
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO”

INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS (GENÉTICA)

André Luiz Molan

Construção de uma ferramenta para análise de
enriquecimento funcional gênico multiespécie entre amostras

comparativas

Botucatu, Junho de 2018


UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO”

INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS (GENÉTICA)

André Luiz Molan

Construção de uma ferramenta para análise de
enriquecimento funcional gênico multiespécie entre amostras

comparativas

Dissertação apresentada ao Instituto de

Biociências, Campus de Botucatu, UNESP,

em preenchimento dos requisitos para a

obtenção do tı́tulo de Mestre no Programa

de Pós-Graduação em Ciências Biológicas

(Genética).

Área de Concentração: Genética

Orientador: Prof. Dr. José Luiz Rybarczyk

Filho

Botucatu, Junho de 2018.


Palavras-chave: atividade gênica; diversidade gênica;

enriquecimento funcional gênico; ferramenta computacional;

grupos de genes funcionalmente associados (GFAGs).

Molan, André Luiz.

   Construção de uma ferramenta para análise de

enriquecimento funcional gênico multiespécie entre

amostras comparativas / André Luiz Molan. - Botucatu, 2018

   Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista

"Júlio de Mesquita Filho", Instituto de Biociências de

Botucatu

   Orientador: José Luiz Rybarczyk Filho

   Capes: 20204000

   1. Bioinformática. 2. Processamento eletrônico de

dados. 3. Expressão gênica. 4. Transcrição genética.

DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CÂMPUS DE BOTUCATU - UNESP

BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSANGELA APARECIDA LOBO-CRB 8/7500

FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORM.


Agradecimentos

• Agradeço aos processos CNPq 458810/2013-4, 473789/2013-2 e 134469/2016-0 pelo

suporte financeiro, fundamental para o desenvolvimento do trabalho;

• Agradeço ao meu orientador, Prof. Dr. José Luiz Rybarczyk Filho, pela orientação de

elevada qualidade, apoio, paciência e incentivo;

• Agradeço à Profa. Dra. Agnes Alessandra Sekijima Takeda, fundamental para melhoria

da qualidade do trabalho e apresentações orais;

• Agradeço aos amigos de laboratório, Giordano Bruno Sanches Seco, José Rafael Pilan e

Carlos Alberto Oliveira de Biaggi Junior, os quais contribuı́ram enormemente com suas

amizades e ideias para eventuais melhorias no trabalho;

• Agradeço aos meus pais, José Alberto Turini Molan e Maria Tereza de Oliveira Molan,

pelo apoio e suporte incondicionais mesmo nos momentos mais difı́ceis.


Resumo

Sequenciar um organismo, atualmente, pode ser financeiramente custoso. A quantidade

de dados gerada por uma única corrida é grande. Analisá-los não é trivial, exigindo, cada vez

mais, técnicas computacionais e métodos estatı́sticos robustos, capazes de extrair o máximo

possı́vel de informações. Normalmente, alguns estudos visam à busca por genes diferencial-

mente expressos mediante diferentes condições experimentais. É importante conhecer perfis de

expressão, porém, faz-se necessário entender como os genes relacionam-se entre si funcional-

mente, o que só é possı́vel por meio de uma análise de enriquecimento funcional.

Dessa forma, desenvolvemos um pacote em ambiente de programação R chamado Entropy-

ClusterGenes. Ele é capaz de enriquecer conjuntos amostrais comparativos sob o ponto de vista

da atividade e diversidade gênica utilizando a teoria da informação de Shannon. A ferramenta

apresenta uma nova perspectiva de enriquecimento funcional, buscando por grupos de genes

funcionalmente associados (GFAGs) através do conceito de entropia relacionado à ontologias

e KEGG pathways. Para cada GFAG encontrado, através da técnica de bootstrap, calcula-se

um p-valor, que é validado via FDR (False Discovery Rate) para determinar se o grupo encon-

trado é ou não significativo em uma dada comparação amostral (controle versus experimento).

Através de uma nova análise de RNA-seq com o protocolo Tuxedo, quantificamos os transcri-

tos de forma bruta e diferencial em 46 amostras de Aedes aegypti e 8 amostras de Drosophila

melanogaster, reagrupadas, posteriormente, em 40 combinações (controle e experimento) para

o enriquecimento funcional pela nova ferramenta. De acordo com cada combinação, encon-

tramos diversos grupos significativos relacionados a processos biológico, funções moleculares,

componentes celulares e KEGG pathways. Para validar a análise de enriquecimento, compara-

mos os resultados obtidos pelo EntropyClusterGenes a alguns dos principais resultados obtidos

pelos pesquisadores nos estudos originais, além de realizarmos um benchmarking com outras

três ferramentas similares, encontrando resultados semelhantes entre elas.


Abstract

An organism sequencing is still expensive. The amount of data generated by a single run

is massive. Analyzing them is not trivial, requiring computational techniques and robust sta-

tistical methods capable of extracting as much information as possible. Usually, some studies

aim to search for genes differentially expressed by different experimental conditions. It is im-

portant to know the expression profiles, however, it is necessary to understand how the genes

are functionally related to each other, which is only possible through a functional enrichment

analysis.

In this context, we have developed a package in the R programming environment called

EntropyClusterGenes. It is able to enrich comparative sample sets from the perspective of gene

activity and gene diversity using Shannon’s information theory. The tool presents a new appro-

ach of functional enrichment, searching for groups of functionally associated genes (GFAGs)

related to ontologies and KEGG pathways classifying them according to their entropy. For each

GFAG found, by means of the bootstrap technique, a p-value is calculated, which is validated

by FDR (False Discovery Rate) to determine if the group found is significant or not in a given

sample comparison (control vs. experiment). Using a new analysis of RNA-seq with the Tuxedo

protocol, we quantified the raw and differential transcripts in 46 samples of Aedes aegypti and

8 samples of Drosophila melanogaster, later regrouped in 40 combinations (control and experi-

ment) for the enrichment with the new tool. According to each combination, we found several

significant groups related to biological processes, molecular functions, cellular components and

KEGG pathways. To validate the enrichment analysis, we compared the results obtained by

EntropyClusterGenes to some of the main results obtained by the researchers in the original

studies. In addition, we have run a benchmarking with three other similar tools, finding similar

results between them.


Lista de Figuras

1.1 Estrutura de uma tı́pica ferramenta de enriquecimento . . . . . . . . . . . . . p. 2

1.2 Sequenciamento Sanger . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 7

1.3 Sequenciamento Illumina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 8

1.4 Sequenciamento SOLiD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 9

1.5 Sequenciamento Roche 454 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 11

1.6 Sequenciamento Ion Torrent . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 12

1.7 Sequenciamento Pacific Biosciences . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 13

1.8 Sequenciamento Nanopore . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 14

1.9 Experimento tı́pico de RNA-seq . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 16

3.1 Visão global do protocolo Tuxedo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 23

3.2 Gráfico acı́clico direto (DAG) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 25

3.3 Relação entre termos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 26

3.4 Overview da base de dados KEGG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 27

3.5 Exemplo de diagrama de vias metabólicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 28

3.6 Workflow do pacote EntropyclusterGenes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 30

3.7 Esquema básico do funcionamento de um bootstrap em um contexto biológico p. 37

4.1 Passos de bootstrap em função de grupos significativos . . . . . . . . . . . . p. 42

4.2 Verificação dos GFAGs encontrados por pasos de bootstrap . . . . . . . . . . p. 43

4.3 Estudo de Diversidade Gênica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 54

4.4 Estudo de Diversidade Gênica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 54

4.5 Perfis de expressão de genes envolvidos na produção de pequenos RNAs . . . p. 55

4.6 Conjunto de genes pertencentes a GO:0003676 . . . . . . . . . . . . . . . . p. 57


4.7 Conjunto de genes pertencentes a GO:0042302 . . . . . . . . . . . . . . . . p. 58

4.8 Conjunto de genes pertencentes a GO:0004175 . . . . . . . . . . . . . . . . p. 60


Lista de Tabelas

3.1 Códigos de evidência de ontologias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 26

3.2 Tabela de contingência de Fisher . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 39

4.1 Comparação de performance entre o código paralelizado e o não paralelizado p. 41

4.2 Genes diferencialmente expressos da amostra S2 . . . . . . . . . . . . . . . p. 44

4.3 Genes diferencialmente expressos da amostra S1 . . . . . . . . . . . . . . . p. 45

4.4 GFAGs de acordo com amostras S1 para o EntropyClusterGenes . . . . . . . p. 46

4.5 GFAGs de acordo com amostras S1 para o EntropyClusterGenes . . . . . . . p. 47

4.6 GFAGs de acordo com amostras S1 para o GAGE . . . . . . . . . . . . . . . p. 48

4.7 GFAGs de acordo com amostras S2 para o GAGE . . . . . . . . . . . . . . . p. 48

4.8 GFAGs de acordo com amostras S1 para o GSVA . . . . . . . . . . . . . . . p. 49

4.9 GFAGs de acordo com amostras S2 para o GSVA . . . . . . . . . . . . . . . p. 50

4.10 GFAGs de acordo com amostras S2 para o ClusterProfiler . . . . . . . . . . . p. 50

4.11 GFAGs de acordo com amostras S1 para o ClusterProfiler . . . . . . . . . . . p. 51

4.12 Similaridade ferramentas com base em Aedes aegypti . . . . . . . . . . . . . p. 52

4.13 Similaridade ferramentas com base em Drosophila melanogaster . . . . . . . p. 52

4.14 Principais genes identificados originalmente nas amostras S1 . . . . . . . . . p. 56

4.15 Diversidade relativa fase embrionária Aedes aegypti . . . . . . . . . . . . . . p. 57

4.16 Ontologias de destaque conforme estudo sobre Drosophila . . . . . . . . . . p. 60

A.1 Descrição das comparações realizadas a partir do conjunto de amostras S1 . . p. 68

A.2 Descrição das comparações realizadas a partir do conjunto de amostras S2 . . p. 69

B.1 Exemplo de arquivo de entrada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 70

B.2 Primeiro arquivo de saı́da . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 71


B.3 Segundo arquivo de saı́da . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 72


Sumário

Resumo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. iv

Abstract . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. v

1 Introdução p. 1

1.1 Enriquecimento Funcional . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 1

1.1.1 Singular Enrichment Analysis (SEA) . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 2

1.1.2 Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) . . . . . . . . . . . . . . . . p. 3

1.1.3 Modular Enrichment Analysis (MEA) . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 4

1.2 Big Data . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 4

1.3 Meta Análise . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 5

1.4 Sequenciamento Next Generation Sequencing (NGS) . . . . . . . . . . . . . p. 5

1.4.1 Sanger . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 6

1.4.2 Illumina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 7

1.4.3 SOLiD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 9

1.4.4 Roche 454 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 10

1.4.5 Ion Torrent . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 11

1.4.6 Pacific Biosciences . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 12

1.4.7 Nanopore Technologies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 13

1.5 RNA-seq . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 14

1.6 Justificativa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 17

2 Objetivos p. 19

2.1 Objetivos Especı́ficos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 19


3 Material e Métodos p. 20

3.1 Sequence Read Archive (SRA) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 20

3.2 Conjuntos de dados brutos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 20

3.3 Unidades para Quantificação de Dados de Expressão . . . . . . . . . . . . . p. 21

3.4 Protocolo Tuxedo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 22

3.5 Gene Ontology . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 24

3.6 KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes . . . . . . . . . . . . . . p. 27

3.7 EntropyClusterGenes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 29

3.8 Ferramentas de Enriquecimento Funcional para Benchmarking . . . . . . . p. 32

3.8.1 clusterProfiler . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 33

3.8.2 Gene set variation analysis for microarray and RNA-Seq data (GSVA) p. 33

3.8.3 GAGE: Generally Applicable Gene-set Enrichment . . . . . . . . . . p. 34

3.9 Hipóteses e p-valores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 34

3.10 FDR: False Discovery Rate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 35

3.11 Bootstrap . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 36

3.12 Teste Wilcoxon rank-sum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 37

3.13 Teste Exato de Fisher . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 38

4 Resultados e Discussão p. 40

4.1 Desempenho . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 40

4.2 Otimização de Bootstraps . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 41

4.3 Análise de Expressão Diferencial Gênica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 44

4.4 Análise de Grupos Significativos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 46

4.5 Benchmarking entre Ferramentas GSEA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 52

4.6 Diversidade Gênica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 53

4.7 Comparação com Estudos Originais - Aedes aegypti . . . . . . . . . . . . . p. 55

4.8 Comparação com Estudos Originais - Drosophila melanogaster . . . . . . . p. 58


5 Conclusão p. 61

Referências Bibliográficas p. 63

Apêndice A p. 68

Apêndice B p. 70


1

1 Introdução

1.1 Enriquecimento Funcional

O avanço da biologia celular nas últimas décadas se deve, particularmente, às tecnologias

de sequenciamento de alto rendimento. A quantidade de dados gerada a partir de experimen-

tos de microarranjo e Next Generation Sequencing (NGS) tem aumentando substancialmente

nos últimos anos. A análise e interpretação desses dados, porém, não é trivial, exigindo uma

combinação de conhecimentos biológicos, modelagem estatı́stica e técnicas computacionais.

Os primeiros conjuntos de expressão gênica eram, em sua maioria, analisados considerando

os genes de maneira individual. No entanto, constatou-se que estes não agem sozinhos. Pro-

cessos celulares são o resultado de complexas interações entre diferentes genes e moléculas.

Atualmente, grupos de genes ligados a diversas funções estão disponı́veis em bases de dados

públicas, podendo ser utilizados para interpretar resultados de novos experimentos (HUANG;

SHERMAN; LEMPICKI, 2008).

Tais bases possibilitaram a implementação de uma série de métodos para a análise de enri-

quecimento gênico, com o propósito de comparar nı́veis de expressão sob duas condições dis-

tintas (experimento vs controle) e identificar grupos diferencialmente expressos (enriquecidos)

na condição experimental (SIGNORELLI; VINCIOTTI; WIT, 2016). Hoje, o Gene Ontology

(ASHBURNER et al., 2000) e o KEGG (OGATA et al., 1999) são duas das bases mais usadas

em estudos funcionais. Contudo, estratégias baseadas em vocabulários múltiplos vêm sendo

criadas, como o Human Disease Ontology e a Pharmacogenomics Knowlege Base (HOEHN-

DORF; DUMONTIER; GKOUTOS, 2012).

Uma série de ferramentas aplicadas à analise de enriquecimento tem sido desenvolvidas.

Elas apresentam grande similaridade, uma vez que todas calculam p-valores das vias enrique-

cidas e utilizam diferentes métodos estatı́sticos, como o teste exato de Fisher, teste do χ2,

testes de distribuição binomial e hipergeométrica, entre outros. Fisher (FISHER, 1935) é mais

apropriado para análise de vias que contêm um pequeno número de genes, ao passo que χ2 é

adequado quando a quantidade de genes é superior a cinco (ROSCOE; BYARS, 1971). Seme-


2

lhante ao teste de Fisher, a distribuição hipergeométrica (KEMP; KEMP, 1956) é utilizada para

uma amostragem com número de genes reduzido, porém, se aproxima da distribuição binomial

(mais adequada quando se considera um número elevado de genes) à medida que a quantidade

de genes aumenta (BRUNK; HOLSTEIN; WILLIAMS, 1968). Além disso, é preciso ressaltar

que as ferramentas de enriquecimento funcional são classificadas em 3 categorias, podendo,

algumas, serem inclusas em mais de uma delas: Singular Enrichment Analysis (SEA), Gene

Set Enrichment Analysis (GSEA) e Modular Enrichment Analysis (MEA) (MACHADO; FREI-

TAS; COUTO, 2013). Embora estejam categorizadas, todas possuem uma estrutura em comum,

conforme Figura 1.1.

Figura 1.1: Estrutura de uma tı́pica ferramenta de enriquecimento. Embora as ferramentas de análise
de enriquecimento possuam caracterı́sticas distintas, elas podem ser resumidas em três blocos principais:
Banco de dados de anotação back-end, data mining e apresentação de resultados. [Figura adaptada de
(HUANG; SHERMAN; LEMPICKI, 2008)]

1.1.1 Singular Enrichment Analysis (SEA)

Uma das estratégias de análise de enriquecimento mais tradicionais, SEA avalia uma relação

de genes pré-selecionados, como, por exemplo, genes diferencialmente expressos, testando ite-

rativamente cada termo de anotação de forma linear. Em seguida, os termos enriquecidos dentro

do limite de p-valor estabelecido são transferidos para uma tabela, ordenados de acordo com

seus respectivos p-valores de enriquecimento, calculados através de métodos estatı́sticos bem

conhecidos (Chi-quadrado, Fisher, distribuição hipergeométrica, entre outros). Ferramentas


3

dessa classe são eficientes quanto à extração dos principais significados biológicos por trás de

grandes listas de genes. Contudo, como ponto fraco desta classe, temos uma saı́da (output) de

termos muito grande - de centenas a milhares - que podem dificultar a análise dos resultados

gerados. Isso torna a análise via SEA instável, uma vez que diferentes cutoffs e métodos es-

tatı́sticos são utilizados (HUANG; SHERMAN; LEMPICKI, 2008). GOStat (BEISSBARTH;

SPEED, 2004) e GoMiner (ZEEBERG et al., 2003) são exemplos de ferramentas SEA.

1.1.2 Gene Set Enrichment Analysis (GSEA)

GSEA se assemelha à SEA, contudo, todos os genes do experimento são utilizados e não

apenas um subconjunto - como genes diferencialmente expressos, por exemplo. Esta estratégia

torna o enriquecimento enriquecimento funcional mais completo, uma vez que há a redução de

fatores arbitrários envolvidos na seleção de grupos gênicos e toda a informação disponı́vel é

utilizada. Para obtenção dos p-valores, algumas ferramentas dessa classe calculam um score de

enriquecimento máximo (MES) a partir do ranqueamento de todos os genes presentes em uma

dada categoria, através do método estatı́stico Kolmogorov-Smirnov, (HOLLANDER; WOLFE,

1999). Outras se baseiam em métodos estatı́sticos paramétricos, como z-score, teste t, análise

de permutação etc, levando em consideração valores experimentais - fold change, por exemplo -

de todos os genes em cada termo de anotação encontrado (HUANG; SHERMAN; LEMPICKI,

2008).

As ferramentas dessa classe, entretanto, apresentam algumas limitações. O fato de não uti-

lizar um valor de corte (cutoff ) para seleção de genes, embora seja a maior vantagem de GSEA,

tornou-se um grande problema em determinados estudos. O método requer como input um va-

lor biológico - por exemplo, fold change - para cada um dos genes do experimento. Porém, de

acordo com o estudo e a plataforma utilizadas, a obtenção de tais valores não é trivial. Além

disso, genes com ranking elevado, geralmente com as maiores variações de expressão, são a

força motora para a definição de p-valores, levando a assumir que estes genes são os maio-

res responsáveis pelos achados biológicos. Mas isso não é verdade, uma vez que pequenas

alterações de sinais podem resultar em consequências mais significativas. (HUANG; SHER-

MAN; LEMPICKI, 2008). GO-Mapper (SMID; DORSSERS, 2004) e PAGE (KIM; VOLSKY,

2005) são exemplos de ferramentas computacionais que se encaixam no perfil definido pela

classe GSEA.


4

1.1.3 Modular Enrichment Analysis (MEA)

MEA possui o mesmo cálculo de enriquecimento encontrado em SEA, acrescido, porém, de

algoritmos de descoberta de redes que levam em conta as relações termo a termo. Ao considerar

o relacionamento entre termos GO (ontologias referentes ao Gene Ontology), há um aumento

na sensibilidade e especificidade do enriquecimento, sendo esta uma das maiores vantagens em

se utilizar tal abordagem. Isso possibilita ao pesquisador, eventualmente, encontrar significados

biológicos na ligação entre dois ou mais termos. Além disso, quando se utiliza anotações he-

terogêneas, os termos são altamente redundantes, apresentando fortes correlações referentes à

diferentes aspectos para a mesma função biológica (HUANG; SHERMAN; LEMPICKI, 2008).

Um exemplo é a ferramenta DAVID (HUANG et al., 2007), capaz de organizar um grande

conteúdo de anotações heterogêneas, como termos GO, domı́nios proteicos e vias metabólicas

em classes gênicas. Tal organização faz uso de estatı́sticas tipo Kappa, aliada ao cálculo de

p-valores, permitindo que a análise de enriquecimento varie de uma análise termo-cêntrica para

uma análise biológica módulo-cêntrica. Como exemplos adicionais de ferramentas dessa classe,

podemos citar topGO (ALEXA; RAHNENFUHRER, 2010) e ClusterProfiler (YU et al., 2012).

Vale ressaltar, entretanto, uma das principais limitações dessa classe. Termos “órfãos” (ele-

mentos sem uma forte relação com seus vizinhos) podem, eventualmente, ser desconsiderados

pela análise. Portanto, é preciso ficar atento e examinar de forma cautelosa todo e qualquer ele-

mento deixado de fora, pois é possı́vel que exista significado biológico de valor elevado mesmo

que o método tenha indicado o contrário (HUANG; SHERMAN; LEMPICKI, 2008).

1.2 Big Data

A quantidade de dados gerado em todo o mundo ao longo dos últimos anos é massiva.

Crescendo de maneira exponencial, saber administrar e analisar tamanho volume armazenado

digitalmente é essencial. É preciso transforma-los em informação, gerando, assim, conheci-

mento (MURDOCH; DETSKY, 2013). O termo big data se refere a conjuntos de dados cujo

tamanho e complexidade demandam técnicas de análise que vão além dos métodos tradicionais

existentes. Seu tamanho pode chegar à casa de petabytes (1015 bytes). Sua classificação é de

acordo com o volume, velocidade, variedade, veracidade e valor. Tais aspectos representam

a variedade dos tipos de dados, que vão de textos não estruturados a dados fisiológicos, de

imagens e sequenciamento genômico. Analisar dados tão complexos requer ferramentas que se

assemelham mais ao campo da informática do que ao de pesquisas clı́nicas, como, por exemplo,

aprendizado de máquina (machine learning). Por meio de diferentes técnicas computacionais


5

é possı́vel refinar determinas questões, gerar hipóteses e identificar grupos experimentais com

maior potencial de resultados promissores (DOCHERTY; LONE, 2015).

1.3 Meta Análise

Dentre os significados para o prefixo meta destacam-se “mudança” e “reflexão crı́tica so-

bre”. Dessa forma, ao tratarmos de meta análise, nos referimos a uma análise que transcende os

resultados anteriores. É fundamental uma nova análise estatı́stica dos dados ou resultados pree-

xistentes. Não basta simplesmente uma análise qualitativa. Dependendo da natureza dos dados

e dos objetivos do estudo, qualquer método de análise estatı́stica, praticamente, poderá ser apli-

cado. Qualquer área pode fazer uso da meta análise, permitindo, eventualmente, a elucidação

de problemas que, anteriormente, não tenham sido possı́veis dada limitações práticas ou cus-

tos elevados. A Biologia é uma das ciências que mais se beneficiou com as técnicas de meta

análise, muito em função de uma série de atividades práticas, custos e ainda implicações éticas

que cercam a realização de experimentos com seres vivos (LUIZ, 2002).

Com as novas tecnologias de sequenciamento, a quantidade de dados genômicos gerados

tem aumentado consideravelmente. Os diferentes designs experimentais utilizados, entretanto,

geram um conteúdo que, na maioria das vezes, não é utilizado em sua totalidade. São estu-

dos focados em determinados cenários que visam observar o comportamento de um grupo de

funções biológicas de um dado organismo ou, simplesmente, a montagem do genoma deste.

Dessa forma, é possı́vel aplicar o conceito de big data, com o intuito de realizar novas análises

e obter resultados diferentes daqueles encontrados na pesquisa inicial (MCAFEE et al., 2012).

Um exemplo de meta análise pode ser observado em um trabalho de DerSimoniane e Laird

(DERSIMONIAN; LAIRD, 1986). Ao examinarem oito artigos referentes a diferentes ensaios

clı́nicos especı́ficos para uma condição médica especı́fica, foram capazes de incorporar hetero-

geneidade dos efeitos na eficácia do tratamento. Isso permitiu que tratamentos mais especı́ficos

pudessem ser recomendados, confirmando que novas conclusões podem ser obtidas a partir de

dados previamente analisados.

1.4 Sequenciamento Next Generation Sequencing (NGS)

Em 1944, Oswald Theodore Avery demostrou o DNA como sendo material genético. Sua

estrutura em dupla hélice, composta por quatro bases, entretanto, só foi demostrada em 1953

por James D. Watson e Francis Crick, fato que levou ao dogma central da biologia molecular.


6

O DNA genômico, na maioria dos casos, define as espécies e indivı́duos, tornando a sequência

desta molécula fundamental para pesquisas sobre estruturas e funções celulares. As tecnologias

de sequenciamento de DNA auxiliam em uma série de aplicações, como montagem de geno-

mas, clonagem molecular, busca por genes patogênicos, estudos comparativos e evolucionários,

entre outros. Nos últimos 30 anos, as tecnologias de sequenciamento passaram por inúmeros

avanços e se tornaram a principal força na era dos genomas. Em 1977, Frederick Sanger de-

senvolveu uma tecnologia de sequenciamento de DNA baseada no método de terminação de

cadeias, também conhecido como sequenciamento de Sanger. Devido a sua alta eficiência e

baixa radioatividade, o sequenciamento de Sanger foi adotado como tecnologia primária para

as aplicações de sequenciamento. Porém, utilizar este método era trabalhoso e requeria materi-

ais radioativos. Foi então que, em 1987, uma empresa chamada Applied Biosystems introduziu

o primeiro equipamento de sequenciamento automático, chamado de AB370. Ele adotava a

eletroforese capilar, aspecto que tornava o sequenciamento mais rápido e acurado. Além disso,

o AB370 era capaz de detectar 96 bases por vez - 500K diários - e reads com 600 bases de

comprimento. Em 1998, instrumentos de sequenciamento automático com software associados

que utilizavam máquinas de sequenciamento capilar e a tecnologia de sequenciamento Sanger

se tornaram as principais ferramentas para a conclusão do projeto genoma humano em 2001.

Posteriormente, surgiram as tecnlogias NGS (Next Generation Sequencing), diferenciando-se

do método de Sanger pela análise paralela massiva, alto rendimento e custo reduzido. Embora

NGS tenha tornado o sequenciamento de genomas mais acessı́vel, as subsequentes análises dos

dados e explicações biológicas ainda são o gargalo para a compreensão destes (LIU et al., 2012).

Seguindo a evolução tecnológica, em 2005 a empresa 454 lança seu sistema de sequenci-

amento - de mesmo nome. No ano seguinte a Solexa lança o Genome Analyzer, seguido pelo

SOLiD (Sequencing by Oligo Ligation Detection), da Agencourt. Todos os três, comparados

ao sequenciamento Sanger, compartilham bom desempenho quanto a rendimento, precisão e

custos. Ainda em 2006 a Agencourt foi adquirida pela Applied Biosystems e, em 2007, a Roche

comprou a 454, enquanto a Solexa foi vendida para a Illumina (LIU et al., 2012).

1.4.1 Sanger

Em 1977, o bioquı́mico inglês Frederick Sanger foi responsável pelo maior avanço no que

se refere ao sequenciamento de DNA, desenvolvendo a técnica de terminação de cadeias (chain-

termination). Tal técnica faz uso de substâncias análogas aos desoxirribonucleotı́deos (dNTPs)

que são monômeros de fitas de DNA. Os dideoxirribonucleotı́deos (ddNTPs) não possuem o

grupo 3’ hidroxil, necessário para a extensão das cadeias de DNA e, portanto, não são capa-


7

zes de formar uma ligação com o 5’ fosfato do próximo dNTP. Ao adicionar radiomarcadores

ddNTPs na reação de extensão do DNA em uma fração da concentração de dNTPs padrão

tem-se como resultado a produção de fitas de DNA de cada comprimento possı́vel, com a

incorporação randômica dos ddNTPs como extensão da fita e consequente interrupção do pro-

cesso. Através da execução de quatro reações paralelas contendo cada uma das bases ddNTP

e processando os resultados em quatro divisões de um gel de poliacrilamida, é possı́vel utilizar

autoradiografia para inferir a sequência de nucleotı́deos presente no fragmento original, uma

vez que existirá uma banda radioativa na correspondente divisão naquela posição do gel (HE-

ATHER; CHAIN, 2016). Um modelo ilustrativo deste tipo de sequenciamento pode ser visto

na Figura 1.2.

Figura 1.2: Sequenciamento Sanger. A região do DNA a ser sequenciada é amplificada e, então, desna-
turada para produzir uma fita de simples, conectando-se um primer a ela. O sequenciamento se aproveita
do fato de que o crescimento de uma cadeia de nucleotı́deos na direção 3’ irá terminar se, ao invés
de um desoxinucleotı́deo convencional, um 2’3’ dideoxynucleotı́deo é incorporado. Através de qua-
tro reações separadas, cada uma contendo uma DNA polimerase e uma pequena quantidade de um dos
quatro dideoxinucleotı́deos além dos deoxinucleotı́deos, quatro conjuntos separados de fragmentos de
terminação de cadeia serão produzidos. Seguindo o passo de replicação/terminação, estes fragmentos
permanecerão ligados à fita simples de DNA, a qual se comporta como um template. Ao aquecer essas
moléculas fita dupla parcial e adicionar um agente desnaturador, como formamida, as moléculas fita sim-
ples de terminação em cadeia podem ser liberadas de seus respectivos templates e separadas por meio da
utilização de eletroforese em gel desnaturador de alta resolução. A sequência da região original do DNA
é, então, deduzida através da análise das posições relativas dos produtos das reações em quatro faixas do
gel desnaturador. [Figura adaptada de (TECHCOUNCIL, 2013)]

1.4.2 Illumina

É a mais popular entre as plataformas de alto rendimento que utilizam o sequenciamento

por sı́ntese quı́mica. Após o preparo das bibliotecas, o cDNA (DNA complementar) de fita du-

pla é colocado sobre uma flow cell onde ocorre a hibridização baseada na complementariedade

de bases com as sequências dos adaptadores. Em seguida, sequências em ambas as extremida-


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des do adaptador são amplificadas como uma ponte. As sequências recém geradas, então, são

hibridizadas próximas umas das outras e, depois de vários ciclos, uma região da flow cell irá

conter várias cópias do cDNA original. Este processo é conhecido como geração de clusters

e, com o surgimento destes, além da remoção de uma das fitas do cDNA, reagentes são intro-

duzidos na flow cell dando inı́cio ao sequenciamento por sı́ntese. Este tipo de sequenciamento

ocorre através de uma reação na qual cada rodada de sı́ntese, a adição de um nucleotı́deo -

A, C, G ou T, conforme determinado pelo sinal de fluorescência - é imageada de forma que

a localização e o nucleotı́deo adicionado possam ser determinados, armazenados e analisados.

Vale ainda ressaltar que existem dois modos de sequenciamento. Caso o sequenciamento seja

executado apenas em uma das extremidades da fita dupla de cDNA, o modo é chamado de

single-end. Entretanto, se o sequenciamento for executado em ambas as extremidades da fita, o

modo recebe o nome de paired-end (KORPELAINEN et al., 2014). Para melhor compreender

o sequenciamento Illumina, observe a Figura 1.3.

Figura 1.3: Sequenciamento Illumina. (1) Preparo da amostra de DNA genômico, com fragmentação
randômica do DNA e adaptadores ligados às extremidades dos fragmentos. (2) Ligação do DNA à
superfı́cie da flow cell. Fragmentos de fita simples são aleatoriamente ligados à superfı́cie de canais
da flow cell. (3) Amplificação de ponte. Adição nucleotı́deos e enzimas para iniciar a fase sólida de
amplificação em ponte. (4) Fragmentos se tornam fitas duplas. (5) Desnaturação das fitas duplas. (6)
Conclusão da amplificação, com a formação de densos clusters de fita dupla de DNA gerados em cada
canal da flow cell. [Figura adaptada de (BIOLOGY NOTES HELP, 2017)]


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1.4.3 SOLiD

SOLiD significa sequenciamento por detecção de ligações oligonucleotı́deas e é uma plata-

forma comercializada pela Applied Biosystems. A quı́mica do sequenciamento, como o próprio

nome diz, se dá via ligação ao invés de sı́ntese. A biblioteca de fragmentos de DNA (derivada,

originalmente, de moléculas de RNA) é associada à esferas magnéticas, sendo uma molécula

por esfera. O DNA em cada esfera é,então, amplificado em uma emulsão de forma que o

conteúdo amplificado permaneça na esfera. Os produtos resultantes da amplificação ligam-se

de forma covalente a uma lâmina de vidro. Um exemplo gráfico deste tipo de sequenciamento

pode ser observado através da Figura 1.4.

Figura 1.4: Sequenciamento SOLiD. (A) Primers hibridizam com o adaptador P1 dentro da biblioteca
de template. Um conjunto de quatro sondas di-base marcadas com um agente fluorescente competem
para ligaram-se à sequência do primer. Essas sondas possuem uma sequência de DNA parcialmente
degenerada (indicada por n e z) e por simplicidade apenas uma sonda é mostrada (a marcação é de-
notada por asterisco). A especificidade de sonda di-base é obtida através da checagem da primeira e
segunda base em cada reação de ligação. Seguindo a ligação, a marcação fluorescente é enzimatica-
mente removida juntamente com as três últimas bases do octâmero. (B) A determinação da sequência
pelo sequenciamento SOLiD é feita em múltiplos ciclos de ligação, utilizando diferentes primers, cada
um menor do que o anterior por uma única base. O número de ciclos de ligação (neste exemplo, 6)
determina o eventual tamanho do read, embora para cada sequência de marcação, ocorrem seis rodadas
de reinicialização do primer (do primer n ao primer n-4). [Figura adaptada de (ANSORGE, 2009)]


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Através de diversos primers que se hibridizam com um primer universal, sondas di-base

fluorescentes são competitivamente ligadas ao primer. Caso as bases na primeira e segunda

posição da sonda di-base sejam complementares à sequência, a reação de ligação ocorrerá e

irá gerar um sinal. Primers são reiniciados por um nucleotı́deo simples cinco vezes, de forma

que, ao final do ciclo, pelo menos quatro nucleotı́deos tenham sido checados duas vezes, de-

vido às sondas dinucleotı́dicas, e um nucleotı́deo pelo menos uma vez. A ligação das sondas

diclueotı́dicas subsequentes possibilitam uma segunda checagem do nucleotı́deo checado ante-

riormente apenas uma vez e, após mais cinco ciclos, outros cinco nucleotı́deos serão checados

pelo menos duas vezes. Os passos de ligação continuam até que a sequência completa tenha

sido lida (KORPELAINEN et al., 2014).

1.4.4 Roche 454

Roche 454 é uma plataforma baseada no sequenciamento de bibliotecas de DNA dupla fita

com a ligação de adaptadores através de sı́ntese quı́mica. O DNA é fixado em esferas e ampli-

ficado em uma emulsão de água e óleo. As esferas são colocadas em placas de picotituladores

onde ocorrem as reações de sequenciamento. O elevado número de poços nas placas de picotitu-

ladores proporcionam o layout paralelo massivo utilizado, caracterı́stico das tecnologias NGS.

Comparado a outras plataformas, o método de detecção difere quanto à sı́ntese quı́mica, a qual

apresenta a detecção de um nucleotı́deo adicionado por meio de uma reação em duas etapas. A

primeira realiza a clivagem do nucleotı́deo trifosfato após uma adição, liberando pirofosfato. A

segunda converte o pirofosfato em adenosina trifosfato (ATP) através da enzima ATP sulfuri-

lase. Em uma terceira etapa, o recém sitetizado ATP é utilizado para catalizar a conversão de

luciferin em oxiluciferin via luciferase, gerando uma quantidade de luminescência que é cap-

turada por uma câmera acoplada à placa picotituladora. Os nucleotı́deos livres e ATPs que não

reagiram são degrados por uma pirase após cada adição. Todas as etapas são repetidas até que

um número predeterminado de reações, de acordo com o fabricante, tenham sido alcançadas.

A gravação da luminescência gerada, bem como a localização do poço após a cada adição de

nucleotı́deo torna possı́vel a reconstrução da identidade do nucleotı́deo e da sequência em cada

poço. Este método, visto na Figura 1.5, é conhecido como pirosequenciamento, apresentando,

como principal vantagem, a possibilidade de reads mais longos quando comparado às outras

plataformas - reads de até 1000 bases podem ser alcançados (KORPELAINEN et al., 2014)


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Figura 1.5: Sequenciamento Roche 454. (A) Esboço do workflow do sequenciador de DNA GS 454. (I)
Construção da biblioteca com a ligação de adaptadores 454 especı́ficos aos fragmentos de DNA, indica-
dos por A e B e (II) acoplamento de DNA e esferas amplificadas em uma emulsão PCR para amplificar
fragmentos antes do sequenciamento. (III) As esferas são carregados em uma placa picotituladora. (B)
Ilustração esquemática da reação de pirosequenciamento na qual ocorre a incorporação para reportar o
sequenciamento por sı́ntese. [Figura adaptada de (ANSORGE, 2009)]

1.4.5 Ion Torrent

Esta plataforma utiliza uma biblioteca de DNA dupla fita ligada a adaptadores seguida pelo

sequenciamento de sı́ntese quı́mica utilizado por outras plataformas, mas possui uma carac-

terı́stica única. Ao invés de detectar sinais de fluorescência ou fótons, são detectadas alterações

no pH da solução em um poço quando o nucleotı́deo é adicionado e prótons são produzidos.

Tais mudanças são extemamente pequenas, no entanto, a plataforma faz uso de tecnologias

baseadas em semicondutores a fim de alcançar alta sensibilidade. O Ion Torrent produz em

média uma quantidade menor de reads em uma única corrida quando comparada a outras pla-

taformas. O tempo de corrida, porém, é muito baixo, levando de 2 a 4 horas. Uma vez que

não é preciso instrumentação de medidas ópticas ou nucleotı́deos modificados, sua grande van-

tagem é a acessibilidade, tanto instrumental quanto de reagentes. O equipamento é pequeno,

pode ser desligado quando não estiver em uso (sendo fácil liga-lo novamente) e demanda pouca

manutenção. Diante dessas caracterı́sticas, foram encontradas consideráveis utilizações para a

plataforma, como sequenciamento de microrganismos e genômica do meio ambiente, além de

aplicações na área clı́nica, em que o tempo é um fator crı́tico (KORPELAINEN et al., 2014).

Um esquema desta plataforma pode ser observado na Figura 1.6.


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Figura 1.6: Sequenciamento Ion Torrent. Utilização de pH para a detecção da incorporação do nu-
cleotı́deo. Durante a extensão da polimerase e incorporação do nucleotı́deo, um próton é liberado, al-
terando o pH de um micropoço. Ao fluir em um tipo de dNTP não modificado por vez (por exemplo,
dATP), os sensores de pH ISFET miniaturizados reportam os micropoços que incorporaram o nucleotı́deo
introduzido. Sequências homopoliméricas (AAAAA, por exemplo) levam à liveração de um grande
número de prótons que podem dificultar uma quantificação precisa. [Figura adaptada de (KHODAKOV;
WANG; ZHANG, 2016)]

1.4.6 Pacific Biosciences

Trata-se de uma plataforma representante da terceira geração. A quı́mica utilizada ainda é

similar às tecnologias de segunda geração, utilizando o sistema de sequenciamento por sı́ntese.

Entretanto, a maior diferença é que ela requer apenas uma única molécula, com os nucleotı́deos

adicionados sendo lidos em tempo real. Dessa forma, sua quı́mica recebeu o nome de SMRT

(Single-Molecule Real Time). O fato de ser molécula única significa que não há a necessidade

de amplificação. Nota-se que essa plataforma sequencia moléculas de DNA. SMRT utiliza zero-

mode waveguides (ZMWs), câmaras de espaço restrito que guia a energia luminosa e reagentes

para dentro de volumes extremamente pequenos que estão na ordem de zeptolitros (10−21 L).

Fazendo uso de trifosfatos nucleotı́dicos fluorescentes, a adição de um A, C, G ou T a uma

cadeia de nucleotı́dica pode ser detectada a medida que está sendo sintetizada. Como um ins-

trumento de tempo real que mede adições a medida em que estas ocorrem, o tempo de execução

pode ser bastante curto - entre uma e duas horas. O tamanho médio dos reads podem chegar

a 5000 bases. Como consequência do sequenciamento direto de DNA de moléculas únicas,

notou-se que modificações de ácidos nucleicos, tais como 5-metil citosina, ocasionaram atrasos

na cinética da DNA polimerase. Tal acontecimento, porém, passou a ser explorado pela plata-


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forma de forma que modificações no DNA pudessem ser sequenciadas (KORPELAINEN et al.,

2014). Através da Figura 1.7.

Figura 1.7: Sequenciamento Pacific Biosciences. Uma única polimerase é posicionada é na parte infe-
rior de um ZMW. Versões de fosfatos marcados de todos os quatro nucleotı́deos estão presentes, permi-
tindo uma polimerização contı́nua de um template de DNA. A incorporação de bases aumenta o tempo
de permanência de um nucleotı́deo no ZMW, resultando em um sinal fluorescente detectável que é cap-
turado em em um vı́deo. [Figura adaptada de (BIOCHEMISTRIES, 2015)]

1.4.7 Nanopore Technologies

Apesar dos ganhos expressivos em rendimento e baixo custo por base das atuais platafor-

mas, as tecnologias de sequenciamento continuam a evoluir. Criada pela Oxford Nanopore

Technologies, Nanopore, descrita pela Figura 1.8, é uma tecnologia de sequenciamento de

molécula única em que uma mesma enzima é utilizada tanto para separar a fita de DNA quanto

para guia-la através de um poro proteico embutido em uma membrana. Ions atravessam o poro

simultaneamente gerando uma corrente elétrica. Esta é sensı́vel a nucleotı́deos especı́ficos que

passam pelo poro, produzindo sinais distintos em função das bases A, C, G e T. A vantagem


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desse sistema é a sua simplicidade, permitindo a construção de dispositivos pequenos. No en-

tanto, ele é extremamente desafiador, uma vez que há a necessidade de medir mudanças na

corrente elétrica em uma escala extremamente pequena (KORPELAINEN et al., 2014).

Figura 1.8: Sequenciamento Nanopore. Templates de DNA são ligados com dois adaptadores. O
primeiro adaptador é ligado com uma enzima motora, assim como a amarra, enquanto o segundo é um
oligo tipo grampo ligado por uma proteı́na motora HP. Alterações na corrente, induzidas a medida que
os nucleotı́deos passam pelo poro, são utilizadas para discriminar as bases. O desenho da biblioteca
possibilita sequenciar ambas as fitas de DNA de uma única molécula (reads em duas direções). [Figura
adaptada de (BIOCHEMISTRIES, 2015)]

1.5 RNA-seq

O transcriptoma é o conjunto completo de transcritos em uma célula - e a sua quanti-

dade - em um determinado estágio de desenvolvimento. Sua compreensão é essencial para

a interpretação de elementos funcionais do genoma, revelando constituintes moleculares de

células e tecidos e possibilitando a compreensão do desenvolvimento de diferentes organismos


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e doenças. Os principais objetivos de um transcriptoma, no entanto, consistem em catalogar

todos os transcritos de uma dada espécie (mRNAs, non-coding RNAs e pequenos RNAs), de-

terminar a estrutura transcricional de genes e quantificar alterações nos nı́veis de expressão du-

rante as diversas fases de desenvolvimento do organismo e sob diferentes condições. Diversas

tecnologias tem sido desenvolvidas para deduzir e quantificar o transcriptoma, incluindo abor-

dagens baseadas em hibridização ou baseadas em sequências (WANG; GERSTEIN; SNYDER,

2009).

RNA-seq é uma coleção de métodos computacionais e experimentais que determinam a

identidade e abundância de sequências de RNA em amostras biológicas. A posição de cada

base nitrogenada, presente em uma fita simples de RNA, é identificada. Os métodos experi-

mentais envolvem isolar o RNA de amostras celulares, tecidos ou animais inteiros, preparar

bibliotecas que representem a espécie nas amostras utilizadas e efetuar um sequenciamento

quı́mico dessas bibliotecas, seguido de uma análise de bioinformática. Uma distinção entre

RNA-seq e os métodos anteriores, está no alto rendimento das atuais plataformas, sensibili-

dade alcançada com as novas tecnologias e poder para descobrir novos transcritos, modelos

gênicos e pequenas espécies de RNA não codificante. Os dados obtidos de um experimento de

RNA-seq podem, de fato, produzir novos conhecimentos, que vão da identificação de diferen-

tes transcritos codificadores de proteı́nas em linhagens de células embrionárias à caracterização

de genes diferencialmente expressos em tumores de pele ou um outro órgão especı́fico. Com

base nisso, questões como diferenças nos nı́veis de expressão entre tecidos doentes e sadios ou

após um tratamento com determinado agente mutagênico, quais genes são positivamente (up)

ou negativamente (down) regulados durante o desenvolvimento do cérebro, quais transcritos

estão presentes na pele e não nos músculos, entre outras, podem ser respondidas. Gerou-se

grandes expectativas para a transcriptômica, quando o RNA-seq revelou que o conhecimento

da estrutura dos genes e a forma como se realizava suas anotações - tanto de organismos uni-

celulares quanto de humanos - era muito pobre e limitada. Novos dados gerados a partir dessa

técnica mostraram uma vasta diversidade para a estrutura gênica, possibilitaram a identificação

de genes antes desconhecidos e jogaram luz sobre o estudo de pequenos e longos transcritos

não codificantes (KORPELAINEN et al., 2014).

Fazendo uso das mais recentes tecnologias de sequenciamento, o método, em geral, utiliza

uma população de RNA (total ou fracionada, como, por exemplo, poly(A)+) convertendo-a

em uma biblioteca de fragmentos de cDNA com adaptadores conectados a uma ou ambas as

extremidades da fita. Cada molécula, com ou sem amplificação, é, então, sequenciada por meio

das novas tecnologias de sequenciamento de forma a obter pequenas sequências a partir de

uma extremidade (single-end sequencing) ou ambas as extremidades (pair-end sequencing). O


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tamanho dos reads obtidos dependem da tecnologia escolhida (WANG; GERSTEIN; SNYDER,

2009). Uma descrição gráfica da metodologia pode ser observada na Figura 1.9.

Figura 1.9: Experimento tı́pico de RNA-seq. Inicialmente, longos RNAs são convertidos em uma
biblioteca de fragmentos de cDNA através da fragmentação de RNA ou DNA. Em seguida, adaptadores
de sequenciamento são adicionados a cada fragmento de cDNA e sequências pequenas são obtidas de
cada cDNA utilizando uma dada tecnologia de sequenciamento de alto desempenho. Os reads obtidos
são alinhados com um genoma ou transcriptoma de referência, e classificados em três tipos: exônicos,
junção e poly(A) end reads. Esses três tipos são utilizados para gerar um perfil de expressão de resolução
de bases para cada gene, como ilustrado no gráfico final. [Adaptada de (WANG; GERSTEIN; SNYDER,
2009)]

RNA-seq oferece uma série de vantagens em relação a outros métodos. Ao contrário das

abordagens baseadas em hibridização, RNA-seq não está limitado a detectar transcritos cor-

respondentes a uma sequência genômica existente, tornando-o extremamente atrativo para or-

ganismos não modelo, com sequências ainda a serem determinadas. Além disso, esta técnica


17

não possui um limite para quantificação, aspecto esse relacionado com as sequências obtidas.

Consequentemente, ele possui um intervalo (range) de nı́veis de expressão através do qual os

transcritos podem ser detectados. Seus resultados, ainda, mostram altos nı́veis de reprodutibili-

dade, tanto para replicatas técnicas como biológicas (WANG; GERSTEIN; SNYDER, 2009).

1.6 Justificativa

Um modo alternativo de análise de enriquecimento consiste na aplicação da Teoria da

Informação de Shannon (SHANNON, 1948). A construção de comunidades celulares a partir

de diferentes fenótipos com um genoma em comum é dependente de subconjuntos especı́ficos

de informações herdadas e da habilidade das células em receber e processar dados do meio que

as cercam. A informação ativa em uma célula é uma soma tempo-dependente de sinais intra-

celulares traduzidos e/ou obtidos do meio extracelular, permitindo o controle da morfologia e

demais funções das células, além de sua interação com o meio externo (GATENBY; FRIEDEN,

2002).

Em uma linguagem mais simples, informação significa conhecimento e denota uma quanti-

dade mensurável. Tal definição, por sua vez, implica em duas propriedades adicionais, tratando-

se de uma quantidade aditiva que, na ausência de ruı́dos, é conservada. Em genética, ruı́dos

podem resultar de mutações aleatórias ou variações epigenéticas, provocando uma instabili-

dade genômica que ocasiona a redução da quantidade de informação transmitida. Vale ainda

ressaltar que quanto maior a redundância da mensagem, menor é a quantidade de informação

transportada. Redundância é uma consequência da estrutura sintática dentro do código, estando

diretamente ligada à eficiência e precisão das mensagens transmitidas (KENDAL, 1990).

Gatenby e Frieden (GATENBY; FRIEDEN, 2002) aplicaram a teoria de Shannon para o

estudo de carcinogênese, demonstrando as interações entre eventos de mutação estocásticos

e pressões de seleção ambiental, responsáveis por caracterı́sticas de fenótipos malignos. Em

2005, Castro e colaboradores (CASTRO et al., 2005) aplicaram o conceito de Shannon para uma

análise citogenética de 14 tipos de tumores epiteliais, avaliando suas respectivas diversidades

cariotı́picas. Em um outro trabalho de Castro e colaboradores (CASTRO et al., 2007), a mesma

teoria foi aplicada com o propósito de estudar a expressão de genes ligados à 10 vias metabólicas

humanas distintas, dentre elas, o mecanismo de reparo por excisão de nucleotı́deos (NER).

Para tanto, foram utilizas bibliotecas SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) de diferentes

tecidos (sadios e com câncer) de diferentes órgãos. Através da função de entropia normalizada

de Shannon, mediu-se a diversidade de cada uma das 10 vias presentes nas bibliotecas SAGE.


18

Em 2009, Castro e Rybarczyk-Filho desenvolveram um software chamado ViaComplex

(CASTRO et al., 2009), implementando computacionalmente a teoria da informação de Shan-

non com o propósito de construir mapas de expressão gênica associados à redes de interação

proteı́na-proteı́na. Isso permitiu, simultaneamente, verificar como os genes de um dado con-

junto relacionavam-se entre si e com os seus vizinhos mais próximos e como cada gene es-

tava expresso. Além disso, o software ainda disponibilizava um módulo estatı́stico que tornava

possı́vel a análise comparativa de dois conjuntos amostrais (controle versus experimento) em

termos de grupos de genes funcionalmente associados (GFAGs). Os genes do conjunto eram

reagrupados em subconjuntos com base em suas ontologias e vias metabólicas. Por meio do

cálculo de entropia e atividade gênica, avaliava-se cada subconjunto quanto à variação da ex-

pressão entre os elementos e o quanto estes estavam expressos. Aplicava-se, então, o método

de bootstrap para a determinação de p-valores, a fim de identificar quais funções eram signi-

ficativamente expressas dentro do espaço amostral em questão. Isso possibilitava traçar um

panorama funcional do experimento, encontrando, eventualmente, grupos gênicos com elemen-

tos passı́veis de um estudo individual mais detalhado.

O ViaComplex, porém, quanto ao módulo estatı́stico, possui algumas limitações. Escrito

na linguagem de programação FORTRAN, embora apresente uma interface amigável para o

usuário, o preparo das entradas a serem processadas requerem conhecimentos adicionais por

parte de quem o utiliza. É preciso, antes, criar uma tabela que contenha a relação entre funções

(ontologias e termos KEGG, por exemplo) e genes da espécie de interesse. Tal tarefa, entre-

tanto, nem sempre é trivial, exigindo que o usuário o acesse repositórios de dados online e

elabore eventuais scripts ou programas. Para cada uma das comparações controle versus expe-

rimento, entretanto, todas as etapas mencionadas precisam ser repetidas, tornando-se inviável

para estudos de grande porte. É preciso, ainda, salientar que a sua criação teve como base a

utilização de dados do SAGE e microarray, ficando defasado quando leva-se em conta as dife-

rentes técnicas de sequenciamento existentes. Dessa forma, aproveitando o conceito de análise

de enriquecimento presente neste software, podemos desenvolver uma versão mais eficiente,

otimizada e atualizada em ambiente R, capaz de processar maiores volumes de dados, a par-

tir de diferentes métodos de sequenciamento aplicados a diferentes espécies, com um grau de

automação elevado.


19

2 Objetivos

O presente trabalho tem como objetivo o desenvolvimento de um novo pacote em ambi-

ente de programação R, capaz de efetuar o enriquecimento funcional de grandes quantidades de

dados obtidas através de diferentes designs experimentais, como microarranjo e RNA-seq, de

maneira otimizada e com elevado grau de automação. Trata-se de uma aplicação multiespécie

que possibilita a busca por grupos de genes funcionalmente associados (GFAGs) significativos,

relacionando ontologias (Gene Ontology) e KEGG pathways sob a perspectiva de entropia (di-

versidade) e valor de expressão gênica absoluto (atividade), utilizando, para tanto, a teoria da

informação de Shannon.

2.1 Objetivos Especı́ficos

• Condução de uma nova análise de RNA-seq em dados de Aedes aegypti e Drosophila

melanogaster utilizando o protocolo Tuxedo;

• Desenvolvimento do pipeline em R;

• Encontrar grupos de genes funcionalmente associados (GFAGs) significativos a partir dos

resultados da análise de RNA-seq;

• Realização de um benchmarking comparando a nova ferramenta com aplicativos similares

disponı́veis.


20

3 Material e Métodos

3.1 Sequence Read Archive (SRA)

As plataformas de sequenciamento NGS tem revolucionado a Biologia, permitindo o es-

tudo de diferentes espécies e produzindo uma quantidade de dados muito superior à tecnologias

como o microarranjo. Em 2009, visando ao armazenamento de tais dados, criou-se o SRA

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra) (KODAMA; SHUMWAY; LEINONEN, 2012), um

repósitório online público criado sob a tutela do International Nucleotide Sequence Database

Collaboration (INSDC) e operado pelo National Center for Biotechnology Information (NCBI),

European Bioinformatics Institute (EBI) e DNA Data Bank of Japan (DDBJ). Em meados de se-

tembro de 2010, o volume de dados armazenado ultrapassava 500 bilhões de reads e 60 trilhões

de pares de base, sendo a maior parcela derivada de sequenciamentos utilizando a plataforma

Illumina e abrangendo, em sua grande maioria, organismos como Homos sapiens e Mus muscu-

lus (LEINONEN; SUGAWARA; SHUMWAY, 2010). Os dados brutos de uma vasta quantidade

de sequenciamentos NGS são disponibilizados para reutilização pelo SRA, juntamente com um

conjunto de ferramentas que facilitam o download e manipulação de seus arquivos.

3.2 Conjuntos de dados brutos

Para demonstrar o EntropyClusterGenes, ferramenta de enriquecimento funcional que de-

senvolvemos e é apresentada com mais detalhes nos próximos tópicos, comparada, na forma de

um Benchmarking à ferramentas de enriquecimento existentes, também descritas com detalhes

mais adiante, optamos por conjuntos de amostras de RNA-seq de Aedes aegypti e Drosophila

melanogaster obtidas a partir de dois diferentes artigos:

• Aedes aegypti:

– Projeto PRJNA209388 (AKBARI et al., 2013): Download via SRA. São 46 corri-

das, com códigos compreendendo os intervalos SRR923822-SRR923857, SRR923736,

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra


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SRR923701-SRR923705 e SRR924021-SRR924024. As bibliotecas foram prepa-

radas utilizando-se ovo, larva, pupa e mosquito adulto de Aedes aegypti, tanto ma-

chos como fêmeas, derivados de uma cepa originária do oeste da África. No caso

de fêmeas adultas, foram utilizados carcaças e ovário. Quanto aos machos, apenas

carcaça e pupa. Houve variação nos tempos de cada um dos estágios de desen-

volvimento dos indivı́duos, com um mı́nimo de 2 horas e um máximo de 72 horas.

Utilizou-se RNA-seq, sendo o sequenciamento dividido em paired-end e single-end.

A plataforma de sequenciamento foi Illumina.

• Drosophila melanogaster:

– Projeto PRJNA418283 (MARXREITER; THUMMEL, 2018): Download via SRA.

São 8 corridas, com códigos compreendendo o intervalo SRR6288269 - SRR6288276.

As bibliotecas foram preparadas utilizando o corpo inteiro de fêmeas (4 normais e 4

mutantes) de uma semana de idade. Os indivı́duos mutantes apresentavam mutação

no receptor nuclear DHR78. Utilizou-se a técnica de RNA-seq, implementada via

Illumina HiSeq 50 Cycle Single Read Sequencing v3.

Realizamos o download dos arquivos brutos, no formato FASTQ, disponı́veis no repositório

online SRA, de forma que pudéssemos conduzir uma nova análise de RNA-seq, com um proto-

colo padrão e diferente daqueles utilizados nos estudos originais. Isso proporcionou a obtenção

de listas de expressão gênica, bem como relação de genes diferencialmente expressos. Foi só

então a partir de tais listas que pudemos fazer o enriquecimento funcional. Cada uma das amos-

tras e combinações são descritas através da Tabela A.1 e Tabela A.2, conforme Apêndice A.

3.3 Unidades para Quantificação de Dados de Expressão

Em diferentes áreas da Biologia, medir a abundância de RNA em determinados organismos

é de extrema importância e serve como base para uma enorme quantidade de estudos. Sendo

obtidas, geralmente, a partir de tecnologias de sequenciamento de alto desempenho, como Il-

lumina, tais medidas precisam ser normalizadas. Isso permite a remoção de dados incorretos

ou com algum tipo de tendência, notadamente as que se referem ao comprimento de espécies

de RNA e profundidade de sequenciamento de uma amostra (WAGNER; KIN; LYNCH, 2012).

Visando à correção dessas inconsistências, diferentes formas de quantificação surgiram, como

RPKM (Reads per Kilobase per Million Reads), FPKM (Fragments per Kilobase per Million)

e TPM (Transcripts per Million).


22

Todas as três métricas tentam normalizar pela profundidade do sequenciamento e com-

primento do gene. Desenvolvido especialmente para sequenciamentos do tipo RNA-seq single-

end, RPKM conta o total de reads - equivalente a cada fragmento sequenciado - em uma amostra

e o divide por 1 milhão. Isso normaliza pela profundidade do sequenciamento, dando origem

ao “per million” (RPM). Em seguida, divide o RPM pelo comprimento do gene (em quiloba-

ses), dando origem ao RPKM. O FPKM foi criado para sequenciamentos que utilizam RNA-seq

paired-end, em que dois reads podem corresponder a um único fragmento ou, caso um read no

par não tenha sido mapeado, 1 read pode corresponder a um único fragmento. A diferença en-

tre RPKM e FPKM está simplesmente no processo de contagem. Dois reads mapeiam somente

um fragmento e este fragmento não é contado duas vezes. TPM, por sua vez, diferencia-se dos

métodos anteriores pela ordem das operações. Primeiro ocorre a divisão da contagem de reads

pelo comprimento de cada gene em quilobases, dando origem ao RPK. Logo após, há a con-

tagem de todos os RPKs na amostra, dividindo-o por 1 milhão e resultando em um fator “por

milhão”. Para concluir, cada RPK é dividido por esse fator, o que nos dá o TPM (RNA-SEQ

BLOG, 2015).

Ao usar TPM, a soma de todos os TPMs em cada amostra é a mesma, tornando mais fácil

a comparação de proporções de reads que mapeiam um gene em cada amostra. Por outro lado,

com RPKM e FPKM a soma de reads normalizados nas amostras pode ser diferente, tornando

mais complexa a comparação direta entre amostras (RNA-SEQ BLOG, 2015).

3.4 Protocolo Tuxedo

O sequenciamento de alto rendimento de mRNA (RNA-seq) permite, em um único expe-

rimento, descobrir novos genes e transcritos e mensurar a expressão destes. A quantidade de

dados gerados a partir do sequenciamento de uma única amostra pode ser superior a 500 giga-

bases em uma só corrida. Dessa forma, os dados gerados a partir de experimentos que utilizam

RNA-seq necessitam de algoritmos robustos e eficientes para serem analisados. As ferramentas

para análise de RNA-seq, normalmente, podem ser divididas em três categorias: alinhamento,

montagem e quantificação de expressão. Tais categorias também podem ser interpretadas como

uma sequência padrão de análise, que recebe o nome de Protocolo Tuxedo (TRAPNELL et al.,

2012), composto por duas ferramentas: Tophat (TRAPNELL; PACHTER; SALZBERG, 2009)

e Cufflinks (TRAPNELL et al., 2010). Tophat é um software que permite o alinhamento dos

dados sequenciados com um genoma de referência. Para tanto, ele precisa de um segundo soft-

ware, chamado Bowtie (LANGMEAD et al., 2009). A função do Bowtie é indexar o genoma de

referência com base na transformada de Burrows-Wheeler (BWT) (BURROWS; WHEELER,


23

1994), a qual permite que grandes quantidades de dados possam ser varridas com alta eficiência

e baixo uso de memória. O Cufflinks, um pacote de programas, utiliza o mapa gerado pelo

Tophat para a montagem e quantificação de transcritos. O funcionamento do protocolo Tuxedo

pode ser observado através da Figura 3.1.

Figura 3.1: Visão global do protocolo Tuxedo. Alinhamento contra o genoma de referência e ma-
peamento usando o Tophat, montagem e quantificação dos transcritos com o Cufflinks, agrupamento de
dados de diferentes condições experimentais para a montagem do genoma final com o Cuffmerge, cálculo
de expressão diferencial com o Cuffdiff e extração de dados e construção de gráficos de expressão com
o pacote em R cummeRbund . [Figura adaptada de (TRAPNELL et al., 2012)]

Uma análise de RNA-seq seguindo este protocolo baseia-se na comparação entre amostras

submetidas a diferentes condições e tem o propósito de avaliar variações nos nı́veis de expressão

gênica. Inicialmente, reads de diferentes amostras, submetidas a condições experimentais es-

pecı́ficas e disponı́veis no formato FASTQ (formato que combina sequências e parâmetros de

qualidade do sequenciamento) (COCK et al., 2010) são alinhados contra um genoma de re-

ferência através do software Tophat. Este, por sua vez, gera um mapa com os reads alinhados

permitindo que o Cufflinks realize a montagem dos transcritos, comparando o mapa com um

arquivo de anotações no formato GTF (General Transfer Format). Os arquivos de anotações


24

armazenam informações sobre a estrutura do gene, incluindo coding sequences (CDS), exons e

códons de inı́cio e parada (DORAN; CREEVEY, 2013). O Cufflinks engloba ainda dois outros

programas: Cuffmerge e Cuffdiff. O primeiro é responsável por unir duas ou mais saı́das do

Cufflinks, ou seja, o genoma de cada condição é montado individualmente e, para compara-los,

faz-se necessário agrupa-los, gerando um genoma final. O segundo utiliza a saı́da do Cuffmerge

para comparar os nı́veis de expressão de cada transcrito entre as amostras. Isso, por exemplo,

permite a verificação de quais genes são positivamente ou negativamente regulados de acordo

com cada condição, além de identificar aqueles que são diferencialmente expressos. Por fim,

tem-se o pacote em linguagem R conhecido como cummeRbund (GOFF; TRAPNELL; KEL-

LEY, 2012). Trata-se de um pacote que permite navegar por todo o conteúdo gerado pelo Cuff-

diff, possibilitando a manipulação de dados estatı́sticos, utilização de filtros para obtenção de

relações mais apuradas de genes, construção de diferentes modelos gráficos para a comparação

dos dados sequenciados, entre outras.

3.5 Gene Ontology

O termo função é vago quando aplicado a genes ou proteı́nas e é coloquialmente utilizado

para descrever atividades bioquı́micas, objetivos biológicos e estrutura celular. É comum se

referir à função de uma proteı́na, por exemplo a tubulina, como “GTPase” ou “constituinte de

fuso mitótico”. Por essa razão, o Gene Ontology Consortium criou 3 categorias independentes

de ontologias: Processos Biológicos (BP), Funções Moleculares (MF) e Componentes Celulares

(CC) (ASHBURNER et al., 2000).

Processos biológicos se referem a um objetivo biológico ao qual um gene ou produto gênico

contribuem. Os processos normalmente estão relacionados à uma transformação fı́sica ou

quı́mica, passando a idéia de que um elemento passa por um processo originando algo dife-

rente. “Crescimento e manutenção celular” ou “metabolismo de pirimidina” são exemplos de

termos BP. As funções moleculares podem ser definidas como sendo a atividade bioquı́mica de

um produto gênico. Ela descreve apenas o que é feito, sem especificar onde ou quando o evento

ocorre. Alguns exemplos são “enzima”, “ligante” e “adenilato-ciclase”. Por fim, componentes

celulares indicam um local na célula onde o produto gênico está ativo e refletem nossa compre-

ensão acerca da estrutura celular eucariótica. Alguns exemplos de tais termos são “ribossomo”,

“proteossomo” e “membrana nuclear” (ASHBURNER et al., 2000).

A relação entre um produto gênico com processos biológicos, funções moleculares e com-

ponentes celulares são de um para muitos, o que reflete a realidade biológica na qual uma dada


25

proteı́na funciona em diversos processos, contém diferentes domı́nios e desempenha diferentes

funções moleculares. Além disso, participam de múltiplas interações alternativas com outras

proteı́nas, organelas ou localizações especı́ficas na célula (ASHBURNER et al., 2000). Os ter-

mos, ainda, possuem uma relação pai-filho, em que o termo filho sempre é mais especı́fico

que o pai, sendo estruturados na forma de um gráfico acı́clico direto (DAG) (GENTLEMAN,

2016). Através dele, um conjunto de genes anotados para um certo termo - ou um nodo - é

um subconjunto daqueles anotados para os termos pais (GOEMAN; MANSMANN, 2008). Em

um gráfico acı́clico direto, nunca um mesmo nodo será visitado duas vezes. Ele apresenta uma

topologia ordenada em que o nodo inicial possui valor inferior ao nodo subsequente - no caso

de ontologias, entendemos os valores como especifidade. Um exemplo desse gráfico pode ser

visto por meio da Figura 3.2.

Figura 3.2: Gráfico acı́clico direto (DAG), tendo como exemplo o termo GO:0006508. “Pais” se re-
ferem à nodos próximos da raiz do gráfico, ao passo que “filhos” são nodos mais próximos às extre-
midades. [Figura adaptada de https://www.ebi.ac.uk/QuickGO/term/GO:0006508. Acesso em
09/10/2017.]

https://www.ebi.ac.uk/QuickGO/term/GO:0006508


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As relações pai-filho podem ser “is-a”, onde o termo filho é mais especı́fico que o pai, “has-

a” ou “part-of ”, em que o filho é parte do pai, como, por exemplo, o telômero sendo parte de um

cromossomo. Outras relações ainda encontradas são “regulates”, “negatively regulates” e “po-

sitively regulates” (http://www.geneontology.org/page/ontology-relations. Acesso

em 10/10/2017). Um exemplo pode ser visto na Figura 3.3.

Figura 3.3: Relação entre termos GO (A, B e C). As setas indicam a direção da relação. Linhas pontilha-
das representam um relacionamento de inferência. [Figura adaptada de http://www.geneontology.

org/page/ontology-relations. Acesso em 10/10/2017.]

Mapear um gene a um termo pode ser baseado em diferentes caracterı́sticas. Existe um

conjunto de códigos de evidência, conforme Tabela 3.1. Isso permite que o pesquisador, even-

tualmente, deixe de utilizar genes ligados a determinadas evidências, podendo escolher as que

melhor lhe atendem (CARLSON, 2017).

Tabela 3.1: Códigos de evidência de ontologias.

IMP inferred from mutant phenotype inferido de fenótipo mutante
IGI inferred from genetic interaction inferido de interação genética
IPI inferred from physical interaction inferido de interação fı́sica
ISS inferred from sequence similarity inferido de sequência similar
IDA infererred from direct assay inferido de análise direta
IEP inferred from expression pattern inferido de padrão de expressão
IEA inferred from electronic annotation inferido de anotação eletrônica
TAS traceable author statement declaração de autoria rastreável
NAS non-traceable author statement declaração de autoria não rastreável
ND no biological data available sem dados biológicos disponı́veis
IC inferred by curator inferido por curador

Fonte: Tabela modificada de (CARLSON, 2017).

As ontologias, também chamadas de GO terms, são divididas, ainda, em quatro classes: pa-

rents (pais), ancestor (ancestrais), children (filhos) e offspring (descendentes). Para cada termo

existe um nı́vel hierárquico. É possı́vel saber exatamente como cada ontologia está conectada às

demais. Vale ainda ressaltar que o nome de cada termo é composto pelas iniciais GO seguidas

de “ : ” e 7 dı́gitos como, por exemplo, GO:0000587 e GO:0089578.

http://www.geneontology.org/page/ontology-relations
http://www.geneontology.org/page/ontology-relations
http://www.geneontology.org/page/ontology-relations


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3.6 KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes

KEGG é uma base de dados online que possibilita o estudo e compreensão de funções e

sistemas biológicos como células, organismos e ecossistemas a partir de dados genômicos e

moleculares. Trata-se de uma representação de biologia de sistemas e tem como propósito a

construção de blocos de genes, proteı́nas e substâncias quı́micas - informações genômicas e

quı́micas, portanto - integradas a diagramas de interação escritos, reações e relacionamento

com redes. Possui, ainda, informações acerca de doenças e drogas, assim como perturbações

do sistema biológico como um todo (KEGG, 2017). Um esquema ilustrativo pode ser obser-

vado a partir da Figura 3.4. O banco de dados KEGG foi desenvolvido em 1995 pelo Kanehisa

Laboratories, tornando-se referência na integração e interpretação de grandes conjuntos de da-

dos originados do sequenciamento de genomas e outros experimentos com tecnologias de alto

desempenho.

Figura 3.4: Overview da base de dados KEGG, mostrando o conteúdo de entrada e o que pode ser
obtido através dele. [Figura adaptada de http://www.genome.jp/kegg/kegg1a.html. Acesso em
13/10/2017.]

Um dos módulos mais bem organizados no KEGG é a base de metabolismo, representada

através de diagramas com vias metabólicas referenciadas. Cada referência pode ser visuali-

zada como uma rede de enzimas ou EC numbers (Enzyme Commission numbers, esquema de

classificação numérica para enzimas, relacionando os genes em genoma, juntamente com seus

produtos gênicos, a uma via metabólica) (KANEHISA; GOTO, 2000). Um exemplo de dia-

grama pode ser visto na Figura 3.5.

Os genes enzimáticos são identificados com base no genoma, por meio de similaridade de

sequências e posicionamento correlacional dos genes. Logo após, são definidos os EC numbers

e, então, rotas metabólicas para organismos especı́ficos são construı́dos computacionalmente.

Algumas rotas metabólicas são bem conservadas entre a maioria dos organismos - de mamı́feros

http://www.genome.jp/kegg/kegg1a.html


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à bactérias. Com isso, é possı́vel desenhar manualmente uma rota e, então, utiliza-la para

diferentes espécies (KANEHISA; GOTO, 2000).

Figura 3.5: Exemplo de diagrama de vias metabólicas. Diferentes cores representam
diferentes vias metabólicas com seus respectivos componentes (pontos).[Fonte: http:

//www.genome.jp/kegg-bin/show_pathway?scale=1.0&query=&map=aag01100&scale=

0.35&auto_image=&show_description=hide&multi_query=&show_module_list=. Acesso em
13/10/2017.]

http://www.genome.jp/kegg-bin/show_pathway?scale=1.0&query=&map=aag01100&scale=0.35&auto_image=&show_description=hide&multi_query=&show_module_list=
http://www.genome.jp/kegg-bin/show_pathway?scale=1.0&query=&map=aag01100&scale=0.35&auto_image=&show_description=hide&multi_query=&show_module_list=
http://www.genome.jp/kegg-bin/show_pathway?scale=1.0&query=&map=aag01100&scale=0.35&auto_image=&show_description=hide&multi_query=&show_module_list=


29

Dados e conhecimento quanto aos sistemas moleculares que gerenciam processos celulares

e o comportamento de organismos são coletados de forma manual a partir da literatura dis-

ponı́vel, dando origem aos mapas metabólicos. Estes representam o conhecimento relacionado

a diversas redes moleculares, como redes de interação/reação para metabolismo, processamento

de informações genéticas, processamento de informações ambientais e outros processos celula-

res, redes perturbadas de interação/reação para doenças humanas e redes de transformação de

estrutura quı́mica para o desenvolvimento de drogas (KANEHISA et al., 2009).

3.7 EntropyClusterGenes

Com base no módulo estatı́stico do software ViaComplex (CASTRO et al., 2009), desenvol-

vemos um pacote em linguagem de programação R capaz de agrupar os genes de duas amostras

comparativas de maneira funcional, identificando os grupos significativos com base em um va-

lor de corte estabelecido pelo usuário. Uma visão global acerca do seu funcionamento é descrita

pela Figura 3.6.

A entrada de dados consiste em um arquivo texto de, no mı́nimo, 3 colunas, conforme a

Tabela B.1, presente no Apêndice B. A primeira refere-se aos nomes dos genes, devendo estes

utilizarem a nomenclatura Entrez ID ou Gene Symbol, enquanto as demais contêm os valores

de expressão de cada uma das amostras envolvidas na análise. O nome de cada uma dessas

colunas funciona como identificador único amostral. Como se tratam de análises comparativas

(controle vs experimento), utiliza-se, como argumento, um vetor de comparações, em que cada

elemento se refere ao nome de duas colunas ligadas a duas amostras, separadas, por exemplo,

por uma vı́rgula ou um hı́fen (o usuário indica o separador).

O EntropyClusterGenes trabalha com múltiplas espécies, permitindo a utilização de paco-

tes de dados de espécies, presentes no repositório online Bioconductor (GENTLEMAN et al.,

2004), ou, caso não exista um pacote, o usuário pode montar tabelas auxiliares relacionando

ontologias e vias metabólicas com os genes da espécie de interesse. O Aedes aegypti não possui

pacote de dados associado. Dessa forma, com o auxilio dos pacotes GO.db (CARLSON, 2013)

e biomaRt (DURINCK et al., 2005; DURINCK et al., 2009), além do repositório online KEGG,

construı́mos uma base especı́fica para essa espécie.


30

Figura 3.6: Workflow do pacote EntropyclusterGenes. A primeira coluna, à esquerda, representa os
módulos principais, enquanto a segunda coluna apresenta quadros explicando brevemente cada um dos
módulos.

Com a relação entre genes e seus papéis biológicos estabelecida, reagrupamos os dados ini-

ciais em GFAGs (Group of Functionally Associated Genes), estabelecendo diferentes grupos de

genes associados entre si por um processo BP, função MF, componente CC ou KEGG pathway.

Para cada grupo, afim de obter uma expressão quantitativa quanto à distribuição das amostras,

conforme (CASTRO et al., 2007), medimos a informação do conjunto utilizando a Teoria da

Informação de Shannon. O cálculo foi realizado da seguinte forma:

Seja M o número de genes em um dado grupo α (α = 1, ...,N). Para um dado grupo, é

possı́vel definir S(i,α) como sendo o sinal de um dado gene i,(i = 1, ...,Mα ), cuja a soma para

um dado α vai até Nα . A contribuição p(i,α) do sinal do gene i para o sinal total do α-GFAG


31

é:

p(i,α) =
S(i,α)

Nα

(3.1)

de maneira que ao somarmos todos os p(i,α) teremos o somatório igual a 1. A função entropia

normalizada Hα , aqui chamada de diversidade, é definida por:

Hα =
∑

Nα

i=1 p(i,α) ln p(i,α)

ln(Mα)
(3.2)

onde dividimos todos os termos pelo fator de normalização ln(Mα) para garantir que 0 ≤ Hα ≤
1. Desta maneira poderemos comparar diferentes GFAGs que podem apresentar diferentes

números de genes. Finalmente, para normalizar as quantidades por grupos de genes tendo

como referência o sinal de algum controle, definimos a diversidade relativa hα para um dado

GFAG como:

hα =
He

α

He
α +Hγ

α

(3.3)

onde He
α e Hγ

α são, respectivamente, a diversidade induzida pelo estı́mulo e pelo controle. Ob-

serve que 0 ≤ hα ≤ 1 , e hα < 0.5 implicam He
α < Hγ

α , isto é, a distribuição do sinal dos genes

no α-ésimo GFAG é mais estreita para o estı́mulo do que para o controle, enquanto que hα > 0.5

representa o caso inverso. Em analogia, a atividade de expressão gênica relativa do α-GFAG é

definida como

nα =
Ne

α

Ne
α +Nγ

α

(3.4)

onde Ne
α e Nγ

α são respectivamente, a expressão da atividade gênica induzida pelo estı́mulo

e pelo controle. Novamente 0 ≤ nα ≤ 1, e nα < 0.5 implica Ne
α < Nγ

α , isto é, neste GFAG

o estı́mulo induz uma atividade de sinal que é menor do que a induzida pelo controle. Esta

análise permite correlacionar os grupos de genes funcionalmente associados e suas funções em

cada amostra.

Definido os valores de atividade e diversidade, partimos agora para uma amostragem dos

dados utilizando bootstrap. De acordo com os grupos funcionais formados, a partir das amos-

tras iniciais criamos conjuntos de genes aleatórios com o mesmo tamanho dos conjuntos inici-

ais. Para cada novo conjunto, calculamos novamente atividade e diversidade, comparando-as


32

com às do grupo original. Tal processo, para cada grupo, é repetido um determinado numero

de vezes, número este maior que zero e definido pelo usuário. Este processo tem como objetivo

estabelecer um p-valor para o conjunto gênico, o qual, através do método estatı́stico BH (Ben-

jamini - Hochberg), é corrigido por um FDR (False Discovery Rate) padrão de 0.05 - ou um

outro também estabelecido pelo usuário. Essa correção leva a um q-valor que, estando abaixo

do FDR, indica que o grupo é significativo no contexto da comparação amostral. Um exem-

plo de arquivos de saı́da, apresentando os resultados, podem ser observados pela Tabela B.2 e

Tabela B.3, presentes no Apêndice B.

Além da análise de diversidade e atividade, via bootstrap, o EntropyClusterGenes oferece

uma análise de significância de GFAGs através de dois outros testes estatı́sticos: teste Wilcoxon

rank-sum e teste exato de Fisher. Ambos são opcionais - podendo ou não serem realizados -

e também retornam um p-valor, corrigido posteriormente por FDR, indicando se o GFAG é ou

não significativo dentro de um valor de corte preestabelecido.

Por fim, o EntropyClusterGenes apresenta um módulo gráfico que permite uma análise

individual de ontologias ou pathways, relacionando-as aos seus respectivos genes. A partir de

um gráfico, é possı́vel verificar quais genes pertencentes a um determinado grupo são up ou

down regulados e quais deles são eventualmente significativamente expressos. Para tanto, além

do resultado gerado pela nova ferramenta, o módulo gráfico necessita de um arquivo contendo

os valores de expressão gênica relacionados à comparação (controle vs experimento), bem como

os q-valores e logFC (fold change) de cada um deles.

3.8 Ferramentas de Enriquecimento Funcional para Bench-
marking

Com o propósito de validar o EntropyClusterGenes, além de compararmos seus resulta-

dos com os resultados dos artigos referentes a cada uma das amostras de RNA-seq utilizadas,

analisamos os mesmos conjuntos de dados utilizando outras três ferramentas de enriquecimento

funcional, comparando todos os seus respectivos outputs com os da nova ferramenta. Para tanto,

como critérios de seleção, optamos, exclusivamente, por pacotes desenvolvidos em linguagem

de programação R e que utilizassem o método GSEA para análise funcional, caracterı́sticas

essas presentes, também, no EntropyClusterGenes.


33

3.8.1 clusterProfiler

A análise de grandes quantidades de dados requer o desenvolvimento de ferramentas de

mineração de dados para a captura de informações biológicas. Uma abordagem comum con-

siste na clusterização gênica, agrupando diferentes genes com base em suas similaridades, como

padrão de expressão e estrutura de redes proteicas. A análise de clusters (grupos) gênicos é utili-

zada para revelar padrões ocultos, como a busca por promotores ou reguladores compartilhados,

classificação de processos biológicos, predição de novos genes ou genes não tão bem caracte-

rizados e detecção de comunidades de proteı́nas. Uma outra forma de procurar por funções

compartilhadas é a incorporação de conhecimentos biológicos através de ontologias. Gene

Ontology (GO), capaz de associar genes a processos biológicos, funções moleculares e compo-

nentes celulares por meio de uma estrutura gráfica acı́clica, Kyoto Encyclopedia of Genes and

Genomes (KEGG), que relaciona genes à vias metabólicas, e Disease Ontology (DO), base de

dados responsável por fazer a ligação entre genes e doenças humanas. Para tanto, surge clusteR-

profiler, um pacote desenvolvido em linguagem R e que possibilita a análise estatı́stica de GO

e KEGG através da comparação de temas biológicos entre grupos gênicos (YU et al., 2012).

O pacote oferece um método de classificação gênica - groupGO - para identificar genes

baseado em nı́veis especı́ficos de GOs, além de funções como enrichGO e enrichKEGG para

realizar o teste de enriquecimento para termos GO e vias KEGG, baseado em uma distribuição

hipergeométrica. Para evitar uma elevada taxa de falsos positivos em múltiplos testes, q-valores

são estimados por meio de um controle via FDR (False Discovery Rate). Além disso, clus-

terProfiler ainda possui uma função - compareCluster - que, automaticamente, calcula catego-

rias funcionais enriquecidas referentes à cada grupo gênico, e dispõe de vários métodos para

a visualização dos resultados. Para o seu funcionamento, pacotes auxiliares são necessários.

GO.db e KEGG.db para o relacionamento com KEGGs e GOs, e algumas bases de dados es-

pecı́ficas para o organismo em estudo, como org.Hs.eg.db (Homo sapiens) e org.Mm.eg.db

(Mus musculus) (YU et al., 2012).

3.8.2 Gene set variation analysis for microarray and RNA-Seq data (GSVA)

Para facilitar a análise de enriquecimento funcional tipo GSEA, foi desenvolvido, em lin-

guagem de programação R, o Gene Set Variation Analysis (GSVA), o qual permite a avaliação

da variação da atividade de pathways subjacentes transformando uma matriz “gene versus amos-

tras” em uma matriz “conjunto de genes versus amostras” sem um conhecimento prévio do

design experimental. O método é não-paramétrico e sem supervisão, e ignora a abordagem


34

convencional de fenótipos de modelagem explı́cita dentro de algoritmos de enriquecimento

com score. O foco é então substituı́do por um enriquecimento relativo de pathways através

do espaço amostral ao invés de enriquecimento absoluto relacionado a um fenótipo. Um ponto

positivo desta abordagem é que ela possibilita o uso de métodos analı́ticos tradicionais como

classificação, análise de sobrevivência, clusterização e análise de correlação em uma dada via

(pathway). Ela também facilita comparações amostrais entre vias e outros tipos de dados com-

plexos tais como expressão de microRNA ou “binding data”. Contudo, para experimentos

caso-controle ou dados com um tamanho amostral moderado (inferior a 30), outros métodos de

enriquecimento de conjunto de genes que incluem explicitamente um fenótipo em seus mode-

los disponibilizam maior poder estatı́stico para detectar enriquecimento funcional (HÄNZEL-

MANN; CASTELO; GUINNEY, 2013).

A ferramenta parte de uma matriz de entrada em que as linhas representam os genes e as

colunas representam as amostras. A saı́da será uma matriz na qual as linhas representam um

conjunto de genes funcionalmente associados e as colunas indicam as amostras. Cada conjunto

gênico dentro de uma dada amostra é ranqueado de acordo com sua significância, ou seja, a

cada grupo é atribuı́do um peso (score) (HÄNZELMANN; CASTELO; GUINNEY, 2013).

3.8.3 GAGE: Generally Applicable Gene-set Enrichment

GAGE é um método desenvolvido em R e que pode ser aplicado a datasets com diferentes

números de amostras, sendo baseado em um processo de randomização gênica paramétrica com

a utilização de log fold change conforme os genes presentes. É capaz de realizar ajustes para di-

ferentes designs experimentais e tamanhos amostrais através da decomposição de comparações

grupo a grupo em comparações um a um entre amostras de diferentes grupos, funcionando tanto

para experimentos de microarranjo quanto RNA-seq. Com base nos p-valores obtidos a partir

de tais comparações, calcula-se um p-valor global, para cada conjunto gênico, usando-se um

meta teste (LUO et al., 2009).

3.9 Hipóteses e p-valores

A abordagem tradicional para tornar válidas alguns tipos de inferência tem sido estabelecer

uma questão a ser respondida na forma de duas hipóteses estatı́sticas contrastantes. A primeira,

representando a inexistência de diferenças entre os parâmetros populacionais de interesse, é

chamada de hipótese nula H0, enquanto a segunda recebe o nome de hipótese alternativa, re-

presentada por H1 . Um teste estatı́stico é realizado a partir de dados amostrais e comparado à


35

hipótese nula com o intuito de avaliar a consistência dos dados com H0. A obtenção de valores

mais extremos a partir do teste sugerem que os dados amostrais não são consistentes com H0

(ANDERSON; BURNHAM; THOMPSON, 2000).

O p-valor é uma medida de discrepância do ajuste de um modelo ou hipótese nula para

um certo conjunto de dados X. Trata-se, na teoria, de uma medida contı́nua de evidência que,

na prática, resume-se à evidência forte, fraca ou sem evidência (altamente significante, margi-

nalmente significante ou sem significância estatı́stica), com pontos de corte de acordo (cutoffs)

com o pesquisador (GELMAN, 2013). P-valores são normalmente usados para testar uma H0,

a qual, geralmente, afirma que não há diferença entre dois grupos ou que não existe correlação

entre duas determinadas caracterı́stica. Quanto menor o p-valor, menor a probabilidade de que

um conjunto de dados observado tenha ocorrido ao acaso, garantindo a veracidade da hipótese

nula. Um p-valor de 0.05 ou menos, normalmente, leva a acreditar na autenticidade da signi-

ficância estatı́stica obtida. No entanto, recentemente, a Associação Americana de Estatı́stica

(ASA) alertou sobre o perigo de tal prerrogativa. Um p-valor de 0.05 não significa que há uma

chance de 95% de que uma dada hipótese esteja correta. Ao invés disso, ela mostra que se um

hipótese nula é verdadeira, e todas as outras suposições feitas são válidas, existe 5% de chance

de se obter um resultado incoerente com H0 (BAKER et al., 2016).

3.10 FDR: False Discovery Rate

A quantidade de dados gerados pela comunidade cientı́fica tem aumentado consideravel-

mente ao longo dos últimos anos. As pesquisas por trás desse aumento, normalmente, envol-

vem tentativas de inferir conclusões por meio de vários testes de hipóteses. Os pesquisadores,

tipicamente, são levados a realizarem ajustes de significância com o intuito de reduzirem a pro-

babilidade de resultados falso positivos. Tais ajustes destinam-se a controlar taxas de erro e

reduzir as chances de rejeitar incorretamente hipóteses nulas verdadeiras. No entanto, a des-

vantagem em fazer uso de tais técnicas consiste na perda de poder em detectar efeitos reais.

Visando reduzir esse problema, surge, então, o método False Discovery Rate (FDR). O FDR

é a probabilidade de que uma hipótese nula seja verdadeira dado que esta tenha sido rejeitada

(GLICKMAN; RAO; SCHULTZ, 2014).

As tecnologias NGS mais recentes permitem aos pesquisadores executarem varreduras em

genomas e monitorar os nı́veis de expressão de milhares de genes simultaneamente. O problema

do teste de múltiplas hipóteses surge quando são comparados um grande número de genes entre

diferentes grupos, por exemplo, pacientes com câncer de mama vs pacientes saudáveis. Nesse


36

contexto, o método de Bonferroni se torna conservativo e de baixo poder. Diante de tal situação,

a melhor alternativa é o uso de FDR, o qual leva em conta a proporção de falsos positivos entre

as hipóteses rejeitadas. Existe, atualmente, diferentes software e pacotes que aplicam a técnica.

Basicamente é fornecido como entrada um conjunto de p-valores referentes à diferentes genes

ou conjuntos gênicos, tendo, como saı́da, os correspondentes q-valores (p-valores corrigidos).

Isso permite, então, identificar os q-valores significativos, que são aqueles menores ou iguais

a um determinado valor (normalmente, 0.05). Caso exista, por exemplo, um total de N genes

identificados como significantes pelo FDR, a maioria dos pesquisadores considerariam que o

número de genes falso positivos não seria superior ao produto entre o corte estabelecido (0.05,

por exemplo) e N (LIN; LEE, 2015).

3.11 Bootstrap

Introduzido em 1977, o termo Bootstrap (EFRON, 1979) faz referência a um método ou

técnica de simulação cujo propósito consiste em obter intervalos de confiança de forma que de-

terminados parâmetros de interesse possam ser estimados através da reamostragem do conjunto

original de dados (MARTINEZ-ESPINOSA; SANDANIELO; LOUZADA-NETO, 2006). O

método, ainda, é capaz de obter, com qualidade, estimativas dos erros padrão consequentes de

estimativas de parâmetros ligados às iterações de reamostroagem (LEPAGE; BILLARD, 1992),

além de permitir encontrar p-valores para testes estatı́sticos com base em uma hipótese nula

(BOOS et al., 2003). A Figura 3.7 ilustra o funcionamento clássico de um bootstrap de amostra

única, modelo aplicado no desenvolvimento do módulo estatı́stico da ferramenta EntropyClus-

terGenes, a qual ainda descreveremos neste capı́tulo.

Para melhor compreender o Bootstrap, é preciso lembrar que um modelo estatı́stico é, ba-

sicamente, um conjunto de distribuições de probabilidades com o propósito de descrever o

real estado da natureza e os dados aleatórios disponı́veis relacionados à compreensão desse es-

tado. Com isso, é possı́vel afirmar que a inferência estatı́stica está na escolha de uma dessas

distribuições, dando uma noção da incerteza sobre ela. Fazemos inferências sobre populações

desconhecidas, representadas por modelos estatı́sticos, a partir de dados de amostragem. O de-

sign da verdadeira amostragem de dados é reproduzida o mais fiel possı́vel, enquanto aspectos

desconhecidos do modelo são substituı́dos por estimativas amostrais (BOOS et al., 2003).


37

Figura 3.7: Esquema básico do funcionamento de um bootstrap em um contexto biológico. Partimos
de um conjunto de genes com os seus respectivos valores de expressão (1). Em seguida, o conjunto é
reagrupado em subgrupos (2) que segregam os genes de acordo com suas ontologias, em que um gene
pode estar presente em mais de um subgrupo. Cada subgrupo (3) apresenta uma determinada quantidade
de genes, a qual servirá como parâmetro para a reamostragem aleatória (4) com reposição a partir do
conjunto inicial gênico. Após a reamostragem (5), tem-se, então as estimativas desejadas, como, por
exemplo, p-valores.

3.12 Teste Wilcoxon rank-sum

A comparação entre duas amostras geralmente se divide em duas categorias: (i) podemos ter

um determinado número de réplicas para cada uma das amostras, as quais seriam não-pareadas

ou (ii) dispomos de uma quantidade de comparações pareadas que levam a diferenças cujos

valores podem ser positivos ou negativos. Frank Wilcoxon (WILCOXON, 1945) propôs um

método que permitia a utilização de rankings, em que scores (1, 2, 3, ..., n) eram substituı́dos


38

por dados numéricos reais de forma que, rapidamente, uma ideia aproximada da significância

das diferenças em experimentos pudesse ser obtida.

Para duas amostras independentes, uma das variações da metodologia de Wilcoxon é o teste

rank-sum (Wilcoxon rank-sum test). Neste tipo de teste, os dados de ambas as amostras são com-

binados e ranqueados, sendo, na sequência, separados, mas mantendo-se o ranking de cada uma

das observações. A hipótese nula comum (H0) é que ambas as amostras pertencem a populações

idênticas, ao passo que a hipótese alternativa (H1) afirma que as populações diferem quanto à

média ou mediana. Caso as amostras tenham como origem a mesma população, espera-se uma

mistura de ranks altos, médios e baixos em cada uma das amostras. Entretanto, considerando-

se que (H1) seja satisfeita, espera-se que ranks baixos dominem uma das populações enquanto

valores elevados predominem na outra. Ao compararmos, por exemplo, um grupo de pacien-

tes tratados com uma determinada dose de um certo medicamento e um grupo, tratado com o

mesmo medicamento, porém com um dose diferente, a mudança de centralidade observada com

a satisfação de (H1) frequentemente se refere a um efeito aditivo do tratamento, ou seja, existe

uma diferença constante entre os tratamentos (SPRENT; SMEETON, 2000).

A função wilcox.test, pertencente ao pacote stats, versão 3.6, da linguagem de programação

R, permite a aplicação do teste de Wilcoxon para duas amostras pareadas ou não-pareadas. Os

dados de cada amostra são armazenados em vetores numéricos finitos. Um argumento lógico

(Verdadeiro ou Falso) indica se o teste será ou não pareado. Como resultado, um p-valor é

retornado, indicando a significância do teste.

3.13 Teste Exato de Fisher

Proposto por Ronald Aylmer Fisher, o teste Exato de Fisher (FISHER, 1934) é um teste

de independência em oposição a associação em tabelas de contingência 2x2, utilizado quando

se dispõe de duas variáveis nominais e desejamos saber se as proporções de uma variável são

diferentes entre os valores de outra. Uma situação tı́pica para o uso dessas tabelas é quando

temos contagens de indivı́duos categorizada de forma dicotômica como, por exemplo, tipos

de tratamento (uso da droga A ou B) e as respostas em função de cada um deles (melhora da

condição clı́nica do paciente ou condição inalterada) (SPRENT, 2011). Um exemplo pode ser

observado através de Tabela 3.2.


39

Tabela 3.2: Exemplo de tabela de contingência para o teste exato de Fisher. Sob a hipótese
de independência, se considerarmos os totais marginais da tabela como fixos, a distribuição
de números na primeira célula (ou outra célula qualquer) apresenta uma distribuição hiper-
geométrica sob independência para qualquer modelo que esteja associado à tabela. As respos-
tas à cada droga são binomialmente distribuı́das com um valor em comum para o parâmetro p
(probabilidade de sucesso).

Melhora Sem Melhora TOTAL

Droga A 8 1 9

Droga B 3 9 12

TOTAL 11 10 21

Fonte: Tabela modificada de (SPRENT, 2011), página 525.

Segundo Fisher, sob a hipótese de independência, se considerarmos os totais marginais da

tabela como fixos, a distribuição de números na primeira célula (ou outra célula qualquer) apre-

senta uma distribuição hipergeométrica sob independência para qualquer modelo que esteja

associado à tabela. As respostas à cada droga, como na Tabela 3.2, são binomialmente dis-

tribuı́das com um valor em comum para o parâmetro p (probabilidade de sucesso) (SPRENT,

2011).

Se uma tabela de contingência apresenta entradas ni,j (i,j = 1, 2), com o total das linhas ni+,

total das colunas n+j e o total de entrada das 4 células como n, a distribuição hipergeométrica

apresenta probabilidade associada conforme Equação 3.5.

(n1+)!(n2+)!(n+1)!(n+2)!
(n11)!(n12)!(n21)!(n22)!n!

(3.5)

Para a execução do teste, é preciso calcular todas as probabilidades para todos os possı́veis

n11 consistentes com os totais marginais fixos e computar um p-valor como sendo a soma de tais

probabilidades que sejam menores ou iguais à aquele associado com a configuração observada

(SPRENT, 2011).

O teste exato de Fisher pode ser calculado através da função fisher.test, pertencente ao

pacote stats, versão 3.6, da linguagem de programação R. Para tanto, basta fornecer como

parâmetro uma matriz de contingência de de dimensões 2x2 tendo, como resultado, um p-valor

mostrando a significância do teste.


40

4 Resultados e Discussão

4.1 Desempenho

Uma das principais caracterı́sticas relacionadas à automação do EntropyC