UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA Uso de antiinflamatórios COX-2 seletivos em ratos (Rattus novergicus) Wistar Annelise Carla Camplesi Botucatu - SP 2010 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA Uso de antiinflamatórios COX-2 seletivos em ratos (Rattus novergicus) Wistar ANNELISE CARLA CAMPLESI Tese apresentada junto ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária para obtenção do título de Doutor. Orientadora: Profa. Dra. Michiko Sakate Nome do Autor: Annelise Carla Camplesi Título: Uso de antiinflamatórios COX-2 seletivos em ratos (Rattus novergicus) Wistar COMISSÃO EXAMINADORA Profa. Dra. Michiko Sakate Presidente e Orientadora Departamento de Clínica Veterinária FMVZ – UNESP - Botucatu Profa. Dra. Noeme de Sousa Rocha Membro Departamento de Patologia Veterinária FMVZ – UNESP – Botucatu Prof. Dr. Maria do Carmo Fernandez Vailati Membro Departamento de Clínica Veterinária FMVZ – UNESP – Botucatu Prof. Dr. Mário Roberto Hatayde Membro Departamento de Clínica e Cirurgia Veterinária FCAV - UNESP – Jaboticabal Profa. Dra. Márcia Ferreira da Rosa Sobreira Membro Setor de Patologia Clínica Veterinária Unicastelo – Campus de Descalvado Data da Defesa: 27 de maio de 2010 DEDICATÓRIA A “MINHA família”! Razão da minha Vida! A minha querida, esperada e já tão amada filha Maria Eduarda e ao meu maridão Gustavo, pelo amor, companheirismo, paciência e apoio. Que Deus permita estarmos sempre juntos. Amo muito vocês! A minha “BASE”! Aos meus pais Airton e Natalina e aos meus irmãos Tom e Anderson, fonte de todos os meus objetivos, que sempre acreditaram em meus sonhos e me apoiaram em minhas decisões. Agradeço ao estímulo (às vezes até demais!) para que eu chegasse até aqui! Amo muito vocês! A minha “ORIENTAÇÃO!” À professora Michiko, pelos ensinamentos, momentos de apoio, orientação e compreensão, sem os quais eu não teria conseguido concretizar mais esta etapa da minha vida. Agradeço muito por ter tido a sorte de tê-la como orientadora! Muitas vezes as pessoas são egocêntricas, ilógicas e insensatas. Perdoe-as assim mesmo. Se você é gentil, as pessoas podem acusá-la de egoísta, interesseira. Seja gentil assim mesmo. Se você é vencedora, terá alguns falsos amigos e alguns inimigos verdadeiros. Vença assim mesmo. Se você é honesta e franca, as pessoas podem enganá-la. Seja honesta e franca assim mesmo. O que você levou anos para construir, alguém pode destruir de uma hora para outra. Construa assim mesmo. O bem que você faz hoje pode ser esquecido amanhã. Faça o bem assim mesmo. Dê ao mundo o melhor de você, mas isso pode nunca ser o bastante. Dê o melhor de você assim mesmo. Veja você que, no final das contas, é entre você e Deus, nunca foi entre você e as outras pessoas... (Madre Tereza de Calcutá) AGRADECIMENTOS A Deus, pela minha existência e por todas as oportunidades que coloca na minha vida. A toda a minha família, meus pais, pelos ensinamentos, incentivo e amor, pela torcida e amizade. Aos meus irmãos: Anderson, agora tão longe, me faz muita falta! e ao Tom e sua família, minha cunhada e amiga Maíra e meus xuxus, minhas lindas, doces e amadas sobrinhas Beatriz e Maria Fernanda. Ao meu marido Gustavo, pela cumplicidade, apoio, companheirismo, amor e tudo o que eu mais preciso pra seguir em frente! e pela nossa filha Duda, que está a caminho! A minha orientadora, Professora Michiko Sakate, pela disposição, pelos ensinamentos, lições de vida e pela amizade. Minha gratidão eterna. A minha verdadeira e fiel amiga Carla Moya-Araújo, por anos de amizade, pelo auxílio com este trabalho, pela companhia de sempre, de festas, de trabalho, pelas confidências, pela troca de conhecimento, por tudo. Ao Gustavo Araújo, amigo e companheiro, e pelo auxílio com as análises estatísticas. A amiga Marcela Marcondes, pela convivência e pelo auxílio com a leitura das lâminas. Aos amigos conquistados durante a pós-graduação na FMVZ-Unesp, Campus de Botucatu durante todos esses anos. Foram muitos momentos alegres e inesquecíveis. À Cristiane Moraes Barbosa e à Carminha (Maria do Carmo F. Vailati), companheiras de experimento, pela convivência, dedicação, amizade e troca de experiências. A Carminha também pelo auxílio na tese e por aceitar fazer parte da minha banca! À professora Noeme S. Rocha, pela disponibilidade, pelos conhecimentos passados, pelas maravilhosas aulas na pós-graduação e por aceitar fazer parte da minha banca. À amiga e professora Márcia F. R. Sobreira, pelo convívio, pelo incentivo, pelo apoio profissional, pela troca de experiências profissionais, emocionais, “maternais”, pela maravilhosa e eterna amizade e por aceitar fazer parte da minha banca. Ao amigo e professor Mário Roberto Hatayde, por todos os ensinamentos desde a graduação, por aceitar mais uma vez fazer parte da minha banca e pela amizade. Aos funcionários da FMVZ – UNESP – Campus de Botucatu, pelo convívio e auxílio. Aos funcionários da seção de pós-graduação, Denise, Maria e José Roberto, pela amizade e auxílio sempre. Às secretárias Cristina e Marlene, pela convivência, pelo auxílio sempre que precisei, pelo companheirismo, dedicação e amizade. Ao professor Thomas Ong e a pós-graduanda Clarissa, do Departamento de Nutrição e Câncer da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da USP, por permitir e orientar a leitura das minhas lâminas de apoptose em seu laboratório. À professora Terezinha Peraçoli e suas orientadas Renata e Érica, pelo auxílio nas dosagens das citocinas, pelo convívio e amizade. A todos os funcionários do Biotério de Experimentação do Departamento de Clínica Médica da Faculdade de Medicina de Botucatu, pelo auxílio na realização deste trabalho, em especial ao Mário, pela ajuda na manipulação com os animais. À FAPESP, pela liberação do auxílio pesquisa, sem o qual este experimento não teria acontecido. Agradeço a todos que colaboram direta ou indiretamente na execução deste trabalho. Aos ratos de experimentação, que foram sacrificados em benefício da ciência e de outros animais. Aos meus lindos e amados animais: Kyara, Johnny, Thor, Luna, Gaya e Naná e a todos os animais, minha grande paixão! Sem eles nada disso teria propósito! “Se você falar com os animais, eles irão falar com você. E assim vocês conhecerão um ao outro. Se você não falar com eles, não os conhecerá... E aquilo que você não conhece, você teme... E aquilo que se teme, se destrói.” (Dan George) FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO DE AQUIS. E TRAT. DA INFORMAÇÃO DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE Camplesi, Annelise Carla. Uso de antiinflamatórios COX-2 seletivos em ratos (Rattus novergicus) Wistar/ Annelise Carla Camplesi. – Botucatu, 2010 Tese (doutorado) – Faculdade de Medicina de Botucatu, Universidade Estadual Paulista, 2010 Orientador: MichiKo Sakate Assunto CAPES: 21001006 1. Farmacologia veterinária. 2. Apoptose. 3. Medicamentos - Interações. Palavras-chave: Apoptose; Citocinas; Firocoxib; Intoxicação medicamentosa; Meloxicam. i LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 01 - (A) Sala do biotério de experimentação do Departamento de Clínica Médica da Faculdade de Medicina – UNESP, campus de Botucatu – SP; (B) gaiola contendo os cincos animais de cada sub-grupo; (C) rato macho Wistar..................................................................................................................... 55 Figura 02 - Sequência da administração dos AINEs pelo método de gavage descrito por Bauck e Bihun (1997)......................................................................... 56 Figura 03 – Esquema representativo da administração dos medicamentos e dos momentos de avaliação utilizados nesse experimento................................... 51 Figura 04 - Administração de pentobarbital por via intraperitoneal para a eutanásia dos animais........................................................................................... 57 Figura 05 - Procedimento de colheita de sangue por punção intracardíaca após a eutanásia dos ratos Wistar................................................................................. 58 Figura 06 - (A) Necropsia do rato do grupo 1 para retirada do fígado; (B) fígado após remoção em placa de petri; (C) cortes do tecido hepático para posterior fixação e (D) fragmento de fígado fixado em solução de Carnoy modificado...... 59 Figura 07 – Fígado de rato do grupo 6, com presença desarranjo das traves de hepatócitos e granulação citoplasmática condizente com degeneração hidrópica (HE, 400x).............................................................................................. 69 Figura 08 – Fígado de rato do grupo 2, apresentando vacuolização citoplasmática condizente com degeneração gordurosa (HE, 400x).................... 71 Figura 09 - Fígado de rato do grupo 2, apresentando células inflamatórias mononucleares ao redor dos ductos biliares condizente com infiltrado periportal (HE, 200x).............................................................................................................. 74 ii Figura 10 - Fígado de rato do grupo 3 (A) CA hepático visualizado pela microscopia de fluorescência (seta) e (B) pela microscopia de luz (seta). Fígado de rato do grupo 2 (C) CA hepático com cromatina visualizado pela microscopia de fluorescência (seta) e (D) pela microscopia de luz (seta) (HE, 400x).................................................................................................................................. 78 Figura 11 - Fígado de rato do grupo 5 (A) Corpúsculos apoptóticos hepático (setas) e com cromatina (seta larga) visualizado pela microscopia de fluorescência e (B) pela microscopia de luz (setas) (HE, 400x)............................ 79 iii LISTA DE TABELAS Tabela 1 – Valores médios de IL-10 sérica (pg/mL) dos grupos e seus respectivos desvios padrão nos diferentes momentos (M1= 48h após início do tratamento, M2= 96h após o início do tratamento e M3= 72h após o término do tratamento).................................................................................... 62 Tabela 2 - Valores médios de TNF-� sérico (pg/mL) dos grupos e seus respectivos desvios padrão nos diferentes momentos (M1= 48h após início do tratamento, M2= 96h após o início do tratamento e M3= 72h após o término do tratamento).................................................................................... 63 Tabela 3 - Valores médios de fibrinogênio plasmático (mg/dL) dos grupos e seus respectivos desvios padrão nos diferentes momentos (M1= 48h após início do tratamento, M2= 96h após o início do tratamento e M3= 72h após o término do tratamento)................................................................................. 65 Tabela 4 – Valores médios (escore) de degeneração hidrópica nos diferentes grupos e seus respectivos desvios padrão nos diferentes momentos (M1= 48h após início do tratamento, M2= 96h após o início do tratamento e M3= 72h após o término do tratamento).................................... 68 Tabela 5 – Valores médios (escore) de degeneração gordurosa nos diferentes grupos e seus respectivos desvios padrão nos diferentes momentos (M1= 48h após início do tratamento, M2= 96h após o início do tratamento e M3= 72h após o término do tratamento).................................... 70 Tabela 6 – Valores médios (escore) de necrose coagulativa nos diferentes grupos e seus respectivos desvios padrão nos diferentes momentos (M1= 48h após início do tratamento, M2= 96h após o início do tratamento e M3= iv 72h após o término do tratamento)................................................................. 72 Tabela 7 – Valores médios (escore) de infiltrado inflamatório mononuclear periportal nos diferentes grupos e seus respectivos desvios padrão nos diferentes momentos (M1= 48h após início do tratamento, M2= 96h após o início do tratamento e M3= 72h após o término do tratamento)..................... 73 Tabela 8 – Valores médios (escore) de infiltrado inflamatório mononuclear intersticial nos diferentes grupos e seus respectivos desvios padrão nos diferentes momentos (M1= 48h após início do tratamento, M2= 96h após o início do tratamento e M3= 72h após o término do tratamento)..................... 75 Tabela 9 – Valores médios de CA/mm2 nos diferentes grupos e seus respectivos desvios padrão nos diferentes momentos (M1= 48h após início do tratamento, M2= 96h após o início do tratamento e M3= 72h após o término do tratamento).................................................................................... 77 v LISTA DE ABREVIATURAS - AINEs = Antiinflamatórios não esteroidais - ALT = Alanina-amino-transferase - CA = Corpúsculo apoptótico - COXs = Cicloxigenases - COX-1 = Cicloxigenase-1 - COX-2 = Cicloxigenase-2 - ELISA = Ensaio imunoenzimático - FA = Fosfatase alcalina - GGT = Gama-glutamil-transferase - G1 = Grupo 1 - G2 = Grupo 2 - G3 = Grupo 3 - G4 = Grupo 4 - G5 = Grupo 5 - G6 = Grupo 6 - HE = Hematoxilina-eosina - IL = Interleucina - IL-1 = Interleucina-1 - IL-2 = Interleucina-2 - IL-4 = Interleucina-4 - IL-6 = Interleucina-6 - IL-8 = Interleucina-8 - IL-10 = Interleucina-10 vi - IL-13 = Interleucina-13 - kg = Quilogramas - M1 = Momento 1 - M2 = Momento 2 - M3 = Momento 3 - mg = Miligramas - mL = Mililitros - pg = Picogramas - PGs = Prostaglandinas - PGE2 = Prostaglandina E2 - TNF-� = Fator de necrose tumoral alfa - TXs = Tromboxanos - TXA2 = Tromboxano-A2 vii SUMÁRIO 1. Introdução...................................................................................................... 20 2. Revisão de Literatura..................................................................................... 23 2.1. Citocinas................................................................................................... 23 2.2. AINES....................................................................................................... 25 2.2.1. Diclofenaco de sódio e de potássio..................................................... 28 2.2.2. Meloxicam............................................................................................ 29 2.2.3. Firocoxibe............................................................................................ 31 2.3. Efeitos adversos dos AINES..................................................................... 33 2.3.1. Trato gastrointestinal........................................................................... 34 2.3.2. Fígado.................................................................................................. 35 2.3.3. Rim...................................................................................................... 40 2.3.4. Sistema cardiovascular........................................................................ 42 2.3.5 Alterações hemostáticas e hematológicas........................................... 43 3. Objetivo.......................................................................................................... 46 3.1. Objetivo geral............................................................................................ 46 3.2. Objetivos específicos................................................................................ 46 4. Material e Métodos........................................................................................ 48 4.1. Animais e ambiente de experimentação................................................... 49 4.2. Formação dos grupos experimentais....................................................... 50 4.3. Momentos................................................................................................. 50 4.4. Quantificação de citocinas........................................................................ 51 4.4.1. Colheita de amostras........................................................................... 51 4.4.2. Detecção da produção de citocinas..................................................... 52 4.5. Dosagem de fibrinogênio plasmático........................................................ 52 4.6. Avaliação histológica................................................................................ 52 4.6.1. Avaliação morfológica.......................................................................... 53 4.6.2. Avaliação da apoptose........................................................................ 53 4.7. Análise estatística..................................................................................... 54 5. Resultados..................................................................................................... 61 5.1. Citocinas................................................................................................... 61 5.2. Fibrinogênio plasmático........................................................................... 64 5.3. Avaliação histopatológica......................................................................... 66 viii 5.3.1. Avaliação histopatológica por meio de microscopia óptica................. 66 5.3.2. Avaliação da apoptose por meio de microscopia de fluorescência..... 76 6. Discussão...................................................................................................... 81 7. Conclusão...................................................................................................... 87 8. Referências.................................................................................................... 89 9. Anexos........................................................................................................... 103 Artigo................................................................................................................ 106 RESUMO O uso de antiinflamatórios não esteroidais (AINEs) aumentou significativamente na clínica médica de pequenos animais após a descoberta de AINEs seletivos, e isso resultou em uma elevação da incidência de intoxicações por estes medicamentos. O presente estudo teve como objetivo avaliar a histologia e o índice apoptótico hepático, níveis de citocinas séricas e fibrinogênio plasmático nos ratos tratados com diclofenaco, meloxicam e firocoxibe. Utilizaram-se 90 animais que foram divididos em seis grupos de 15 animais cada: G1 - controle: 0,3mL/100g de solução fisiológica; G2 - diclofenaco de sódio: 15mg/kg; G3 – meloxicam: 2mg/kg; G4 – meloxicam: 10mg/kg; G5 – firocoxibe: 5mg/kg; G6 – firocoxibe: 25mg/kg. A medicação foi realizada por meio de gavage, a cada 24 horas, por cinco dias. Após a eutanásia dos ratos, foram colhidos materiais para dosagens de fibrinogênio e citocinas, análise histopatológica e de apoptose hepática. Os ratos tratados com diclofenaco, meloxicam e firocoxibe não apresentaram diferença estatística em relação aos índices apoptóticos hepáticos. A concentração sérica de TNF-� foi semelhante em todos os grupos avaliados, e a IL-10 foi maior nos grupos tratados com os AINEs quando comparada ao grupo de solução fisiológica. O fibrinogênio plasmático elevou-se nos ratos tratados com diclofenaco e com meloxicam. As alterações histopatológicas foram mais frequentemente observadas nos animais que receberam diclofenaco e alterações leves, com o uso de meloxicam e firocoxibe. O meloxicam e o firocoxibe foram considerados AINEs seguros, pois não causaram alterações significativas nos ratos tratados com a dose recomendada e discreto grau de toxicidade no grupo tratado com cinco vezes a dosagem. Palavras-chave: intoxicação, diclofenaco, meloxicam, firocoxibe, citocinas, apoptose, ratos. ABSTRACT The employ of non-steroidal anti-inflammatory drugs increased significantly in medical clinic of small animals after the discovery of NSAID selected and this effected in an increase of times of intoxications by these medicines. The present study aims to evaluate the histology and the hepatic apoptotic index, quantify serum dosage of cytokines and plasmatic fibrinogen in rats deal with diclofenac, meloxicam and firocoxibe. It were used 90 animals which they’re divided in six groups with 15 animals each one. G1- control: 0.3mL/100g physiologic solution; G2- diclofenac: 15mg/kg (positive control); G3- meloxicam: 2mg/kg; G4- meloxicam: 10mg/kg; G5- firocoxib: 05mg/kg; G6- firocoxib: 25mg/kg. Medication was administered though gavage every 24 hours by five days. After euthanasia of these rats, were cropped materials to dosing of fibrinogen, cytokines, hipathology and hepatic apoptosis. The rats which were under care with diclofenac, meloxicam and firocoxibe didn’t show difference statistics in report to the hepatic apoptotic index. TNF-� serum concentration was similar to all groups and IL-10 concentration was higher on the groups which were under care with the AINEs when were compared with the group of physiological solution. The plasma fibrinogen is elevated in rats treated with diclofenac and meloxicam. The most frequency histopathological changes were observed in animals that received diclofenac and mild changes, with the use of meloxicam and firocoxib. Meloxicam and firocoxib cam be considered NSAIDs safe, because they didn’t cause significatives alterations in the rats treated with the recommended dose and a slight degree of toxicity in the group treated with five times the dosage. Key words: intoxication, diclofenac, meloxicam, firocoxib, cytokines, apoptosis, rats. 20 1. INTRODUÇÃO Conhecidos pela humanidade há cerca de 100 anos, os antiinflamatórios não esteroidais (AINEs) estão dentre os antiinflamatórios mais utilizados. Apresentam um amplo espectro de indicações terapêuticas, como analgésica, antiinflamatória propriamente dita, antipirética e profilaxia contra doenças cardiovasculares (Kummer e Coelho, 2002). Atualmente, existem mais de 50 AINEs diferentes no mercado e há, ainda, uma produção contínua de novas formulações (Boothe, 2001). O foco no desenvolvimento de novos produtos está voltado para substâncias que comprovadamente causem maior alívio à dor e à inflamação e simultaneamente possuam menos efeitos colaterais (Jones e Budsberg, 2000). Os AINEs são classificados, segundo Less et al. (2004), de acordo com sua capacidade de inibir diferentes isoformas da ciclooxigenase (COX). Com base nisso, os antiinflamatórios podem ser divididos em inibidores não seletivos, como a aspirina e o cetoprofeno; preferencialmente inibidores da ciclooxigenase-2 (COX-2), como meloxicam, nimesulida e celecoxibe e por último, os inibidores seletivos da COX-2, como o valdecoxibe, firocoxibe e etoricoxibe (McCann et al., 2004). Depois da introdução dos AINEs inibidores seletivos, o uso destes aumentou significativamente na clínica médica de pequenos animais e isso resultou em uma elevação da incidência de intoxicações agudas e crônicas por estes medicamentos, que podem até levar o animal a óbito (Vollmar, 1993; Steagall et al., 2007). Um estudo retrospectivo do Hospital Veterinário da Universidade de São Paulo, entre 1998 e 2000, revelou que, dos 5136 animais atendidos no setor de emergência, 250 eram casos de intoxicações, sendo 203 (81,2%) em cães e 47 (18,8%) em gatos. As causas de intoxicação mais comuns 21 em cães foram 28,9% de produtos terapêuticos, sendo destes, 86,4% por AINEs; em gatos foram 29,9% de produtos terapêuticos, sendo 50% por AINEs (Xavier e Kogika, 2002). Barbosa et al. (2007a), em estudo retrospectivo do Hospital Veterinário da Universidade Estadual Paulista – campus de Botucatu, entre 2004 e 2006, relataram o atendimento de 242 casos de intoxicação, sendo 212 (87,6%) em cães e 30 (12,4%) em gatos. A principal causa de intoxicação em cães foi por produtos terapêuticos (40,57%), sendo destes 88,37% por AINEs (92% diclofenaco de sódio); enquanto em gatos, apenas 16,67% foram por produtos terapêuticos, sendo 60% por AINEs (66% diclofenaco de sódio). O consumo acidental do medicamento devido ao armazenamento inadequado ou a administração de drogas aos animais pelos próprios proprietários sem prescrição feita pelo médico veterinário, em doses superiores àquelas recomendadas, são riscos de intoxicação por AINEs em animais de estimação (Jones et al., 1992; Fitzgerald e Bronstein, 2006). Além disso, o aparecimento de efeitos adversos também pode estar relacionado ao uso prolongado dos antiinflamatórios (Luna et al., 2007). Frente ao exposto, torna-se importante a avaliação das alterações histopatológicas hepáticas, incluindo o índice apoptótico, a quantificação de citocinas séricas e fibrinogênio plasmático em estudo experimental com a administração dos antiinflamatórios não esteroidais diclofenaco de sódio, meloxicam e firocoxibe em ratos Wistar. 22 23 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1. Citocinas As citocinas são polipeptídeos produzidos principalmente por linfócitos ativados e macrófagos, que modulam a função de outros tipos celulares. Estão envolvidas nas respostas imunológicas, apoptose, hematopoiese e apresentam efeitos importantes na resposta inflamatória, sendo a IL-1, TNF-�, IL-6 e a IL-8 as principais mediadoras da inflamação. A liberação destas citocinas pode ser estimulada por endotoxinas, imunocomplexos, toxinas, trauma físico, dano tóxico direto nas células produtoras de citocinas, inibição de sua produção ou liberação, entre outros processos. Exercem seus efeitos de três diferentes maneiras: atuando sobre a própria célula que a produz (efeito autócrino), sobre células vizinhas (efeito parácrino), ou a nível sistêmico (efeito endócrino), sendo suas principais células alvo as células endoteliais, leucócitos e fibroblastos. A IL-1, TNF-� e IL-6 estimulam respostas sistêmicas de fase aguda associadas à infecção ou agressão, causando sinais clínicos como hipertermia e apatia, além de provocarem a liberação de neutrófilos, hormônio adrenocorticotrófico e corticosteróides para a circulação (House, 1999; Contran, 2000). A concentração sérica de citocinas é baixa ou indetectável em indivíduos saudáveis, sendo sua produção estimulada durante a invasão por microrganismos patogênicos ao hospedeiro ou em situações que comprometem a homeostase (Netea et. al., 2003). Como estes mediadores inflamatórios são liberados apenas na presença de um estímulo e por possuírem uma meia-vida curta, quando liberados, sua função se limita à atividade biológica que possuem, como, por exemplo, a comunicação entre as células. A síntese das citocinas é um evento autolimitado, portanto, elas não são estocadas permanentemente; quando ocorre 24 o estímulo, as citocinas são sintetizadas e liberadas, sendo que após a resolução do processo ativador, a concentração sérica diminui a níveis baixos ou indetectáveis (Abbas e Litchtman, 2005). A IL-1 e o TNF-� são considerados “citocinas alarmes”, ou iniciadoras, e induzem as células locais como fibroblastos, macrófagos e células endoteliais a secretarem uma segunda sequência de citocinas que amplificam a reação inflamatória (Barravieira, 1994). O TNF-� é um potente agente pró-inflamatório produzido primariamente por monócitos ativados e macrófagos. Entre outras atividades, o TNF-� pode induzir a diferenciação de macrófagos, degranulação de neutrófilos, liberação de leucotrienos e estimular a migração leucocitária para o local da lesão (Vassali, 1992; Ulloa e Tracey, 2005). Durante o processo inflamatório, o nível sérico de TNF-� eleva-se durante os primeiros 30 a 90 minutos após a exposição ao antígeno, com pico entre três e quatro horas (Cohen, 2002). Induz, ainda, a liberação de praticamente todos os mediadores da inflamação, como IL-1, IL-6, IL-8 e metabólitos do ácido araquidônico, além de estimular sua própria síntese e liberação a partir de macrófagos (Moura-Da-Silva, 1996). Existem duas formas de IL-1, a IL-1� e a IL-1�, com atividades biológicas bastante semelhantes, localizadas em genes distintos (Dinarello, 1998). A IL-1 induz a liberação de histamina por mastócitos no foco inflamatório. A histamina, por sua vez, induz uma imediata vasodilatação e aumenta a permeabilidade vascular (Feghali e Wright, 1997). A IL-10 é uma importante citocina antiinflamatória, produzida por macrófagos e monócitos e capaz de diminuir a produção de IL-1, TNF-�, IL-6 e IL- 8 por meio da degradação de RNAm (Oswald et al., 1992; Bogdan et al., 1992; 25 Oberholzer et al., 2002). Atua por meio de retroalimentação negativa, ou seja, inibindo a síntese de citocinas pró-inflamatórias (Bone et al., 1997; Doughty et al., 1998). 2.2. AINEs Os AINEs estão entre os medicamentos mais utilizados no mundo e possuem propriedades analgésicas, antipiréticas e antiinflamatórias (Maddison, 2007; Luz et al., 2006). A eficácia dos AINEs decorre da inibição, específica ou não, da atividade das enzimas cicloxigenases, fato este que resulta no bloqueio da síntese das prostaglandinas (PGs) e tromboxanos (TXs), segundo Vane e Botting (1995). Em quase todos os tecidos do organismo, foi detectada a presença estrutural da COX-1 (Dubois et al., 1998) e baixos ou indetectáveis níveis da COX-2, a qual pode ser expressa em maior quantidade mediante presença de citocinas, fatores de crescimento e estimulantes tumorais, sugerindo sua importância nas neoplasias e em processos inflamatórios (Fitzgerald e Patrono, 2001). Os mediadores pró-inflamatórios resultantes da COX-1 são representados pelas PGs relacionadas com os efeitos fisiológicos no sistema gastrointestinal (Tanaka et al., 2001; Kummer e Coelho, 2002), como a proteção da mucosa gástrica devido à inibição da secreção ácida gástrica (Vane et al., 1998; Willoughby et al., 2000; Perazella e Tray, 2001), no sistema renal, com a manutenção do fluxo sanguíneo renal e da homeostase renal e no sistema cardiovascular com a manutenção da homeostase plaquetária (Vane et al., 1998; Perazella e Tray, 2001; Kummer e Coelho, 2002). 26 O efeito citoprotetor das prostaglandinas sintetizadas pela COX-1 baseia- se em três mecanismos de ação. Primeiro, reduz a secreção ácida produzida pelas células parietais do estômago; segundo, exerce efeito direto como vasodilatador sobre a mucosa gástrica e finalmente, terceiro, aumenta o fluxo sanguíneo e mantém a integridade do tecido gástrico, além de estimular a produção de muco e bicarbonato pelas células epiteliais que tem por função proteger a mucosa de injúrias. Desta forma, preservar a função da COX-1 minimiza os efeitos adversos atribuídos aos AINEs (Clark, 2006). A prostaglandina E2 (PGE2), produzida pela via da COX-1, age sobre a motilidade gástrica, ou seja, inibe a contratilidade do músculo circular e estimula a contratilidade do longitudinal, além de favorecer o esvaziamento gástrico para alimentos líquidos e retenção em casos de alimentos sólidos (Sanders, 1984). Por outro lado, a COX-2 participa na formação de PGs presentes no processo inflamatório (Vane e Botting, 1995; Kay-Mugford et al., 2000), surgindo apenas em trauma tissular e inflamação (Kummer e Coelho, 2002). A COX-2 pode ser induzida na presença de citocinas, como interleucina-1 (IL-1), IL-2, fator de necrose tumoral alfa (TNF-�), fatores de crescimento e endotoxinas, sendo expressa caracteristicamente por células envolvidas no processo inflamatório. Por outro lado, a expressão da COX-2 pode ser inibida por glicocorticóides, IL-4, IL-13 e IL-10, além de ser regulada pela PGE2 (Carvalho, 2004). Em cães saudáveis, a COX-1 é responsável pela produção de PGE2, mas a COX-2 pode estar presente participando do mecanismo de regulação após a exposição a um agente irritante (Papich, 2008). Como referido, os AINEs são caracterizados de acordo com a sua capacidade de inibição COX-1 e/ou 2 (Pairet e Van Ryn, 2001). As drogas que 27 bloqueiam inespecificamente as cicloxigenases são importantes causadoras de efeitos colaterais, especialmente àquelas relacionados com o trato gastrointestinal (Boothe, 2001). Desde a década de 1990, vêm sendo introduzidas no mercado, AINEs com maior especificidade para COX-2, como, por exemplos, o meloxicam, carprofeno, nimesulide, celecoxibe entre outros. A incidência de intoxicação com o uso destes medicamentos tem diminuído drasticamente (Doig et al., 2000). Entretanto, há evidências recentes da presença de COX-2 em determinados tecidos humanos e animais com possíveis ações fisiológicas, pondo em discussão, se o uso de agentes antiinflamatórios com inibição específica desta isoforma teria realmente vantagens sobre os AINEs convencionais (Doig et al., 2000). A porção medular do rim é o local de maior síntese de prostaglandinas e apresenta importante expressão de COX-1 e COX-2. Esta predomina em células medulares intersticiais e parece manter a viabilidade destas células, pois em situações experimentais de desidratação e posterior tratamento com inibidores da COX-2, houve indução de apoptose (morte celular programada). Estes dados propõem o possível papel da COX-2, como coadjuvante na preservação da função renal (Kummer e Coelho, 2002). A liberação de proteínas de fase aguda é uma resposta imunológica não específica a um processo inflamatório (infecção, doenças auto-imunes) ou lesão tecidual (trauma, cirurgia, intoxicações, neoplasias). Esta liberação ocorre para restabelecer a homeostase orgânica. Citocinas pró-inflamatórias, especialmente IL-1, IL-6 e TNF-�, estimulam a produção de proteínas de fase aguda (haptoglobina, proteína C-reativa, fibrinogênio, amilóide A sérico), estimulando o surgimento da hipertermia e de leucocitose. A produção dessas proteínas é 28 predominantemente hepática. Dentre estas, a primeira reconhecida foi o fibrinogênio (Harr, 2006). A secreção de fibrinogênio é considerada um fator de risco para doença cardiovascular (Moya et al., 2002). Já uma diminuição dos níveis de fibrinogênio pode ocorrer em coagulação intravascular disseminada (CID), caquexia, lesão hepática (Harr, 2006) e após tratamento com inibidores seletivos COX-2, como o meloxicam (Moya et al., 2002). A modificação de algumas drogas, notadamente o nimesulide, visando o aumento de sua seletividade sobre a COX-2, originou estruturas sem um grupamento carboxílico e com a presença de grupos sulfonamida ou de sulfona, chamadas inibidores específicos de segunda geração. Neste grupo, incluem o celecoxibe e o rofecoxibe (Kullarny et al., 2000). Por pouparem a COX-1, os coxibes foram introduzidos como uma nova classe de AINEs de eficiências antiinflamatória e analgésica equivalentes aos medicamentos convencionais (Cannon e Breedveld, 2001) e proporcionam menor índice de complicações que os AINEs tradicionais causam (Jainn, 2000), como por exemplo, alteração gastrointestinal (Giraudel et al., 2005). Em seres humanos, os antiinflamatórios da família dos coxibes podem aumentar o risco de eventos cardiovasculares, como por exemplo, infarto de miocárdio (Mukherjee et al., 2001) e outros efeitos adversos como a trombose (Carvalho et al., 2004). Em cães, não há relatos de problemas cardíacos com o uso de celecoxibe e rofecoxibe como observados em humanos (Wismer, 2005). 2.2.1. Diclofenacos de sódio e de potássio Os diclofenacos de sódio e de potássio são utilizados na medicina humana devido à alta potência antiinflamatória e analgésica, por promover 29 inibição inespecífica das ciclooxigenases (Andrade e Jericó, 2002), assim a aplicação destas drogas tem sido limitada pelos seus efeitos colaterais que incluem lesões gastrointestinais, renais e hepáticas (Poujafar e Derakhshanfar, 2004). Em cães, pode haver grave gastroenterite hemorrágica, podendo levá-los a óbito (Andrade e Jericó, 2002). O diclofenaco de sódio foi administrado em cães, na dose de 3mg/kg, por via oral, a cada 12 horas durante quatro dias por Ramesh et al. (2002), sendo que a droga produziu úlceras gástricas e nefropatia, porém não foram demonstradas alterações hepáticas. Contudo, em humanos, o diclofenaco de sódio tem sido associado a graves quadros de hepatotoxicidade (O’Beirne e Cairns, 2001). Barbosa et al. (2007b) relataram que a intoxicação por diclofenaco de sódio é frequente em cães e os principais sinais clínicos observados são vômito, anorexia, oligodipsia e melena. Neste estudo, foi observado um aumento de alanina-amino-transferase (ALT) sugerindo lesão hepatocelular, aumento da fosfatase alcalina (FA) e gama-glutamil-transferase (GGT) indicando uma colestase e na urinálise uma bilirrubinúria, sugerindo alteração hepática. O diclofenaco de sódio não é recomendado para uso em cães devido à alta sensibilidade desta espécie a esta droga. Como é um antiinflamatório muito utilizado na medicina humana, existem muitos casos de intoxicação em cães por meio de administração desta droga pelos próprios proprietários que fazem uso dessa medicação (Andrade e Jericó, 2002). 2.2.2. Meloxicam A primeira geração dos inibidores específicos da COX-2 é representada pelos nimesulide, etodolaco e meloxicam. A descoberta da especificidade destes 30 produtos foi, na realidade, constatada após a comercialização, principalmente pelas observações clínicas na redução da incidência de efeitos colaterais gastrointestinais, sendo posteriormente confirmada por estudos in vitro. Inicialmente, sugeriu-se que o meloxicam inibia seletivamente a COX-2, baseando-se em estudos in vitro. No entanto, quando testados in vivo, em seres humanos, sua especificidade para COX-2 foi somente cerca de 10 vezes maior do que àquela para a COX-1, apresentando ainda efeitos adversos em relação à agregação plaquetária (Panara et al., 1999). O meloxicam é aprovado para uso em cães e gatos e é um medicamento muito utilizado na clínica de pequenos animais. Em cães, o meloxicam é preferencialmente seletivo para a COX-2, apresentando propriedades analgésicas, antiinflamatórias e antipiréticas (Curry et al., 2005). No entanto, produz efeitos deletérios, dose-dependentes, no trato gastrointestinal e nas células sanguíneas. Este fármaco mostrou uma ampla margem de segurança em cães, quando administrado cinco e 10 vezes a dose terapêutica durante 16 dias de tratamento (Alencar et al., 2003; Clark, 2006), porém Curry et al. (2005) relataram que, em altas doses (10mg/kg), pode diminuir a produção das prostaglandinas fisiológicas. Em outro estudo, em cães, o meloxicam não causou alterações da função renal na presença de hipotensão durante a anestesia (Boströn et al., 2006). Segundo Fusellier et al. (2008), o meloxicam não provocou efeitos adversos sobre a função renal quando administrado em animais saudáveis durante sete dias. Narita et al. (2006) relataram que a administração de meloxicam, por via oral, na dose de 0,1mg/kg a cada 24 horas em cães, não alterou as concentrações de glicose, creatinina, alanina aminotransferase e de fosfatase alcalina, que se mantiveram dentro dos padrões normais para a 31 espécie. Neste experimento, não foi detectada a presença de sangue oculto nas fezes dos animais tratados. Alterações gastrointestinais com o uso do meloxicam têm sido reportadas comumente em cães, porém a toxicidade renal é relativamente baixa e muito raramente efeitos sérios, incluindo morte, têm sido reportados (Plumb, 2005), além disso, não há comprometimento da hemostasia primária (Fresno et al., 2005). Porém a hepatotoxicidade do meloxicam em cães ainda não está bem estudada (Plumb, 2005). Em outro estudo com cães, utilizando uma, três ou cinco vezes a dose recomendada (0,1mg/kg), Clark (2006) relatou a redução na contagem de eritrócitos e no volume globular, neutrofilia, aumento da uréia e diminuição da albumina séricas, nos animais tratados com três e cinco vezes a dose recomendada. Nakagawa et al. (2005) relataram que o meloxicam pode causar hepatotoxicidade, úlcera duodenal, peritonite secundária à ulceração e morte em casos graves. Em ratos, foram relatadas lesões gástricas quando foram comparados o meloxicam (3,75 e 7,5mg/kg) e piroxicam (5 e 10mg/kg), com administração de 14 e 28 dias destes medicamentos. Neste estudo, os resultados mostraram que o meloxicam causou lesões gástricas na mesma proporção que outros AINEs tradicionais e não induziu importantes mudanças nos parâmetros hematológico, renal e hepático (Villegas et al., 2002). 2.2.3. Firocoxibe O firocoxibe é um dos mais recentes AINEs produzidos e foi desenvolvido especialmente para medicina veterinária com indicação para uso em cães. Como todo novo medicamento, avaliações minuciosas e cuidadosas são necessárias 32 para o estabelecimento da real segurança desse composto em animais. Segundo Kummer e Coelho (2002), como toda nova medicação, a observação criteriosa e adicionais análises clínicas em larga escala serão importantes para determinação do verdadeiro benefício e segurança dos medicamentos. Por serem medicamentos de alto custo, torna-se fundamental uma correta avaliação custo- benefício para o uso adequado dos atuais e futuros inibidores COX-2. Não existem estudos do firocoxibe em roedores e nem dosagens recomendadas para esta espécie até o momento. Firocoxibe é inibidor altamente seletivo da COX-2 e membro da classe coxibe, sendo desenvolvido principalmente para controle da dor em cães com osteoartrites e, apresentam como principais efeitos adversos, o vômito e inapetência (Hanson et al., 2006, Clark, 2006). McCann et al. (2004) compararam as relações de seletividade para os diversos AINEs em cães. Os resultados demonstraram que o firocoxibe é 380 vezes mais seletivo para COX-2 do que à COX-1, sendo atualmente considerado o inibidor mais seletivo da COX-2 para uso em cães. Em um estudo com cães adultos da raça Beagle, avaliou-se o efeito do firocoxibe administrado por 180 dias, nas doses de 5, 15 e 25mg/kg (uma, três e cinco vezes a dose terapêutica). Inapetência, diarréia e vômito foram observados em todos os animais tratados. A fosfatase alcalina permaneceu dentro da faixa de variação normal para a espécie, porém foi maior nos animais tratados com 15 e 25mg/kg. A albumina sérica apresentou uma diminuição transitória nos animais tratados com três e cinco vezes a dose recomendada. O mesmo protocolo experimental, agora realizado em cães jovens, evidenciou o aparecimento de 33 degeneração gordurosa hepática, edema pancreático e ulceração duodenal nos animais tratados com 15 e 25mg/kg de firocoxibe (Clark, 2006). Hanson et al. (2006) trataram 575 cães com osteoartrite com diferentes AINEs, sendo 292 cães com firocoxibe, 132 com carprofeno e 152 com etodolaco. Foi relatada diarréia em 3,1% dos cães tratados com firocoxibe, sendo destes, 0,3% com melena; 6,8% com carprofeno e 8,6% com etodolaco sendo 3,3 % com melena. Concluíram que o firocoxibe, durante 30 dias, controla a dor e a inflamação associadas à osteoartrite e apresenta baixos efeitos colaterais quando comparado aos tratamentos com carprofeno e etodolaco. Ryan et al. (2006) relataram baixo índice de alterações gastrointestinais em cães tratados com firocoxibe, porém, foram observadas alterações de comportamento, ficando os animais hiperativos após o tratamento com este AINE. Steagall et al. (2007) avaliaram os efeitos adversos do firocoxibe em seis cães sadios tratados durante 28 dias e concluíram que este AINE não causa efeitos adversos no trato gastrointestinal e não apresenta alterações hematológicas e bioquímicas séricas, sugerindo que a administração oral de firocoxibe foi bem tolerada em cães adultos e jovens saudáveis. 2.3. Efeitos adversos dos AINES Não existem evidências contundentes que demonstrem maior efetividade de um AINE sobre outro e, muitas vezes, a escolha baseia-se na menor frequência e intensidade dos efeitos colaterais e no custo da medicação (Hilário et al., 2006). É contra-indicado o uso de AINE em animais com doenças renal ou hepática, desidratação, hipotensão, trombocitopenia, evidência de ulceração 34 gástrica, ou outras desordens gastrointestinais, hemorragias e uso concomitante com outros AINEs e corticóides (Mathews, 2001). Assim como outros medicamentos, os AINEs têm potencial para causar reações adversas dada a sua toxicidade sobre vários sistemas (Luz et al., 2006), dependendo do tipo de fármaco, dose, tempo de uso, associação com outros medicamentos, além de doenças pré-existentes (Bricks e Silva, 2005). Seus efeitos colaterais mais comumente descritos são aqueles relacionados ao sistema gastrointestinal e justificados pela inibição de PGs essenciais à manutenção dos mecanismos de proteção gástrica, porém, aqueles efeitos adversos relacionados aos sistemas renal, hematológico, articular e hepático, bem como as reações de hipersensibilidade têm importância também, apesar de pouca ocorrência (Xavier et al., 2008). Os principais efeitos colaterais são descritos a seguir. 2.3.1. Trato gastrointestinal Dentre os efeitos colaterais causados pelos AINEs, os problemas gastrointestinais são a razão pela descontinuidade da terapia com antiinflamatórios ou pela adoção de tratamentos alternativos. A toxicidade é causada por dois mecanismos: 1) irritação direta da mucosa gástrica pela droga ou 2) inibição da síntese de PGs. A primeira ocorre pela característica lipofílica dos antiinflamatórios em ambiente ácido e, assim, a maior difusão através da mucosa causando sua injúria. Por outro lado, as PGs têm um efeito citoprotetor da mucosa gastrointestinal, e a inibição da sua síntese resulta em uma diminuição da produção do muco e inibição da renovação e da reparação das células da mucosa (Papich, 2008). Já Sato et al. (2009) descreveram que a injúria gástrica provocada pelos AINEs é causada por três mecanismos: inibição da atividade da 35 COX-1, inibição da atividade da COX-2 e um efeito citotóxico direto sobre o epitélio. Como referido, os eventos gastrointestinais estão entre os mais frequentes que decorrem do uso de AINEs por inibir predominantemente a COX-1 (Bricks e Silva, 2005), havendo bloqueio da síntese de PGs gástricas. Desta maneira, podem ocorrer gastrites, úlceras, hemorragias gástricas e gastroenterites (Andrade e Jericó, 2002; Sato et al., 2009). No entanto, na maioria dos casos, a toxicidade gastrointestinal está relacionada com dosagens superiores às recomendadas, embora possa ser observada com doses recomendadas em animais susceptíveis. Alguns fatores, como uso concomitante com corticosteróides ou outras doenças do sistema digestório, podem aumentar o risco de aparecimento de problemas (Papich, 2008). Entretanto, alguns estudos revelam que os inibidores seletivos da COX-2 também causam lesões locais, acompanhados ou não de sinais clínicos. O risco de efeitos adversos gastrointestinais parece estar diretamente associado à dose e ao tempo de uso (Bricks e Silva, 2005). Os AINEs preferencialmente seletivos da COX-2 causam menos ulceração gastrointestinal do que os não seletivos. Sinais de irritação gastrointestinal, como vômito e diarréia, ainda ocorrem em aproximadamente 10% dos animais tratados (Perkowski, 2006). 2.3.2. Fígado O fígado é um dos órgãos responsáveis pela manutenção da homeostase metabólica do organismo. O sangue venoso proveniente do estômago e intestino flui para a veia porta e então passa pelo fígado antes de retornar à circulação sistêmica. Assim, o fígado é o primeiro órgão a encontrar os nutrientes, drogas e 36 substâncias tóxicas provenientes da ingestão, escolhendo o destino das substâncias absorvidas da corrente sanguínea para o catabolismo, armazenamento e/ou excreção pela bile. Estas funções hepáticas podem ser alteradas por uma exposição aguda ou crônica às substancias tóxicas. A perda da função pode ocorrer quando a substância tóxica destrói um número significativo de células ou quando uma injúria crônica leva a substituição das células por um tecido não funcional. Isto ocorre, por exemplo, com o uso abusivo de etanol, que ocasiona um acúmulo de lipídeos devido à alteração da capacidade de síntese de lipoproteínas responsáveis pelo transporte de lipídeos para fora do fígado (Thomson, 1983; Treinen-Moslen, 2001). Quanto à organização estrutural, o fígado é dividido em lóbulos e ácinos. O lóbulo hepático é dividido em três regiões conhecidas como: centrolobular, zona média e periportal. O ácino é a unidade funcional hepática, que possui três zonas: a Zona 1, que está intimamente relacionada a entrada de sangue e os hepatócitos desta região são os primeiros a receber sangue e nutrientes, os últimos a serem destruídos após exposição a substâncias nocivas e os primeiros a se regenerarem; a Zona 3 é a porção final que fica encostada na veia hepática terminal e suas células são mais susceptíveis e são as primeiras a serem destruídas por receberem sangue de qualidade inferior com menor concentração de oxigênio; a Zona 2 é a intermediária. Enzimas envolvidas na bioativação e desintoxicação são encontradas ao longo dos ácinos. Altos níveis de glutationa estão presentes na Zona 1 e grandes quantidades de proteínas do complexo Citocromo P450 na Zona 3 (Treinen-Moslen, 2001). As alterações histopatológicas descritas comumente em fígado são degenerativa, inflamatória e necrótica. Dentre as degenerativas, destacam-se a 37 hidrópica e a gordurosa. A degeneração hidrópica é o acúmulo de água no meio intracelular, consequência de desequilíbrios no controle do gradiente osmótico da membrana citoplasmática e nos mecanismos de absorção, eliminação de água e eletrólitos intracelulares. É o grau mais intenso do edema celular e que geralmente conduz à morte da célula (Miranda, 2008). A degeneração gordurosa é provocada pelo desequilíbrio entre a captação hepática dos ácidos graxos e sua utilização, e as principais causas são hipoxemia, substâncias tóxicas e insuficiência de fatores lipotróficos (Rossi, 2005). Em seres humanos, a toxicidade hepática com elevação sanguínea das amino-transferases, colestase e necrose podem ocorrer, principalmente com os inibidores da COX-1 (Hilário et al., 2006). O fígado é vulnerável à lesão tóxica devido à sua localização estratégica e ao seu papel fundamental na biotransformação dos medicamentos. Degeneração e necrose hepatocelulares são alguns dos efeitos citotóxicos do medicamento sobre os componentes celulares. As lesões concorrentes também podem ser mediadas por mecanismos imunes (Davis, 1997). O uso de AINEs na medicina veterinária pode ocasionar lesão hepática, mas não é muito comum. Em um estudo com carprofeno administrado por via oral de duas semanas até cinco anos, a incidência de reações adversas como vômito, diarréia, anorexia e letargia foi de 1,3% (MacPhail et al., 1998). Em outro estudo, com a administração por via oral de carporfeno, flunexim, cetoprofeno ou meloxicam por 90 dias foram detectadas pequenas alterações clinicas e variáveis mudanças no perfil bioquímico sérico, porém sem grande importância (Luna et al., 2007). 38 Um dos efeitos relacionados ao uso dos AINEs, como relatado por Gómez-Lechon et al. (2003) quando utilizaram diclofenaco de sódio experimentalmente em ratos, é o aumento da morte celular programada (apoptose) nos hepatócitos. Esta apoptose foi observada após uma exposição à dose sub-citotóxica da droga (solução com 100μM), sem a ocorrência simultânea de necrose tecidual, e foi dependente do tempo e da dose utilizados. A apoptose é definida como um processo fisiológico altamente controlado de morte celular programada que desempenha papel fundamental na manutenção da homeostase tecidual. É importante em muitos processos fisiológicos, como no remodelamento tecidual durante o crescimento, regulação do número de células em tecidos proliferativos e mecanismos de defesa para remoção de células indesejáveis ou agressivas, como as células T reativas a auto-antígenos, células infectadas por vírus ou células neoplásicas. O desequilíbrio nesse processo pode levar a estados patológicos, principalmente quando ocorre um aumento do índice de apoptose, incluindo desordens neurológicas, isquêmicas, infecciosas ou inflamatórias (Webster, 2003). A apoptose excessiva pode resultar disfunção tecidual ou atrofia (Patel, 2000). O processo de apoptose é caracterizado por um programa de autodestruição celular estereotipado, que pode ser iniciado por vários sinais endógenos e exógenos. A apoptose é desencadeada pela ativação sequencial das caspases que destroem os substratos, requeridos pelas células não apoptóticas para processos como o controle do ciclo celular, reparação do DNA e integridade da sinalização e estrutural celular (Earnshaw et al., 1999). As caspases representam um grupo de proteases de cisteína, que está presente nas células como pró-enzimas inativas e 39 são ativadas por clivagem proteolítica de uma célula, que sofrerá apoptose (Tanaka et al., 2000). Os mecanismos moleculares responsáveis pela apoptose têm sido bem estudados, revelando uma família de proteases intracelulares, as caspases, que são responsáveis direta ou indiretamente pelas mudanças morfológicas e bioquímicas que caracterizam o fenômeno da apoptose (Reed, 2000). Apesar de existirem vários processos para ativação das caspases, apenas dois estão elucidados detalhadamente: o primeiro é controlado pela ativação de receptores da membrana plasmática (extrínseco), enquanto o segundo envolve a ativação de sinais de estresse intracelulares relacionados com danos mitocondriais (intrínseco) de acordo com Reed (2000) e Webster (2003). Nos hepatócitos, a apoptose é ativada pelo processo extrínseco, devido à presença de receptores específicos da membrana plasmática para o TNF-�. A ligação destes receptores causa a ativação das caspases, iniciando o processo apoptótico (Webster, 2003). A avaliação do índice de apoptose em um tecido pode ser realizada pela contagem de corpúsculos apoptóticos (CA) em cortes histológicos corados pela técnica de hematoxilina-eosina (HE) e microscopia de fluorescência. Tal avaliação é empregada como marcador de apoptose em estudos quantitativos em tecido hepático (Stinchcombe et al., 1995). Esses mesmos autores observaram que a técnica de microscopia de fluorescência se mostrou adequada para a identificação e quantificação de corpúsculos apoptóticos hepáticos de ratos. Esta técnica baseia-se na observação de corpúsculos apoptóticos, que apresentam intensa fluorescência da eosina em cortes histológicos de fígado corados com hematoxilina-eosina (HE) e submetidos à luz no comprimento de onda entre 450 e 40 490nm. Este dado concorda com Espada et al. (1993), que relataram a coloração HE como sendo a mais utilizada para cortes histológicos em parafina em estudos de fluorescência. 2.3.3. Rim Nos rins, as PGs têm um papel importante na modulação do tônus dos vasos sanguíneos e na regulação do equilíbrio hidro-eletrolítico. A injúria renal pelo uso de AINEs ocorre como resultado da inibição da síntese de PGs, principalmente quando associado a casos de desidratação, anestesia, choque hipovolêmico ou doenças renais pré-existentes (Mathews, 1996; Bricks e Silva, 2005, Papich, 2008). Em condições normais de volemia, a secreção de PGs renais é baixa (Lascelles et al., 2007; Delfino e Mocelin, 1995) e as mesmas não desempenham papel importante na manutenção do fluxo sanguíneo renal e da filtração glomerular. Nestas condições, a inibição de sua síntese pelos AINEs não produz alterações significativas na função renal (Delfino e Mocelin, 1995). Há diferença entre as espécies na susceptibilidade da indução de toxicidade renal pelos AINEs e isso pode estar associada com a expressão COX- 1 e COX-2. Foi demonstrado que ambas isoformas são expressas nos rins de cães, ratos, macacos e seres humanos. Entretanto, há diferenças marcantes na localização e expressão basal das COXs entre essas espécies. Por exemplo, condições que levam a depleção de volume sanguíneo resultam em um aumento marcante da expressão COX-2 em ratos e cães, mas não em macacos. Em cães, COX-2 é expressa constitutivamente na alça ascendente de Henle e na mácula densa (Boothe, 2001). Não são conhecidas, ainda, a distribuição e expressão das COX-1 e 2, em diferentes condições, nos rins dos felinos (Lascelles et al., 2007). 41 Em seres humanos, a síntese de PGs derivadas da COX-2, pela porção medular, pode ter o papel crítico na manutenção do fluxo sanguíneo renal e na modulação da reabsorção de água por meio de efeitos diretos na absorção de sódio. Estas observações sugerem que a inibição da COX-2 pode aumentar a retenção de sódio, o que compromete o fluxo sanguíneo medular, agrava a lesão por hipóxia, prejudicando assim a viabilidade da célula intersticial medular renal. Deste modo, inibidores específicos da COX-2 são capazes de desenvolver efeitos colaterais no sistema renal semelhantes aos ocasionados pelos AINEs não seletivos (Kummer e Coelho, 2002). Estes promovem alterações da função renal, resultando principalmente em edema periférico, hipertensão, inibição da excreção renal de sódio e hipercalemia (Carvalho et al., 2004). Diante de hipovolemia, o eixo renina-angiotensina-aldosterona é ativado, o que contribui para vasoconstrição sistêmica e maior reabsorção renal de sódio e água, na tentativa de manter os níveis hídricos adequados. Ao mesmo tempo, a angiotensina provoca síntese de prostaglandinas renais vasodilatadoras pela COX-1 presente nos endotélio, glomérulo e ductos coletores renais (Kummer e Coelho, 2002). O aumento concomitante das PGs renais contrabalanceia os efeitos renais de vasoconstrição, contribuindo para a manutenção da filtração glomerular (Delfino e Mocelin, 1995). Na presença de AINEs, e consequente inibição das PGs, esse mecanismo protetor falha, podendo ocasionar isquemia e danos renais irreversíveis, sendo relatadas falência renal aguda e morte em cães e gatos (Lascelles et al., 2007). A síntese de PGs em túbulos renais distais, produzidas principalmente por intermédio da COX-1, interfere no metabolismo de sódio e água. AINEs convencionais podem ocasionar redução do fluxo sanguíneo, aumento da 42 reabsorção tubular de sódio e consequente edema (Delfino e Mocelin, 1995), os quais estão entre seus efeitos adversos mais comuns em relação ao rim. Por isso, o advento dos inibidores específicos da COX-2 trouxe a possibilidade de diminuir o índice destes efeitos colaterais (Kummer e Coelho, 2002). Existe risco de doença renal crônica devido ao uso prolongado e de altas doses de AINEs ligado à persistente inibição da síntese de PGs, acarretando isquemia medular (Delfino e Mocelin, 1995). O celecoxibe e o rofecoxibe produzem moderada hipercalemia (Carvalho et al., 2004). Diferentes antiinflamatórios foram comparados quanto a sua influência sobre a excreção urinária de sódio e potássio em ratos. Diclofenaco, flubiprofeno, rofecoxibe e celecoxibe reduziram significativamente a excreção urinária de sódio e potássio. Por outro lado, o meloxicam não influiu na excreção urinária destes eletrólitos (Harirforoosh e Jamali, 2005; Harirforoosh et al., 2006). Em estudo realizado por Luna et al. (2007), a administração oral de carprofeno, flumexim, cetoprofeno ou meloxicam em cães por 90 dias, não demonstrou nenhuma evidencia de injuria renal após avaliação das bioquímica sérica e urinálise. 2.3.4. Sistema cardiovascular Em humanos, inúmeros trabalhos têm sido publicados recentemente sobre a toxicidade cardiovascular dos diversos AINEs, especialmente dos inibidores seletivos da COX-2. O mecanismo responsável por esta toxicidade ainda não está totalmente esclarecido. A hipótese mais provável envolve a ruptura no balanço da prostaciclina, que é vasodilatora e inibe a agregação plaquetária e a proliferação vascular, e do tromboxano A2 (TXA2), que causa agregação 43 plaquetária, vasoconstrição e proliferação da musculatura lisa. As plaquetas, que estimulam somente a COX-1, são as produtoras primárias de TXA2 e as células endoteliais produzem a prostaciclina em resposta a COX-2. Os AINEs, que inibem tanto COX-1 e COX-2, mantêm certa homeostase em relação a estas duas substâncias. Já os inibidores seletivos da COX-2 inibem predominantemente a prostaciclina, desviando o balanço em favor do tromboxano (Hilário et al., 2006), podendo provocar a trombose (Lascelles et al., 2007). Há indicativos que a cardiotoxicidade seja dose-dependente e proporcional à seletividade para COX-2 (Araujo et al., 2005). Entretanto, este mecanismo não ocorre frequentemente em animais domésticos, pois os AINEs não são usados cronicamente (Boothe, 2001). Desconhecem-se estudos publicados que avaliam a administração crônica de drogas seletivas para COX-2 na incidência de trombose vascular em gatos (Lascelles et al., 2007). 2.3.5. Alterações hemostáticas e hematológicas A hemostasia primária é mediada pela interação entre o endotélio vascular e as plaquetas, que estimulam a COX-1 (Fresno et al., 2005). As alterações clínicas observadas devido à administração de AINEs não seletivos são causadas principalmente pelo bloqueio da agregação plaquetária, devido à inibição da síntese dos TXs (Andrade e Jericó, 2002). Em um estudo realizado por Fresno et al. (2005), foi descrito que durante a administração pré-operatória de meloxicam (preferencialmente seletivo para COX-2) para controle da dor em cadelas saudáveis submetidas a ovariosalpingohisterectomia, não houve alteração da função plaquetária, portanto sem comprometimento da hemostasia 44 primária. Outras alterações que podem ocorrer com o uso de AINEs são anemia aplásica, trombocitopenias, leucopenias e agranulocitoses (Andrade e Jericó, 2002). O foco no desenvolvimento de novos antiinflamatórios está na busca de medicamentos que tenha eficiência no controle da inflamação e simultaneamente apresente menos efeitos deletérios aos animais. A maioria das pesquisas, na Medicina Veterinária, está direcionada às alterações gastrointestinais dos AINEs. Existem várias controvérsias em torno dos AINEs em relação à segurança, eficácia, hepato e nefrotoxicidades, porém, não há estudos, até o presente momento, que sejam capazes de responder todas estas questões (Taboaba e Papich, 2006). Devido à escassez de relatos sobre estudos de hepatotoxicidade, índice de apoptose e relação das citocinas inflamatórias (TNF-�), citocinas reguladoras (IL-10) e proteínas de fase aguda (como o fibrinogênio) com o dano tóxico causado nas células por meio do uso de drogas antiinflamatórias no rato, o presente estudo é de grande importância, pois os dados obtidos irão trazer novas informações sobre estes medicamentos, contribuindo ainda como modelo experimental para outros animais e para o homem. 45 46 3. OBJETIVOS 3.1. Objetivo Geral Avaliar a histologia e o índice apoptótico hepático, níveis de citocinas séricas e fibrinogênio plasmático em ratos tratados com os antiinflamatórios não esteroidais diclofenaco, meloxicam e firocoxibe. 3.2. Objetivos específicos Os objetivos específicos do presente ensaio experimental após a administração de diclofenaco, meloxicam e firocoxibe em ratos foram: - Avaliar o índice apoptótico hepático; - Quantificar as citocinas séricas (TNF-� e IL-10); - Quantificar o fibrinogênio plasmático; - Avaliar as características histopatológicas hepáticas de cada antiinflamatório; - Estudo comparativo entre a dose terapêutica e em concentração cinco vezes a dose terapêutica do antiinflamatório meloxicam em ratos, avaliando a margem de segurança entre estas duas dosagens; - Estudo comparativo entre duas diferentes dosagens do antiinflamatório firocoxibe em ratos; - Avaliar os efeitos do tratamento com firocoxibe em ratos. 47 48 4. MATERIAL E MÉTODOS Para avaliar os efeitos tóxicos dos AINEs: diclofenaco de sódio (inibidor não seletivo da COX), meloxicam (inibidor preferencial da COX-2) e firocoxibe (inibidor específico COX-2) foram analisadas as alterações hepáticas, de citocinas e de fibrinogênio plasmático. A duração dos tratamentos foi padronizada em cinco dias. Foi realizado estudo piloto para a padronização da dose do diclofenaco de sódio. As dosagens inicialmente utilizadas no estudo foram baseadas nos relatos de Aydin et al. (2003) sobre alterações histopatológicas no fígado e nos rins dos ratos. No estudo piloto, inicialmente foi utilizada alta dose de diclofenaco, 150mg/kg a cada 24 horas, mas 100% dos animais vieram a óbito logo após o final do tratamento. Quando foram testadas dosagens média (100mg/kg a cada 24 horas) e baixa (50mg/kg a cada 24 horas) deste AINE, 50% dos ratos de cada grupo vieram a óbito após o final do tratamento, não sendo possível a realização dos exames de todos os animais. A dosagem foi reduzida para 15mg/kg a cada 24 horas, ou seja, cinco vezes a dosagem recomendada de 3mg/kg a cada 24 horas que foi selecionada baseada em estudos experimentais (Tiseo et al., 2006; Minossi et al., 1998; Tognini et al., 1998), sendo também utilizada por Sallustio e Holbrook (2001). A dosagem de meloxicam empregada foi de 2mg/kg a cada 24 horas, de acordo com Kirchgessner (2006) e Roughan et al. (2004). Em cães, foram observados efeitos deletérios do meloxicam no sistema digestório e nas células sanguíneas quando administrado cinco vezes a dose terapêutica durante 16 dias de tratamento (Alencar et al., 2003). Assim, a dosagem de 10mg/kg do meloxicam a cada 24 horas também foi usada no presente estudo. 49 Como não existem dosagens de firocoxibe para roedores e nem estudos experimentais nesta espécie, a dosagem deste fármaco foi a mesma recomendada para cães e cinco vezes mais, ou seja, 5mg/kg a cada 24 horas (Steagall et al., 2007) e 25mg/Kg. 4.1. Animais e ambiente de experimentação Para a realização deste experimento, foram utilizados ratos Wistar não isogênicos, machos, adultos (dois meses de idade), hígidos, com 250 ± 20g de peso corpóreo, provenientes do Biotério de Criação do Departamento de Clínica Médica da Faculdade de Medicina da UNESP, campus de Botucatu. Os animais foram mantidos no Biotério de Experimentação do departamento supracitado, em gaiolas coletivas de 46x30x16cm, composta de caixa de polipropileno e com grade de aço cromado (cinco animais em cada gaiola forrada com maravalha) no Biotério de Experimentação do Departamento de Clínica Médica (Figura 01), em ambiente com controle de luz (ciclos de 12 horas), temperatura constante (25ºC), umidade do ar de 55 a 65% e tempo de exaustão de 10 trocas de ar da sala/hora, recebendo dieta padrão para animais de laboratório (Purina®) e água ad libitum. Os ratos passaram por um período de sete dias para adaptação ao ambiente. As técnicas utilizadas e o manejo dos animais realizado nesse estudo foram aprovados pela Câmara de Ética em Experimentação Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – UNESP, campus de Botucatu (Anexos 9.1. Protocolo no 43/2007-CEEA). 50 4.2. Formação dos grupos experimentais Foram utilizados 90 animais divididos aleatoriamente em seis grupos contendo 15 animais cada. Os animais foram submetidos à administração dos fármacos, a cada 24 horas, totalizando cinco aplicações conforme a descrição a seguir: �� G1 - controle: 0,3mL/100g de peso corporal de solução fisiológica �� G2 - diclofenaco de sódio (Voltaren�1): 15mg/kg de peso corporal �� G3 – meloxicam (Meloxicam�2): 2mg/kg de peso corporal �� G4 – meloxicam (Meloxicam�): 10mg/kg de peso corporal �� G5 – firocoxibe (Previcox�3): 5mg/kg de peso corporal �� G6 – firocoxibe (Previcox�): 25mg/kg de peso corporal Os AINEs foram remanipulados, com excipiente inerte, na farmácia de manipulação localizada em Botucatu - SP com a dosagem específica de cada tratamento. O conteúdo de cada cápsula foi diluído em solução fisiológica e a administração dos medicamentos foi realizada por via intragástrica através do método de gavage (Figura 02) descrito por Bauck e Bihun (1997). 4.3. Momentos Cada um dos grupos citados foi separado em subgrupos de cinco animais utilizados para a obtenção das amostras em cada momento de avaliação. Os momentos (M) de avaliação utilizados, como ilustra a figura 03, foram: 1 Voltaren: Novartis, São Paulo - SP, Brasil. 2 Meloxicam: SEM, São Bernardo do Campo - SP, Brasil. 4 Previcox: Merial, Campinas - SP, Brasil. 51 �� M1 – 48h após o início do tratamento; �� M2 – 96h após o início do tratamento; �� M3 – 72h após o término do tratamento; Figura 03 – Esquema representativo da administração dos medicamentos e dos momentos de avaliação utilizados nesse experimento. Os animais foram submetidos à eutanásia no final de cada momento e para tal procedimento foi utilizado pentobarbital sódico na dose de 150mg/kg de peso corporal via intraperitoneal (Figura 04). 4.4. Quantificação de citocinas 4.4.1. Colheita de amostras Nos momentos indicados (M1, M2 e M3), os ratos foram eutanasiados e o sangue foi colhido diretamente do ventrículo esquerdo por meio de punção intracardíaca (Figura 05). As amostras foram centrifugadas a 600g durante 10 minutos e os soros foram estocados a -80oC para posterior dosagem das citocinas. 52 4.4.2. Detecção da produção de citocinas Para a detecção das citocinas nos soros dos animais, as amostras foram submetidas ao ensaio imunoenzimático (ELISA). Para cada uma das citocinas avaliadas (TNF-� e IL-10), foram utilizados kits comerciais seguindo-se o protocolo especificado pelo fabricante (R & D Systems®). A concentração foi referida em pg/mL. As análises de citocinas foram realizadas no laboratório de Imunologia do Instituto de Biociências – UNESP, campus de Botucatu - SP. 4.5. Dosagem de fibrinogênio plasmático O fibrinogênio foi dosado no sangue dos animais por meio da técnica de precipitação térmica (Kaneko, 1997) e a leitura foi realizada em refratômetro (T2- Ne Clinical - ATAGO). Estas dosagens foram realizadas pelo Laboratório Clínico do Departamento de Clínica Veterinária da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia - UNESP, campus de Botucatu – SP. 4.6. Avaliação histológica Após a eutanásia dos animais, realizou-se a retirada do fígado que foi separado em fragmentos. Os fragmentos hepáticos de cada animal foram fixados em solução de Carnoy modificada (60% metanol, 30% clorofórmio e 10% ácido acético glacial) durante 24 horas (Figura 06). Em seguida, os fragmentos foram colocados em solução de álcool 70% permanecendo até a inclusão em parafina. A partir dos blocos de parafina, foram realizados cortes histológicos de três micrômetros para a coloração com Hematoxilina-Eosina (HE). A confecção das lâminas e a coloração destas com HE foram realizados na Histotech Lâminas Didáticas, localizada na cidade de São Paulo - SP. 53 4.6.1. Avaliação morfológica Um fragmento de fígado de cada animal foi estudado, totalizando 90 amostras. Para a avaliação histopatológica dos fragmentos hepáticos, as alterações foram classificadas em degenerativa, inflamatória e necrótica. Foi feito a leitura de toda a lâmina histológica, com objetiva de 40x e ocular de 10x (A: 400x). Quando observado acúmulo de substâncias no interior da célula, as lesões foram consideradas degenerativas. A degeneração hidrópica (acúmulo de água) foi caracterizada morfologicamente por granulação citoplasmática, enquanto que a degeneração gordurosa (acúmulo de gordura) foi definida quando o citoplasma apresentava-se com vacuolização. As lesões inflamatórias foram caracterizadas pela presença de infiltrado inflamatório mononuclear intersticial ou periportal, enquanto morte das células hepáticas estava presente nas lesões necróticas. A intensidade da lesão foi classificada pela utilização de escores considerando a percentagem de campos apresentando as lesões, da seguinte forma: ausente (0), 1+ (leve), 2+ (moderado) e 3+ (acentuado) adaptado de Moreira et al. (2009). 4.6.2. Avaliação da apoptose Para a determinação do índice de corpúsculos apoptóticos (CA) em cortes histológicos de fígado de rato, foi utilizada a técnica de microscopia de fluorescência descrita por Stinchcombe et al. (1995), usando microscópio Nikon (Tokyo, Japan) equipado com uma unidade de epifluorescência. Este método é baseado na forte fluorescência do CA nos cortes histológicos do fígado corado com HE, submetidos a um comprimento de onda 450 a 490nm (azul). A 54 identificação do CA foi confirmada desligando a emissão da luz azul e voltando para a microscopia óptica para avaliar a morfologia dos hepatócitos segundo critério descrito por Goldsworthy et al. (1996). O CA foi representado por corpúsculos acidofílicos com fragmentação ou ausência de cromatina com condensação e/ou fragmentação do citoplasma. Os resultados foram expressos como o número de CA/mm2 de área do corte. A análise de lâminas com cortes de fígado foi realizada no Laboratório de Dieta, Nutrição e Câncer, da Faculdade de Ciências Farmacêuticas - USP, campus de São Paulo – SP. 4.7. Análise estatística Foi realizada a comparação entre momentos no mesmo grupo e entre grupos nos diferentes momentos. Para os dados com distribuição normal foi empregada a ANOVA e quando não havia, foi utilizada a ANOVA on Ranks, seguida quando necessário de um teste de comparação múltipla. Para os resultados da análise histopatológica e das citocinas séricas, foi empregado o Teste de Kruskal-Walis, enquanto que para os dados de fibrinogênio plasmático, o Teste de Tukey. Todos os testes foram realizados considerando-se o nível de 5% de significância (Morrison, 1990). Quando o resultado do teste estatístico revelou significância, as indicações das diferenças foram apresentadas por meio de letras maiúsculas (linha) ou minúsculas (coluna) diferentes. 55 A B C Figura 01 - (A) sala do biotério de experimentação do Departamento de Clínica Médica da Faculdade de Medicina – UNESP, Campus de Botucatu – SP; (B) gaiola contendo cinco animais de cada subgrupo; (C) rato macho Wistar. 56 Figura 02 - Sequência da administração dos AINEs pelo método de gavage descrito por Bauck e Bihun (1997). 57 Figura 04 - Administração de pentobarbital por via intraperitoneal para a eutanásia dos animais. 58 Figura 05 – Procedimento de colheita de sangue por punção intracardíaca após a eutanásia dos ratos Wistar. 59 A C B D Figura 06 – (A) necropsia do rato do grupo 1 para retirada do fígado; (B) fígado após remoção em placa de petri; (C) cortes do tecido hepático para posterior fixação e (D) fragmento de fígado fixado em solução de Carnoy modificado. 60 61 5. RESULTADOS 5.1. Citocinas Os valores médios e os desvios padrão de IL-10 e TNF-� (pg/mL) nos diferentes grupos e momentos estão mostrados nas tabelas 1 e 2, respectivamente. Quando os valores médios de IL-10 foram comparados entre grupos nos diferentes momentos, observou-se que no M1 (48h após o início do tratamento), a concentração sérica de IL-10 no G3 (meloxicam 2mg/kg) e G6 (firocoxibe 25mg/kg) foi significativamente maior (p<0,05) do que no G1 (controle). No M2 (96h após o início do tratamento), o G1 foi estatisticamente menor (p<0,05) que G3 e G4 e o G3 foi maior que G5 (firocoxibe 5mg/kg). Contudo no M3 (72h após o término do tratamento), a IL-10 no G4 foi significativamente menor do que no G3 (p<0,05). Contudo, na comparação entre momentos no mesmo grupo, a concentração sérica de IL-10 no G4 foi significativamente maior (p<0,05) no M2 em relação ao M3. No G5, houve uma tendência (p=0,090) da concentração dessa citocina ser menor no M2. Nos demais grupos, não houve diferença significativa no nível sérico de IL-10 (p<0,05). Para a dosagem de TNF-�, não foi detectada diferença estatística entre os grupos nos diferentes momentos e nem entre momentos dentro do mesmo grupo (p>0,05). 62 Tabela 1 – Valores médios de IL-10 sérica em pg/mL dos grupos e seus respectivos desvios padrão nos diferentes momentos (M1= 48h após início do tratamento, M2= 96h após o início do tratamento e M3= 72h após o término do tratamento). Grupos M1 (n=5) M2 (n=5) M3 (n=5) G1 23,50±1,49bA 24,41±3,85cA 25,33±2,51abA G2 29,03±8,27abA 28,18±5,39abcA 30,03±4,51abA G3 30,49±4,90aA 33,19±7,52aA 30,10±5,43aA G4 30,52±6,36abAB 31,39±6,54abA 24,80±1,55bB G5 28,53±4,05abA 25,59±1,89bcA 28,93±4,23abA G6 29,89±4,88aA 27,57±5,16abcA 29,26±8,34abA Letras minúsculas iguais na mesma coluna e letras maiúsculas iguais na mesma linha não diferem entre si (p>0,05). G1= controle (0,3mL/100g de solução fisiológica por via intragástrica a cada 24 horas) G2= Diclofenaco de sódio (15mg/kg por via intragástrica a cada 24 horas) G3= Meloxicam (2mg/kg por via intragástrica a cada 24 horas) G4= Meloxicam (10mg/kg por via intragástrica a cada 24 horas) G5= Firocoxibe (5mg/kg por via intragástrica a cada 24 horas) G6= Firocoxibe (25mg/kg por via intragástrica a cada 24 horas) 63 Tabela 2 – Valores médios de TNF-� sérico em pg/mL dos grupos e seus respectivos desvios padrão nos diferentes momentos (M1= 48h após início do tratamento, M2= 96h após o início do tratamento e M3= 72h após o término do tratamento). Grupo M1 (n=5) M2 (n=5) M3 (n=5) G1 9,24±2,21 9,95±2,37 9,03±1,88 G2 9,68±2,65 9,92±1,95 9,38±2,17 G3 9,44±2,108 9,27±1,47 9,31±1,76 G4 9,51±1,89 9,82±1,55 9,59±2,18 G5 8,96±1,88 9,87±2,10 9,62±2,18 G6 10,14±2,15 8,99±2,24 9,36±2,67 G1= controle (0,3mL/100g de solução fisiológica por via intragástrica a cada 24 horas) G2= Diclofenaco de sódio (15mg/kg por via intragástrica a cada 24 horas) G3= Meloxicam (2mg/kg por via intragástrica a cada 24 horas) G4= Meloxicam (10mg/kg por via intragástrica a cada 24 horas) G5= Firocoxibe (5mg/kg por via intragástrica a cada 24 horas) G6= Firocoxibe (25mg/kg por via intragástrica a cada 24 horas) 64 5.2. Fibrinogênio plasmático Os valores médios do fibrinogênio plasmático (mg/dL) e seus respectivos desvios padrão nos diferentes grupos e momentos estão apresentados na tabela 3. A comparação entre momentos nos diferentes grupos revelou que a concentração de fibrinogênio no M1 do G4 foi significativamente maior do que o G1 (solução fisiológica) e do que o G2 (diclofenaco de sódio 15mg/kg) (p<0,05). O fibrinogênio no M2 foi estatisticamente maior no G2 em relação ao G5 (p<0,05). No M3, não foi observada diferença estatística entre os grupos (p>0,05). No entanto, na comparação dentro do mesmo grupo nos diferentes momentos, observou-se que no G2, o fibrinogênio plasmático foi significativamente maior no M2 em relação ao M1 e M3 (p<0,05). No G4, houve uma tendência estatística (p=0,066) do fibrinogênio ser maior no M1 em relação ao M3. Não foi detectada diferença significativa entre os momentos estudados nos demais grupos (p>0,05). 65 Tabela 3 – Valores médios de fibrinogênio plasmático em mg/dL dos grupos e seus respectivos desvios padrão nos diferentes momentos (M1= 48h após início do tratamento, M2= 96h após o início do tratamento e M3= 72h após o término do tratamento). Grupo M1 (n=5) M2 (n=5) M3 (n=5) G1 166,67±51,64bA 183,33±40,82abA 160,00±54,77aA G2 160,00±54,77bB 400,00±0,00aA 171,43±48,80aB G3 360,00±167,33abA 240,00±207,36abA 220,00±109,54aA G4 360,00±89,44aA 300,00±200,00abA 160,00±54,77aA G5 220,00±109,54abA 140,00±54,77bA 180,00±44,72aA G6 200,00±122,47abA 200,00±122,47abA 180,00±130,40aA Letras minúsculas iguais na mesma coluna e letras maiúsculas iguais na mesma linha não diferem entre si (p<0,05). G1= controle (0,3mL/100g de solução fisiológica por via intragástrica a cada 24 horas) G2= Diclofenaco de sódio (15mg/kg por via intragástrica a cada 24 horas) G3= Meloxicam (2mg/kg por via intragástrica a cada 24 horas) G4= Meloxicam (10mg/kg por via intragástrica a cada 24 horas) G5= Firocoxibe (5mg/kg por via intragástrica a cada 24 horas) G6= Firocoxibe (25mg/kg por via intragástrica a cada 24 horas) 66 5.3. Avaliação histopatológica 5.3.1. Avaliação histopatológica por meio de microscopia óptica As alterações encontradas durante a avaliação das lâminas de cortes histológicos de fígado dos animais tratados foram: infiltrado inflamatório mononuclear periportal e intersticial, degeneração hidrópica, degeneração gordurosa e necrose coagulativa, sendo as três últimas mais frequentes. Os resultados encontrados entre os grupos nos três momentos para degeneração hidrópica, degeneração gordurosa, necrose, infiltrado inflamatório mononuclear periportal e intersticial estão descritos nas tabelas 4, 5, 6, 7 e 8. Quanto à degeneração hidrópica (Figura 07), pode-se observar que na análise dentro do mesmo grupo nos diferentes momentos, no G5, o M2 foi superior ao M1 e ao M3, e no G6, o M2 foi significativamente maior que o M3, que por sua vez foi superior ao M1 (p<0,05). Na comparação entre momentos nos diferentes grupos, o G2 foi significativamente maior que os demais grupos no M1 e no M3, e o G6 foi significativamente maior que G1 e G2 no M2 (p<0,05), que, por sua vez foram iguais ao G3, G4 e G5. No M3, o G2 foi estatisticamente superior aos demais grupos (p<0,05). Avaliando os resultados estatísticos da degeneração gordurosa (Figura 08), detectou-se que a comparação entre grupos não apresentou diferença significativa (p>0,05), porém quando se realizou a comparação no mesmo grupo entre momentos, observou-se que no G2, o M3 foi superior ao M1 (p<0,05) e que o M2 não diferiu de M1 e M3. No G3, o M3 foi significativamente maior que o M2 (p<0,05) e no M1 não apresentou diferença estatística em relação ao M2 e M3. 67 Em relação à necrose coagulativa, a análise dos resultados demonstrou que na comparação dentro do mesmo grupo nos diferentes momentos, não foi observada diferença estatística (p>0,05), já a comparação entre grupos nos diferentes momentos, pode-se observar que no M2, o G2 foi significativamente maior (p<0,05) que os demais grupos, enquanto que no M3, o G1 foi estatisticamente menor que os demais grupos (p<0,05). Pela análise dos resultados de infiltrado inflamatório mononuclear periportal, pode-se observar que não houve diferença estatística entre os grupos e nem entre os diferentes momentos (p>0,05). Avaliando os dados obtidos de infiltrado inflamatório mononuclear intersticial, detectou-se que na comparação do mesmo grupo nos diferentes momentos, no G2, o M2 foi superior ao M1 (p<0,05) e o M3 foi igual ao M1 e ao M2. Contudo, a comparação dos valores entre momentos nos diferentes grupos, no M2, o G2 foi estatisticamente maior que os demais grupos (p<0,05). 68 Tabela 4 – Valores médios (escore) de degeneração hidrópica nos diferentes grupos e seus respectivos desvios padrão nos diferentes momentos (M1= 48h após início do tratamento, M2= 96h após o início do tratamento e M3= 72h após o término do tratamento). Grupo M1 (n=5) M2 (n=5) M3 (n=5) G1 0,17±0,41bA 0,17±0,41bA 0,0±0,0bA G2 1,2±0,45aA 1,20±0,45bA 1,7±0,49aA G3 0,20±0,45bA 1,00±1,22abA 0,0±0,0bA G4 0,0±0,0bA 0,60±0,89abA 0,40±0,89bA G5 0,0±0,0bB 1,2±0,84abA 0,0±0,0bB G6 0,0±0,0bC 1,6±0,55aA 0,40±0,89bB Letras minúsculas iguais na mesma coluna e letras maiúsculas iguais na mesma linha não diferem entre si (p>0,05). G1= controle (0,3mL/100g de solução fisiológica por via intragástrica a cada 24 horas) G2= Diclofenaco de sódio (15mg/kg por via intragástrica a cada 24 horas) G3= Meloxicam (2mg/kg por via intragástrica a cada 24 horas) G4= Meloxicam (10mg/kg por via intragástrica a cada 24 horas) G5= Firocoxibe (5mg/kg por via intragástrica a cada 24 horas) G6= Firocoxibe (25mg/kg por via intragástrica a cada 24 horas) 69 Figura 07 – Fígado de rato do grupo 6, com presença desarranjo das traves de hepatócitos e granulação citoplasmática condizente com degeneração hidrópica (HE, 400x). 70 Tabela 5 – Valores médios (escore) de degeneração gordurosa nos diferentes grupos e seus respectivos desvios padrão nos diferentes momentos (M1= 48h após início do tratamento, M2= 96h após o início do tratamento e M3= 72h após o término do tratamento). Grupo M1 (n=5) M2 (n=5) M3 (n=5) G1 0,17±0,41A 0,17±0,41A 0,40±0,55A G2 0,0±0,0B 1,00±1,00AB 1,29±0,95A G3 0,60±0,89AB 0,20±0,45B 1,60±0,89A G4 1,00±0,71A 0,60±0,55A 1,40±0,55A G5 1,00±0,71A 0,20±0,45A 0,80±0,84A G6 1,00±0,71A 0,60±0,89A 0,60±0,55A Letras maiúsculas iguais na mesma linha não diferem entre si (p>0,05). G1= controle (0,3mL/100g de solução fisiológica por via intragástrica a cada 24 horas) G2= Diclofenaco de sódio (15mg/kg por via intragástrica a cada 24 horas) G3= Meloxicam (2mg/kg por via intragástrica a cada 24 horas) G4= Meloxicam (10mg/kg por via intragástrica a cada 24 horas) G5= Firocoxibe (5mg/kg por via intragástrica a cada 24 horas) G6= Firocoxibe (25mg/kg por via intragástrica a cada 24 horas) 71 Figura 08 – Fígado de rato do grupo 2, apresentando vacuolização citoplasmática condizente com degeneração gordurosa (HE, 400x). 72 Tabela 6 – Valores médios (escore) de necrose coagulativa nos diferentes grupos e seus respectivos desvios padrão nos diferentes momentos (M1= 48h após início do tratamento, M2= 96h após o início do tratamento e M3= 72h após o término do tratamento). Grupo M1 (n=5) M2 (n=5) M3 (n=5) G1 0,0±0,0a 0,0±0,0b 0,0±0,0b G2 0,0±0,0a 0,60±0,55a 0,43±0,53a G3 0,40±0,55a 0,0±0,0b 0,40±0,55a G4 0,40±0,55a 0,0±0,0b 0,20±0,45a G5 0,40±0,55a 0,0±0,0b 0,40±0,55a G6 0,20±0,45a 0,0±0,0b 0,40±0,55a Letras minúsculas iguais na mesma coluna não diferem entre si (p>0,05). G1= controle (0,3mL/100g de solução fisiológica por via intragástrica a cada 24 horas) G2= Diclofenaco de sódio (15mg/kg por via intragástrica a cada 24 horas) G3= Meloxicam (2mg/kg por via intragástrica a cada 24 horas) G4= Meloxicam (10mg/kg por via intragástrica a cada 24 horas) G5= Firocoxibe (5mg/kg por via intragástrica a cada 24 horas) G6= Firocoxibe (25mg/kg por via intragástrica a cada 24 horas) 73 Tabela 7 – Valores médios (escore) de infiltrado inflamatório mononuclear periportal nos diferentes grupos e seus respectivos desvios padrão nos diferentes momentos (M1= 48h após início do tratamento, M2= 96h após o início do tratamento e M3= 72h após o término do tratamento). Grupo M1 (n=5) M2 (n=5) M3 (n=5) G1 0,0±0,0 0,0±0,0 0,20±0,45 G2 0,20±0,45 0,0±0,0 0,0±0,0 G3 0,0±0,0 0,20±0,45 0,0±0,0 G4 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 G5 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 G6 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 G1= controle (0,3mL/100g de solução fisiológica por via intragástrica a cada 24 horas) G2= Diclofenaco de sódio (15mg/kg por via intragástrica a cada 24 horas) G3= Meloxicam (2mg/kg por via intragástrica a cada 24 horas) G4= Meloxicam (10mg/kg por via intragástrica a cada 24 horas) G5= Firocoxibe (5mg/kg por via intragástrica a cada 24 horas) G6= Firocoxibe (25mg/kg por via intragástrica a cada 24 horas) 74 Figura 09 – Fígado de rato do grupo 2, apresentando células inflamatórias mononucleares ao redor dos ductos biliares condizente com infiltrado periportal (HE, 200x). 75 Tabela 8 – Valores médios (escore) de infiltrado inflamatório mononuclear intersticial nos diferentes grupos e seus respectivos desvios padrão nos diferentes momentos (M1= 48h após início do tratamento, M2= 96h após o início do tratamento e M3= 72h após o término do tratamento). Grupo M1 (n=5) M2 (n=5) M3 (n=5) G1 0,20±0,45a 0,0±0,0b 0,20±0,45a G2 0,0±0,0aB 0,80±0,45aA 0,14±0,38aAB G3 0,20±0,45a 0,0±0,0b 0,40±0,89a G4 0,40±0,55a 0,0±0,0b 0,20±0,45a G5 0,20±0,45a 0,0±0,0b 0,40±0,55a G6 0,20±0,45a 0,0±0,0b 0,60±0,55a Letras minúsculas iguais na mesma coluna e letras maiúsculas iguais na mesma linha não diferem entre si (p>0,05). G1= controle (0,3mL/100g de solução fisiológica por via intragástrica a cada 24 horas) G2= Diclofenaco de sódio (15mg/kg por via intragástrica a cada 24 horas) G3= Meloxicam (2mg/kg por via intragástrica a cada 24 horas) G4= Meloxicam (10mg/kg por via intragástrica a cada 24 horas) G5= Firocoxibe (5mg/kg por via intragástrica a cada 24 horas) G6= Firocoxibe (25mg/kg por via intragástrica a cada 24 horas) 76 5.3.2. Avaliação da apoptose por meio de microscopia de fluorescência Para a avaliação da apoptose, empregou-se a contagem dos corpúsculos apoptóticos (CA) presentes no corte histológico do fígado. Os resultados foram expressos como número de corpúsculos apoptóticos/mm2 de área do corte. A média e desvio padrão estão descritos na tabela 9. As figuras 10 e 11 ilustram a célula apoptótica em fígado, sendo utilizadas como padrão morfológico para as células que apresentavam fluorescência. Detectaram-se corpúsculos apoptóticos com cromatina e sem cromatina. Após a comparação entre os seis grupos e entre os momentos estudados, não houve diferença estatística significante (p>0,05). Houve uma tendência estatística (p=0,063) do M1, no G2, ser menor em relação ao M2 e M3. 77 Tabela 9 – Valores médios de CA/mm2 nos diferentes grupos e seus respectivos desvios padrão nos diferentes momentos (M1= 48h após início do tratamento, M2= 96h após o início do tratamento e M3= 72h após o término do tratamento). Grupo M1 (n=5) M2 (n=5) M3 (n=5) G1 1,52±1,02 1,04±0,65 1,13±0,92 G2 0,24±0,10 1,17±0,92 0,59±0,44 G3 2,29±3,15 1,28±0,93 0,93±0,44 G4 1,02±0,59 0,80±0,37 1,16±0,93 G5 2,70±3,96 1,15±1,11 1,05±0,61 G6 2,25±3,55 0,85±0,15 0,67±0,47 G1= controle (0,3mL/100g de solução fisiológica por via intragástrica a cada 24 horas) G2= Diclofenaco de sódio (15mg/kg por via intragástrica a cada 24 horas) G3= Meloxicam (2mg/kg por via intragástrica a cada 24 horas) G4= Meloxicam (10mg/kg por via intragástrica a cada 24 horas) G5= Firocoxibe (5mg/kg por via intragástrica a cada 24 horas) G6= Firocoxibe (25mg/kg por via intragástrica a cada 24 horas) 78 BA DC Figura 10 – Fígado de rato do grupo 3 (A) CA hepático visualizado pela microscopia de fluorescência (seta) e (B) pela microscopia de luz (seta). Fígado de rato do grupo 2 (C) CA hepático com cromatina visualizado pela microscopia de fluorescência (seta) e (D) pela microscopia de luz (seta) (HE, 400x). 79 A B Figura 11 – Fígado de rato do grupo 5 (A) Corpúsculos apoptóticos hepático (setas) e com cromatina (seta larga) visualizado pela microscopia de fluorescência e (B) pela microscopia de luz (setas) (HE, 400x). 80 81 6. DISCUSSÃO O TNF-� é o primeiro mediador inflamatório a ser produzido em resposta a um estímulo, sendo considerado um mediador primário do sistema imune inato e crucial para induzir proteção local (Ulloa e Tracey, 2005). Durante o processo inflamatório, o nível sérico de TNF-� eleva-se durante os primeiros 30 a 90 minutos após a exposição ao antígeno, com pico entre três e quatro horas, com meia-vida de 1 a 2 dias (Cohen, 2002). A IL-10 é a principal citocina contra-reguladora da resposta imune inata (Oberholzer et al., 2002). Atua como citocina antiinflamatória agindo por retroalimentação negativa, ou seja, inibindo a síntese de citocinas pró- inflamatórias. Elevadas concentrações de IL-10 reduzem a produção de TNF-� pelos monócitos (Doughty et al., 1998). Oberholzer et al.(2002) sugeriram que a magnitude da resposta da IL-10 parece correlacionar-se com a gravidade do processo inflamatório e a concentração de citocinas pró-inflamatórias, com a ativação da TNF-�. Existe, de fato, um mecanismo homeostático que envolve a IL-10 e as citocinas pró-inflamatórias. Enquanto o TNF-� e outras citocinas estimulam a síntese de IL-10, na vigência de estímulo inflamatório, esta bloqueia a síntese de TNF-� de forma diretamente proporcional à resolução do processo inflamatório (Bone et al., 1997). Por fim, têm-se os mediadores pró-inflamatórios em concentração sérica baixa, enquanto os antiinflamatórios estão elevados, restaurando a homeostase (Carrigan et al., 2004). O fibrinogênio é uma proteína de grande peso molecular produzida pelo fígado, que funciona como substrato para a trombina, na formação da fibrina. Sua concentração está elevada em processos inflamatórios ativos, por isso é 82 conhecida como proteína reagente de fase aguda, sendo um bom indicador de inflamação (Johnston e Morris, 1993). O exame histopatológico do fígado revelou a presença de infiltrado inflamatório mononuclear, degeneração hidrópica e gordurosa, além de necrose coagulativa. A degeneração hidrópica é o acúmulo de água no meio intracelular, decorrente de desequilíbrios no controle do gradiente osmótico no nível da membrana citoplasmática e nos mecanismos de absorção, eliminação de água e eletrólitos intracelulares (Miranda, 2008). A degeneração gordurosa acomete principalmente o fígado, rim e miocárdio sendo causada por fatores nutricionais, tóxicos ou hipóxicos (Thomson, 1983; Rossi, 2005). O método mais frequentemente utilizado para quantificar apoptose em fígado dos ratos é a contagem de corpos apoptóticos em corte histológicos corados com HE, sendo sua detecção facilitada pelo uso de microscopia de fluorescência. Neste estudo, a microscopia de fluorescência mostrou-se adequada para a identificação e quantificação dos corpúsculos apoptóticos hepáticos de ratos corroborando com Eckle et al. (2004). A ausência de diferença significativa no número médio de CA nesse experimento ocorreu, provavelmente, em função da grande variação do desvio padrão. Correlacionando todos os resultados em cada grupo, discutir-se-ão as alterações mais significativas em função da toxicidade medicamentosa. A administração dos AINEs neste estudo foi realizada por cinco dias, sendo considerado um tratamento de curto período. No G1 (controle), como era esperado, não foi observada nenhuma alteração nos parâmetros avaliados condizentes com intoxicação, fazendo desse grupo o controle negativo. 83 O G2 (diclofenaco) foi utilizado neste estudo, para servir como controle positivo em relação à ação tóxica dos AINEs sobre o fígado, uma vez que os efeitos hepatotóxicos já foram descritos por Gomez-Lechon et al. (2003) e O’Beirne e Cairns (2001), além de efeitos colaterais gastrointestinais e renais (Andrade e Jericó, 2002; Poujafar e Derakhshanfar, 2004). Neste grupo, o fibrinogênio plasmático, 96 horas após o início do tratamento, foi maior que os demais grupos indicando um processo inflamatório apesar de não estar relacionado com os níveis de TNF-�, provavelmente pela curta duração desta citocina na corrente sanguínea, além de coexistir uma homeostase entre a IL-10 e TNF-�. Como não se avaliou a expressão tecidual do mesmo no fígado afetado dos animais tratados, não se pode sugerir que a ausência de diferença estatística nos valores circulantes desta citocina, seja decorrente da pouca expressão tecidual. Provavelmente essa citocina estaria aumentada no tecido hepático nos animais com lesões histológicas. A análise histopatológica do G2 revelou a presença de infiltrado inflamatório intersticial, degeneração hidrópica e gordurosa, além de necrose coagulativa corroborando com os achados de Gómez-Lechon et al. (2003), os quais relataram que o uso do diclofenaco experimentalmente em ratos, aumentou a morte celular hepática. O diclofenaco é um AINE classificado como inibidor não seletivo das cicloxigenases, assim a aplicação deste medicamento tem sido limitada pelos seus efeitos colaterais que incluem lesões gastrointestinais, renais e hepáticas (Andrade e Jericó, 2002; Poujafar e Derakhshanfar, 2004). O meloxicam foi testado em duas dosagens, a dose terapêutica (G3= 2mg/kg) e cinco vezes esta dose (G4= 10mg/kg). Em comparação aos demais grupos, o G3 não apresentou nenhuma alteração histopatológica importante. Foi 84 observado apenas aumento de IL-10 e um valor numericamente maior de fibrinogênio plasmático que, apesar de não significativo estatisticamente, mostra- se clinicamente importante ao comparar com os outros valores. Pode-se considerar, a partir dos dados obtidos neste grupo, que houve um processo inflamatório devido ao aumento de fibrinogênio, uma proteína de fase aguda, e da IL-10, que se eleva para controlar um processo inflamatório existente. Porém, devido a ausência de lesões histológicas hepáticas significativas, não se pode afirmar que este processo inflamatório tenha ocorrido neste órgão. O mais provável é que essa inflamação tenha ocorrido no trato gastrointestinal, onde as lesões devido ao uso deste fármaco são comumente descritas. Os resultados deste experimento são condizentes com os achados de Villegas et al. (2002) que utilizaram meloxicam na dosagem de 3,75 e 7,5mg/kg e não observaram importantes mudanças no perfil hepático dos animais submetidos aos tratamentos na dose recomendada e no dobro da dose. No G4, foi detectada diferença em relação à concentração plasmática de fibrinogênio e de IL-10. Provavelmente houve um processo inflamatório que não foi capaz de induzir alterações histopatológicas, em função do curto período de tempo de administração do AINE. Estes dados confirmam a menor incidência de efeitos adversos com o uso do meloxicam, podendo ser empregado como um medicamento seguro, uma vez que mesmo empregando cinco vezes a dose recomendada, não foram observadas alterações significativas, pelo menos em curto prazo. Estes resultados concordam com