RESSALVA Atendendo solicitação do autor, o texto completo desta Dissertação será disponibilizado somente a partir de 19/12/2026. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA "JULIO DE MESQUITA FILHO" FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS CÂMPUS DE ARARAQUARA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA DE BIOMATERIAIS E BIOPROCESSOS MESTRADO PROFISSIONAL LUCAS CAMPOS ALVES AVALIAÇÃO DA OBTENÇÃO DE PREPARADO ENZIMÁTICO RICO EM OXIRREDUTASES POR EXTRAÇÃO SÓLIDO-LÍQUIDO DE SUBPRODUTOS INDUSTRIAIS ARARAQUARA - SP 2024 2 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA "JULIO DE MESQUITA FILHO" FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS CÂMPUS DE ARARAQUARA LUCAS CAMPOS ALVES AVALIAÇÃO DA OBTENÇÃO DE PREPARADO ENZIMÁTICO RICO EM OXIRREDUTASE POR EXTRAÇÃO SÓLIDO-LÍQUIDO DE SUBPRODUTOS INDUSTRIAIS Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Biomateriais e Bioprocessos (Mestrado Profissional), Área de Biomateriais, Bioprocessos, Bioprodutos da Faculdade de Ciências Farmacêuticas, UNESP, como parte dos requisitos para obtenção do Título de Mestre em Engenharia de Biomateriais e Bioprocessos. ORIENTADOR: Prof. Dr. Fernando Masarin COORIENTADOR: Prof. Dr. Álvaro Baptista Neto ARARAQUARA - SP 2024 3 4 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA Câmpus de Araraquara CERTIFICADO DE APROVAÇÃO TÍTULO DA DISSERTAÇÃO: Avaliação da obtenção de preparado enzimático rico em oxirredutases por extração sólido-líquido de subprodutos industriais AUTOR: LUCAS CAMPOS ALVES ORIENTADOR: FERNANDO MASARIN Aprovado como parte das exigências para obtenção do Título de Mestre em Engenharia de Biomateriais e Bioprocessos, área: Biomateriais, Bioprocessos, Bioprodutos pela Comissão Examinadora: Prof. Dr. FERNANDO MASARIN (Participaçao Virtual) Departamento de Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia / Faculdade de Ciencias Farmaceuticas Unesp Prof. Dr. JULIÁN PAUL MARTÍNEZ GALAN (Participaçao Virtual) Escuela de Nutrición y Dietética / Universidad de Antioquia (UdeA) Prof. Dr. ELIAS DE SOUZA MONTEIRO FILHO (Participaçao Virtual) Departamento de Engenharia, Física e Matemática / Instituto de Química do Câmpus de Araraquara da Unesp Araraquara, 19 de dezembro de 2024 Faculdade de Ciências Farmacêuticas - Câmpus de Araraquara - Rodovia Km 1 , 14804083 https://www2.fcfar.unesp.br/#!/pos-graduacao/engenharia-de-biomateriais-e-bioprocessos-mestrado-profissional/CNPJ: 48.031.918/0025-00. 5 IMPACTO POTENCIAL DESTA PESQUISA O desenvolvimento de um processo eficiente para a obtenção de extrato enzimático a partir do substrato de cogumelos comestíveis constitui em inovação tecnológica com aplicação nos setores de polpa celulósica, tratamento de efluentes, dentre outros. A valorização desta tecnologia impulsionará o desenvolvimento da bioeconomia em regiões produtoras de cogumelos com oportunidades de negócios e empregos. POTENTIAL IMPACT OF THIS RESEARCH The development of an efficient process for obtaining enzymatic extract from the substrate of edible mushrooms constitutes a technological innovation with applications in the sectors of cellulose pulp, effluent treatment, among others. The valorization of this technology will boost the development of the bioeconomy in mushroom-producing regions with business and employment opportunities. 4 AGRADECIMENTOS Em especial ao meu Deus, por ensinar o caminho a andar. E a Larissa e Celine pelo amor, dedicação e inspiração, com quem compartilho o mérito desta conquista, “é por vocês!”. Aos Professores Dr. Fernando Masarin e Dr. Alvaro Baptista Neto, pela orientação e paciência. Aos meus pais, irmãs e professores, agradeço o amparo e apoio. São pessoas que passaram por minha vida e que auxiliaram na construção do meu ser, agradeço a todos por fazerem parte da minha história. Aos amigos e mentores, Prof. Dr. Fernando Afonso Silva e Dr. Bruno Alencar Pereira sem os quais o caminho teria sido mais árduo, por sempre estarem dispostos a me ouvir e oferecer uma visão crítica e incentivadora, definitivamente, a eles devo muito do meu aprendizado e entusiasmo. À KHEMI LABORATORIO, pelo apoio financeiro, industrial e laboratorial. 7 RESUMO O presente estudo avaliou a obtenção de extrato rico em atividades enzimática de oxiredutases, enzimas capazes de oxidar compostos aromáticos/fenólicos, como por exemplo a lignina e seus derivados (compostos presentes em materiais lignocelulósicos). Os extratos obtidos apresentaram atividade de três enzimas oxiredutases lacase (Lac), manganês peroxidase (MnP) e lignina peroxidase (LiP). Após foi ultrafiltrado o caldo bruto obtendo um extrato enzimático com atividades enzimáticas concentradas. Mostraram-se promissores para extração e obtenção de lacase (Lac), manganês peroxidase (MnP) e lignina peroxidase (LiP), portanto, apresenta potencial para a formulação de preparado enzimático. No entanto, são necessários estudos mais detalhados para que sejam obtidas condições ótimas de extração das enzimas, com a variação do método purificação por ultrafiltração. Por fim, com estes estudos será possível avaliar se o produto terá uma aceitação no mercado. Palavras-chave: Enzimas Oxiredutases; Lacase; Manganês Peroxidase; Lignina Peroxidase; Ultrafiltração. 6 ABSTRACT This study evaluated the production of an extract rich in enzymatic activities of oxidoreductases, enzymes capable of oxidizing aromatic/phenolic compounds, such as lignin and its derivatives (compounds present in lignocellulosic materials). The extracts obtained showed activity of three oxidoreductase enzymes: laccase (Lac), manganese peroxidase (MnP) and lignin peroxidase (LiP). The crude broth was then ultrafiltered, obtaining an enzymatic extract with concentrated enzymatic activities. They showed promise for extraction and production of laccase (Lac), manganese peroxidase (MnP) and lignin peroxidase (LiP), and therefore have potential for the formulation of an enzymatic preparation. However, more detailed studies are needed to obtain optimal conditions for enzyme extraction, with variations in the ultrafiltration purification method. Finally, these studies will allow evaluating whether the product will be accepted in the market. Keywords: Oxidoreductase Enzymes; Laccase; Manganese Peroxidase; Lignin Peroxidase; Ultrafiltration. 11 9 1. INTRODUÇÃO O mercado mundial de produtos à base de enzimas é um segmento que está em constante crescimento devido ao aumento do consumo destas nos processos industriais. Segundo dados publicados pela Fior Market Research (2019), o mercado global de enzimas deve crescer de US$ 8,2 bilhões em 2018 para US$ 13,8 bilhões até 2026. O setor industrial do Brasil apresenta aplicação ainda reduzida de preparados enzimáticos em comparação com outros países, sendo principalmente um importador de enzimas. Em 2012, o Ministério do Desenvolvimento, Indústria e Comércio Exterior (MDIC, 2012) publicou um relatório sobre a biotecnologia no Brasil, no qual relata que as importações dos preparados enzimáticos chegaram a US$ 119 milhões e as exportações a US$ 52 milhões no ano de 2011 (MDIC, 2012). Todavia existe grande importância em obter-se tais moléculas, já que o setor de papel e celulose gera grande quantidade de compostos químicos (incluindo compostos intensamente coloridos), dos quais vários são considerados tóxicos. Esses compostos são formados na etapa de branqueamento de polpa, como por exemplo, os organoclorados (clorofenóis, cloroalifáticos etc. Destacam-se os estudos da aplicação da enzima lacase (Lac) (EC 1.10.3.2) no setor de papel e celulose. A enzima em questão é uma oxirredutase multinuclear; utiliza o oxigênio como receptor de elétrons, oxidando compostos fenólicos, aromáticos e aminas, produzindo água ao final da reação (Litthauer et al., 2007). Portanto, o uso de Lac no branqueamento de polpa de celulose não gera resíduos tóxicos ao meio ambiente, sendo seu uso, considerado umaalternativa ecológica e sustentável visando a diminuição de compostos químicos organoclorados utilizados atualmente (Sharma et al., 2014). As enzimas para serem aplicadas em processo de branqueamento de polpa de celulose devem apresentar termo resistência (ser estável a temperaturas >60ºC), capacidade de atuar em diferentes faixas de pH, bem como, apresentar estabilidade térmica e ao pH por no mínimo 4 horas (Singh, 2009). Dentro do âmbito do conceito apresentado e considerando à importância de novas tecnologias para a busca por melhorias no processo de papel e celulose, este trabalho propõe avaliar a viabilidade técnica de obtenção de enzimas oxirredutases, bem como avaliar o potencial de aplicabilidade do preparado enzimático obtido no setor da indústria, como por exemplo no setor de papel e celulose, resultando na contribuição da ampliação da oferta deste produto no mercado interno, favorecendo o desenvolvimento e autonomia tecnológica nacional. 12 10 6 CONCLUSÃO • Ambos os SCC obtidos dos principais fungos filamentosos comerciais mostraram-se promissores para extração e obtenção de enzimas oxirredutases (lacase, MnP e LiP); • Os tempos de cultivo em que resultou as melhores atividades enzimáticas, ficaram compreendidos nas três primeiras semanas, o que viabiliza à aplicação comercial do extrato enzimático obtido; • O processo de purificação de uma amostra selecionada mostrou-se eficiente, aumentando em média 20 vezes a atividade das enzimas oxirredutases; • O pH ótimo da atividade de LiP e Lac foi de 5, enquanto da MnP foi de 3; • A temperatura ótima de atividade das enzimas Lac, MnP e LiP foram de 50 °C, 60 °C e 40 °C, respectivamente; • Os estudos preliminares de estabilidade ao pH mostram que durante a incubação de 1 h as enzimas Lac, MnP e LiP foram estáveis em seus pHs ótimos de atividade; • Os estudos preliminares de estabilidade térmica mostram que durante a incubação de 1 h as enzimas Lac, MnP foram estáveis até 60°C; • Os estudos mostram que há potencial para a formulação de um extrato enzimático rico em atividades de oxirredutases; • Foi constatado um processo eficiente de extração e recuperação de oxirredutases oriundas de SCC com características que tornam estas enzimas, uma importante ferramenta a ser utilizada em diversos processos biotecnológicos. • Entretanto, são necessários estudos mais detalhados para que sejam obtidas condições ótimas de extração de enzimas oxirredutases de SCC, além de aplicar um método eficiente de refino/purificação, como por exemplo à ultrafiltração. • Estudos de estabilidade a temperatura com diferentes tempos de incubação devem ser realizados com as oxirredutases para a determinação dos parâmetros de estabilidade térmica (energia de ativação e tempo de meio vida das enzimas); • Por fim, os resultados referentes obtidos neste trabalho são animadores e nos estimulam a realizar futuros estudos visando produção em maior escala, passo importante para avaliar a viabilidade econômica e tecnológica deste processo. 11 11 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AHLAWAT, O. 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