BEATRIZ SILVA CAMPANHOL Otimização da produção de pigmento melanina por Aspergillus nidulans usando subprodutos agroindustriais como substrato para cultivo em frascos e biorreatores Orientação: Prof.ª Dra. Sandra Regina Pombeiro Sponchiado Coorientação: Prof.ª Dra. Kelly Johana Dussán Medina ARARAQUARA 2023 Tese de Doutorado apresentado ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” como parte dos requisitos para a obtenção do título de Doutora. Sistema de geração automática de fichas catalográficas da Unesp. Biblioteca do Instituto de Química, Araraquara. Dados fornecidos pelo autor(a). Essa ficha não pode ser modificada. Campanhol, Beatriz Silva C186o Otimização da produção de pigmento melanina por Aspergillus nidulans usando subprodutos agroindustriais como substrato para cultivo em frascos e biorreatores / Beatriz Silva Campanhol. -- Araraquara, 2023 103 f. : il., tabs. Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista (Unesp), Instituto de Química, Araraquara Orientadora: Sandra Regina Pombeiro Sponchiado Coorientadora: Kelly Johana Dussán Medina 1. Planejamento experimental. 2. Vinhaça. 3. Melanina. 4. Aspergillus nidulans. 5. Biorreatores. I. Título. 3 IMPACTO POTENCIAL DESTA PESQUISA Com base nos resultados anteriores obtidos pelo nosso grupo de pesquisa, os quais demonstraram que a melanina produzida pelo mutante MEL1 do fungo Aspergillus nidulans apresenta atividade antioxidante, atividade anti-inflamatória e também age como agente quelante para a recuperação de metal, esse pigmento tornou-se um material promissor para utilização nas áreas da medicina, farmacosmética e ambiental. Diante disso, o presente estudo tem como impacto potencial possibilitar um aumento na produção de melanina com redução de custos do processo em escala industrial, tornando possível uma futura aplicação biotecnológica desse pigmento em diferentes áreas. POTENTIAL IMPACT OF THIS RESEARCH On the basis of the previous results obtained by our research group, which demonstrated that the melanin produced by the MEL1 mutant of Aspergillus nidulans exhibits antioxidant and anti-inflammatory activities and also acts as a chelating agent for metal recovery, this pigment has become a promising candidate for biotechnological applications in the fields of medicine, pharmacosmetics and the environment. In view of this, the potential impact of the present study is to enable an increase in melanin production with a reduction in process costs on an industrial scale, making possible a future biotechnological application of this pigment in different areas. 4 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA Câmpus de Araraquara CERTIFICADO DE APROVAÇÃO TÍTULO DA TESE: "Otimização da produção de pigmento melanina por Aspergillus nidulans usando subprodutos agroindustriais como substrato para cultivo em frascos e biorreatores." AUTORA: BEATRIZ SILVA CAMPANHOL ORIENTADORA: SANDRA REGINA POMBEIRO SPONCHIADO COORIENTADORA: KELLY JOHANA DUSSAN MEDINA Aprovada como parte das exigências para obtenção do Título de Doutora em Biotecnologia, pela Comissão Examinadora: Prof.ª Dr.ª SANDRA REGINA POMBEIRO SPONCHIADO (Participação Virtual) Departamento de Bioquímica e Tecnologia Química / Instituto de Química - UNESP - Araraquara Profa. Dra. VALÉRIA DE CARVALHO SANTOS EBINUMA (Participação Virtual) Departamento de Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia / Faculdade de Ciências Farmacêuticas - UNESP - Araraquara Prof. Dr. REINALDO GASPAR BASTOS (Participação Virtual) Departamento de Tecnologia Agro-Industrial e Sócio-Economia Rural / Universidade Federal de São Carlos - UFSCar - Araras Prof. Dr. JONAS CONTIERO (Participação Virtual) Departamento de Biologia Geral e Aplicada / Instituto de Biociências - UNESP - Rio Claro Prof. Dr. MARCEL OTÁVIO CERRI (Participação Virtual) Departamento de Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia / Faculdade de Ciências Farmacêuticas - UNESP - Araraquara Araraquara, 13 de junho de 2023 Instituto de Química - Câmpus de Araraquara - Rua Prof. Francisco Degni, 55, 14800060, Araraquara - São Paulo http://www.iq.unesp.br/#!/pos- graduacao/biotecnologia/CNPJ: 48.031.918/0027-63. http://www.iq.unesp.br/%23!/pos-graduacao/biotecnologia/CNPJ http://www.iq.unesp.br/%23!/pos-graduacao/biotecnologia/CNPJ 5 DADOS CURRICULARES IDENTIFICAÇÃO Nome: Beatriz Silva Campanhol Nome em citações bibliográficas: CAMPANHOL, B.S.; CAMPANHOL, BEATRIZ SILVA ENDEREÇO PROFISSIONAL Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, Instituto de Química de Araraquara, Departamento de Bioquímica e Tecnologia Química. Unesp – Campus de Araraquara. Jardim Quitandinha. 14800900 - Araraquara, SP – Brasil. FORMAÇÃO ACADÊMICA/TITULAÇÃO 2018 - Atual: Doutorado em andamento em Biotecnologia. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, Brasil. Título: Otimização da produção de pigmento melanina por Aspergillus nidulans usando subprodutos agroindustriais como substrato para cultivo em frascos e biorreatores. Orientador: Sandra Regina Pombeiro Sponchiado. Coorientador: Kelly Johana Dussán Medina. Bolsista do(a): Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, CAPES, Brasil. 2016 – 2018: Mestrado em Agricultura e Ambiente. Universidade Federal de São Carlos, UFSCAR, Brasil. Título: Efeito da solução nutriente na produção microbiana sequencial de ácido cítrico e etanol a partir de bagaço de cana-de-açúcar e vinhaça, Ano de Obtenção: 2018. Orientador: Reinaldo Gaspar Bastos. Bolsista do(a): Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, CAPES, Brasil. 6 2011 – 2015: Graduação em Ciências Biológicas. Universidade Federal de São Carlos, UFSCAR, Brasil. Título: Efeitos dos processos produtivos convencionais e orgânicos sobre a atividade e biomassa microbiana de carbono do solo sob cultivo de cana-de-açúcar. Orientador: Silvana Perissatto Meneghin. FORMAÇÃO COMPLEMENTAR 2021 – 2021: Inglês para pesquisadores: da escrita a publicação. (Carga horária: 6h). UNA Assessoria Linguística, UNA, Brasil. 2021 – 2021: Maratona da Neuroeducação 2.0. (Carga horária: 30h). Instituto Thais Faria Coelho, ITFC, Brasil. 2020 – 2020: Técnicas de Oratória. (Carga horária: 2h). Universidade Federal de São Carlos, UFSCAR, Brasil. 2019 – 2019: Planejamento e Otimização de Processos Industriais. (Carga horária: 8h). Universidade de São Paulo, USP, Brasil. 2018 – 2018: Bases de dados Clarivate Analytics. (Carga horária: 3h). Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, Brasil. 2018 – 2018: Bases de dados da Elsevier. (Carga horária: 3h). Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, Brasil. 2016 – 2016: Tópicos em Cromatografia Liquida de Alta Eficiência. (Carga horária: 10h). Universidade Federal de São Carlos, UFSCAR, Brasil. 2016 – 2016: Otimize suas pesquisas e trabalhos com o Portal de Periódicos CAPES. (Carga horária: 2h). Universidade Federal de São Carlos, UFSCAR, Brasil. 2014 – 2014: Pequenos RNAs e Controle da Expressão Gênica. (Carga horária: 4h). Universidade Federal de São Carlos, UFSCAR, Brasil. 2013 – 2013: Microbiologia Ambiental. (Carga horária: 4h). Universidade Federal de São Carlos, UFSCAR, Brasil. 7 ATUAÇÃO PROFISSIONAL Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, Brasil. Vinculo institucional 2018 - Atual: Vinculo: Bolsista, Enquadramento Funcional: Estudante de Pós- graduação (nível Doutorado), Regime de dedicação exclusiva. Atividades 08/2018 – Atual: Pesquisa e desenvolvimento, Instituto de Química de Araraquara. Linha de pesquisa: Biotecnologia industrial e Ambiental. 04/2021 – 08/2021; Estágio-docência, Instituto de Química de Araraquara. Estagio realizado na Disciplina de Bioquímica Geral e Experimental II. Universidade Federal de São Carlos, UFSCAR, Brasil. Vínculo institucional 2016 – 2018: Vínculo: Bolsista, Enquadramento Funcional: Estudante de pós- graduação (nível Mestrado), Regime: Dedicação exclusiva. Atividades 01/2016 - 02/2018: Pesquisa e desenvolvimento, Universidade Federal de São Carlos - Campus Araras. Linha de pesquisa: Utilização sustentável dos recursos naturais e soluções para problemas agroambientais 01/2016 - 12/2017: Conselhos, Comissões e Consultoria, Universidade Federal de São Carlos - Campus Araras. Cargo ou função: Titular – Representante Discente. 07/2016 - 12/2016: Estágios, Universidade Federal de São Carlos - Campus Araras. Estagio realizado na Disciplina de Enzimologia. http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K8177870T6&tokenCaptchar=03AFY_a8U4ruTE5-ZcDNOVEKTrhK_QklmMfc6k5rviDOgHsp06-TB20BOl8QR81GP-vfepB99vXjT2C3FJSi8E4dDjGZaS_5LC-_LbdP0kaTW45XpvcvZirMA1FDxSOD7ZJeszxLhV7VSBTdkMKn6pvty8_sSmSi9kaExX3EO454exTA9TGIVCnHx4z2Ni7VSLzs3D9e8n1wzpAa29cCgaAkxGjOnrURxw0PCFD4v37t56RMvQcyLoX46r9Lx8VmAPVhc5SLRlOES7tiNXiOQdGLnX6EOnpqORgr5th4M5yQ24PCIxqjaQz8vjpXlQjTcVwreH07SrmLvQieWtMbzaf3qpZ9EOEV4cYrldSVM3XpEHTxBDrH4t2JRFelLDnjBXjXeIxZjsmqpopoZA11YQMbsEhezdpD6_tcQ2bBnHu95Bm7sxPW6WSwe7RU8jBaDEvN1Con4Aw-VN5637Z1bbk6JhZ12loTaFQ4keSBZPZYRVRZRvkYZZrt-MXcJ9QqbvpjkuvNg2kk1_bTNKPWhJfTaznMeMVvaEX7k4Ht7XZPShCh3C1MRok0ba_zrOOIJA_8qr28mTOf1ptuB7D7pm-dZMb0CbE0Xs6g#LP_Utiliza%C3%A7%C3%A3o%20sustent%C3%A1vel%20dos%20recursos%20naturais%20e%20solu%C3%A7%C3%B5es%20para%20problemas%20agroambientais http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K8177870T6&tokenCaptchar=03AFY_a8U4ruTE5-ZcDNOVEKTrhK_QklmMfc6k5rviDOgHsp06-TB20BOl8QR81GP-vfepB99vXjT2C3FJSi8E4dDjGZaS_5LC-_LbdP0kaTW45XpvcvZirMA1FDxSOD7ZJeszxLhV7VSBTdkMKn6pvty8_sSmSi9kaExX3EO454exTA9TGIVCnHx4z2Ni7VSLzs3D9e8n1wzpAa29cCgaAkxGjOnrURxw0PCFD4v37t56RMvQcyLoX46r9Lx8VmAPVhc5SLRlOES7tiNXiOQdGLnX6EOnpqORgr5th4M5yQ24PCIxqjaQz8vjpXlQjTcVwreH07SrmLvQieWtMbzaf3qpZ9EOEV4cYrldSVM3XpEHTxBDrH4t2JRFelLDnjBXjXeIxZjsmqpopoZA11YQMbsEhezdpD6_tcQ2bBnHu95Bm7sxPW6WSwe7RU8jBaDEvN1Con4Aw-VN5637Z1bbk6JhZ12loTaFQ4keSBZPZYRVRZRvkYZZrt-MXcJ9QqbvpjkuvNg2kk1_bTNKPWhJfTaznMeMVvaEX7k4Ht7XZPShCh3C1MRok0ba_zrOOIJA_8qr28mTOf1ptuB7D7pm-dZMb0CbE0Xs6g#LP_Utiliza%C3%A7%C3%A3o%20sustent%C3%A1vel%20dos%20recursos%20naturais%20e%20solu%C3%A7%C3%B5es%20para%20problemas%20agroambientais 8 Universidade Federal de São Carlos, UFSCAR, Brasil. Vínculo institucional 2012 – 2014: Vínculo: Bolsista, Enquadramento Funcional: Membro, Carga horária: 12, Regime: Dedicação exclusiva. Atividades PIBID/CAPES - Programa Institucional de Bolsa de Iniciação à Docência. Este programa tem por fim aperfeiçoar e valorizar a prática docente para estudantes em processo de formação. Orientadora: Dra. Helka Fabbri Broggian Ozelo. PRODUÇÕES • Artigos completos publicados em periódicos: ROCHA, LAURA MACEDO; CAMPANHOL, BEATRIZ SILVA; BASTOS, REINALDO GASPAR. Solid-State Cultivation of Aspergillus niger-Trichoderma reesei from Sugarcane Bagasse with Vinasse in Bench Packed-Bed Column Bioreactor. APPLIED BIOCHEMISTRY AND BIOTECHNOLOGY, v. 193, p. 2983-2992, 2021. CAMPANHOL, B. S.; SILVEIRA, G.C.; CASTRO, M.C.; CECCATO-ANTONINI, S.R.; BASTOS, R.G. Effect of the nutrient solution in the microbial production of citric acid from sugarcane bagasse and vinasse. BIOCATALYSIS AND AGRICULTURAL BIOTECHNOLOGY, v. 19, p. 101147, 2019. • Artigos aceitos para publicação CAMPANHOL, B. S.; RIBEIRO, B. D.; CASELLATO, F.; MEDINA, K. J. D.; SPONCHIADO, S. R. P. Improvement of melanin pigment production by Aspergillus nidulans using eco-friendly and inexpensive substrates. JOURNAL OF FUNGI, 2023. http://lattes.cnpq.br/0655549761728791 9 • Trabalhos completos publicados em anais de congressos: BASTOS, R. G.; FRANCA, H. C. R. ; CAMPANHOL, B. S.; SILVEIRA, G. C.; CASTRO, M. Sequential process of citric acid production in sugarcane bagasse by microbial consortium and ethanol fermentation from fungal extract.. In: ASABE Annual International Meeting, 2017, Spokane. ASABE Annual International Meeting, 2017. CAMPANHOL, B. S.; SILVEIRA, G. C. ; CASTRO, M.C.; BASTOS, R. G. Citric acid production by microbial consortium from sugarcane bagasse: effect of ethanol and vinasse in moisturizing soluction. In: XXI Simpósio Nacional de Bioprocessos (SINAFERM) - XII Simpósio de Hidrólise Enzimática de Biomassas (SHEB), 2017, Aracaju. Anais do XXI SINAFERM - XII SHEB, 2017., 2017. • Resumos publicados em anais de congressos SILVEIRA, G. C. ; FRANCA, H. C. R.; CAMPANHOL, B. S. ; BASTOS, R. G. Ethanol fermentation of fungal extract by solid-state cultivation of Trichoderma reesei from sugarcane bagasse. In: VIII Simpósio de Microbiologia Aplicada, 2017, Rio Claro. Anais do VIII SMA, 2017, 2017. SILVEIRA, G. C.; CAMPANHOL, B. S.; BASTOS, R. G. Perspectiva da produção de etanol a partir de extrato obtido via cultivo em estado sólido de consórcio fúngico em bagaço de cana-de-açúcar. In: XXIV Congresso de Iniciação Científica da UFSCar, 2017, Araras. Anais do XXIV CIC UFSCar, 2017. FRACETTO, F. J. C.; FRACETTO, G. G. M.; PEDROSO, A.; CAMPANHOL, B. S.; SILVA, C. S.; STOROLLI, G. M.; ROSA, L. B. G.; BELOTO, L. M. Bactérias Desnitrificantes no Agrossistema do Solo de Cana-de-açúcar. In: II Semana dos Estudantes de Biologia, 2014, Araras. Bactérias Desnitrificantes no Agrossistema do Solo de Cana-de-açúcar, 2014. http://lattes.cnpq.br/0655549761728791 http://lattes.cnpq.br/4706550271809604 http://lattes.cnpq.br/4706550271809604 http://lattes.cnpq.br/4216625034914382 http://lattes.cnpq.br/0655549761728791 http://lattes.cnpq.br/4706550271809604 http://lattes.cnpq.br/4706550271809604 http://lattes.cnpq.br/0655549761728791 http://lattes.cnpq.br/4706550271809604 http://lattes.cnpq.br/0655549761728791 http://lattes.cnpq.br/0655549761728791 http://lattes.cnpq.br/0655549761728791 10 FRACETTO, F. J. C.; FRACETTO, G. G. M.; BELOTO, L. M.; PEDROSO, A.; CAMPANHOL, B. S.; SILVA, C. S.; STOROLLI, G. M.; ROSA, L. B. G. Measurement of Denitrifying Bacteria in Agrosystem Sugarcane Soils. In: VI Simpósio de Microbiologia Aplicada, 2013, Rio Claro. Measurement of Denitrifying Bacteria in Agrosystem Sugarcane Soils., 2013. • Apresentações de Trabalho: MEDEIROS, W. B.; CAMPANHOL, B. S.; POMBEIRO-SPONCHIADO, S. R. Efeito da Granulometria da Biomassa no Processo de Extração da Melanina em Fungos. 2019. (Apresentação de Trabalho/Simpósio). RIBEIRO, B. D.; CAMPANHOL, B. S.; POMBEIRO-SPONCHIADO, S. R. Produção do pigmento melanina pelo mutante MEL1 do fungo Aspergillus nidulans com substratos de baixo custo. 2019. (Apresentação de Trabalho/Congresso). MACEDO, L. R.; CAMPANHOL, B. S.; CARACA, S. N.; ZUMPANO, C. B. C.; CECCATO-ANTONINI, S.R.; BASTOS, R.G. Cultivo em Estado Sólido de Aspergillus niger e Trichoderma reesei em bagaço de cana-de-açúcar e vinhaça: Produção de Ácido Cítrico em biorreator de bancada. 2018. (Apresentação de Trabalho/Congresso). MACEDO, L. R.; CAMPANHOL, B. S.; CARACA, S. N.; ZUMPANO, C. B. C.; CECCATO-ANTONINI, S.R.; BASTOS, R.G. Efeito da vinhaça e etanol como solução nutriente na Produção de Ácido Cítrico por Aspergillus niger e Trichoderma reesei em bagaço de cana-de-açúcar. 2018. (Apresentação de Trabalho/Congresso). MACEDO, L. R.; CAMPANHOL, B. S.; BASTOS, R.G. Efeito da altura de leito na produção de ácido cítrico por consórcio fúngico em biorreator de coluna a partir de bagaço de cana-de-açúcar. 2018. (Apresentação de Trabalho/Congresso). http://lattes.cnpq.br/0655549761728791 11 SILVEIRA, G. C.; CAMPANHOL, B. S.; FRANCA, H. C. R.; BASTOS, R. G. Ethanol fermentation of fugal extract by solid-state cultivation of Trichoderma reesei from sugarcane bagasse. 2017. (Apresentação de Trabalho/Simpósio). CAMPANHOL, B. S.; SILVEIRA, G. C. ; CASTRO, M.C; BASTOS, R. G.. Citric acid production by microbial consortium from sugarcane bagasse: effect of ethanol and vinasse in moisturizing soluction. 2017. (Apresentação de Trabalho/Simpósio). BASTOS, R. G.; FRANCA, H. C. R.; SILVEIRA, G. C.; CAMPANHOL, B. S.; CASTRO, M. C . Sequential process of citric acid production in sugarcane bagasse by microbial consortium and ethanol fermentation from fungal extract. 2017. (Apresentação de Trabalho/Congresso). FRACETTO, F. C.; FRACETTO, G. G. M.; BELOTO, L. M.; PEDROSO, A.; CAMPANHOL, B. S.; SILVA, C. S.; STOROLLI, G. M.; ROSA, L. B. G. Bactérias Desnitrificadoras no Agrosistema do Solo de cana-de-açúcar. 2014. (Apresentação de Trabalho/Outra). BELOTO, L. M.; FRACETTO, F. C.; FRACETTO, G. G. M.; PEDROSO, A.; CAMPANHOL, B. S.; SILVA, C. S.; STOROLLI, G. M.; ROSA, L. B. G. Measurement of denitrifying bacteria in agrosystem sugarcane soils. 2013. (Apresentação de Trabalho/Simpósio). FIORINI, B. R.; MARTARELLO, N. S.; SOUZA, I. A.; CAMPANHOL, B. S.; OLIVEIRA, E. H.; STEFANI, J. L.; BARBOSA, V. M. B.; MENEGHIN, S. P.; OZELO, H. F. B.; LUCA, L. Q. J.; SOUZA, P.. Uma Ferramenta eficaz para o aprendizado. 2013. (Apresentação de Trabalho/Outra). SOUZA, I. A.; CAMPANHOL, B. S.; CARNEIRO, F. G.; MOMO, D. H. Equação do 2º grau. 2013. (Apresentação de Trabalho/Outra). http://lattes.cnpq.br/4706550271809604 http://lattes.cnpq.br/0655549761728791 http://lattes.cnpq.br/0655549761728791 http://lattes.cnpq.br/4706550271809604 http://lattes.cnpq.br/4216625034914382 http://lattes.cnpq.br/4706550271809604 http://lattes.cnpq.br/0655549761728791 http://lattes.cnpq.br/0655549761728791 http://lattes.cnpq.br/4216625034914382 http://lattes.cnpq.br/0655549761728791 http://lattes.cnpq.br/0655549761728791 http://lattes.cnpq.br/0655549761728791 http://lattes.cnpq.br/0655549761728791 12 EVENTOS • 4ª Escola de Pesquisadores do Campus USP São Carlos. 2020. (Outra). • Eletroquímica-Técnicas de medição de pH. 2020. (Outra). • Live con experto: como escribir un articulo cientifico. 2020. (Outra). • X Simpósio Agroambiental e Jornada Agronômica 2020. 2020. (Simpósio). • XXXII Congresso de Iniciação Científica da Unesp. XXXII Congresso de Iniciação Científica da Unesp. 2020. (Congresso). • 4° Congresso de Educação Profissional e Tecnológica. Congresso de Educação Profissional e Tecnológica. 2018. (Congresso). • Oficina sobre o cadastro no SISGEN. 2018. (Oficina). • VIII Congresso Farmacêutico da Unesp e IV Jornada de Engenharia de Bioprocesso e Biotecnologia ia. 2018. (Congresso). • XXI Simpósio Nacional de Bioprocessos. Citric acid production by microbial consortium from sugarcane bagasse: effect of ethanol and vinasse in moisturizing soluction. 2017. (Simpósio). • XXIV Congresso de Iniciação Científica da UFSCar. XXIV Congresso de Iniciação Científica da UFSCar. 2017. (Congresso). • VI Simpósio Agroambiental e Jornada Agronômica 2016. 2016. (Simpósio). • III Semana dos Estudantes de Biologia. 2015. (Outra). • II Semana dos Estudantes de Biologia. Bactérias Desnitrificadoras no Agrosistema do Solo de cana-de-açúcar. 2014. (Outra). • 10ª Jornada Científica e Tecnológica da UFSCar. Uma Ferramenta Eficaz para o Aprendizado. 2013. (Congresso). • III Encontro PIBID-UFScar: um balanço das ações compartilhada entre Universidade e Escola. Equação do 2º Grau. 2013. (Encontro). • I Semana dos Estudantes de Biologia. 2013. (Outra). • I Simpósio de linhas de pesquisas. 2013. (Simpósio). • IV Encontro PIBID-UFScar: um balanço das ações compartilhadas entre Universidade e Escola. 2013. (Encontro). • VI Simpósio de Microbiologia Aplicada. Measurement of Denitrifying Bacteria in Agrosystem Sugarcane Soils. 2013. (Simpósio). • Cine PET. 2012. (Encontro). 13 • A Inclusão escolar no município de Araras. 2011. (Seminário). Organização de eventos, congressos, exposições e feiras: • CAMPANHOL, B. S.; SANTOS, P. H. V.; BERNARDO, C. P.; CIRINO, A. E. M.; MEDINA, A. F.; ROSA, L. B. G.; ROSARIO, V. A. C.; CAETANO, L. F.; TALLARICO, L. C.; OLIVEIRA, A. A. S.; STELUTTI, I. M.; FADIN, D. A.; SILVA, V. R.; CURIEL, A. C.; CAMPREGHER JUNIOR, J. C. VII Simpósio Agroambiental e Jornada Agronômica. 2017. (Outro). • CAMPANHOL, B. S.. III Encontro PIBID-UFSCar: um balanço das ações compartilhadas entre Universidade e Escola. 2013. (Outro). SUPERVISÃO CIENTÍFICA Iniciação científica: Beatriz Dias Ribeiro. Produção do pigmento melanina pelo mutante MEL1 do fungo Aspergillus nidulans com substratos de baixo custo. 2019. Iniciação Científica. (Graduando em Bacharelado em Química Tecnológica) - Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho. Supervisor: Beatriz Silva Campanhol. http://lattes.cnpq.br/0655549761728791 http://lattes.cnpq.br/0655549761728791 14 Dedico este trabalho a Deus que me permitiu viver esta experiência. Aos meus pais e irmão pelo apoio, incentivo, amor e carinho. Aos meus amigos pela convivência, apoio e atenção nos momentos tristes e alegres. 15 AGRADECIMENTOS Primeiramente gostaria de agradecer a Deus por ter me permitido viver e a realizar este sonho. Aos meus pais Eli e Valdirene, e ao meu irmão Hugo, por todo amor, carinho e por sempre estarem ao meu lado me apoiando em todos os momentos. A minha orientadora Prof.ª Dra. Sandra Regina Pombeiro Sponchiado, por ter acreditado em mim, ter sido paciente e ter me proporcionado grandes conhecimentos. Muito obrigada. A minha coorientadora Prof.ª Dra. Kelly Johana Dussán Medina, por ter sido paciente e atenciosa para sanar todas as minhas dúvidas. Muito obrigada. A coordenação do Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, por estar sempre de prontidão e dispostos a ajudar. Aos meus companheiros de Laboratório Fátima, Jazmina, William e Karen por todo apoio, amizade, troca de conhecimento e por tornarem a rotina no laboratório mais leve e agradável. Aos amigos do departamento, Raul, Guilherme, Marcos, Rebeca, David, Fuller, Gabriela, Naiara, Carolina e Gregório, muito obrigada por todo ensinamento e amizade ao longo dessa jornada. Aos amigos de longa data, que mesmo distante se fazem presente, para dar apoio, atenção e boas risadas. A Drielle, Caroline, Tamires, Camila Gruber, Ângela, Marília, Larissa, Isabela, Rafaela, Camila Azevedo e Tatiane obrigada por toda amizade. E agradeço a todos que direta ou indiretamente fizeram parte da minha formação e contribuíram para que este dia chegasse. Obrigada. A CAPES pela concessão da bolsa de doutorado, com a qual pude concretizar todo o trabalho. O presente trabalho foi realizado com o apoio da coordenação de aperfeiçoamento de pessoal de nível superior - Brasil CAPES – Código de financiamento 001. 16 RESUMO Com o grande interesse das indústrias pelo uso de pigmentos naturais em substituição aos corantes sintéticos, os fungos filamentosos destacam-se como uma fonte mais vantajosa por produzirem uma gama de pigmentos com altos rendimentos por meio de estratégias econômicas e sustentáveis. Em estudos anteriores foi demonstrado que a melanina extraída do mutante MEL1 de Aspergillus nidulans exibe atividades antioxidante e anti-inflamatória, não apresentando efeito citotóxico ou mutagênico, e também mostrou ser eficiente na remoção de metais em solução. Estes resultados sugerem que este pigmento pode ser considerado um material promissor para utilização nas áreas da medicina, farmacosmética e ambiental. Neste contexto, o presente estudo teve como principal objetivo otimizar a composição do meio usando melaço, vinhaça e água de maceração de milho para o cultivo em fermentação submersa do mutante MEL1, visando uma maior produção do pigmento melanina com menor custo. Também foi avaliada a produção de melanina nos reatores em escala de bancada, tanque agitado e coluna de bolhas. Com os resultados obtidos nos planejamentos experimentais, realizados em frascos, foi possível observar que a adição de 0,81 % (v/v) de vinhaça e 1,62 % (m/v) de glicose ao meio de cultura resultou na produção de 291,74 ± 4,59 mg de melanina não purificada por g de biomassa, o que equivale a um aumento de 88% (acréscimo de 136,59 mg de melanina não purificada por g de biomassa) comparado as condições antes da otimização. Na condição otimizada, a produção da melanina purificada foi de 225,39 ± 4,52 mg de melanina purificada por g de biomassa, equivalendo a um aumento de 125% (acréscimo de 125,07 mg de melanina purificada por g de biomassa) quando comparado as condições antes da otimização. Os resultados obtidos nos biorreatores mostraram que o cultivo em reator de coluna de bolhas resultou em maior produção de melanina não purificada (271,56 ± 9,37 mg g-1 de biomassa) quando comparado ao cultivo em tanque agitado (231,11 ± 21,09 mg g-1 de biomassa), chegando a uma produção total de 1,2 g L-1. Portanto, o cultivo do mutante MEL1 em biorreator de coluna de bolhas, utilizando o meio de cultura contendo glicose e vinhaça como substrato de baixo custo, torna o processo de produção da melanina pelo mutante MEL1 de A. nidulans economicamente viável para futuras aplicações biotecnológicas. Palavras-chave: otimização; vinhaça; melanina; Aspergillus nidulans; biorreator. 17 ABSTRACT Due to the great interest of industries for the use of natural pigments to replace synthetic dyes, filamentous fungi stand out as a more advantageous source for producing a range of pigments with high yields through economic and sustainable strategies. In previous studies, it was demonstrated that the melanin extracted from the MEL1 mutant of Aspergillus nidulans exhibits antioxidant and anti-inflammatory activities, not showing cytotoxic or mutagenic effects, and also proved to be efficient in removing metals in solution. These results suggest that this pigment can be considered a promising material for use in medicine, pharmacosmetics and environment. In this context, the main objective of the present study was to optimize the composition of the medium using molasses, vinasse and corn steep liquor for submerged fermentation cultivation of the MEL1 mutant, aiming at a greater production of the pigment melanin with lower cost. Melanin production in bench-scale using stirred tank and bubble column reactors was also evaluated. With the results obtained in the experimental design carried out in flasks, it was possible to observe that the addition of 0.81% (v/v) of vinasse and 1.62% (w/v) of glucose to the culture medium resulted in the production of 291.74 ± 4.59 mg of unpurified melanin per g of biomass, which is equivalent to an increase of 88% (increase of 136.59 mg of unpurified melanin per g of biomass) compared to the conditions before optimization. In the optimized condition, the production of purified melanin was 225.39 ± 4.52 mg of purified melanin per g of biomass, equivalent to an increase of 125% (increase of 125.07 mg of purified melanin per g of biomass) when compared to the conditions before optimization. The results obtained in the bioreactors showed that cultivation in a bubble column reactor resulted in greater unpurified melanin production (271.56 ± 9.37 mg g-1 of biomass) when compared to cultivation in a stirred tank (231.11 ± 21. 09 mg g-1 of biomass), reaching a total production of 1.2 g L-1. Therefore, the cultivation of the MEL1 mutant in a bubble column bioreactor, using the culture medium containing glucose and vinasse as a low- cost substrate, makes the process of melanin production by the MEL1 mutant of A. nidulans economically viable for future biotechnological applications. Keywords: optimization; vinasse; melanin; Aspergillus nidulans; bioreactor. 18 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Diferentes pigmentos produzidos por fungos.............................................29 Figura 2. Modelo para estrutura da eumelanina........................................................33 Figura 3. Via de síntese de melanina em fungos......................................................34 Figura 4. Morfologia do mutante MEL1 de A. nidulans em meio mínimo suplementado com glicose (1% m/v), nitrato de sódio (0,60% m/v), inositol (20 ppm) e com AMM (1% v/v)..................................................................................................42 Figura 5. Cultivo de mutante MEL1 (etapa de cultura) em reator de tanque agitado com impelidor náutico.................................................................................................47 Figura 6. Cultivo do mutante MEL1 (etapa de cultura) em reator de coluna de bolhas com difusor circular de ar...........................................................................................48 Figura 7. Curva de referência de DOPA-melanina sintética......................................50 Figura 8. Gráfico de Pareto sobre a analises dos principais efeitos das variáveis independentes sobre a produção de melanina pelo mutante MEL1 em função do planejamento fatorial fracionado 25-1..........................................................................64 Figura 9. Gráfico da Correlação de ordem de Spearman com os dados da produção de biomassa e melanina não purificada obtidos no DCCR 23....................................70 Figura 10. Gráfico de Pareto sobre a análise dos efeitos das variáveis independentes sobre a produção de melanina pelo mutante MEL1 em função do planejamento composto central rotacional (DCCR) 23...............................................71 Figura 11. Superfície de resposta para a produção de melanina não purificada (mg g-1 de biomassa) pelo mutante MEL1 e a interação entre as variáveis independentes............................................................................................................74 Figura 12. Função de desejabilidade (com valores reais) para a produção de melanina não purificada (mg g-1 de biomassa) em função da combinação das variáveis independentes em seus níveis ótimos........................................................76 Figura 13. Representação esquemática da biossíntese da DOPA-Melanina em fungos. Reações 1 e 2 são catalisadas por tirosinase e reação 3 pode ser catalisada por tirosinase ou lacase..............................................................................................80 Figura 14. Cinética de crescimento, produção de melanina e consumo de glicose pelo mutante MEL1 durante o cultivo na condição otimizada....................................83 Figura 15. Velocidade específica de crescimento (µx), velocidade especifica de consumo de substrato (µs) e a velocidade específica de formação de produto (µp) em relação ao tempo do mutante MEL1..........................................................................85 19 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Ocorrência natural de pigmentos fúngicos do solo e sua aplicação sugerida......................................................................................................................31 Tabela 2. Composição química do melaço e vinhaça de cana-de-açúcar, e água de maceração de milho...................................................................................................43 Tabela 3. Concentrações das variáveis independentes em diferentes níveis para o planejamento fracionado 25-1......................................................................................46 Tabela 4. Concentrações das variáveis independentes em diferentes níveis para o delineamento composto central rotacional (DCCR)...................................................47 Tabela 5. Condições operacionais dos reatores de tanque agitado e coluna de bolhas.........................................................................................................................49 Tabela 6. Matriz dos ensaios do planejamento fatorial fracionado 25-1 para a produção de biomassa e melanina pelo mutante MEL1. Os valores reais estão entre parênteses..................................................................................................................57 Tabela 7. Matriz dos ensaios do DCCR 23 para a produção de biomassa e melanina pelo mutante MEL1. Os valores reais estão entre parênteses...................................65 Tabela 8. Análise de variância para a produção de melanina pelo mutante MEL1 em função do planejamento composto central rotacional (DCCR) 23..............................72 Tabela 9. Produção de melanina não purificada e purificada pelo mutante MEL1 nas condições antes e após otimização............................................................................78 Tabela 10. Atividade das enzimas tirosinase e lacase após cultivo do mutante MEL1 nas condições antes e após otimização.....................................................................81 Tabela 11. Avaliação dos parâmetros relativos aos fatores de conversão de substrato em biomassa, de substrato em produto, de biomassa em produto e produtividade máxima de melanina não purificada em relação a produção de biomassa e de melanina não purificada com o consumo de glicose durante o cultivo do mutante MEL1 na condição otimizada..................................................................86 Tabela 12. Avaliação da produção de biomassa, melanina não purificada e produção total de melanina não purificada obtida após o cultivo do mutante MEL1 por 72 e 96 horas em reator de tanque agitado e coluna de bolhas na condição otimizada........89 Tabela 13. Avaliação dos parâmetros fermentativos produção de biomassa, melanina não purificada, consumo de glicose, fator de conversão de substrato em biomassa, fator de conversão de substrato em melanina não purificada e produtividade máxima de melanina não purificada no cultivo do mutante MEL1 em biorreatores por 72 e 96 horas...................................................................................93 20 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AMM: Água de Maceração de Milho ANOVA: Análise de variância CLAE: Cromatografia Liquida de Alta Eficiência cm: Centímetro DCCR: Delineamento Composto Central Rotacional DHN: 1,8-dihidroxinaftaleno Esporos mL-1: Esporos por mililitro EDTA: Etilenodiamino tetra-acético g: grama H: Horas HMG: 2,5-dihidroxifenilacetato L: Litros L-DOPA: L-3,4-di-hidroxifenilalanina LED: Diodo Emissor de Luz LPS: Lipopolissacarídeo m/v: Massa por Volume mg g-1 h-1: Miligrama por grama por hora mg g-1: Miligrama por grama min: minuto mL: Mililitro mm: Milímetros mol L-1: Mol por litro nm: Nanômetros PMFS: Fluoreto de fenilmetilsulfonil ppm: Partes por milhão rpm: Rotação por minuto THN: 1,3,6,8-tetrahidroxinaftaleno U/mL: unidade de atividade enzimática por mililitro v/v: Volume por Volume vvm: Volume de ar por volume de meio por minuto xg: Força centrífuga relativa https://www.iq.unesp.br/#!/biblioteca/normalizacao/normas-dissertacao-e-teste/parte-interna/lista-de-abreviaturas-e-siglas/ 21 μg: Micrograma μmol: Micromol µL: Microlitro 22 LISTA DE SÍMBOLOS %: Porcentagem <: Menor >: Maior ±: Mais ou menos ºC: Graus Celsius µp: Velocidade específica de formação de produto µs: Velocidade especifica de consumo de substrato µx: Velocidade específica de crescimento Ɛ: Coeficiente de extinção molar HCl: Ácido clorídrico HGA: Ácido homogentésico HOCl: Ácido hipocloroso KOH: Hidróxido de potássio Ks: Constante de saturação NaOH: Hidróxido de sódio NH4OH: Hidróxido de amônio P: Quantidade de pigmento final P0: Quantidade de pigmento inicial Pm: Concentração máxima de pigmento Po: Concentração inicial de pigmento Qp: Produtividade de pigmento R2: Coeficiente de determinação S: Concentração final de glicose S0: Concentração inicial de glicose tfp: Tempo final da fermentação U: unidade de atividade enzimática Ve: Volume de extrato enzimático utilizado X: Concentração final de biomassa X0: Concentração inicial de biomassa YP/S: Fator de conversão de glicose em melanina não purificada Yx/s: Fator de conversão de glicose em biomassa https://www.iq.unesp.br/#!/biblioteca/normalizacao/normas-dissertacao-e-teste/parte-interna/lista-de-simbolos/ 23 ΔA: Variação da absorbância μm: Velocidade máxima específica de crescimento μx: Velocidade específica de crescimento do micro-organismo µm: Máxima velocidade específica de crescimento (h-1) rx: Velocidades instantâneas de crescimento rp: Velocidades instantâneas de formação produto rs: Velocidades instantâneas de consumo de substrato dt: Variação do tempo ds: Variação do consumo de substrato dp: Variação de formação de produto 24 SUMÁRIO 1.INTRODUÇÃO.......................................................................................................25 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................................. 28 2.1. PRODUÇÃO DE PIGMENTO E SUAS APLICAÇÕES BIOTECNOLÓGICAS ......................................................................................... 28 2.2 SÍNTESE E EXTRAÇÃO DA MELANINA PRODUZIDA POR FUNGOS ..... 32 2.3 UTILIZAÇÃO DE RESÍDUOS AGROINDUSTRIAIS PARA A PRODUÇÃO DE PIGMENTOS ................................................................................................ 36 2.4 PRODUÇÃO DE PIGMENTOS EM BIORREATORES ................................ 39 3. OBJETIVO ............................................................................................................ 41 4. MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................... 42 4.1 Fungo .......................................................................................................... 42 4.2 Vinhaça, Água de maceração de milho e Melaço................................... 42 4.3 Obtenção dos esporos ............................................................................. 44 4.4 Cultivo do fungo em frascos .................................................................... 45 4.5 Otimização das condições de cultivo do mutante MEL1 em frascos 46 4.6 Cultivo do fungo em biorreatores de bancada ....................................... 47 4.7 Extração do pigmento .............................................................................. 49 4.8 Purificação da melanina ........................................................................... 50 4.9 Quantificação da melanina ........................................................................ 50 4.10 Determinação da atividade enzimática tirosinase e lacase pelo mutante MEL 1 .................................................................................................. 51 4.11 Determinação do teor de glicose .......................................................... 52 4.12 Determinação dos parâmetros cinéticos de pigmentação ................. 53 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................ 56 5.1 Efeito da glicose, nitrato de sódio, melaço, vinhaça e AMM na produção de melanina pelo mutante MEL1. .................................................................... 56 5.2 Avaliação da atividade das enzimas lacase e tirosinase no mutante MEL1 .................................................................................................................. 79 5.3 Estudo dos parâmetros fermentativos de pigmentação em frascos ... 82 5.4 Avaliação do processo de produção de melanina pelo mutante MEL1 em biorreatores de bancada ............................................................................ 88 6. CONCLUSÃO ....................................................................................................... 96 7. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS ................................................... 97 8. REFERENCIAS ..................................................................................................... 98 25 1. INTRODUÇÃO As indústrias farmacêutica, cosmética, têxtil e de alimentos tem demonstrado um crescente interesse no uso de pigmentos naturais em substituição aos pigmentos sintéticos, devido ao seu alto custo de produção por síntese química e também aos seus efeitos indesejáveis e potencialmente prejudiciais à saúde humana e ao meio ambiente (RAO; XIAO; LI, 2017). Com o aumento da demanda por pigmentos naturais mais seguros e ecologicamente estima-se que até 2025 o mercado mundial de pigmentos naturais arrecade US$ 37,5 bilhões, devido à procura por alimentos que ofereçam propriedades funcionais e à rápida expansão do setor de alimentos e bebidas em todo o mundo (SANTOS et al., 2021). Pesquisas tem sido realizadas para substituir pigmentos sintéticos por pigmentos naturais, uma vez que, a natureza é uma fonte rica de organismos produtores de pigmentos, incluindo plantas, animais e micro-organismos (KALRA; CONLAN; GOEL, 2020; LYU et al., 2022; TULI et al., 2015). No entanto, os pigmentos obtidos a partir de animais e vegetais têm limitações devido a disponibilidade sazonal, preocupações com o desmatamento e a extinção de espécies e também produção de compostos instáveis e insolúveis. Com isso, micro-organismos como fungos e bactérias são fontes alternativas mais vantajosas de biopigmentos devido ao seu rápido crescimento, produção independente das condições climáticas, com altos rendimentos por meio de estratégias econômicas e sustentáveis (MERUVU; DOS SANTOS, 2021). Os fungos têm atraído atenção especial para a produção de pigmentos naturais por esses compostos apresentarem amplo espectro de cores com alta estabilidade luminosa e química (KALRA; CONLAN; GOEL, 2020). Várias espécies de fungos conseguem produzir diferentes classes de pigmentos, incluindo carotenoides, melaninas, flavinas, fenazinas e quinonas, os quais têm inúmeras aplicações (BELL; WHEELER, 1986; CORDERO; CASADEVALL, 2017; POMBEIRO- SPONCHIADO et al., 2017; TULI et al., 2015; VENIL; LAKSHMANAPERUMALSAMY, 2009). Dentre estes micro-organismos, pode-se citar o fungo ascomiceto Aspergillus nidulans, o qual é capaz de produzir pigmentos escuros, como a melanina, que são encontradas na parede celular das hifas e esporos e/ou também no meio extracelular, como polímeros insolúveis (ELLIS, 1974; GOMEZ; NOSANCHUK, 2003; MARTINELLI, 1994). A função deste pigmento nos fungos pode ser vista como 26 vantagem de adaptação e/ou sobrevivência em condições ambientais extremas, pois confere proteção contra radiação ultravioleta, ação de enzimas líticas, dessecamento, extremos de temperatura, toxicidade a metal pesado e drogas antimicrobianas (CORDERO; CASADEVALL, 2017). As melaninas podem ser definidas como metabólitos secundários, constituídos por monômeros fenólicos e/ou indólicos, formando polímeros complexos (TOLEDO et al., 2017). Devido ao seu amplo espectro de atividades biológicas, incluindo radioproteção, antioxidante, antimicrobiana, antiviral, anti-inflamatória, antitumoral e imunoestimulante, a melanina apresenta potencial para ser utilizada em diversas aplicações biotecnológicas nas áreas da medicina, ambiental, farmacosmética e nanotecnologia (POMBEIRO-SPONCHIADO et al., 2017; SOLANO, 2014). No entanto, para uma aplicação prática desse pigmento é necessário estabelecer rotas mais econômicas para a sua produção em larga escala. Uma alternativa é a utilização de meios de cultivo de baixo custo, uma vez que a composição do meio é um fator crítico na determinação de bioprocessos economicamente viáveis (LOPES; LIGABUE-BRAUN, 2021; PANESAR; KAUR; PANESAR, 2015). Atualmente os pesquisadores tem demonstrado um grande interesse na utilização de subprodutos agroindustriais, como água de maceração de milho, melaço, vinhaça, bagaço de cana-de-açúcar, soro do queijo, tortas oleaginosas (amendoim, algodão, mamona), em processos fermentativos, por estarem disponíveis em grandes quantidades e com baixo valor comercial. Estes subprodutos podem ser utilizados como meio de cultura, uma vez que apresentam uma composição rica em nutrientes, principalmente fontes de carbono, nitrogênio e minerais os quais podem atuar para o crescimento dos micro-organismos (HAMANO; KILIKIAN, 2006; LOPES; LIGABUE- BRAUN, 2021; PANESAR; KAUR; PANESAR, 2015; VALDUGA et al., 2007). A aplicação de uma variedade de substratos naturais em processos fermentativos, para estimular e aumentar o rendimento de pigmentos microbianos foram estudados e, indicou os substratos naturais como um elemento nutriente potencial na produção de pigmento microbiano (RAMESH et al., 2022). Além disso, a utilização de subprodutos agroindustriais são capazes de diminuir os custos de produção em processos fermentativos (LOPES; LIGABUE-BRAUN, 2021). 27 Com o objetivo de obter maior rendimento do composto de interesse é necessário avaliar o processo de produção em biorreatores (VENKATACHALAM et al., 2023). A produção de alguns pigmentos encontra-se em estágios mais avançados de aumento de escala com o uso dos biorreatores de tanque agitado e de coluna de bolhas (BÜHLER et al., 2013; GMOSER et al., 2018; LOPES; LIGABUE-BRAUN, 2021; SHARMA; GHOSHAL, 2020; VENKATACHALAM et al., 2023). Ambos os biorreatores se destacam por fornecer condições mais adequadas de oxigênio dissolvido, transferência de calor e massa, tempo de mistura, taxa de cisalhamento e a velocidade de agitação (ESPINOSA-ORTIZ et al., 2016; ZHONG, 2010). Esses parâmetros operacionais são os principais influenciadores para o sucesso do processo de produção, visando uma futura aplicação industrial (VENKATACHALAM et al., 2023). Considerando o grande potencial biotecnológico do pigmento melanina, este projeto teve como principais objetivos estabelecer as condições ótimas de cultivo em frasco do mutante MEL1 do fungo Aspergillus nidulans, utilizando subprodutos agroindustriais como substrato para uma maior produção da melanina e também avaliar o cultivo na condição otimizada em escala de bancada, usando os biorreatores de tanque agitado e coluna de bolhas, visando a sua produção em escala industrial para uma futura aplicação biotecnológica desse pigmento. 28 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1. PRODUÇÃO DE PIGMENTO E SUAS APLICAÇÕES BIOTECNOLÓGICAS O uso de pigmentos remonta ao início das civilizações antigas, onde inicialmente a natureza era a única fonte de pigmentos, podendo ser obtidos a partir de plantas, insetos e minerais, que serviam para tingir tecidos, pintar o corpo em cerimônias religiosas e colorir os alimentos. Em 1856, o químico inglês William Henry Perkin descobriu o primeiro pigmento sintético, sintetizado a partir do destilado de alcatrão de hulha, o que desencadeou o florescimento comercial de pigmentos sintéticos. Esses pigmentos sintéticos foram amplamente utilizados nas indústrias com impacto nos setores têxtil, cosmético e farmacêutico. Todavia, sérias preocupações contra os pigmentos sintéticos foram levantadas em 2007, destacando riscos graves a saúde como: toxicidade, oncogenicidade, teratogenicidade e hiperalergenicidade. Com isso, agências reguladoras como a Organização Mundial da Saúde (OMS), a Administração de Alimentos e Medicamentos (FDA) dos Estados Unidos e a Autoridade Europeia de Normas Alimentares (EFSA) recomendaram uma dosagem segura desses pigmentos em alimentos, medicamentos e cosméticos. No entanto, como muitos pigmentos sintéticos têm sido banidos em muitos países, pesquisas tem sido realizadas para substituir os pigmentos sintéticos por aqueles obtidos de fontes naturais, incluindo plantas, animais e micro-organismos (KALRA; CONLAN; GOEL, 2020; LYU et al., 2022; TULI et al., 2015). Entretanto, pigmentos naturais de origem vegetal e animal apresentam algumas desvantagens como: extinção de espécies devido ao seu uso extensivo, produção mais onerosa e dependente da estação do ano, variações na tonalidade e intensidade das cores e questões relacionadas a estabilidade e solubilidade dos pigmentos. Com isso, os micro-organismos destacam-se na produção desses pigmentos por apresentar crescimento fácil e rápido em meio de cultura barato e independentemente das condições climáticas, estabilidade dos pigmentos produzidos, disponibilidade por longos períodos, facilidade no processo de separação e purificação do pigmento (KALRA; CONLAN; GOEL, 2020; KUMAR et al., 2015; LAGASHETTI et al., 2019). 29 Os fungos têm atraído atenção especial para a produção de pigmentos naturais pelo fato desses compostos apresentarem alta estabilidade química, amplo espectro de cores, bem como maior rendimento do produto, com fornecimento sustentável e de baixo custo (KALRA; CONLAN; GOEL, 2020). Esses organismos são capazes de produzir uma gama extraordinária de pigmentos, como: carotenóides, melaninas, flavinas, fenazinas, quinonas, monascinas, violaceína e índigo (Figura 1) (DUFOSSÉ et al., 2014; MERUVU; DOS SANTOS, 2021; RAO; XIAO; LI, 2017; SAJID; AKBAR, 2018; TULI et al., 2015). Figura 1. Diferentes pigmentos produzidos por fungos. Fonte: adaptado de ( KALRA; CONLAN; GOEL, 2020). 30 Os fungos sintetizam os pigmentos durante o metabolismo secundário, que ocorre na fase tardia de crescimento (idiofase), uma vez que não são essenciais para o crescimento das culturas, mas desempenham diversas funções para a sobrevivência do microrganismo na natureza (MUKHERJEE; MISHRA; DESHMUKH, 2017; RUIZ et al., 2010). A produção de pigmento pode ser afetada por fatores nutricionais (concentrações de fontes de carbono, nitrogênio e outros), parâmetros microbiológicos (idade dos esporos, quantidade do inóculo) e condições ambientais (pH, temperatura, aeração) (LYU et al., 2022). Além desses fatores, o rendimento de pigmento produzido depende do sistema de fermentação utilizado. Na fermentação em estado sólido (FES), onde é empregado substratos sólidos para ancoragem micelial, aspectos como umidade do meio, propriedades físicas e estruturais dos substratos, temperatura e pH, devem ser avaliadas para a produção de pigmentos. Por outro lado, a fermentação submersa (FS), que se baseia na cultura líquida para a maioria dos micro-organismos, é altamente influenciada pela velocidade de agitação e aeração, bem como temperatura e pH, sendo mais vantajosa que a FES devido ao menor tempo de cultivo e maior qualidade do produto obtido (LYU et al., 2022; MERUVU; DOS SANTOS, 2021; MUKHERJEE; MISHRA; DESHMUKH, 2017). De acordo com a literatura (Tabela 1), os pigmentos produzidos por fungos apresentam uma ampla utilização em diversas indústrias como: alimentícia, cosmética, têxtil e farmacêutica, uma vez que podem exibir várias atividades biológicas, como antioxidantes, antimicrobiana, anticancerígenas, além de servir como aditivos e intensificadores de cor (AKILANDESWARI; PRADEEP, 2016; MERUVU; DOS SANTOS, 2021; RAO; XIAO; LI, 2017; SAJID; AKBAR, 2018). Isso demonstra que a produção de pigmentos em larga escala por fungos, precisa ser implementada intensivamente com a otimização dos processos fermentativos, a fim de encontrar substitutos para os pigmentos sintéticos e superar os perigos para a saúde humana e ao meio ambiente (RAMESH et al., 2022; SAJID; AKBAR, 2018). 31 Tabela 1. Ocorrência natural de pigmentos fúngicos do solo e sua aplicação sugerida. Fungos Cores Pigmentos Aplicações Referências Aspergillus nidulans Marrom/ Preto Melanina Atividade antioxidante Atividade anti-inflamatória Agente quelante de metal Goncalves et al. (2015); Gonçalves et al.(2013); Gonçalves; Pombeiro- Sponchiado (2005); Rissoni Toledo et al. (2021) Aspergillus niger Preto Aspergillina Atividade Antimicrobiana Ray and Eakin (1975) Aspergillus niger Marrom - Tingimento têxtil Atividade Antibacteriana Atalla et al. (2011); Aishwarya and Aishwarya (2014 Aspergillus sclerotiorum Amarelo Ácido Neoaspergílico Atividade Antibacteriana Micetich and Macdonald (1965); Texeira et al. (2012) Aspergillus versicolor Amarelo Asperversina Atividade Antifúngica Miao et al. (2012) Fusarium oxysporum Rosa/ Violeta Antraquinona Tingimento têxtil Atividade Antibacteriana Gessler et al. (2013) Fusarium verticillioides Amarelo Naftoquinona Atividade Antibacteriana Boonyapranai et al. (2008); Kurobane et al. (1986) Monascus sp. Amarelo Monascina Corante alimentar Juzlova and Martinkova (1996); Mostafa and Abbady (2014); Babitha et al. (2008); Moharram et al. (2012); Babula et al. (2009); Yang et al. (2014) Ancaflavina Farmacêuticos Laranja Monascorubrina Atividade antibacteriana Rubropuntatina Atividade anticancerígena Vermelho Monascorubramina Antioxidante Rubroputamina Penicillium herquei Amarelo Atronenetina Aditivo alimentar Antioxidante Takahashi and Carvalho (2010) Penicillium oxalicum Vermelho Antraquinona Efeito anticancerígeno em alimentos e produtos farmacêuticos Tingimento têxtil Dufosse (2006); Atalla et al. (2011) Penicillium purpurogenum Laranja para amarelo Purpurogenona Tingimento de tecidos de algodão Buchi et al. (1965); King et al. (1970); Martinkova et al. (1995); Mapari et al.(2005); Takahashi and Carvalho (2010); Teixeria et al. (2012); Santos-ebinuma et al. (2013b); Amarelo para Laranja Mitorubrin Alimentos, produtos farmacêuticos e cosméticos Vermelho Mitorubrinol Penicillium sclerotiorum Amarelo para Laranja Pencolide Atividade antibacteriana Brikinshaw et al. (1963); Chidananda and Sattur (2007); Lucas et al. (2007); Lucas et al. (2010) Esclerotiorina Atividade antibacteriana Atividade antifúngica Isocromofilona VI Atividade antibacteriana Trichoderma viride Amarelo Viridina Tingimento têxtil Atividade antifúngica Indústria alimentícia Chitale et al. (2012); Neethu et al. (2012); Gupta et al. (2013) Verde - Marrom - Trichoderma virens Amarelo Viridol Tingimento têxtil Mukherjee and Kenerley (2010); Sharma et al. (2012); Kamala et al. (2015) Virona Atividade antifúngica Fonte: adaptado de (AKILANDESWARI; PRADEEP, 2016). 32 2.2 SÍNTESE E EXTRAÇÃO DA MELANINA PRODUZIDA POR FUNGOS As melaninas são classificadas como um dos pigmentos naturais mais amplamente distribuídos, pois são sintetizados em todos os reinos biológicos, incluindo uma ampla variedade de plantas, animais, fungos, bactérias e protozoários (NOSANCHUK; STARK; CASADEVALL, 2015). No reino fúngico, muitas espécies produzem melanina, que pode estar localizada na parede celular das hifas e/ou esporos ou, podem ocorrer como polímeros extracelulares formados no meio de cultura ao redor das células fúngicas (BELL; WHEELER, 1986). Entretanto, algumas espécies de fungos são constitutivamente melanizadas, enquanto outras melanizam apenas em fases específicas do seu desenvolvimento (esporulação e crescimento micelial), na presença de precursores da via de síntese da melanina e/ou em resposta as condições ambientais. A melanização pode ser vista nestes organismos como uma forma de proteção aos vários estresses físicos e químicos do meio, por exemplo, servindo como proteção contra a radiação ultravioleta, ação de enzimas líticas, dessecamento, extremos de temperatura, toxicidade a metal pesado e drogas antimicrobianas (CHANG; CARY; LEBAR, 2020; CORDERO; CASADEVALL, 2017; POMBEIRO-SPONCHIADO et al., 2017). Melaninas são macromoléculas biológicas formadas pela polimerização oxidativa de compostos fenólicos ou indólicos, geralmente complexados com proteínas e, muitas vezes, também com carboidratos. Como pode ser observado na Figura 2, as melaninas são caracterizadas como moléculas hidrofóbicas e carregadas negativamente, que apresentam propriedades físico-químicas específicas, como insolubilidade em água e solventes orgânicos, resistência a ácidos concentrados, branqueamento quando submetido à ação de oxidantes, que permite diferenciá-las de quaisquer outros pigmentos (BUTLER; DAY, 1998; LANGFELDER et al., 2003; TOLEDO et al., 2017). Com base nessas propriedades químicas, principalmente as suas características de solubilidade, é possível realizar a extração da melanina da parede celular do fungo. O tratamento da biomassa com álcalis quentes (NaOH; KOH ou NH4OH) permite romper a associação da melanina com as proteínas e outros componentes da parede, tornando o pigmento solúvel no meio. Para a recuperação desse pigmento, é adicionado ácidos concentrados ao meio, o que promove a precipitação da melanina. A purificação desse pigmento é realizada por hidrólise ácida e lavagens sucessivas em solventes orgânicos para remoção de algumas proteínas, 33 carboidratos e lipídeos provenientes da parede celular (LEBEAU et al. 2017; PRALEA et al., 2019; SAVA et al., 2001). Figura 2. Modelo para estrutura da eumelanina. Fonte: (SOLANO, 2014). A biossíntese da melanina em fungos envolve várias enzimas, como tirosinase, lacase, policetídeo sintase e catecol oxidase que realizam as oxidações iniciais dos precursores da melanina, dando origem a cinco tipos diferentes: eumelanina, feomelanina, alomelanina e piomelanina (Figura 3) (CORDERO; CASADEVALL, 2017; SINGH et al., 2021). 34 Figura 3. Vias de síntese da melanina em fungos. Fonte: adaptado de (SINGH et al., 2021). As eumelaninas são pigmentos pretos ou marrons, sintetizados a partir de L- DOPA (L-3,4-di-hidroxifenilalanina) ou tirosina pela ação das enzimas tirosinase e lacase, sendo conhecidas como DOPA-melaninas. Alguns fungos são capazes de sintetizar eumelaninas, qual apresenta biocompatibilidade com a melanina presente nos mamíferos, uma vez que, a via de síntese deste tipo de melanina fúngica se assemelha àquela descrita em mamíferos. Já as feomelaninas são pigmentos que variam de tons vermelhos a amarelos, derivadas da via L-DOPA, mas incorporando enxofre durante a sua síntese (EISENMAN; CASADEVALL, 2012; SINGH et al., 2021). As alomelaninas apresentam cores que variam de marrom escuro a totalmente preto e fazem parte de grupo heterogêneo de polímeros que são sintetizados por oxidação ou polimerização do DHN (1,8-dihidroxinaftaleno), dando origem a também conhecida DHN-melaninas. As piomelaninas são pigmentos escuros, capazes de dar suporte aos micro-organismos em condições de estresse ambiental e, são derivados do catabolismo da tirosina, via p-hidroxifenilpiruvato (HPP) formando ácido homogentésico (HGA), o qual sofre posterior auto-oxidação e polimerização. (EOM; 35 WOO; SHIM, 2016; SINGH et al., 2021). Espécies de Aspergillus são capazes de produzir dois tipos de melaninas, DHN (alomelanina) e L-DOPA (eumelanina) (CHANG; CARY; LEBAR, 2020; EISENMAN; CASADEVALL, 2012). Gonçalves, Lisboa e Pombeiro-Sponchiado (2012) demonstraram que a melanina produzida pelo mutante MEL1 do fungo Aspergillus nidulans é a do tipo DOPA-melanina, por apresentar propriedades físico-químicas e perfis espectrofotométrico ultravioleta e infravermelho muito semelhantes ao da DOPA-melanina sintética e também não produzir pigmento na presença do inibidor da biossíntese de DOPA-melanina (tropolone). Apesar das diferenças em suas estruturas químicas, as melaninas fúngicas tem-se destacado pela diversidade de atividades biológicas com inúmeras aplicações biotecnológicas. Gonçalves, Pombeiro-Sponchiado (2005) demonstraram que a melanina produzida pelo mutante MEL1 do fungo Aspergillus nidulans apresentou atividade antioxidante, sendo capaz de neutralizar os radicais gerados pelo ácido hipocloroso (HOCl), apresentando uma magnitude de proteção comparável a melanina sintética. Em outros estudos, o pigmento melanina produzida pelo mutante MEL1 do fungo Aspergillus nidulans exibiu atividade anti-inflamatória, agindo como inibidor da produção de NO e TNF-α em macrófagos estimulados por lipopolissacarídeo (LPS) bacterianos e, além disso, foi verificado que esse pigmento não apresentou efeito citotóxico em cultura de células McCoy, mesmo após metabolização com as enzimas da fração S9 do fígado, e também não exibiu atividade mutagênica para as linhagens de Salmonella thyphimurium usada no teste de Ames (GONCALVES et al., 2015; GONÇALVES et al., 2013). Rissoni Toledo et al. (2021) demonstraram que biomassa altamente pigmentada do mutante MEL1 de A. nidulans exibiu eficiência de 70% na recuperação de cobre em solução durante cinco ciclos de biossorção/dessorção. Esses estudos confirmaram que a melanina produzida por A. nidulans pode ser considerada uma candidata promissora para várias aplicações nas áreas da medicina, ambiental, farmacosmética e nanotecnologia (EL-NAGGAR; SABER, 2022; POMBEIRO-SPONCHIADO et al., 2017; TRAN-LY et al., 2020). 36 2.3 UTILIZAÇÃO DE RESÍDUOS AGROINDUSTRIAIS PARA A PRODUÇÃO DE PIGMENTOS Para uma aplicação prática dos pigmentos fúngicos, incluindo a melanina, torna-se necessário estabelecer rotas mais baratas para a sua produção em larga escala. Uma alternativa é a utilização de meios de cultivo de baixo custo, uma vez que a composição do meio é um fator crítico na determinação de bioprocessos economicamente viáveis (PANESAR et al., 2015). Os resíduos agroindustriais, advindos das indústrias alimentícias e da produção agrícola, incluindo vários materiais à base de plantas (palhas, caules, folhas, cascas, sementes, polpas, bagaço) e também de origem animal (penas e soro de leite), podem ser considerados substratos para o crescimento dos micro-organismos. Esses resíduos possuem uma composição rica em carboidratos, proteínas, lipídios, minerais e vitaminas, porém também apresentam altos valores de demanda biológica de oxigênio e podem causar problemas de diferentes aspectos, incluindo contaminação do meio ambiente, custo de coleta e tratamento do resíduo e perda de matérias-primas valiosas. Com isso, a transformação eficiente desses resíduos tornou-se uma questão ambiental central nos últimos anos e, assim, a biotecnologia microbiana também surgiu com novas possibilidades de utilização massiva dos resíduos agroindustriais no desenvolvimento de produtos de valor agregado (FREITAS et al., 2021; LOPES; LIGABUE-BRAUN, 2021; PANESAR; KAUR; PANESAR, 2015). Processos fermentativos têm utilizado resíduos agroindustriais, para a obtenção de compostos de interesse industrial, incluindo os pigmentos microbianos, o que tem possibilitado reduzir os custos da produção, uma vez que a utilização de substratos e/ou meios de cultura sintéticos costumam ser caros. Outra vantagem da aplicação desses substratos naturais (subprodutos agroindustriais) é atuar como uma potente ferramenta no gerenciamento de resíduos, evitando o seu descarte no meio ambiente (LOPES; LIGABUE-BRAUN, 2021; NIGAM; LUKE, 2016; PANESAR; KAUR; PANESAR, 2015; RAMESH et al., 2022). 37 No processamento do milho são obtidos mais de 1000 tipos de subprodutos, que são amplamente utilizados em indústrias alimentícias e químicas, fermentação, dentre outros. A água de maceração de milho (AMM), o principal subproduto da produção do amido de milho, é considerada uma fonte rica e barata de carbono, nitrogênio, aminoácidos e minerais, tendo ampla perspectiva de aplicação no desenvolvimento de processo biotecnológico (JIAO et al., 2022). A exemplo disso, a AMM tem sido utilizado como uma importante fonte de nutriente para a produção de pigmento (NIGAM; LUKE, 2016). Hamano e Kilikian (2006), em estudos sobre a produção de pigmentos vermelhos por Monascus ruber em meios de cultura contendo AMM, encontraram que em meio contendo 10 g L-1 de glicose, 5 g L-1 de água de maceração de milho e 7,6 g L-1 de glutamato monossódico resultou na maior produção de pigmento vermelho extracelular quando comparado ao meio contendo sais e extrato de levedura. Estudos realizados por Basto et al. (2022) mostraram que a produção de pigmentos por Penicillium brevicompactum em um meio de baixo custo, composto por 34,6 g L-1 de soro de queijo e 8 g L-1 de AMM, foi muito semelhante ao meio sintético sob fermentação submersa com micélio livre e imobilizado. Em estudos anteriores, foi avaliado a utilização de água de maceração de milho para o cultivo do mutante MEL1 do fungo Aspergillus nidulans e, os resultados mostraram que o crescimento do fungo foi favorecido na presença de 2% de água de maceração de milho, enquanto que na concentração de 0,2% houve um aumento na produção de pigmento pela linhagem em estudo (Pretti, 2009). Nas indústrias sucro-alcooleiras, o melaço de cana de açúcar é um subproduto obtido durante o processo de extração da sacarose, numa proporção de 35 a 45 kg por 1 tonelada de cana processada, sendo produzidos cerca de 20 milhões de toneladas de melaço anualmente (JAMIR et al., 2021). O melaço de cana-de- açúcar tem sido utilizado como um fonte de carbono em processos fermentativos, uma vez que contém aproximadamente 34% de sacarose, 11% de açúcares redutores (glicose e frutose) e vários minerais (SINDHU et al., 2016). Anjos (2013) obtiveram um aumento de 42% na produção de astaxantina por Mucor circinelloides quando a concentração de 4% (v/v) de melaço foi aplicado no meio de cultivo na presença de luz (LED) azul. Cheng e Yang (2016) encontraram que um maior crescimento celular e a síntese de carotenóides por Rhodotorula mucilaginosa ocorreu quando melaço estava presente no meio de cultivo como fonte de carbono em comparação ao meio 38 controle contendo glicose. Estudos realizados por Da Silva, Ienczak e Moritz (2021), usando subprodutos agroindustriais para produção de biopigmento vermelho por Monascus ruber, observaram uma alta produtividade desse pigmento quando a mistura de farinha de arroz e melaço (ambos na concentração 10 g L-1) foi aplicada como meio de cultivo. A vinhaça também é um subproduto das indústrias sucro-alcooleiras obtido após a destilação fracionada do caldo fermentado da cana-de-açúcar para a produção de etanol, sendo gerados cerca de 10 a 15 L de vinhaça para cada litro de etanol produzido. Isso mostra que a vinhaça pode ser usada como substrato em processos fermentativos para a obtenção de vários compostos, incluindo pigmentos, pois apresenta uma composição rica em nitrogênio, carbono, sulfato, potássio, fósforo, magnésio, alguns metais (zinco, cobre, bário) e fenóis (CHRISTOFOLETTI et al., 2013; DEL GOBBO; COLIN, 2018; ESPAÑA-GAMBOA et al., 2011; HOARAU et al., 2018; KAHRAMAN; YEILADA, 2001; PINHEIRO et al., 2020; SINDHU et al., 2016). Dorla et al. (2013) demonstraram que a produção de β-caroteno por Phycomyces blakesleanus aumentou em 95% quando o fungo foi cultivado em vinhaça na presença de luz. Com base nos estudos reportados na literatura, os subprodutos agroindustriais podem ser utilizados como substrato para a obtenção de diversos produtos, incluindo os pigmentos microbianos, solucionando tanto as preocupações econômicas quanto as ambientais. No entanto, ainda são necessários mais estudos sobre a otimização dos processos em escala industrial. 39 2.4 PRODUÇÃO DE PIGMENTOS EM BIORREATORES Para o escalonamento da produção microbiana de pigmentos, como a melanina, a escolha do tipo de biorreator e a determinação de alguns parâmetros, são importantes para uma eficiente produção em larga escala. Vários tipos de biorreatores vem sendo explorados e desenvolvidos junto com os avanços na compreensão dos sistemas biológicos, pois diversos fatores podem afetar um determinado bioprocesso como: agitação, transferência de oxigênio, mistura, cisalhamento e estabilidade operacional (SPIER et al., 2011; ZHONG, 2010). Com isso, diferentes configurações de biorreatores têm sido utilizados para o cultivo de fungos, são eles: reator de tanque agitado, reator de coluna de bolhas, airlift e leito fluidizado, pois estes reatores são capazes de fornecer adequada transferência de oxigênio, pouco estresse de cisalhamento e uma boa homogeneização do meio (ESPINOSA-ORTIZ et al., 2016; ZHONG, 2010). Para a produção de pigmentos em fermentação submersa, alguns estudos descrevem o uso dos biorreatores de tanque agitado e de coluna de bolhas (LOPES; LIGABUE-BRAUN, 2021; WANG et al., 2021). O tipo mais comum de biorreator para cultivo submerso é o de agitação mecânica e/ou de tanque agitado. Biorreatores de tanque agitado têm o meio de cultivo agitado mecanicamente por um motor elétrico, que gera uma boa homogeneização, suspensão de sólidos, dispersão gás-líquido, aeração e a transferência de calor e massa. As desvantagens desse tipo de biorreator são o estresse gerado pela agitação, impraticável para certos microrganismos, e a alta demanda de energia elétrica em altas agitações. Entretanto, esse tipo de biorreator é o mais utilizado em estudos laboratoriais de escalonamento (ZHONG, 2010). Investigações realizadas por Sharma e Ghoshal (2020) demonstraram que houve um aumento de aproximadamente 100 µg/g na produção de carotenoides por Rhodotorula mucilaginosa em reator de tanque agitado quando comparado a produção em frascos. Estudos realizados por Venkatachalam et al., (2023) demonstraram que a utilização do reator de tanque agitado aumentou a produção de pigmento laranja e vermelho por Talaromyces albobiverticillius quando comparado ao cultivo em frascos. 40 Outro reator utilizado para a produção de pigmento é o de colunas de bolhas, os quais são reatores pneumáticos, que foram desenvolvidos para cultura de células sensíveis, como células de fungos filamentosos, pois a intensa agitação (dependendo do tipo de reator e geometria) afeta o grau de compactação e formação dos pellets, afetando a obtenção dos produtos de interesse. No entanto, em reatores pneumáticos a agitação do sistema ocorre através do gás que é aspergido na forma de bolhas em uma fase líquida ou em uma suspensão líquido-sólido (ESPINOSA-ORTIZ et al., 2016; SPIER et al., 2011). Este tipo de reator apresenta excelentes características como, alta taxa de transferência de calor e massa, alta homogeneização, baixo atrito (ou seja, menos estresse ao micro-organismo cultivado), baixos custos operacionais e maior produtividade volumétrica comparado ao de leito fixo e tanques agitados. (ESPINOSA-ORTIZ et al., 2016; ZHONG, 2010). Estudo realizados por Nanou, Roukas e Papadakis (2012), demonstraram que o reator de coluna de bolhas mostrou ser um sistema de fermentação adequado para a produção de carotenos por Blakeslea trispora a partir de meio sintético. Gmoser et al. (2018), obtiveram uma maior pigmentação de Neurospora intermedia em um reator de coluna de bolhas, quando comparado ao cultivo em frasco. Esses estudos são importantes pois mostram que é possível aumentar a escala de produção de pigmentos microbianos, visando uma futura aplicação industrial. Para isso, a otimização das condições de fermentação, como temperatura, pH, aeração, agitação e componentes do meio, é necessária para maximizar a produção de pigmento associada a uma redução dos custos do bioprocesso (LOPES; LIGABUE-BRAUN, 2021). 41 3. OBJETIVO O presente estudo teve como principal objetivo estabelecer as condições ótimas de cultivo do mutante MEL1 do fungo A. nidulans para uma maior produção de melanina, usando subprodutos agroindustriais como componentes do meio de cultura, visando uma futura aplicação do processo em escala industrial. Para alcançar este propósito, este projeto teve como objetivos específicos: • Avaliar o efeito dos subprodutos (vinhaça, melaço e água de maceração de milho) na produção de melanina pelo mutante MEL1 em frascos, por meio de planejamentos estatísticos (fatorial fracionado) e, otimizar o meio de cultura para a maior produção de melanina por meio de planejamentos estatísticos (delineamento composto central rotacional); • Avaliar os parâmetros fermentativos (rendimentos e produtividades) na condição otimizada; • Avaliar a produção de melanina nos biorreatores tanque agitado e coluna de bolhas, com a composição do meio de cultivo otimizado em frascos, visando o aumento da produção de melanina em escala de banca; • Avaliar a influência dos parâmetros operacionais, velocidade de agitação e vazão de ar, na produção de melanina nos reatores. 42 4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1 Fungo Para o desenvolvimento deste trabalho foi utilizado o mutante MEL1 do fungo filamentoso Aspergillus nidulans (Figura 4), o qual apresenta auxotrofia para inositol (inoB1) e produção aumentada do pigmento DOPA-melanina (melC1) (GONÇALVES; LISBOA; POMBEIRO-SPONCHIADO 2012). Esse microrganismo está estocado no laboratório de Fungos Filamentosos do Departamento de Bioquímica e Química Orgânica do Instituto de Química de Araraquara (UNESP). Figura 4. Morfologia do mutante MEL1 do fungo A. nidulans em meio mínimo suplementado com glicose (1% m/v), nitrato de sódio (0,60% m/v), inositol (20 ppm) e com AMM (1% v/v). Fonte: Acervo da Autora. 4.2 Vinhaça, Água de maceração de milho e Melaço A vinhaça e o melaço utilizados nos experimentos foram coletados na Usina de Açúcar e Álcool São Martinho localizada em Pradópolis/São Paulo. A água de maceração de milho (AMM) foi cedida pela indústria Corn Products Brazil-Ingredientes Industriais LTDA, localizada na cidade de Balsa Nova/Paraná. Previamente a cada experimento, estes subprodutos agroindustriais foram filtrados em papel Whatman nº1 para a remoção de sólidos e esterilizados em autoclave a 121ºC por 20 min. A composição química da vinhaça, melaço e água de maceração de milho está apresentada na Tabela 2. Esses subprodutos foram 43 caracterizados em termos de carbono e nitrogênio em analisador TOC – LCPN SHIMADZU®. Tabela 2. Composição química do melaço e vinhaça de cana-de-açúcar, e água de maceração de milho. Vinhaça (mg L-1) Melaço (mg L-1) Água de Maceração de Milho (mg L-1) Carbono total 8295(c) 306189,9(c) 28658,7(c) Nitrogênio total 288,2(c) 5409,9(c) 4250,7(c) Ca 719(a) 769,5 (b) 239,8 (b) Na 50,2(a) 435,3 (b) 206,2 (b) K 2056(a) 1803,2 (b) 2753,9 (b) P 190(a) 0,78 (b) 1,5 (b) Mg 237(a) 246,2 (b) 723,8 (b) Mn - 17,5 (b) 55,3 (b) Zn 1,66(a) 0,82 (b) 10,7 (b) Cu 0,35(a) 0,43 (b) 1,1 (b) Fe - 12,7 (b) 15,6 (b) Fenóis 671,36 (c) - - (a)CHRISTOFOLETTI et al., (2013); (b) VALDUGA et al., (2007); (c) Fonte do Autor. 44 4.3 Obtenção dos esporos Para o crescimento das linhagens foi utilizado o meio mínimo descrito por Cove (1966), com a seguinte composição: 10 mL de solução de sais (descrita abaixo), 1 mL de solução de elementos traços (descrita abaixo) e o volume foi completado até 1000 mL com água destilada. • Solução de sais (Cove, 1966): Fosfato de potássio monobásico.............................................................................14 g Fosfato de potássio bibásico................................................................................6,86 g Cloreto de potássio.................................................................................................1,0 g Sulfato de magnésio...............................................................................................1,0 g Água destilada até completar 100 mL • A solução de elementos traços (Cove, 1966): Borato de sódio decahidratado.............................................................................40 mg Sulfato de cobre pentahidratado........................................................................400 mg Sulfato de ferro heptahidratado..........................................................................532 mg Sulfato de manganês monohidratado.................................................................292 mg Molibdato de sódio bihidratado...........................................................................800 mg Sulfato de zinco heptahidratado.............................................................................8 mg Água destilada até completar 100 mL. Para a preparação do meio mínimo sólido foi adicionado 1,5% de ágar. Após esterilização do meio de cultivo por autoclavagem a 121,1°C por 20 minutos, foi adicionado de maneira asséptica glicose (1% m/v), nitrato de sódio (0,60% m/v), inositol (20 ppm) e água de maceração de milho 1% (v/v). Após crescimento do fungo por 5 dias a 37ºC, os conídios foram coletados em solução salina (0,85%), filtrados em lã de vidro e o seu número foi estimado por contagem em Câmara de Neubauer. Para a padronização do inoculo foi utilizado nos ensaios 106 esporos mL-1. 45 4.4 Cultivo do fungo em frascos De acordo com os estudos realizados anteriormente (SOUSA, 2017), para a obtenção de uma maior pigmentação da biomassa do mutante MEL1, o cultivo foi realizado em duas etapas: • Pré-cultura: com o objetivo de estimular o crescimento do fungo, o cultivo foi feito em frascos Erlenmeyer de 500 mL, contendo 200 mL de meio mínimo descrito por Cove (1966), suplementado com glicose (1% m/v), nitrato de sódio (0,60% m/v), inositol (20 ppm) e com AMM (1% v/v), inoculados com 106 esporos. mL-1 e mantidos a 29ºC por 48 h sob agitação constante de 225 rpm. • Cultura: para promover a maior pigmentação da biomassa, foi realizada a transferência da massa micelial (10% v/v), obtida na etapa da pré-cultura, para frascos Erlenmeyer de 500 mL, contendo 200 mL de meio mínimo descrito por Cove (1966), porém, suplementado com glicose, nitrato de sódio, inositol (20 ppm), AMM, melaço e vinhaça em diferentes concentrações, de acordo com o apresentado nos planejamentos experimentais. Em seguida os frascos foram incubados a 29ºC por 72 h, sob agitação constante de 225 rpm. Ao final desse período de cultivo, a biomassa obtida foi separada do caldo de cultivo por filtração a vácuo e seca em estufa a 55ºC até peso constante. A biomassa seca foi triturada e selecionada com um tamanho de partícula entre 0,21 a 0,42 mm, usando um conjunto de peneiras TYLER (MESH 65 e 35), para a posterior extração do pigmento. 46 4.5 Otimização das condições de cultivo do mutante MEL1 em frascos Com o intuito de avaliar a influência da glicose, nitrato de sódio, AMM, melaço e vinhaça (variáveis independentes) sobre a produção de pigmento (variável dependente), foi elaborado um planejamento fatorial fracionado 25-1, com 3 repetições no ponto central totalizando 19 ensaios. As concentrações dos subprodutos escolhidas para este planejamento foram determinadas a partir de estudos anteriores (PRETTI, 2009; SOUSA, 2017). A partir dos resultados da análise estatística do planejamento fatorial fracionado (25-1) visando a produção de pigmento, foi elaborado um delineamento composto central rotacional (DCCR) 23, com três repetições no ponto central, totalizando 17 ensaios. Nas Tabelas 3 e 4 encontram-se os níveis codificados usados nos planejamentos de experimentos fracionado (25-1) e DCCR (23). As condições de cultivo foram otimizadas para a etapa de cultura do fungo mutante MEL1, com o objetivo de promover a maior pigmentação da biomassa. Os resultados obtidos nos planejamentos experimentais foram submetidos a análise de variância (ANOVA), pelo programa computacional Statistica v10.0 onde foi possível avaliar os efeitos dos fatores estudados na produção de pigmento pelo mutante MEL1. Tabela 3. Concentrações das variáveis independentes em diferentes níveis para o planejamento fracionado 25-1. Variáveis Níveis -1 0 +1 X1 AMM (% v/v) 0 0,50 1,00 X2 Melaço (% v/v) 0 1,00 2,00 X3 Vinhaça (% v/v) 0 0,50 1,00 X4 Nitrato de sódio (% m/v) 0 0,30 0,60 X5 Glicose (% m/v) 0 0,50 1,00 47 Tabela 4. Concentrações das variáveis independentes em diferentes níveis para o delineamento composto central rotacional (DCCR). Variáveis Níveis -1,68 -1 0 +1 1,68 X1 Melaço (% v/v) 0,01 1,00 2,45 3,90 4,89 X2 Vinhaça (% v/v) 0,01 0,50 1,23 1,95 2,44 X3 Glicose (% m/v) 0,01 0,50 1,23 1,95 2,44 4.6 Cultivo do fungo em biorreatores de bancada Para a realização destes ensaios foram utilizados dois reatores de bancada: tanque agitado e o de coluna de bolhas (Figuras 5 e 6). As dimensões dos reatores são: • Reator de tanque agitado (Figura 5): apresenta uma altura de vaso de 224 mm, diâmetro de 176 mm e volume total de 5 L. Um impelidor naval (Figura 5) foi utilizado nos ensaios, o qual apresenta altura da haste de 785 mm, diâmetro da haste de 10 mm, diâmetro total da hélice de 123 mm e a medida de cada hélice de 70 mm. O volume de trabalho 1,5 L foi utilizado nos ensaios. Figura 5. Cultivo do mutante MEL1 (etapa da cultura) em reator de tanque agitado com impelidor náutico. Fonte: Acervo da autora. 48 • Reator de coluna de bolhas (Figura 6): apresenta uma altura de vaso de 540 mm, diâmetro de 107 mm, encamisamento térmico ao longo da coluna de bolhas e volume total de 2 L. na base da coluna foi acoplado um difusor de ar, que apresenta 67 mm de diâmetro e a saída de ar é de 1 mm de diâmetro. O volume de trabalho 1,5 L foi utilizado nos ensaios. Figura 6. Cultivo do mutante MEL1 (etapa de cultura) em reator de coluna de bolhas com difusor circular de ar. Fonte: Acervo da autora. O cultivo do mutante MEL1 nos biorreatores de bancada foi realizado em duas etapas, como mencionado no item 4.4: • Pré-cultura: com o objetivo de estimular o crescimento do fungo, o cultivo foi feito em frascos Erlenmeyer de 500 mL, contendo 200 mL de meio mínimo descrito por Cove (1966), suplementado com glicose (1% m/v), nitrato de sódio (0,60% m/v), inositol (20 ppm) e com AMM (1% v/v), inoculados com 106 esporos mL-1 e mantidos a 29ºC por 48 h sob agitação constante de 225 rpm. • Cultura: foi realizada a transferência da massa micelial (10% v/v), obtida na etapa da pré-cultura, para os reatores de tanque agitado e o de coluna de bolhas, os quais apresentaram volume de trabalho de 1,5 L, suplementado de acordo com a condição otimizada obtida nos planejamentos. Em seguida os reatores foram incubados a 29ºC conforme descrito na Tabela 5. 49 Tabela 5. Condições operacionais dos biorreatores de tanque agitado e coluna de bolhas. Tipos de biorreatores Ensaios Vazão de Ar (L min-1) Vazão volumétrica específica (vvm)* Agitação (rpm) Tempo (horas) Tanque agitado 1 - - 150 72 2 - - 150 96 3 - - 200 72 4 - - 200 96 5 0,8 0,53 200 96 Coluna de bolhas 1 1,5 1 - 72 2 1,5 1 - 96 *(volumear/volumemeio/minuto). Ao final da etapa de cultura, a biomassa obtida foi separada do caldo de cultivo por filtração a vácuo e seca em estufa a 55ºC até peso constante. A biomassa seca foi triturada e selecionada um tamanho de partícula entre 0,21 a 0,42 mm, usando um conjunto de peneiras TYLER (MESH 65 e 35), para a posterior extração do pigmento. 4.7 Extração do pigmento Para a extração do pigmento presente na massa micelial foi feita seguindo o método adaptado de Sava et al. (2001), onde a biomassa obtida nos ensaios foi submetida a adição de hidróxido de sódio (NaOH) 1mol L-1 na proporção 1:30 (m/v), seguido de autoclavagem a 121ºC por 10 minutos e centrifugação a 1935 xg por 20 min a 20°C. Este procedimento foi repetido até a completa descoloração da massa micelial. Com o sobrenadante, resultante do processo de centrifugação, o qual contém o pigmento, foi acidificado com ácido clorídrico concentrado (HCl) até pH 2, deixado em repouso por 5 dias. Após este processo, foi feita a lavagem do sedimento com água destilada, seguido de centrifugação por 20 minutos a 48384 xg a 10°C. Este procedimento foi repetido por cinco vezes. O pigmento obtido foi seco em estufa a 55- 60ºC, pesado e a quantidade de pigmento obtido foi expresso em mg g-1 de biomassa. 50 4.8 Purificação da melanina A purificação do pigmento foi realizada conforme método adaptado de Sava et al. (2001), onde o pigmento extraído foi hidrolisado com ácido clorídrico (HCl) 7mol L-1 a 100ºC por 2 horas e submetido a centrifugação a 12096 xg por 15 minutos a 10°C. O sedimento foi lavado com água destilada e solventes orgânicos (clorofórmio, acetato de etila e etanol) seguido de centrifugação a 1935 xg por 15 min a 20°C. O sedimento foi seco a temperatura ambiente e dissolvido em hidróxido de sódio (NaOH) 1 mol L-1, precipitado com ácido clorídrico (HCl) 3mol L-1 e centrifugado a 12096 xg por 15 minutos a 10°C. Após estes procedimentos, a melanina purificada foi lavada com água destilada, seca em estufa a 55-60ºC, pesada e a quantidade de pigmento obtido foi expresso em mg g-1 de biomassa. 4.9 Quantificação da melanina A quantificação da melanina, foi feita conforme o descrito por Bull (1970). As amostras foram preparadas na concentração de 1 mg de pigmento por mL de NaOH 0,5 mol L-1, a leitura foi realizada em um espectrofotômetro com o comprimento de onda de 540 nm. A quantidade de melanina em μg foi determinada a partir do coeficiente de absortividade obtido da curva analítica da DOPA-melanina sintética (Figura 7). A quantidade total de melanina foi expressa em mg g-1 de biomassa. Figura 7. Curva de referência de DOPA-melanina sintética. Fonte: (SOUSA, 2017). 51 4.10 Determinação da atividade enzimática tirosinase e lacase pelo mutante MEL 1 4.10.1 Preparação do extrato enzimático livre de células Para a preparação do extrato enzimático livre de células foi realizado o cultivo do fungo em frascos, nas condições antes e após a otimização do meio de cultivo e com 72h de cultivo. Em seguida, a biomassa foi separada do caldo de cultivo por filtração a vácuo, triturada no almofariz utilizando nitrogênio líquido e solubilizada em tampão de extração (Tris-HCl 50 mmol L-1; EDTA 1 mmol L-1, PMFS 1 mmol L-1) na proporção de 0,5:2 (m/v), agitado por 1 minuto no vórtex e centrifugado a 8626 xg por 10 minutos (BRIDGE; KOKUBUN; SIMMONDS, 2004). O precipitado contendo os detritos celulares foi descartado e o sobrenadante (extrato enzimático) foi utilizado para os ensaios das atividades de tirosinase e lacase. 4.10.2 Atividade da tirosinase Para a determinação da atividade de tirosinase foi feita seguindo o método adaptado de Amaral e Ribeiro (2013). O meio reacional apresentou 1,5mL de tampão fosfato de sódio (0,1 mol L-1) pH 6,5 com L-tirosina (1mmol L-1) e 1,5mL de extrato enzimático. A atividade da tirosinase foi avaliada pela formação o-quinona em função da variação da absorbância em 280 nm na porção linear da curva durante o período de 10 a 12 minutos, 25°C e pH 6,5. A atividade de tirosinase (U) foi determinada através da equação 1. 𝑈. 𝑚𝐿−1 = Δ𝐴280 min ∗ 1000 𝑉𝑒 Onde: ΔA280: variação da absorbância em um aumento linear por minuto; Ve: volume de extrato enzimático utilizado (1,5 mL). (1) 52 4.10.3 Atividade da lacase Para determinação da atividade da lacase foi feita seguindo o método adaptado descrito por Szklarz et al. (1989). O meio reacional foi composto por 0,3 mL de extrato enzimático, 1,3 mL de tampão citrato-fosfato (0,05 mol L-1) pH 5,0 e 0,4 mL de solução contendo siringaldazina. A solução de siringaldazina foi preparada adicionando 0,05 g de siringaldazina em 50 mL de etanol. Como controle negativo foi utilizado extrato enzimático fervido por 5 minutos a 100°C. A atividade da lacase foi avaliada pela oxidação da siringaldazina, a qual foi determinada pelo monitoramento do aumento da absorbância a 525 nm após 10 minutos de reação a 30°C. A atividade enzimática (U) foi definida como a quantidade de enzima necessária para oxidar 1 μmol de siringaldazina min-1, usando o coeficiente de extinção molar (Ɛ) igual a 6,5 x 104 M-1cm-1 (SZKLARZ et al., 1989). 4.11 Determinação do teor de glicose A determinação do teor de glicose foi realizada por Cromatografia Liquida de Alta Eficiência (CLAE) SHIMADZU®. As amostras analisadas foram previamente filtradas em filtro SepPak C18. Para a análise de glicose foi utilizada a coluna analítica BIO-RAD AMINEX HPX-87H (300 x 7,8 mm). O método utilizado manteve a velocidade de fluxo de 0,6 mL min-1, temperatura de 60°C, com volume de injeção fixo de 20 µL e, além disso, a fase móvel utilizada foi composta por H2SO4 0,01mol L-1. 53 4.12 Determinação dos parâmetros cinéticos de pigmentação 4.12.1 Velocidades instantâneas de transformação As velocidades instantâneas de crescimento (rx), consumo de glicose (rs) e formação de melanina (rp), foram determinados pelas respectivas equações: 𝑟𝑥 = 𝑑𝑋 𝑑𝑡 𝑟𝑠 = − 𝑑𝑆 𝑑𝑡 𝑟𝑝 = 𝑑𝑃 𝑑𝑡 4.12.2 Fatores de conversão A determinação dos fatores de conversão (ou rendimentos) foi obtida correlacionando-se a massa de biomassa produzida (X), com a massa de glicose consumida (S) e a massa de melanina produzido (P), em gramas, em um determinado tempo de cultivo, conforme as equações: 𝑌𝑥/𝑠 = 𝑋 − 𝑋0 𝑆0 − 𝑆 Onde: YX/S: fator de conversão de glicose em biomassa (g/g); X: concentração final de biomassa (g/L); X0: concentração inicial de biomassa (g/L); S0: concentração inicial de glicose (g/L); S: concentração final de glicose (g/L). (2) (3) (4) (5) 54 𝑌𝑝/𝑠 = 𝑃 − 𝑃0 𝑆0 − 𝑆 Onde: YP/S: fator de conversão de glicose em melanina não purificada (g/g); P: quantidade de melanina não purificada final (g); P0: quantidade de melanina não purificada inicial (g); S0: concentração inicial de glicose (g); S: concentração final de glicose (g). 4.12.3 Velocidades específicas de transformação As velocidades específicas de crescimento (µx), consumo de glicose (µs) e formação de melanina (µp), foram determinação respectivamente conforme as equações (GADEN, 1955): µ𝑥 = 1 𝑋 . 𝑑𝑋 𝑑𝑡 µ𝑠 = 1 𝑋 (− 𝑑𝑆 𝑑𝑡 ) µ𝑝 = 1 𝑋 . 𝑑𝑃 𝑑𝑡 (6) (7) (8) (9) 55 4.12.4 Modelo cinético de Monod O modelo cinético de Monod foi utilizado neste trabalho, conforme descrito pela equação: µ𝑥 = µ𝑚 𝑆 𝐾𝑠 + 𝑆 Onde: μx: velocidade máxima específica de crescimento (h-1); µm: máxima velocidade específica de crescimento (h-1); Ks: constante de saturação; S: Concentração de glicose (g/L). 4.12.5 Produtividade de pigmento (QP) A produtividade de melanina, a qual expressa a produção de pigmento produzido (g g-1 de biomassa) por tempo (h), foi calculada de acordo com equação 12. 𝑄𝑝 = 𝑃𝑚 − 𝑃𝑜 𝑡𝑓𝑝 Onde: Qp: produtividade de pigmento (mg/g/h); Pm: concentração máxima de pigmento (mg/g); Po: concentração inicial de pigmento (mg/g); Tfp: tempo final da fermentação (h). (11) (10) 56 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1 Efeito da glicose, nitrato de sódio, melaço, vinhaça e AMM na produção de melanina pelo mutante MEL1. Com o intuito de avaliar a influência da glicose, nitrato de sódio e dos subprodutos agroindustriais, AMM, melaço e vinhaça, sobre a produção de melanina, primeiramente foi realizado um planejamento fatorial fracionado 25-1 (Tabela 6 - com valores codificados e reais). Esta estratégia foi aplicada somente na etapa de cultura do mutante MEL1 do fungo A. nidulans, a qual corresponde a etapa de maior pigmentação. 57 Tabela 6. Matriz dos ensaios do planejamento fatorial fracionado 25-1 para a produção de biomassa e melanina pelo mutante MEL1. Os valores reais estão entre parênteses. Ensaios AMM (v/v) Melaço (v/v) Vinhaça (v/v) Nitrato de Sódio (m/v) Glicose (m/v) Melanina não purificada (mg g-1 de biomassa) Biomassa (g L-1) 1 -1 (0%) -1 (0%) -1 (0%) -1 (0%) 1 (1%) 173,26 2,66 2 1 (1%) -1 (0%) -1 (0%) -1 (0%) -1 (0%) 22,86 1,75 3 -1 (0%) 1 (2%) -1 (0%) -1 (0%) -1 (0%) 133,33 4,20 4 1 (1%) 1 (2%) -1 (0%) -1 (0%) 1 (1%) 151,04 7,68 5 -1 (0%) -1 (0%) 1 (1%) -1 (0%) -1 (0%) 32,97 0,91 6 1 (1%) -1 (0%) 1 (1%) -1 (0%) 1 (1%) 46,46 4,95 7 -1 (0%) 1 (2%) 1 (1%) -1 (0%) 1 (1%) 192,64 4,08 8 1 (1%) 1 (2%) 1 (1%) -1 (0%) -1 (0%) 74,98 6,94 9 -1 (0%) -1 (0%) -1 (0%) 1 (0,6%) -1 (0%) 25,97 0,77 10 1 (1%) -1 (0%) -1 (0%) 1 (0,6%) 1 (1%) 53,43 4,96 11 -1 (0%) 1 (2%) -1 (0%) 1 (0,6%) 1 (1%) 158,21 6,61 12 1 (1%) 1 (2%) -1 (0%) 1 (0,6%) -1 (0%) 57,08 6,92 13 -1 (0%) -1 (0%) 1 (1%) 1 (0,6%) 1 (1%) 181,22 3,04 14 1 (1%) -1 (0%) 1 (1%) 1 (0,6%) -1 (0%) 12,23 1,64 15 -1 (0%) 1 (2%) 1 (1%) 1 (0,6%) -1 (0%) 174,39 4,53 16 1 (1%) 1 (2%) 1 (1%) 1 (0,6%) 1 (1%) 99,75 7,97 17 0 (0,5%) 0 (1%) 0 (0,5%) 0 (0,3%) 0 (0,5%) 96,52 4,46 18 0 (0,5%) 0 (1%) 0 (0,5%) 0 (0,3%) 0 (0,5%) 94,90 4,90 19 0 (0,5%) 0 (1%) 0 (0,5%) 0 (0,3%) 0 (0,5%) 90,52 4,64 58 De acordo com os resultados apresentados na Tabela 6, a suplementação do meio de cultivo com os subprodutos agroindustriais e soluções quimicamente conhecidas, como glicose e nitrato de sódio, influenciaram a produção de melanina pelo mutante MEL1, pois houve uma grande variação na quantidade de melanina não purificada produzida, variando de 12,23 a 192,64 mg g-1 de biomassa (Ensaios 14 e 7, respectivamente - Tabela 6). Essa variação na produção de melanina, segundo Papagianni (2004), pode estar relacionada com os parâmetros do processo de cultivo que podem afetar a produtividade dos fungos, são eles: inoculo, composição do meio de cultivo, tipo e concentração das fontes de carbono, nitrogênio e fosfato, metais e outros íons, tensão de oxigênio dissolvido, tensão de dióxido de carbono dissolvido, pH do meio de cultura, temperatura e forças mecânicas. Além disso, o estudo destaca que a composição do meio de cultivo, usados nas fermentações industriais submersas, deve favorecer o crescimento e a formação do produto com altos rendimentos, mas para isso os fungos requerem água, uma fonte de carbono e de energia, uma fonte de nitrogênio e vários outros elementos. Com os resultados apresentados nos ensaios 1 e 9 (Tabela 6), houve uma grande variação nos resultados sobre a produção de melanina não purificada, sendo que os valores obtidos foram de 173,26 mg g-1 de biomassa na presença somente de glicose (Ensaio 1) e de 25,97 mg g-1 de biomassa na presença somente de nitrato de sódio (Ensaio 9). Além disso, para o ensaio 9, o qual apresenta somente nitrato de sódio em sua composição, houve uma redução na produção de melanina não purificada de 147,29 mg g-1 de biomassa, valor este equivalente a 6,67 vezes menor quando comparado com a produção de melanina não purificada em meio contento somente glicose em sua composição (Ensaio 1). Esses resultados indicam que as fontes de carbono e nitrogênio influenciam a produção de melanina. Estudos realizados por Sun et al., (2016), o qual a avaliou o efeito de nutrientes em meio de cultivo para a produção de melanina em Auricularia auricula, relatou que a presença de fontes de carbono no meio de cultivo, afeta tanto o crescimento micelial quanto a síntese de melanina, pois o carbono não é somente utilizado para as necessidades energéticas de manutenção das atividades celulares, como também para a biossíntese de melanina em Auricularia auricula. Por outro lado, a menor produção de melanina obtida na presença de fontes de nitrogênio também foram reportadas por Jiang et al. (2016), os quais reportaram um aumento na produção de melanina pela 59 linhagem da levedura XJ5‑1 de Aureobasidium melanogenum na ausência de fontes de nitrogênio, tanto nas culturas em placas como em meio líquido. Estudos apresentados por Gmoser et al. (2017), sobre os fatores que influenciam na produção de pigmento por fungos filamentosos, sugerem que a limitação de nitrogênio em meios de cultivo pode aumentar a concentração de pigmentos totais na maioria das cepas de fungos filamentosos, uma vez que, a limitação de nitrogênio pode influenciar na taxa de metabolismo de aminoácidos. Com isso, Sanchez et al. (2013), em revisão sobre a produção de microbiana de carotenoides, sugere que com uma síntese lenta de proteínas e o crescimento lento do micro-organismo, causados pela limitação de nitrogênio, é capaz e favorecer a carotenogênese. Assim, estes estudos vão ao encontro dos resultados obtidos no ensaio 1 (Tabela 6), onde a ausência de nitrogênio e a presença de fonte de carbono, como a glicose, durante a etapa da cultura, favoreceu a produção de melanina pelo mutante MEL1 do Aspergillus nidulans. Com o resultado apresentado no ensaio 7 (Tabela 6), o qual apresenta melaço, vinhaça e glicose em sua composição, houve uma maior produção de melanina não purificada com 192,64 mg g-1 de biomassa, onde a adição de melaço, vinhaça e glicose ao meio de cultivo favoreceu a maior produção de melanina. Com isso, esses resultados vão ao encontro ao apresentado na literatura, pois estudos tem demonstrado que os micro-organismos apresentam uma preferência pelas fontes de carbono para obter energia para o crescimento e a formação do produto (THAIRA et al., 2019). Entretanto, esse aumento na produção de melanina não purificada, apresentado no ensaio 7 (Tabela 6) pode também estar relacionado com a ausência de fontes de nitrogênio, como o nitrato de sódio e AMM, uma vez que, estudos tem demonstrado que a limitação de nitrogênio pode favorecer a produção de pigmentos em fungos filamentosos (GMOSER et al., 2017; SANCHEZ et al., 2013). Além disso, a presença de melaço e vinhaça, no ensaio 7 (Tabela 5), pode ser visto como uma suplementação do meio de cultivo, pois em comparação com o ensaio 1 (Tabela 6), onde há apenas glicose em meio de cultivo, houve um aumento na produção de melanina não purificada de 19,68 mg g-1 de biomassa, valor este equivalente a 1,11 vezes maior apenas com a adição de melaço e vinhaça. Com isso, Panesar, Kaur e Panesar (2015) afirmam que os meios sintéticos que apresentam uma suplementação com resíduos agroind