WELDER FRANZINI AMARAL CALLERA 

 

 

Estudos de mecanismos redox enzimáticos por  

eletroquímica e modelagem computacional 

 

 

 

Tese apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Biotecnologia, do Instituto de 

Química, da UNESP – Universidade 

Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, 

como parte dos requisitos para obtenção do 

Título de Doutor em Biotecnologia. 

 

 

 

Orientador: Prof. Dr. Paulo Roberto Bueno 

Co-orientador: Prof. Dr. Gustavo Troiano Feliciano 

 

 

Araraquara 

2017 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

 

 

 

 

 



 

 

 

 

WELDER FRANZINI AMARAL CALLERA 

 

Curriculum Vitae 

 

Dados pessoais 

Nome em citações bibliográficas CALLERA, W. F. A.; CALLERA, WELDER F.A. 

Sexo Masculino 

Cor ou Raça Branca 

Filiação Antonio Carlos Amaral Callera e Maria Célia Franzini Callera 

Nascimento 18/06/1982 - Araraquara/SP - Brasil 

Endereço residencial Rua Amazonas, 551 

 Jardim Silvania, Araraquara, SP – Brasil 

 CEP: 14811-066  

Endereço profissional Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, 

Instituto de Química de Araraquara 

 R. Prof. Francisco Degni, nº 55 

 Quitandinha - Araraquara, SP - Brasil 

 CEP: 14800-900 

 URL da home page: www.iq.unesp.br 

Endereço eletrônico weldercallera@hotmail.com 

  

Formação acadêmica/titulação 

2013         Doutorado em Biotecnologia.  

 Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, São 

Paulo, Brasil 

 Título: Estudos de mecanismos redox enzimáticos por Eletroquímica 

e Modelagem Computacional. 

 Orientador: Prof. Dr. Paulo Roberto Bueno 

 Co-orientador: Prof. Dr. Gustavo Troiano Feliciano 

 Bolsista da: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível 

Superior (CAPES) 

 



 

 

 

 

2011 - 2013  Mestrado em Biotecnologia.  

 Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, São 

Paulo, Brasil 

 Título: Estudo de processos redox enzimáticos confinados em 

eletrodos pelo concomitante monitoramento da variação de massa e 

da corrente: O caso da penicilinase como modelo., Ano de obtenção: 

2013 

 Orientador: Prof. Dr. Paulo Roberto Bueno 

 Bolsista da: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e 

Tecnológico (CNPq) 

 

2005 - 2010  Graduação em Farmácia.  

 Universidade Estadual de Londrina, UEL, Londrina, Brasil 

 Título: Utilização de ensaio imunoenzimático de captura para 

determinação do nível de gp43 na urina de camundongos 

experimentalmente infectados com Paracoccidioides brasiliensis 

 Orientador: Profª Drª Eiko Nakagawa Itano 

 

 

Atuação profissional 

 

1. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho - UNESP 

 

Vínculo institucional 

  

2015 - 2015    Vínculo: Estágio docência, Enquadramento funcional: 

Estagiário, Carga horária: 4,  Regime: Parcial  

 Outras informações:  

 Disciplina: Biotecnologia Farmacêutica. Ministrada ao 5° 

ano do curso de Farmácia. 

Supervisora: Prof.ª Dr.ª Rosemeire Pietro. 

 



 

 

 

 

2014 - 2014    Vínculo: Estágio docência, Enquadramento funcional: 

Estagiário, Carga horária: 4,  Regime: Parcial  

 Outras informações:  

 Disciplina: Biotecnologia. Ministrada ao 4° ano do curso 

de Farmácia. 

Supervisora: Prof.ª Dr.ª Rosemeire Pietro. 

 

2013 - Atual   Vínculo: Bolsista, Enquadramento funcional: Doutorando, 

Carga horária: 40,  Regime: Dedicação exclusiva  

 Outras informações: Biotecnologia de Enzimas. 

Biossensores: desenvolvimento e alicações.  

 

2011 - 2013    Vínculo: Bolsista, Enquadramento funcional: Mestrando,  

Regime: Dedicação exclusiva  

 

Atividades  

 

08/2013 - Atual Pesquisa e Desenvolvimento, Instituto de Química de 

Araraquara 

 Linhas de pesquisa: Biotecnologia de enzimas. 

 

 

2. Universidade Estadual de Londrina - UEL 

 

Vínculo institucional 

  

2006 - 2010    Vínculo: Colaborador, Enquadramento funcional: 

Estagiário, Carga horária: 20,  Regime: Dedicação 

exclusiva  

 

Atividades 

  



 

 

 

 

2006 - 2010 Estágio, Centro de Ciências Biológicas 

 Estágio:  

 Laboratório de Imunologia - PAT 

 

04/2006 - 02/2007 Extensão Universitária, Centro de Ciências Biológicas 

 Especificação:  

 Diagnóstico da Paracoccidioidomicose por Ensaio 

Imunoenzimático 

 

 

Linhas de pesquisa 

 

1. Biotecnologia de enzimas. 

 

 Objetivos: Biossensores: Desenvolvimento e Aplicações. 

Biossensores são dispositivos analíticos no qual o material de 

origem biológica, tal como enzimas, anticorpos, entre outros, é 

imobilizado junto a um transdutor. Os objetivos dos estudos residem 

em definir metodologias que apresentem alta seletividade e 

sensibilidade de análise. 

 

 

Idiomas 

 

Inglês Avançado  

Espanhol Avançado  

 

 

Produção 

 

Produção bibliográfica 

Artigos completos publicados em periódicos 



 

 

 

 

 

1. GONÇALVES, LUÍS MOREIRA; CALLERA, WELDER F.A.; SOTOMAYOR, 

MARIA D.P.T.; BUENO, PAULO R. 

Penicillinase-based amperometric biosensor for penicillin G. Electrochemistry 

Communications, v.38, p.131-133, 2014. 

Palavras-chave: cysteine, metallo-β-lactamase, Self-assembled monolayer (SAM), β-

lactam antibiotic, Lineweaver–Burk plot 

Referências adicionais: Inglês.  

 

 

Trabalhos publicados em anais de eventos (resumo expandido) 

 

1. CALLERA, W. F. A.; ITANO, E. N.; MASSUDA, T. Y. C. 

Utilização de anticorpos monoclonais a gp380 e análise de gp380 solúvel na 

paracoccidioidomicose experimental em urina de camundongos In: XVII EAIC - 

Encontro anual de iniciação científica - PIBIC/CNPq, 2008, Foz do Iguaçu - PR. 

Encontro Anual de Iniciação Científica - XVII EAIC -  PIBIC/CNPq. , 2008.  

Áreas do conhecimento: Imunologia,Imunologia Aplicada 

Referências adicionais: Brasil/Português. Meio de divulgação: Meio magnético 

 

 

 Apresentação de trabalho e palestra 

 

1. CALLERA, W. F. A.; RIECHI, S.C.; GUIMARÂES, P.M.; ANDRADE, L.A.; 

VOGLER, I.H.; SIMAO, A.N.C. 

Estudo de prevalência de marcadores sorológicos para doenças infecto-

contagiosas em doadores do Banco de Sangue do Hospital Universitário de 

Londrina, 2010.  (Congresso, Apresentação de Trabalho) 

Áreas do conhecimento: Farmácia, Hematologia, Imunologia 

Referências adicionais: Brasil/Português. Meio de divulgação: Vários; Cidade: 

Londrina; Evento: 2° Congresso Sul Brasileiro de Análises Clínicas; 

Inst.promotora/financiadora: Sociedade Brasileira de Análises Clínicas (SBAC) 



 

 

 

 

Produção técnica 

Trabalhos técnicos 

 

1. CALLERA, W. F. A. 

Programa de educação pelo trabalho para a saúde - PET - Saúde - Portaria 

Interministerial MS/MEC n°1802/2008, 2009 

Referências adicionais: Brasil/Português. Meio de divulgação: Meio digital 

 

Redes sociais, websites, blogs 

 

1. CALLERA, W. F. A. 

A criação da Biotecnologia, 2014 

Referências adicionais: Brasil/Português.  

Home page: <http://www.educacaoeminovacao.blogspot.com.br/2014/06/a-criacao-

da-biotecnologia.html> 

 

 

Participação em eventos 

 

1. Apresentação de Poster/Painel no 2° Congresso Sul Brasileiro de Análises 

Clínicas, 2010.  (Congresso) 

Estudo de prevalência de marcadores sorológicos para doenças infecto-contagiosas 

em doadores do Banco de Sangue do Hospital Universitário de Londrina.  

 

2. Apresentação (Outras Formas) no I Fórum de Farmácia, 2007.  (Outra) 

Adequações no currículo vigente.  

 

3. Apresentação de Poster/Painel no I Workshop de tópicos atuais em Imunologia 

do curso de Farmácia, 2006.  (Outra) 

Imunologia do transplante.  

 

 



 

 

 

 

4. Apresentação de Poster/Painel na VIII Jornada de Farmácia e Análises Clínicas 

de Londrina e II Encontro de Farmácia Industrial, 2005.  (Outra) 

Atuação dos Estudantes de Farmácia da UEL junto aos agentes comunitários na 

campanha da Tuberculose em uma Unidade Básica de Saúde no município de 

Londrina.  

 

 

 

 

 

 

 

 

  

  

  

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 “Eu não tenho ídolos. Tenho admiração por 

trabalho, dedicação e competência. 

(Ayrton Senna) 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

A Deus por, simplesmente, tudo; 

Aos meus pais Antonio Carlos Amaral 

Callera e Maria Célia Franzini Callera; 

Meu irmão Welber Franzini Amaral Callera; 

E minha noiva, Aline Viana de Souza, 

Que desde sempre acreditaram, me guiaram 

e me incentivaram, 

Serviram-me de amor e companheirismo 

pelo trajeto percorrido,  

Principalmente, nos momentos difíceis..., 

 

Muitíssimo obrigado! 

 

A todos familiares e amigos que me 

incentivaram e apoiaram... 



 

 

 

 

AGRADECIMENTOS 

Quero expressar minha gratidão e apreço por todos que, direta ou 

indiretamente, contribuíram para que este trabalho se tornasse uma realidade. Pois 

o final de mais esta etapa é um momento em que a realização pessoal e o 

crescimento profissional superam qualquer obstáculo que tenha aparecido durante a 

sua execução. 

Ao meu orientador e amigo, Prof. Dr. Paulo Roberto Bueno, que acreditou e 

apostou na minha capacidade, não mediu esforços em colaborar, sugestionar e 

apoiar minhas decisões. 

Ao meu co-orientador e amigo, Prof. Dr. Gustavo Troiano Feliciano, que veio 

agregar em conhecimento, em amizade, me apoiou, ensinou e incentivou como um 

mestre e sem negar esforços. 

Aos meus amigos e companheiros de laboratório: Willian Ribeiro, Adriano dos 

Santos, Flávio Bedatty, Márcio Góes, Juliana Cecchetto, Tiago Benites, Fernanda 

Carvalho, Rute Lopes, Mellany I. G. Nicholson e Luis Paulo M. Freitas pelas 

discussões e contribuições geradas. 

À Rose Portasio, pela sua prontidão em auxiliar. 

A todos os funcionários do Instituto de Química, da UNESP, campus 

Araraquara – SP. 

Aos professores do Programa de Pós-graduação em Biotecnologia. 

 Às funcionárias da seção de pós-graduação e ao pessoal da biblioteca por 

sempre estarem receptivos e prontos a auxiliar. 

 A todos meus familiares e amigos, meus sinceros agradecimentos, por me 

aturarem, pelos desabafos, pelas alegrias e tristezas compartilhadas, e 

principalmente, por fazerem parte da minha vida. 

 À CAPES pela bolsa concedida... Muitíssimo obrigado. 

 



 

 

 

 

RESUMO 

Esta tese de doutoramento apresentou o entendimento de processos redox 

enzimáticos, detalhando o mecanismo envolvido na troca eletrônica, a qual resulta 

na formação de um produto, por catálise enzimática. Observou-se a influência de um 

eletrodo sob a ação de um potencial estacionário aplicado ( 𝐸 ) na reação 

enzima/substrato. Realizou-se eletroanálises, como: Voltametria Cíclica (VC) e 

Espectroscopia de Impedância Eletroquímica (EIE), para a penicilinase. Os 

resultados obtidos dão indícios de que a reação enzimática se beneficia de 

determinados potenciais, pois o parâmetro utilizado, 𝑅𝑐𝑡, resistência à transferência 

de cargas, sugere que ocorre maior troca eletrônica em alguns potenciais ótimos 

(faixa de -0,3 a -0,5 V). A Simulação Molecular serviu para estudar o comportamento 

atomístico por métodos clássicos (Dinâmica Molecular – DM) para as condições 

impostas experimentalmente, esclarecendo o mecanismo de reação enzimática  por 

métodos quânticos (DFT – Teoria do Funcional de Densidade) e híbridos (QM/MM), 

cabendo salientar que a penicilinase não pertence à classe das enzimas 

oxirredutivas.   

 

Palavras-chave: Enzimas redox. Voltametria Cíclica (VC). Espectroscopia de 

Impedância Eletroquímca (EIE). Dinâmica Molecular (DM). Teoria do Funcional de 

Densidade (DFT). Métodos Híbridos (QM/MM). Penicilinase.  

 

  

 

 

 

 

 

 

 



 

 

 

 

ABSTRACT 

This doctoral thesis presented the understanding of enzymatic redox processes, 

detailing the mechanism involved in the electronic exchange, which results in the 

formation of a product by enzymatic catalysis. The influence of an electrode under 

the action of an applied stationary potential (𝐸) on the enzyme/substrate reaction was 

observed. Electroanalysis was performed, such as: Cyclic Voltammetry (VC) and 

Electrochemical Impedance Spectroscopy (EIS), for the penicilinase. The results 

obtained indicate that the enzymatic reaction benefits from certain potentials, since 

the parameter used, 𝑅𝑐𝑡, resistance to the transfer of charges, suggests that there is 

greater electronic exchange in some optimal potentials (range the -0.3 to -0.5 V). The 

Molecular Simulation was used to study the atomistic behavior by classical methods 

(Molecular Dynamics - DM) for experimentally imposed conditions, clarifying the 

mechanism of enzymatic reaction by quantum methods (DFT) and hybrids (QM/MM). 

That penicillinase does not belong to the class of oxidoreductive enzymes. 

 

Keywords: Redox enzymes. Cyclic Voltammetry (CV). Electrochemical Impedance 

Spectroscopy (EIS). Molecular Dynamics (DM). Density Functional Theory (DFT). 

Hybrid Methods (QM/MM). Penicillinase.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

 

 

LISTA DE FIGURAS 
 

Figura 1 - Estrutura cristalográfica de uma penicilinase de Bacillus cereus, com 
zinco. Coordenadas obtidas de 1BMC.pdb. A esfera cinza 
representa o átomo de zinco em seu sítio catalítico. ................................ 25 

Figura 2 - Placa de Petri, recoberta com ágar Sabouraud, inoculada com 
Staphylococcus sp. e Penicillium notatum, simulando a 
contaminação no experimento de Fleming, demonstrando a inibição 
do crescimento bacteriano onde se difundiu a penicilina no ágar, 
halo de restrição. ...................................................................................... 29 

Figura 3 - Colônia fúngica característica de Penicillium notatum em ágar 
Sabouraud. ............................................................................................... 29 

Figura 4 - Mecanismo de ação da penicilinase, abertura do anel β-lactâmico na 
presença de água. O anel beta lactâmico é colapsado (1 e 2), a 
ligação amida é quebrada, o nitrogênio é reduzido a N- (3) e retira-se 
o hidrogênio da água (4). ......................................................................... 34 

Figura 5 - Estrutura da metalo-β-lactamase (2M5C.pdb) de Bacillus cereus, em 
tampão fosfato (PBS), pH 7, com dois íons zinco em seu sítio ativo........ 35 

Figura 6 - Circuito elétrico equivalente, do tipo Randles (a), com diagrama de 

Nyquist (b). Onde Rs é resistência de solução, Cdl é capacitância da 

dupla camada elétrica, Rct é resistência a transferência de cargas, 

Zw é Impedância de Warburg,  -Z” é impedância imaginária e Z’ é a 

impedância real. O diagrama (1) apresenta menor Rct que o (2). ............ 45 
Figura 7 - Voltamograma cíclico obtido da limpeza eletroquímica. ........................... 47 
Figura 8 - Estrutura cristalográfica obtida por difratometria de raios-X da 

metalo-β-lactamase (coordenadas obtidas de 2M5C.pdb) de Bacillus 
cereus, em tampão fosfato (PBS), ph 7, com dois íons zinco em seu 
sítio ativo. ................................................................................................. 62 

Figura 9 - VC´s características de diferentes eletrodos: o de Au puro, o de 
Au/SAM, o de Au/SAM/Penicilinase e o de Au/SAM/Penicilinase na 
presença de substrato. Realizadas em solução de ferri/ferro, 1 mmol 
L-1, em KNO3, 0,5 mol L-1. O substrato é a penicilina G a 0,65 mmol 
L-1. Em destaque, ampliação na região onde ocorreu bloqueio de 
corrente (-0,5 a 0,5 µA cm-2) devido à formação de filme na 
superfície metálica. ................................................................................... 65 

Figura 10 - Perfis voltamétricos de uma apoenzima e uma holoenzima, 
imobilizadas em eletrodo de Au. Realizado em PBS 0,1 mol L-1, pH 
7,4 a 25°C. Velocidade de varredura de 100 mV s-1. Penicilina G a 
0,65 mmol L-1. O íon Zn2+, a 25 mmol L-1, foi utilizado como cofator. 
Região hachurada indica um “laço de nucleação”. ................................... 66 

Figura 11 - Voltametrias cíclicas da reação enzimática da penicilinase com 
cofator. Realizado em PBS 0,1 mol L-1, pH 7,4 a 25°C. Velocidade 
de varredura de 100 mV s-1. Penicilina G a 0,65 mmol L-1. Utilizou-se 
0,01 mol L-1 e 0,2 mol L-1 de zinco como cofator. Ambas 
apresentaram densidades de corrente próximas e com “laço de 
nucleação”. A VC do zinco apresenta um ponto de reversão da 
enzima em -0,6 V. .................................................................................... 68 



 

 

 

 

Figura 12 - Espectro de impedância (construídos em intervalo de frequências 
de 1 mHz a 1 MHz) para onze diferentes potenciais aplicados entre -
0,6 V a 0,4 V. Estes espectros foram obtidos em PBS 0,1 mol L-1, pH 
7,4 a 25°C. Penicilina G (substrato) em concentrações de 0,65 mmol 
L-1. Utilizou-se 1 mmol L-1 de cofator, Zn. Em destaque, regiões de 
baixa impedância real (Z’). ....................................................................... 70 

Figura 13 - Em (a) tem-se o circuito elétrico equivalente correspondente ao 

sistema, onde Cm corresponde à capacitância da monocamada sem 
contribuição iônica, Rt  e Ct , resistência e capacitância, 
respectivamente, não compensadas, Rs é resistência de solução, Cdl 
é capacitância da dupla camada elétrica,   Rct  é resistência a 

transferência de cargas, Zw é Impedância de Warburg. Em (b), tem-
se diagramas de Nyquist realizados em solução de PBS 0,1 mol L-1, 
pH 7,4, a 25°C, contendo 1 mmol  L-1 de cofator e penicilina G a 0,65 
mmol L-1. Foram obtidas as correntes para os potenciais -0,3V, 0 V e 
0,3 V para frequências de 1 mHz a 1 MHz, com cofator, zinco. 
Destacou-se em (c) e (d), as respectivas curvas de ajuste para cada 
potencial aplicado, de acordo com o circuito elétrico equivalente 
correspondente à interação eletrodo funcionalizado e seu substrato. 

Onde, -Z” é impedância imaginária e Z’ é a impedância real. ................... 71 

Figura 14 - Gráfico da resistência à transferência de carga (Rct) vs. E (V). 
Mostra em a) a variação da Rct  na ausência e na presença de 
cofatores da reação enzimática na presença do substrato, Penicilina 
G em concentrações de 0,65 mmol L-1, utilizou-se 1 mmol L-1 de 

cofator, Zn ou Co, em b) o comportamento de Rct na presença e na 
ausência de substrato tendo Zn, como cofator. O aumento da 

atividade da metaloenzima é inversamente proporcional ao Rct. A 
área hachurada corresponde aos potenciais que favorecem a 
reação. ..................................................................................................... 73 

Figura 15 - Penicilinase (2M5C.pdb) obtida por difratometria de raios-X, em pH 
7. A priori, os íons inorgânicos foram retirados da estrutura. ................... 76 

Figura 16 - Função de distribuição radial (RDF) entre átomos, de oxigênio e 
nitrogênio, da proteína e os átomos de zinco. As trajetórias de 
Dinâmica Molecular foram obtidas para as concentrações de 0,01 e 
0,2 mol L-1 de zinco, respectivamente. ..................................................... 78 

Figura 17 - Distribuição de potencial eletrostático relacionado à carga parcial 
clássica da penicilinase, em volts. Região destacada pelo círculo 
corresponde ao sítio ativo, quando a enzima está inativa. ....................... 79 

Figura 18 - Representação em fita da penicilinase junto com os resíduos 
carregados positivos (azul) e negativos (vermelho). ................................ 80 

Figura 19 - Distribuição de potencial eletrostático relacionado à carga parcial 
clássica da penicilinase, em volts. Região destacada pelo círculo 
corresponde ao sítio ativo, quando a enzima está ativada pelo 
cofator. ..................................................................................................... 81 

Figura 20 - Representação atomística do modelo complexo enzima-substrato 
mais eletrodo, utilizado nos cálculos quânticos de estrutura 
eletrônica, com carbono (ciano), nitrogênio (azul), oxigênio 



 

 

 

 

(vermelho), hidrogênio (branco), enxofre (laranja), zinco (cinza) e 
ouro (amarelo). ......................................................................................... 82 

Figura 21 - Densidade de estados eletrônicos (DOS) quando adicionado água 
ao sistema, com e sem a influência do eletrodo de ouro. ES 
corresponde ao sistema modelo da enzima/substrato, ESH2O 
contém uma molécula de água explícita e AUESH2O, o sistema com 
uma molécula de água sob influência do eletrodo de ouro. ..................... 84 

 
 
 
 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

 

 

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS 

 𝐾𝑚 – Constante de Michaelis-Menten 

 °C – Celsius 

 µ – Micro 

 A – Ampère 

 Å – Angstron 

 Aativa – Área ativa 

 AMCG – Auto-monitorização da glicemia capilar 

 C – Coulomb 

 CG – Glicemia capilar 

 d – Deci 

 DFT – Density Functional Theory 

 DNA – Ácido desorribonucleico 

 e-  – Elétron 

 ECE – Espectroscopia de Capacitância Eletroquímica 

 EDC – Etilo (dimetilaminopropil) carbodiimida 

 EIE – Espectroscopia de impedância eletroquímica 

 f – Femto 

 Fr - Fator de rugosidade 

 GAD – Ácido glutâmico 

 GGA – Generalizated gradient approximation 

 GROMACS – Groningen Machine for Chemical Simulations 



 

 

 

 

 H – Hamiltoniano. 

 HLA – Antígeno leucocitário humano 

 Hz – Hertz 

 IA2 – Antitirosina fosfatase 

 IUPAC – International Union of Pure and Applied Chemistry 

 j – Densidade de corrente 

 K – Kelvin 

 kDa – Kilodalton 

 LDA – Local density approximation 

 LSCF – Local Self Density Field  

 MM - Mecânica Molecular 

 MβL – Metalo-β-lactamase 

 NAD – Nicotinamida adenina dinucleotídeo 

 NHS – N-hidroxi-succinimida 

 PBS – Solução tampão fosfato de sódio 

 PDB – Protein Data Bank 

 QM – Mecânica Quântica 

 SAM – Monocamada auto-organizada (self assembled monolayer) 

 SIESTA – Spanish Initiative for Electronic Simulations with Thousands of 

Atoms 

 SPLAM – Método do átomo ligado com posição escalada  

 US$ - Dólar americano 



 

 

 

 

 UV – Ultra violeta. 

 V –  Volts 

 VC – Voltametria cíclica 

 Znt – Anti-transportador de zinco 

 Ψ – Função de onda 

 𝐶 – Capacitância 

 𝐸 – Potencial aplicado 

 𝑅 – Resistência 

 𝑍 – Impedância 

 𝑓 – Frequência 

 𝑖 – Corrente elétrica 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

 

 

SUMÁRIO 

1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................. 22 

1.1 Penicilinase .................................................................................................................... 24 

1.1.1 Fleming e a penicilina ................................................................................................. 27 

1.1.2 Antibioticoterapia e sepse ........................................................................................... 30 

1.1.3 Resistência bacteriana e inibidores de β-lactamases .................................................. 32 

1.1.4  Penicilinase de Bacillus cereus .................................................................................. 33 

1.2 Métodos eletroquímicos ................................................................................................. 35 

1.3 Simulação molecular ...................................................................................................... 36 

2 OBJETIVOS ................................................................................................................. 38 

3 MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................................ 39 

3.1 Parte experimental ........................................................................................................ 39 

3.1.1 Análises Eletroquímicas......................................................................................... 41 

3.1.1.1 Voltametria cíclica (VC) ......................................................................................... 42 

3.1.1.2 Espectroscopia de Impedância Eletroquímica (EIE) ................................................. 43 

3.1.2 Protocolo de limpeza da superfície de ouro ................................................................ 45 

3.1.3 Funcionalização do eletrodo ....................................................................................... 47 

3.2 Parte teórica ................................................................................................................. 48 

3.2.1 Modelagem clássica ................................................................................................... 48 

3.2.1.1 Mecânica Molecular (MM) ou Campos de Força ...................................................... 48 

3.2.1.2 Dinâmica Molecular.................................................................................................. 51 

3.2.2 Modelagem quântica ................................................................................................... 54 

3.2.2.1 Mecânica Quântica (QM) ......................................................................................... 54 

3.2.2.2 Equação de Schrödinger .......................................................................................... 55 

3.2.2.3 Teoria do funcional de densidade (DFT) .................................................................. 57 

3.2.2.4 Metodologia Híbrida - QM/MM ................................................................................. 58 

3.2.3 Protocolo de cálculos .................................................................................................. 61 

4 PENICILINASE: abordagem eletroquímica e modelagem computacional .............. 64 

4.1 Abordagem Eletroquímica .............................................................................................. 64 

4.2 Análise computacional da interação penicilinase/Zn2+. ................................................... 75 

5 CONCLUSÕES ............................................................................................................ 86 

REFERÊNCIAS ................................................................................................................... 88 



22 

 

 

 

1 INTRODUÇÃO 

 

Há muitos anos, a ficção científica e ciência se fundem, pois o que era apenas 

um fruto do imaginário poético ou fictício vem se tornando real por meio de muito 

estudo e avanço técnico-científico, principalmente no campo das Biotecnologias, 

área de conhecimento com caráter multidisciplinar, que tem por objetivo o 

desenvolvimento e/ou melhoria de processos de uso específico utilizando de 

organismos vivos ou parte deles (PLEIN, 1991).  

Mary Shelley, em 1818, ao publicar sua obra “Frankenstein”, choca a 

sociedade da época ao relatar a criação de um homem gigantesco por meio da 

ciência, utilizando uma descarga elétrica como ignição da vida. Nos dias atuais, é 

considerado possível o desenvolvimento de vida em laboratório, devido às 

tecnologias de ponta desenvolvidas, como a técnica de clonagem, conhecida 

mundialmente por causa da famosa ovelha Dolly, nascida a 7 de julho de 1996, no 

Instituto Roslin, na Escócia, sendo o primeiro mamífero a ser clonado com sucesso a 

partir de uma célula adulta, e as modernas técnicas de embriogênese in vitro 

(MARCUS, 2002). 

A ficção científica dividiu-se em vários subgêneros, sendo que no fim do 

século XX, destacou-se o Biopunk, o qual relata histórias em que indivíduos são 

manipulados geneticamente, como visto em “Admirável Mundo Novo”, de Aldous 

Huxley (1932), onde as pessoas eram condicionadas biologicamente e divididas por 

castas de acordo com características genéticas previamente estabelecidas. 

Entretanto, nesta época já se conhecia o conceito de eugenia, o “bem nascido”, 

criada em 1883, por Galton, definida como "o estudo dos agentes sob o controle 

social que podem melhorar ou empobrecer as qualidades raciais das futuras 

gerações seja física ou mentalmente", seguido pela genética, estudo da variação de 

características herdadas, criada em 1908, por Bateson, sendo temas delicados e 

perigosos, se usados de maneira errônea e antiética, como no caso da “eugenia 

nazista”, na Alemanha governada por Adolf Hitler, de 1943-1945, que criou a Lei de 



23 

 

 

 

Nuremberg, a qual, resumindo, proibia relacionamento de alemães com judeus, por 

julgar serem inferiores, culminando no Holocausto, por isto o mundo precisa de 

cautela com os avanços tecnológicos (GALTON, 1883; HUXLEY, 1932; VAN 

OVERWALLE et al., 2006; DAWIDOWICZ, 2010).  

A inovação biológica salta dos livros e vai além da Biotecnologia. É sobre 

cada manipulação humana de sistemas vivos em busca de quantidade e qualidade 

de vida, resumindo, mais saúde e maior tempo de perspectiva de vida, como pode 

ser observado pela criação de novas vacinas, alimentos transgênicos, entre outros 

avanços (VAN OVERWALLE et al., 2006). 

A alimentação é um ponto estratégico, principalmente num mundo onde ainda 

800 milhões de pessoas são cronicamente desnutridas, mesmo que uma boa parte 

destes seja de obesos que ingerem alimentos de baixo valor nutritivo, superando o 

números de pessoas com doença infecciosa grave, sendo a maior causa de 

problemas de saúde e morte prematura (COUSIN, 2014). 

Nas atuais condições, é inaceitável desperdiçar capital humano e intelectual. 

Sendo que, a partir da combinação de novas ferramentas de informática, 

comunicação e compreensão biológica  se tem cada vez mais inovações. É 

desejável que estas sejam de fácil acesso às populações de menores condições, 

sem que o potencial da ciência e tecnologia sejam perdidos (COUSIN, 2014). 

A necessidade de melhores condições da população mundial serve como 

combustível para a chama da ciência, pois a cada dia que passa novos 

pesquisadores surgem e com eles a vontade de proporcionar melhor qualidade de 

vida à sociedade. Desta ânsia, surgem inovações em diversas áreas. Focando na 

área da saúde, investe-se em desenvolvimento de novos métodos de diagnóstico 

para que se detectem doenças antes que esta se manifeste clinicamente ou num 

novo fármaco com maior eficácia (COUSIN, 2014). 

O desenvolvimento de dipositivos mais acurados abre espaço para o estudo 

dos fundamentos da fisiologia associados à corrente elétrica envolvida nas reações 

do corpo humano, por exemplo, os impulsos elétricos do sistema nervoso, sendo 

este um dos campos da bioeletrônica, ciência que  propõe explorar a biologia 



24 

 

 

 

sinergicamente com a eletrônica, estando relacionada a processos 

bioeletroquímicos, os quais envolvem reações de oxirredução (MILLER, 1977).  

Os processos redox definem-se como reações em que um dos reagentes, no 

caso o oxidante (ou redutor), aceita (doa) elétrons do (ao) reagente redutor 

(oxidante). Diversas reações que ocorrem nos organismos são oxirredutivas, como a 

respiração celular, que consiste na oxidação da glicose na presença de oxigênio (O2) 

formando gás carbônico (CO2), água e energia na forma de ATP (adenosina 

trifosfato). No entanto, esta reação não ocorre diretamente, sendo necessárias 

diversas etapas mediadas por enzimas da classe das oxirredutases, ou seja, a 

glicose vai cedendo elétrons, de 2 em 2, e formando intermediários mais oxidados 

(GNAIGER et al., 1995). 

  

1.1 Penicilinase 

 

Muitas oxirredutases são metaloproteínas com função catalítica ou, 

simplificadamente, metaloenzimas. As metaloenzimas são proteínas que possuem 

um ou mais íons metálicos ligados covalentemente à sua cadeia polipeptídica. A 

função da metaloenzima é conferida por um átomo metálico que estabilizará a forma 

terciária ou quaternária da molécula, sendo este necessário para a atividade 

catalítica e que contribuirá para o efeito eletrônico comum das reações de 

oxirredução,  como observado na penicilinase de Bacillus cereus, Figura 1 

(ROSALES et al., 1986; GÓMEZ-ARIZA et al., 2004; SZPUNAR, 2005; MOUNICOU 

et al., 2009; SHI ; CHANCE, 2011).  

 

 

 

 



25 

 

 

 

Figura 1 - Estrutura cristalográfica de uma penicilinase de Bacillus cereus, com zinco. Coordenadas 

obtidas de 1BMC.pdb. A esfera cinza representa o átomo de zinco em seu sítio catalítico. 

 

Fonte: adaptado de Carfi et al. (1995). 

 

Os metais de transição, como ferro (Fe), cobre (Cu), zinco (Zn), manganês 

(Mn), molibdênio (Mo) e cobalto (Co), devido às suas propriedades (pequeno raio 

atômico e interação via eletromagnética e forças eletrostáticas), estão ligados à 

maioria das metaloenzimas com a função de cofator metálico incorporado por meio 

de ligações específicas, caracterizando-se pela alta afinidade da interação metal-

proteína e é responsável pela transferência de elétrons entre a enzima e o substrato 

(enzima redox) (SILVA, 2009). 

As β-lactamases (EC 3.2.5.6) são hidrolases, porém apresentam 

“características” redox, que hidrolisam a ligação amida do anel β-lactâmico do 

antibiótico, fazendo com que este perca sua função de inibir a síntese da parede 

celular bacteriana. São divididas em quatro classes de acordo com a sua estrutura 



26 

 

 

 

primária e podem também ser classificadas dentro de dois grupos com base no seu 

mecanismo catalítico, isto é, serina-β-lactamases (classes A, C e D) e metalo-β-

lactamases (classe B), de acordo com a classificação de Ambler (BERTONCHELI E 

HÖRNER, 2008). 

Katchalski, na década de 60, introduziu os primeiros suportes inertes úteis na 

preparação das enzimas imobilizadas, visto que sua recuperação era difícil quando 

elas estavam livres em solução. Desta forma, possibilitou que as enzimas fossem 

imobilizadas no eletrodo de trabalho mediante ligações químicas covalentes dos 

grupos primários aminas e o anel fenólico dos aminoácidos constituintes da enzima 

com os grupos reativos do suporte (-COOH; dentre outros) (GOLDMAN et al., 1968; 

MOSBACH, 1980; KATCHALSKI et al., 2006).  

Vários métodos surgiram para ancoragem de substânias em superfícies,  

dentre eles, as monocamadas automontadas (SAMs), como dito pelo próprio nome, 

são uma única camada molecular que se adsorve espontaneamente sobre uma 

superfície metálica para funcionalização, no caso o eletrodo de trabalho de ouro, e 

torna-o susceptível a uma variedade de aplicações, inclusive a de estudo da cinética 

enzimática quando se tem uma enzima redox acoplada/imobilizada a SAM 

(GONÇALVES et al., 2014; LUZ et al., 2014).  

Com a possibibilidade de imobilizar as enzimas vieram vários estudos 

relacionados com a cinética enzimática e desenvolvimento de biossensores, por 

exemplo, o sensor de penicilina, desenvolvido e estudado no grupo Nanobionics, o 

qual resultou no trabalho Penicilinase-based amperometric biosensor for penicillin G, 

de Gonçalves et al. (2014), fornecendo sinais analíticos referentes à abertura do 

anel β-lactâmico da penicilina pela metaloenzima, sendo esta responsável pela alta 

sensibilidade e seletividade do sensor, o que trouxe novos questionamentos 

relacionados ao mecanismo enzimático envolvido na reação (GONÇALVES et al., 

2014).  

Para que o desenvolvimento e análise da superfície adsorvida fosse possível, 

experimentalmente, optou-se pelo uso de ferramentas eletroquímicas para 



27 

 

 

 

compreender os mecanismos envolvidos na reação enzimática, no caso a 

Voltametria Cíclica (VC) e a Espectroscopia de Impedância Eletroquímica (EIE). 

 

1.1.1 Fleming e a penicilina 

 

O século XX foi marcado por uma das maiores descobertas da humanidade, a 

Penicilina, por Sir Alexander Fleming, em 1928, advento que trouxe inúmeros 

benefícios à sociedade civil, sendo um marco na história da farmacologia, que 

passou a ser contada do antes e depois do uso da antibioticoterapia (FLEMING, 

1946; LUDOVICI, 1952). 

Lembrando-se, que a supressão da atividade e crescimento bacteriano e o 

tratamento de doenças infecciosas constitui uma preocupação da comunidade 

científica, desde a escola francesa liderada por Pasteur à escola alemã tutelada por 

Koch é continuada até hoje, devido ao uso indiscriminatório dos antibióticos e o 

surgimento de cepas bacterianas resistentes às drogas conhecidas (FLEMING, 

1946; PEREIRA; PITA, 2005; ANUSHA et al., 2015). 

Alexander Fleming nasceu em 6 de Agosto de 1881, na Escócia. Em 1895, 

inicia uma nova fase com a sua ida para Londres, a capital, onde alguns dos seus 

irmãos já residiam. Em 1900, Fleming e outro irmão, John, alistaram-se no London 

Scottish Regiment estando em guerra com os Boers. Entretanto, nunca esteve na 

frente de combate.  Ao receber uma herança de seu tio, pode abandonar o emprego 

e preparar-se aos estudos enveredando-se pelas áreas médicas (FLEMING, 1946; 

LUDOVICI, 1952; ROWLAND, 1957). 

Em 1901, Fleming inicia seus estudos de medicina em Londres, na Escola 

Médica aspirando ao Hospital de St. Mary (ROWLAND, 1957; PEREIRA E PITA, 

2005). Ao formar-se em 1906, começou a trabalhar com Almroth Wright, conceituado 

bacteriologista e patologista, no Serviço de Inoculação, no “Inoculation Department”, 

fundado em 1902 (ROWLAND, 1957; HUGHES, 1974).   



28 

 

 

 

Em 1909, Fleming passa a ser habilitado a realizar cirurgias, porém o apego 

pelo trabalho de investigação laboratorial, e, em particular, pela bacteriologia, levou-

o a continuar suas pesquisas cujos resultados veio a publicar ao longo da sua vida 

na forma de livro e em revistas como Practitionner, The Lancet, British Medical 

Journal, British Journal of Experimental Pathology, St Mary’s Hospital Gazette, 

American Journal of Clinical Pathology, Gazette des Hôpitaux, Annales de l’Institut 

Pasteur, The Biochemical Journal, entre outros. Alguns dos trabalhos de Fleming 

foram realizados em colaboração, destacando-se as publicações conjuntas com L. 

Colebrook, S.R. Douglas, A.E. Wright, A.B. Porteous, F.J. Clemenger, V.D. Allison, 

Ian H. Maclean, K.B. Rogers, C. Smith, J.R. May, A. Voureka, I.R.H. Kramer e W.H. 

Hughes (PEREIRA; PITA, 2005; ANUSHA et al., 2015). 

Na Primeira Guerra Mundial (1914-1918), Almroth Wright propôs ao governo 

britânico que o seu Serviço de Inoculação preparasse vacinas contra a febre tifoide e 

cuidasse das feridas dos guerrilheiros feridos em combate, no intuito de evitar 

processos infecciosos. Assim, Fleming e outros pesquisadores foram enviados para 

Boulogne-sur-Mer, onde instalaram um laboratório, no qual estudaram um amplo 

número de microrganismos, permitindo que tratamentos eficazes aos ferimentos de 

guerra fossem estabelecidos, tornando-se a maior autoridade mundial em matéria de 

feridas de guerra, resultando em inúmeras publicações científicas, onde avaliou o 

poder antibacteriano dos leucócitos contidos nos exsudatos de feridas (PEREIRA; 

PITA, 2005). 

Em 1922, no pós Guerra, ele descobre o poder da Lisozima, enzima presente 

no exsudato de feridas com extraordinário poder lítico sobre algumas bactérias e 

que veio a ser mencionado no discurso proferido ao recebimento do seu Prêmio 

Nobel de Medicina e Fisiologia, em 1945. 

Fleming estudava os estafilococos, bactérias Gram-positivas, adquirindo cor 

arroxeada, devido à sua membrana simples e parede de peptideoglicano (atividade 

endotóxica, desencadeador de febre e processo inflamatório) grossa, anaeróbios 

facultativos, com 1 µm de diâmetro e que se agrupam como cachos de uvas, em 

parceria com Professor Bigger, resultando na descoberta da Penicilina (MAUROIS, 

1959; FLEMING et al., 2007). 



29 

 

 

 

Certo dia, uma placa de Petri inoculada com estafilococos apresenta uma 

contaminação por fungo e constatou-se que até certa distância da colônia fúngica 

não havia proliferação bacteriana, como visto na Figura 2 (HUGHES, 1974).  

 

Figura 2 - Placa de Petri, recoberta com ágar Sabouraud, inoculada com Staphylococcus sp. e 

Penicillium notatum, simulando a contaminação no experimento de Fleming, demonstrando a inibição 

do crescimento bacteriano onde se difundiu a penicilina no ágar, halo de restrição. 

 

Fonte: Cummings (2017). 

 

Mais tarde, caracterizou-se o fungo e constatou se tratar do Penicillium 

notatum, Figura 3, e que este inibia o crescimento de outras bactérias patogênicas. 

“Fleming reconhecia o papel do acaso na descoberta científica e, por outro lado, 

implicitamente sublinhava que a observação genial do investigador marcava a 

diferença entre descobrir e não descobrir”. (HUGHES, 1974).  

 

 

Figura 3 - Colônia fúngica característica de Penicillium notatum em ágar Sabouraud. 



30 

 

 

 

 

Fonte: Calver (2016). 

 

Apesar da descoberta, a Penicilina passou por uma fase de esquecimento, 

mesmo tendo aparecido em algumas publicações do Fleming, até passar a ser 

estudada com mais afinco pelo doutor Chain e Sir Howard Florey, coparticipantes do 

Prêmio Nobel recebido (ABRAHAM; CHAIN, 1940; FLEMING, 1946; RANDO, 1975; 

PEREIRA; PITA, 2005). 

 

1.1.2 Antibioticoterapia e sepse  

 

O surgimento dos antibióticos revolucionou a Medicina ao diminuir o número 

de mortes de pessoas infectadas por microrganismos, sendo os processos 

infecciosos os responsáveis por grande número de doenças (ABRAHAM; CHAIN, 

1940; SKLYARENKO et al., 2015).  

Após a descoberta da penicilina, acreditou-se que a humanidade estaria salva 

de infecções bacterianas, até que em 1940, se descobriu a penicilinase. E 

começaram-se os estudos referentes à resistência bacteriana (BACTERIAL, 1979).  

https://www.google.com.br/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&source=images&cd=&cad=rja&uact=8&ved=&url=http://www.ox.ac.uk/news/science-blog/75-years-penicillin-people&bvm=bv.146786187,d.Y2I&psig=AFQjCNE-PBvtru95ztmAjmyDwahzqUbd_w&ust=1487181314663903


31 

 

 

 

Na mesma proporção que surgem novos antibióticos no mercado também 

surgem cepas bacterianas multirresistentes, o que dificulta a introdução de uma 

antibioticoterapia eficaz, pois o fator resistência está ligado ao material genético da 

bactéria, o qual não está livre de possíveis mutações gênicas, o que pode torná-la 

uma superbactéria, com resistência a todos os fármacos disponíveis, sendo este um 

dos maiores problemas de saúde pública (CITRI; ZYK, 1965; VERKHOVTSEVA et 

al., 1972). 

Um paciente infectado por bactéria pode evoluir a sepse, uma condição em 

que o organismo começa a danificar seus próprios órgãos e tecidos, em virtude à 

resposta inflamatória exacerbada própria do corpo, ou seja, passa-se a ter uma 

resposta inflamatória sistêmica (GAYNES, 2011). 

A sepse é a causa mortis que mais acomete pacientes infectados por 

bactérias no mundo, mesmo a Biotecnologia desenvolvendo novas vacinas, soros e 

fármacos constantemente (GAYNES, 2011).  

Um paciente entra em choque séptico quando há um alto índice de infecção, 

consequentemente, a pressão arterial cai, há desidratação, comprometendo a 

oxigenação e a distribuição adequada de suplementos aos tecidos do organismo, 

comprometendo o funcionamento de órgãos como rins, coração, pulmões e cérebro, 

cruciais à manutenção da vida (GAYNES, 2011). 

Para uma antibioticoterapia ser eficaz e adequada pode ser feita uma cultura 

de material infectado para que se identifique o agente patogênico e eliminá-lo sem 

correr o risco de induzir o desenvolvimento de cepas resistentes (GOLEMI-KOTRA 

et al., 2004; KNECHT et al., 2014).  

No tratamento com antibióticos utiliza-se, a priori, um antibiótico de amplo 

espectro e depois se adequa com antibiótico específico para a bactéria identificada 

na cultura celular, na intenção de que o microrganismo não se torne resistente aos 

fármacos de maior potência disponíveis no momento (FLEMING, 1946; BEARD et 

al., 1992; KNOX et al., 1996). 

 



32 

 

 

 

1.1.3 Resistência bacteriana e inibidores de β-lactamases 

 

A resistência evoluiu com naturalidade como em qualquer outro ser vivo. O 

antibiótico torna-se ineficaz no tratamento de doenças pelo simples fato da bactéria 

ser insistentemente exposta a estes fármacos (VU; NIKAIDO, 1985; LEWIS et al., 

1997; FISHER; MOBASHERY, 2009). 

A resistência pode ser intrínseca, sendo característica de toda uma espécie, 

ou adquirida, caracterizando-se pelas mutações ocorridas ou pela inclusão de 

material genético exógeno, proveniente de plasmídeos, sendo um fator de extrema 

preocupação, devido à possibilidade de transmissão do DNA (ácido 

desoxirribonucleico) a toda uma cepa bacteriana (LEWIS et al., 1997). 

Há mecanismos de resistência que mudam a conformação do sítio alvo da 

bactéria, fazendo com que o antibiótico não consiga acessá-lo (LAMOTTE-

BRASSEUR et al., 1994). 

Tem-se também, alterações de permeabilidade da membrana externa da 

bactéria, fazendo com que substâncias hidrofílicas sejam impossibilitadas de entrar 

na bactéria, muito comum em bactérias Gram negativo, ou seja, a membrana 

“composta por uma dupla camada assimétrica de fosfolipídios, polissacáridos e 

proteínas é uma excelente barreira, e é a primeira linha de defesa à entrada de 

agentes antimicrobianos. As porinas são proteínas que permitem a passagem de 

agentes hidrofílicos, tais como os antibióticos β-lactâmicos, e a perda de porinas 

funcionais poderão levar à resistência” (BEARD et al., 1992).  

Existe o mecanismo de bombas de efluxo, os quais são proteínas 

transmembranares com função de expelir para fora da bactéria substâncias tóxicas a 

ela, também, a inativação do antibiótico pela produção de proteínas (enzimas) que o 

degradam por hidrólise, como no caso da penicilinase, alvo de estudo deste 

trabalho, degradando o anel β-lactâmico da penicilina e de outros da sua classe de 

fármacos como os antimicrobianos (VU; NIKAIDO, 1985; KNOX et al., 1996; 

DAVIES; DAVIES, 2010). 



33 

 

 

 

Os inibidores da β-lactamases como o ácido clavulânico, tazobactam ou 

sulbactam são utilizados para ampliar o espectro das penicilinas, antimicrobiano com 

ação na síntese de peptideoglicanos da parede celular bacteriana, na ação de 

destruição dos microrganismos produtores de β-lactamase (BAPTISTA, 2013).  

Os inibidores possuem uma estrutura idêntica à penicilina, modificando 

apenas a cadeia lateral. Desta forma as β-lactamases atuam nos inibidores, 

deixando disponível o antibiótico para atuar na infecção. Dois exemplos comuns são 

a combinação da amoxicilina com o ácido clavulânico, utilizado no combate a 

infecções do trato respiratório e a piperacilina com tazobactam administrada em 

infecções do trato respiratório inferior e vias urinárias. A piperacilina com tazobactam 

são administrados em pacientes imunocomprometidos, sempre em associação com 

os aminoglicosídeos, para a profilaxia de infecções por estirpes de Pseudomona 

aeruginosa (BAPTISTA, 2013). 

 

1.1.4  Penicilinase de Bacillus cereus 

 

A penicilinase é uma subclasse das β-lactamases, pois atua principalmente 

na penicilina. β-lactamases são uma das maiores preocupações médico-

farmacêuticas nos dias atuais, sendo uma das grandes responsáveis pela 

resistência bacteriana aos antibióticos. O uso indiscriminado de antibiótico é 

responsável pela seleção de cepas bacterianas resistentes, ou seja, produtoras da 

enzima (BERTONCHELI; HÖRNER, 2008).  

As cefamicinas, carbapenêmicos e penicilina são antibióticos que apresentam 

em sua estrutura o anel β-lactâmico e são sensíveis às β-lactamases, sendo que 

apenas  as cefalosporinas apresentam  resistência relativa. A hidrólise do anel β-

lactâmico, como visto na Figura 4, leva à inativação do antibiótico, sendo que o 

ataque ocorre na ligação amida e é dependente de 1 ou 2 íons de zinco, os quais 

coordenam moléculas de água para servirem de nucleófilos. O mecanismo de 

hidrólise é complexo e como não está completamente esclarecido serviu de 

incentivo para este trabalho (BERTONCHELI; HÖRNER, 2008). 



34 

 

 

 

 

Figura 4 - Mecanismo de ação da penicilinase, abertura do anel β-lactâmico na presença de água. O 

anel beta lactâmico é colapsado (1 e 2), a ligação amida é quebrada, o nitrogênio é reduzido a N
-
 (3) 

e retira-se o hidrogênio da água (4).  

 

N

SR
1

O

O
OH

CH3

CH3

enzima+Zn+H-OH

NH

SR
1

O

O
OH

CH3

CH3

OH

enzima+Zn
 

 

Fonte: Adaptado de Bertoncheli e Hörner (2008) e Prado (2012). 

 

A penicilinase de Bacillus cereus, utilizada neste trabalho de doutoramento, é 

uma metalo-β-lactamase (MβL), Figura 5, que possui um ou dois íons de zinco no 

sítio ativo, uma constante de Michaelis-Menten (𝐾𝑚) de aproximadamente 60 µmol  

L-1 (para enzima imobilizada e analisada por espectrofometria modificada (KLEMES; 

CITRI, 1979) e um peso molecular de 28 kDa (PLACZEK, 2017). 

+ H-OH 

1 

2 

3 

4 



35 

 

 

 

Figura 5 - Estrutura da metalo-β-lactamase (2M5C.pdb) de Bacillus cereus, em tampão fosfato (PBS), 

pH 7, com dois íons zinco em seu sítio ativo. 

 

Fonte: adaptado de Karsisiotis et al. (2013). 

 

1.2 Métodos eletroquímicos 

 

Luigi Galvani, um médico, físico, pesquisador e filósofo italiano foi professor 

de anatomia na Universidade de Bolonha, no séc. XVIII. Foi o primeiro estudioso da 

bioeletricidade e eletroquímica, baseado nos padrões elétricos do sistema nervoso, 

um enigma para a pesquisa científica até os dias de hoje (CAFIERO, 1959). 

Sua pesquisa não conseguiu desvincular a biologia da física, mas serviu de 

incentivo para outros, como Alessandro Volta, que usou os achados científicos de 



36 

 

 

 

Galvani para construir a primeira bateria elétrica, ou pilha voltáica (BERETTA ; 

GRANDIN, 2001). 

A Eletroquímica é uma área da físico-química que estuda as reações que 

envolvem transferência de elétrons e seus fenômenos associados por meio de um 

dispositivo chamado célula eletroquímica pelo qual ocorrem reações de oxirredução 

para produzir interconversão de energia química em elétrica. É uma ferramenta 

poderosa para desenvolvimento de métodos de diagnóstico mais acurados 

(BERETTA; GRANDIN, 2001; PARENT, 2004). 

A Eletroquímica serviu para estudar a transferência de cargas envolvidas na 

reação da penicilinase, uma hidrolase, que apresentou caráter redox, servindo de 

incentivo para este trabalho de doutorado, para saber de onde ocorre a transferência 

de elétrons envolvidos na reação catalítica da enzima com seu substrato. 

 

1.3 Simulação molecular 

 

A modelagem molecular é uma técnica computacional, interdisciplinar, devido 

o foco da abordagem a ser pesquisada, que mimetiza o comportamento de 

moléculas. Segundo definição da IUPAC, a modelagem molecular “é a investigação 

das estruturas e das propriedades moleculares pelo uso de química computacional e 

técnicas de visualização gráfica, visando fornecer uma representação tridimensional, 

sob um dado conjunto de circunstâncias”, auxiliando na compreensão de processos 

químicos, físicos e biológicos. Uma ferramenta atuante na construção da 

nanotecnologia, pois propicia o desenvolvimento de máquinas completas a nível 

atômico-molecular (CARVALHO et al., 2003). 

Buscou-se um modelo baseado nas leis da mecânica clássica (conhecido por 

Mecânica Molecular (MM) ou campos de força), no intuito de observar quão estável 

é a interação que ocorre entre a enzima e seu cofator metálico. Para isto, foram 

criados modelos simplificados, que fornecem uma descrição razoável do sistema, 

pois não há quebra/formação de ligações químicas, sendo adequado ao processo 

de interação da enzima com o cofator, permitindo a compreensão e predição de uma 

variedade de fenômenos, por exemplo, localização espacial do cofator na enzima, a 



37 

 

 

 

estabilidade desta interação, se de alguma forma há modificação na estrutura da 

enzima e como ocorre a reação com o substrato no sítio ativo (JONES et al., 1997). 

Entretanto, a mecânica molecular (MM), é dependente de parâmetros, 

escolha de campo de força adequado, porém pode ser realizada para modelos 

moleculares maiores, pois trabalha com reducionismo, assumindo os átomos, como 

pontos carregados, necessitando de parametrização das interações e forças 

envolvidas entre os pontos, ou seja, campos de força. Para se ter conhecimento da 

estrutura eletrônica se faz necessário o uso da mecânica  quântica (QM) (JONES et 

al., 1997; SERWAY; JEWETT, 2007). 

A QM, como a MM, é um ramo de física, porém que assume os átomos como 

prótons e elétrons interagentes, assumindo a energia envolvida como ondas 

eletromagnéticas distribuídas em pacotes, remetendo a necessidade de descrição 

eletrônica do sistema, em fenômenos ocorridos na ordem de femtosegundos (10-15 

segundos) (SERWAY; JEWETT, 2007). 

A modelagem molecular traz à luz do conhecimento propriedades 

microscópicas do sistema estudado, o que experimentalmente não é possível. 

Sendo uma excelente ferramenta na rotina de grupos de pesquisa atuantes no 

desenvolvimento e inovação tecnológica, i.e. na pesquisa  de novos fármacos, 

desenvolvimento de ferramentas de diagnóstico mais acurados, entre outros 

(COVENEY; FOWLER, 2005). 

 

 

 

 

 

 

 



38 

 

 

 

2 OBJETIVOS 

 

O objetivo principal deste trabalho foi o entendimento dos processos 

enzimáticos sob a influência do meio e de um potencial aplicado, ou seja, reações 

enzimáticas assistidas por densidade eletrônica de um eletrodo. 

 A impedância eletroquímica (EIE) e a voltametria cíclica (VC) foram as 

técnicas eletroquímicas usadas para estudar a influência das variáveis (cofator, 

potencial aplicado, entre outras) no sinal obtido e entendimento do mecanismo de 

reação. 

A enzima estudada, necessariamente, precisava apresentar caráter redox. 

Entretanto, optou-se por uma hidrolase, a penicilinase, a qual apresentou 

características oxirredutivas.  

Os mecanismos de operação e detecção foram estudados a nível 

atômico/molecular por modelagem computacional, ou seja, mecânica quântica (QM) 

e mecânica molecular (MM) para esclarecer os resultados obtidos 

experimentalmente. 

 

 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
  



39 

 

 

 

3 MATERIAIS E MÉTODOS 

 

3.1 Parte experimental 

 

Tabela 1 - Reagentes utilizados, fornecedores e sua aplicação neste trabalho. 

Produto Procedência Finalidade 

Aluminas (diâmetros de 1; 0,3; 

0,05 µm) 

Buehler Polimento mecânico dos 

eletrodos de ouro da 

METROHM 

Etanol ultrapuro Sigma Limpeza do eletrodo 

Ácido Sulfúrico concentrado 

(95-98%) 

Quemis Solução aquosa 0,5 M para 

limpeza eletroquímica dos 

eletrodos 

N-hidroxisuccinimida (NHS) 

1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil)-

carbodiimida (EDC) 

Sigma  

Fluka 

Ativação da superfície 

carboxílica da SAM (obtenção 

de éster) para ancoragem da 

espécie receptora 

Hidróxido de sódio (NaOH) Sigma Solução aquosa 0,5 M para 

dessorção eletroquímica para 

limpeza do eletrodo de ouro 

Cloreto de sódio (NaCl) 

Nitrato de sódio (NaNO3) 

Cloreto de potássio (KCl) 

Monohidrogenofosfato de sódio 

dodecahidratado 

(Na2HPO4.12H2O) 

Dihidrogenofosfato de potássio 

(KH2PO4) 

Sigma 

Sigma 

J. T. Baker 

Sigma 

 

 

Sigma 

Tampão fostato salino (PBS), 

0,1 M, pH 7,4 

Penicillinase de Bacillus cereus Sigma Tornar o eletrodo sensível à 

penicilina G 

Penicilina G Sigma Substrato para reação com a 

penicilinase 



40 

 

 

 

Cloreto de zinco (ZnCl2) 

Cloreto de cobalto (CoCl2) 

 

Sigma 

Sigma 

Cofator enzimático 

L-cisteína Sigma Formação da SAM 

Ferricianeto de potássio 

Ferrocianeto de potássio tri-

hidratado 

Nitrato de potássio (KNO3) 

Sigma 

Sigma 

 

Sigma 

Solução de ferri/ferro 

 

Todos solutos apresentados na Tabela 1 apresentam grau analítico. 

As soluções aquosas foram preparadas com água ultra pura obtida com 

resistividade não menor que 18 MΩ cm-2 a 25°C utilizando um sistema Milli-Q® 

Millipore Simplicity.  

O tampão fosfato salino (PBS), pH 7,4, utilizado possui a composição a 

seguir: NaCl, 137 mmol L-1, KCl, 2,7 mmol L-1; Na2HPO4.12H2O, 10 mmol L-1; 

KH2PO4, 2 mmol L-1. O mesmo foi conservado em geladeira. 

A penicilinase classe B de Bacillus cereus utilizada, também fornecida pela 

Sigma-Aldrich®, é composta de uma mistura de β-lactamase I e β-lactamase II. 

As medidas de pH foram realizadas utilizando o peagâmetro da ION modelo 

pHB500, que era calibrado imediatamente antes do uso. 

 As medidas eletroquímicas foram conduzidas no potenciostato da AUTOLAB 

(PGSTAT302N), controlado pelo software NOVA. O sistema de medidas se baseou 

na configuração de três eletrodos, sendo o eletrodo de ouro (2,0 mm de diâmetro e 

área de 0,03142 cm2) obtido da METROHM, uma placa de platina como contra-

eletrodo e eletrodo de Ag/AgCl (KCl saturado) como eletrodo de referência. Todos 

os potenciais descritos neste texto são relativos ao eletrodo Ag/AgCl (KCl saturado). 

A penicilinase comprada da empresa Sigma-Aldrich, vem do fabricante sem 

cofator na sua estrutura, fazendo com que o mesmo fosse colocado por dopagem do 



41 

 

 

 

eletrodo com solução contendo certa concentração de cofator, o que gerou a 

problemática para certificação de que o cofator iria se acoplar/alojar na região 

correta para ativação da apoenzima e qual concentração seria apropriada para 

garantir a saturação da enzima, o que trouxe a necessidade de cálculos de 

modelagem computacional para investigação da estrutura e comportamento da 

enzima frente ao cofator. (CARVALHO et al., 2003).  

  

3.1.1 Análises Eletroquímicas 

 

Utilizou-se solução de tampão fosfato salino, a 0,1 mol L-1, pH 7,4 como 

eletrólito suporte da reação, para garantir a não denaturação da proteína adsorvida 

na superfície do eletrodo e reproduzir as condições de um meio biológico.  

Como dito pelo próprio nome, as monocamadas automontadas (SAMs) 

consistem numa única camada molecular que se adsorve espontaneamente sobre 

uma superfície metálica, no caso o eletrodo de ouro, e torna-o susceptível a uma 

variedade de aplicações, inclusive a de estudo do mecanismo de reação enzimática 

quando se tem uma enzima redox acoplada/imobilizada a SAM (GONÇALVES et al., 

2014).  

Uma técnica eletroquímica importante utilizada na caracterização das SAMs é 

a voltametria cíclica (VC), pois se obtêm, rapidamente, informações qualitativas 

sobre as reações que estão a ocorrer no eletrodo funcionalizado. Muito utilizada 

para caracterização dos sistemas eletroquímicos, a VC consiste em observar a 

corrente que flui pelo eletrodo de interesse enquanto se aplica um potencial, variado 

linearmente em relação ao eletrodo de referência, sendo que o gráfico obtido é 

dependente da concentração de eletrólito na solução e da velocidade de varredura 

(SPATARU et al., 1996).  

Medidas de Espectroscopia de Impedância Eletroquímica (EIE) foram 

realizadas para observar as variações na catálise enzimática sob influência de 

potencial aplicado, e relacionar a uma possível eletrocatálise.  



42 

 

 

 

Todas as medidas apresentadas neste trabalho são médias de, no mínimo, 

triplicatas. 

 

3.1.1.1 Voltametria cíclica (VC) 

 

A VC é uma técnica eletroquímica importante utilizada na caracterização da 

superfície funcionalizada, pois se obtêm, rapidamente, informações sobre os 

processos redox, da cinética de reações heterogêneas de transferência de elétrons 

e sobre reações químicas acopladas a processos adsortivos (WANG et al., 2000).  

A técnica consiste em observar a corrente que flui pelo eletrodo de interesse 

enquanto se aplica um potencial, variado linearmente em relação ao eletrodo de 

referência, sendo que o gráfico obtido é dependente da concentração de eletrólito na 

solução e da velocidade de varredura (VAN BENSCHOTEN et al., 1983; SPATARU 

et al., 1996).  

Duas componentes são fundamentais para determinar as reações que estão 

acontecendo no eletrodo, a difusão de massa do analito em solução para superfície 

do eletrodo e a transferência heterogênea de carga entre o analito e o eletrodo, 

podendo haver reações químicas acopladas a um destes processos, podendo ser 

resumido a equação de Nernst, quando a reação é reversível, apenas a 

transferência de massa ditará a corrente do pico, em amperes, conforme Equação 1: 

 

𝑖𝑝𝑐 = (2,69 105) 𝑛
2

3 𝐴𝐷0

1

2 𝑣
1

2 𝐶0  (Eq.1) 

 

onde, 𝑛 é o número de elétrons envolvidos no processo, 𝐴 é a área do eletrodo 

(cm2), 𝐷0 é o coeficiente de difusão (cm2 s-1), 𝐶0 é a concentração da espécie em 

solução (mol cm-3) e 𝑣 é a velocidade de varredura (V s-1) (PACHECO et al., 2013). 

 



43 

 

 

 

3.1.1.2 Espectroscopia de Impedância Eletroquímica (EIE) 

 

A EIE é uma técnica muito difundida no meio de pesquisa para estudos 

fundamentais e também para o desenvolvimento de novas técnicas para diagnóstico 

clínico baseado em análises por transferência de elétrons entre eletrodo e o meio 

(amostra clínica, por exemplo) (CARVALHO et al., 2006).  

A EIE baseia-se na razão entre um potencial alternado (de pequena dimensão 

– apenas perturbativo) aplicado e a medida da corrente de resposta a este potencial. 

As medidas são realizadas em uma faixa de frequências (método espectroscópico), 

de forma que diferentes processos físicos e químicos possam ser separados por 

suas constantes de tempo ou pelo seu tempo próprio de resposta permitindo obter 

parâmetros como a resistência da solução ( 𝑅𝑠 ), a resistência transferência de 

elétrons do eletrodo para a solução (𝑅𝑐𝑡) e a capacitância da dupla camada elétrica 

(𝐶𝑑𝑙), por exemplo. A impedância obtida é uma função complexa definida a partir das 

suas componentes real, 𝑍’ , e imaginária, −𝑍”  (LASIA, 1995; CARVALHO et al., 

2006).  

De forma geral, a EIE é usada para se obter informações sobre as 

propriedades da reatividade de interfaces (proteínas/substrato) como é o caso de 

proteínas adsorvidas na superfície de eletrodos. A EIE utiliza sinais muito pequenos 

de perturbação que não comprometem as propriedades da superfície funcionalizada 

pela metaloenzima (ensaio não destrutivo), tornando possível estudar as reações de 

oxirredução de forma consistente e em função de mudanças periódicas do campo 

externo (LASIA, 1995; CARVALHO et al., 2006; FERNANDES et al., 2014; 

FERNANDES et al., 2015). 

Define-se a Impedância Eletroquímica (𝑍 ), como a razão obtida entre o 

potencial alternado aplicado (𝐸 (𝑡)) e a corrente obtida em função desta perturbação 

(𝑖 (𝑡)), Equação 2. 

 

𝑍 =  
𝐸(𝑡)

𝑖(𝑡)
  (Eq. 2) 



44 

 

 

 

 

 À medida que se varia a frequência (𝑓) em que se aplica o 𝐸 (𝑡) , são 

revelados os mecanismos eletroquímicos (pois se revela a escala de tempo de 

diferentes processos) que podem ser modelados por elementos de circuito (como 

resistores e capacitores). Os resultados obtidos podem ser plotados em gráficos do 

tipo Nyquist, os quais relacionam cartesianamente a componente da impedância real 

(𝑍′)  com a componente da impedância imaginária (−𝑍")  (BARD et al., 1980; 

BUENO et al., 2013) 

É comum utilizar um circuito elétrico equivalente, com elementos de circuito 

para se modelar a resposta dos espectros de impedância construídos a partir das 

variáveis complexas 𝑍’ e −𝑍”. A representação mais comum do espectro é o de 

Nyquist e o circuito equivalente normalmente mais utilizado em eletroquímica é 

chamado de circuito de Randles, onde para sistemas mais simples (interface metal-

eletrólito) o elemento com “característica” redox fica livre em solução e em contato 

direto com a superfície metálica com a qual troca elétrons. Este circuito é composto 

de elementos como 𝑅𝑠  (resistência da solução eletrolítica), 𝑅𝑐𝑡  (resistência à 

transferência de cargas, indicando reação de oxirredução), 𝐶𝑑𝑙  (capacitância da 

dupla camada) e 𝑍𝑤  (impedância de Warburg) para descrever as características 

físicas da interface eletroquímica. O modelo de circuito de Randles é mostrado na 

Figura 6 (a). O sistema de interface eletroquímica com monocamada dielétrica 

(SAM) é um sistema mais complexo, e as propriedades dielétricas da SAM são 

importantes uma vez que impedem o contato direto do par redox em solução com o 

eletrodo metálico. Além disso, no caso específico deste trabalho tem-se a enzima e 

o seu cofator adsorvidos na superfície do eletrodo, ambos suportados em uma SAM 

que bloqueia o contato direto (existindo então uma transferência de elétrons não-

adiabática)  (CARVALHO et al., 2006; BUENO et al., 2013).  

 

 

 



45 

 

 

 

Figura 6 - Circuito elétrico equivalente, do tipo Randles (a), com diagrama de Nyquist (b). Onde 𝑹𝒔 é 

resistência de solução, 𝑪𝒅𝒍 é capacitância da dupla camada elétrica, 𝑹𝒄𝒕 é resistência a transferência 

de cargas, 𝒁𝒘 é Impedância de Warburg,  −𝒁” é impedância imaginária e 𝒁’ é a impedância real. O 

diagrama (1) apresenta menor 𝑹𝒄𝒕 que o (2).  

 

Rs Rct

-Z
’’ 

(
)



frequência (Hz)
diminui 

Z’ ( )

(1) (2)

ZW

R
s

Rct

C
dl

 

Fonte: Adaptado de  Carvalho et al. (2006). 

 

A adição de elementos ao circuito elétrico equivalente tem que ser criteriosa 

para que os resultados sejam compatíveis com os fenômenos físicos e químicos que 

acontecem na interface eletrodo/solução. 

 

 

3.1.2 Protocolo de limpeza da superfície de ouro 

 

O eletrodo de trabalho foi composto de ouro (Au) e antes de ser 

funcionalizado necessita de um pré-tratamento, sendo que o protocolo utilizado no 



46 

 

 

 

grupo Nanobionics,  consistiu no polimento mecânico com pasta de alumina de 

diferentes granulometrias (1 μm, 0,3 μm e 0,05 μm, respectivamente nesta ordem). 

No intervalo de cada polimento, o eletrodo era exaustivamente lavado com água e 

sonicado em água ultrapura por 5 min para retirar partículas adsorvidas. 

Em seguida, fez-se uma dessorção eletroquímica com 1 mmol L-1 de NaOH 

(preparado em água ultra pura MilliQ®), por voltametria cíclica (VC), -0,7 V a -1,7 V 

versus Ag/AgCl KCl saturado, com velocidade de varredura de 0,1 V s-1, 100 ciclos. 

Posteriormente, o eletrodo foi sonicado em etanol ultrapuro por 15 min e 

tratado eletroquimicamente, também chamada de limpeza eletroquímica. Este 

tratamento consiste em realizar VC em solução de ácido sulfúrico (H2SO4) 0,1 mol 

L1, com varredura de -0,2 V a 1,5 V versus Ag/AgCl KCl saturado, 25 ciclos a uma 

velocidade de varredura de 0,1 V s-1, Figura 10. 

Neste trabalho, definiu-se um intervalo de fator de rugosidade (Fr) entre 1 e 

1,3 para que a área ativa (Aativa) do eletrodo esteja o mais próximo da área 

geométrica, ou seja, quanto mais próximo de 1, o fator de rugosidade, mais lisa a 

superfície.  

Para obter o valor do Fr, integra-se o pico da corrente catódica, obtido na VC, 

destacado na Figura 7, para obtenção da área ativa do eletrodo, sendo de 

conhecimento que esta área é proporcional a quantidade total de carga, pode-se 

dividi-la pela constante de 400 μC cm-2, resultando na área ativa de 0,0395 cm2.  A 

relação área ativa pela área geométrica nos remete ao fator de rugosidade, que no 

caso foi de 1,25 (SPATARU et al., 1996; TKAC; DAVIS, 2008). 

 

 

 

 

 

 



47 

 

 

 

Figura 7 - Voltamograma cíclico obtido da limpeza eletroquímica. 

-0,5 0,0 0,5 1,0 1,5

-20

-10

0

10

i 
(



E (V)
 

 

 

 

 

3.1.3 Funcionalização do eletrodo 

 

A superfície do eletrodo de ouro começa a ser funcionalizada com a adsorção 

da L-cisteína (10 mmol L-1), aplicando-se uma solução do aminoácido em PBS, pH 

7,4, sobre a superfície por 12 h formando uma SAM (monocamada automontada). 

Após lavagem em PBS e em seguida em água ultra pura, foi seco e 

mergulhado numa solução aquosa de EDC (10 mmol L-1) e NHS (20 mmol L-1), por 2 

h, utilizada para ativar o grupamento carboxílico da L-cisteína. 

O eletrodo foi lavado com água ultra pura e imerso em solução contendo a 

enzima que o funcionalizará em concentração de 0,15 mg mL-1, em PBS, por 2 h. 



48 

 

 

 

No caso da penicilinase, após as 2 h, retira-se o eletrodo, que foi lavado como 

no passo anterior e na sequência imerso em uma solução que contém o cofator para 

ativação da enzima.  

Cada processo de acoplamento foi avaliado por voltametria cíclica com o seu 

respectivo analito para garantir que a reação não ocorresse de outra forma que não 

fosse pela atividade enzimática.  

 

3.2 Parte teórica 

 

Com a finalidade de esclarecer o comportamento mecanístico da enzima 

penicilinase e confrontar com dados obtidos experimentalmente, optou-se pelo uso 

de ferramentas de bioinformática amparadas pelos resultados eletroquímicos obtidos 

neste estudo. A modelagem subdivide-se em modelagem clássica e modelagem 

quântica. 

 

3.2.1 Modelagem clássica 

 

3.2.1.1 Mecânica Molecular (MM) ou Campos de Força  

 

Modelos simplificados podem fornecer uma descrição razoável do sistema e 

permitem obter muitas informações de interesse. Modelos baseados nas leis da 

mecânica clássica (conhecidos por Mecânica Molecular ou Campos de Força) 

permitem simulações de sistemas compostos por alguns milhares de átomos 

eficientemente, e são particularmente adequados em processos onde não há 

quebra/formação de ligações químicas ou excitações eletrônicas, ou seja, não 

requerem descrição quântica do sistema. Por estas razões, estes têm sido o método 

de escolha na comunidade científica para estudar diversos sistemas biomoleculares 

(SMITH et al., 2012).   



49 

 

 

 

A descrição dos campos de força ignora a dinâmica eletrônica e calcula a 

energia do sistema apenas como uma função das coordenadas nucleares. Portanto, 

a aplicabilidade dos campos de força tem base em algumas suposições.  A principal 

é a validade da aproximação de Born-Oppenheimer, que permite definir a energia 

potencial do sistema em função das coordenadas nucleares (a superfície de energia 

potencial). Geralmente, a forma da função energia potencial, em função das 

posições dos N átomos no sistema, é dada pela Equação 3:  

 

U = ∑ klig (r − r0)
2

lig + ∑ kang (θ − θ0)
2

ang − ∑ Vn torções [1 + cos(nτ − φ)] +

 ∑ ∑ (
Aij

rij
12 −

Bij

rij
6 +

qiqj

rij
ji )    (Eq. 3) 

 

caracterizada pelos seguintes termos, respectivamente:  

1) Estiramento e deformação angular de ligação: A energia potencial é 

representada pela lei de Hooke, como uma expansão da verdadeira energia 

potencial em torno de uma posição de equilíbrio da mesma, onde a primeira 

contribuição é quadrática. Na equação acima, 𝑟0 é a distância de equilíbrio da 

particular ligação considerada e 𝑘𝑙𝑖𝑔 representa a constante de força do oscilador, 

assim como a contribuição de cada ângulo é caracterizada por um valor de 

referência 𝜃0 e uma constante de força 𝑘𝑎𝑛𝑔. As constantes de força são derivadas 

principalmente de dados espectroscópicos e de cálculos ab-initio em sistemas-

modelo. Como foi dito, o verdadeiro potencial não é harmônico (somente para 

pequenos deslocamentos em torno da posição de equilíbrio) e, portanto, não permite 

a modelagem de processos envolvendo rearranjo de ligações químicas, como já 

mencionado (HU et al., 2013; PRATT et al., 2015). 

2) Torção de ligações: O terceiro termo corresponde à energia de torção dos 

ângulos diedrais (definidos por ligações entre 4 átomos), onde 𝑉𝑛 é usualmente a 

altura da barreira de rotação, da mesma maneira que se faz em estudos de análise 

conformacional de alcanos. Contudo, há outros termos que contribuem para a 

barreira, como será visto a seguir. 𝑛 é a multiplicidade e seu valor dá o número de 



50 

 

 

 

pontos de mínimo de energia em função do ângulo diedro, variado entre 0 e 360° e 

𝜑 é a fase angular (HU et al., 2013; PRATT et al., 2015). 

3) Interações de VDW e eletrostática: Moléculas e átomos independentes 

interagem através de forças não-ligadas, as quais não dependem de nenhuma 

relação específica entre átomos. Estas constituem interações dependentes da 

posição, inversamente proporcionais a certa potência da distância. Usualmente são 

divididos em dois grandes grupos: interações eletrostática e de van der Waals 

(VDW).  A interação eletrostática é modelada da seguinte maneira: a cada um dos 

átomos é atribuída uma carga, normalmente retirada de ajustes, por análise 

populacional em cálculos ab-initio, de modo a reproduzir o potencial eletrostático do 

cálculo com o mínimo de erro, e utiliza-se a lei de Coulomb para o cálculo da 

energia eletrostática do sistema de cargas pontuais.  É claro que a eletrostática não 

leva em conta todas as interações não-ligadas. Sabe-se que num simples sistema 

composto por um par de dipolos oscilantes, a teoria de perturbação de segunda 

ordem resulta numa energia de interação inversamente proporcional à sexta 

potência da distância, que é a interação de van der Waals. Tal interação é modelada 

via a função 6-12 de Lennard-Jones (um potencial atrativo na sexta potência do 

inverso da distância e repulsivo a 12ª potência, que é a repulsão a curta distância 

entre os átomos). Os parâmetros ajustáveis são tabelados para cada átomo, a 

saber, a distância entre os átomos 𝑖 e 𝑗 no qual a energia de VDW é mínima, 𝑅𝑖𝑗
∗ , e a 

energia mínima 휀𝑖𝑗 , e são usados nos coeficientes do termo de VDW: 𝑅𝑖𝑗
∗ =

(𝑅𝑖
∗ + 𝑅𝑗

∗)  e 휀𝑖𝑗 = √휀𝑖휀𝑗 ,  e 𝐴𝑖𝑗 = 휀𝑖𝑗(𝑅𝑖𝑗
∗ )12 e  𝐵𝑖𝑗 = 2휀𝑖𝑗(𝑅𝑖𝑗

∗ )6 . Os potenciais de 

Lennard-Jones permitem, portanto, a descrição de interações repulsivas de curto 

alcance e atrativas dispersivas de longo alcance (HU et al., 2013; PRATT et al., 

2015). 

Os parâmetros obtidos a partir dos modelos, possibilitaram a criação de 

vários campos de força que permitem a descrição de diversos fenômenos. Neste 

trabalho, utilizou-se do AMBER99SB, conjunto de parâmetros utilizados para proteínas, 

para compreensão dos fenômenos estudados (SMITH et al., 2015; SOMAVARAPU; 

KEPP, 2015). 

Simplificações ainda são possíveis para diminuir o custo de cálculo. Sendo 

que o maior esforço está no cálculo da energia de interação entre átomos não-



51 

 

 

 

ligados, visto que estes escalam em 𝑁2, quando comparados a termos ligados, que 

escalam linearmente com o número 𝑁 de átomos do sistema. Ou seja, é possível 

que se calcule a interação num raio de corte entre átomos, apenas se recomenda 

que o raio não seja menor que 10Å. Mas, ainda assim, é necessário calcular a 

distância entre todos pares de átomos para saber se estão ou não na região de 

corte, o que custa tanto quanto calcular a energia. Para esse fim é criada uma lista 

de vizinhos, que armazena, para cada átomo, todos os átomos vizinhos dentro da 

distância de corte e os átomos ligeiramente fora da região. Os vizinhos são então 

fixados e atualizados a intervalos regulares durante a simulação, tipicamente, a cada 

20 femtosegundos (HU et al., 2013; PRATT et al., 2015). 

 

3.2.1.2 Dinâmica Molecular  

 

Uma das técnicas mais usadas na simulação e compreensão de sistemas 

complexos moleculares e suas propriedades é a chamada dinâmica molecular. A 

dinâmica molecular calcula  a dinâmica real do sistema, ou seja, calcula a evolução 

de determinado sistema no tempo, através de equações que traduzam leis de 

movimento, permitindo o cálculo de médias temporais, sobre a trajetória gerada, de 

propriedades físicas do sistema. No caso utiliza-se a segunda lei de Newton dada 

pelo conjunto de equações diferenciais, Equação 4: 

 

𝑚𝑖
𝑑2𝑟𝑖⃑⃑⃑  (𝑡)

𝑑𝑡2 = −∇U[𝑟1⃑⃑⃑  (𝑡), 𝑟2⃑⃑  ⃑(𝑡),… 𝑟𝑛⃑⃑  ⃑(𝑡)] para i =0,1,2, ...N  (Eq. 4) 

 

Pode-se notar que o potencial (seja ele clássico ou quântico) é função da 

posição de todas as partículas e as equações diferenciais são acopladas. Trata-se 

de um problema de muitos corpos extremamente difícil de resolver analiticamente. 

Na prática, a equação é resolvida pelo método do elemento finito, ou seja, o tempo é 

discretizado em intervalos ∆𝑡  finitos (consequentemente a trajetória também é 

discreta) e a equação é integrada numericamente. Dada uma posição inicial 

qualquer e as velocidades iniciais, calcula-se as forças que agem nos mesmos (e 



52 

 

 

 

portanto a aceleração) e calcula-se a próxima posição, como uma aproximação em 

série de Taylor, Equação 5:    

 

𝑟  (𝑡 + 𝛿𝑡) =  𝑟  (𝑡) + 𝛿𝑡𝑣 (𝑡)  +  
1

2
𝛿𝑡2𝑎 (𝑡) + ⋯   (Eq. 5) 

 

onde pode-se truncar a expansão até a ordem desejada. Combinando-se estas 

equações, pode-se ainda eliminar a dependência de certas variáveis e até mesmo 

diminuir a ordem do erro cometido no truncamento da expansão. O algoritmo 

integrador de Verlet (VERLET, 1967; 1968) é um dos mais usados para este fim e 

consiste na obtenção das posições e novas acelerações sem uma dependência 

direta da velocidade, através da soma das duas expansões, Equações 6 e 7:  

 

𝑟  (𝑡 + 𝛿𝑡) =  𝑟  (𝑡) + 𝛿𝑡𝑣 (𝑡)  +  
1

2
𝛿𝑡2𝑎 (𝑡) +

1

6
𝛿𝑡3�⃑� (𝑡) + 𝑂 (𝛿𝑡4)  (Eq. 6) 

 

𝑟  (𝑡 − 𝛿𝑡) =  𝑟  (𝑡) − 𝛿𝑡𝑣 (𝑡)  +  
1

2
𝛿𝑡2𝑎 (𝑡) −

1

6
𝛿𝑡3�⃑� (𝑡) + 𝑂 (𝛿𝑡4)  (Eq. 7) 

 

resultando na Equação 8: 

 

𝑟  (𝑡 + 𝛿𝑡) =  2𝑟  (𝑡) − 𝑟 (𝑡 − 𝛿𝑡)  + 𝛿𝑡2𝑎 (𝑡) + 𝑂 (𝛿𝑡4)  (Eq. 8) 

 

Existem outros algoritmos integradores como o algoritmo leap-frog (Verlet 

modificado, onde usa-se a metade do passo no tempo) ou até mesmo outros mais 

precisos, com esquemas de extrapolação, como os algoritmos Preditores-Corretores 

(VERLET, 1967; 1968). O passo de integração é algo a ser também discutido neste 

ponto. Usualmente, utiliza-se o que seria 1/10 do período de movimento mais curto 

de certo átomo, como a frequência de estiramento das ligações químicas 

(especialmente as que envolvem átomos de hidrogênio, que oscilam com período de 

10 fs). Como as vezes essa é uma restrição muito severa (muitas vezes é 

necessária uma dinâmica mais longa), há outras estratégias, como o uso de 



53 

 

 

 

vínculos nestas ligações (há vários algoritmos para esse fim) ou usar átomos de 

deutério no lugar de hidrogênio. 

Muitas vezes deseja-se realizar as simulações levando em conta a 

contribuição do ambiente, onde o sistema se encontra à pressão ou temperatura 

constante, como no estudo de reações químicas, transição de fase, etc. A 

temperatura está diretamente relacionada com a energia cinética média do sistema. 

Certos algoritmos, chamados de termostatos, podem, portanto, simular o sistema a 

uma certa temperatura constante, re-escalando a velocidade das partículas, como o 

caso do termostato de Berendsen (SCHROËN et al., 2002). Neste, as velocidades 

são diretamente modificadas a cada passo, de tal maneira que, Equação 9: 

 

𝑑𝑇(𝑡)

𝑑𝑡
=

1

𝜏
 [𝑇𝑒𝑥𝑡 − 𝑇(𝑡)]  (Eq. 9) 

 

𝜏 é o parâmetro que determina o acoplamento entre o sistema e o banho térmico. O 

fator de escalonamento das velocidades é dado pela Equação 10: 

 

𝜆 = 1 + 
𝛿𝑡

𝜏
[
𝑇𝑒𝑥𝑡

𝑇(𝑡)
− 1]   (Eq. 10) 

 

Embora seja simples de se implementar, garanta a conservação do momento 

total e a execução não seja muito dispendiosa, há o problema de que este não gera 

uma distribuição verdadeiramente canônica, ou mesmo às vezes, ergódica. Existem 

outros algoritmos que levam em conta o reservatório térmico, explicitamente, na 

equação de movimento, como um grau de liberdade adicional que evolui no tempo, 

como o algoritmo de Nosé-Hoover (NOSÉ, 1984; EVANS ; HOLIAN, 1985; BUSSI et 

al., 2009), onde as equações de movimento agora se escrevem, conforme Equações 

11, 12 e 13: 

   

𝑑𝑟(𝑡)

𝑑𝑡
= 𝑣(𝑡)   (Eq. 11) 

 



54 

 

 

 

𝑑𝑣(𝑡)

𝑑𝑡
= 

𝑓(𝑡)

𝑚
−  𝜒(𝑡)𝑣(𝑡)  (Eq. 12) 

 

𝑑𝜒(𝑡)

𝑑𝑡
=

1

𝜏𝑇
2 (

𝑇

𝑇𝑒𝑥𝑡
− 1)   (Eq. 13) 

 

onde 𝜏𝑇 é uma constante de tempo com o mesmo papel da constante no algoritmo 

de Berendsen, porém o parâmetro de fricção agora obedece a uma equação 

diferencial de primeira ordem no tempo, e pode-se mostrar que este algoritmo gera 

uma distribuição genuinamente canônica em tempos suficientemente longos. 

 

3.2.2 Modelagem quântica 

 

3.2.2.1 Mecânica Quântica (QM) 

 

A Mecânica Quântica estuda eventos que ocorrem a nível atômico e sub 

atômicos, ou seja, consiste em perscrutar um sistema em que há transferência de 

energia e/ou elétrons entre compostos. Neste trabalho, serviu para entendimento 

mecanístico da reação específica da enzima com substrato (TAYLOR, 1976). 

A Física Quântica teve seu início com os estudos de Max Planck, no fim do 

século XIX, o qual teorizou que cada átomo só poderia trocar pacotes discretos de 

energia (PLANCK, 1959). 

Planck teve sua teoria seguida por outros cientistas, como Albert Einstein, 

que foi o primeiro a utilizar o termo quantum para a constante de Planck, visto na  

equação de Bohr, Equação 14 (LANCZOS, 1974; KARLSSON, 2001),  

 

𝐸 = ℎ𝑣  (Eq. 14) 

 

onde 𝐸  é a energia do fóton, ℎ é a constante de Planck (6,62x10-34 J.s) e 𝑣  é a 

frequência de radiação, em um estudo, de 1905, onde desenvolveu o conceito de 

fóton. O termo relaciona-se com quantização de energia, isto é, o elétron passa de 



55 

 

 

 

um nível a outro, mas sem passar por intermediários, ou seja, realiza saltos 

energéticos (MILLER, 1981). 

Em 1926, Werner Heisenberg, um físico alemão, criou a teoria do “Princípio 

da Incerteza”, a qual dizia que não se pode determinar simultaneamente, com 

absoluta exatidão, a velocidade e a posição de um elétron num átomo. Surgindo 

então o conceito de orbital, regiões ao redor do núcleo do átomo, nas quais a 

probabilidade de se encontrar um elétron é máxima. Assim, em 1927, o físico teórico 

austríaco Erwin Schrödinger, descreveu o movimento do elétron ao redor do núcleo 

atômico por intermédio de equações matemáticas que relacionam a natureza dual 

da partícula-onda, a carga, a energia, e a massa do elétron. Caracterizando a nuvem 

eletrônica ao relacionar a velocidade do elétron movimentando-se no espaço 

(orbital) (PLOTNITSKY, 2010). 

 

3.2.2.2 Equação de Schrödinger 

 

Qualquer aproximação para estudar sistemas atômicos e moleculares a partir 

de primeiros princípios deve ser baseada na teoria que descreve o comportamento 

microscópico de partículas, ou seja, a mecânica quântica. Basicamente, isto consiste 

em resolver a equação de Schrödinger independente do tempo, Equação 15: 

 

Ĥ𝜓 = 𝐸𝜓  (Eq. 15) 

 

Esta é uma equação diferencial a autovalores, cuja resolução resulta na 

função de onda 𝜓(𝑟, 𝑡), que é a descrição matemática de um sistema de partículas 

quântico, sujeito a um determinado potencial externo. A função de onda contém 

todas as informações do sistema, o que nos permite obter qualquer propriedade do 

mesmo. O principal objetivo da química quântica é então resolver esta equação para 

o sistema contendo núcleos e elétrons, como uma molécula, por exemplo. No caso 



56 

 

 

 

de um sistema contendo N elétrons e M núcleos, o operador Hamiltoniano, em 

unidades atômicas, se escreve como na Equação 16: 

 

 

Ĥ = ∑
1

2

𝑁

𝑖=1

∇𝑖
2 − ∑

1

2𝑀𝐴

𝑀

𝐴=1

∇𝐴
2 − ∑ ∑

𝑍𝐴

𝑟𝑖𝐴

𝑀

𝐴=1

𝑵

𝑖=1

+ ∑∑
1

𝑟𝑖𝑗

𝑁

𝑗>𝑖

𝑵

𝑖=1

+ ∑ ∑
𝑍𝐴𝑍𝐵

𝑅𝐴𝐵

𝑀

𝐵>𝐴

𝑴

𝐴=1

 

(Eq. 16) 

  

 

onde 𝑖 e 𝑗 são os índices eletrônicos e 𝐴 e 𝐵 os nucleares. Os primeiros dois termos 

correspondem à energia cinética eletrônica e nuclear e os outros três correspondem 

à interação coulombiana elétron-núcleo, elétron-elétron e núcleo-núcleo, 

respectivamente. Para esse tipo de sistema, uma solução exata não é possível, e 

soluções aproximadas devem ser procuradas. 

A primeira das aproximações consiste no desacoplamento dos graus de 

liberdade eletrônicos e nucleares seguido da resolução do problema eletrônico 

isoladamente, e é conhecida como aproximação de Born-Oppenheimer (BORN ; 

OPPENHEIMER, 1927). Nessa aproximação, supõe-se que os elétrons respondem 

instantaneamente ao movimento nuclear e foi motivada originalmente pela grande 

diferença entre a massa do núcleo e do elétron. Sob esta aproximação, o segundo 

termo da Equação 16 é desprezado e o último se torna uma constante. O restante é 

o chamado Hamiltoniano eletrônico, que possui uma dependência paramétrica das 

coordenadas nucleares.   

Se levar em conta o spin eletrônico, a função de onda deve também satisfazer 

o princípio da antissimetria, que dita que a função de onda correspondente a 

férmions deve ser antissimétrica com respeito à troca de coordenadas entre 

quaisquer dois elétrons. 

Como se pode ver a resolução desta equação é bastante complexa e possível 

apenas para elétrons livres ou átomos hidrogenóides. Desta forma, os últimos 90 

anos foram dedicados a resolver a equação de forma simplificada. 



57 

 

 

 

3.2.2.3 Teoria do funcional de densidade (DFT) 

 

Em 1964, Kohn e Hohenberg, publicaram um artigo onde apresentavam uma 

reformulação da mecânica quântica baseada na densidade eletrônica e não mais na 

função de onda. Esta densidade, normalmente representada por 𝜌 (𝑟), envolvia a 

probabilidade de se encontrar o elétron em determinada coordenada. Kohn, 

auxiliado por Sham, determinaram como descobrir a 𝜌 (𝑟) para um sistema real e 

assim surgiu a DFT (Density Functional Theory) (HOHENBERG; KOHN, 1964; 

POPLE et al., 1992). 

A DFT permitiu o desenvolvimento de uma nova forma de estudar os 

complexos sistemas atômicos que compõe as moléculas e suas interações, de modo 

que computadores são usados para ajudar a compreender e a prever as 

propriedades (POPLE et al., 1992). 

Para conseguir descrever camadas eletrônicas, Kohn e Sham, construíram 

um sistema de elétrons “fictícios”, onde os “elétrons” não interagem uns com os 

outros, mas cuja densidade é igual à densidade do sistema original. Para isso, 

imergimos os nossos elétrons fictícios num potencial efetivo, o potencial de Kohn-

Sham, escolhido de forma a que esta condição seja satisfeita. Como este é um 

sistema de elétrons independentes (não-interatuantes), eles obedecem a uma 

equação de Schrödinger, a equação de Kohn-Sham. Se pode também provar que 

este potencial de Kohn-Sham é, ele próprio, um funcional da densidade, escreve-se 

normalmente este funcional como a soma de três partes, conforme Equação 17: 

 

𝑣𝐾𝑆[𝜌](𝑟 ) =  𝑣𝑒𝑥𝑡 (𝑟 ) +  𝑣𝐻𝑎𝑟𝑡𝑟𝑒𝑒 [𝜌](𝑟 ) +  𝑣𝑥𝑐 [𝜌](𝑟 )  (Eq. 17) 

 

O primeiro termo representa o potencial externo, que numa molécula ou num 

sólido é normalmente criado pelos núcleos atômicos. O segundo, o potencial de 

Hartree, já presente na teoria de Thomas-Fermi, leva em conta a interação 

eletrostática clássica entre os elétrons, isto é, a interação entre o elétron e a 



58 

 

 

 

densidade média de carga de todos os elétrons do sistema. O último termo, 

denominado potencial de troca e correlação, inclui todos os termos não triviais da 

interação. O problema é encontrar boas aproximações para este último termo, mas 

que pode ser substituída pela LDA, aproximação da densidade local, do inglês Local 

Density Approximation. Já foram propostas inúmeras outras aproximações para o 

potencial de troca e correlação. As mais populares para o estudo de sólidos são 

agora as chamadas aproximações generalizadas de gradientes (GGA, de 

Generalized Gradient Approximation), aproximações um pouco mais complexas do 

que a LDA (HOHENBERG; KOHN, 1964; VOSKO et al., 1980; POPLE et al., 1992; 

PERDEW et al., 1996). 

A DFT é aplicada para compreensão da transferência eletrônica envolvida na 

reação da enzima com substrato.  

 

3.2.2.4 Metodologia Híbrida - QM/MM 

 

Esquemas híbridos mecânica quântica-mecânica molecular (QM/MM) são 

adequados para a investigação de propriedades de macromoléculas ou reações 

químicas em ambientes complexos e particularmente adequados para estudar sítios 

ativos de enzimas ou solutos em fase condensada. O método combina a descrição 

da estrutura eletrônica do soluto (subsistema QM) com o computacionalmente mais 

barato tratamento de mecânica molecular do ambiente (subsistema MM), sendo 

estes acoplados por um Hamiltoniano híbrido, 𝐻𝑄𝑀𝑀𝑀. 

Em geral, denota-se o Hamiltoniano total,  𝐻 𝑇𝑂𝑇, que opera sobre a função de 

onda de todo o sistema Ψ, conforme Equação 18:  

 

 𝐻 𝑇𝑂𝑇Ψ(r, R, τ) = 𝐸𝑇𝑂𝑇 (𝑅, 𝜏)Ψ(r, R, τ)   (Eq. 18) 

 



59 

 

 

 

onde 𝜏 , 𝑅, e 𝑟 representam respectivamente as coordenadas dos átomos clássicos, 

dos núcleos dos átomos quânticos e dos elétrons dos átomos quânticos. Este 

Hamiltoniano envolve três termos: um Hamiltoniano quântico, um Hamiltoniano 

clássico e um termo de acoplamento, Equação 19: 

 

𝐻𝑇𝑂𝑇 = 𝐻𝑄𝑀 + 𝐻𝑀𝑀 + 𝐻𝑄𝑀𝑀𝑀  (Eq. 19) 

 

o mesmo vale para energia total, visto na Equação 20: 

 

𝐸𝑇𝑂𝑇 = 𝐸𝑄𝑀 + 𝐸𝑀𝑀 + 𝐸𝑄𝑀𝑀𝑀   (Eq. 20) 

 
 

Para o tratamento de ambientes macromoleculares biológicos, foi 

implementada a parametrização por campo de força de Wang e Shen (WANG; 

SHEN, 2013). Finalmente, o termo de acoplamento 𝐸𝑄𝑀𝑀𝑀− pode ser decomposto 

em três contribuições, Equação 21:  

 

𝐸𝑄𝑀𝑀𝑀 = ∑ 𝑞𝑖 ∫
𝜌(𝑟)

|𝑟−𝜏𝑖|
𝑑𝑟 +∑ ∑

𝑞𝑖𝑍𝛼

|𝑅𝛼−𝜏𝑖|

𝑄
𝛼=1 + 𝐸𝑄𝑀𝑀𝑀

𝐿𝐽𝐶
𝑖=1

𝐶
𝑖=1   (Eq. 21) 

  
onde 𝐶 é o número de átomos na região clássica, cujas cargas 𝑞𝑖 são determinadas 

pelo campo de força escolhido para modelar o ambiente e 𝛼  é o índice dos 

𝑄 núcleos dentro do subsistema quântico com carga 𝑍𝛼 . O primeiro e o segundo 

termo representam respectivamente a interação eletrostática entre os elétrons e as 

cargas clássicas e entre núcleos no subsistema quântico e as cargas clássicas. 

Finalmente, 𝐸𝑄𝑀𝑀𝑀
𝐿𝐽

− modela a interação de van der Waals entre os átomos das 

regiões QM e MM através de um potencial de Lennard-Jones (WARSHEL; LEVITT, 

1976B; MASSOVA; KOLLMAN, 2002; FERRER et al., 2012). 

Outra situação que merece atenção especial é o que acontece na fronteira 

entre os sistemas QM e MM se esta envolve a separação de uma ligação covalente, 

pois ao se “cortar” esta ligação, a parte QM ganha um elétron desemparelhado, 

enquanto que na parte MM, o elétron não é tratado e é, portanto, suprimido no 

processo. O sistema passa a não ser descrito corretamente. Os principais métodos 

são:  



60 

 

 

 

  

1. o procedimento "link-atom", em que orbitais "fantasmas" são colocados 

no átomo de fronteira MM para saturar a valência da parte QM.  

2. o procedimento LSCF (Local Self Consistent Field), que "congela" o 

orbital que descreveria a ligação de fronteira, ou seja, o orbital que 

seria do elétron MM da fronteira é incluído no cálculo QM, mas não é 

otimizado no processo SCF.      

3. o geração de um pseudopotencial no carbono de fronteira MM, que 

permite tratar todos os elétrons na parte QM (não-trivial) (WARSHEL; 

LEVITT, 1976B; MASSOVA; KOLLMAN, 2002; FERRER et al., 2012). 

 

Esta ligação entre as porções QM e MM pode ser tratada de várias maneiras 

diferentes. Normalmente o corte é feito nas ligações homopolares, como o caso de 

uma ligação carbono-carbono em uma proteína.  O método adotado na particular 

implementação foi o método do “átomo ligado” com posição escalada, SPLAM 

(EICHINGER et al., 1999). Neste método, as ligações de fronteira (suposto C-C, mas 

não necessariamente) são substituídas por ligações carbono-hidrogênio. Este 

“hidrogênio de ligação” completa a valência do sistema QM, e sua posição é 

superimposta na ligação 𝐶𝑄𝑀 − 𝐶𝑀𝑀 .  As forças exercidas neste hidrogênio são 

divididas em componentes perpendiculares e paralelas à ligação, sendo que a 

primeira é adicionada ao átomo de fronteira clássico, e a segunda é multiplicada por 

0.1 e somada sobre os átomos de fronteira clássico e quântico, para evitar incluir um 

torque externo. Os outros termos clássicos de energia ligados envolvendo pelo 

menos um centro MM de fronteira são computados normalmente. Interações 

Lennard-Jones entre os átomos de fronteira e o hidrogênio de ligação são omitidos 

para pares de átomos separados por menos de três ligações. A carga do átomo de 

fronteira MM é dividida e somada sobre seus vizinhos para manter a carga total 

inalterada. Este método já foi utilizado com sucesso em cálculos anteriores com 

diferentes sistemas, incluindo biomoléculas (WARSHEL; LEVITT, 1976a; b). 

 

 

 



61 

 

 

 

3.2.3 Protocolo de cálculos 

 

Para a realização dos cálculos teóricos em modelagem computacional 

utilizou-se o código GROMACS e SIESTA, em servidores Supermicro de rack da 

VERSATUS, servidores altamente paralelos, desenvolvidos para uma grande gama 

de aplicações intensivas nos campos de Modelagem Química, Simulações 

Financeiras, Genômica e Física. 

Foi de particular interesse a utilização de esquemas de simulação baseados 

em Dinâmica Molecular, dando uma abordagem relacionada à minimização de 

energia, de forma a observar o comportamento do cofator frente a enzima inativa.  

Também se estudou a descrição mecânico-quântica do modelo escolhido 

para representar o sítio catalítico, e para este, elegeu a Teoria do Funcional de 

Densidade (DFT) (HOHENBERG; KOHN, 1964). 

Também foi utilizado o software AutoDock Vina, para simular o melhor 

posicionamento da penicilina frente ao sítio ativo da enzima (TROTT; OLSON, 

2010). 

E para estudar a reação da enzima com seu substrato fez-se uso de método 

híbrido de mecânica quântica-mecânica molecular usando uma penicilinase de 

Bacillus cereus, uma metalo-β-lactamase (MβL), obtida por difração de raios-X e 

disponível no banco de dados PDB, Protein Data Bank, com a seguinte numeração, 

2M5C.pdb, Figura 8, que possui dois íons de zinco (II) no sítio ativo, uma constante 

de Michaelis-Menten ( 𝐾𝑚 ) de aproximadamente 60 µmol L-1 (para enzima 

imobilizada e analisada por espectrofometria modificada e  um peso molecular de 28 

KDa (KLEMES; CITRI, 1979). 

 

 

 

 

 



62 

 

 

 

Figura 8 - Estrutura cristalográfica obtida por difratometria de raios-X da metalo-β-lactamase 

(coordenadas obtidas de 2M5C.pdb) de Bacillus cereus, em tampão fosfato (PBS), ph 7, com dois 

íons zinco em seu sítio ativo. 

 

 Fonte: adaptado de Karsisiotis et al. (2013). 

 

A modelagem computacional esclarece, detalhadamente, a estrutura 

tridimensional da molécula enzimática e do antibiótico, penicilina G, pois a dinâmica 

molecular (MD) contribui para entendimento  do comportamento atomístico dos 

átomos envolvidos, considerando o campo de força (AMBER99SB) utilizado para 

parametrizar as interações interatômicas e direcionar à compreensão da reação 

enzimática heterogênea assistida, ao estudar o comportamento eletrônico dos 

átomos envolvidos na catálise enzimática, por mecânica quântica (QM).  

Todos os cálculos e estudo por mecânica molecular foi feita utilizando-se o 

código GROMACS (PRONK et al., 2013). Para os estudos de simulação, a estrutura 



63 

 

 

 

da penicilinase, obtida por raios-X, era composta de aproximadamente 3560 átomos, 

os quais foram acomodados numa caixa ortogonal de 72 x 70 x 65 Å, visto que a 

menor distância entre as moléculas vizinhas era 12 Å. Em princípio os íons 

inorgânicos foram removidos daquela estrutura obtida por difração de raios-X.  

Os estados de protonação dos resíduos foram ajustados para coincidir com 

os correspondentes a um pH 7, obtendo-se uma proteína com carga negativa de  

-5e-, quando não ativada pelo cofator. A proteína foi em seguida relaxada pela 

otimização da geometria, minimizando o potencial para o mínimo mais próximo 

(JONES et al., 1997). 

O sistema foi solvatado por água explícita e quantidade suficiente de contra-

íons para neutralizar o sistema de modo a se atingir a concentração desejada. O sal 

escolhido para gerar os contras íons foi o cloreto de zinco (ZnCl2) em duas 

concentrações (quanto ao número de íons): 0,01 mol L-1 e 0,2 mol L-1, que 

correspondem aos pontos extremos das concentrações usadas no experimento. 

Portanto, o número total de átomos do sistema solvatado, nesta situação, passou a 

ter cerca de 32.000 átomos. A geometria do sistema foi re-otimizada de modo que a 

força máxima fosse inferior a 500 kJ mol-1 nm-1. O sistema foi ainda termalizado por 

dinâmica molecular NVT-conjunto (MD) usando o campo de força empírico 

AMBER99SB para 1 ns e com um intervalo de tempo de 2 fs. O termostato Nosé-

Hoover foi usado para controlar a temperatura em torno de 300 K (EVANS; HOLIAN, 

1985; HORNAK et al., 2006) 

Numa segunda etapa, a pressão do sistema foi equilibrada usando o 

barostato Parrinello-Rahman, a 1 atm. Isso teve como objetivo equilibrar a 

densidade do sistema, por mais 1 ns. Finalmente um tipo de dinâmica computacional 

sustentada em cálculos NPT-MD em 300 K e 1 atm, para 100 ns. Toda a análise 

estrutural é então realizada dentro da trajetória correspondente (PARRINELLO; 

RAHMAN, 1981).   

 



64 

 

 

 

4 PENICILINASE: abordagem 

eletroquímica e modelagem 

computacional 

 

4.1 Abordagem Eletroquímica 

 

Em cada etapa de funcionalização foram realizadas voltametrias cíclicas para 

garantir que uma adsorção completa e efetiva da superfície tenha ocorrido como 

visto na Figura 9.  

A solução de ferri/ferro utilizada na célula eletroquímica é composta de 

ferricianeto de potássio (1 mmol L-1), adicionalmente a ferrocianeto de potássio tri-

hidratado (1 mmol L-1) e nitrato de potássio (0,5 mol L-1), a qual possibilita a troca 

eletrônica da interface com o meio, ou seja, há transferência de elétrons entre o 

eletrodo de trabalho e os íons de Fe, 𝐹𝑒+2   𝐹𝑒+3 + 𝑒− , ocorrendo reações de 

oxirredução. 

 

 

 

 

 

 

 



65 

 

 

 

Figura 9 – VC´s características de diferentes eletrodos: o de Au puro, o de Au/SAM, o de 

Au/SAM/Penicilinase e o de Au/SAM/Penicilinase na presença de substrato. Realizadas em solução 

de ferri/ferro, 1 mmol L
-1

, em KNO3, 0,5 mol L
-1

. O substrato é a penicilina G a 0,65 mmol L
-1

. Em 

destaque, ampliação na região onde ocorreu bloqueio de corrente (-0,5 a 0,5 µA cm
-2

) devido à 

formação de filme na superfície metálica.  

 

 

 

Observou-se que houve um decréscimo nas densidades de corrente anódicas e 

catódicas, ou seja, a monocamada de L-cisteína impede a passagem de elétrons, 

responsáveis pela oxidação e redução, 𝐹𝑒+2   𝐹𝑒+3 + 𝑒− (associado ao par redox 

ferri/ferro), mas não totalmente, pois há transferência eletrônica, em quantidade 

diminuta, demonstrando que ocorreu efetivamente a formação da SAM. 

Para fins comparativos, destacou-se na imagem a região onde ocorreu a 

diminuição da corrente, possibilitando analisar que ao adsorver a MβL, houve um 

 Au 

 Au/SAM

 Au/SAM/Penicilinase

 Au/SAM/Penicilinase/Penicilina G

-0,3 0,0 0,3 0,6

-4

-3

-2

-1

0

1

2

3

4

j 
(

A
 c

m
-2
)

E (V) vs Ag/AgCl

 

 

0,0 0,4

-0,3

0,0

0,3

j 
(

A
 c

m
-2
)

E (V) vs Ag/AgCl



66 

 

 

 

novo impedimento e quando se coloca a penicilina G, sem íons metálicos, também 

ocorre, porém discreto. Visto que não há presença de cofator, não se observou 

atividade catalítica e, portanto, correntes associadas a uma reação desta enzima 

com o substrato não foram detectadas nestes voltamogramas. 

As enzimas possuem um centro ativo aonde o substrato irá se ligar e reagir 

formando o produto. No entanto, algumas enzimas precisam ser ativadas, ou seja, 

uma apoenzima (enzima inativada) liga-se a um grupo não proteico, denominado 

cofator (íon metálico) ou coenzima (pequenos grupos orgânicos), adquirindo as 

condições necessárias para a reação. A enzima quando ativada pelo cofator (neste 

caso específico foi utilizado o átomo|íon zinco) é denominada holoenzima. A Figura 

10 mostra o perfil voltamétrico da enzima quando a mesma está ativa e inativa. 

 

Figura 10 - Perfis voltamétricos de uma apoenzima e uma holoenzima, imobilizadas em eletrodo de 

Au. Realizado em PBS 0,1 mol L
-1

, pH 7,4 a 25°C. Velocidade de varredura de 100 mV s
-1

. Penicilina 

G a 0,65 mmol L
-1

. O íon Zn
2+

, a 25 mmol L
-1

,
 
foi utilizado como cofator. Região hachurada indica um 

“laço de nucleação”. 

-0,6 -0,3 0,0 0,3 0,6
-12

-9

-6

-3

0

3

j 
(

A
 c

m
-2

)

E(V) vs.