ANDRÉ  LUIS  DA  SILVA  FABRIS           ANÁLISE  HISTOLÓGICA,   IMUNOISTOQUÍMICA  E  MORFOMÉTRICA  DE   BIÓPSIAS  DE  TECIDO  ÓSSEO  DE  PACIENTES   HIPERTENSOS  COMPENSADOS                     Araçatuba  –  São  Paulo   2016     ANDRÉ  LUIS  DA  SILVA  FABRIS         ANÁLISE  HISTOLÓGICA,   IMUNOISTOQUÍMICA  E  MORFOMÉTRICA  DE   BIÓPSIAS  DE  TECIDO  ÓSSEO  DE  PACIENTES   HIPERTENSOS  COMPENSADOS   Tese  apresentada  à  Faculdade  de  Odontologia   do   Campus   de   Araçatuba   –   Universidade   Estadual   Paulista   “Júlio   de   Mesquita   Filho”-­‐   UNESP,   para   obtenção   do   Título   de   DOUTOR   EM  ODONTOLOGIA   (Área  de  concentração  em   Cirurgia  e  Traumatologia  Bucomaxilofacial).     Orientador:  Profa.  Ass.  Dra.  Roberta  Okamoto   Coorientador:  Prof.  Ass.  Dr.  Leonardo  Perez  Faverani         Araçatuba  –  São  Paulo   2016                                   Catalogação na Publicação (CIP) Diretoria Técnica de Biblioteca e Documentação – FOA / UNESP Fabris,André Luís da Silva. F128a Análise histológica, imunoistoquímica e morfométrica de biópsias de tecido ósseo de pacientes hipertensos compensados André Luís da Silva Fabris. - Araçatuba, 2016 66f. : il. + 1 CD-ROM Tese (Doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Odontologia de Araçatuba Orientadora: Profa. Roberta Okamoto Coorientador: Prof.Leonardo Perez Faverani 1.Hipertensão2. Implantes dentários3. Osso e ossos I. T. Black D7 CDD 617.64                               DEDICATÓRIA                     Dedicatória     Dedico  esta  tese  às  pessoas  mais  importantes  para  mim:  aos  meus  pais  Abílio  Fabris  (in   Memorian),  porém  vivo  em  mim,  e  Maria  Ivone  da  Silva  Fabris  (Dona  Ivone)  por  me  ajudarem   sempre  durante  minha  caminhada  sendo  tão  especiais  não  só  na  minha  formação,  educação,   mas  me  ensinando  a  ser  uma  pessoa  melhor,  justa  e  honesta.  Só  uma  palavra  que  resume  isso,   Amor.   Aos   meus   irmãos   Rodrigo   da   Silva   Fabris   e   Gustavo   da   Silva   Fabris   por   sempre   me   apoiarem  em  todas  as   fases  da  minha  vida,  me  amparando  nas  dificuldades  ensinando  a   ter   paciência,  perseverança  e  uma  força  no  qual  nos  une  de  forma  extraordinária.   Aos  meus  tios  José  Alberto  da  Silva  (Zé  Branco)  e  Claudineia  Green  Silva  por  cuidarem   de  mim   de   forma   tão   especial   durante   um   período   no   qual   ingressei   na   odontologia   e   me   acolheram  na  casa  de  vocês  como  um  filho,  tendo  uma  gratidão  eterna.   Tia   Sônia   Maria   da   Silva   sendo   minha   segunda   mãe,   cuidando   de   tudo   e   de   todos   abdicando   de   suas   próprias   coisas   para   cuidar   dos   demais.   Deixo   aqui   meu   sentimento   de   amor  por  você.   Tio   Paulo   Roberto   da   Silva   uma   pessoa   especial   que   sempre   mostrou   a   todos   sua   honestidade,  seriedade  e  compromisso  me  ajudando  na  formação  de  meu  caráter.  Deixo  aqui   meu  profundo  abraço.                                           AGRADECIMENTOS    ESPECIAIS         Agradecimentos  Especiais   A  minha  orientadora,  Professora  Assistente  Doutora  Roberta  Okamoto.  Agradeço  o   apoio,   a   amizade,   a   disponibilidade,   a   partilha   do   saber   e   as   valiosas   contribuições   para   o   trabalho.  Acima  de  tudo,  obrigado  por  me  acompanhar  nesta   jornada  e  por  estimular  o  meu   interesse  pelo  conhecimento  e  vida  acadêmica,  que  me  recebeu  sempre  de  braços  abertos  e   com   um   sorriso   estampado   no   rosto,   constantemente   disponível   para   resolver   os   meus   problemas,  indecisões  e  impasses   Ao  Prof.  Adj.  Idelmo  Rangel  Garcia  Júnior.  Uma  pessoa  iluminada,  no  qual  não  mede   esforços  para  ajudar  o  próximo,  ser  mestre  é  o  seu  dom.  Meu  muito  obrigado  e  receba  meu   carinho!   Ao  Prof.  Titular  Tetuo  Okamoto  (in  memorian).    Desde  a  minha  graduação  esteve  ao   meu  lado  segurando  minha  mão  durante  cirugias,  tendo  como  espelho  e  um  exemplo  de  vida   como  pessoa  e  como  pesquisador.  Ao  Prof.  Ruy  dos  Santos  Pinto  minha  sincera  gratidão  por   me  proporcionar  momentos  de  extrema  felicidade  durante  atendimentos  no  CAOE  ¨centrinho¨   um  lugar  onde  pacientes  recebem  amor  de  forma  plena.   Ao  Professor  Adj  Osvaldo  Magro  Filho,  por  ser  um  exemplo  de  professor  para  todos  os   alunos  da  FOA.  Sempre  extremamente  carinhoso  no  qual  me  recepcionou  com  um  aperto  de   mão,  palavras  de  conforto  e  tranquilidade,  nos  mostra  o  caminho  desta  linda  profissão.  Muito   obrigado  pelo  incentivo  e  ensinos.  Receba  minha  admiração!   Ao  meu   coorientador   Professor  Assistente  Dr.   Leonardo   Perez   Faverani.  Um  amigo   especial   e   agora   professor   desta   instituição   tão   respeitada,  merecedor   de   estar   trilhando   o   caminho  da  docência  com  extrema  competência  e  brilho,  deixo  aqui  meu  abraço  especial.   Ao  Professor  Assistente  Dr.  Francisley  Ávila  Souza.  Por  várias  conversas  de  incentivo   pela   confiança   e   a   oportunidade   em   abrir   caminhos   aonde   jamais   havia   pensado   seguir,   8       mesmo  sem  me  conhecer.  Agradeço  por  sempre  me  ajudar  em  tudo.  Saiba  que  é  uma  dádiva  a   confiança  depositada  em  mim.   A  Professora  Assistente  Doutora  Alessandra  Marcondes  Aranega.  Muito  obrigado  por   todo  o  carinho  e  amizade  que  me  manifestou.  Agradeço,  de  forma  especial,  a  ajuda,  o  apoio  e   a  preocupação,  nos  momentos  de  maior  aflição.   Aos  Professores  da  Disciplina  da  Cirurgia  e  Traumatologia  Bucomaxilofacial  Daniela   Ponzoni   e   Ana   Paula   Farnezi   Bassi,   pela   amizade   desfrutada   em   nosso   departamento.   Recebam  o  meu  carinho  e  admiração.   Ao   Professor   Wilson   Roberto   Poi,   pelo   maior   exemplo   do   “Ser   Professor”.   Muito   obrigado   por   fazer   parte   da  minha   formação   e  me   fazer   descobrir   o   professor   que   está   em   mim.     Ao  Professor  Claudio  Maldonado  Pastori,  um  professor  e  acima  de  tudo  uma  pessoa   extremamente   humana,   educada,   solícita   e   que   sempre  me   inspirou   durante   a   residência   a   sermos  cirurgiões  melhores.  Deixo  aqui  um  abraço  forte  e  minha  gratidão.   Ao   professor   Paulo   Roberto   Botacin,   uma   pessoa   extremamente   contagiante,   maravilhosa  e  educada,  sempre  preocupado  com  a  formação  dos  alunos,  mas  nunca  deixando   de  ser  amigo.  Deixo  aqui  meu  abraço.   A  professora  Ass.  Dra  Ana  Claudia  Rossi,  pela  educação,  empenho  e  disponibilidade   em  aceitar  o   convite  para   formar  a  banca  examinadora  em  um  momento   impar  para  minha   formação,  muito  obrigado.  Estendo  meus  agradecimentos  ao  Professor  Alexandre  Freire,  pela   pronta   disposição   na   interpretação   dos   dados   microtomográficos   e   das   imagens   tridimensionais  deste   trabalho.  Assim,  agradeço  a  Faculdade  de  Odontologia  de  Piracicaba   -­‐   UNICAMP  pela  facilitação  destas  análises.   Aos  professores  da  Disciplina  de  Clínica   Integrada  (Sônia  Regina  Panzarini  Barioni,   Denise   Pedrini,   Daniela   Brandini   e   Celso   Sonoda),   por   serem   os   maiores   exemplos   de   9       professores.  Pela  disposição  e  empenho  com  o  crescimento  da  nossa  faculdade.  Pelo  cuidado   no  trato  com  os  alunos  da  graduação  e  da  pós-­‐graduação.  Vocês  são  mestres  por  excelência.   Recebam  minha  eterna  gratidão,  carinho  e  admiração  neste  momento.   À  “Sassá”   (Sabrina  Ferreira),  pelo   imenso   respeito  e  carinho  que  existe  entre  nós.  O   Doutorado   não   seria   tão   legal   sem   a   sua   presença.   Uma   menina   especial,   competente,   dedicada  e  que  tem  um  futuro  brilhante  pela  frente,  pois  do  fundo  do  coração  desejo  o  melhor   pra  você  minha  amiga.   À  “Ju  Zorzi”  (Juliana  Zorzi  Colete),  pelo  respeito,  amor  e  amizade.  Obrigado  por  estar   ao  meu  lado.   À  “Pili”  (Maria  del  Pilar),  pela  amizade,  carinho  e  alegria  que  você  irradia.  Receba  meu   carinho!   Aos  amigos  da  pós  graduação,  Valthierre,   João  Paulo,  Erik,  Pedro,  Leonardo,  Heldo,   Carulina,  Wilian,  Ricardo,  Tarik,  Igor,  Gabriel,  André,  Ciro,  Jhonathan,  Rodrigo,  Sormani  ,  por   estarem   ao   nosso   lado   e   sempre   dispostos   a   nos   ajudar   no   desenvolvimento   de   nossas   pesquisas.  Vocês  são  exemplos  a  serem  seguidos.   Ao  senhor  Camilo  Roberto  Venancio  pela  disponibilidade,   carinho  e  atenção  com  os   animais  do  biotério  desta  faculdade,  assim  como  o  senhor  Arnaldo  Cezar  Dos  Santos,  que  com   o  mesmo  carinho  vem  tratando  dos  animais  aqui  operados  sendo  de  fundamental  importância   para  o  andamento  de  nossas  pesquisas.  Deixo  aqui  um  grande  abraço.   A  Faculdade  de  Odontologia  de  Araraquara  -­‐  UNESP,  pela  facilitação  na  obtenção  das   imagens  microtomográficas.   A   Coordenação   de   Aperfeiçoamento   Pessoal   de   Nível   Superior   (CAPES),   pela   concessão   da   Bolsa   de   Doutorado   durante   o   curso.   Meus   sinceros   agradecimentos   por   promover  o  apoio  financeiro  e  com  isso,  permitir  que  fosse  possível  a  realização  do  doutorado.     10                                 AGRADECIMENTOS   11       Agradecimentos   À  Faculdade  de  Odontologia  de  Araçatuba  –  UNESP,  na  pessoa  do  diretor  Prof.  Titular   Wilson  Roberto  Poi  pela  oportunidade  de  realização  do  curso  de  Doutorado.     Ao  Coordenador  do  Programa  de  Pós-­‐Graduação  em  Odontologia,  da   Faculdade  de   Odontologia  de  Araçatuba,  da  Universidade  Estadual  Paulista   “Júlio  de  Mesquita  Filho”  Prof.   Adj.  André  Luiz  Fraga  Briso,  pela  competência  e  afinco  na  condução  da  nossa  pós-­‐graduação.     Aos   funcionários   da   Pós-­‐graduação   da   Faculdade   de   Odontologia   de   Araçatuba   -­‐   UNESP   pela   disponibilidade   e   paciência   em   todas   as   etapas   do   doutorado.   Pelo   trabalho   honesto  e  sempre  ágil.   Aos  funcionários  da  Biblioteca  da  Faculdade  de  Odontologia  de  Araçatuba  –  UNESP   pela  prontidão  em  nos  atender  e  carinho.   Aos   funcionários   do   Departamento   de   Cirurgia   e   Clínica   Integrada   (Dirce,   Gilmar,   Odair,  Tina,  Paulo  Gratão,  Renato  e  Joilson).  Muito  obrigado  pelo  carinho  e  respeito.   Aos   colegas   da   pós-­‐graduação   da   área   de   Cirurgia   e   Traumatologia   Bucomaxilofacial.  Tenho  aprendido  a   cada  momento   com  cada  um  de   vocês.  Obrigado  pelo   auxílio  constante  na  minha  vida  e  na  pós-­‐graduação.           12               LISTAS  E  SUMÁRIO   13       Lista  de  Figuras     Figura  1  –   Imagens  microtomográficas  com  transparência  da  biópsia  do  grupo  GSA  (A)  e  GAS   (B)  em  vista  frontal                                           34                         Figura  2.  Imagens  microtomográficas  sem  transparência  da  biópsia  do  grupo  GSA  (A)  e  GAS  (B)   em  vista  frontal                     35       Figura  3  –Representação  dos  valores  médios  de  BV  entre  os  grupos  experimentais  GSA  e  GAS.                         36     Figura  4  –  Representação  dos  valores  médios  de  BV/TV  entre  os  grupos  experimentais  GSA  e   GAS.                       36                         Figura  5   -­‐  Representação  dos  valores  médios  de  Tb.Th  entre  os  grupos  experimentais  GSA  e   GAS.                       37                           Figura   6   -­‐  Representação   dos   valores  médios   de   Tb.N   entre   os   grupos   experimentais   GSA   e   GAS.                                                         37                         Figura  7   -­‐  Representação  dos   valores  médios  de  Tb.Sp  entre  os  grupos  experimentais  GSA  e   GAS.                       38                       Figura  8   -­‐  Representação  dos   valores  médios  de  Potot  entre  os   grupos  experimentais  GSA  e   GAS.                       38                         Figura  9  -­‐  Imagens  histológicas  da  biópsia  do  grupo  GSA  (A)  e  GAS  (B)  no  aumento  de  6,3X.                         40                         Figura  10  -­‐  Imagens  histológicas  das  biópsia  do  grupo  GAS  (A)  e  GSA  (B)  em  aumento  de   40X.                                                                                                                                                                                                                                                                                                            40     Figura  11  -­‐  Imagens  imunoistoquímicasdos  grupo  GSA  e  GAS  com  imunomarcações  de  Runx2,   OP  e  OC  no  aumento  de  40X.                 43                       14       Lista  de  Tabelas   Tabela  1  –  Valores  médios,  desvio  padrão  e  do  coeficiente  estatístico  (p)  para  os  parâmetros   volumétricos  (BV,  BV/TV,  Tb.Th,  Tb.N,  Tb.  Sp  e  Po  (tot),  na  comparação  entre  os  grupos  GSA  e   GAS.                         34   Tabela  2  –  Representação  dos  escores  mais  frequentes  durante  a  análise  qualitativa  ordinal  da   imunoistoquímica  das  proteínas  Runx2,  OP  e  OP,  para  os  grupos  GSA  e  GAS.                         41                                         15           Lista  de  Abreviaturas   mm   =  Unidade  de  medida  milímetros   HAS   =  Hipertensão  arterial  sistêmica   SRAA   =  Sistema  renina-­‐angiotensina-­‐aldoesterona   Ang  II   =  Angiotensina  II   ECA   =  Enzima  conversora  de  angiotensina   Runx2   =  Fator  2  de  transcrição  relacionado  a  Runt   OP   =  Osteopontina   OC   =  Osteocalcina   α   =  Coeficiente  estatístico  de  confiabilidade   p     =  Nível  de  significância  estatística  (p<0,05)   mg/kg   =  Unidade  de  medida  miligramas  por  quilograma   IM   =  Via  de  administração  intramuscular   %   =  Percentual   Rpm   =  Rotação  por  minuto   ml   =  Unidade  de  volume  mililitro   16       EDTA   =  Ácido  etilenodiamino  tetra-­‐acético     HE   =  Corantes  Hematoxilina  e  Eosina   µm²   =  Unidade  de  medida  micrometros  ao  quadrado   BV   =  Volume  ósseo   BV/TV   =Percentual  de  volume  ósseo   Tb.Th   =  Espessura  trabecular   Tb.N   =  Número  de  trabéculas   Tb.S   =  Separação  trabecular   Potot   =  Porosidade  total   GSA   =  Grupo  sem  alteração   GAS   =  Grupo  alteração  sistêmica   ASA                    =  Articulador  Semi-­‐ajustável   INR                    =  Razão  normalizada  internacional     N.cm                    =  Newtons  por  centímetos   17       Sumário   Análise   histológica,   imunoistoquímica   e   morfométrica   de   biópsias   de   tecido   ósseo   de   pacientes  hipertensos  compensados             Resumo                   20   Abstract                   22   Introdução                   24   Material  e  Métodos                 27   Resultados                   33   Discussão                   44   Referências                   49   Anexos                     53                             Análise   histológica,   imunoistoquímica   e   morfométrica   de   biópsias   de   tecido   ósseo   de   pacientes   hipertensos   compensados       *Este   trabalho   foi   formatado   de   acordo   com   as   normas   do   periódico   Clinical   Oral   Implants   Research                         19       Fabris  ALS.  Análise  histológica,  imunoistoquímica  e  morfométrica  de  biópsias  de  tecido   ósseo  de  pacientes  hipertensos  compensados      [Tese].   Araçatuba:   Faculdade   de   Odontologia  da  Universidade  Estadual  Paulista;  2016.     Resumo   Objetivo:   O   presente   estudo   objetivou   avaliar   as   características   morfométicas,  histológicas  e  imunoistoquímicas  do  tecido  ósseo  coletado  de  pacientes   portadores  de  hipertensão  arterial  sistêmica  compensada  pelo  uso  de  medicamentos   antagonistas  do  sistema  renina-­‐angiotensina-­‐aldoesterona  (SRAA).     Materiais  e  Métodos:  Trinta  pacientes  com  indicação  para  reabilitação  por   meio   de   implantes   instalados   na   região   posterior   de  mandíbula   foram   divididos   em   dois  grupos,  seguindo  os  critérios  de  inclusão  e  exclusão  previamente  estabelecidos.  O   primeiro   grupo   não   apresentava   alterações   sistêmicas   (GSA)   e   não   fazia   uso   de   qualquer   medicação   e,   o   segundo   grupo   foi   composto   por   pacientes   hipertensos   diagnosticados  e  medicados  por  antagonistas  do  SRAA  (GAS).  Durante  o  procedimento   cirúrgico   para   instalação   dos   implantes   osseointegráveis   com   superfície   texturizada,   foram   coletados   blocos   ósseos   por  meio   de  biópsia   com  broca   trefina   de   3,0mm  de   diâmetro   nos   locais   de   instalação   dos   implantes.   As   biópsias   coletadas   foram   separadas   para   avaliação   por  microtomografia   computadorizada,   sendo   avaliados   os   seguintes   parâmetros:     volume  ósseo   (BV/TV),   percentual   de   volume  ósseo   (BV/TV),   espessura   de   trabéculas   (Tb.Th),   número   de   trabéculas   (Tb.N),   separação   entre   as   trabéculas  (Tb.S)  e  porosidade  total  (Po-­‐tot).  Também  foi  realizada  a  análise  dos  cortes   histológicos   corados   por   hematoxilina   e   eosina,   bem   como   a   avaliação   20       imunoistoquímica  de  proteínas  que  caracterizam  as  células  da  linhagem  osteoblástica:   Runx2,  Osteopontina  e  Osteocalcina     Resultados:  Para  todos  os  parâmetros  analisados  (BV,  BV/TV,  Tb.Th,  Tb.N,  Tb.S   e  Po-­‐tot),  houve  similaridade  na  comparação  entre  os  grupos  GAS  e  GSA  (p<0,05,  teste   t).   As   imunomarcações   para   osteopontina   e   osteocalcina  mostraram-­‐se   semelhantes   nos  dois  grupos.  Vale  destacar   importante  marcação  observada  no  grupo  GAS  para  o   fator  de  transcrição  Runt  2  (Runx2),  em  comparação  a  marcação  da  mesma  proteína  no   grupo   GSA.   Além   disso,   a   biologia   do   tecido   ósseo   do   ponto   de   vista   histológico   foi   semelhante  nos  dois  grupos.   Conclusões:   Foi   possível   concluir   que   indivíduos   hipertensos   tratados   com   antagonistas   do   SRAA   apresentam   grande   similaridade   óssea   microestrutural   e   também  celular/protéica  aos  indivíduos  normotensos.   Palavras  chaves:  hipertensão,  implantes  dentários,  osso  e  ossos.                   21         Fabris  ALS.  Histological,  molecular  and  morphometric  analysis  of    bone  tissue  biopsies   in   compensated   hypertensive   patients   [Thesis].   Araçatuba:   UNESP   -­‐   São   Paulo   State   University;  2016.       Abstract     Objectives:   This   study   aimed   to   evaluate   the  morphometric   characteristics,   histological   and   immunohistochemical   bone   tissue   collected   from   patients   with   hypertension  offset  by  the  use  of  drugs  antagonists  of  the  renin  angiotensin  system.     Material  and  Methods:  30  patients  referred  for  rehabilitation  with   implants   placed  in  the  posterior  mandible  were  divided  into  two  groups,  following  the  criteria  of   inclusion   and   exclusion   previously   established.   The   first   group   showed   no   systemic   changes  (GSA)  and  did  not  use  any  medication  and  the  second  group  was  composed  of   diagnosed   hypertensive   patients   treated   by   RAAS   (GAS)   antagonists.   During   the   procedure  for  installation  of  dental  implants  with  textured  surface,  they  were  collected   bone  blocks  through  biopsy  trephine  drill  3.0mm  diameter  implants  in  the  installation   sites.  The  collected  biopsies  were  separated  for  evaluation  by  microtomography,  being   evaluated   the   following   parameters:   bone   volume   (BV   /   TV),   trabecular   thickness   (Tb.Th),   trabecular   number   (Tb.N),   separation   of   the   trabecular   (Tb.S)   and   total   porosity   (Po-­‐tot).   Also   the   analysis   of   histological   sections   stained  with   hematoxylin   and  eosin   staining  was  performed  as  well  as   the   immunohistochemical  evaluation  of   proteins   that   characterize   the   cells   of   osteoblast   lineage:   Runx2,   osteopontin   and   osteocalcin   22         Results:   For   all   parameters   (BV,   BV   /   TV,   Tb.Th,   Tb.N,   Tb.S   and   E-­‐tot)  were   similar  in  the  comparison  between  GAS  and  GSA  (p>  0.05,  t  test).  The  biology  of  bone   tissue   to   analyze  by   immunohistochemistry  presented   similar   results   in  both  groups,   with  markings  scores   in  ordinal  qualitative  analysis   for   transcription   factor   related   to   Runt   2   (Runx2)   -­‐   GSA   (light)   and   GAS   (moderate),   osteopontin   (OP)   -­‐   GSA   (mild   to   moderate)  and  GAS   (moderate   to   intense),  osteocalcin   (OC)   -­‐  GSA   (intense)  and  GAS   (moderate).  Furthermore,  the  biology  of  bone  tissue  was  histologically  similar  in  both   groups.     Conclusions:  Therefore,   it  was  concluded  that  hypertensive  subjects  treated   with   renin-­‐angiotensin   system  antagonists  have  great  bone  microstructural   similarity   and  also  cell  /  protein  to  normotensive  individuals.   Key-­‐words:  hypertension,  dental  implants,  bone  and  bones.   23       Introdução       A  hipertensão  arterial   sistêmica   (HAS)   foi   considerada  como  a  complicação   cardiovascular  mais  encontrada  em  todo  o  mundo  nas  últimas  duas  décadas  (Afghani  e   Goran,  2007;  Otgontuya  et  al.,  2013;  Tibazarwa  e  Damasceno,  2014).  De  acordo  com  a   pesquisa  Vigilância  de  Fatores  de  Risco  e  Proteção  para  Doenças  Crônicas  por  Inquérito   Telefônico   –   Vigitel   de   2014,   24,8%   da   população   brasileira   apresenta   hipertensão   arterial,  segundo  dados  da  American  Heart  Association  2013,  uma  a  cada  3  pessoas  na   população  adulta  dos  EUA  tem  hipertensão.  Estima-­‐se  que  cerca  de  50%  dos  acidentes   vasculares   encefálicos,   42%   das   doenças   isquêmicas   do   coração   e   22%   de   outras   complicações  cardiovasculares  em  homens  e  mulheres  com  idade  superior  a  30  anos,   são   decorrentes   da   HAS   (Mohan   et   al.,   2013;   Gealh   et   al.,   2014;   Tibazarwa   e   Damasceno,  2014).   Dentre  as  disfunções  metabólicas  observadas  na  hipertensão  em  relação  ao   tecido   ósseo,   é   conhecido   que   indivíduos   hipertensos   apresentam   metabolismo   anormal  de  cálcio  resultando  em  concentrações  inferiores  desse  mineral,  de  vitamina   D,  magnésio  e  altas  concentrações  de  hormônio  da  paratireoide  (PTH)  (Mccarron  et  al.,   1981;  Wright  e  Rankin,  1982;  Javed  et  al.,  2012;  Pludowski  et  al.,  2013),  prejudicando  a   qualidade   e   a   densidade   do   tecido   ósseo   (Afghani   e   Goran,   2007;   Manrique   et   al.,   2012).  Portanto,  uma  questão  que  precisa  ser  abordada  de  forma  adequada,  refere-­‐se   à   qualidade   do   tecido   ósseo   em   pacientes   hipertensos,   e   ainda,   a   capacidade   de   formação   óssea   em   situações   como   a   osseointegração   após   a   instalação   desses   implantes.   24       O   sistema   renina-­‐angiotensina-­‐aldoesterona   (SRAA)   consiste   numa   cascata   hormonal   que   atua   como   um   dos   principais   controladores   da   pressão   sanguínea   e   volume   de   fluidos   corporais   (Haznedaroglu   e   Buyukasik,   1997;   Namazi   et   al.,   2011).   Estudos  recentes  mostraram  que  componentes  deste  sistema  como  a  renina,  a  enzima   conversora  de  angiotensina  e  receptores  da  angiotensina  II  (Ang  II),  são  expressos  no   tecido   ósseo,   tendo   a   Ang   II   a   capacidade   dede   interferir   através   de   receptores   localizados  nos  osteoblastos  e  osteoclastos  ou  pelo  fluxo  sanguíneo  capilar  da  medula   óssea.   Existem   dois   principais   subtipos   de   receptores   da   angiotensina,   AT1   e   AT2   (Wright  e  Rankin,  1982;  Whitebread  et  al.,  1989;  Ludwig  et  al.,  2013).   O   losartan,   droga   da   classe   de   antagonistas   de   receptor   da   Ang   II,   é   um   fármaco  seletivo  e  age  especificamento  nos   receptores  de  AT1  da  Ang   II  no  músculo   liso   vascular   e   a   glândula   supra-­‐renal,   tendo   efeito   vasoconstritor   e   de   secreção   de   aldosterona.  Esta  é  uma  droga  de  interesse,  não  apenas  sua  eficácia,  mas  também  por   ter  a  capacidadede  proteger  órgãos  alvo,  com  uma  baixa  incidência  de  efeitos  adversos   (Broulik  et  al.,  2001;  Al-­‐Majed  et  al.,  2015).  Já  o  captopril,  droga  pertencente  a  classe   de   inibidores   da   enzima   conversora  da   angiotensina   (ECA),   tem  efeito   de   inibir   toda   cascata  SRAA,  inclusive  a  formação  de  Ang  II  e  seus  efeitos  (Diao  et  al.,  2014;  Zhang  et   al.,  2014).   O   SRAA  está  presente  nos   tecidos  periodontais   de  humanos  e   em   ratos,   e   mostra   uma   ação   funcional   nos   tecidos   periodontais.   Podendo   assim,   haver   a   prevenção  da  perda  óssea  periodontal  em  ratos  com  periodontite   induzida  por  meio   do  bloqueio  do  receptor  AT1  com  o  losartan  de  forma  significativa  (13).   25       Investigações  in  vitro  (Nishiya  e  Sugimoto,  2001;  Nakai  et  al.,  2013)  e  in  vivo   (Strawn  e   Ferrario,   2008;  Donmez   et   al.,   2012;   Pereira,   2013;  Rajkumar   et   al.,   2013)   mostraram   uma   participação   importante   desta   classe   de  medicamentos   na  melhora   das   respostas   do   metabolismo   ósseo,   aumentando   a   quantidade   de   osso   formado,   bem  como  suas  características  biomecânicas  (Shimizu  et  al.,  2008;  Nakai  et  al.,  2013;   Rajkumar   et   al.,   2013;   Zhang,   Y.   et   al.,   2013).   Os   bloqueadores   dos   receptores   AT1   como  o  losartan,  parecem  agir  de  maneira  seletiva  nas  células  do  tecido  ósseo,  como   observado  em  experimentos  de  cultura  de  células  (Nakai  et  al.,  2013).   No  entanto,  ainda  permanecem  dúvidas  e  algumas  controvérsias  em  relação   à   ação   destes   medicamentos   e   faltam   informações   consistentes   quanto   às   vias   de   sinalização   celulares   envolvidas   nas   respostas   já   observadas   e   também   quanto   a   microestrutura   óssea   presente   nesses   casos   de   hipertensão   compensada.   Tendo   em   vista  a  alta  frequência  de  extrações  dentárias  e  o  aumento  da  procura  pela  instalação   de  implantes  osseointegráveis,  faz-­‐se  necessária  a  busca  por  respostas  do  tecido  ósseo   comprometido  pela  hipertensão,  mesmo  que  compensada  por  anti-­‐hipertensivos.     O   presente   estudo   teve   como   objetivo   caracterizar   o   tecido   ósseo   comprometido   pela   hipertensão   instalada,   levando-­‐se   em   conta   a   terapia   anti-­‐ hipertensiva   que   tem   sido   bastante   utilizada   na   atualidade,   que   são   as   medicações   antagonistas   do   SRAA.   A   caracterização   ocorreu   a   partir   de   aspectos   histológicos,   imunoistoquímicos  e  microtomográficos  tridimensionais  de  pacientes  com  hipertensão   submetidos   a   instalação   de   implantes   e   tratados   com   medicações   do   SRAA   ou   pacientes  sem  alteração  sistêmica  (normotensos).     26       Material  e  Métodos     Esse  estudo   foi  cadastrado  na  Plataforma  Brasil  e   realizado  de  acordo  com   os  Princípios  Éticos  para  Experimentação  em  Humanos,  submetido  ao  Comitê  de  Ética   em  Experimentação  Humana  da  Faculdade  de  Odontologia  de  Araçatuba  –  UNESP,  e   obteve  parecer  favorável  sob  o  número  1.521.728  (Anexo  A).  Os  voluntários  assinaram   um  termo  de  consentimento   livre  e  esclarecido,  assim  como  os  autores  da  pesquisa.   Os  procedimentos  cirúrgicos   foram   iniciados,  após  o  parecer   favorável  do  Comitê  de   Ética,     Foram  selecionados  para  este  estudo  30  pacientes  divididos  em  dois  grupos,   em  que  o  primeiro  grupo  correspondeu  aos  pacientes  sem  alterações  sistêmicas  e  que   não  faziam  uso  de  qualquer  medicação  (Grupo  Sem  alteração  –  GSA,  n=15)  e  os  demais   pacientes,  hipertensos  diagnosticados  e  medicados  por  antagonistas  do  SRAA,   sendo   estes   losartan  ou   captopril   (Grupo  Alteração   Sistêmica   -­‐  GAS,   n=15).   Estes   pacientes   foram   preparados   para   reabilitação   com   implantes   osseointegráveis   na   região   posterior  da  mandíbula,  tendo  sidos  triados  na  clínica  de  Implantodontia  da  Faculdade   de  Odontologia  da  Universidade  Estadual  Paulista  “Júlio  de  Mesquita  Filho”  –  UNESP.     Os   fatores   de   exclusão   desta   pesquisa   foram   os   pacientes   tabagistas,   etilistas,  presença  de  raiz  residual  em  região  da  instalação  do  implante,  pacientes  com   alterações   sistêmico   tais   com   diabetes,   doenças   ósseas   e   alterações   ósseas   por   medicamentos,  radiação  na  área  de  cabeça  e  pescoço  e  pacientes  em  tratamento  de   quimioterapia,  além  de  problemas  periodontais  não  controlados.     27       Procedimento  cirúrgico     Antes   do   procedimento   cirúrgico,   os   pacientes   foram   moldados   para   a   confecção   de   modelos   de   estudo   em   gesso,   foi   feita   a   tomada   do   arco   facial   e   montagem   dos   modelos   em   articulador   semi-­‐ajustável   ASA   (Bio-­‐art,   São   Carlos,   SP,   Brasil),   confecção   do   registro   inter-­‐oclusal   para   o   planejamento   reverso.   Destes   modelos,   foi   confeccionado   o   guia-­‐cirúrgico   com   silicone   transparente,   para   a   fresagem  com  a  maior  precisão  possível  em  relação  ao  posicionamento  e  paralelismo   dos   implantes.  Ainda  no  que  diz  respeito  ao  planejamento,   foram  solicitados  exames   imaginológicos,   em   geral   tomografia   computadorizada   Cone   Beam,   para   o   correto   diagnóstico   da   atrofia   óssea   alveolar,   bem   como   da   correta   mensuração   da   altura   entre   o   rebordo   óssea   alveolar   e   a   parede   superior   do   canal   mandibular.   Por   fim,   foram   solicitados   exames   laboratorias   pré-­‐operatórios   para   a   averiguação   das   condições  hematológicas,  tais  como  hemograma  completo  (séries  branca,  vermelha  e   função  plaquetária)  e  coagulograma  (tempos  de  sangria,  coagulação  e  INR).   Cabe  salientar  que  para  todos  os  procedimentos  cirúrgicos  foram  feitos  por   um  operador  e  foi  adotado  um  rigoroso  protocolo  asséptico,   incluindo  a  esterilização   do   instrumental,   proteção   do   paciente   e   das   superfícies   em   contato   com   os   instrumentais   com   campos   estéreis   usa   de   aventais   e   luvas   cirúrgicas   estéreis,   bem   como  dos  equipamentos  individuais  de  proteção.   As  cirurgias  para   instalação  dos   implantes  dentários  na   região  posterior  da   mandíbula   foram   realizadas   sob   anestesia   local,   seguida   de   incisão   na   crista   do   rebordo  alveolar  edêntulo,  realização  do  descolamento  mucoperiosteal  e  exposição  do   28       osso  alveolar.  Após  a  adaptação  do  guia  cirúrgico,  foram  coletadas  biópsias  do  tecido   ósseo  nas  áreas  planejadas  para  os  implantes.  Para  tanto,  foi  utilizada  broca  trefina  de   2,0   mm   de   diâmetro   interno   e   3,0   mm   de   diâmetro   externo   montada   em   contra-­‐ ângulo  de  implante  e  este  conectado  a  um  motor  elétrico  Kavo  Koncept  Surg  (Kavo  do   Brasil   Ind.,   Joinville,   SC,   Brasil)   em  1200   rpm.  Destas   biópsias,   aquelas   destinadas   às   análises   microtomográficas,   histométricas   e   imunoistoquímicas   foram   armazenadas   em  solução  de  paraformaldeido  a  10%  para  prosseguir-­‐se  com  as  etapas  laboratoriais.   Foram   instalados   implantes   com  superfície   tratada  por  duplo  ataque  ácido   (Implalife   Biotecnologia   -­‐   IMPLALIFE®,   Jales,   São   Paulo,   Brasil),   com   contra-­‐ângulo   montado  em  motor  elétrico  em  20  a  25  rpm  ou  em  chave  catraca,  com  torque  máximo   de  50  N.cm.   Como   protocolo   medicamentoso   pós-­‐operatório,   foi   instituída   antibioticoterapia  preventiva,  com  Amoxicilina  500  mg,  1  comprimido  e/ou  cápsula  a   cada   8   horas   por   7   dias.   Caso   o   paciente   fosse   alérgico   às   penicilinas,   foi   prescrito   Clindamicina  300  mg,  a  cada  6  horas  por  7  dias.    Também  foi  prescrito  Nimesulida  100   mg,  1  comprimido  a  cada  12  horas  por  3-­‐4  dias,  Dipirona  Sódica  500  mg,  1  comprimido   a  cada  6  horas,  enquanto  dor  e,  de  uso  tópico  do  Digluconato  de  Clorexidina  a  0,12%,  a   partir  do  segundo  dia  pós-­‐operatório,  na  forma  de  bochechos.     Aquisição  de  imagens  e  análise  microtomográfica     As   biópsias   do   tecido   ósseo,   após   o   armazenagem   em   paraformaldeido,   foram   levadas   para   escaneamento   e   análise   em   microtomógrafo   computadorizado.   29       Para  isso,  ao  término  da  etapa  de  fixação,  as  biópsias  foram  lavadas  por  24  horas  em   água  corrente  e  armazenadas  em  álcool  70%,  a  fim  de  serem  submetidas  à  análise  por   varredura   de   feixe   de   raios-­‐X   em   um   sistema   de   microtomografia   digital   computadorizada   (IB-­‐Unicamp).   As   peças   foramescaneadas   pelo   microtomógrafo   SkyScan  (SkyScan  1178  BrukerMicroCT,  Aatselaar,  Bélgica,  2003)  utilizando  cortes  de  9   μm  de  espessura  (50Kv  e  500μ),  com  filtro  de  Cobre  e  Alumínio  e  passo  de  rotação  de   0.3  mm.   As   imagens   obtidas   pela   projeção   dos   raios-­‐X   nas   amostras   foram   armazenadas  e  reconstituídas  determinando  a  área  de  interesse  pelo  software  NRecon   (SkyScan,  2011;  Versão  1.6.6.0).  No  software  Data  Viewer   (SkyScan,  Versão  1.4.4  64-­‐ bit)  as  imagens  foram  reconstruídas  (figuras  1  e  2)  para  adequação  da  posição  padrão   para   todas   as   amostras,   podendo   ser   observadas   em   três   planos   (transversal,   longitudinal   e   sagital)   ,   como   nas   figuras   1   e   2.   Em   seguida,   utilizando   o   software   CTAnalyser  –  CTAn  (2003-­‐11SkyScan,  2012  BrukerMicroCT  Versão  1.12.4.0)  foi  definida   a   área   para   avaliação   tridimensional.   No   software   CTAnalyser,   todos   os   slices   foram   avaliados   de   acordo   com   a   escalas   de   cinza   (thershould).   O   threshould   utilizado   na   análise   foi   de   25-­‐90   tons   de   cinza,   que   possibilitou   a   obtenção   da   morfometria   tridimensional  do  osso  das  amostras  coletadas.   Os  parâmetros  adotados  seguiram  o  guia  para  avaliação  da  microarquitetura   do   osso   em   roedores   usando   microtomografia   computadorizada   (Bouxsein   et   al.,   2010).  Portanto,  foi  possível  obter  parâmetros  volumétricos  relacionados  à  quantidade   do  tecido  ósseo  (volume  e  porcentagem  do  volume  ósseo:  BV  e  BV/TV)  e  relacionados   30       à   quantidade   do   tecido   ósseo   (espessura   das   trabéculas:   Tb.Th;   número   das   trabéculas:  Tb.N;  separação  entre  as  trabéculas:  Tb.Sp  e  porosidade  total:  Po  (tot))     Etapas   laboratoriais   para   obtenção   das   lâminas   histológicas   e   análise   imunoistoquímica     As  amostras  destinadas  para  as  avaliações  histológicas  e  imunoistoquímicas   foram  lavadas  em  água  corrente,  submetidas  a  trocas  semanais  de  solução  de  EDTA  (4   semanas),  desidratadas  em  álcoois  gradativamente  (70  -­‐  100%),  diafanizadas  em  xilol  e   incluídas  em  parafina.  Foram  realizados  cortes  em  micrótomo  (5  µm)  e  montagem  em   lâminas   histológicas.   Os   cortes   pares   foram   destinados   para   a   análise   histológica,   enquanto  que  os  ímpares  foram  destinados  para  a  análise  imunoistoquímica.     Análise  histológica     As   lâminas   coradas   em   hematoxilina   e   eosina   (HE)   foram   capturadas   em   microscópio  óptico  (LeicaR  DMLB,  Heerbrugg,  Switzerland)  acoplado  a  uma  câmera  de   captação  de  imagem  (LeicaR  DC  300F  microsystemsltd,  Heerbrugg,  Switzerland)     Foi   avaliada   de   forma  qualitativa   tanto   a  morfologia   como   a   espessura   do   tecido   ósseo   que   compunha   a   amostra   obtida   após   a   cirurgia   de   coleta   da   biópsia,   estabelecendo  comparação  entre  os  grupos  de  pacientes  pertencentes  aos  grupos  GSA   vs  GAS.  As  lâminas  foram  fotomicrografadas  nos  aumentos  originais  de  6,3x  e  40x.       31       Análise  imunoistoquímica     Os   anticorpos   primários   policlonais,   produzidos   em   cabra   (Santa   Cruz   Biotechnology)   foram   utilizados   com   o   objetivo   de   caracterizar   as   etapas   de   diferenciação   das   células   da   linhagem   osteoblástica   observadas   nas   amostras   coletadas.  Foi  utilizado  o  método  de  detecção  por  imunoperoxidase  e  como  anticorpos   primários   foram   utilizados   o   anti-­‐RUNX2,   que   marca   pré-­‐osteoblastos,   o   anti-­‐ Osteopontina,   que   marca   a   etapa   inicial   de   mineralização   do   tecido   ósseo   (os   osteoblastos   jovens)  e,  o  anti-­‐Osteocalcina,  que  marca  a  etapa  final  de  mineralização   do  tecido  ósseo  (os  osteoblastos  em  grau  de  maior  maturidade).     Como   anticorpo   secundário,   foi   utilizado   o   anticorpo   biotinilado   anti-­‐cabras   produzido   em   coelhos   (Pierce   Biotechnology,   Waltham,   Massachusetts,   USA).   A   amplificação   do   sinal   da   reação   foi   realizado   pelo   kit   Avidina-­‐Biotina   (Vector   laboratories,  Burlingame,  CA,  EUA)  e  o  cromógeno  de  escolha  foi  a  Diaminobenzidina   (Dako,   Glostrup   Denmark),   que   marcou   no   tom   de   marrom   acastanhado   as   células   positivas   para   cada  um  dos   antígenos   determinados   das   reações   imunoistoquímicas.   Ainda   foi   realizada   a   contra-­‐coloração  por  Hematoxilina   de  Harris   e   na   sequência   as   lâminas  foram  desidratadas  para  a  montagem  das  lamínulas  com  resina  permount.   As   reações   imunoistoquímicas   foram   avaliadas   através   da   atribuição   de   escores,   por   análise   qualitativa   ordinal.   Após   a   análise   de   toda   a   amostra   de   tecido   ósseo,  foram  considerados  os  seguintes  escores:  leve,  com  25%  da  área  avaliada  com   marcação  positiva  para  o  antígeno  de  interesse;  moderado,  com  50%  da  área  avaliada   com   marcação   positiva   para   o   antígeno   de   interesse;   intensa,   com   75%   da   área   32       avaliada   com  marcação   positiva   para   o   antígeno   de   interesse   (Pedrosa   et   al.,   2009;   Manrique   et   al.,   2015).   A   atribuição   dos   escores   foi   feita   por   um   único   avaliador,   submetido  ao  teste  Kappa  (k>0,8),  após  três  testes  consecutivos.  Foram  considerados   representativos  os  escores  com  maior  frequência  após  a  análise  de  todos  os  espécimes   estudados.  Para  a  aquisição  das  imagens,  foi  utilizado  o  Fotomicroscópio  Nikon  Eclipse   80i,  conectado  a  um  micro-­‐computador.     Análise  Estatística     Todos   os   dados   quantitativos   da   avaliação   microtomográfica   foram   inicialmente  submetidos  ao  teste  de  normalidade  e  homocedasticidade  (Shapiro-­‐Wilk).   Os   parâmetros   microtomográficos   (BV,   BV/TV,   Tb.Th,   Tb.N,   Tb.Sp   e   Po   (tot))   foram   comparados  pelo  teste  t.   Os   testes   foram   aplicados   no   programa   computacional   SigmaPlotTM   (SigmaPlot  Exakt  Graphs  and  Data  Analysis,  San  Jose,  CA,  USA),  em  que  foi  considerado   como  nível  de  significância  p<  0,05.   Resultados     Análise  Microtomográfica     Em   relação   aos   parâmetros   morfométricos,   foi   observado   que   todos   os   parâmetros   analisados   (BV,   BV/TV,   Tb.Th,   Tb.N,   Tb.Sp   e   Po   (tot))   apresentaram   resultados   similares   estatisticamente   na   comparação   entre   as   características   33       sistêmicas   analisadas   (GSA   e   GAS)   (p>0,05,   Teste   t)   e   similar   também   nas   imagens   microtomográsficas   tridimensionais   das   figuras   1   e   2.   Os   valores   médios   e   desvio   padrão   dos   parâmetros   morfométricos   estão   representados   na   tabela   1.   A   representação  gráfica  destes  valores  pode  ser  visualizada  nas  figuras  3,  4,  5,  6,  7  e  8.                             Figura  1.  Imagens  microtomográficas  com  transparência  da  biópsia  do  grupo  GSA  (A)  e  GAS  (B)   na  vista  frontal,  obtidas  pelo  software  Mimics  v.18  (Materialise,  Bélgica).       34                       Figura  2.   Imagens  microtomográficas   sem   transparência  da  biópsia  do   grupo  GSA   (A)  e  GAS  (B)  na  vista  frontal,  obtidas  pelo  software  Mimics  v.  18  (Materialise,  Bélgica).               Tabela   1   –  Valores  médios,   desvio  padrão  e  do   coeficiente   estatístico   (p)   para  os   parâmetros  volumétricos   (BV,  BV/TV,  Tb.Th,  Tb.N,  Tb.  Sp  e  Po   (tot),  na  comparação  entre  os   grupos  GSA  e  GAS.               Grupos/  Parâmetros   Volumétricos   BV   BV/TV   Tb.Th   Tb.N   Tb.Sp   Po  (tot)   GSA   21.58±3.6   1.59±0.9   1.43±0.58   0.009±0.001   4.18±1.08   98.39±0.91   GAS   19.13±9,1   1.93±1.6   1.23±0.53   0.01±0.006   4.25±0.41   98.05±1.6   Valores  de  p   0.687   0.649   0.4   0.384   0.926   0.764   35         Figura  3  –  Representação  dos  valores  médios  de  BV  entre  os  grupos  experimentais   GSA  e  GAS.           Figura   4   –   Representação   dos   valores   médios   de   BV/TV   entre   os   grupos   experimentais  GSA  e  GAS.           36           Figura   5   –   Representação   dos   valores   médios   de   Tb.Th   entre   os   grupos   experimentais  GSA  e  GAS.           Figura   6   –   Representação   dos   valores   médios   de   Tb.N   entre   os   grupos   experimentais  GSA  e  GAS.       37             Figura   7   –   Representação   dos   valores   médios   de   Tb.Sp   entre   os   grupos   experimentais  GSA  e  GAS.       Figura   8   –   Representação   dos   valores   médios   de   Potot   entre   os   grupos   experimentais  GSA  e  GAS.       38         Análise  hislógica  da  citoarquitetura  do  tecido  ósseo         O   tratamento   com   medicamentos   antagonistas   do   SRAA   no   grupo   GAS   evidenciou  tecido  ósseo  organizado,  com  a  presença  de  osso  trabecular,  caracterizado   por   menor   espessura   quando   comparado   ao   grupo   GSA.   Notou-­‐se   também   a   importante  presença  de  osteócitos  aprisionados  no  tecido  ósseo  reparacional.   No   grupo  GSA,   o  osso   trefinado  mostrou-­‐se  preenchido  por   trabéculas  ósseas   bem   diferenciadas,   espessas   e   organizadas.   Também   foram   observados   osteócitos   aprisionados  interior  do  tecido  ósseo  avaliado,  como  observados  nas  figuras  9  e  10.   Dessa  forma,  foi  possível  caracterizar  o  tecido  ósseo  alveolar  durante  a  condição   de  hipertensão  compensada  pelos  fármacos  antagonistas  do  SRAA,  ficando  claro  que  a   morfologia   tecido  ósseo  do  ponto  de  vista  histológico  é   semelhante  nos  dois   grupos,   sendo  importante  para  procedimentos  futuros  de  reabilitação.     39         Figura  9.   Imagens  histológicas  da   trefina  do  grupo  GSA  (A)  e  GAS   (B)  no  aumento   de  6,3X.         Figura  10.  Imagens  histológicas  da  trefina  do  grupo  GAS  (A)  e  GSA  (B)  em  aumento  de  40X.     40       Análise  imunoistoquímica       Foram   realizadas   as   análises   para   a   imunomarcação   de   proteínas   que   são   marcadoras  de  importantes  etapas  da  diferenciação  osteoblástica,  para  caracterizar  o   perfil  celular  das  células  coletadas  nas  amostras  dos  diferentes  grupos,  com  resultados   apresentados  na  tabela  2  e  figura  11.     A  marcação  positiva  para  RUNX2  caracteriza  a  presença  de  células   jovens,  em   etapa   de   diferenciação   osteoblástica,   passando   da   etapa   de   pré-­‐osteoblastos   para   osteoblastos   jovens.  No  Grupo  GSA   foi   possível   observar   áreas   de   tecido  ósseo   com   células  positivas  para  RUNX2  na  porção  medular,  porém  este  foi  um  achado  bastante   escasso.   No   grupo   GAS,   foi   observado   osso   trabecular   em   grande   quantidade   na   amostra   e   o   tecido   conjuntivo   entre   as   trabéculas   apresentou-­‐se   com   importante   evidenciação  das  células  positivas  para  RUNX2.     A   osteopontina  marca   os   osteoblastos   jovens,   quando   iniciam   o   processo   de   mineralização  óssea.  Também  é  um  marcador  das  linhas  de  reversão  do  tecido  ósseo.     No  grupo  GSA  foram  observadas  as  lamelas  de  tecido  ósseo  bem  organizadas,   com  a  marcação  positiva  para  OP  incipiente,  conforme  esperado  (osso  em  atividade  de   remodelação).   No   grupo   GAS,   as   trabéculas   ósseas   apresentavam-­‐se   repletas   de   osteoblastos   marcados   positivamente   para   osteopontina.   Este   achado   também   foi   observado  no  tecido  conjuntivo  intertrabecular.     A  osteocalcina   é  uma  glicoproteína  que   se   caracteriza  por   ser   o  marcador  da   mineralização  óssea,  apresentando-­‐se  expressa  em  osteoblastos  maduros  e  na  matriz   41       extracelular   precipitada   com   cálcio.   Dentre   as   proteínas   não   colágenas,   é   a   que   predomina  no  tecido  ósseo.     No  Grupo  GSA,  o  tecido  ósseo  apresenta  intensa  marcação  de  OC,  precipitação   da  DAB  sobre  a  matriz  colágena.  As  lamelas  concêntricas  apresentam-­‐se  também  bem   marcadas   por   esta   proteína.   No   Grupo   GAS,   o   osso   trabecular   ,   com   trabéculas   delgadas   de   moderada   a   intensa,   apresenta   precipitação   deste   cromógeno   ligado   a   osteocalcina.  Na  região  intertrabecular  observa-­‐se  importante  marcação  positiva  para   a  osteocalcina  nas  células  da  linhagem  osteoblástica.   Tabela  2  –  Representação  dos  escores  mais  frequentes  durante  a  análise  qualitativa  ordinal  da   imunoistoquímica  das  proteínas  Runx2,  OP  e  OC,  para  os  grupos  GSA  e  GAS.     GSA   GAS   Runx  2   leve   moderado   OP   leve  a  moderado   moderado  a  intenso   OC   intenso   moderado     42         Figura  11.  Imagens  imunoistoquímicas  dos  grupo  GSA  e  GAS  com  imunomarcações   apontadas   pelas   setadas   de   Runx2,   OP   e   OC   no   aumento   de   40x.   Na   imunomarcação   da   proteína  osteopontina,  pode-­‐se  observar  que  no  GSA,  as  linhas  cementantes  apresentaram-­‐se   mais  marcadas  que  em  GAS.  Já  na  osteocalcina,  tanto  GSA  como  GAS,  a  impregnação  ocorreu   na  matriz  extracelular  do  tecido  ósseo  (destacadas  pelas  setas  em  vermelho).         Os   escores   observados   representam   que   há   células   viáveis   em   atividade   de   síntese   da  matriz   extracelular   presentes   tanto   nas   amostras   dos   grupos   GSA   e   GAS.     Apesar  da  presença  evidenciada  de  osso  trabecular  no  grupo  GAS,  importante  destacar   43       que   as   células   presentes   se   apresentam   com   importante   atividade   de   síntese   de   matriz,   evidenciado   pela   importante   presença   dos   3   marcadores   analisados   neste   estudo.       Discussão       Este   estudo   permitiu   caracterizar   a   microcitoarquitetura   óssea,   no   que   diz   respeito   aos   aspectos   teciduais   histológicos   e   as   repostas  moleculares   presentes   no   tecido  ósseo  de   indivíduos  hipertensos   compensados  e  de   indivíduos   sem  alterações   sistêmicas  por  meio  da  microtomografia,  da  análise  histológica  e  imunoistoquímica.   Com   os   resultados   obtidos   na   análise   histológica,   foi   possível   comparar   a   qualidade   histológica   entre   os   dois   grupos.   No   grupo   GSA,   notaram-­‐se   trabéculas   ósseas  mais   espessas,   organizadas,   com  menor   espaçamento   entre   elas.   Já   no   grupo   GAS,  observou-­‐se  um  trabeculado  ósseo  menos  espesso  e  com  maior  separação  entre   as   trabéculas.   Em   ambos   os   grupos   foi   evidenciada   a   qualidade   óssea   do   tecido   avaliado,   caracterizado  pela   presença   tecido  ósseo  maduro   e   com  osteócitos   em   seu   interior.  Esse  fato,  pode  ser  explicado  por  estudos  prévios,  em  que  a  administração  de   losartan,  uma  droga  antagonista  do  SRAA,  contribuiu  para  melhora  da  angiogênese  em   quadros   de   hipertensão   (Gealh   et   al.,   2014).   Pode   ser   sugerido   neste   estudo   que   a   vasodilatação   propiciada   pelo   agente   anti-­‐hipertensivo   no   grupo   GAS,   fez   com   que   houvesse  melhora  no  aporte  sanguíneo  pela  angiogênese  nos  quadros  de  hipertensão,   ao  ponto  que  o  grupo  GAS  obtivesse  uma  maturação  óssea  semelhante  ao  GSA  (Gealh   44       et   al.,   2014).   Corroborando   com   outros   estudos,   onde  mostrou-­‐se   que   agentes   anti-­‐ hipertensivos  contra  HAS  proporcionaram  aumento  do  número  de  células  progenitoras   circulantes,   restabelecendo   o   potencial   angiogênico   diminuído   em   ratos   espontâneamento  hipertensos  (You  et  al.,  2008).   Os   aspectos   imunoistoquímicos   devem   ser   ressataltados   como   sendo   uma   possibilidade  de  se  avaliar  as  células  e  seu  potencial  de  síntese  proteica  no  momento   de   análise   do   estudo.   Ficou   evidente   com   estes   resultados   que   para   os   dois   grupos   experimentais,   as   células   reparacionais   se   encontram   em  momentos   diferentes,  mas   muito  próximos  quando  se  considera  os  eventos  de  remodelação  óssea.  O  grupo  GSA,   que   caracteriza   os   pacientes   normotensos,   mostra   que   as   biópsias   coletadas   são   constituídas   por   osso   com   poucas   trabéculas   e   caracterizado   por   células   ósseas   maduras   e   com  atividade   de   síntese   de   proteínas   da  matriz   extracelular   importantes   para   a   formação   óssea.   Com   relação   ao   grupo   GAS,   hipertensos   compensados,   o   padrão   de   amostras   observados   é   semelhante,   no   entanto   uma   característica   que   precisa   ser   ressaltada   é   que   entre   as   trabéculas   ósseas   foi   observado   um   tecido   conjuntivo   bastante   celularizado   e   imunorreativo   às   proteínas   avaliadas   nas   imunomarcações,   especialmente   quando   se   avaliou   a   RUNX2.   Este   último   achado   é   bastante   importante   porque   mostra   que   há   uma   expectativa   de   turnover   do   tecido   ósseo,   já   que   a   renovação   promovida   pelos   pré-­‐osteoblastos   está   evidenciada   pela   presença  deste  fator  de  transcrição.  Na  marcação  da  osteocalcina,  tanto  no  grupo  GSA   como  GAS,  a  impregnação  do  cromógenos  sobre  a  matriz  extracelular  do  tecido  ósseo,   caracterizaram  um   tecido  mineralizado  e   com  grau  de  maturidade   importante,  e  que   45       foi  comum  aos  dois  grupos.  Portanto,  com  relação  ao  aspecto  celular,  as  amostras  de   GAS  mostram  um  osso  tão  viável  para  a  reabilitação  quanto  as  amostras  de  GSA.   Não  há  como  esperar  que  os  tecidos  comparados  nas  duas  condições  estudadas   tenham  a  mesma  morfologia  ou  sejam  iguais  (Afghani  e  Goran,  2007).  O  que  se  espera   é   que   sabendo   das   diferenças   micro   arquiteturais   que   devem   estar   presentes   pela   condição   sistêmica   estudada,   o   tratamento   escolhido   para   a   interferência   sistêmica   poderia  recuperar  parcialmente  a  condição  do  tecido  ósseo  comprometido,  tornando-­‐o   adequado   para   as   manobras   de   reabilitação   (Chen   et   al.,   2015).     E   isto   foi   possível   observar  também  nos  resultados  da  análise  microtomográfica.   Assim,   na   análise   tridimensional,   levando   em   conta   o   volume   ósseo   (BV/TV),   espessura   do   trabeculado   (Tb.Th),   número   de   trabéculas   (Tb.N),   separação   entre   as   trabéculas   (Tb.S)   e   porosidade   (Po-­‐tot)   foi   possível   notar   que   o   tecido   ósseo   dos   pacientes   hipertensos   compensados   apresentou   microarquitetura   semelhante   em   todos  estes  parâmetros,  quando  comparados  aos  indivíduos  normotensos.  Além  disso,   quando  comparadas  as  imagens  microtomográficas  das  reconstruções  tridimensionais,   observou-­‐se   que   do   ponto   de   vista   macroscópico,   os   dois   grupos   apresentaram   características   do   trabeculado   bastante   parecidas,   observando-­‐se   que   o   grupo   com   hipertensão   compensada   foi   capaz   de  manter   sua  morfologia   estrutural,   e   portanto,   podendo  assim,  desempenhar  suas  atividades  funcionais.   Em  relação  ao  SRAA,  nos  quadros  de  hipertensão,  a  Ang  II   leva  ao  aumento  da   expressão  do  Receptor  ativador  do  fator  nuclear  kappa  B  ligante  (RANKL)  e  diminuição   da  expressão  do  fator  de  transcrição  relacionado  a  Runt  2  (Runx2)  (Moura  et  al.,  2016).   46       Ambos  mediadores  desempenham  papel  importante  na  diferenciação  dos  osteoblastos   e   osteoclastos.  Quando   isso   ocorre,   há   diminuição  da   formação  óssea   e   aumento  da   reabsorção.  Ao   impedir  a  ação  de  Ang   II  pelo  bloqueio  do  SRAA,  por  meio  de  drogas   que   agem   nesse   sistema,   inibidores   da   reabsorção   óssea   e   marcadores   para   diferenciação   osteoblástica   como   a   osteoprotegerina   e   RUNX2   respectivamente   (Zhang,   Y.   F.   et   al.,   2013),   são  aumentados.  Da  mesma   forma   como  observado  neste   estudo  com  relação  ao  RUNX2,  melhorando  assim  o  processo  de  formação  óssea.  Este   estudo  apresenta  como  aspecto  de  grande  relevância,  a  caracterização  do  tecido  ósseo   que  atuará  como  suporte  para  os  implantes  dentários  instalados.  Com  base  no  exposto,   foi  possível  observar  a  viabilidade  óssea  do  ponto  de  vista  microestrutural  e   também   do  aspecto  celular/proteico,  como  evidenciado  na  imunomarcação  no  tecido  ósseo  em   quadros  de  hipertensão  compesadas  pelo  uso  de  bloqueadores  do  SRAA.   Uma   limitação   deste   estudo   consistiu   na   dificuldade   em   se   separar   os   medicamentos   bloqueadores   do   SRAA   como   losartan/captopril,   pois   apesar   deles   apresentarem  o  mesmo  mecanismo  de   ação,   atuam  em   receptores  diferentes.  Deste   modo,  estudos   futuros  deverão  buscar  a  diferenciação  também  entre  os   fármacos  do   sistema.     Portanto,  dentro  dos  limites  no  presente  estudo,  podemos  concluir  que:   1.   Do   ponto   de   vista   histológico   e   imunoistoquímico,   GSA   e   GAS   apresentaram   tecido   ósseo   semelhante   e   caracterizado   por   células   47       marcadas  positivamente  para  RUNX2,  OP  e  OC,  mostrando  a  viabilidade   celular  das  amostras  avaliadas  nos  dois  grupos.     2.   Indivíduos  hipertensos  tratados  com  antagonistas  do  sistema  renina   angiotensina   apresentam   microarquitetura   óssea   semelhante   aos   indivíduos  normotensos.     3.  A  medicação  antagonista  do  SRAA  desempenha  papel  importante  no   metabolismo   ósseo,   fazendo   com   que   o   tecido   ósseo   apresente   características  quantitativas  e  qualitativas  favoráveis  a  reabilitação  com   implantes  osseointegráveis.                               48       Referências   AFGHANI,   A.;   GORAN,   M.   I.   Lower   bone   mineral   content   in   hypertensive   compared   with   normotensive  overweight  Latino  children  and  adolescents.  Am  J  Hypertens,  v.  20,  n.  2,  p.  190-­‐ 6,  Feb  2007.  ISSN  0895-­‐7061  (Print)   0895-­‐7061.         AL-­‐MAJED,   A.   R.     et   al.   Losartan:   Comprehensive   Profile.   Profiles   Drug   Subst   Excip   Relat   Methodol,  v.  40,  p.  159-­‐94,    2015.  ISSN  1871-­‐5125  (Print)   1871-­‐5125.         BOUXSEIN,  M.   L.     et   al.   Guidelines   for   assessment   of   bone  microstructure   in   rodents   using   micro-­‐computed  tomography.  J  Bone  Miner  Res,  v.  25,  n.  7,  p.  1468-­‐86,  Jul  2010.  ISSN  1523-­‐ 4681   (Electronic)   0884-­‐0431   (Linking).   Disponível   em:   <   http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20533309  >.       BROULIK,  P.  D.    et  al.   Impact  of  antihypertensive  therapy  on  the  skeleton:  effects  of  enalapril   and  AT1  receptor  antagonist   losartan   in  female  rats.  Physiol  Res,  v.  50,  n.  4,  p.  353-­‐8,    2001.   ISSN  0862-­‐8408  (Print)   0862-­‐8408.         CHEN,   S.     et   al.   Losartan   increases   bone   mass   and   accelerates   chondrocyte   hypertrophy   in   developing  skeleton.  Mol  Genet  Metab,  v.  115,  n.  1,  p.  53-­‐60,  May  2015.  ISSN  1096-­‐7192.         DIAO,  T.  Y.    et  al.  Effects  of  angiotensin-­‐converting  enzyme  inhibitor,  captopril,  on  bone  of  mice   with  streptozotocin-­‐induced  type  1  diabetes.  J  Bone  Miner  Metab,  v.  32,  n.  3,  p.  261-­‐70,  May   2014.  ISSN  0914-­‐8779.         DONMEZ,   B.   O.     et   al.   Effect   of   angiotensin   II   type   1   receptor   blocker   on   osteoporotic   rat   femurs.  Pharmacol  Rep,  v.  64,  n.  4,  p.  878-­‐88,    2012.  ISSN  1734-­‐1140  (Print)   1734-­‐1140.         GEALH,  W.  C.    et  al.  Healing  process  of  autogenous  bone  graft  in  spontaneously  hypertensive   rats   treated   with   losartan:   an   immunohistochemical   and   histomorphometric   study.   J   Oral   Maxillofac  Surg,  v.  72,  n.  12,  p.  2569-­‐81,  Dec  2014.  ISSN  0278-­‐2391.         HAZNEDAROGLU,   I.   C.;   BUYUKASIK,   Y.   Current   evidence   for   the   existence   of   a   local   renin-­‐ angiotensin  system  affecting  physiological  and  pathological  haemopoiesis  in  the  bone  marrow.   Br  J  Haematol,  v.  99,  n.  2,  p.  471,  Nov  1997.  ISSN  0007-­‐1048  (Print)   0007-­‐1048.       49         JAVED,   F.     et   al.   Association   of   hypertension   and   bone  mineral   density   in   an   elderly   African   American   female  population.   J  Natl  Med  Assoc,  v.  104,  n.  3-­‐4,  p.  172-­‐8,  Mar-­‐Apr  2012.   ISSN   0027-­‐9684  (Print)   0027-­‐9684.         LUDWIG,  M.    et  al.  Characterization  of   ion  currents  of  murine  CD117(pos)   stem  cells   in  vitro   and  their  modulation  under  AT2  R  stimulation.  Acta  Physiol   (Oxf),  v.  208,  n.  3,  p.  274-­‐87,  Jul   2013.  ISSN  1748-­‐1708.         MANRIQUE,  N.    et  al.  Alveolar  bone  healing  process  in  spontaneously  hypertensive  rats  (SHR).   A   radiographic  densitometry  study.   J  Appl  Oral  Sci,  v.  20,  n.  2,  p.  222-­‐7,  Mar-­‐Apr  2012.   ISSN   1678-­‐7757.         ______.   Hypertension  modifies   OPG,   RANK,   and   RANKL   expression   during   the   dental   socket   bone   healing   process   in   spontaneously   hypertensive   rats.   Clin   Oral   Investig,   v.   19,   n.   6,   p.   1319-­‐27,  Jul  2015.  ISSN  1432-­‐6981.         MCCARRON,   D.   A.     et   al.   Disturbances   of   calcium   metabolism   in   the   spontaneously   hypertensive  rat.  Hypertension,  v.  3,  n.  3  Pt  2,  p.  I162-­‐7,  May-­‐Jun  1981.  ISSN  0194-­‐911X  (Print)   0194-­‐911x.         MOHAN,  V.;   SEEDAT,   Y.   K.;   PRADEEPA,  R.   The   rising  burden  of  diabetes   and  hypertension   in   southeast  asian  and  african  regions:  need  for  effective  strategies  for  prevention  and  control  in   primary   health   care   settings.   Int   J   Hypertens,   v.   2013,   p.   409083,     2013.   ISSN   2090-­‐0384   (Print).         MOURA,  A.  P.    et  al.  Effects  of  angiotensin   II   type   I   receptor  blocker   losartan  on  orthodontic   tooth  movement.  Am   J  Orthod  Dentofacial  Orthop,   v.   149,   n.   3,   p.   358-­‐65,  Mar   2016.   ISSN   0889-­‐5406.         NAKAI,   K.     et   al.   Angiotensin   II   induces   the   production   of  MMP-­‐3   and  MMP-­‐13   through   the   MAPK  signaling  pathways  via  the  AT(1)  receptor  in  osteoblasts.  Biochimie,  v.  95,  n.  4,  p.  922-­‐ 33,  Apr  2013.  ISSN  0300-­‐9084.         NAMAZI,   S.;   ARDESHIR-­‐ROUHANI-­‐FARD,   S.;   ABEDTASH,   H.   The   effect   of   renin   angiotensin   system  on  tamoxifen  resistance.  Med  Hypotheses,  v.  77,  n.  1,  p.  152-­‐5,   Jul  2011.   ISSN  0306-­‐ 9877.         NISHIYA,   Y.;   SUGIMOTO,   S.   Effects   of   various   antihypertensive   drugs   on   the   function   of   osteoblast.  Biol  Pharm  Bull,  v.  24,  n.  6,  p.  628-­‐33,  Jun  2001.  ISSN  0918-­‐6158  (Print)   0918-­‐6158.       50         OTGONTUYA,  D.    et  al.  Assessment  of  total  cardiovascular  risk  using  WHO/ISH  risk  prediction   charts   in   three   low   and  middle   income   countries   in   Asia.  BMC   Public   Health,   v.   13,   p.   539,     2013.  ISSN  1471-­‐2458.         PEDROSA,  W.  F.,  JR.    et  al.  Immunohistochemical,  tomographic  and  histological  study  on  onlay   bone  graft  remodeling.  Part  II:  calvarial  bone.  Clin  Oral  Implants  Res,  v.  20,  n.  11,  p.  1254-­‐64,   Nov   2009.   ISSN   1600-­‐0501   (Electronic)   0905-­‐7161   (Linking).   Disponível   em:   <   http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19531103  >.       PEREIRA,  C.  Análise  do  processo  de  reparo  alveolar  em  ratos  espontaneamente  hipertensos   (SHR)  não  tratados  e  tratados  com  losartan.  Estudo  imunoistoquímico  e  histomorfométrico.   http://unesp.br/portal/cgb/bibliotecas-­‐digitais/cthedra-­‐biblioteca-­‐digital-­‐teses/:   Aracatuba   Dental  School  (Univ.  Estadual  Paulista  -­‐  UNESP)  2013.     PLUDOWSKI,   P.     et   al.   Vitamin   D   status,   body   composition   and   hypertensive   target   organ   damage  in  primary  hypertension.  J  Steroid  Biochem  Mol  Biol,  Nov  1  2013.  ISSN  0960-­‐0760.         RAJKUMAR,  D.  S.    et  al.  Comparative  evaluation  of  enalapril   and   losartan   in  pharmacological   correction   of   experimental   osteoporosis   and   fractures   of   its   background.   J   Osteoporos,   v.   2013,  p.  325693,    2013.  ISSN  2090-­‐8059  (Print)   2042-­‐0064.         SHIMIZU,  H.    et  al.  Angiotensin  II  accelerates  osteoporosis  by  activating  osteoclasts.  Faseb  j,  v.   22,  n.  7,  p.  2465-­‐75,  Jul  2008.  ISSN  0892-­‐6638.         STRAWN,  W.   B.;   FERRARIO,   C.   M.   Angiotensin   II   AT1   receptor   blockade   normalizes   CD11b+   monocyte  production   in   bone  marrow  of   hypercholesterolemic  monkeys.  Atherosclerosis,  v.   196,  n.  2,  p.  624-­‐32,  Feb  2008.  ISSN  0021-­‐9150.         TIBAZARWA,  K.  B.;  DAMASCENO,  A.  A.  Hypertension  in  developing  countries.  Can  J  Cardiol,  v.   30,  n.  5,  p.  527-­‐33,  May  2014.  ISSN  0828-­‐282x.         WHITEBREAD,  S.    et  al.  Preliminary  biochemical  characterization  of  two  angiotensin  II  receptor   subtypes.  Biochem  Biophys  Res  Commun,  v.  163,  n.  1,  p.  284-­‐91,  Aug  30  1989.  ISSN  0006-­‐291X   (Print)   0006-­‐291x.         WRIGHT,   G.   L.;   RANKIN,   G.   O.   Concentrations   of   ionic   and   total   calcium   in   plasma   of   four   models   of   hypertension.  Am   J   Physiol,   v.   243,   n.   3,   p.   H365-­‐70,   Sep   1982.   ISSN   0002-­‐9513   (Print)   0002-­‐9513.       51         YOU,  D.    et  al.  Hypertension  impairs  postnatal  vasculogenesis:  role  of  antihypertensive  agents.   Hypertension,  v.  51,  n.  6,  p.  1537-­‐44,  Jun  2008.  ISSN  0194-­‐911x.         ZHANG,  Y.    et  al.  Effects  of  angiotensin  II  type  1  receptor  blocker  on  bones  in  mice  with  type  1   diabetes   induced  by   streptozotocin.   J  Renin  Angiotensin  Aldosterone  Syst,   Jan  2  2013.   ISSN   1470-­‐3203.         ______.  Effects  of  angiotensin  II  type  1  receptor  blocker  on  bones  in  mice  with  type  1  diabetes   induced  by   streptozotocin.   J  Renin  Angiotensin  Aldosterone  Syst,  v.  15,  n.  3,  p.  218-­‐27,   Sep   2014.  ISSN  1470-­‐3203.         ZHANG,   Y.   F.     et   al.   Effect   of   angiotensin   II   type   I   receptor   blocker   losartan   on   bone   deterioration  in  orchiectomized  male  hypertensive  and  normotensive  rats.  Chin  Med  J  (Engl),   v.  126,  n.  14,  p.  2661-­‐5,  Jul  2013.  ISSN  0366-­‐6999  (Print)   0366-­‐6999.                         52                 ANEXOS   53       Anexo  A  –  Aprovação  do  projeto  pelo  comitê  de  ética       54       Anexo   B   -­‐   Normas   para   publicação   do   periódico   Clinical   Oral   Implants   Research       Author  Guidelines     Content  of  Author  Guidelines:  1.  General,  2.  Ethical  Guidelines,  3.  Submission  of  Manuscripts,   4.  Manuscript  Types  Accepted,  5.  Manuscript  Format  and  Structure,  6.  After  Acceptance.       Useful  Websites:  Submission  Site,  Articles  published  in  Clinical  Oral  Implants  Research,  Author   Services,  Wiley-­‐Blackwell’s  Ethical  Guidelines,  Guidelines  for  Figures     The   journal   to   which   you   are   submitting   your   manuscript   employs   a   plagiarism   detection   system.  By  submitting  your  manuscript  to  this  journal  you  accept  that  your  manuscript  may  be   screened  for  plagiarism  against  previously  published  works.     1.  GENERAL   Clinical  Oral  Implants  Research  conveys  scientific  progress  in  the  field  of  implant  dentistry  and   its  related  areas  to  clinicians,  teachers  and  researchers  concerned  with  the  application  of  this   information  for  the  benefit  of  patients  in  need  of  oral  implants.  The  journal  addresses  itself  to   clinicians,   general   practitioners,   periodontists,   oral   and   maxillofacial   surgeons   and   prosthodontists,  as  well  as  to  teachers,  academicians  and  scholars  involved  in  the  education  of   professionals  and  in  the  scientific  promotion  of  the  field  of  implant  dentistry.     Clinical  Oral  Implants  Research  publishes:   Original  research  articles  of  high  scientific  merit  in  the  field  of  material  sciences,  physiology  of   wound   healing,   biology   of   tissue   integration   of   implants,   diagnosis   and   treatment   planning,   prevention   of   pathologic   processes   jeopardizing   the   longevity   of   implants,   clinical   trials   on   implant   systems,   stoma-­‐tognathic   physiology   related   to   oral   implants,   new  developments   in   therapeutic  concepts  and  prosthetic  rehabilitation.     Review  articles  by  experts  on  new  developments  in  basic  sciences  related  to  implant  dentistry   and  clinically  applied  concepts.     Case  reports  and  case  series  only  if  they  provide  or  document  new  fundamental  knowledge.     Novel  developments  if  they  provide  a  technical  novelty  for  any  implant  system.     55       Short   communications   of   important   research   findings   in   a   concise   format   and   for   rapid   publication.     Treatment  rational  by  experts  with  evidence-­‐based  treatment  approach.     Please  read  the  instructions  below  carefully  for  details  on  the  submission  of  manuscripts,  the   journal's  requirements  and  standards  as  well  as  information  concerning  the  procedure  after  a   manuscript  has  been  accepted  for  publication   in  Clinical  Oral   Implants  Research.  Authors  are   encouraged   to   visit   Wiley-­‐Blackwell   Author   Services     for   further   information   on   the   preparation  and  submission  of  articles  and  figures.     2.  ETHICAL  GUIDELINES   Clinical   Oral   Implants   Research   adheres   to   the   below   ethical   guidelines   for   publication   and   research.       2.1.  Authorship  and  Acknowledgements   Authors  submitting  a  paper  do  so  on  the  understanding  that   the  manuscript  have  been  read   and  approved  by  all  authors  and  that  all  authors  agree  to  the  submission  of  the  manuscript  to   the  Journal.  ALL  named  authors  must  have  made  an  active  contribution  to  the  conception  and   design  and/or  analysis  and  interpretation  of  the  data  and/or  the  drafting  of  the  paper  and  ALL   must   have   critically   reviewed   its   content   and  have   approved   the   final   version   submitted   for   publication.  Participation  solely  in  the  acquisition  of  funding  or  the  collection  of  data  does  not   justify  authorship.     Clinical   Oral   Implants   Research   adheres   to   the   definition   of   authorship   set   up   by   The   International  Committee  of  Medical  Journal  Editors  (ICMJE).  According  to  the  ICMJE  authorship   criteria   should   be   based   on   1)   substantial   contributions   to   conception   and   design   of,   or   acquisition  of  data  or  analysis  and   interpretation  of  data,  2)  drafting   the  article  or   revising   it   critically  for  important  intellectual  content  and  3)  final  approval  of  the  version  to  be  published.   Authors  should  meet  conditions  1,  2  and  3.     Up   to   6   authors   are   accepted   without   need   for   justification.   In   the   case   of   a   specific   and   detailed   justification   of   the   role   of   every   author,   up   to   8   authors  may   be  mentioned.   It   is   a   requirement   that   all   authors   have   been   accredited   as   appropriate   upon   submission   of   the   manuscript.   Contributors   who   do   not   qualify   as   authors   should   be   mentioned   under   Acknowledgements.     56       Acknowledgements:  Under  acknowledgements  please  specify  contributors  to  the  article  other   than   the   authors   accredited.   Acknowledge   only   persons   who   have   made   substantive   contributions   to   the   study.   Authors   are   responsible   for   obtaining   written   permission   from   everyone   acknowledged  by   name  because   readers  may   infer   their   endorsement   of   the   data   and  conclusions.     2.2.  Ethical  Approvals   Experimentation   involving   human   subjects   will   only   be   published   if   such   research   has   been   conducted   in   full  accordance  with  ethical  principles,   including  the  World  Medical  Association   Declaration  of  Helsinki  (version,  2008)  and  the  additional  requirements,  if  any,  of  the  country   where  the  research  has  been  carried  out.  Manuscripts  must  be  accompanied  by  a  statement   that   the   experiments  were   undertaken  with   the   understanding   and  written   consent   of   each   subject  and  according  to  the  above  mentioned  principles.  A  statement  regarding  the  fact  that   the  study  has  been  independently  reviewed  and  approved  by  an  ethical  board  should  also  be   included.   Editor   reserve   the   right   to   reject   papers   if   there   are   doubts   as   to   whether   appropriate  procedures  have  been  used.     When  experimental  animals  are  used  the  methods  section  must  clearly  indicate  that  adequate   measures  were   taken   to  minimize   pain   or   discomfort.   Experiments   should   be   carried   out   in   accordance  with  the  Guidelines  laid  down  by  the  National  Institute  of  Health  (NIH)  in  the  USA   regarding   the   care   and   use   of   animals   for   experimental   procedures   or   with   the   European   Communities   Council   Directive   of   24   November   1986   (86/609/EEC)   and   in   accordance   with   local  laws  and  regulations.     2.3  Clinical  Trials   Clinical   trials   should   be   reported   using   the   CONSORT   guidelines   available   at   www.consort-­‐ statement.org.  A  CONSORT  checklist  should  also  be  included  in  the  submission  material.     Clinical  Oral   Implants  Research  encourages  authors   submitting  manuscripts   reporting   from  a   clinical   trial   to   register   the   trials   in   any   of   the   following   free,   public   clinical   trials   registries:   www.clinicaltrials.gov,   http://clinicaltrials.ifpma.org/clinicaltrials,   http://isrctn.org/.   The   clinical  trial  registration  number  and  name  of  the  trial  register  will  then  be  published  with  the   paper.     2.4  Conflict  of  Interest  and  Source  of  Funding   Clinical   Oral   Implants   Research   requires   that   sources   of   institutional,   private   and   corporate   financial  support  for  the  work  within  the  manuscript  be  fully  acknowledged,  and  any  potential   conflicts  of   interest  noted.  Suppliers  of  materials   should  be  named  and   their   location   (town,   57       state/county,   country)   included.   Information   concerning   conflict   of   interest   and   sources   of   funding  should  be  included  under  Acknowledgements.     2.5  Appeal  of  Decision   The  decision  on  a  paper  is  final  and  cannot  be  appealed.     2.6  Permissions   If  all  or  parts  of  previously  published  illustrations  are  used,  permission  must  be  obtained  from   the  copyright  holder  concerned.  It  is  the  author's  responsibility  to  obtain  these  in  writing  and   provide  copies  to  the  Publishers.     2.7  Copyright  Assignment   Authors   submitting   a   paper   do   so   on   the   understanding   that   the   work   and   its   essential   substance   have   not   been   published   before   and   is   not   being   considered   for   publication   elsewhere.     If   your   paper   is   accepted,   the   author   identified   as   the   formal   corresponding   author   for   the   paper  will  receive  an  email  prompting  them  to  login  into  Author  Services;  where  via  the  Wiley   Author  Licensing  Service  (WALS)  they  will  be  able  to  complete  the  license  agreement  on  behalf   of  all  authors  on  the  paper.     For  authors  signing  the  copyright  transfer  agreement   If  the  OnlineOpen  option  is  not  selected  the  corresponding  author  will  be  presented  with  the   copyright   transfer   agreement   (CTA)   to   sign.   The   terms   and   conditions   of   the   CTA   can   be   previewed  in  the  samples  associated  with  the  Copyright  FAQs  below:   CTA  Terms  and  Conditions  http://authorservices.wiley.com/bauthor/faqs_copyright.asp   For  authors  choosing  OnlineOpen   If   the   OnlineOpen   option   is   selected   the   corresponding   author   will   have   a   choice   of   the   following  Creative  Commons  License  Open  Access  Agreements(OAA):     Creative  Commons  Attribution  Non-­‐Commercial  License  OAA   Creative  Commons  Attribution  Non-­‐Commercial  -­‐NoDerivs  License  OAA     To   preview   the   terms   and   conditions   of   these   open   access   agreements   please   visit   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