RESSALVA Atendendo solicitação do autor, o texto completo desta Dissertação será disponibilizado somente a partir de 22/11/2020. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA "JULIO DE MESQUITA FILHO" FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS CÂMPUS DE ARARAQUARA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA DE BIOMATERIAIS E BIOPROCESSOS MESTRADO PROFISSIONAL ESTUDO DA ESTERILIZAÇÃO DE SCAFFOLDS PARA REGENERAÇÃO DO TECIDO ÓSSEO ERIC MARK FRANCISCO ORIENTADOR: Prof. Dr. Antonio Carlos Guastaldi ARARAQUARA – SP 2019 1 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA "JULIO DE MESQUITA FILHO" FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS CÂMPUS DE ARARAQUARA ESTUDO DA ESTERILIZAÇÃO DE SCAFFOLDS PARA REGENERAÇÃO DO TECIDO ÓSSEO ERIC MARK FRANCISCO Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Engenharia de Biomateriais e Bioprocessos (Mestrado Profissional), Área de Biomateriais, Bioprocessos, Bioprodutos da Faculdade de Ciências Farmacêuticas, UNESP, como parte dos requisitos para obtenção do Título de Mestre em Engenharia de Biomateriais e Bioprocessos. ORIENTADOR: Prof. Dr. Antonio Carlos Guastaldi ARARAQUARA – SP 2019 2 3 4 AGRADECIMENTOS Á minha mãe Angela Rita, a maior mestra da minha vida, que me incentivou nas horas difíceis, de desânimo e cansaço. Ao meu pai Altair Francisco, que é a minha inspiração e talvez eu não consiga ser metade do que ele é, ou talvez um dia eu consiga olhar no espelho e ver que me tornei quem eu mais admirava. Aos meus irmãos Kelly e Alex, que nos momentos de minha ausência dedicados aos estudos, torceram pelo meu sucesso. À Paula Scanavez, pela paciência, pelo apoio e por acreditar em mim. Uma pessoa que eu tenho um carinho enorme e se hoje sou mestre eu devo muito a ela. Ao meu orientador Prof. Dr. Antonio Carlos Guastaldi, pela oportunidade e pelas suas precisas pontuações para à elaboração deste trabalho. Ao Prof. Dr. Jorge Enrique Rodriguez Chanfrau, que compartilhou os seus conhecimentos, pelo suporte, pelas suas correções e por me proporcionar caráter no processo de formação profissional. À Profa. Dra. Janaina Habib Jorge e a Jacqueline de Oliveira Zoccolotti, pelas análises microbiológicas e pelo empenho dedicado, que sem dúvida foram essenciais para realização deste trabalho. Aos amigos Beatriz Ambrozini, Thales Pelizaro e Elisabeth Pizoni, do Grupo de Biomateriais do Instituto de Química, Campus de Araraquara – UNESP, pela ajuda, incentivos e conselhos. À Faculdade de Ciências Farmacêuticas do Campus de Araraquara – UNESP e seus colaboradores, Claudia Lúcia Molina, Aniele Vilella, Larissa Trindade e Vanessa Peixoto, pelo suporte técnico. À CAPES: O presente trabalho foi realizado com o apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Código de financiamento 001. https://www.facebook.com/elisabeth.pizoni?__tn__=%2CdlC-R-R&eid=ARCufIEuJBTphQwBkyYQeCEDyaEA1d5ra92Fq0wL4GJ0SzxbqhZviZ9JyDLmZAxHSnI_VlihyEBCSyaO&hc_ref=ART3DDtNKgNQ2xuRtAwgqpkkJ0RZoAyvRJjcV2mTVqco_ZeEvSPAc_4PSdNnN6KQBtk 5 “Irmão, você não percebeu que você é o único representante do seu sonho na face da terra. Se isso não fizer você correr, chapa, eu não sei o que vai”. Emicida 6 RESUMO ESTUDO DA ESTERILIZAÇÃO DE SCAFFOLDS PARA REGENERAÇÃO DO TECIDO ÓSSEO O desenvolvimento de biomateriais para a regeneração de tecidos é de grande importância e sua demanda aumenta a cada dia, devido ao aumento do envelhecimento da população, da expectativa e qualidade de vida, bem como ao aumento das taxas de acidentes (trânsito e violência). Os Scaffolds são uma estrutura tridimensional, projetada para suportar infiltração, crescimento e diferenciação celular, a fim de melhorar o desenvolvimento e a formação de novos tecidos. Muitos biomateriais podem ser usados para fabricar essas estruturas, como as biocerâmicas e biopolímeros. No entanto, poucos estudos foram realizados para avaliar sua contaminação microbiológica e a influência dos métodos de esterilização podem ter sobre a estrutura e propriedades dos implantes. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar as propriedades mecânicas, físico-químicas e microbiológicas, antes e após três métodos de esterilização. Esses Scaffolds foram feitos de celulose bacteriana, alginato de sódio e fosfato de cálcio amorfo. Os Scaffolds foram elaborados mediante processo de liofilização. Eles foram divididos em quatro grupos: um grupo controle e três diferentes métodos de esterilização (esterilização a vapor, esterilização por irradiação ultravioleta e esterilização por micro-ondas). O número de colônias viáveis (UFC/mL) foi obtido através do plaqueamento das amostras em Ágar Dextrose Sabouraud com Cloranfenicol (SDA), Ágar Infusão Cérebro e Coração (BHI), Chromagar e Ágar Sangue. Todos os experimentos foram realizados em triplicata e analisados estatisticamente. Para avaliar se o processo de esterilização afetou a estrutura e composição química dos Scaffolds, as amostras correspondentes a cada grupo foram caracterizadas por Difração de Raios-X (DRX), Espectroscopia na Região do Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR) e Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV). Os resultados mostraram que a esterilização a vapor foi eficaz na eliminação de micro- organismos, enquanto a esterilização por micro-ondas, diminuiu significativamente o número de UFC/mL, e a ultravioleta não demonstrou ação esterilizante. Conclui-se que o processo de esterilização a vapor foi o mais efetivo, não observando mudanças na estrutura e composição dos Scaffolds. Palavras-chave: Esterilização. Scaffolds. Fosfatos de cálcio. Celulose bacteriana. 7 ABSTRACT SCAFFOLDS STERILIZATION STUDY FOR BONE TISSUE REGENERATION The development of biomaterials for the regeneration of tissues is of great importance and their demand increases every day, due to the increase of the aging population, of the expectation and quality of life, as well as the increase of the accident rates (traffic and violence). Scaffolds are a three-dimensional structure designed to withstand cellular infiltration, growth and differentiation in order to improve the development and formation of new tissues. Many biomaterials can be used to make these structures, such as bioceramics and biopolymers. However, few studies have been conducted to evaluate its microbiological contamination and the influence of sterilization methods may have on the structure and properties of implants. Thus, the aim of this work was to evaluate the mechanical, physicochemical and microbiological properties of Scaffolds, before and after three different sterilization methods. These Scaffolds were made of bacterial cellulose, sodium alginate and amorphous calcium phosphate. Scaffolds were made by lyophilization process. They were divided into four groups: a control group and three different sterilization techniques (steam sterilization, sterilization by ultraviolet irradiation and microwave sterilization). The number of viable colonies (CFU/mL) was obtained by plating the samples in Sabouraud Dextrose Agar with Chloramphenicol (SDA), Brain and Heart Infusion Agar (BHI), Chromagar and Blood Agar. All experiments were performed in triplicate and analyzed statistically. Later, the samples were characterized by X-ray Diffraction (XRD), Infrared Spectroscopy with Fourier Transform (FTIR) and Microscopy Scanning Electronics (SEM) in order to evaluate if the sterilization process affected the structure and chemical composition of the Scaffolds. The results showed that steam sterilization was effective in eliminating the microorganisms, whereas microwave sterilization significantly reduced the number of CFU/mL, and ultraviolet did not demonstrate sterilizing efficacy. It was concluded that the steam sterilization process was the most effective, not observing changes in the structure and composition of the Scaffolds. Keywords: Sterilization. Scaffolds. Calcium phosphates. Bacterial cellulose. 8 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Composição química do tecido ósseo ......... Erro! Indicador não definido. Tabela 2 - Classificação dos biomateriais de acordo com seu comportamento fisiológico...................................................................... Erro! Indicador não definido. Tabela 3 - Capacidade de inativar micro-organismos pelas diferentes técnicas de esterilização ................................................................. Erro! Indicador não definido. Tabela 4 - Vantagens e desvantagens dos métodos de esterilizaçãoErro! Indicador não definido. Tabela 5 - Resultado da viscosidade da tinta e dureza dos Scaffold obtidos ....... Erro! Indicador não definido. Tabela 6 - Resultados microbiológicos em meio Ágar SangueErro! Indicador não definido. Tabela 7 - Resultados microbiológicos em meio BHI ... Erro! Indicador não definido. Tabela 8 - Resultados da comparação estatística entre as réplicas de cada grupo ..................................................................................... Erro! Indicador não definido. Tabela 9 - Valores médios da análise das amostras tratadas com diferentes técnicas de esterilização ............................................................ Erro! Indicador não definido. 9 LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Estrutura óssea ............................................ Erro! Indicador não definido. Figura 2 - Canal de Havers e canal de Volkmann ........ Erro! Indicador não definido. Figura 3 - Principais tipos de células ósseas................ Erro! Indicador não definido. Figura 4 - Conceito de Engenharia de Tecidos ............ Erro! Indicador não definido. Figura 5 - Diferenciação das células-tronco ................. Erro! Indicador não definido. Figura 6 - Células-tronco embrionárias sendo extraída do blastocistoErro! Indicador não definido. Figura 7 - Obtenção de células-tronco adultas ............. Erro! Indicador não definido. Figura 8 - Reprogramação das células da pele através da inserção dos vetores virais ..................................................................................... Erro! Indicador não definido. Figura 9 - Diferenciação da célula hematopoiética ....... Erro! Indicador não definido. Figura 10 - Célula mesenquimatosa e suas diferenciaçõesErro! Indicador não definido. Figura 11 - Coração artificial constituído por biomaterialErro! Indicador não definido. Figura 12 - Scaffolds obtidos por: (a) liofilização (b) impressão tridimensional - 3D ..................................................................................... Erro! Indicador não definido. Figura 13 - Região das micro-ondas no espectro eletromagnéticoErro! Indicador não definido. Figura 14 - Diagrama da síntese de fosfato de cálcio amorfoErro! Indicador não definido. Figura 15 - Pó de fosfato de cálcio amorfo ................... Erro! Indicador não definido. Figura 16 - Diagrama de trabalho estabelecido para determinar a concentração de celulose bacteriana (CB) na tinta (AS: alginato de sódio. ACP: fosfato de cálcio amorfo) ......................................................................... Erro! Indicador não definido. Figura 17 - Diagrama da confecção dos Scaffolds (AS: alginato de sódio; CB: celulose bacteriana; ACP: fosfato de cálcio amorfo) .... Erro! Indicador não definido. Figura 18 - Difratograma de Raios-X da amostra sintetizada (DCPD: monohidrogênio fosfato de cálcio dihidratado; OCP: fosfato octa-cálcico; HA: hidroxiapatita; ACP: fosfato de cálcio amorfo) .............................................. Erro! Indicador não definido. 10 Figura 19 - Transformações de fases de fosfatos de cálcio intermediárias como as fases brushita (DCPD), fosfato octa-cálcico (OCP), monetita (DCPA) na formação de hidroxiapatita (HA) ........................................................ Erro! Indicador não definido. Figura 20 - Espectro de FTIR da amostra sintetizada .. Erro! Indicador não definido. Figura 21 - Micrografia MEV da amostra sintetizada (a = 2000X e b = 100000X) Erro! Indicador não definido. Figura 22 - Espectro de FTIR de ACP e Tinta contendo celulose bacteriana e fosfato de cálcio amorfo ........................................................... Erro! Indicador não definido. Figura 23 - Avaliação microbiológica (Meios de cultura: a. Ágar Sangue; b. BHI; c. Chromagar; d. SDA) ..................................................... Erro! Indicador não definido. Figura 24 - Gráfico Q-Q Plot da avaliação no meio Ágar SangueErro! Indicador não definido. Figura 25 - Gráfico de dispersão no meio Ágar SangueErro! Indicador não definido. Figura 26 - Gráfico de comparação mediana aplicando o teste de Kruskal Wallis ..................................................................................... Erro! Indicador não definido. Figura 27 - Gráfico Q-Q Plot da avaliação no meio BHIErro! Indicador não definido. Figura 28 - Gráfico de dispersão no meio BHI ............. Erro! Indicador não definido. Figura 29 - Gráfico de comparação de medianas aplicando o teste de Kruskal Wallis ..................................................................................... Erro! Indicador não definido. Figura 30 - Espectro de FTIR das amostras tratadas com os diferentes métodos de esterilização e amostra controle (Controle: sem esterilização; MW: micro-ondas; UV: ultravioleta) ................................................................... Erro! Indicador não definido. Figura 31 - Micrografia MEV das amostras tratadas (b: MW; c: UV e d: Vapor) e a amostra controle (a) em 1000X .................................... Erro! Indicador não definido. Figura 32 - Resultados do estudo de aplicação da MWErro! Indicador não definido. Figura 33 - Gráfico de tensão versus deformação das amostras não esterilizadas (esquerda) e esterilizadas (direita) ............................... Erro! Indicador não definido. Figura 34 - Micrografia MEV das amostras antes (a e c) e depois (b e d) do teste mecânico. (a e b amostras não esterilizadas; c e d amostras esterilizadas) em 300X ..................................................................................... Erro! Indicador não definido. 11 LISTA DE ABREVIATURAS ACP: Fosfato de Cálcio Amorfo AS: Alginato de Sódio BHI: Ágar Infusão Cérebro e Coração CAD: Computer Aided Designs CB: Celulose Bacteriana DRX: Difração de Raios-X EtO: Óxido de Etileno FTIR: Espectroscopia na Região do Infravermelho com Transformada de Fourier HA: Hidroxiapatita iPS: Induced Pluripotent Stem Cells MA: Manufatura Aditiva Me.PEG-PLA: Poli (ácido lático) - Poli (etileno glicol) - Monometil Éter MEV: Microscopia Eletrônica de Varredura MSCs: Células Estaminais Mesenquimatosas MW: Micro-ondas OCP: Fosfato Octa-Cálcico PAA: Ácido Peracético PEG: Polietileno Glicol PGA: Poli (ácido glicólico) PLA: Poli (ácido lático) 12 PLGA: [poli (ácido láctico-co-glicólico)] RM: Ressonância magnética sCO2: Dióxido de Carbono Supercrítico SDA: Ágar Dextrose Sabouraud com Cloranfenicol STL: Standard Triangle Language TC: Tomografia Computadorizada TCP: Fosfato Tri-Cálcico Tg: Transição Vítrea UFC: Unidade Formadora de Colônia UNESP: Universidade Estadual Paulista UV: Ultravioleta SUMÁRIO RESUMO..................................................................................................................... 6 ABSTRACT ................................................................................................................. 7 LISTA DE TABELAS ................................................................................................... 8 LISTA DE FIGURAS ................................................................................................... 9 LISTA DE ABREVIATURAS ...................................................................................... 11 SUMÁRIO.................................................................................................................. 12 1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 14 2. OBJETIVOS .......................................................................................................... 16 2.1 Geral.................................................................................................................... 16 2.2 Específicos .......................................................................................................... 16 3. REVISÃO DA LITERATURA .................................... Erro! Indicador não definido. 3.1 Osso ....................................................................... Erro! Indicador não definido. 3.1.1 Estrutura óssea ................................................... Erro! Indicador não definido. 3.1.2 Formação óssea .................................................. Erro! Indicador não definido. 3.2 Medicina Regenerativa ........................................... Erro! Indicador não definido. 3.3 Engenharia de Tecidos........................................... Erro! Indicador não definido. 3.3.1 Células ................................................................ Erro! Indicador não definido. 3.3.2 Biomateriais ......................................................... Erro! Indicador não definido. 3.3.3 Scaffolds .............................................................. Erro! Indicador não definido. 3.4 Métodos de esterilização ........................................ Erro! Indicador não definido. 3.4.1 Esterilização por micro-ondas ............................. Erro! Indicador não definido. 13 3.4.2 Esterilização por vapor ........................................ Erro! Indicador não definido. 3.4.3 Esterilização por irradiação ultravioleta ............... Erro! Indicador não definido. 4. MATERIAIS E MÉTODOS........................................ Erro! Indicador não definido. 4.1 Materiais ................................................................. Erro! Indicador não definido. 4.2 Etapas de desenvolvimento do trabalho ................ Erro! Indicador não definido. 4.3 Procedimento experimental .................................... Erro! Indicador não definido. 4.3.1 Obtenção de fosfato de cálcio amorfo (ACP) ...... Erro! Indicador não definido. 4.3.1.1 Caracterização do fosfato de cálcio amorfo (ACP) ........... Erro! Indicador não definido. 4.3.1.1.1 Difração de Raios X (DRX) ............................ Erro! Indicador não definido. 4.3.1.1.2 Espectroscopia na região do Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR) ........................................................................... Erro! Indicador não definido. 4.3.1.1.3 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) . Erro! Indicador não definido. 4.3.2 Elaboração da tinta ............................................. Erro! Indicador não definido. 4.3.2.1 Estabelecimento da concentração adequada de alginato de sódio (AS) . Erro! Indicador não definido. 4.3.2.2 Estabelecimento da concentração adequada de celulose bacteriana (CB) ..................................................................................... Erro! Indicador não definido. 4.3.2.3 Caracterização da tinta ..................................... Erro! Indicador não definido. 4.3.3 Confecção de Scaffolds....................................... Erro! Indicador não definido. 4.3.3.1 Caracterização dos Scaffolds ........................... Erro! Indicador não definido. 4.3.3.1.1 Determinação da dureza Shore A ................. Erro! Indicador não definido. 4.3.4 Estudo da esterilização ....................................... Erro! Indicador não definido. 4.3.4.1 Esterilização por micro-ondas .......................... Erro! Indicador não definido. 4.3.4.2 Esterilização por vapor ..................................... Erro! Indicador não definido. 4.3.4.3 Esterilização por irradiação ultravioleta ............ Erro! Indicador não definido. 4.3.4.4 Avaliação microbiológica .................................. Erro! Indicador não definido. 4.3.4.5 Estudo estatístico ............................................. Erro! Indicador não definido. 4.3.4.6 Caracterização dos Scaffolds após esterilização ............. Erro! Indicador não definido. 4.3.3.1.2 Teste mecânico ............................................. Erro! Indicador não definido. 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................ Erro! Indicador não definido. 5.1 Caracterização do fosfato de cálcio amorfo (ACP) . Erro! Indicador não definido. 5.2 Caracterização da tinta........................................... Erro! Indicador não definido. 5.2.1 Estabelecimento da concentração adequada de alginato de sódio (AS) .... Erro! Indicador não definido. 5.2.2 Estabelecimento da concentração adequada de celulose bacteriana (CB). Erro! Indicador não definido. 5.3 Estudo da esterilização .......................................... Erro! Indicador não definido. 14 5.3.1 Avaliação microbiológica ..................................... Erro! Indicador não definido. 5.3.2 Estudo estatístico ................................................ Erro! Indicador não definido. 5.3.3 Caracterização dos Scaffods após esterilização . Erro! Indicador não definido. 5.3.4 Estudo da influência da aplicação de MW ao longo do tempo ... Erro! Indicador não definido. 5.3.5 Teste mecânico ................................................... Erro! Indicador não definido. 6. CONCLUSÃO ........................................................................................................ 18 8. REFERÊNCIAS ..................................................................................................... 19 14 1. INTRODUÇÃO O desenvolvimento de novos tipos de tratamento para regeneração tecidual é uma área de grande impacto social, visto que uma proporção significativa das doenças crônicas progressivas é representada pelas doenças degenerativas, as quais podem não apresentar abordagens terapêuticas eficazes, resultando em aumento da morbidade populacional. O tecido ósseo tem a capacidade de regeneração, porém é limitada com o tamanho da lesão, assim defeitos ósseos grandes não se regeneram espontaneamente (MCNAMARA et al., 2014). O preenchimento de defeitos com osso do próprio paciente, de doadores ou por próteses sintéticas são opções de tratamento regenerativo. No entanto, esta prática de substituição por enxertos é restrita devido à quantidade limitada de tecido, ausência de biocompatibilidade, infecção e rejeição imunológica (SOWJANYA et al., 2013; CUERVO-LOZANO et al., 2018). Já as próteses apresentam limitações por não terem como funcionalidade a regeneração, mas sim uma estruturação mecânica. O número significativo de pessoas que sofrem destes problemas, assim como os consequentes custos socioeconômicos, evidenciam a necessidade do desenvolvimento de terapias alternativas para a solução destas perdas. Com o intuito de aumentar a expectativa e qualidade de vida da população, a Engenharia de Tecidos busca desenvolver novos sistemas para atuarem como suporte artificial temporário para regeneração de órgãos e tecidos que tenham sofrido algum dano. Nessa perspectiva os biomateriais são exemplos de materiais com resultados promissores para aplicação em dispositivos médicos ou estruturas para regeneração do tecido ósseo. As principais classes de materiais utilizados na composição dos biomateriais são: metais, polímeros, compósitos e cerâmicos. Em virtude da boa biocompatibilidade, adequada resistência mecânica e dureza, as biocerâmicas e os biopolímeros têm recebido destaque na área médica, contudo, ambos apresentam limitações como alta densidade e liberação de partículas, respectivamente (KAWACHI et al., 2000). Os biomateriais formados a partir de compósitos tem o intuito de superar essas limitações, pois se trata da combinação de materiais de diferentes características, resultando em uma associação com propriedades superior à dos materiais atuando individualmente (CHEN et al., 2012). 15 A Engenharia de Tecidos tem desenvolvido uma alternativa para promover a regeneração tecidual óssea, designada por Scaffolds, os quais são estruturas tridimensionais biodegradáveis, constituídos pelos diferentes biomateriais, que funcionam como suporte para o crescimento celular, podendo ocorrer in vivo ou in vitro. Dessa maneira auxiliam na agregação, proliferação e diferenciação celular, promovendo um ambiente adequado para deposição da nova matriz extracelular óssea, e consequentemente, para regeneração de tecido ósseo (MORENO, 2014). Uma das vantagens na utilização dessas estruturas é sua completa degradação ao longo do tempo, eliminando a necessidade de cirurgia para a recuperação do implante, permitindo uma recuperação mais rápida no local da lesão (DAI et al., 2016). Uma vez que os Scaffolds são constituídos por biomateriais estes precisam apresentar características semelhantes para a utilização em sistemas biológicos, como biocompatibilidade, taxa de degradação adequada, porosidade, além de propriedades mecânicas, físicas e químicas à adesão de células e formação de novo tecido (FONTES, 2010). Portanto, a escolha dos biomateriais mais adequados para a produção de um Scaffold, capaz de cumprir todos esses requisitos é um passo crítico a ser estudado e continua sendo objeto de pesquisas para a Medicina Regenerativa (GAUTAM et al., 2013; YU et al., 2017). No que se refere à fabricação dos Scaffolds, estes podem ser produzidos via método convencional (liofilização, lixiviação, formação de espumas, e separação de fases) ou via prototipagem rápida (impressão tridimensional - 3D, estereolitografia, sinterização laser e extrusão). Enquanto a metodologia convencional não permite o controle da arquitetura interna do Scaffolds ou um alto controle de sua porosidade, a prototipagem rápida atua de maneira contrária, proporcionando a fabricação de Scaffolds de geometria complexa, com maior controle da porosidade e arquitetura interna (MA, 2004). Além dos métodos de fabricação, outra etapa essencial é a esterilização, pois, devido às propriedades biológicas que os biomateriais utilizados precisam apresentar, estas estruturas tornam-se alvo de contaminação microbiológica, associada à sua utilização in vivo. A esterilização é um processo pelo qual um produto torna-se livre de contaminação de micro-organismos vivos. Quando se esterilizam estruturas biodegradáveis, a técnica de esterilização escolhida deve manter as propriedades estruturais e bioquímicas dos Scaffolds, garantindo que cumprirão as finalidades pretendidas após a esterilização. Essas estruturas podem 16 ser contaminadas por uma ampla gama de micro-organismo, como vírus, fungos e bactérias. Esses micro-organismos podem causar infecções e doenças, por exemplo, tétano, gripe, AIDS, febre amarela, candidíase e histoplasmose (COGLIATI, 2013). De acordo com as características morfológicas, cada micro- organismo apresenta um nível de resistência a esterilização. De acordo com DAI et al. (2016) em termos de resistência às esterilizações, na ordem de alto a baixo, os esporos bacterianos mostraram ser os mais resistentes, seguidos por micobactérias, vírus sem envelope, fungos, bactérias e vírus envelopados. Estão sendo testadas técnicas de esterilização, como iodo, ácido peracético (PAA) e alguns métodos recentemente desenvolvidos, como liofilização e dióxido de carbono supercrítico (sCO2). Por exemplo, Jimenez et al. (2008) avaliaram a eficácia da esterilização do sCO2 no poli (acrilacido-co-acrilamida), um modelo de biomaterial hidrogel, e relataram que a uma pressão de 27,6 MPa e a uma temperatura de 40°C, o hidrogel era efetivamente esterilizado. Portanto, considerando a importância da utilização de suportes estéreis em ambientes biológicos e a crescente demanda por implantes para regeneração óssea, este trabalho tem o objetivo de estudar as propriedades mecânicas, físico-químicas e microbiológicas, antes e após três métodos de esterilização, em Scaffolds constituídos de celulose bacteriana, alginato de sódio e fosfato de cálcio amorfo. 2. OBJETIVOS 2.1 Geral • Estudar as propriedades mecânicas, físico-químicas e microbiológicas, antes e após três metodologias de esterilização sobre Scaffolds feitos de celulose bacteriana, alginato de sódio e fosfato de cálcio amorfo, visando a aplicação destes na regeneração óssea. 2.2 Específicos • Produzir fosfato de cálcio amorfo a escala de banco e caracterizar mediante Difração de Raios X (DRX), Espectroscopia na região do Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR) e Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV). 17 • Elaborar uma tinta à base de alginato de sódio, celulose bacteriana e fosfato de cálcio amorfo e caracterizar através de Espectroscopia na região do Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR), viscosidade e estudo de estabilidade. • Confeccionar Scaffolds por processo de liofilização e caracterizar por meio de Espectroscopia na região do Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR), dureza e prova mecânica. • Estudar a efetividade da esterilização por micro-ondas, vapor e por irradiação ultravioleta sobre os Scaffolds. Caracterizar os Scaffolds após a esterilização por Espectroscopia na região do Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR), Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) e testes mecânicos. 18 6. CONCLUSÃO • Elaborou-se a escala de banco da fase fosfato de cálcio amorfo que cumpre com os parâmetros de qualidade dos mesmos segundo a caracterização realizada. • Estabeleceu-se um procedimento tecnológico que permite obter tintas de alginato de sódio, celulose bacteriana e fosfato de cálcio amorfo com uma viscosidade adequada. • A partir da tinta elaborada se obteve Scaffolds por liofilização e os mesmos cumpriram com os parâmetros de dureza. • Estudaram-se três processos de esterilização em Scaffolds, realizando-se a avaliação microbiológica em quatro meios de cultivos. • Nas amostras avaliadas não houve crescimento de fungos. • O método de esterilização por Vapor elimina totalmente a carga microbiana nos meios avaliados • O método de esterilização por MW teve uma redução logarítmica igual a 1 nas condições estudadas. • Método de esterilização por UV não diminui a carga microbiana nas amostras avaliadas; • As técnicas de esterilização não afetam de maneira geral as propriedades físico-químicas dos Scaffolds estudados; • Um aumento no tempo de exposição à radiação no MW diminui a carga microbiana nas amostras nas condições de trabalho estabelecidas, porém modifica o material. • As metodologias de esterilização por Vapor, nas condições avaliadas neste trabalho, não afetam as propriedades mecânicas dos Scaffolds. 19 8. 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