xiii UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA Staphylococcus aureus e Estafilococos coagulase-negativa: Virulência, Resistência aos Antimicrobianos e Epidemiologia Molecular MARIA DE LOURDES RIBEIRO DE SOUZA DA CUNHA Texto sistematizado da linha de pesquisa, apresentado ao Instituto de Biociências, como parte das exigências para obtenção do título de Livre-docente em Microbiologia - Bacteriologia Botucatu-SP 2012 xiv FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. E TRAT. DA INFORMAÇÃO DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: Rosemeire Aparecida Vicente Cunha, Maria de Lourdes Ribeiro de Souza da. Staphylococcus aureus e estafilococos coagulase-negativa: virulência, resistência aos antimicrobianos e epidemiologia molecular / Maria de Lourdes Ribeiro de Souza da Cunha. – Botucatu : [s.n], 2012 Tese (livre-docência) - Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências de Botucatu Capes: 21201021 1. Epidemiologia molecular. 2. Infecções. 3. Estafilococos. 4. Cateteres. Palavras-chave: Biofilme; Cateter; Epidemiologia molecular; Infecções neonatais; MRSA; Peritonites; Resistência; Staphylococcus spp.; Toxinas estafilocócicas. xiii Nome do autor: Maria de Lourdes Ribeiro de Souza da Cunha Título: Staphylococcus aureus e Estafilococos coagulase-negativa: Virulência, Resistência aos Antimicrobianos e Epidemiologia Molecular COMISSÃO EXAMINADORA Prof. Titular Dr. Carlos Alberto de Magalhães Lopes Presidente Departamento de Microbiologia e Imunologia Instituto de Biociências -IB Universidade Estadual Paulista -UNESP - Botucatu-SP Prof. Titular Dr. Augusto Cezar Montelli Membro Titular Departamento de Clínica Médica Faculdade de Medicina de Botucatu - FMB Universidade Estadual Paulista -UNESP - Botucatu-SP Prof. Titular Dr. Antonio Carlos Campos Pignatari Membro Titular Departamento de Medicina Universidade Federal de São Paulo, UNIFESP - São Paulo-SP Prof. Titular Dr. Antonio Fernando Pestana de Castro Membro Titular Departamento de Microbiologia Instituto de Ciências Biomédicas- ICB Universidade de São Paulo - USP - São Paulo -SP Profa. Titular Dra. Elizabeth Oliveira da Costa Freitas Guimarães Membro Titular Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia -FMVZ Universidade de São Paulo - USP - São Paulo -SP xiv "Deus quer, o homem sonha, a obra nasce" Fernando Pessoa xv A Deus, alicerce que me faz forte, persistente e sonhadora... Caminho, verdade e vida xvi Aos meu pais, ANTENOR e ALICE Amor incondicional... xvii Ao meu marido Toninho, Companheiro que Deus colocou na minha vida para compartilhar amor, sonhos, dificuldades, realizações , e o que temos de mais precioso em nossa vida... xviii Às minhas adoráveis filhas Taís e Letícia, Dons mais preciosos que Deus me permitiu ter... Amor incondicional, incentivo para nunca desistir... xix À DEUS, por dar-me a conhecer os seus caminhos e conviver com pessoas abençoadas e orientar-me. À equipe que participou diretamente da execução dos trabalhos inseridos neste Texto Augusto Cezar Montelli, Adilson Oliveira, Adriano Martison Ferreira, André Martins, Alessandro Lia Mondelli, Ana Maria Fioravante, Camila Marconi, Camila Sena Martins, Carlos Alberto de Magalhães Lopes, Carlos Henrique Camargo, Carlos Magno Castelo Branco Fortaleza, Deise Rafaela Ustulin, Eliane Peresi, Eliane Pessoa da Silva, Jacqueline Teixeira Costa Caramori, Jackson Eliezer Neves Batalha, João Cesar Lyra, João Pessoa Araújo Júnior, José Eduardo Corrente, Letícia Teixeira Pazzini, Liciana Vaz de Arruda Silveira, Ligia Maria Suppo de Souza Rugolo, Marcus Vinicius Pimenta Rodrigues, Maria Fátima Sugizaki, Maria Regina Bentlin, Mariana Fávero Bonesso, Natalia Bibiana Teixeira, Nathalie Gaebler Vasconcelos, Pasqual Barretti, Regina Adriana Oliveira Calsolari, Taíse Marongio Cotrim de Moraes, Valéria Cataneli Pereira Agradeço pelo privilégio de conviver com tantas pessoas inteligentes, dedicadas, que proporcionaram significante contribuição à minha carreira científica. Aos meus orientados Patrícia, Valéria, Eliane, André, Adilson, Mariana, Adriano, Claudia, Danilo, Ligia, Taísa, Katheryne, Camila, Luiza, Carla, Natália, Maria Raquel, Ariane, e meus co-orientados Jackson, Thaís, Carlos, Fabiana e Evelyn, pela dedicação, disponibilidade, amizade e apoio efetivo nesses anos de convívio e aprendizado mútuos. Agradecimento especial às pós-graduandas Ligia Maria Abraão, Camila Sena Martins de Souza e à pós-doutoranda Patrícia Yoshida Faccioli Martins pela disposição, paciência e eficiência com que me auxiliaram durante a revisão do texto e organização do memorial. À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e à Fundação para o xx Desenvolvimento da UNESP (FUNDUNESP) pelos auxílios financeiros e bolsas de estudo que foram fundamentais para a obtenção desses resultados. Aos Professores Prof. Titular Augusto Cezar Montelli, Prof. Adjunto Pasqual Barretti, Profa. Adjunto Jacqueline Costa Teixeira Caramori pela oportunidade de fazer parte de um grupo de pesquisa tão atuante e aprender um pouco com a experiência de profissionais tão dedicados e competentes. Ao Prof. Dr. Carlos Magno Castelo Branco Fortaleza, que sempre esteve pronto a me auxiliar com suas valiosas sugestões, efetivo apoio, trabalhos em parceria e inestimável ajuda. Aos Professores Profa. Adjunto Ligia Maria Suppo de Souza Rugolo, Prof. Dr. João Cesar Lyra, Profa. Dra Maria Regina Bentlin, Prof. Titular Silvio Alencar Marques, Prof. Dr. Alessandro Lia Mondelli pela disponibilidade e confiança na realização dos trabalhos realizados em parceria. Ao Prof. Adjunto Paulo Câmara Marques Pereira coordenador do Programa de Pós- graduação em Doenças Tropicais da Faculdade de Medicina de Botucatu e Profa. Adjunto Clélia Akiko Hiruma Lima coordenadora do Programa de Pós-graduação em Biologia Geral e Aplicada do Instituto de Biociências pela confiança e apoio. Aos professores Prof. Titular Hélio Langoni, Profa. Titular Elizabeth Oliveira da Costa, Prof. Adjunto Márcio Garcia, Profa. Simone Baldini Lucheis pela confiança na realização de trabalhos em parceria. Ao Prof. Titular Antonio Carlos Campos Pignatari pela confiança e nova parceria que enriquecerá a minha carreira científica. xxi A todos os professores do Departamento de Microbiologia e Imunologia pelo apoio e incentivo, e agradecimento especial aos professores Prof. Titular Carlos Alberto de Magalhães Lopes, Prof. Dr. Silvio Luis de Oliveira, Prof. Adjunto João Pessoa Araújo Júnior, Profa. Titular Maria Terezinha Serrão Peraçoli, Prof. Dr. Ary Fernandes Júnior, Profa. Adjunto Alexandrina Sartori, pelos trabalhos em parceria que contribuíram muito para a minha carreira científica. Aos funcionários do Departamento de Microbiologia e Imunologia Sonia Maria Faraldo, Leonice Aparecida Garcia, Luiz Severino dos Santos, Luiz Henrique Alquati pela dedicação, apoio, ajuda e convívio harmonioso. À minha pequena Grande família, Toninho, Taís e Letícia, obrigada pelo amor, ajuda, apoio e incentivo, sempre... Aos meus pais Antenor e Alice, exemplos de pessoas batalhadoras, dedicadas e vencedoras, que me ensinaram que podemos sonhar, lutar e com a Graça de Deus realizar. À minha única e querida irmã Irene, pessoa iluminada, carinhosa, dedicada, com quem aprendi que as dificuldades da vida são essenciais para nos tornar pessoas melhores e mais felizes. Aos meus irmãos João e Claudio por fazerem parte da minha vida, pelo carinho, apoio e ajuda nos primeiros passos da minha caminhada. xxii Aos meus cunhados, cunhadas, sobrinhas e sobrinhos, em especial ao casal Ana e Aníbal, pela ajuda, apoio, carinho e amizade, não só nos bons, mas principalmente nos momentos mais difíceis. xiii LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS...........................................................................xiii LISTA DE FIGURAS..................................................................................................xxii LISTA DE TABELAS..................................................................................................xxiii 1. Considerações Iniciais........................................................................................... .1 2. O Gênero Staphylococcus.......................................................................................5 3. Significância Clínica de Estafilococos Coagulase-negativa......................................9 ANEXO 1.......................................................................................................21 ANEXO 2.......................................................................................................32 ANEXO 3.......................................................................................................38 4. Infecções Relacionadas a Cateteres......................................................................47 ANEXO 4.......................................................................................................65 ANEXO 5.......................................................................................................72 5. Identificação de Staphylococcus spp.....................................................................77 ANEXO 6.......................................................................................................86 ANEXO 7.......................................................................................................93 6. Biofilme Estafilocócico........................................................................................119 ANEXO 8......................................................................................................135 xiv ANEXO 9......................................................................................................145 ANEXO 10....................................................................................................149 7. Toxinas Estafilocócicas........................................................................................158 ANEXO 11....................................................................................................177 ANEXO 12....................................................................................................206 ANEXO 13................................................................................................... 212 ANEXO 14....................................................................................................223 ANEXO 15....................................................................................................238 8. Resistência aos Antimicrobianos.........................................................................253 ANEXO 16....................................................................................................268 ANEXO 17....................................................................................................276 9. Epidemiologia de Staphylococcus spp. Resistentes à Meticilina..........................286 ANEXO 18....................................................................................................298 10. Referências Bibliográficas.................................................................................309 xiii LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS Aap Proteína Associada ao Acúmulo ab Quase Negro AIP Polipeptídeo autoindutor agr Gene Regulador Acessório ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária arl Lócus Relacionado a Autolisina ATCC American Type Culture Collection Atle Autolisina B Bordô b Negro Bap Proteína Associada ao Biofilme Bhp Proteína Homóloga Associada ao Biofilme brd Bordô CA-MRSA Staphylococcus aureus Resistente à Meticilina Adquirido na Comunidade CAPD Diálise Peritoneal Ambulatorial Contínua CC Complexo Clonal xiv CDC Centers for Disease Control cDNA DNA complementar CFL Cefalotina CFO Cefoxitina CIM Concentração Inibitória Mínima CLSI Clinical Laboratory Standards Institute CRA Ágar Vermelho Congo CVE Centro de Vigilância Epidemiológica CTI Centro de Terapia Intensiva CVC Cateter Vascular Central DP Diálise Peritoneal DTP Método Diferencial de Tempo de Positividade ECN Estafilococos Coagulase-negativa ECTA Ácidos Teicóicos Extracelulares eDNA DNA genômico extracelular egc Enterotoxin gene cluster ELISA Ensaio Imunoenzimático ERI Eritromicina xv ERIC Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus ETs Toxinas esfoliativas EUA Estados Unidos da América FAPESP Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo FMB Faculdade de Medicina de Botucatu GEN Gentamicina GPI Identificação de Gram-Positivo HA-MRSA Staphylococcus aureus Resistente à Meticilina de Origem Hospitalar HACO-MRSA Staphylococcus aureus Resistente à Meticilina de Origem Hospitalar de Início na Comunidade HC Hospital das Clínicas ica Locus de Adesão Intercelular ICSRC Infecção da Corrente Sanguínea Relacionada com Cateter ID Identificação IRAS Infecções Relacionadas à Assistência à Saúde IRC Infecção Relacionada ao Cateter ITS-PCR Intergenic Transcribed Spacers xvi ITU Infecção do Trato Urinário MH Ágar Muller-Hinton mgrA Regulador Global Múltiplo MLST Multilocus Sequence Type MSCRAMMs Microbial Surface Components Recognizing Adhesive Matrix Molecules MOD-SA Resistência Modificada à Oxacilina MRSA Staphylococcus aureus Resistente à Meticilina MSSA Staphylococcus aureus Sensível à Meticilina NEC Enterocolite necrosante NNIS National Nosocomial Infection Surveillance System OPT Operon Technology PB Preto Brilhante OXA Oxacilina pb pares de bases PBP Proteína Ligadora de Penicilina PCR Reação em Cadeia da Polimerase PEN Penicilina xvii PFGE Pulsed Field Gel Electrophoresis PS Preta Seca PIA Polissacarídeo de Adesão Intercelular PMNs Leucócitos Polimorfonucleares PNAG Poli-N-Acetilglicosamina PTs Toxinas Pirogênicas PVL Leucocidina Panton-Valentine qRT-PCR Reação em Cadeia da Polimerase – Transcriptase Reversa quantitativo QS Quorum-sensing R Rosa r Vermelho RAP Proteína Ativadora de RNA RAPD-PCR Random Amplified Polymorphic DNA Based PCR REP-PCR Repetitive Extragenic Palindromic Sequence Based PCR RIA Radioimunoensaio RIF Rifampicina RIP Peptídeo Inibidor de RNA xviii RNAm RNA mensageiro RNAt RNA transportador RNMPB Recém-nascidos de Muito Baixo Peso ROC Curva de Operação Resposta rot Repressor de Toxinas RPHA Hemaglutinação Reversa Passiva RPLA Aglutinação Reversa e Passiva de Látex RT-PCR Reação em Cadeia da Polimerase – Transcriptase Reversa SAgs Superantígenos SaPI Ilha de Patogenicidade de Staphylococcus aureus sae Elemento Acessório Estafilocócico sar Regulador Acessório Estafilocócico SCCmec Cassete Cromossômico Estafilocócico SCOPE Surveillance and Control of Pathogens of Epidemiological Importance SEs Enterotoxinas Estafilocócicas SEA Enterotoxina Estafilocócica A SEB Enterotoxina Estafilocócica B xix SEC Enterotoxina Estafilocócica C sec-1 Gene da Enterotoxina Estafilocócica C subtipo 1 SEC3 Enterotoxina Estafilocócica C subtipo 3 SED Enterotoxina Estafilocócica D SEE Enterotoxina Estafilocócica E SEG Enterotoxina Estafilocócica G SEH Enterotoxina Estafilocócica H SEI Enterotoxina Estafilocócica I SEl Enterotoxina-like estafilocócica SElJ Enterotoxina-like estafilocócica J SElK Enterotoxina-like estafilocócica K SElM Enterotoxina-like estafilocócica M SElN Enterotoxina-like estafilocócica N SElO Enterotoxina-like estafilocócica O SElP Enterotoxina-like estafilocócica P SePI Ilha de Patogenicidade de Staphylococcus epidermidis SElQ Enterotoxina-like estafilocócica Q SER Enterotoxina Estafilocócica R xx SES Enterotoxina Estafilocócica S SET Enterotoxina Estafilocócica T spaTyping Tipagem do Gene da Proteína A SRC Sepse Relacionada a Cateter srr Resposta Respiratória Estafilocócica SSR Sequência Curta de Repetições TCP Aderência em Placa de Poliestireno TM Método de Aderência em Tubo de Borossilicato TP Tempo de Positividade TRAP Proteína Alvo de RAP TSST-1 Toxina 1 da Síndrome do Choque Tóxico TSS Síndrome do Choque Tóxico UFC Unidades Formadoras de Colônias UNESP Universidade Estadual Paulista UNIFESP Universidade Federal do Estado de São Paulo UTI Unidade de Tratamento Intensivo UTINs Unidades de Tratamento Intensivo Neonatais V Vermelha xxi VAN Vancomicina vb Muito Negro VISA Staphylococcus aureus Intermediário à Vancomicina VPP Valor Preditivo Positivo vr Muito vermelho VRE Enterococos Resistente à Vancomicina (VRE) VRSA Staphylococcus aureus Resistente à Vancomicina xxii LISTA DE FIGURAS Figura 1: Teste de sensibilidade às drogas antimicrobianas – técnica de disco difusão em ágar para determinação da similaridade de estafilococos coagulase- negativa isolados de cateter e hemocultura..................................................60 Figura 2: Dendogramas obtidos pela técnica de Random Amplified Polymorfic DNA Based PCR (RAPD-PCR) e Repetitive Extragenic Palindromic Sequence Based PCR (REP-PCR) em amostras de Staphylococcus spp. isoladas de cateteres e hemoculturas para determinação da similaridade.........................................62 Figura 3: Modelo da biossíntese do Polissacarídeo de Adesão Intercelular (PIA)........122 Figura 4: Pesquisa da produção de biofilme pelo método de aderência em tubo (TM) em amostras de Estafilococos coagulase-negativa.......................................125 Figura 5: Pesquisa da produção de biofilme pelo método de aderência em placa de poliestireno (TCP) em amostras de Estafilococos coagulase-negativa.........127 Figura 6: Pesquisa da produção de biofilme pelo método de Ágar vermelho Congo (CRA) em amostras de Estafilococos coagulase-negativa.............................128 Figura 7: Interação de TRAP e Sistema Agr..................................................................133 xxiii LISTA DE TABELAS Tabela 1: Tipos de SCCmec identificados em Staphylococcus aureus .........................257 Tabela 2: Histórico dos casos de Staphylococcus aureus Resistentes à Vancomicina (VRSA) nos Estados Unidos e informação geográfica..................................263 1 1. Considerações Iniciais O presente trabalho foi realizado de acordo com o disposto no Artigo 6° da Resolução Unesp-27, de 15-4-2009 que estabelece, como uma das provas realizadas para a obtenção do título de Livre-Docente, "II- defesa de tese original e inédita ou de texto que sistematize criticamente a obra do candidato, ou parte dela, elaborados após o doutoramento". Neste contexto, optei por discutir os trabalhos vinculados à linha de pesquisa "Staphylococcus aureus e Estafilococos coagulase-negativa: virulência, resistência antimicrobiana e epidemiologia molecular". Meu interesse por essa linha de pesquisa surgiu desde a minha iniciação científica na Universidade Estadual de Londrina quando comecei estudar a detecção de enterotoxinas estafilocócicas em S. aureus orientada pela Profa. Dra. Elisa Yoko Hirooka. Na pesquisa para dissertação de mestrado continuei a estudar S. aureus enterotoxigênicos, porém com ênfase em seu desenvolvimento em leite e extrato de soja. A partir do meu projeto de doutorado já como professora no Departamento de Microbiologia e Imunologia do Instituto de Biociências da UNESP de Botucatu e orientada pelo Prof. Dr. Carlos Alberto de Magalhães Lopes comecei a trabalhar também com as outras espécies do gênero Staphylococcus, os Estafilococos coagulase-negativa (ECN), pesquisando desde a identificação dessas espécies, bem como a detecção fenotípica de vários fatores de virulência, incluindo enzimas, biofilme, enterotoxinas e a resistência aos antimicrobianos em amostras isoladas de recém-nascidos da Unidade Neonatal do Hospital das Clínicas (HC) da Faculdade de Medicina de Botucatu (FMB), com a colaboração da Profa. Dra. Ligia Maria S. S. Rugolo e posteriormente também dos 2 neonatologistas Dr. João César Lyra e Dra. Maria Regina Bentlin, professores pesquisadores do Departamento de Pediatria da Faculdade de Medicina de Botucatu. A partir dos resultados do meu doutorado e da dificuldade de convencer os revisores da veracidade dos resultados obtidos quanto a toxigenidade de ECN e da necessidade da confirmação dos resultados com métodos genotípicos mais confiáveis, ingressei na área de Biologia Molecular, com a pesquisa de genes de toxinas em amostras de S. aureus e estafilococos coagulase-negativa com o meu primeiro projeto financiado pela FAPESP “Detecção de genes de enterotoxinas e toxina 1 da síndrome do choque tóxico em estafilococos, com ênfase em estafilococos coagulase negativa” e com a colaboração do Prof. Dr. João Pessoa Araújo Júnior do Departamento de Microbiologia e Imunologia. A partir desse projeto ainda continuou a dificuldade de publicar, sendo agora questionado o fato de que estas amostras de ECN poderiam ser S. aureus mutantes que perderam a capacidade de produzir a enzima coagulase e a cobrança em relação ao fato da PCR detectar somente os genes e não a expressão das enterotoxinas. Para tentar resolver essa questão iniciamos as pesquisas para aprimorar a identificação desses micro-organismos e a utilização de técnicas moleculares para confirmação das espécies, bem como a detecção de RNAm pela técnica de RT-PCR, o que possibilitou o desenvolvimento da Dissertação de mestrado da minha primeira aluna no programa de pós-graduação em Doenças Tropicais e o desenvolvimento do segundo projeto financiado pela FAPESP, com o título "Determinação do perfil toxigênico em Staphylococcus pela técnica de RT-PCR". A partir do meu doutorado também ingressei por convite do Dr. Augusto Cezar Montelli no grupo de pesquisa das peritonites em Diálise Peritoneal juntamente com o 3 Dr. Pasqual Barretti e a Dra. Jacqueline Teixeira Caramori, professores pesquisadores e responsáveis pela Unidade de Diálise do HC da FMB, com vários projetos já desenvolvidos e outros em andamento, com ênfase para o estudo dos fatores de virulência envolvidos na evolução das peritonites causadas por S. aureus e ECN. Paralelamente a esses projetos de estudos dos fatores de patogenicidade ingressei no estudo da detecção de resistência à oxacilina por métodos moleculares com o desenvolvimento do terceiro projeto de pesquisa aprovado pela FAPESP e minha segunda orientação de mestrado “Resistência à oxacilina em Staphylococcus aureus e Staphylococcus coagulase-negativa provenientes de pacientes do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu”. A partir daí ingressamos também na área de epidemiologia molecular com a compra do equipamento de Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) no quarto projeto financiado pela FAPESP “Epidemiologia molecular e fatores de risco para aquisicão de clones endêmicos de Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) em um hospital de ensino”, e minha primeira orientação de Doutorado, juntamente com a colaboração do Prof. Dr. Carlos Magno Castelo Branco Fortaleza do Departamento de Doenças Tropicais da FMB. Sendo assim, continuo nessa mesma linha de pesquisa, com quatro projetos de pesquisa em andamento financiados pela FAPESP e várias orientações, incluindo alunos de iniciação científica, mestrado, doutorado, pós-doutorado, vinculados ao programa de pós-graduação em Doenças Tropicais da FMB ou ao programa de pós- graduação em Biologia Geral e Aplicada do Instituto de Biociências da UNESP de Botucatu. 4 Os trabalhos publicados e os manuscritos submetidos inseridos nesse texto são portanto, os resultados desta linha de investigação, sendo que os mesmos foram organizados em áreas e não por execução cronológica, por entender que a apreciação dos mesmos será facilitada. Finalmente, gostaria de ressaltar que, embora eu tenha participado diretamente da execução de todos os trabalhos, seja como coordenadora, colaboradora ou orientadora, só a dedicação, esforço e competência dos alunos e de todos os professores pesquisadores envolvidos permitiram a obtenção desses resultados. 5 2. O Gênero Staphylococcus O nome Staphylococcus tem origem do grego (staphyle cacho de uva, e coccus grão ou semente) e foi dado por Alexander Ogston, cirurgião escocês em 1880, quando isolou esse micro-organismo de um abscesso cirúrgico, referindo-se à morfologia e ao arranjo de tais bactérias quando observadas ao microscópio óptico, e conseguiu por meio de vários experimentos demonstrar a importância de estafilococos em infecções humanas purulentas (1). Entretanto, foi somente em 1884 que o pesquisador Rosenbach, estudando micro-organismos isolados a partir de pus, propôs a criação do gênero Staphylococcus. Desde a sua proposição por Rosenbach o gênero Staphylococcus tem sido classificado dentro da família Micrococcaceae e foi somente na última década com o avanço da biologia molecular, estudos genéticos, perfis de ácidos graxos, composição da parede celular e, principalmente, estudos com RNA ribossômico 16S que o gênero Staphylococcus foi incluído na nova família Staphylococcaceae (2,3). Diferentemente de Micrococcaceae, a família Staphylococcaceae pertence ao filo Firmicutes, Classe Bacilli e ordem Bacillales, evidenciando-se, depois de mais de um século desde sua primeira descrição, a distância filogenética entre os gêneros Staphylococcus e Micrococcus e a importância do avanço da biologia molecular na correta classificação taxonômica dos micro- organismos. Os estafilococos são cocos Gram-positivos, imóveis, anaeróbios facultativos, apresentando metabolismo fermentativo com produção de ácido e não gás, não fotossintético, não esporulado, catalase-positiva e capazes de crescer em meio contendo 10% de cloreto de sódio. São micro-organismos mesófilos, com temperatura 6 de desenvolvimento de 7 a 48o C, com ótima de 37o C e pH na faixa de 4,0 a 10,0, com ótimo de 6,0 a 7,0 (4). Os estafilococos crescem rapidamente na maioria dos meios bacteriológicos. As colônias em meios sólidos são redondas, lisas, elevadas e brilhantes. Produzem um pigmento carotenóide somente em aerobiose, intensificando-se em meios contendo alta concentração salina. A capacidade de se desenvolver em meios contendo alta concentração de NaCl e certa tolerância ao telurito de potássio são aproveitadas para o preparo de meios seletivos. O gênero Staphylococcus compreende diversas espécies e subespécies, que se encontram amplamente distribuídas na natureza, sendo principalmente encontradas na pele e membranas mucosas de aves e mamíferos (4). Atualmente já são 45 espécies descritas dentro do gênero (5, 6), a maioria coagulase-negativa, caracterizando-se a exclusividade da síntese da enzima coagulase as espécies S. aureus subsp. aureus, S. aureus subsp. anaerobius, S. hyicus, S. intermedius, S. pseudintermedius, S. schleiferi subsp. coagulans, S. delphini e S. lutrae. A espécie S. hyicus é variavelmente coagulase positiva e, frequentemente incluída como coagulase-negativa (5). Cerca de metade das espécies de estafilococos coagulase-negativa (ECN) coloniza naturalmente o homem, incluindo-se dentre eles S. epidermidis, S. haemolyticus, S. saprophyticus, S. lugdunensis (7), S. xylosus (8), S. warneri, S. simulans (9), S. saccharolyticus (10), S. auricularis (11), S. caprae (12), S. pasteuri (13), S. vitulinus (14), S. pettenkoferi (15) e S. massiliensis descrita mais recentemente (16). Das 23 subespécies de ECN descritas, o S. hominis subsps. S. hominis, S. hominis subsps. novobiosepticus, S. capitis subsps. capitis, S. capitis subsps. urealyticus (17), S. schleiferi subsps. schleiferi, S. cohnii 7 subsps. cohnii e S. cohnii subsps. urealyticum (18), também são naturais do homem e de outros primatas. Staphylococcus aureus sempre foi a espécie mais importante relacionada com uma série de infecções e intoxicações no homem e nos animais. Vários fatores de virulência são responsáveis pelos sintomas e gravidade das infecções causadas por S. aureus, adquiridas tanto na comunidade como em hospitais, sobressaindo-se atualmente como um dos maiores problemas clínicos e epidemiológicos em Infecções Relacionadas à Assistência à Saúde (IRAS). S. aureus se destaca por sua patogenicidade e alta frequência, causando doenças tanto em indivíduos imunocomprometidos quanto em sadios por sua fácil disseminação intra-hospitalar e sua enorme capacidade de adaptação e resistência a antimicrobianos (19). Os ECN constituem-se nos mais frequentes integrantes da microbiota do homem (20), podendo atingir de 103 a 106 UFC/cm2 na superfície de regiões mais úmidas do corpo, tais como, narinas anteriores, axilas e nas áreas inguinal e perineal. Algumas espécies e subespécies demonstram uma marcante preferência por certos habitats, tais como S. capitis subsps. capitis encontrado em grandes concentrações na cabeça, fronte, sobrancelha e canal auditivo externo (20). Já S. capitis subsps. urealyticus é encontrado em menor número nesses sítios, sendo porém mais amplamente distribuído em outras regiões corpóreas (5). S. auricularis é uma das espécies mais encontradas no canal auditivo externo de humanos (11), enquanto que S. saprophyticus é geralmente encontrado em baixas concentrações e transitoriamente em vários locais orgânicos, mas apresentando aderência especifica as células urogenitais (21). S. epidermidis é a espécie predominante em humanos, sendo 8 encontrada em grande número nas narinas anteriores, axila, área perineal (22). S. hominis e S. haemolyticus são também numerosos nas regiões mais úmidas do corpo, mas também colonizam regiões mais secas da pele com maior frequência que outras espécies (22). S. warneri e S. lugdunensis são amplamente distribuídos por todo o corpo, embora sua concentração seja geralmente baixa (5). S. caprae e S. xylosus, embora, muito distribuídos na natureza, são ocasionalmente isolados da pele de humanos (9). Contudo, os ECN são também considerados micro-organismos oportunistas, que podem se aproveitar de algumas situações, como rupturas da barreira cutânea por trauma ou pela presença de artigos estranhos, e com isso atingir outros tecidos, proliferar e desenvolver um comportamento patogênico (23). Normalmente estão envolvidos em processos infecciosos em pacientes imunocomprometidos ou em pacientes que fazem uso de cateteres. As principais razões para o aumento da taxa de infecções por ECN nos últimos anos são o aumento da resistência aos antimicrobianos entre os ECN e o uso crescente de dispositivos médicos (24). 9 3. Significância Clínica de Estafilococos Coagulase-Negativa Antes dos anos 70, poucos foram os relatos de infecção por ECN, sendo reconhecidos por clínicos e microbiologistas como contaminantes em amostras clínicas e S. aureus como a única espécie patogênica dentro do gênero Staphylococcus (25). Esta distinção, muito usada para o diagnóstico clínico, entretanto tem sido considerada como um desafio quanto ao papel que esses micro-organismos desempenham em processos infecciosos. Os dois primeiros relatos na literatura associando ECN a processos patogênicos datam do ano de 1945, quando Herbst e Merricks (26) relataram um caso de septicemia associado a S. albus em paciente submetido à cirurgia percutânea em rim para retirada de cálculo renal e no ano seguinte Harry (27) citou um caso de meningite infantil pela mesma espécie. S. albus foi renomeado posteriormente como S. epidermidis e treze anos mais tarde Smith et al. (28) descreveram o envolvimento desses micro-organismos com três casos de septicemia. Vários anos mais tarde Pulverer e Halswick (29) relataram 128 casos de endocardites causadas por ECN e Pulverer (30) compartilhou sua frustração com a comunidade médica no Fifth International Symposium on Staphylococci and Staphylococcal Infections, da dificuldade de convencer os editores da publicação alemã que seus dados eram sérios quando tentou publicar seu trabalho em 1967. Wilson e Stuart (31) encontraram ECN em 53 culturas puras de 1.200 casos de infecções de feridas (4,4%). Pulverer e Pillich (32) também publicaram a incidência de ECN em infecções piogênicas na Alemanha apresentando dados de 1960, 1969 e 1970, encontrando ECN em cerca de 10% das lesões piogênicas. Pereira em 1962 (33) relatou que S. saprophyticus causava 10 infecções do trato urinário (ITU). Poucos anos depois Gallagher et al. (34) e Mabeck (35) também evidenciaram ITU causadas por S. saprophyticus. Em muitos laboratórios S. epidermidis era usado como termo genérico e coletivo para todas as outras espécies de Estafilococos Coagulase-Negativa. Na década de 80 essa situação mudou radicalmente, quando o National Nosocomial Infections Surveillance System (NNIS) do Centers for Disease Control and Prevention (CDC) demonstrou um aumento significante de infecções hospitalares causadas por diferentes espécies de ECN (36). Consideráveis progressos na classificação sistemática dos estafilococos e no desenvolvimento de métodos para a identificação do gênero, espécies e subespécies têm permitido aos clínicos se inteirarem da variedade de ECN presentes em amostras clínicas e, assim, os considerarem como agentes etiológicos de uma série de processos infecciosos (25). Atualmente, são reconhecidos como micro-organismos essencialmente oportunistas que se prevalecem de inúmeras situações orgânicas para produzirem graves infecções. Dados do SCOPE (Surveillance and Control of Pathogens of Epidemiological Importance) dos EUA referentes a um período de sete anos, de março de 1995 a setembro de 2002, indicaram os micro-organismos gram-positivos como os principais agentes de infecções da corrente sanguínea (65%) e os ECN como o agente mais frequente (31%), seguido por S. aureus (20%) (37). Dados recentes (junho de 2007 a março de 2010) de um estudo multicêntrico brasileiro utilizando a mesma metodologia do programa SCOPE dos Estados Unidos, SCOPE brasileiro, com o objetivo de estudar a epidemiologia e a microbiologia das infecções da corrente sanguínea nosocomial de pacientes provenientes de 16 hospitais brasileiros de vários tamanhos e 11 diferentes regiões revelaram S. aureus (14%) e ECN (12,6%) como os micro-organismos mais frequentemente isolados (38). Dados reportados pelo National Healthcare Safety Network (NHSN) do CDC do período de janeiro de 2006 a outubro de 2007 ranquearam os ECN em 1° e S. aureus em 2° lugar na etiologia de IRAS (39). No Brasil, dados do Sistema de Vigilância de Infecção Hospitalar do Estado de São Paulo, Centro de Vigilância Epidemiológica (CVE) também relataram os ECN como os agentes mais associados com infecção da corrente sanguínea em 2010, mantendo a predominância de Staphylococcus epidermidis e outros ECN (30,1%), seguido por S. aureus (16,6%), taxas similares as encontradas em 2009 (40). Os ECN mantêm uma relação simbiótica ou comensal com os seus hospedeiros, em algumas situações desenvolvendo mecanismos para a interferência do crescimento de outras bactérias patogênicas, sugerindo a coevolução entre o micro-organismo e o hospedeiro (41). S. epidermidis era descrito apenas como um micro-organismo comensal, mas sua importância como patógeno oportunista é reconhecida atualmente, principalmente por ser um dos principais agentes de infecções nosocomiais (42). As infecções causadas por S. epidermidis não são tão graves como as causadas por S. aureus, por não possuir muitos fatores de virulência, acometendo principalmente prematuros, pacientes imunossuprimidos e com implantes de próteses (43). O baixo nível de virulência mantido por S. epidermidis pode ser devido ao processo adaptativo entre patógeno e hospedeiro. A evolução favorece as espécies que oferecem pouco ou nenhum dano ao seu hospedeiro, e em micro-organismos menos virulentos, essas adaptações oferecem vantagens evolutivas através da duração 12 prolongada da infecção, que favorece o potencial de transmissão de um hospedeiro para o outro (44). Massey et al. (44) desenvolveram um modelo matemático para compreender as vantagens de S. epidermidis manter um baixo nível de virulência em relação a S. aureus. Esse modelo matemático considerou a colonização de todo epitélio por S. epidermidis em todos os humanos, que difere de S. aureus, que coloniza quase que exclusivamente as narinas de algumas pessoas, e também considerou os fatores de regulação gênica envolvidos na colonização e interferência bacteriana. De acordo com esse modelo, S. epidermidis se dissemina mais facilmente do que S. aureus e a baixa virulência está relacionada ao potencial de secretar fatores que promovam a persistência de S. epidermidis no hospedeiro e não o ataque agressivo (42, 44). Os ECN são a maior causa de bacteremia em pacientes mantidos em unidades de tratamento intensivo (UTI) e UTI neonatal (25), com destaque para recém-nascidos de baixo peso, os quais são imunologicamente imaturos e frequentemente requerem procedimentos invasivos para administração de substâncias nutritivas e medicamentosas (45). O aumento da incidência de bacteremia nosocomial por ECN em neonatos nos últimos 20 anos tem sido também associado ao aumento da sobrevivência de crianças prematuras com peso menor que 1.500g ao nascimento e à sua longa permanência no ambiente hospitalar (45, 46). Contudo, a interpretação de hemoculturas positivas para os ECN é particularmente difícil devido ao fato desses micro-organismos colonizarem a pele e as membranas mucosas como comensais, e poderem contaminar as hemoculturas 13 durante a coleta de sangue (25, 47). A esse respeito, investigadores têm usado uma variedade de critérios clínicos e laboratoriais para distinguir contaminação de bacteremia. Assim, o diagnóstico de bacteremia tem sido feito com base nos dados clínicos dos pacientes e no isolamento de micro-organismos idênticos em duas ou mais hemoculturas. As culturas em que ocorre o crescimento de múltiplas linhagens ou de espécies de ECN em associação a outras espécies de micro-organismos são classificadas como contaminantes (25, 48-49). Entretanto, como o volume sanguíneo é pequeno em recém-nascidos (RNs) prematuros com baixo peso, somente uma hemocultura é geralmente realizada para se evitar a necessidade e os riscos de transfusões devido a venopunções constantes (25, 50). Assim, os neonatologistas têm se apoiado em critérios clínicos e laboratoriais, tais como, instabilidade térmica, bradicardia, apnéia, intolerância alimentar, piora do desconforto respiratório, intolerância à glicose, instabilidade hemodinâmica, hipoatividade/ letargia (48, 51). D`Angio et al. (52) descreveram uma taxa de colonização por ECN entre 50% a 80% até 4 dias após a admissão dos RNs em unidade de tratamento intensivo neonatal (UTIN) e observaram que havia um aumento da resistência a múltiplos antibióticos de 32% para 82% no final de uma semana na UTIN. Não há dúvidas de que o isolamento de ECN de amostras de sangue, líquor e urina de um RN com sinais e sintomas de sepse é significativo, porém, com muita frequência pode representar uma contaminação no momento da coleta. De acordo com os critérios do CDC (49, 51) e da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) no Brasil (48), os ECN devem ser isolados de pelo menos duas hemoculturas colhidas em dois locais diferentes, com intervalo máximo de 48 horas entre as coletas. Em caso de isolamento de ECN em 14 somente uma hemocultura, a evolução clínica deve ser valorizada, exames complementares (hemograma e Proteína C reativa) e crescimento do micro-organismo nas primeiras 48 horas de incubação. O crescimento após este período sugere contaminação, e se a amostra positiva tiver sido colhida somente de cateter vascular central (CVC), ECN não deve ser valorizado como agente etiológico da infecção. Entre as 18 espécies encontradas no ser humano, Staphylococcus epidermidis é clinicamente o mais importante para os RNs. Essa bactéria, nos EUA, é responsável por cerca de 10% a 27% de todos os casos de sepse nas UTINs, com taxas de 55% em recém-nascidos de muito baixo peso (RNMBP = < 1.500 gramas) (53). As principais manifestações relatadas num estudo de sepse em prematuros foram apnéia e bradicardia (88%), necessidade de oxigênio (59%) e ventilação mecânica (69%), e os marcadores laboratoriais de fase aguda foram pouco sensíveis (54). O quadro clínico inclui sepse, meningite com ou sem alterações no líquor, enterocolite necrosante, pneumonia, onfalite, abscesso de tecido mole, endocardite, abscesso e osteomielite nos locais de venopunção. A letalidade é baixa, concordante com os nossos resultados (ANEXO 1) obtidos em estudo realizado com RNs da Unidade Neonatal do Hospital das Clínicas (HC) da Faculdade de Medicina de Botucatu (FMB) que mostraram uma letalidade de 13% relacionadas a infecções por esses micro-organismos. Nesse estudo foram isoladas de 107 RNs, 117 amostras de ECN, dos quais 51% foram considerados patogênicos e 49% contaminantes. Entre os infectados, a maioria era RNs prematuros (80%), sendo a metade RNMBP, ou seja, com imaturidade imunológica. Além disso, estavam associados a dois ou mais procedimentos invasivos, sendo que 89% tinham um cateter venoso central, 65% nutrição parenteral e 61% 15 ventilação mecânica. A análise multivariada de regressão mostrou que um peso de nascimento < 1.500g aumentava a chance de infecção em 6 vezes, a presença de corpo estranho em 4,4 vezes, e o uso prévio de antibióticos aumentava em 5,4 vezes mais a chance de infecção. A espécie mais isolada foi S. epidermidis em 78% dos casos, sendo presente em 87% das infecções e em 65% das contaminações. Silbert et al. (55) em estudo para determinar a prevalência de infecção versus contaminação em pacientes com menos de 60 dias de vida, com hemoculturas positivas para ECN relataram também, no Brasil, que entre 41 RNs com hemocultura positiva para ECN, apenas 27% foram considerados infectados, sendo os demais 73% considerados como casos de contaminação ou casos duvidosos. Portanto, a maior dificuldade no diagnóstico de infecção por ECN é a contaminação no momento da coleta do material, sendo significativa para o sangue, e muito pior para corpo estranho e secreções, conforme se verificou em nosso estudo e no trabalho de Silbert et al. (55). Outras espécies de ECN, incluindo duas amostras de S. haemolyticus, três de S. lugdunensis, uma amostra de S. simulans, uma de S. warneri e uma de S. xylosus também foram isoladas de crianças com evidência clínica de pneumonia, enterocolite necrosante e sepse. A identificação de espécies de ECN constitui um marcador útil de infecção, visto que S. epidermidis foi o agente etiológico mais frequentemente associado aos processos infecciosos (ANEXO 1). Silbert et al. (55), encontraram 91,1% dos isolados pertencentes à espécie S. epidermidis, 3 (6,7%) S. hominis e 1 (2,2%) S. warneri, sendo que no grupo de pacientes infectados somente S. epidermidis foi encontrado. Estes resultados confirmam os achados de Lowy e Hammer (56) que 16 acreditam na importância da identificação das espécies de ECN para diferenciação entre contaminação e infecção. Estudos multicêntricos têm mostrado a significância desses micro-organsimos em infecções neonatais. Na Austrália, um estudo de 10 anos realizado com 18 unidades neonatais revelou o ECN como responsável por 1.281 casos de sepse, totalizando 57,1% de todos os episódios de sepse de início tardio, com incidência de 3,46/1000 nascidos vivos e a maioria (71%) era prematuros com 24–29 semanas de gestação (57). Recentemente, resultados semelhantes foram obtidos em estudo também multicêntrico realizado na Inglaterra por Vergnano et al. (58) envolvendo 12 unidades neonatais com 358 episódios de sepse causados por ECN em 321 crianças Os autores verificaram uma incidência total de infecções de 3/1000 nascidos vivos quando consideradas outras etiologias e um aumento para 8/1000 quando considerados os episódios causados por ECN. A maioria das infecções causadas por ECN ocorreu em crianças de ≤ 32 semanas de gestação (86%) e de extremo baixo peso ao nascer (65%). Staphylococcus spp. também são considerados mundialmente os agentes etiológicos mais frequentes das peritonites em diálise peritoneal ambulatorial contínua (CAPD). A peritonite bacteriana se mantém como a complicação mais grave da diálise peritoneal (DP), sendo a causa mais frequente de saída do paciente do método dialítico (59), com importante impacto na mortalidade (60). O quadro clínico e a evolução dos episódios de peritonite são fortemente influenciados pelas características do agente causal. Os ECN são os agentes etiológicos mais frequentes (61), enquanto S. aureus se associa a infecções graves e com elevada letalidade. 17 A incidência de peritonite causada por S. aureus na Unidade de Diálise do HC da FMB diminuiu significantemente, de 0.13 em 1996-2000 para 0.04 episódios/paciente/ano em 2006 a 2010 (p = 0.03). Embora, não haja dados disponíveis que possam explicar a alteração da etiologia prevalente, pode-se sugerir que cuidados instituídos na rotina assistencial, destinados à profilaxia das infecções relacionadas ao cateter, bem como à erradicação de S. aureus de carreadores nasais, podem ter contribuído para a redução de infecções peritoneais por S. aureus. Entretanto, os episódios de peritonites causados por S. aureus cursam com infecção persistente, maior risco de hospitalização, remoção de cateter e morte (59, 60). As peritonites causadas por ECN evoluem para cura, sem outras complicações, na maior parte dos casos (62), porém recidivas de infecções aparentemente curadas são frequentemente observadas. Estudos que compararam o curso clínico das infecções por essas espécies em anos recentes, entretanto, são encontrados em pequeno número de publicações (63), sendo pertinente avaliar se as taxas de resistência progressivamente crescentes entre os ECN, tiveram impacto na evolução e complicações das infecções por esses micro-organismos. Sendo assim, nosso grupo de pesquisa vem realizando vários estudos com pacientes em tratamento com diálise peritoneal ambulatorial contínua (CAPD), em pacientes da Unidade de Diálise do HC da FMB, com os objetivos de descrever as propriedades microbiológicas dos estafilococos causadores das peritonites, comparar as infecções por S. aureus com as causadas por ECN e estabelecer associações entre as características do agente e do hospedeiro na evolução dessas infecções. 18 A análise dos episódios de peritonite ocorridos entre janeiro de 1996 a dezembro de 2000 mostrou que a resolução das peritonites não foi influenciada por fatores do hospedeiro (idade, sexo, diabetes, uso de vancomicina, sistema de troca e tempo em diálise), enquanto a etiologia S. aureus foi um fator independentemente associado com a não resolução quando comparado com as peritonites por ECN (ANEXO 2). Fatores relacionados com as espécies e resistência antimicrobiana poderiam explicar esses resultados. Entretanto, não houve diferença na taxa de resolução entre as amostras resistentes a oxacilina e as sensíveis, e como a resistência a oxacilina é mais frequente entre os ECN do que para S. aureus, a contribuição da resistência aos antimicrobianos é inconsistente. Os resultados desse estudo indicaram que os fatores de virulência encontrados mais frequentemente em S. aureus poderiam ser responsáveis pela natureza mais agressiva de S. aureus e, portanto, pela pior evolução. Estudo publicado mais recentemente pelo nosso grupo (ANEXO 3) com dois modelos de regressão logística corroborou nossa hipótese. No primeiro modelo quando não foram incluídos os fatores de virulência, a chance de resolução não foi influenciada por fatores do hospedeiro, mas foi maior para os episódios causados por S. epidermidis quando comparado com S. aureus (p= 0,0263). Entretanto, no segundo modelo quando foram incluídos os fatores de virulência não foi verificado diferença na probabilidade de resolução das peritonites causadas por S. aureus e S. epidermidis. Este achado pode ser explicado pelo fato de que a inclusão de enzimas e toxinas no modelo permitiu o controle do efeito desses fatores sobre as espécies, ou seja, o efeito das espécies observado no primeiro modelo para os episódios de 19 S. aureus pode ser devido ao efeito dos fatores de patogenicidade que são mais frequentes nessa espécie. Além disso, no último modelo os episódios causados por S. epidermidis apresentaram mais baixa resolução quando comparado com os causados por outras espécies de ECN, independentemente dos fatores de virulência. Esses resultados reforçam a importância da identificação de espécies de ECN que realmente se comportam de forma diferente e não podem ser avaliadas como um grupo, mas sim como espécies distintas com características específicas. Estudos recentes descrevem S. epidermidis como um micro-organismo versátil, que pode viver entre o comensalismo e a patogenicidade. Emprega sofisticados mecanismos de regulação gênica para a adaptação rápida do seu metabolismo às mudanças nas condições externas, para a comunicação com outras células no nicho ecológico ou para escapar da resposta imune do hospedeiro (43). A infecção do trato urinário (ITU) é uma das doenças infecciosas mais comuns na prática clínica, figurando como a segunda infecção mais frequente no ser humano, sendo sua incidência apenas inferior as do trato respiratório. Os agentes etiológicos, mais frequentemente envolvidos com ITU são as enterobactérias, não fermentadores, fungos, enterococos e os estafilococos. Dentre as espécies de estafilococos as mais comuns e importantes em relação às ITUs são S. aureus e S. saprophyticus, porém, outras espécies de ECN vem adquirindo importância nos últimos anos. Estudo realizado em nosso laboratório por Ferreira (64) mostrou a espécie S. saprophyticus como a mais frequente (56,4%) na etiologia de infecção urinária, seguida por S. aureus (16,9%), S. epidermidis (15,9%), S. haemolyticus (7,9%), S. warneri (1,9%) e S. 20 lugdunensis (1,0%). S. aureus é relativamente incomum em ITU na população em geral (65), todavia, em alguns pacientes causa colonização e infecção através da via ascendente. Outros fatores de risco como a instrumentação do trato urinário e a presença de cateterização aumentam o risco de ITU por este micro-organismo (66). Em nosso estudo S. aureus foi a segunda espécie mais encontrada em isolados de origem hospitalar (23,5%) sendo apenas menos frequente que S. epidermidis (41,1%). Também foi encontrada uma alta taxa de S. aureus (16,2%) em amostras não hospitalares (ambulatórios e centros de saúde). Staphylococcus saprophyticus é o segundo agente etiológico mais frequente de ITU na comunidade e raramente é isolado de pacientes hospitalizados ou como contaminantes de cultura de urina (67). Embora em nosso estudo foram isolados 3 S. saprophyticus de pacientes internados e com infecção urinária, com duas pacientes internadas na enfermaria da obstetrícia, e uma na enfermaria da urologia do HC da FMB, após análise dos prontuários desses pacientes, as infecções não foram consideradas nosocomiais, devido a não estarem relacionadas a procedimentos hospitalares, e a manifestação clínica de infecção ter iniciado antes de 72 horas após a admissão. Avaliando a idade e sexo dos pacientes com ITU por S. saprophyticus, 74 (73,2%) eram do sexo feminino, sendo que 56 (55,4%) das mulheres tinham entre 15 e 44 anos de idade. Braoios et al. (68) relataram em seu estudo que a maioria dos pacientes com ITU pertencia ao sexo feminino (69,1%) e tinham entre 20 a 49 anos (52,9%), deste modo nossos dados corroborram com os achados desses autores, demonstrando que, na vida adulta, a incidência de ITU por S. saprophyticus aumenta e ocorre um 21 predomínio no sexo feminino, com picos de maior acometimento no início da atividade sexual ou relacionado a esta. ANEXO 1 CUNHA MLRS, LOPES CAM, RUGOLO LMSS, CHALITA LVS. Significância clínica de estafilococos coagulase-negativa isolados de recém-nascidos. J Pediatr (Rio J). 2002; 78(4): 279-88. http://lattes.cnpq.br/1742303453523352 http://lattes.cnpq.br/1197755531108177 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 ANEXO 2 CUNHA MLRS, MONTELLI AC, FIORAVANTE AM, BATALHA JEN, CARAMORI JCT, BARRETTI P. Predictive factors of outcome following staphylococcal peritonitis in continuous ambulatory peritoneal dialysis. Clin Nephrol. 2005; 64(5): 378-82. http://lattes.cnpq.br/0237893072545577 http://lattes.cnpq.br/5496411983893479 33 34 35 36 37 38 ANEXO 3 BARRETTI P, MONTELLI AC, BATALHA JEN, CARAMORI JCT, CUNHA MLRS. The role of virulence factors in the outcome of staphylococcal peritonitis in CAPD patients. BMC Infect Dis. 2009; 9: 212-9. http://lattes.cnpq.br/5496411983893479 http://lattes.cnpq.br/3029388714636569 39 40 41 42 43 44 45 46 47 4. Infecções relacionadas a cateteres Com o advento dos centros de terapia intensiva (CTI) ocorreu um avanço no tratamento do paciente crítico, promovendo maior sobrevida mesmo na população de maior risco, como na sepse, nos imunodeprimidos, nos pacientes oncológicos e nos recém-nascidos prematuros de muito baixo peso. No entanto, a evolução do arsenal terapêutico, utilizando-se de técnicas cada vez mais invasivas, resultou em mecanismos de quebras de barreiras e exposição de tecidos previamente íntegros, tornando-os suscetíveis à infecção. A infecção relacionada ao cateter (IRC) é um exemplo desta realidade, ela ocorre quando há invasão da corrente sanguínea por um germe através do cateter vascular. A infecção associada ao uso de dispositivos intravasculares representa de 10 a 20% de todas as infecções relacionadas à assistência à saúde (IRAS) e é uma das causas mais frequentes de morbidade e mortalidade, representando uma fonte de bacteremia e sepse em pacientes hospitalizados, aumentando o tempo de permanência hospitalar, os custos de internação e o índice de mortalidade. Estudo brasileiro publicado recentemente utilizando a metodologia SCOPE revelou a presença do cateter venoso central como o fator de risco principal para a ocorrência de infecções da corrente sanguínea nosocomial, sendo encontrado em 70,3% dos pacientes (38). Aproximadamente 65% dessas infecções resultam da migração de micro- organismos da microbiota da pele a partir do sítio de inserção do cateter, 30% da contaminação é intraluminal e 5% por outras vias, como infusão de fluidos contaminados e focos infecciosos à distância (69). 48 Vale ressaltar que mais de 150 milhões de cateteres vasculares são utilizados anualmente em Hospitais e Clínicas nos Estados Unidos. A maioria desses dispositivos são cateteres venosos periféricos, porém um número expressivo destes, mais de 5 milhões, são cateteres venosos centrais (CVC) inseridos em vasos profundos ou centrais (70). Mais de 200.000 infecções da corrente sanguínea ocorrem nos Estados Unidos, a maioria relacionada com CVC não tunelizado. A finalidade desses cateteres é variada e envolve a administração de medicamentos, sangue e derivados, nutrição parenteral, monitoramento da condição hemodinâmica do paciente e acesso vascular para realização de hemodiálise (71). Em Unidades de Cuidados Intensivos Neonatais a taxa de infecção é inversamente proporcional ao peso de nascimento do recém-nascido variando de 9,1 por 1000 cateteres dias em crianças com peso ao nascimento <1000 g a 3,5 por 1000 cateteres dias em crianças com peso de nascimento >2500 g (69). No Brasil, a infecção da corrente sanguínea relacionada com cateter (ICSRC) é a principal infecção em UTI neonatal. Segundo dados de Pessoa-Silva et al. (72), a incidência de ICSRC variou de 17,3 /1000 CVC-dia em RN entre 1501g a 2500g até 34,9/1000 CVC-dia em RN < 1000g. A maioria das ICSRC é causada pelos Estafilococos coagulase-negativa (ECN). De acordo com dados de Perlman et al. (73), estes micro-organismos foram responsáveis por 55,5% das ICSRC em neonatos, seguido por Staphylococcus aureus (13,2%) e Enterococcus (9,2%). Os micro-organismos Gram-negativos como as enterobactérias Escherichia coli, Enterobacter, Klebsiella pneumoniae e Bacilos Gram-negativos não fermentadores, Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii foram isolados em cerca de 20,2% dessas infecções. Staphylococcus epidermidis foi isolado de cerca 49 de 39,8% das ICSRC, S. warneri (6,9%) e outras espécies de ECN (8,7%), sendo a maioria das ICSRC causada pelos micro-organismos gram-positivos (79,8%). Dados reportados pelo NHSN do CDC (39) referente ao período de janeiro de 2006 a outubro de 2007 também ranquearam os ECN em 1° na etiologia das ICSRC (34,1%) seguido por espécies de Enterococcus (16%), espécies de Candida (11,8%) e S. aureus em 4° lugar (9,9%). Os micro-organismos Gram-negativos incluindo as enterobactérias Escherichia coli, Enterobacter, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca foram responsáveis por 12,4% dessas infecções e os Bacilos Gram-negativos não fermentadores Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii por 5,3%. A patogênese dessas infecções é complexa e parcialmente conhecida, especula- se estar diretamente relacionada à aderência dos micro-organismos, que se tornam capazes de colonizar o dispositivo. Há quatro fontes potenciais para colonização do cateter e a ocorrência de ICSRC, o sitio de inserção do cateter na pele, o canhão, a via hematogênica e a contaminação do infundido. A pele é a principal fonte para colonização e infecção de cateter de curta duração. As bactérias que estão na pele do paciente migram ao longo de sua superfície, colonizando a extremidade distal, resultando em infecção (74). O canhão (hub) é outra fonte para colonização e os micro-organismos podem ser introduzidos pelas mãos da equipe de saúde, contaminando o canhão, migrando ao longo da superfície interna do cateter, podendo causar uma infecção da corrente sanguínea. Quando há uso prolongado do canhão do cateter (acima de 30 dias), pode ser esperada maior colonização da superfície interna (75). A contaminação hematogênica do CVC, a partir de um foco infeccioso à distância, como por exemplo, pneumonia, infecção gastro-intestinal, ou do trato urinário, foi 50 sugerida, mas não é uma causa importante de colonização do cateter, e raramente é comprovada (76). As soluções de nutrição parenteral e emulsões lipídicas promovem o crescimento de muitas bactérias e fungos, como Candida parapsilopsis e Malassezia furfur (77). Embora muitas epidemias de bacteremia hospitalar foram causadas pelo infundido contaminado, é muito baixa a contribuição desta fonte para as bacteremias primárias hospitalares endêmicas. Todas essas fontes de contaminação são importantes, mas nenhuma compete com a contaminação por micro-organismos do próprio paciente em áreas próximas à inserção dos cateteres. Isso explica porque os ECN são os micro-organismos frequentemente mais associados com essas infecções, já que são os mais encontrados na pele. A aderência de micro-organismos na superfície de cateter é dependente da interação de três fatores: hospedeiro, micro-organismo e o material do cateter. O hospedeiro reage contra o cateter, considerado corpo estranho, e forma ao seu redor uma cobertura de fibrina e fibronectina. Esses componentes protéicos do hospedeiro que estão recobrindo a superfície do cateter permitem a aderência de S. aureus. Esses micro-organismos são produtores de coagulase, promovendo a trombogênese, além de várias outras proteínas que estão em sua superfície denominadas MSCRAMMs (Microbial Surface Components Recognizing Adhesive Matrix Molecules), adesinas que possuem receptores para proteínas liberadas pelo hospedeiro, como fibrinogênio e fibronectina que permitem a aderência e colonização do cateter (78-79). 51 Os estafilococos coagulase-negativa podem colonizar a superfície nativa do cateter, assim como superfícies condicionadas por essas proteínas do hospedeiro. Uma vez aderidas, essas bactérias proliferam, formando múltiplas camadas e produzem um polissacarídeo extracelular, formando o biofilme, que potencializa sua patogenicidade. O biofilme não só favorece a aderência dos micro-organismos como também sua manutenção, atuando como barreira ao ataque dos antibióticos, neutrófilos, fagócitos, macrófagos e anticorpos. A concentração de antibiótico requerida para destruir bactérias em um biofilme é 100 a 1000 vezes maior do que a necessária para destruir as mesmas espécies em suspensão, dificultando o tratamento e aumentando a possibilidade de infecções recorrentes, uma vez que as bactérias ficam protegidas do sistema imune do hospedeiro (80). A Candida também figura como micro-organismo preocupante uma vez que há estudos mostrando ser responsável por cerca de 80% das infecções fúngicas no ambiente hospitalar. Em adição, algumas espécies, na presença de soluções contendo glicose, podem produzir o biofilme similar ao bacteriano, o que explica o aumento da proporção de ICSRC devido à patógenos fúngicos especialmente em pacientes recebendo nutrição parenteral (81). O terceiro fator importante para a aderência microbiana é o material do cateter. Estudos in vitro demonstram que cateteres de cloreto de polivinil ou polietileno são menos resistentes à aderência de microrganismos do que cateteres feitos de teflon, silicone ou poliuretano (82). 52 Em relação ao tempo de permanência na instituição, índice de mortalidade e custos de internação dos pacientes com ICSRC, todos esses aspectos aumentam significativamente. A ocorrência dessa infecção prolonga a internação de 6,5 a 22 dias e acrescenta um custo de U$29.000 a U$56.000 por episódio de infecção. Estima-se que pacientes nessas condições tenham uma mortalidade de 13% a 28% maior em relação a pacientes da mesma gravidade sem essa complicação (83,84). A sepse relacionada a cateter (SRC) em recém-nascidos também tem se constituído em séria complicação, pois os cateteres intravasculares são amplamente utilizados para inúmeros procedimentos em UTI neonatal, possibilitando o rápido acesso intravenoso para a administração de medicamentos e nutrição parenteral, entre outros (85). Embora a utilização de cateteres seja procedimento fundamental para a sobrevida dos RN em UTI neonatal, também atua como importante fator de risco para o desenvolvimento de infecção e contribui para o aumento da incidência de infecções da corrente sanguínea e consequente aumento nas taxas de morbidade e do tempo de hospitalização (82). Assim como nos indivíduos adultos, cerca de 60% das infecções da corrente sanguínea relacionadas com cateteres em RNs são causadas por bactérias gram- positivas, dentre as quais se destacam as espécies de estafilococos coagulase-negativa, já que são também os principais componentes da microbiota da pele e mucosas, sendo reconhecidos como os agentes etiológicos mais frequentemente envolvidos com infecções em RNs, principalmente os com muito baixo peso ao nascimento (< 1500g) (69). 53 Até pouco tempo atrás não havia consenso entre os estudiosos em relação ao diagnóstico de infecções relacionadas a cateteres. Em 2002 o CDC padronizou esses conceitos, diferenciando a colonização significativa do cateter e a sepse relacionada com cateter. De acordo com o CDC (82), na colonização significativa do cateter há uma forte correlação entre inflamação local do cateter e o isolamento de mais de 15 Unidades Formadoras de Colônias (UFC) de um micro-organismo do segmento do cateter. Por isso é frequentemente empregado o termo “infecção local” nessa eventualidade. Outros pesquisadores usam o termo “colonização” para descrever esse evento em oposição ao termo “contaminação” quando menos de 15 UFC forem isoladas. Porém uma cultura positiva de um segmento do cateter na ausência de hemocultura positiva não deve ser considerada uma bacteremia ou fungemia relacionada com o dispositivo. O termo sepse ou ICSRC é o termo empregado no caso de além de uma cultura semiquantitativa com crescimento ≥ 15 UFC ou cultura quantitativa com ≥ 1000 UFC do segmento do cateter, for isolado o mesmo micro-organismo (espécie e antibiograma) na hemocultura, além da presença de sinais clínicos de sepse (febre, hipotermia, apnéias), sem fonte aparente de infecção, exceto seu cateter. Portanto, o diagnóstico definitivo é estabelecido quando o cateter é significativamente colonizado com o mesmo micro-organismo encontrado na hemocultura (82). Vale acrescentar que a falta de padronização de critérios clínicos, diagnósticos e a diversidade de conceitos de infecção, comprometem os sistema de vigilância epidemiológica das infecções, bem como dificulta a generalização dos resultados de pesquisas realizadas. 54 Neste contexto, antes do desenvolvimento da técnica de cultura semiquantitativa, a maioria dos laboratórios de Microbiologia Clínica utilizava a cultura em caldo das pontas de cateteres, para avaliação qualitativa. Esta técnica resultava em dados poucos confiáveis e sem especificidade, não permitindo distinção entre colonização e infecção. Em estudo realizado em nosso laboratório (ANEXO 4) comparando a cultura qualitativa com a cultura semiquantitativa no diagnóstico de ICSRC em recém-nascidos da Unidade Neonatal do HC da FMB foi verificado que embora a cultura semiquantitativa tenha apresentado menor sensibilidade (90%), apresentou uma maior especificidade (71%) em comparação à sensibilidade de 100% e especificidade de 60% encontradas pela técnica qualitativa, permitindo aos autores concluir que o método de cultura semiquantitativa de cateter apresentou vantagens para o diagnóstico de ICSRC em RNs quando comparado com o método qualitativo tradicional. A confiabilidade da cultura depende da técnica empregada. A cultura semiquantitativa proposta por Maki et al. (86), que é o método de rolar o cateter em placa de ágar sangue, é o mais utilizado para determinar as taxas de infecção da corrente sanguínea relacionada ao cateter, existindo vários estudos comprovando sua importância. Em seu trabalho Maki et al. (86) demonstraram que uma cultura semiquantitativa da ponta de cateter com ≥ 15 UFC correlacionou melhor com a presença de infecção, entretanto, esses autores encontraram somente quatro casos de sepse relacionada a cateter e todos relacionados com números de micro-organismos com crescimento confluente. Analisando esses resultados os autores discutiram que o ponto de corte ≥ 15 UFC considerado resultado positivo, necessitava de outras 55 avaliações para determinação do número de UFC que melhor se correlaciona com a presença de ICSRC, sem reduzir a sensibilidade do teste. O diagnóstico de ICSRC em Unidades Neonatais tem sido realizado usando métodos que são similares aos empregados para o diagnóstico dessas infecções em pacientes adultos, conforme o critério proposto por Maki et al. (86). Neste contexto foi desenvolvido um estudo pelo nosso grupo para determinar o ponto de corte da cultura semiquantitativa que melhor correlaciona com a presença de ICSRC em recém- nascidos (ANEXO 5). Foram estudadas 85 pontas de cateteres provenientes de 63 RN, sendo que os micro-organismos isolados de cateteres e hemoculturas periféricas foram identificados e submetidos ao teste de sensibilidade às drogas pelo método de difusão da droga com disco. O ponto de corte ótimo foi determinado pela curva de operação resposta (Curva ROC) e o padrão ouro correspondeu ao diagnóstico de certeza de ICSRC, com o isolamento do mesmo micro-organismo (espécie e perfil de sensibilidade às drogas) na cultura de cateter e em hemocultura periférica, na ausência de outro foco aparente de infecção, exceto seu cateter. Dos 11 episódios de infecção diagnosticados, 8 (72,7%) foram associados aos estafilococos coagulase-negativa, dos quais 6 pertenciam a espécie S. epidermidis. Pela curva ROC, o ponto de corte ótimo para o diagnóstico de infecção relacionada a cateter foi ≥ 122 UFC, com 91,0% de sensibilidade e 81,1% de especificidade, comparado com 91,0% de sensibilidade e 71,6% de especificidade utilizando o ponto de corte ≥ 15 UFC. O ponto de corte 122 UFC revelou maior especificidade e maior VPP, sem perda da sensibilidade quando comparado com 15 UFC. 56 Em estudo realizado por Collignon et al. (87) com pacientes adultos, os autores sugerem que o melhor ponto de corte para a detecção de ICSRC é de 5 UFC, já que apresentou maiores taxas de sensibilidade (92%) e a mesma taxa de especificidade (83%) encontrada para culturas com crescimento 15 UFC. Para determinar se a cultura semiquantitativa de pontas de cateteres é útil para o diagnóstico de ICSRC, um teste com alta especificidade e valor preditivo positivo é necessário e desejado, entretanto, Collignon et al. (87) encontraram um valor preditivo positivo de apenas 8,8%, com 124 cateteres apresentando resultados falsos-positivos. Por outro lado, para o ponto de corte de 100 UFC a especificidade seria de 94%, com redução dos falsos-positivos para 46. Segundo Brun-Buisson et al. (88), os autores deveriam escolher como melhor ponto de corte o crescimento de 100 UFC, ao invés de 5 UFC, pois um teste de diagnóstico com VPP menor que 10% não pode ser considerado adequado para uso no diagnóstico clínico. Em nosso estudo apesar da maioria dos casos de ICSRC apresentarem crescimento superior a 122 UFC, foi observado um caso de ICSRC por S. aureus cuja cultura apresentou crescimento de apenas 8 UFC. Outros autores também têm verificado ICSRC e culturas semiquantitativas com crescimento <15 UFC (87). Esses resultados podem ser explicados pelo uso de antibióticos antes da cultura ou então pela contaminação intraluminal do cateter, que constitui o fator limitante da cultura semiquantitativa, a qual detecta somente os micro-organismos aderidos na superfície externa do dispositivo (89). Esta técnica é limitada principalmente em cateteres de longa permanência, nos quais a superfície interna é a fonte de colonização predominante. Essa desvantagem não é verificada nos métodos quantitativos tais 57 como o método por vórtex ou sonicação. No método por vórtex descrito por Brun- Buisson et al. (88), é feito um “flush” interno com água destilada estéril no segmento do cateter que descola micro-organismos da superfície interna, seguido por diluição seriada e a semeadura em placa de ágar sangue. O crescimento igual ou superior a 1000 UFC/ml é indicativo de ICSRC. Baseado nos aspectos descritos acima, e tendo em vista que na cultura semiquantitativa determina-se a presença de micro-organismos somente da superfície externa do cateter e na cultura quantitativa além da superfície externa isolam-se também micro-organismos presentes no seu lúmen, outro estudo, com o objetivo principal de estudar comparativamente a técnica semiquantitativa preconizada por Maki et al. (1977)(86) e a técnica quantitativa descrita por Brun-Bruisson et al. (88) está sendo desenvolvido atualmente em nosso laboratório. Uma desvantagem dessas metodologias de cultura semiquantitativa e quantitativa é a necessidade de retirada do cateter para a realização da cultura, de forma que outras metodologias de diagnóstico de ICSRC que dispensam a retirada do dispositivo devem ser consideradas. Os métodos mais promissores são aqueles que permitem a manutenção do acesso. Esta vantagem é particularmente marcante em pacientes críticos, com dificuldade de acesso, e naqueles com cateteres de longa permanência. Isso tem levado ao uso de novas técnicas para o diagnóstico de ICSRC sem remoção do cateter. Entre essas novas técnicas que sugerem infecção sem remoção do cateter está o Método Diferencial de Tempo de Positividade (DTP) com hemoculturas qualitativas coletadas do CVC e de veia periférica, utilizando monitorização contínua do crescimento de micro-organismos, onde o intervalo do 58 tempo de positividade da cultura no sangue do CVC e hemocultura periférica maior que duas horas, indica positividade de ICSRC. Basta a comparação dos registros do tempo de crescimento das hemoculturas periféricas e do cateter, quando for feito por método automatizado, se a cultura do cateter positivou duas horas ou mais antes da periférica, o exame é considerado positivo. A outra técnica é a hemocultura pareada quantitativa colhida de cateter e veia periférica, onde o crescimento de micro- organismos pelo menos cinco vezes maior no sangue colhido do cateter do que na veia periférica, indica resultado positivo (90). A técnica DTP é uma técnica mais simples que a hemocultura quantitativa e amplamente disponível já que muitos laboratórios de microbiologia clínica têm adotado o uso de sistemas automatizados no monitoramento de hemoculturas. Assim, essa técnica, pode ser utilizada para grandes estudos prospectivos clínicos, constituindo em um método fácil de ser adotado e não muito caro para o diagnóstico de ICSRC e que dispensa a remoção do cateter (91). Em trabalho realizado por Blot et al. (91), foi possível fazer o diagnóstico em 16 dos 17 pacientes que tiveram um resultado positivo da hemocultura colhida do CVC pelo menos 2 horas antes da hemocultura periférica, com 91% de sensibilidade e 94% de especificidade. Para a elucidação das ICSRC é fundamental determinar a similaridade das linhagens de micro-organismos isoladas das pontas de cateteres e das hemoculturas. Os testes bioquímicos podem determinar o gênero e a espécie do micro-organismo em questão, e o antibiograma pode determinar a similaridade das amostras isoladas de cateter e hemocultura a partir do perfil de resistência da bactéria presente nas amostras, auxiliando não só no tratamento das ICSRC, mas também no diagnóstico 59 dessas infecções (Figura 1). Em estudo comparativo entre técnicas moleculares e métodos microbiológicos na determinação das fontes de infecções nosocomiais Martín-Lozano et al. (92) avaliaram a utilidade do antibiograma para estudos epidemiológicos e concluíram que o diagnóstico da fonte de bacteremia utilizando-se de critérios clínicos convencionais e/ou microbiológicos, incluindo antibiograma, nem sempre são precisos e suficientes. Vários dos problemas são resultantes da expressão variável de características fenotípicas que são utilizadas como parâmetros. Por essas razões, significantes esforços têm sido realizados no sentido de desenvolver métodos alternativos que combinam facilidade, confiabilidade e baixo custo. Surgiram então as técnicas de tipagem molecular que podem representar um potencial discriminatório adicional, principalmente porque não dependem da expressão de genes para avaliação. Alguns desses métodos são baseados nos princípios da reação em cadeia da polimerase (PCR), tais como o RAPD-PCR (Random Amplified Polymorphic DNA Based PCR) e o REP-PCR (Repetitive Extragenic Palindromic Sequence Based PCR). O RAPD-PCR é basicamente uma variação do protocolo de PCR, com duas características distintas: utiliza um “primer” único ao invés de um par de “primers” e o primer único tem sequência arbitrária e, portanto sua sequência alvo é desconhecida (93). O REP-PCR faz uso de primers complementares àqueles de ocorrência natural, altamente conservado, com sequências repetitivas e não codificadoras (geralmente 30 a 500pb) (94). Esses métodos apresentam a vantagem de um custo mais baixo e uma relativa facilidade metodológica, quando comparada com outras técnicas. Buscando-se metodologias com especificidade e sensibilidade mais refinadas e que sejam capazes de estabelecer relações genéticas entre os isolados obtidos de 60 cateteres e hemoculturas, foi desenvolvido em nosso laboratório um estudo por Pazzini (95) que analisou por meio de técnicas de tipagem molecular o perfil genômico de micro-organismos isolados de cateteres e hemoculturas através de técnicas baseadas em PCR e comparou através do agrupamento por coeficientes de similaridade as amostras isoladas de cateteres e hemoculturas para o diagnóstico de ICSRC em recém-nascidos. Figura 1: Teste de sensibilidade às drogas antimicrobianas – técnica de disco difusão em ágar para determinação da similaridade de estafilococos coagulase- negativa isolados de cateter e hemocultura. Vancomicina (VAN), Oxacilina (OXA), Cefoxitina (CFO), Gentamicina (GEN), Rifampicina (RIF), Penicilina (PEN), Cefalotina (CFL) e Eritromicina (ERI). Foram testados primers aleatórios da Operon Technology Inc. (OPT13, OPR18, OPR13, OPK18 e OPERON21) e da Invitrogen (RAPD1, RAPD7, M13, 1026, Random D is c o s : R IF , P E N , C F L , E R I D is c o s : V A N , O X A , C F O , G E N Hemocultura Cultura quantitativa de cateter Cultura semiquantitativa de cateter 61 primer, ERIC1 e ERIC2) para padronização das reações de RAPD. Foram selecionados para o estudo os primers mais reprodutíveis, com maior capacidade de diferenciação e com bandas mais bem definidas e fortes para cada grupo de micro-organismos (Figura 2). Para a avaliação da capacidade de diferenciação dos primers, foram utilizadas linhagens de padrão internacional American Type Culture Collection (ATCC) e amostras da mesma espécie das estudadas, mas não relacionadas, como por exemplo, amostras provenientes de outro hospital. Procurou-se selecionar primers que apresentassem no mínimo seis bandas bem definidas e para melhor reprodutibilidade da técnica de RAPD-PCR foram selecionados dois primers para cada gênero ou espécie do micro- organismo estudado. Todas as 21 amostras positivas para ICSRC no teste fenotípico (mesmo perfil de sensibilidade entre os isolados de cateter e hemocultura pelo método de disco difusão) foram também positivas para ICSRC pelos métodos genotípicos. Entretanto, 10 amostras foram positivas nos testes genotípicos e negativas no teste fenotípico, sendo que dessas, 7 foram positivas na técnica de RAPD com os dois primers (RAPD 1 e M13) e na técnica de REP-PCR, e três foram positivas na técnica de RAPD com o primer RAPD 1, e somente uma com o primer M13. Não foi verificada diferença estatística significativa entre os resultados obtidos no teste de disco difusão e na técnica de RAPD com os primers estudados. Os resultados mostraram uma detecção significativa de bactérias do gênero Staphylococcus em todos os métodos utilizados para avaliação de ICSRC (p< 0,0001). Em relação às espécies de Staphylococcus, a análise dos resultados revelou uma frequência maior de S. epidermidis associada a essas infecções (p< 0,0001). 62 Segundo Tenover et al. (96), a combinação de dois ou mais métodos de tipagem proporciona maior possibilidade de discriminação dos padrões das estirpes estudadas. Neste sentido, observou-se que apesar das diferenças encontradas nas técnicas, a realização das técnicas de RAPD-PCR e de REP-PCR foi importante para a segurança na confirmação das ICSRC, além disso, devido à baixa reprodutibilidade do Dice (Opt:0.80%) (Tol 2.0%-2.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%] RAPD-PCR(Rapd1) 1 0 0 100 RAPD-PCR(Rapd1) . . . 431505 431505 H-2584 08/11/2001 08/11/2001 09/11/2001 Cateter semi Cateter quali Hemocultura S. aureus S. aureus S. aureus Dice (Opt:0.80%) (Tol 2.0%-2.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%] RAPD-PCR(Rapd1) 1 0 0 9 8 9 6 9 4 100 92.3 RAPD-PCR(Rapd1) . . . 442706 H-2212 442706 26/07/2002 01/08/2002 26/07/2002 Cateter quali Hemocultura Cateter semi S. epidermidis S. epidermidis S. epidermidis Dice (Opt:0.80%) (Tol 2.0%-2.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%] RAPD-PCR(M13) 1 0 0 9 8 9 6 9 4 100 92.3 RAPD-PCR(M13) . . . 540528 540528 H-1874 02/05/2007 02/05/2007 17/05/2007 Cateter Semi Cateter Quant Hemocultura S. epidermidis S. epidermidis S. epidermidis Dice (Opt:0.80%) (Tol 2.0%-2.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%] REP-PCR 1 0 0 9 8 9 6 9 4 9 2 94.1 90.8 REP-PCR . . . 540528 540528 H-1874 02/05/2007 02/05/2007 17/05/2007 Cateter Semi Cateter Quant Hemocultura S. epidermidis S. epidermidis S. epidermidis Figura 2: Dendogramas obtidos pela técnica de Random Amplified Polymorfic DNA Based PCR (RAPD-PCR) e Repetitive Extragenic Palindromic Sequence Based Paciente s A D E E 63 PCR (REP-PCR) em amostras de Staphylococcus spp. isoladas de cateteres e hemoculturas para determinação da similaridade. S. aureus com o primer RAPD1 (paciente A), com coeficiente de similaridade 100% e para S. epidermidis com o primer RAPD 1 (paciente D), RAPD-PCR com o primer M13 (paciente E) e REP-PCR (paciente E), com coeficiente de similaridade entre 90,8 e 94,1%. método de RAPD-PCR, a realização de duas reações RAPD-PCR com diferentes primers auxilia em atenuar esse problema. A determinação do perfil clonal das amostras de S. epidermidis isoladas de hemoculturas pela técnica de RAPD-PCR e REP-PCR demonstrou clones de S. epidermidis persistentes de 1 a 7 anos na UTI neonatal da Faculdade de Medicina de Botucatu. Todos os clusters majoritários apresentaram isolados que foram associados com ICSRC e, em algumas situações clusters menores também apresentaram isolados associados com ICSRC. Trabalhos realizados por Huebner et al.(97), Neumeister et al. (98) e Villari et al. (99) também revelaram clones persistentes de S. epidermidis em ambiente hospitalar. Villari et al. (99) sugerem que uma parcela significativa de infecções por S. epidermidis pode ser atribuída à transmissão entre pacientes e que certas cepas podem se tornar endêmicas durante longos períodos. Estes resultados confirmam a importância da infecção cruzada dos ECN na UTI Neonatal. O sucesso dos clones predominantes nestes estudos pode estar relacionado a fatores ainda não caracterizados que fornecem aos micro-organismos, vantagens na 64 colonização ou na sua capacidade de infectar pacientes, sendo que possivelmente entre esses fatores estão a formação de biofilme e a resistência a antimicrobianos. Tenover et al. (96) em estudo para comparação de métodos moleculares para a tipagem de isolados de S. aureus apresentaram alguns padrões para validade de boas técnicas moleculares, como reprodutibilidade, poder discriminatório, facilidade de uso e a facilidade de interpretação das técnicas, além de, uma intensidade maior das bandas que pode auxiliar na interpretação dos resultados (100). No nosso estudo as técnicas RAPD-PCR e REP-PCR apresentaram um bom poder discriminatório, pois diferenciaram as amostras estudadas das cepas ATCC e de isolados não relacionados com um valor de coeficiente de similaridade ≤ 70. Entretanto, o método de RAPD-PCR com os primers RAPD1 e M13 para amostras de Staphylococcus spp. apresentou melhores padrões da bandas quando comparados com o REP-PCR, facilitando assim a interpretação dos resultados. Também foi possível verificar na determinação do perfil clonal das amostras de S. epidermidis isoladas de hemoculturas um maior agrupamento dos isolados associados com ICSRC, além da maior facilidade de aplicação do método de RAPD-PCR quando comparado com método de REP-PCR. Apesar de relatos de baixa reprodutibilidade na técnica de RAPD-PCR (101) não foi verificada dificuldade referente a esse aspecto nesse estudo. As técnicas de tipagem molecular apresentaram um poder discriminatório adicional, principalmente nas infecções causadas por ECN, sendo esse resultado de grande importância, uma vez que esses micro-organismos fazem parte da microbiota normal, e o entendimento das relações entre esses micro-organismos é fundamental para a elucidação das ICSRC. 65 ANEXO 4 MARCONI C, CUNHA MLRS, LYRA JC, BENTLIN MR, BATALHA JEN, SUGIZAKI MF, RUGOLO LMSS. Comparison between qualitatitive and semiquantitative catheter-tip cultures: laboratory diagnosis of catheter-related infection in newborns. Braz J Microbiol. 2008; 39: 262-7. http://lattes.cnpq.br/2439951126870898 http://lattes.cnpq.br/4116472442821075 http://lattes.cnpq.br/2559637400719543 http://lattes.cnpq.br/1197755531108177 66 67 68 69 70 71 72 ANEXO 5 MARCONI C, CUNHA MLRS, LYRA JC, BENTLIN MR, BATALHA JEN, SUGIZAKI MF, CORRENTE JE, RUGOLO LMSS. Usefulness of catheter tip culture in the diagnosis of neonatal infections. J Pediatr (Rio J.) 2009; 85: 80-3. http://lattes.cnpq.br/2439951126870898 http://lattes.cnpq.br/4116472442821075 http://lattes.cnpq.br/2559637400719543 http://lattes.cnpq.br/7346060152836689 http://lattes.cnpq.br/2558409902235019 http://lattes.cnpq.br/1197755531108177 http://lattes.cnpq.br/1197755531108177 http://lattes.cnpq.br/1197755531108177 73 74 75 76 77 5. Identificação de Staphylococcus spp. Apesar do aumento na significância clínica de espécies de ECN, na maioria dos laboratórios de rotina, os estafilococos são identificados somente com base em aspectos morfológicos das colônias, coloração de gram, produção de catalase e coagulase, que permitem apenas a classificação de estafilococos isolados de amotras clínicas somente em S. aureus e não-S. aureus, com o último simplesmente sendo classificado como ECN. No entanto, com o aumento na ocorrência de infecções causadas por diferentes espécies de ECN, torna-se cada vez mais importante aprender mais sobre a epidemiologia, resistência aos antimicrobianos e o potencial patogênico das espécies individualmente. Isto pode ser particularmente importante em relação a isolados de hemocultura, uma vez que muitas vezes é difícil determinar a significancia clínica do ECN isolado. Kloos e Schleifer (9) delinearam uma chave a partir da qual os ECN podem ser facilmente diferenciados em espécies através de suas características bioquímicas. O esquema proposto por esses autores e modificado por Bannerman (5) é o método usado convencionalmente. No entanto, este método é relativamente trabalhoso para ser utilizado na rotina dos laboratórios de microbiologia clínica devido ao grande número de testes bioquímicos. A identificação precisa dos ECN é importante para fazer uma previsão do potencial patogênico de cada espécie e do perfil de susceptibilidade a antibióticos, permitindo assim uma conduta mais adequada na avaliação da significancia clínica de 78 cada espécie. Há divergências na literatura específica sobre o significado clínico da identificação de ECN. De acordo com os dados de alguns autores (102), esse procedimento não é clinicamente significativo, embora outros pesquisadores (56) acreditem que essa identificação seja importante na diferenciação entre contaminação e infecção. A identificação dos ECN é de grande importância para a associação de certas espécies com infecções específicas (103), tendo em vista que alguns dados sugerem que além de S. epidermidis e S. saprophyticus, que têm sido considerados patogênicos, algumas espécies como S. haemolyticus, S. lugdunensis e S. schleiferi estão mais associados às infecções do que outras espécies (104-105). Os isolados repetidos de ECN de pacientes com doenças invasivas devem ser identificados para permitir uma comparação das cepas. Em adição, a identificação de espécies é um pré- requisito antes de iniciar os procedimentos para realização de estudos epidemiológicos. O desenvolvimento de métodos para a identificação de espécies e subespécies de estafilococos permite obter informações sobre a variedade de ECN presentes em amostras clínicas e considerá-los como agentes etiológicos de processos infecciosos. Nos últimos anos, vários sistemas comerciais para a rápida identificação de estafilococos foram desenvolvidos como uma alternativa para os protocolos de identificação clássica (5). No entanto, estes sistemas de diagnóstico apresentam problemas, tais como custo e tempo de incubação, e muitas vezes fornecendo resultados não confiáveis (106-107). Além disso, muitos desses kits foram projetados para o identificação de todas as espécies conhecidas de ECN (provenientes de amostras clínicas, veterinárias, e de alimentos) e, portanto, não são muito 79 específicos. Com base nas considerações acima e tendo em vista a necessidade de métodos rápidos, simples e confiáveis, foi desenvolvido um estudo com o objetivo de comparar quatro técnicas para a identificação de ECN, ou seja, um método de referência (5, 9), o comercial API Staph miniaturizado e dois métodos modificados em nosso laboratório, além da proposição de uma chave simplificada com a finalidade de desenvolver métodos alternativos de identificação que combinam confiabilidade, simplicidade e baixo custo, especialmente para locais com recursos limitados (ANEXO 6). Dois métodos de identificação modificados em nosso laboratório foram usados (método simplificado e o método de disco). O método simplificado foi dividido em duas etapas. Durante a primeira etapa, a fermentação de xilose, sacarose, trealose, maltose e manitol, produção de hemolisina e crescimento anaeróbio em tioglicolato foram testados. Os testes utilizados na segunda etapa variaram de acordo com os resultados obtidos na primeira etapa após 72 h de incubação a 37oC. Os 100 isolados de amostras clínicas de estafilococos foram testados pelo quatro métodos propostos simultaneamente. Linhagens de referência internacionais (ATCC) de S. epidermidis, S. simulans, S. saprophyticus e S. xylosus foram corretamente identificadas pelos quatro métodos. Das linhagens de referência somente o S. warneri ATCC 10209 foi erroneamente identificado pelo sistema API Staph, com a caracterização desta estirpe como S. saprophyticus (ID% = 58,7%), como S. hominis (ID% = 19,5%), ou como S. warneri (% ID = 15,8%). O método simplificado realizado em duas etapas não diferiu do método de referência em termos de identificação de espécies de ECN. Identificação imprecisa pelo sistema API Staph foi observado para S. epidermidis (2,2%), S. warneri 80 (47,1%), S. hominis (25%) e S. haemolyticus (37,5%). A sensibilidade e especificidade do método simplificado foi de 100% para todas as espécies estudadas. O método de disco mostrou uma sensibilidade de 93,8% para o identificação de S. hominis devido à não-fermentação da sacarose no disco, levando à classificação desta estirpe como S. caprae e 100% de sensibilidade para a outras espécies, enquanto a especificidade foi de 98,8% para S. hominis, 98,9% para S. caprae, e 100% para as outras espécies. O método simplificado usando o esquema de identificação proposto levou à identificação de S. epidermidis, S. hominis, S. xylosus, S. capitis e S. simulans em uma única etapa, com um total de sete testes bioquímicos, um número inferior ao empregado no método de referência (16 testes). Desde que S. epidermidis é a espécie mais frequentemente isolada, 70 a 90% das amostras isoladas no laboratório clínico podem ser identificadas utilizando um número reduzido de testes. O método comercial API Staph kit apresentou a menor precisão na identificação de ECN entre os métodos estudados (84% de concordância), resultados concordantes com os obtidos por Bannerman et al. (108) e Renneberg et al. (109). As espécies S. warneri e S. hominis foram as mais difíceis de identificar. Bannerman et al. (108) também relataram uma menor precisão na identificação destas espécies. Em estudo de Ieven et al. (110), S. hominis foi identificado com o mínimo de precisão pelo sistema API Staph ID 32. Este achado pode ser explicado pela falta de testes complementares, como resistência a novobiocina, crescimento anaeróbio em tioglicolato e produção de hemolisina. Três (3%) das 100 cepas analisadas pela API Staph foram identificadas erroneamente como S. aureus, fato também relatado por Renneberg et al. (109). O kit demonstrou ser ineficiente nestes casos, uma vez que não solicita o resultado do teste 81 fundamental e mais amplamente aceito para a identificação de S. aureus, ou seja, o teste de coagulase (23). Em diversos laboratórios de rotina a identificação de S. saprophyticus é realizada principalmente com base na resistência a novobiocina (5µg), ausência de hemólise, e teste negativo para coagulase e/ou DNAse. Entretanto, tem sido reconhecido que outras espécies de ECN, incluindo S. cohnii, S. sciuri, S. xylosus e S. hominis subesp. novobiosepticus são também resistentes à novobiocina nessa concentração (23, 111). Esses resultados sugerem que provas adicionais, incluindo fermentação de carboidratos e outros testes, devam ser usadas em conjunto com a prova de sensibilidade à novobiocina para a correta identificação de espécies de ECN (112). Nos últimos anos, diversos sistemas comerciais para identificação de estafilococos foram desenvolvidos como uma alternativa para o protocolo de identificação clássico de Bannerman (5), que é muito trabalhoso e demorado para ser utilizado na rotina laboratorial. Os sistemas automatizados e kits comerciais, com base em testes bioquímicos miniaturizados, são amplamente utilizados atualmente, tanto em laboratórios de rotina como de pesquisa. No entanto, estes sistemas de diagnóstico apresentam problemas, tais como custo, tempo de incubação, e o mais importante, ainda não são capazes de fazer uma diferenciação confiável entre as diferentes espécies de ECN devido à expressão variável das características fenotípicas. Além disso, muitos destes sistemas automatizados e kits são baseados em resultados colorimétricos e a subjetividade na sua interpretação pode levar à ambiguidade (113). 82 Bannerman et al. (108) avaliaram a base atualizada do cartão de identificação GPI (Identificação de Gram-Positivo) usado com o sistema automatizado de identificação bacteriana Vitek I (Biomérieux) em 500 isolados clínicos. A concordância global entre o cartão GPI e os métodos convencionais foi de 89%. O cartão identificou 92% dos isolados de S. epidermidis, 95% de S. haemolyticus, 88% de S. capitis subesp. capitis e 100% de S. saprophyticus estudados. Os micro-organismos não incluídos na base de dados, como S. lugdunensis, ou foram identificados erroneamente ou não foram identificados pelo cartão GPI. Na avaliação realizada por Perl et al. (107), o cartão GPI identificou corretamente apenas 67% de 185 isolados. Esses pesquisadores ressaltaram que o baixo rendimento do cartão GPI em seu estudo pode ter sido devido à preponderância de estafilococos “não S. epidermidis” entre os 227 isolados avaliados. Outra técnica utilizada para identificação de estafilococos é a técnica da PCR que permite a identificação genotípica de várias espécies de estafilococos com alta sensibilidade e especificidade. A técnica de ITS-PCR permite a análise dos espaços intergênicos transcritos ou “intergenic transcribed spacers” (ITS) entre os loci gênicos 16S e 23S do RNAr, técnica usada frequentemente em PCR “fingerprint” para identificação e discriminação de linhagens bacterianas em nível de espécie e subespécie (114). Em gel de poliacrilamida ou agarose, as regiões amplificadas formam um padrão de bandas específico para cada espécie. Utilizando os respectivos padrões ATCC, pode-se comparar o padrão de bandas das amostras de referência com as amostras investigadas, não restando dúvidas quanto à identificação precisa das diferentes espécies de estafilococos. Esse método foi originalmente descrito por Barry 83 et al. (11