

4.2. Coloração com orceína lacto - acética e reação de Feulgen 

 

 Espermatogênese em Zaprionus indianus 

 

Na parte apical dos testículos observou-se um grande número de células em divisão. 

Na prófase I, os núcleos dos espermatócitos primários em diplóteno/diacinese apresentaram 

os cromossomos dispostos em anel circular (2n = 12; 10A+XY), com associações entre si e os 

cromossomos sexuais separados desse anel (Figura 3B). Apresentaram também quiasmas 

intersticiais conferindo sua disposição em forma de cruz (Figuras 3C-E e 3L). As metáfases I 

da meiose mostraram os cromossomos bivalentes em um arranjo circular no núcleo (Figuras 

3F e 3M-N). Durante a anáfase meiótica foi possível discriminar alguns cromossomos 



32 

 

acrocêntricos migrando para os polos da célula (Figuras 3G e 3O). Na telófase I o material 

genético mostrou-se difuso no centro do núcleo (Figuras 3H e 3P). Ao término da telófase II, 

observou-se a formação de quatro núcleos haploides (Figura 3I), originando as espermátides. 

Por fim, durante o processo da espermiogênese, essas espermátides sofreram alongamento 

(Figuras 3J e 3Q) e se organizaram em longos feixes de espermatozoides (Figuras 3K e 3R).  

 

 Espermatogênese em Zaprionus sepsoides 

 

  

Durante a prófase I, na fase diplóteno/diacinese os cromossomos estavam dispostos em 

um anel circular, com associações entre si e os cromossomos sexuais separados desse anel 

(Figuras 4B e 4N-O). Ainda na fase diplóteno/diacinese quiasmas duplo terminais conferem 

aos cromossomos a morfologia arredondada (Figura 4C). Ainda em diplóteno/diacinese, os 

cromossomos apresentaram quiasmas intersticiais conferindo sua disposição em forma de 

cruz (Figura 4M). As metáfases I da meiose mostraram seis pares de cromossomos bivalentes 

(2n=10A+XY) (Figuras 4D-E e 4P-Q). Na anáfase foi possível observar cromossomos 

migrando para os polos da célula (Figura 4F). Na telófase I o material genético mostrou-se 

difuso no centro do núcleo (Figura 4G). Ao término da telófase II, observou-se a formação de 

quatro núcleos haploides (Figura 4H), originando as espermátides. Por fim, essas 

espermátides sofreram alongamento (Figura 4I) e em uma fase posterior se organizaram em 

curtos feixes de espermatozoides (Figuras 4K e 4S-T). Esses feixes de espermatozoides 

mostraram forte coloração e concentração de material genético em sua extremidade anterior, 

que correspondem aos núcleos desses espermatozoides em individualização (Figuras 4J-K e 

4S-T), indicando a presença de moléculas carregadas positivamente dos grupos amina de 

resíduos dos aminoácidos proteicos (-NH3
+
), por conta da coloração com orceína lacto - 



33 

 

acética, bem como a presença de grupos aldeídos, por conta da reação produzida pelo reativo 

de Shiff. 

 

 

4.3. Impregnação por prata (AgNOR) em células de Z. indianus e Z. sepsoides 

 

 Foram observadas células em variadas fases da espermatogênese impregnadas com 

prata. Em Z. indianus foram vistos espermatócitos no estágio inicial da prófase I mostrando 

corpúsculos nucleolares espalhados por todo o núcleo das células (Figuras 5A-D). 

Espermátides em um estágio mais avançado de elongamento não apresentaram impregnação 

específica ao longo de todo o seu comprimento (Figuras 5E-F), enquanto espermatozoides 

organizados em feixes longos com extremidades fortemente coradas pela AgNOR foram 

vistos com bastante frequência (Figuras 5G-H).  

 Em Z. sepsoides foram observados espermatócitos em prófase com os núcleos corados 

pelo nitrato de prata. Esses núcleos apresentaram corpúsculos nucleolares impregnado pela 

prata (Figuras 5I-L). Espermátides em um estágio mais avançado de elongamento não 

apresentaram impregnação específica ao longo de todo o seu comprimento (Figuras 5M-N). 

Os feixes de espermatozoides apresentaram-se distribuídos em todas as direções (Figura 5S), 

com as regiões das cabeças dos espermatozoides fortemente marcadas pela prata (Figuras 5O-

U). Notou-se claramente a diferença de morfologia entre as células em prófase I, espermátides 

alongadas e espermatozoides (Figura 5V). Espermatozoides foram vistos entrelaçando-se uns 

nos outros (Figuras 5X-Z). 

 

 

 



34 

 

4.4. Análise estrutural e ultraestrutural dos testículos e da espermatogênese de Z. 

indianus e Z. sepsoides 

 

Foram analisados testículos de Z. sepsoides e Z. indianus em diferentes fases de 

desenvolvimento (1, 3, 5 e 8 dias de vida). Foi observado que as duas espécies possuem 

células em divisão e espermatozoides nos machos de diferentes idades. No entanto, células em 

divisão (espermatócitos) e em processo de elongamento (espermátides) são mais facilmente 

encontradas nos primeiros dias de vida do que com mais de cinco dias, onde são vistos 

espermatozoides com maior frequência, isto para Z. sepsoides foi mais evidente que em Z. 

indianus, que mostrou uma abundância maior de espermatozoides em machos jovens (1 a 3 

dias), com poucas células nos estágios iniciais da espermatogênese. 

Nos testículos das duas espécies foram identificadas diversas estruturas celulares 

diferenciadas que são descritas a seguir. Camada de revestimento (cr): camada externa de 

células envolvendo cada órgão de maneira contínua. Essas células estão separadas do interior 

do testículo por um envoltório (en), na qual se alinha os espermatócitos e as células 

espermatogoniais. Centro germinativo (Cg): local onde foi observada uma quantidade 

considerável de células germinativas, identificadas no ápice do testículo (ap) das duas 

espécies de Zaprionus estudadas (Figuras 6A-B e 5D e Figuras 8A-C). O conteúdo testicular 

foi dividido em duas partes: células germinativas no ápice do testículo e o restante do testículo 

preenchido pelas células correspondentes as outras fases da espermatogênese (Figuras 6A e 

8B-C).  

Principalmente nos testículos de Z. sepsoides foram observados grânulos fortemente 

corados, os quais podem ser grânulos de glicogênio, segundo dados da literatura. A presença 

de carboidratos nesses grânulos foi confirmada realizando-se a técnica de P.A.S. nesses 

testículos (Figura 9B). 



35 

 

Em Z. indianus não foi possível observar ao longo do testículo a localização das 

sucessivas fases da espermatogênese, talvez pela característica morfológica e tamanho deste 

órgão (em espiral) nesta espécie, que dificultou uma preparação adequada para a observação 

nos cortes ultrafinos ou porque o pico das fases iniciais pode ter ocorrido em estágios 

anteriores como, por exemplo, nas pupas. Em regiões como o ápice testicular, foram vistas 

muitas espermátides circulares e alongadas ocupando todo o interior dessa parte do órgão. 

Nas outras regiões, foram observados feixes de espermatozoides distribuídos em todas as 

direções (Figuras 6A-B e 7A-B). 

Em Z. sepsoides observou-se a localização de algumas fases da espermatogênese, com 

células em divisão ocupando toda a porção apical do testículo, juntamente coma presença de 

muitos grânulos (Figura 9B). Logo em seguida, foi localizada uma massa de espermátides e, 

adiante, ocupando todo o restante do interior do testículo, feixes de espermatozoides 

distribuídos em todas as direções (Figuras 9A-C).  

Pela microscopia eletrônica de transmissão (MET) foi possível observar que o 

testículo é composto de uma camada externa de revestimento, circundando o envoltório nas 

duas espécies estudadas (Figuras 10A, 10C e 11A). 

A diferenciação das espermátides nas duas espécies ocorre em sincronia dentro dos 

cistos, portanto estas se encontram no mesmo estágio de maturação (Figuras 10A-B e Figuras 

11A-B). Dessa maneira, um fator relevante observado ultraestruturalmente foi o número 

constante de 64 espermatozoides por feixe em Z indianus (Figuras 10A-B) e em Z. sepsoides 

(Figuras 11A-B). 

A ultraestrutura dos espermatozoides de Z. indianus e Z. sepsoides revelou que o 

axonema de ambas as espécies possui o arranjo de 9+9+2: um par de microtúbulos centrais, 

nove microtúbulos duplos periféricos (formados por fibrila A e fibrila B), nove microtúbulos 

acessórios adicionais, além de nove 'spokes' (Figuras 10G-H e 11D-E, respectivamente). Foi 



36 

 

visto também que próximo ao axonema, dois derivados mitocondriais de tamanhos diferentes 

estão presentes em ambas as espécies (Figuras 10B, 10D-G e Figuras 11B-D). O derivado 

mitocondrial de maior tamanho contém material paracristalino bem evidente principalmente 

em Z. indianus (Figuras 10D-E). 

 



37 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 3. 



38 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 3. A-R. Células de testículos de Zaprionus indianus coradas com orceína lacto – 

acética (A-K) e submetidas à reação de Feulgen (L-R). A. Intérfase com região 

correspondente ao nucléolo deslocada para a periferia do núcleo. B. Prófase I 

(diplóteno/diacinese), mostrando os cromossomos dispostos em um anel circular, e os 

cromossomos sexuais separados desse anel. C, D, L. Diplóteno/diacinese com quiasmas 

intersticiais que conferem aos cromossomos morfologia em forma de cruz; E, F, M, N. 

Metáfases I da meiose mostrando os seis pares de cromossomos bivalentes. G, O. Anáfase 

meiótica; H, P. Telófase I mostrando o material genético no centro de cada núcleo; I. 

Telófase II e a formação de quatro núcleos haploides; J, Q. Espermátides elongadas; K, R. 

Espermatozoides organizados em longos feixes. 



39 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 4. 



40 

 

 

 

 

 

 

Figura 4. A-T. Células de testículos de Zaprionus sepsoides coradas com orceína lacto - 

acética (A-L) e submetidas à reação de Feulgen (M-T); A. Intérfase com região 

correspondente ao nucléolo deslocada para a periferia do núcleo; B, C e M, N, O. Prófase I 

(diplóteno/diacinese), mostrando os quiasmas intersticiais que conferem aos cromossomos a 

morfologia arredondada e os cromossomos sexuais separados desse anel; D, E e P, Q. 

Metáfases I da meiose mostrando os seis pares de cromossomos bivalentes; F. Anáfase inicial 

mostrando alguns cromossomos migrando para os polos da célula; G. Telófase I mostrando o 

material genético no centro de cada núcleo; H. Telófase II, mostrando a formação de quatro 

núcleos haploides; I e R. Espermátides elongadas; J, K e S, T. Feixes de espermatozoides 

apresentando forte coloração e concentração de material cromatínico na ponta desses feixes, 

que correspondem aos núcleos desses espermatozoides; L. Espermatozoides dispostos em 

feixes curtos e circulares no testículo 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



41 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 5. 



42 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 5. Células de testículos de Zaprionus indianus (A-H) e Zaprionus sepsoides (I-Z) 

impregnadas pela prata. A-D. Células de testículos de Zaprionus indianus impregnadas pela 

prata. Espermatócitos no estágio inicial da prófase I mostrando corpúsculos nucleolares 

espalhados por todo o núcleo das células; E, F. Espermátides em um estágio mais avançado 

de elongamento não apresentando impregnação específica ao longo de todo o seu 

comprimento; G, H. Espermatozoides organizados em feixes longos e com as extremidades 

fortemente coradas pela AgNOR. (I-Z) Células de testículos de Zaprionus sepsoides 

impregnadas pela prata; I-L. Espermatócitos em prófase I mostrando os corpúsculos 

nucleolares das célula impregnados com a prata; M, N. Espermátides em um estágio mais 

avançado de elongamento não apresentando impregnação específica ao longo de todo o seu 

comprimento; O-R. Espermatozoides mostrando forte marcação de AgNOR em uma de suas 

extremidades correspondentes aos núcleos dessas células; S. Feixes curtos de espermatozoides 

distribuídos em todas as direções com as regiões das cabeças dos espermatozoides fortemente 

marcadas pela prata; V. Três tipos celulares da espermatogênese: núcleos em prófase, 

espermátides alongadas e espermatozoides; (T, U, X, Z) Feixes de espermatozoides vistos em 

detalhe 

 

 

 

 

 

 

 



43 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 Figura 6. 



44 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 6. Testículos e células de Zaprionus indianus. A, B. Esmagamento e coloração com 

orceína lacto - acética, mostrando no ápice do testículo (ap) a região do centro germinativo 

(Cg), seguida de células em divisão (Cd) e espermatozoides (C) presentes na região mediana 

do testículo; D. Corte histológico mostrando espermátides (spmtd), seguidas de feixes de 

espermatozoides arranjados em forma de feixes transversais de espermatozoides (fte), além de 

feixes longitudinais de espermatozoides (fle). Observar também outras estruturas presentes 

nos testículos como a camada de revestimento (cr) e o envoltório (en). Corte histológico em 

(D) com 0,5 µm de espessura e corado com azul de toluidina a 1%. Barras correspondem a 10 

µm. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



45 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 7. 



46 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 7. Testículos e células de Zaprionus indianus; A. Corte histológico com 0,5 µm de 

espessura e corado com azul de toluidina a 1%, e em detalhe em (B), mostrando espermátides 

(spmtd), seguidas de feixes transversais de espermatozoides (fte); Observar também outras 

estruturas presentes nos testículos como a camada de revestimento (cr) e o envoltório (en). 

Barras correspondem a 10 µm. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



47 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 8. 



48 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 8. A-C. Testículos e células de Zaprionus sepsoides. A. Órgão de indivíduo com 8 

dias de vida. Notar coloração amarelada; B. Esmagamento e coloração com orceína lacto - 

acética, mostrando no ápice do testículo (ap) a região do centro germinativo (Cg), seguida de 

células em divisão (Cd) e espermatozoides presentes na região mediana do testículo; C. Corte 

histológico células organizadas de forma regular e progressiva ao longo do comprimento dos 

testículos: centro germinativo (Cg) formado por espermatogônias e células em divisão (Cd) 

constituídas de espermatócitos e espermátides (spmtd), seguidas de feixes de espermatozoides 

(sptz) individualizados e arranjados em forma de feixes transversais de espermatozoides (fte), 

além de feixes longitudinais de espermatozoides (fle). Observar também outras estruturas 

presentes nos testículos como a camada de revestimento (cr) e o envoltório (en). Corte 

histológico em (C) com 0,5 µm de espessura e corado com azul de toluidina 1%. Barras 

correspondem a 10 µm. 

 

 

 

 

 

 

 



49 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 
Figura 9. 



50 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 9. Cortes semifinos de testículos de Z. sepsoides corados com azul de toluidina 

a 1% e com P.A.S. A, C. Corte histológico com 0,5 µm de espessura, corado com azul 

de toluidina a 1%; em detalhe em (C), espermátides (spmtd), seguidas de feixes 

transversais de espermatozoides (fte), onde é possível visualizar o número de 64 

espermatozoides por feixe (detalhe). Observar também outras estruturas presentes nos 

testículos como a camada de revestimento (cr), o envoltório (en), grânulos internos de 

glicogênio (gri) e grânulos externos de glicogênio. A figura (B) mostra o mesmo corte 

mostrado em (A), porém submetido à coloração P.A.S. Os detalhes mostram os 

grânulos de transição (grt) e os feixes transversais (fte) e longitudinais (fle) de 

espermatozoides. Barras correspondem a 10 µm. 

 

 

 

 

 

 

 



51 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 10. 



52 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 10. Micrografias em MET de espermatozoides-região do flagelo- de Z. indianus. A. 

Seção transversal do testículo mostrando diversos feixes de espermatozoides organizados em 

cistos. B. Seção transversal do testículo mostrando em detalhe um feixe contendo 64 

espermatozoides. C. Seção transversal do testículo onde é possível observar uma camada de 

revestimento (cl) e um envoltório (notar estrela). D-G. Seção transversal de um feixe de 

espermatozoides, mostrando a região da cauda com axônios (Ax) e derivados mitocondriais 

de diferentes tamanhos: derivado mitocondrial maior (MD), onde é possível notar acúmulo de 

material paracristalino (p) e derivado mitocondrial menor (Md). Em (H) detalhe de um 

axônio, mostrando o arranjo de 9+9+2: um par de microtúbulos centrais, nove microtúbulos 

duplos periféricos (notar fibrila A e fibrila B), nove túbulos acessórios (TA), além de nove 

'spokes' (s). 

 

 

 

 

 

 



53 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 
Figura 11. 



54 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 11. Micrografias em MET de espermatozoides-região do flagelo- de Z. sepsoides. A. 

Seção transversal do testículo mostrando diversos feixes de espermatozoides organizados em 

cistos. B. Seção transversal do testículo mostrando em detalhe feixes contendo 64 

espermatozoides. C, D. Seção transversal de um feixe de espermatozoides, mostrando a 

região da cauda com axônios (Ax) e derivados mitocondriais de diferentes tamanhos: 

derivado mitocondrial maior (MD), onde é possível notar acúmulo de material paracristalino 

(p) e derivado mitocondrial menor (Md). Em (E) detalhe de um axônio, mostrando o arranjo 

de 9+9+2: um par de microtúbulos centrais, nove microtúbulos duplos periféricos (notar 

fibrila A e fibrila B), nove túbulos acessórios (TA), além de nove 'spokes' (s). Observar o 

acúmulo de material elétron denso nos nove microtúbulos acessórios e nos dois microtúbulos 

centrais. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



55 

 

5. DISCUSSÃO 

 

A rápida dispersão de Z. indianus em diferentes continentes e principalmente no 

Brasil, onde é considerada uma praga das plantações de figo (STEIN et al., 2000), tem 

estimulado um crescente número de estudos visando entender aspectos de sua biologia e da 

história de sua invasão. A mesma razão motivou o presente estudo da espermatogênese desta 

espécie e de outra com características ecológicas e da morfologia testicular diferentes, que é 

Z. sepsoides. 

 Foi evidenciado que os testículos de Z. indianus são formados por dois tubos 

enovelados com cerca de 5 mm de comprimento cada um e em Z. sepsoides os testículos são 

dois tubos de aparência reniforme com cerca de 2 mm de comprimento cada um. Essas 

medidas coincidem com as medidas lineares feitas por Yassin e David (2010) em testículos de 

diferentes espécies do gênero Zaprionus. Espécies do grupo inermis podem ser classificadas 

em duas categorias: aquelas com pequenos testículos variando de 1.0 a 2.0 mm (Z. sepsoides, 

Z. inermis, Z. cercus, Z. kolodkinae e Z. tsacasi), e aquelas com testículos grandes, variando 

de 5.2 a 5.4 mm, como em Z. indianus, Z. africanus e Z. taronus. 

Araripe et al. (2004) mostraram que a anatomia e fisiologia reprodutiva de Z. indianus 

são diferentes das conhecidas em D. melanogaster, uma vez que Z. indianus possui 

espermatozoides maiores (5 mm) que D. melanogaster (1.8 mm). Joly e Bressac (1994) 

mediram o tamanho dos espermatozoides e dos testículos de várias espécies de drosofilídeos e 

verificaram que, em Z. indianus, o tamanho do espermatozoide é de aproximadamente 6.07 

mm e em Z. sepsoides de 0.78 mm, sendo os tamanhos dos testículos de 6.53 mm e 1.42 mm 

respectivamente. Essas medidas dos testículos correspondem às encontradas no presente 

trabalho.  



56 

 

Foi verificado que os feixes de espermatozoides em Z. sepsoides possuem menor 

comprimento do que em Z. indianus, refletindo seu menor tamanho e, consequentemente, 

menor tamanho dos testículos. Como já é conhecido por dados da literatura, os testículos são 

tão longos quanto os espermatozoides que são fabricados neles (LINDSLEY; TOKUYASU, 

1980; PITNICK; MARKOW, 1994). 

 O número diploide de Z. indianus e Z. sepsoides foi confirmado como sendo 2n = 12. 

No presente trabalho não foi possível, pela técnica AgNOR evidenciar nos cromossomos 

meióticos as Regiões Organizadoras de Nucléolo, somente nos núcleos em prófase e nos 

espermatozoides, nos quais sua presença confirmou a intensa atividade de síntese proteica em 

sua região anterior, correspondente às cabeças dos espermatozoides. Esta marcação já foi 

evidenciada em estudos com outros organismos (TAVARES; AZEREDO-OLIVEIRA, 1997; 

TARTAROTTI; AZEREDO-OLIVEIRA, 1999; SEVERI-AGUIAR; AZEREDO-OLIVEIRA, 

2005; MORIELLE-SOUZA; AZEREDO-OLIVEIRA, 2008; COSTA et al., 2008; 

PERUQUETTI et al., 2008, 2010).  

 Existem poucos estudos utilizando marcações com AgNOR em espécies do gênero 

Zaprionus. Gupta e Kumar (1987) estudaram a associação dos cromossomos politênicos com 

o nucléolo em quatro populações indianas distintas de Zaprionus indianus e observaram que 

diferentes cromossomos, como o cromossomo X e o menor par de cromossomos do conjunto, 

estão envolvidos com as atividades da Região Organizadora do Nucléolo (RON).  

Em machos jovens (1 a 3 dias) de Z. sepsoides foram observados mais frequentemente 

que em Z. indianus, células em estágios iniciais da espermatogênese, como espermatócitos I e 

II, poucas espermátides e uma quantidade relativa de espermatozoides. Já em machos jovens 

de Z. indianus foram obtidas poucas células na fase inicial da espermatogênese e uma 

quantidade maior de espermátides e espermatozoides. Esta diferença observada sugere tempo 

de maturação diferencial dos espermatozoides entre estas espécies. Para espécies do gênero 



57 

 

Drosophila foi verificado que os espermatócitos começam a entrar na primeira divisão 

meiótica ainda no estágio de pupa (COOPER, 1950), sendo que os testículos da maioria das 

espécies de Drosophila não estão completamente desenvolvidos na eclosão e, portanto, 

continuam se desenvolvendo durante o período de maturação do adulto, e isto é altamente 

variável entre as espécies (PITNICK; MILLER, 2000). Em Z. indianus isto parece ocorrer 

também, tendo em vista que machos de um dia de idade mostram uma quantidade significante 

de espermatozoides, diferente de Z. sepsoides, que apresenta maiores quantidades em machos 

mais velhos (8 dias de idade).  

Estes resultados contrariam os de Pitnick e Miller (2000). Esses autores demonstraram 

um aumento no tempo de desenvolvimento (ovo-adulto) e no tempo de maturação dos 

espermatozoides pós-eclosão em D. hydei selecionada para testículos maiores, e isto contribui 

para um atraso na reprodução desta população. Em Z. indianus, que possui maior testículo e 

maior espermatozoide que Z. sepsoides, isto parece não ocorrer, pelo fato de machos jovens já 

apresentarem quantidades significantes de espermatozoides. 

A fertilidade de Z. indianus é maior que a de Z. sepsoides, ao menos em experimentos 

de laboratório (MADI-RAVAZZI, L; DAVID, J, comunicação pessoal), indicando um valor 

adaptativo diferencial entre estas espécies. Se as diferenças de tamanho e maturação de 

espermatozoides entre estas espécies favorecem maior potencial reprodutivo necessita ser 

investigado em detalhes. 

A distribuição organizada e direcionada das células espermatogênicas observadas em 

Z. indianus e Z. sepsoides obedece à mesma distribuição e localização nos testículos 

encontrada em outros drosofilídeos (COOPER, 1950; BAIRATI, 1968; MEYER, 1974; 

HARDY et al., 1979; LINDSLAY; TOKUYASU, 1980; FULLER, 1993, JOLY; BRESSAC, 

1994; GÖNCZY; DINARDO, 1996; LI; XIE, 2005; SCHARER et al., 2008; MOJICA et al., 

2000; BARREAU et al., 2008, CHENG; MRUK, 2010). 



58 

 

Outro fator relevante observado foi o número constante de 64 espermatozoides por 

feixe em Z indianus e em Z. sepsoides. O mecanismo de formação desses feixes é semelhante 

ao que ocorre em Drosophila e em outros insetos. Nessas espécies, um feixe de 

espermatozoides é produzido por uma série de divisões mitóticas da espermatogônia dentro de 

um cisto espermático (COOPER, 1950; HARDY et al., 1979; LINDSLAY; TOKUYASU, 

1980; FULLER, 1993; FABRIZIO et al., 1998; MOJICA et al., 2000).  

Embora na maioria dos insetos as divisões mitóticas dentro do feixe sejam sincrônicas, 

em algumas espécies de Drosophila podem também ser assincrônicas e o número de 

espermatozoides por feixe pode variar de 32 como em D. hydei a 128 em D. pseudoobscura 

(MOJICA et al., 2000), bem como ocorre em abelhas (CRUZ-LANDIM, 2001) e em 

Coleoptera (NAME et al., 2007). Isso sugere que as células goniais de qualquer estágio são 

capazes de se tornarem espermatócitos e que o programa genético espécie-específico 

determina o número de divisões pré-meióticas na linhagem germinativa masculina (MOJICA 

et al., 2000). 

De acordo com Virkii (1969), ordens basais de insetos possuem mais espermatozoides 

por feixe que ordens mais recentes. Os grupos mais especializados tendem a possuir o menor 

número de espermatozoides por feixe. Name et al. (2007) mostraram, por exemplo, que 

alguns coleópteros como os escarabulídeos possuem de 128 a 512 espermatozoides por feixe e 

que as espécies por eles estudadas, Sitophilus zeamays e S. oryzae possuem cerca de 260 

espermatozoides por feixe. Menos espermatozoides por feixe indicam produção reduzida de 

espermatozoides a qual pode corresponder a um valor adaptativo que limita a variabilidade 

genética (MOJICA et al., 2000). 

Embora em Z. indianus e em Z. sepsoides tenhamos observado o mesmo número de 

espermatozoides por feixe (64), há possibilidade de haver números diferentes de feixes nestas 



59 

 

espécies, o que é indicado pela abundância maior de espermatozoides em Z. indianus do que 

em Z. sepsoide. Isto necessita ser investigado. 

O presente estudo confirmou o padrão organizacional do axonema dos insetos que 

segue o esquema 9+9+2, que é o arranjo usual de 9+2 microtúbulos internos circundados por 

nove microtúbulos acessórios adicionais. Estudos da organização estrutural do axonema em 

Drosophila foram realizados por vários autores (PEROTTI, 1969; KIEFER, 1970; PHILLIPS, 

1970; DALLAI; AFZELIUS, 1991; DALLAI et al., 1993; FABRIZIO et al., 1998; MOJICA 

et al., 2000) que confirmaram a conservação dessa estrutura em diferentes espécies do gênero 

Drosophila e da família Drosophilidae. 

Dois derivados mitocondriais de tamanhos diferentes estão presentes em ambas as 

espécies. Estas estruturas têm sido estudadas ultraestruturalmente em insetos com enfoque 

filogenético (PHILLIPS, 1970; MOJICA et al., 2000). Ao longo do processo de diferenciação, 

os derivados mitocondriais são preenchidos ao longo de sua extensão por uma estrutura 

proteica rica em prolina e organizada num padrão paracristalino (PHILLIPS, 1970; 

BACCETTI et al., 1977). Algumas funções dos derivados mitocondriais podem estar 

relacionadas ao processo de estocagem e liberação de energia necessária para a mobilidade do 

flagelo (PHILLIPS, 1970, LINDSLEY; TOKUYASU, 1980).  

Embora as relações dentro do gênero Zaprionus fossem propostas recentemente 

(YASSIN; DAVID, 2010), a sua posição dentro da família Drosophilidae ainda é debatida 

(YASSIN et al., 2007, 2008, 2010;. YASSIN; DAVID, 2010). Atualmente, a maior parte dos 

estudos concordam que Zaprionus pertence ao gênero Drosophila e que Zaprionus está mais 

intimamente relacionada com a Drosophila do que com os subgêneros Sophophora, o qual 

pertence o subgrupo melanogaster (DA LAGE et al, 2007;. COMMAR et al, 2012).  



60 

 

Estudos com elementos transponíveis mostraram maior similaridade de sequencias 

entre espécies do subgênero Zaprionus e algumas espécies do grupo melanogaster do que 

entre espécies do mesmo grupo (DE SETTA et al., 2009).  

As observações ultraestruturais do padrão organizacional do axonema (9+9+2) e dos 

derivados mitocondriais, sendo um maior e o outro menor, são características presentes nos 

espermatozoides das espécies do gênero Drosophila, corroborando a proximidade filogenética 

com Zaprionus. 

O estudo da espermatogênese efetuado no presente trabalho, de duas espécies com 

dinâmica ecológica bem diferenciada, uma invasora, Z. indianus, a outra com distribuição 

restrita, Z. sepsoides, com morfologia testicular e tamanho de espermatozoides diferentes, 

evidenciou diferenças na fase de maturação dos espermatozoides, entre estas espécies, as 

quais poderiam causar uma diferenciação adaptativa favorecendo Z. indianus a explorar novos 

ambientes.  

 

6. CONCLUSÕES 

 

- Os aspectos da espermatogênese e da espermiogênese das espécies Z. indianus e Z. 

sepsoides são semelhantes em suas fases e também muito próximos de D. melanogaster, 

indicando uma conservação destes processos dentro da família Drosophilidae. 

- As principais diferenças observadas por microscopia óptica e pela microscopia 

eletrônica de transmissão entre Z. indianus e Z. sepsoides foram: menor tamanho do 

espermatozoide de Z. sepsoides em relação ao de Z. indianus, uma maior quantidade de 

material paracristalino nos derivados mitocondriais de Z. indianus e uma coloração 

destacada na região da cabeça do espermatozoide de Z. sepsoides quando submetidos à 



61 

 

coloração por orceína e Feulgen. Se estas diferenças estão relacionadas com o maior 

potencial invasivo de Z. indianus, há necessidade de maior investigação. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



62 

 

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 

 

ANANINA, G. et al. Inversion polymorphism and a new polytene chromosome map of 

Zaprionus indianus Gupta (1970) (Diptera: Drosophilidae). Genetica, v.131, p.117-125, 

2007. 

 

ARARIPE, L.O. et al. Male sterility thresholds in a tropical cosmopolitan drosophilid, 

Zaprionus indianus. Journal of Thermal Biology, v.29, p.73-80, 2004 

 

BACCETTI, B. Insect sperm cell, Advances in Insect Physiology, v. 9 p. 315-397, 1972. 

 

BACCETTI, B.; AFZELIUS, B.A. The biology of the sperm cell. Basel, New York, Karger, 

254p., 1976. 

 

BACCETTI, B. et al. Protein of insect sperm mitochondrial crystals: crystallomitin. The 

Journal of Cell Biology, v. 73 p. 594-600, 1977. 

 

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71 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

8. ARTIGO ACEITO NA GENETICS AND MOLECULAR BIOLOGY 

 

 



72 

 

Spermatogenesis of Zaprionus indianus and Zaprionus sepsoides (Diptera: 

Drosophilidae): cytochemical, structural and ultrastructural 

characterization 

 

Leticia do Nascimento Andrade de Almeida Rego
1 

Maria Tercília Vilela de Azeredo-Oliveira
2 

Rosana Silistino-Souza
2
 

Lilian Madi-Ravazzi
1,3 

 

1
UNESP – Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas, 

Departamento de Biologia, Laboratório de Ecologia, Evolução e Genética de Drosophila, São 

José do Rio Preto, SP, Brasil; 

2
UNESP – Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas, 

Departamento de Biologia, Laboratório de Biologia Celular, São José do Rio Preto, SP, 

Brasil. 

3
Send

 
correspondent to

 
Lilian Madi-Ravazzi, UNESP- Universidade Estadual Paulista, 

Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas, Departamento de Biologia, Laboratório de 

Ecologia, Evolução e Genética de Drosophila, Cristóvão Colombo, 2265- Jardim Nazareth. 

15054-000. São José do Rio Preto, SP, Brasil.  

(17) 3221 2389/ FAX (17) 3221 2390/ email: lilian@ibilce.unesp.br 

Running Title: Spermatogenesis in Zaprionus sp. 

Key words: Zaprionus indianus, Zaprionus sepsoides, spermatogenesis, cytochemistry, 

ultrastructure, meiosis. 

 

 

mailto:lilian@ibilce.unesp.br


73 

 

ABSTRACT 

 

      Zaprionus indianus is a drosophilid native to the Afrotropical region that has colonized 

South America. Z. indianus exhibits a wide geographical distribution, whereas Z. sepsoides is 

restricted to certain African regions. The two species differ in the size of their testes, which 

are larger in Z. indianus than in Z. sepsoides. To better understand the biology and the degree 

of differentiation of these species, the current study evaluated spermatogenesis in males of 

different ages (1, 3, 5 and 8 days old) from both species by conventional staining techniques 

and ultrastructural analysis. Spermatogenesis and the ultrastructure of spermatozoa were 

similar in the two species, for which the diploid number was confirmed to be 2n = 12 

chromosomes. However, a greater number of spermatozoa were observed in young Z. 

indianus males (1-3 days old) than in young Z. sepsoides males, which showed a higher 

frequency of cells at the early stages of spermatogenesis at this age. A portion of the head of 

the sperm was strongly marked in both species by silver staining (AgNOR), lacto-acetic 

orcein and the Feulgen reaction. Additionally, when submitted to P.A.S. reaction, the testes of 

both Z. sepsoides and Z. indianus exhibited glycogen granules. The two species also presented 

the same flagellar ultrastructure, in which the axoneme includes a 9+9+2 arrangement of 

microtubules, two mitochondrial derivatives of different sizes are present and the number of 

spermatozoa per bundle is 64. The great similarity in the pattern of microtubule arrangement 

in the axoneme and in the mitochondrial derivatives of the species Zaprionus, as compared 

with other species of Drosophila, indicates that these structures are preserved in the family 

Drosophilidae. The differences observed between the young males of Z. indianus and Z. 

sepsoides, including the number and frequency of sperm cells in the early stages of 

spermatogenesis, are features that may interfere with reproductive success and may be related 

to the invasive potential of Z. indianus. 



74 

 

INTRODUCTION 

 

The genus Zaprionus is divided into two biogeographically separate subgenera: the 

subgenus Anaprionus Okada, with approximately 10 species in the Eastern region, and the 

Zaprionus subgenera, with approximately 50 species in the Afrotropical region (Okada and 

Carson, 1983; Yassin et al., 2008). Phylogenetically, Zaprionus is very close to the genus 

Drosophila (Yassin et al., 2007, 2008, 2010; Yassin and David, 2010).  

The species Zaprionus indianus (Gupta, 1970) originated in Africa and was first 

identified in Brazil in 1999 and is considered an invasive species that has infested the fig 

plantations (Vilela, 1999; Tidon et al., 2003). After 1999, Z. indianus has been detected in 

different regions of Brazil (Toni et al., 2001, Castro and Valente, 2001; Santos et al., 2003; 

Kato et al., 2004; Mattos-Machado et al., 2005, David et al., 2006), Uruguay (Goñi et al., 

2001) and, in 2005, Florida (USA) (Van der Linde et al., 2006) and Argentina (Soto et al., 

2006). 

 Some studies have examined the invasive potential of Z. indianus, including its life 

cycle (Amoudi et al., 1991; Stein et al., 2003), its larval competition (Amoundi et al., 1993a) 

and components of its adaptive value (Amoundi et al., 1993b; Setta and Carareto, 2005) in 

strains of Saudi Arabian origin. Allozyme studies have indicated that plasticity in the 

distribution of the allelic frequency of the locus Est-3 may have also contributed to this 

species success in spreading across the Americas (Gallego and Carareto, 2007, 2010). 

However, few studies have examined the biology and reproduction of Z. indianus (Araripe et 

al., 2004) or other Zaprionus species (Yassin et al., 2007; Yassin and David, 2010; Yassin et 

al., 2010).  

Of the 49 species of the genus Zaprionus, only three have become invasive: Z. 

indianus, Z. tuberculatus and Z. ghesquierei (Chassagnard and Kraaijeveld, 1991). Z. 



75 

 

indianus is the most widespread species of the genus and the most ecologically diverse of the 

Afrotropical drosophilid fauna (Yassin et al., 2007; Yassin and David, 2010; Yassin et al., 

2010). The general habits of this species may be a major factor in its successful occupancy of 

four continents (Lachaise and Tsacas 1983, Schmitz et al., 2007). However, other factors, 

including aspects of its reproduction, adaptation and ecology, may also be involved in the 

invasion process.  

Male characteristics that influence the competitive ability to mate and fertilization 

success can also interfere with the adaptive potential of the species. For example, the size of 

the sperm is a male trait that is predicted to undergo strong sexual selection (Hosken et al., 

2003, Snook, 2005; Scharer et al., 2008), although the selective advantage of different sizes of 

sperm remains largely unclear (Garcia-Gonzalez and Simmmons, 2007; Amitin and Pitnick, 

2007). The number of sperm and their developmental stages are also factors that can 

contribute to the reproductive potential of the species.  

The present study aims to expand on previous studies of the biology of Z. indianus and 

the characteristics that aid its adaptation to various environments, reflected by its successful 

invasion of different continents. More specifically, this paper analyzes spermatogenesis and 

the sperm ultrastructure of a geographical strain of Z. indianus and Z. sepsoides (Duda, 1939). 

Z. sepsoides is restricted to some regions of East Africa, differs in testicular size and sperm 

from Z. indianus and is not considered an invasive species. 

 

MATERIAL AND METHODS 

 

Origin of insects 

 



76 

 

A strain of Z. indianus from Ubatuba, SP, Brazil, and a strain of Z. sepsoides from the 

Congo region of Africa were used in the present work. 

 

Measurements of testes 

 

Linear measurements of a total of 24 testes from each species were collected. The 

pairs of testes were obtained from 12 eight-day-old adult males. To perform the linear 

measurements, the testes from Z. indianus were first uncoiled due to their spiral shape. 

 

Preparation of slides and cytochemical techniques 

 

In this analysis, the testes were removed from males of different ages (1-8 days of life) 

from both species. The testes were stained using lacto-aceto orcein following De Vaio et al. 

(1985) and impregnated with silver nitrate following Howell and Black (1980), with 

modifications. After the slides were prepared, the two species were prepared for the Feulgen 

reaction following Mello and Vidal (1980), with modifications.  

The structural and ultrastructural analysis was performed according to Cotta-Pereira et 

al. (1976), with modifications. The testes of adult Z. indianus and Z. sepsoides were removed 

at different developmental stages (1, 3, 5 and 8 days old) and fixed in a solution of 4% 

paraformaldehyde and 2.5% glutaraldehyde in 0.2 M phosphate buffer, pH 7.4. After initial 

fixation for 4 hours in the refrigerator (4
o
C), the testes were washed three times in 0.1 M 

phosphate buffer, pH 7.4, for 15 minutes each. Next, the material was post-fixed in a 1% 

osmium tetroxide solution for 2 hours in a dark, sealed bottle in the refrigerator. After this 

procedure, the material was washed three times in distilled water for 5 minutes each. The 

material was then dehydrated in a series of four increasingly concentrated acetone solutions 



77 

 

(30%, 50%, 70% and 90% acetone), with 15 minutes per solution, followed by dehydration in 

95% and 100% acetone three times for 15 minutes each. After dehydration, the material was 

embedded in a 1:1 mixture of resin (Araldite®) and 100% acetone and incubated overnight at 

room temperature. The next day, the material was removed from the resin-acetone solution, 

placed in resin and placed in a 37ºC oven for 2 hours. The testes were then removed from the 

bottles containing the pure resin, and the embedding process was initiated for the mold. A 

plate containing the mold was placed in a 60ºC oven for 72 hours, allowing polymerization.  

Semi-thin, 0.5 μm sections of the testes were stained with 1% toluidine blue and 

analyzed using a light microscope. Ultra-thin, 70 nm sections were contrasted with uranyl 

acetate and lead citrate and analyzed by transmission electron microscopy. To perform period 

acid-Schiff (P.A.S.) staining, the slides were first prepared for structural analysis for the two 

species, as follows (Mello and Vidal, 1980, with modifications). A solution of 0.5% periodic 

acid was applied to the semi-thin, 0.5 μm sections using a dropper, and the sections were then 

placed in a 60°C oven for 14 minutes. Next, the sections were washed in distilled running 

water for 5 minutes. A Schiff reagent was added to Petri dishes, which were protected from 

light and were placed in a 60°C oven for 45 minutes. Following the washing of each sample 

in 3 distilled water baths for 5 minutes each; the slides were air-dried and mounted with 

polish before analysis by light microscopy.  

The material prepared using conventional cytochemical and staining techniques was 

analyzed using a light microscope (Olympus BX40) and