UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS – RIO CLARO unesp PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS ÁREA DE CONCENTRAÇÃO: ZOOLOGIA Energética alimentar de Gracilinanus microtarsus (Didelphimorphia: Didelphidae) DENIS CRISTIANO BRIANI Tese apresentada ao Instituto de Biociências do Câmpus de Rio Claro, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas (Área de Concentração: Zoologia). Novembro - 2006 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS – RIO CLARO unesp Tese apresentada ao Instituto de Biociências do Câmpus de Rio Claro, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas (Área de Concentração: Zoologia). PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS ÁREA DE CONCENTRAÇÃO: ZOOLOGIA Energética alimentar de Gracilinanus microtarsus (Didelphimorphia: Didelphidae) DENIS CRISTIANO BRIANI ORIENTADOR: PROF. DR. ARIOVALDO PEREIRA DA CRUZ NETO Novembro - 2006 i AGRADECIMENTOS Essa tese é fruto do profissionalismo e competência da orientação do Prof. Ariovaldo P. Cruz Neto, que depositou confiança em todos nós. Obrigado pela oportunidade durante esses quatro anos o qual pude aprender muito com você. Agradeço ao Clube Náutico Araraquara pelo apoio dado, cedendo suas áreas de Reserva Natural, assim como, toda a infraestrutura desde alojamento até alimentação. Agradeço ao Prof. Dr. Augusto Shinya Abe pelo espaço cedido no jacarezário, pelas conversas e aprendizado. E também ao amigo e técnico do Depto. de Zoologia Luiz Fernando Bonatti, pelo apoio inicial no campo. Agradeço ao Prof. Dr. Sérgio Furtado dos Reis, pela sugestão inicial do trabalho com Gracilinanus microtarsus. Sem dúvida essa tese não sairia sem a parceria e o auxilio da Luiza Duarte. Ao nosso estagiário Paul François “Franco-Paraguaio/Baiano” pelo auxílio no campo, assim como pela nossa amizade. Agradeço ao amigo Prof. Dr. Henrique Caviedes, pela amizade e pelo estágio concedido em seu laboratório da Universidade Nacional de San Luis – Argentina. Aos seus alunos e meus companheiros de laboratório Juan, Maria Eugênia, Fabrício e Verônica pelos ensinamentos, apoio e paciência em entender meu Portunhol. Aos demais companheiros e amigos da Pós-graduação da Zoologia e aos Professores meu muito obrigado por esses quatro anos. Aos meus familiares pelo apoio e incentivo durante toda minha vida acadêmica. ii Um agradecimento especial a Angela minha esposa, pelo incentivo, apoio e confiança nesses 12 anos de convivência. Agradeço ao apoio financeiro do CNPq pela bolsa concedida. A FUNDUNESP por financiar parte das análises e por fim a FAPESP (proc. 00/09968-8) pelo suporte financeiro ao projeto. E como não poderia deixar de ser, agradeço aos equipamentos da TOBEC e principalmente da SABLE por nos proporcionar longos dias de coleta e analise de dados. “estou quase convencido... de que as espécies (isso é como confessar um assassinato) não são imutáveis. Deus me livre do disparate lamarckiano... mas as conclusões a que sou levado não diferem muito das dele – embora os meios da mudança sejam inteiramente diferentes” Charles Darwin: Carta a Hooker, 11/02/1844. iii Em memória ao amigo de pós-graduação Daniel Ricardo Scheibler iv INDÍCE Página RESUMO..................... .......................................................................................1 ABSTRACT..................... ....................................................................................2 INTRODUÇÃO GERAL........................................................................................3 Referências Bibliográficas.........................................................................9 CAPÍTULO 1 – ESTIMATING LEAN AND LIPID MASS IN A MARSUPIAL: ASSESSING THE METHOD OF TOTAL BODY ELECTRICAL CONDUCTIVITY (TOBEC®)....................................…………………………………………………..13 Resumo...................................................................................................14 Abstract...................................................................................................15 1. Introduction..........................................................................................16 2. Material and Methods..........................................................................19 2.1 Measuring body electrical conductivity...................................20 2.2 Chemical Analysis..................................................................21 2.3 Generating Predictive Equations............................................22 2.4 Assessing and comparing the equations................................23 3. Results................................................................................................24 3.1 Chemically-determined Body Condition: General Patterns....24 3.2 Lean Mass Estimates.............................................................24 3.3 Lipid Mass Estimates..............................................................25 4. Discussion...........................................................................................26 5. Acknowledgments...............................................................................30 6. Literature Cited....................................................................................32 CAPÍTULO 2 – FATORES QUE AFETAM A DINÂMICA DA CONDIÇÃO CORPÓREA DE GRACILINANUS MICROTARSUS (DIDELPHIMORPHIA: DIDELPHIDAE)..................................................................................................43 Resumo...................................................................................................44 Abstract...................................................................................................45 v 1. Introdução...........................................................................................46 2. Material e Métodos..............................................................................49 2.1 Categorização da área de Estudo..........................................49 2.2. Captura dos Animais e Determinação da Condição Reprodutiva.................................................................................50 2.3 Condição Corpórea................................................................51 2.4 Disponibilidade de Recursos: Coletas de Invertebrados e Frutas...........................................................................................52 2.5 Manuseio e Análise dos Dados.............................................53 3. Resultados..........................................................................................55 3.1 Sazonalidade Climática e Disponibilidade de Recursos........55 3.2 Padrões Reprodutivos............................................................56 3.3 Variabilidade na Massa Corpórea, Massa Magra e Massa de Lipídeos........................................................................................57 4. Discussão............................................................................................59 5. Agradecimentos..................................................................................62 6. Literatura Citada..................................................................................63 CAPÍTULO 3 - VARIABILIDADE DA TAXA METABÓLICA EM GRACILINANUS MICROTARSUS (DIDELPHIMORPHIA: DIDELPHIDAE): EFEITO DA DIETA E DA CONDIÇÃO CORPÓREA...............................................................................75 Resumo...................................................................................................76 Abstract...................................................................................................77 1. Introdução...........................................................................................78 2. Material e Métodos..............................................................................81 2.1 Obtenção de dados de taxa metabólica.................................81 2.2 Determinação da condição corpórea......................................83 2.3 Analise Isotópica de Nitrogênio e Carbono da dieta..............83 2.4 Manuseio e Análise dos Dados..............................................86 2.4.1 Descrição da Dieta....................................................86 2.4.2 Padrões Metabólicos.................................................86 vi 3. Resultados..........................................................................................88 3.1 Análise da Composição Isotópica do Sangue e fatores que influenciam na Dieta................................................................................88 3.2 Variabilidade da Taxa Metabólica...........................................89 4. Discussão............................................................................................90 4.1 Dieta.......................................................................................90 4.2 Variabilidade da Taxa de Metabólica......................................91 5. Agradecimentos..................................................................................94 6. Literatura Citada..................................................................................95 CONCLUSÃO GERAL..................................................................................107 1 RESUMO O presente estudo versa sobre energética alimentar de um animal. O estudo procurou analisar, dentre outras coisas, os fatores intrínsecos e extrínsecos que respondem pela variabilidade na taxa metabólica em repouso (TMR) e a relação entre esta variação e padrões de história de vida de um marsupial (Gracilinanus microtarsus). Especificamente, a variabilidade da TMR seria determinada através de um aspecto especifico da história de vida, a dieta. Aspectos como possíveis efeitos da dinâmica de variação das reservas energéticas sobre esta relação também foram analisados. Utilizando metodologia apropriada também analisamos a variação da disponibilidade e qualidade da dieta. Variações desses fatores induzem modificações na condição corpórea e, desta forma, os efeitos desta variável sobre a TMR mediariam um dos objetivos do estudo, servindo como elemento de ligação para averiguar quais componentes da condição corpórea seriam responsáveis pela variabilidade na TMR. Palavras-Chave: energética, dieta, condição corpórea, taxa metabólica em repouso, Gracilinanus microtarsus, marsupial. 2 ABSTRACT The present study turns about energetics to feed of an animal. The study analyzed, among other things, the intrinsic and extrinsic factors that answer for the variability in the resting metabolic rate (RMR) and the relationship between this variation and patterns of life history of a marsupial (Gracilinanus microtarsus). Specifically, the variability of RMR would be determined through an aspect specify of the life history, the diet. Aspects as possible effects of the dynamics of variation of the energy budge about this relationship were also analyzed. Using appropriate methodology also analyzed the variation of the availability and quality of the diet. Variations of those factors induce modifications in the body condition and, this way, the effects of this variable on RMR would mediate one of the objectives of the study, serving as connection element to discover which components of the body condition would be responsible for the variability in RMR. Key words: energetic, diet, condition, resting metabolic rate, Gracilinanus microtarsus, marsupial. 3 INTRODUÇÃO GERAL Padrões de história de vida são considerados como um conjunto de adaptações morfológicas, fisiológicas e comportamentais que, de forma direta ou indireta, influenciam a sobrevivência e o sucesso reprodutivo e, em última análise, determinam a aptidão darwiniana das espécies (RICKLEFS, 1991; ROFF, 2002). Análises comparativas dos padrões de história de vida em endotérmicos (aves e mamíferos) revelam que as estratégias apresentadas situam-se dentro de um contínuo ao longo de um único eixo (“slow-fast continuum” – STEARNS, 1992; ROFF, 2002). Um dos aspectos mais marcantes que emerge destas análises é a noção de uma quase ausência de estratégias intermediárias entre os dois extremos do contínuo (RICKLEFS AND WIKELSKI, 2002). Esta observação sugere a existência de empecilhos evolutivos para a diversificação das estratégias de história de vida, sendo que fatores fisiológicos como metabolismo, nutrição e relações térmicas podem desempenhar um importante papel neste contexto (RICKLEFS AND WIKELSKI, 2002). Diversos estudos têm demonstrado que fatores fisiológicos, notadamente aqueles associados aos padrões energéticos, são evolutivamente correlacionados com a estratégia de história de vida (PARTRIDGE AND HARVEY, 1988; PROMISLOW AND HARVEY, 1991; RICKLEFS, 1991; RICKLEFS AND WIKELSKI, 2002; CRUZ-NETO AND JONES, 2003). A importância de considerações energéticas pode ainda ser verificada pela observação de que grande parte da teoria ecológica está voltada para a 4 compreensão e explicação das interações entre a energética e estratégias de história de vida (MCNAB, 2002). Por exemplo, estudos conduzidos por LOVEGROVE (2000, 2001, 2003) têm demonstrado que, para mamíferos em geral, há a existência de um contínuo metabólico que se correlaciona evolutivamente, em aspectos gerais, ao contínuo observado para as estratégias de história de vida. Em conseqüência, estes estudos demonstram que a verificação dos processos que culminaram na evolução da variabilidade de estratégias metabólicas é um pré-requisito para compreender a evolução da diversidade de estratégias de história de vida (LOVEGROVE, 2003). Dentre as várias medidas dos padrões energéticos de animais endotérmicos, a taxa metabólica basal (TMB) é a medida mais bem documentada (e.g. BLAXTER, 1989; TIELEMAN AND WILLIANS, 2000; MCNAB, 2002; WHITE AND SEYMOUR, 2003; WITHERS, et al., 2006). Operacionalmente, a TMB é definida como sendo a quantidade mínima de energia necessária para manter a homeostase em animais normotérmicos na ausência de atividade externa, em animais adultos, não-reprodutivos, inativos e dentro da zona da neutralidade térmica (KLEIBER, 1961; MCNAB, 1992, 1997, 2002). Apesar de existirem algumas controvérsias acerca da abrangência desta definição (e.g. CRUZ-NETO, et al., 2003, CRUZ-NETO AND BOZINOVIC, 2004), a TMB vem sendo utilizada para predizer ou ser correlacionada com diversos processos biológicos intimamente relacionados com os padrões de história de vida (e.g. KOZLOWSKI AND WEINER, 1997; MCNAB, 2002; LOVEGROVE, 2003). Uma das criticas que se faz aos critérios para se definir TMB, é que raramente tais condições se dêem simultaneamente (CRUZ-NETO, et al. 2003). Alguns animais são praticamente impossíveis de se medir em repouso ou em condições pós-absortivas (e.g. SPEAKMAN, 2000; MCNAB, 2002). Para algumas pequenas aves e morcegos, o estado pós-absortivo pode implicar em uma redução da temperatura corpórea tendo como conseqüência mudanças na TMB (e.g. MORRIS, et al., 1994; LOPEZ-CALLEJA AND FERNÁNDEZ, 2003). Em outro extremo os grandes ruminantes produzem calor como produto da fermentação digestiva, o qual tem influência direta na TMB (MCNAB, 2002). 5 Desta forma, esses animais se encontram em condições de metabolismo mínimo, por definição não se ajustam aos requisitos da TMB. Nestas situações sugere-se adotar o protocolo proposto por THOMPSON (1992), o qual utiliza o termo taxa metabólica em repouso (TMR), para medidas feitas sobre condições que violem um ou mais dos critérios usados para se definir TMB (SPEAKMAN et al., 2003, 2004). Em nosso estudo utilizamos o termo TMR, pois incluímos em nossas analises animais reprodutivos, violando assim umas das premissas acima. O presente estudo versa sobre energética alimentar de um animal, mais especificamente sobre o significado funcional e as bases estruturais do metabolismo em uma espécie de marsupial. O estudo procurou analisar, dentre outras coisas, os fatores extrínsecos e intrínsecos que respondem pela variabilidade na taxa metabólica em repouso (TMR), e a relação entre esta variabilidade e padrões de história de vida (ver CRUZ-NETO et al., 2003; CRUZ-NETO AND JONES, 2004). Dentro deste objetivo amplo, e com base no contexto apresentado acima, o projeto em tela teve como objetivo central determinar o significado funcional da TMR. Especificamente, o significado funcional seria determinado cotejando a variabilidade na TMR com um aspecto específico da história de vida, a dieta. Como será explorada abaixo, a dieta pode influenciar de forma direta ou indireta o metabolismo (CRUZ-NETO AND BOZINOVIC, 2004). Tal influência depende da maneira como os animais lidam com as flutuações na qualidade e disponibilidade de alimento, e potencialmente, estaria correlacionada com os demais aspectos da história de vida, como por exemplo, condição corpórea. A decisão de se trabalhar com uma espécie de marsupial é basicamente em função de evidências que sugerem um certo conservantismo nas estratégias de história de vida de marsupiais que podem ter relação com a suposta redução no metabolismo basal destas espécies quando comparada a mamíferos eutérios (McNAB, 2002, 2005; WITHERS et al., 2006). Os dados apresentados formam um quadro abrangente da variabilidade da TMR, das bases estruturais desta variabilidade, e sua relação com a dieta. 6 No tocante a variabilidade da taxa metabólica, especialmente em mamíferos, é explicada principalmente por diferenças na massa e temperatura corpórea que podem responder por cerca de 90% desta variação (MCNAB, 2002, 2005; WITHE AND SEYMOUR, 2003; MUÑOZ-GARCIA AND WILLIANS, 2005). Por outro lado, quando os efeitos desses fatores, são controlados, ainda observa-se uma variação residual (LOVEGROVE, 2000; TILEMAN AND WILLIANS, 2000; WHITE AND SEYMOUR, 2003, WITHERS et al., 2006). Essa variação residual vem sendo discutida basicamente por dois grupos de hipóteses. A primeira atribui a variabilidade residual a fatores filogenéticos (e.g. HAYSSEN AND LACY, 1985; ELGAR AND HARVEY, 1987; BENNETT AND HARVEY, 1987; WITHERS et al., 2006), ao passo que a segunda a associa a fatores ecológicos, principalmente a dieta e fatores climáticos, independentes da filogenia (MCNAB, 2002, 2005; LOVEGROVE, 2003). Quanto ao hábito alimentar animais que apresentam uma dieta facilmente digerida, livre de agentes químicos e/ou que estariam disponíveis ao longo do ano estão associadas a altas TMB (McNAB, 1986, 1992, 2002). Esta associação pressupõe evolução correlativa entre dieta e TMB. Todavia, a nível próximo (ecológico), existem algumas maneiras de um organismo lidar com uma queda na qualidade de seu recurso (e.g. CRUZ-NETO AND BOZINOVIC, 2004). Em marsupiais, por exemplo, a variação na TMB está relacionada principalmente a variações na massa corpórea, tendo o hábito alimentar como um os fatores responsáveis pela variação residual (McNAB, 1980a, 1980b, 1983, 1986a, 2002, 2005). Por sua vez, a dieta pode ser dividida em dois grupos quanto a sua influência na TMB: aqueles que tendem a uma alta TMB e aqueles com tendência a uma baixa TMB (McNAB, 1986a). Marsupiais com dieta especializada em invertebrados, frutos ou folhas apresentam uma baixa TMB, por outro lado, espécies com uma dieta a base de vertebrados ou plantas herbáceas apresentam maior TMB (McNAB, 1978; McNAB, 1986b; BOZINOVIC, et al. 2005). Nenhum dos estudos mencionados acima que procuraram verificar a relação entre dieta e padrões metabólicos quantificaram os possíveis efeitos da 7 dinâmica de variação das reservas energéticas sobre esta relação. Portanto a possibilidade de que ao menos uma parte da diferença observada nestes estudos tenham sido ocasionados por diferenças na dinâmica de utilização das reservas energéticas ainda é uma questão em aberto. Pelo exposto, mudanças na qualidade e disponibilidade da dieta poderiam induzir modificações na condição corpórea e, desta forma, a análise dos efeitos desta variável sobre a TMR mediaria um dos objetivos do projeto, servindo como elemento de ligação para averiguar as bases estruturais responsáveis pela variabilidade na TMR. A massa corpórea de um animal não é constante ao longo do tempo, apresentando variações diárias e sazonais (e.g. SPEAKMAN, 1996). Portanto, não causa surpresa a constatação de que a relação alométrica entre TMB e massa corpórea em um contexto intraespecífico seja pouco visível, o que sugere que a variabilidade na TMB não pode ser simplesmente explicada como sendo uma conseqüência da variação na massa total de um organismo (KOZLOWSKI AND WEINER, 1997). Como a principal causa da variação na massa corpórea entre indivíduos adultos e não-reprodutivos de uma mesma espécie está associada á dinâmica da composição corpórea (taxas de deposição e utilização das reservas energéticas - e.g. POND, 1978), estudos sobre a relação entre estas variações e os padrões metabólicos poderiam ser úteis para se analisar as bases estruturais responsáveis pela variabilidade na TMR (e.g. EARLE AND LAVIGNE, 1990; SCOTT et al., 1996; BURNESS et al., 1998). Neste contexto o Capitulo 2 nos deu subsídios para que pudéssemos verificar possíveis alterações na condição corpórea em função de fatores como época do ano, período reprodutivo, disponibilidade de recursos. Posteriormente testando os efeitos da variabilidade da condição corpórea sobre o padrão metabólico de G. microtarus (Capítulo 3). O capitulo 1 versa sobre a validação do método utilizado para estimar a condição corpórea, conhecido como método para analise de condutividade elétrica corpórea “TOBEC”. Apesar de ser considerado um método não- invasivo, TOBEC requer validação contra dados químicos, e esta validação é espécie-específica. Procuramos validar o método para estimar dois 8 compartimentos da condição corpórea, massa magra e massa de lipídeos, para G. microtarsus. Procuramos também testar a precisão e acuracidade dos diversos modelos de regressão propostos para a validação do método. Após a validação do método, descrevemos no capitulo 2 a dinâmica anual da condição corpórea através de seus dois compartimentos (massa magra e massa de lipídeos). Possíveis efeitos de fatores como sexo, condição reprodutiva, época do ano e disponibilidade de recursos (biomassa de frutas e invertebrados), foram testadas através do Modelo Linear Geral. Pelo exposto no neste capitulo, modificações em função de sazonalidade ambiental da dieta poderiam induzir modificações na condição corpórea, e desta forma, o objetivo do Capitulo 3 mediaria a análise dos efeitos desta variável sobre a TMR. Neste capitulo pretendeu-se verificar a variabilidade da TMR em função de variações na condição corpórea e na dieta de G. microtarsus. A associação da massa corpórea e dieta com TMR podem revelar as causas envolvidas na magnitude e variabilidade da TMR, desta forma, uma análise sobre o significado funcional da condição corpórea requer identificar os prováveis efeitos destas variações sobre o orçamento energético da espécie sob condições naturais (McNAB, 1997; SPEAKMAN, 2000). 9 Literatura Citada BENNETT, A. F. AND RUBEN, J. A. 1979. Endothermy and activity in vertebrates. Science, 206:649-654. BLAXTER, H. 1989. Energy Metabolism in Animals an Man. Cambridge University Press, Cambridge. BOZINOVIC, F., RUIZ, G., CORTEZ, A. AND ROSENMANN, M. 2005. Energetic, thermoreguation and torpor in the Chilean mouse-opossum Thylamys elegans (Didelphidae). Revista Chilena de História Natural. 78. BURNESS, G.P., YDENBERG, R.C. AND HOCHACHKA. 1998. Interindividual variability in body composition and resting oxygen consumption in breeding tree-swallows, Tachycineta bicolor. Physiol. Zool. 71: 247-256. CRUZ-NETO, A.P. AND BOZINOVIC, F. 2004. The relationship between diet quality and basal metabolic rate in endotherms: insights from intraespecif analysis. Physiological and biochemical zoology. 77(6): 877:889. CRUZ-NETO, A. P., D. C. BRIANI AND F. BOZINOVIC. 2003. La tasa metabólica basal: ¿una variable unificadora en energética animal? En: Fisiología Ecológica & Evolutiva: Teoria y Casos de Estudio. (F. BOZINOVIC, EDITOR). Editora da Universidad Católica de Chile. CRUZ-NETO, A. P. AND JONES, K. 2003. The evolution of basal metabolic rate in bats In: ZUBAID, A. MCCRACKEN, G.F. & KUNZ, T.H. (eds). Functional and evolutionary ecology of bats. Oxford University Press. EARLE, M. AND LAVIGNE, D.M. 1990. Intraespecific variation in body size, metabolic rate and reproduction of deer mice (Peromyscus maniculatus). Can. J. Zool. 68: 381-388. ELGAR, M.A., AND HARVEY, P. H. 1987. Basal metabolic rates in mammals: allometry, phylogeny and ecology. Functional Ecology, 1: 25-36. 10 HAYSSEN, V., AND LACY, R. C. 1995. Basal metabolic rate in mammals: taxonomic differences in the allometry of BMR and body mass. Comparative Biochemistry and Physiology, 81A: 741-754. KLEIBER, M. 1961. The fire of life: Na Introduction to animal anergetics. Wiley & Sons. New York. KOZLOWSKI, J. AND WEINER, J. 1997 Interspecific allometries are by-products of body size optimization. The American Naturalist. 149:352-380. LÓPEZ-CALLEJA, M. V. AND FERNÁNDEZ, M. J. 2003. El tiempo y la regulatición del presupuesto e energia: el caso de los picaflores. En: Fisiología Ecológica & Evolutiva: Teoria y Casos de Estudio. (F. BOZINOVIC, EDITOR). Editora da Universidad Católica de Chile. LOVEGROVE, B. G. 2000. The zoogeography of mammalian basal metabolic rate. The American Naturalist. 156: 201-219. LOVEGROVE, B. G. 2001. The evolution of body armor in mammals: Plantigrade constraints of large body size. American Naturalist, 55: 1464-1473. LOVEGROVE, B. G. 2003. The influence of climate on the basal metabolic rate of small mammals: a slow-fast metabolic continuum. J.comp Physiol B. 173:87- 112. MCNAB, B. K. 1978. The comparative energetics of Neotropical marsupials. Journal of Comparative Physiology. 125: 115-128. MCNAB, B. K. 1980. Food habits, energetics, and the populations biology of mammals. The American Naturalist. (A). 116:106-124. MCNAB, B. K. 1980. On estimating thermal conductance in endotherms. Physiol. Zool. (B). 53:145-156. MCNAB, B. K. 1983. Energetic, body size, and the limits to endothermy. J. Zool. Lond., 199:1-19. MCNAB, B. K. 1986. Food habits, energetics, and the reproduction of marsupials. J. Zool. Lond (A) 208: 595-614. 11 MCNAB, B. K. 1986. On estimating thermal conductance in endothermy. J. Zool. Lond., (B). 199: 1-19. MCNAB, B. K. 1992. Energy expenditure: a short history. Pp 1-15 in T. E. Tomasi & T.H. Horton (eds), Mammalian Energetics: Interdiscplinary Views of Metabolism and Reproduction, Cornell Universyity Press, Cornell. MCNAB, B. K. 1997. On the utility of uniformity in the definition of basal rate of metabolism. Physiol. Zool. 70: 718-720. MCNAB, B. K. 2002. The Physiological ecology of vertebrates: A view from energetics. Cornell University Press, Ithaca. McNab, B. K. 2005. Uniformity in the basal metabolic rate of marsupials: its causes and consequences.Revista Chilena de Historia Natural. 78: 183-198. MORRIS, S., CURTIN, A. L. AND THOMPSON, M. B. 1994. Heterothermy, torpor, respiratory gas exchange, water balance an the effect of feeding in Goul´s long-eared bat Nyctophilus gouldi. Journal of Experimental Biology. 197309- 335. MUÑOZ-GARCIA A. AND WILLIAMS, J. B. 2005. Basal Metabolic rate in Carnivores is associated with diet after controlling for phylogeny. Physiological and Biochemical Zoology. 78(6):1039-1056. PARTRIDGE, L AND HARVEY, P. H. 1988. The ecological context of life history evolution. Science. 241: 1449-1455. PROMISLOW, D. E. L. AND Harvey, P. H. 1991. Mortality rates and the evolution of mammal life histories. Acta Oecologia. 12: 119-137 RICKLEFS, R. E. 1991. Structures and transformations of life histories. Func. Ecol. 5: 174-183. RICKLEFS, R. E. AND WIKELSKI, M. 2002. The physiology/life history nexus. Trends in Ecology & Evolution. 17: 462-468. ROFF, D. A. 2002. Life history evolution, Sinauer Associates. 12 SCOTT, I, SELMAN, C., MITCHELL, P. I. AND EVANS, P. R. 2001. The use of total body electrical conductivity (TOBEC) to determine body composition in vertebrates. In: SPEAKMAN, J.R. ed.). Body Composition Analysis of Animals. A Handbook of non-Destructive Methods. 242 p. SPEAKMAN, J. R. 1996. Energetics and the evolution of body size in small terrestrial mammals. Symp. Zool. Soc. Lond. 69: 63-81. SPEAKMAN, J. R. 2000. The cost of living: field metabolic rates of small mammals. Adv. Ecol. Res. v. 30: 178-297. SPEAKMAN, J. R., ERGON, T., CAVANAGH, K., REID, K., SCANTLEBURY, D. M. AND LAMBIN, X. 2003. Resting and daily energy expenditures of free-living fiel voles are positively correlated but reflect extrinsic rather than intrinsic effects. Proc Natl Acad Sci. 100:14057-14062. SPEAKMAN, J. R., KRÓL, E. AND JOHNSON, M. S. 2004. The functional significance of individual variation in basal meabolic rate. Physiol Biochem Zool. 77:900- 915. STEARNS, S. C. 1992. The Evolution of Life Histories. Oxford University Press. THOMPSON, S. D. 1992. Gestation and Lactation in small mammals: Basal Metabolic Rate and the Limits of Energy Use. In: T. E. TOMASI, T. H. HORTON (eds) Mammalian Energetics, Ithaca, N.Y., Cornell University Press. TIELEMAN B. I. AND WILLIANS J. B. 2000. The adjustments of avian metabolic rates and water fluxes to desert environments. Physiological and Biochemical Zoology. 73:461-479. WHITE, C. R. AND SEYMOUR, R. S. 2003. Mammalian basal metabolic rate is proportional to body mass2/3. Proc. Natl Acad Sci. 100:4046-4049. WITHERS, P. C., COOPER, C. E. AND LARCOMBE, A. N. 2006. Environmental Correlates of Physiological Variables in Marsupials. Physiological and Biochemical Zoology. 79: 437–453. 13 CAPÍTULO 1 ESTIMATING LEAN AND LIPID MASS IN A MARSUPIAL: ASSESSING THE METHOD OF TOTAL BODY ELECTRICAL CONDUCTIVITY (TOBEC®). 14 Resumo A condição corpórea de um animal esta associada ao seu estado energético e, portanto, fornecem uma medida indireta da aptidão. Métodos químicos para quantificar a composição corpórea são mais precisos, mas tem o inconveniente de serem destrutivos. Como forma de contornar estes problemas diversas metodologias indiretas foram desenvolvidas, sendo o uso da condutividade elétrica corpórea total (TOBEC) uma das mais utilizadas. Apesar de ser considerado um método não-invasivo, TOBEC requer validação contra dados químicos, e esta validação é espécie-específica. No presente trabalho, procuramos validar o método TOBEC para estimar dois compartimentos da condição corpórea, massa magra e lipídeos, para o marsupial Gracilinaus microtarsus. Procuramos também testar a precisão e acuracidade dos diversos modelos de regressão propostos para a validação do método. Apesar do método TOBEC ter sido adequado para estimar a massa magra de G. microtarsus, sua eficiência é maior quando utilizado em conjunto com outras medidas biométricas para corrigir eventuais diferenças interindividuais na massa corpórea ou na massa magra. Portanto, não encontramos justificativa para o uso do chamado modelo clássico para estimar a massa magra com o método TOBEC. Não encontramos diferença entre os chamados modelos de dois estágios ou modelos diretos e inversos para estimar a massa de lipídeos Todavia, a capacidade do método, independentemente do modelo utilizado, mostrou-se aquém da desejada para estimar a quantidade de lipídeos. Portanto, a baixa capacidade do método não reflete qual o tipo de modelo utilizado, mas sim as condições intrínsecas de reserva de gordura do que ao método propriamente dito. Palavras-Chave : EM-SCAN TOBEC®, condição corpórea, massa magra, massa de lipideos, marsupial, Gracilinanus microtarsus 15 Abstract Body condition refers to some attributes of an animal that reflects its well-being and which, directly or indirectly, ultimately contribute to its fitness. The most accurate and precise way to estimate body condition is by chemical analysis, but this method has several drawnbacks. To minimize such drawbacks, several indirect models have been proposed, and indirect estimates of body condition by quantification of the body electrical conductivity has witnessed a growing usage. In the present work, we empirically validate the TOBEC® method to estimate the body condition of the marsupial Gracilinanus microtarsus. The second aim of our study was to test assumptions regarding the best way to formulate predictive models to estimate body condition from TOBEC® measurements. The TOBEC® method was precise and accurate enough to estimate lean mass for G. microtarsus, and its efficiency was improved when used in conjunction with other morphometric measurements. In this case, E- index seems to be more suitable to correct for eventual interindividual differences in Mb or in LMb rather than a predictive factor on its own. Thus, we did not find justification to the “classical” approach used to estimate lean mass with this method. We did not find any difference between the two-stage and the direct models to estimate lipid mass. It seems that the low ability of the TOBEC® method in estimate lipid mass did not reflected the type of the model used but, rather, the inefficiency of the method when applied to animals that do not accumulate proportionally higher amount of fat. Key words: EM-SCAN TOBEC®, body condition, lean mass, fat mass, marsupial, Gracilinanus microtarsus 16 1. Introduction Body condition refers to some attributes of an animal that reflects its well- being and which, directly or indirectly, ultimately contribute to its fitness. Often, body condition is associated with an organism’ energetic state, so that estimates of lipid mass is assumed to provide an accurate measurement of body condition (POND, 1978; WOLLNOUGH, et al. 1997; SCHULTE- HOSTEEDE et al. 2001; 2005). Analysis of the dynamics of the variation in body condition has provided powerful insights for elucidating several aspects of the ecology and physiology of different vertebrate species (e.g. BACHMAN, 1994; KARASOV AND PINSHOW, 1998; BACHMAN AND WIDEMO, 1999; SCHULTE-HOSTEDDE et al. 2001; PANGLE AND SUTTON 2005; PIERCE et al., 2005). Even though the energy densities of hydrated lean body tissue is nearly 10 times lower than the energy of fat tissue (BINTZ, 1985), the energy conveyed by the lean tissue can also, under some circumstances, be an important source of energy (ROBBINS, 1993; BACHMAN, 1994). Thus, an accurate estimate of body condition requires the estimate of both lean and lipid mass. In this context, the definition of body condition overlaps with that of body composition, in the sense that both pertain to the variation of the body protein, carbohydrates, lipids and water of an organism (ROBBINS, 1993; WOLLNOUGH et al., 1997). The most accurate and precise way to estimate body condition is by chemical analysis of the homogenized carcass (REYNOLDS AND KUNZ, 2001). 17 Besides the inherent problems associated with adequate sample size and/or ethical considerations, this purely invasive method does not allow for temporal resolution. An indirect estimate of body condition, thus, offers an alternative approach for chemical analysis. The use of morphometric indexes is though to be a convenient way to overcome these problems. Albeit such approach allows for longitudinal measurements, its precision and accuracy seems to depend upon the underlay statistical methods used to generate the models. Besides, this approach rests on the often-untested assumption that the variability in the morphometric indexes parallels the variability in body condition (e.g. HAYES AND SHONKWILLER, 2001; GREEN, 2001; SCHULTE-HOSTEDDE et al. 2001; 2005). Indirect estimates of body condition by quantification of the body electrical conductivity has witnessed a growing use in the past decades. This method relies on the fact that the conductivity of a living organism is mainly determined by its lean mass, which contains most of the electrolytes, and that the conductivity of the lipid mass is only 5% of that observed for lean mass (VAN LOAN AND MAYCLIN, 1987; SCOTT, et al. 2001). Hence, if one assumes a two-compartmental model, the lipid mass can be simply estimated by the difference between total fresh body mass and the lean mass estimated by the electrical conductivity (SCOTT et al., 2001). Two main methods have been used to assess body condition through electrical conductivity: body impedance analysis (BIA – LICHTENBELT, 2001) and the method of total body electrical conductivity (TOBEC® – SCOTT et al., 2001). The use of BIA with small mammals and birds is still incipient (LICHTENBELT, 2001; KARASOV AND PINSHOW, 1998; WIRSING et al., 2002; WOOLNOUGH et al., 1997). On the other hand, TOBEC® has been widely used to estimate body condition in small mammals and birds (SCOTT et al., 2001 and references therein; UNANGST AND WUNDER, 2002; WIRSING et al. 2002) and, compared with BIA, it has produced results fairly similar in terms of precision and accuracy (KARASOV AND PINSHOW, 1998; WIRSING et al. 2002). The utility of TOBEC® depends, among other factors, on the tridimensional distribution of the lean mass within the body (SCOTT et al. 2001). 18 This means that the validation of the method for a given species does not have applicability for other species, even when they have the same geometry (SKAGEN et al., 1993; UNANGST AND WUNDER, 2001). Thus, the first objective of this study is to empirically validate the use of TOBEC® method to estimate body condition in Gracilinanus microtarsus, a marsupial species from South America. WOLLNOUGH et al. (1997) used BIA to estimate body water in the Australian marsupial Lasiorhinus latifrons, which was validated against the isotopic dilution method to estimate lipid mass PARKER AND KROCKENBERGER (2002) used TOBEC® and the isotopic dilution method to validate the use of total body water to estimate lipid mass in another Australian marsupial (Isoodon macrourus). Hence, our study is the first to be carried out to estimate body condition in a New-World marsupial and also the first where the TOBEC® method was directly used to estimate lean and lipid mass in a marsupial. The second aim of our study was to test assumptions regarding the best way to formulate predictive models to estimate body condition from TOBEC® measurements. The most widely used approach to validate the TOBEC® method involves the use of ordinary least square equations (OLS) to relate the chemically-determined lean mass with the variation in the electrical conductivity and, latter, the validation of the resultant equation in an independent sample or through cross-validation methods (SCOTT et al., 2001 and references therein). However, considerable debate still exists as to which variable should be used as the independent ones in such predictive equations (SCOTT et al., 2001). Besides this controversy, the use of direct or inverse equations and the two- stage model to estimate lipid mass has produced conflicting results (SKAGEN et al. 1993; CONWAY et al., 1994; BURGER, 1997; SCOTT et al., 2001; VOLTURA AND WUNDER 1998; UNANGST AND WUNDER, 2001; 2002). Few studies that attempted to validate the TOBEC® method compared the accuracy and precision of the predictive equations as function of the assumption about the variables and the impact of this assumptions on the resultant estimate of lipid mass (SKAGEN et al., 1993; BURGER, 1997). Notwithstanding the species-specific nature of the validation of the TOBEC® method (UNANGST 19 AND WUNDER, 2001), we believe that such comparisons are worth in that they may provide useful recommendations for another validation studies. Furthermore, we believe that such comparisons may help in the search for the mostly accurate and precise equations to predict body condition within a temporal scale. Thus, in order to test for the accuracy and precision of the models, we carried out paired comparisons between the absolute and relative errors associated with the direct, inverse models to estimate lean mass and direct, inverse and two-stage model to estimate lipid mass with the TOBEC® method. 2. Material and Methods Adult, non-reproductive females (n = 7) and males (n = 10) of G. microtarsus were collected with Sherman traps between February and July 2004 in a savana-like vegetation (locally know as Cerradão) in the municipiality of Américo Brasiliense, São Paulo State, southeastern Brazil (21o43’33’’S and 48o 01’07’’W). In order to avoid the potential effects of capture (stress, changes in body water, etc), and of the stomach content on the conductivity readings (VOLTURA AND WUNDER, 1998; SCOTT et al., 2001), animals were kept in individual cages for one day before the measurements, when they were feed with artificial diets (Purina, < 5% crude fiber), and had ad libitum access to water. Cages were kept at room temperature (between 25 – 28°C). Experiments were carried out at the same period of the day (between 16:00-18:00 hours) out in animals food-deprived for 12 hours, within temperature similar to those used for maintenance. This work was carried out under permission issued by the “Instituto Brasileiro de Meio Ambiente”, Brazil (IBAMA (64/2003-CGF AU/LIC – proc. 02001.007176/03-69) and all procedures conformed to guidelines of the American Society of Mammalogists (Animal Care and Use Committee 1998). 20 2.1 Measuring body electrical conductivity All measurements of body electrical conductivity were carried out in an EM-SCAN® Small Animal Body Composition Analyser model SA-3057. Initially we attempted to use the smallest detection chamber (model SA-3044). However, we found that the background levels of this chamber consistently remained outside the factory-specified levels, even after warm-up times in excess of 3 hours. Thus, we decided to use the largest chamber available, which attained stability after a warm-up time of less than an hour. In principle, the most precise readings are obtained in chamber with the smallest possible internal diameter. However, VOLTURA AND WUNDER (1998) found that the predictive error associated with a detection chamber (model SA-3044) was higher than the predictive error associated with the use of a larger detection chamber (model SA-2) for praire voles (Microtus ochrogaster). Thus, we assumed that the use a larger detection chamber in our study did not affect the accuracy of our readings. We warmed-up the instrument for at least 3 hours before the onset of conductivity measurements (hereafter referred to as E-index, the output of the EM-SCAN®). After, we placed each individual into the holding acrylic device supplied by the factory, and constancy of position was assured by restraining the unanesthetized animal with nylon mesh stock secured to the holding device by Velcro fastenings. The holding device were then fully inserted into the detection chamber, with the closed part facing up, and with the belly snugly pressed against the wall of the chamber. The holding device were inserted and positioned in the center of the detection chamber until a stable reading was obtained (usually less than 10 seconds). Then, the holding device was removed and re-inserted, a new reading was taken, and the protocol repeated 5 times. This procedure was repeated for all measurements in all individuals and took less than 5 minutes. The E-index obtained in such runs were then averaged and used for subsequent analysis. Mean coefficient of variation (CV) calculated from the mean and standard deviations of these individuals successive readings gave a value of 0.57 ± 0.11% (0 – 1.86%). Prior to the measurements, the equipment were calibrated by inserting a phantom tube with a know 21 electromagnetic field (E-index = 400). The reference phantom was inserted 3 times. Average readings were equal to 404.7 ± 1.91 (range: 395.3 – 414.8; CV = 1.94%), well within the confidence limits determined by the manufacturer. Body mass were measured also prior and after the readings with an electronic balance (precision of ± 0.01g) and a mean value were used for latter calculations. Although body temperature was not measured, we did not observed any sign of torpor after the end of the experiments. Finally, chemically determination of body water content (see Table 1) revealed that all animals were in a good hydration state. 2.2 Chemical Analysis Immediately after the last reading, animals were killed by a ketamine overdose and carcass was frozen in liquid N2 until they were homogenized in the laboratory (usually 3-5 days latter). Homogenization was accomplished by grinding the carcass in an industrial blender several times. During the homogenization procedure, no organs were removed and we found that all the stomachs were emptied. The resultant frozen homogenate was sent by contract to the Animal Nutrition Laboratory of The Federal University of Ponta Grossa (Paraná State) where they were dried in an oven at 50°C until constant weight. Fat content was extracted by the Soxhelt method, following standard procedures (see details in REYNOLDS AND KUNZ, 2001), usually in triplicates. We used a two-compartment model to chemically assess the body composition (REYNOLDS AND KUNZ, 2001). Water content was determined as the difference between fresh dead mass and the dry mass. Fat mass was equal to the extracted fat, and lean mass is the difference between dead fresh body mass and fat mass, and thus, includes the water content of the animal. Accordingly to the contracted laboratory standards the coefficient of variations (CV) associated with fat determination were always less than 3%. 22 2.3 Generating Predictive Equations Before generating predictive equations from regression analysis, we tested for normality, with a Kolgomorov-Smirnov test, all variables involved in the analysis. K-S distances for all variables showed no detectable departure from normality (P > 0.05 for all variables). In the course of derivation of all the regression models described below, we also checked for potential outliers by calculating Cook´s distances from the residuals and flagging those that exceeded or approached 1 (ZAR, 1999). In no circumstances we found an outlier in our data set. Finally, t-tests showed that there were no differences between males and females in any of the body compartments (see Table 1 for results), or in the E-index value (t = 0.15; df = 15; P = 0.9). Thus, gender was not considered for generating the models. Values of fresh total body mass (Mb), E-index, wet lean body mass (LMb) and wet lipid mass (LiMb) were used in simple and multiple regressions to derive equations to predict body condition of G. microtarsus. We opted to use only ordinary least regressions (OLS) because preliminary analysis showed that other equations (polynomials, quadratic) did not improve the predictive power. In the inverse models, LMb and LiMb were used in an OLS as the independent variables, whereas E-index and Mb were used as the dependent variables. Thus, LMb and LiMb were obtained by algebraic transformations, and the confidence and predictive intervals calculated by the inverse procedure (ZAR, 1999). We did not presented multiple inverse equations due to the impossibility of calculating confidence and predictive intervals for such estimates (ZAR, 1999 – see discussion). We also generated equations from direct models to estimate LMb and LiMb. In this case, we used multiple (E-index and Mb jointly as independent variables) and simple regressions (E-index and Mb analysed separately). Confidence and prediction intervals for such equations were calculated following ZAR (1999). Further, we also used the two-stage model, whereby LiMb is estimated by the difference between Mb and LMb obtained from the inverse and direct models, as described above. It should be noted that, with this approach, absolute errors, but not the relative errors (see below), were the same as those calculated from the estimates of LMb (SCOTT et al., 2001). 23 2.4 Assessing and comparing the equations We evaluated the predictive power of each equation (for lean mass and fat mass) by using the procedure described by SCOTT et al. (2001). We first calculated the absolute error of each equation by a method knows as cross- validation (e.g. SKEGEN et al., 1993; UNANGST AND MERKELY, 2002). In this method, a value for a given animal was omitted and a regression equation is generated and used to predict the value for this particular animal. The difference between the actual and the predicted value is termed the individual absolute error. Then, this point is added back and a new point removed until all individuals were accounted. The average of all individual absolute errors is termed the average absolute error. The sum of square of the individual errors gives the Predicted Error Sum of Squares (PRESS), which is a useful measure of how well the regression equation fits the data (ZAR, 1999). Finally, we used the protocol suggested by SCOTT et al. (2001) to calculate the relative error of predictive equations. The mean absolute error is compared against the variation range of the chemically determined values used in the calibration equations. If the absolute errors, within a 95% confidence interval, exceeded these values, then the resolution of the equation cannot be considered fine enough to predict the value of interest. Accordingly to SCOTT et al. (2001), errors expressed in the context of the variability in the limits of the estimated value are more indicative of the accuracy of a given equation than the errors estimated by conventional method. Direct, pairwise, comparisons between the absolute and relative errors, PRESS statistics and the prediction and confidence intervals were jointly used to choose the best equations among the several ones generated to predicted lean and lipid mass of G. microtarsus. We carried out all analysis with the software Statistica 7.0, used a fiducial level of 0.05% to access significance. Unless otherwise noted, mean values were presented with their respective standard errors. 24 3 Results 3.1 Chemically-determined Body Condition: General Patterns Biometric and chemically-determined parameters of body condition of G. microtarsus are presented in Table 1. These values were latter used to validate the TOBEC® method. Overall, the variables showed lower coefficient of variation (CV). An exception was the amount of lipid mass, which showed CV up to 50%. Hydration state was considered satisfactory, with total body water content ranging from 60 to 70% of Mb. A correlation analysis among all the components (absolute values) of body condition listed in Table 1 showed significant pairwise correlations (P < 0.05 for all cases) but for between LiMb and E-Index (P = 0.08), and between LiMb and body water content (P = 0.07). 3.2 Lean Mass Estimates Results obtained for LMb estimates of G. microtarsus with the direct and inverse models are presented in Table 2. In the linear equation 1 (direct model), using only Mb as the independent variable, 99% of the variability in LMb is predicted by the variability in Mb, with a mean absolute error of 0.23g. Thus, the relative error of the estimate is only 4% of the actual variation in LMb (8.4g- see Table 1). The direct model using only E-Index as the predictor variable (equation 2 – Table 2), explain 85% of the variation in LMb, with a mean absolute error of 0.90g, which translate into a relative error of 14%. The confidence and prediction intervals to estimate a mean value of LMb with this model are wider than the limits observed with the use of equation 1 (Table 3). When E-Index and Mb were jointly used to predict LMb (multiple regression- equation 3), the mean absolute error was similar to those observed for the equation 1, the relative error decreased by 0.2%, the PRESS statistics showed a lower value (Table 2), and the confidence and prediction intervals narrowed (Table 3). Taken together, these results suggest a better accuracy of the direct multiple regression to estimate LMb. Equations derived from OLS with the inverse model did not improve the accuracy and precision of the LMb estimates. When Mb was used as the dependent variable, the absolute and relative error was similar to the analogous 25 direct equation (equation 1), but the confidence interval increased substantially (Table 3). By using E-index as the dependent variable increases the mean absolute error to 1.10g, which translate into a relative error of 16.4%. When compared to the analogous direct model (equation 2), both confidence and prediction intervals showed wider amplitudes (Table 3). 3.3 Lipid Mass Estimates Estimates of LiMb were carried out with two procedures: via two-stage model and with a similar procedure used to estimate LMb (direct and inverse models). Table 4 shows the results obtained for estimates of LiMb from direct and inverse models. As hitherto reported, no correlation was found between LiMb and E-index, so results from direct and inverse models using only these two variables were not presented. In the resultant linear direct model, variation in Mb explained 40% of the variation in LiMb. The relative error indicates that 30% of the total variation in the estimated LiMb can be attributed to the error of the model. When a multiple regression model was used, including E-index along with Mb as the predictor variables, the accuracy and precision of the estimate improved. In fact, adding E-index to the model further increased in 11% the amount of the explained variability in LiMb. Furthermore, the value for the PRESS statistics lowered and the relative error of the estimate decreased by 1% (Table 4). Finally, for direct models confidence and prediction intervals for the multiple regressions narrowed when compared with the linear equation to estimate LiMb (Table 5). For the inverse model, linear equation using Mb as the dependent variable, the mean absolute error in the estimate of LiMb was 0.4g (Table 4).. Compared with the actual range of LiMb (1.3g – Table 1), this absolute error translates into a relative error of 49.3% (Table 4). In terms of confidence intervals, the inverse model gave intervals whose range were 40% higher than those observed for the analogous direct model (Table 5). Comparisons of the accuracy and precision of the LiMb estimates with the use of the two-stage procedure (subtracting LMb from Mb) were carried out by the analysis of the relative error of the estimates (Figure 1). Thus, within the amplitude of the chemically-determined LiMb, the best model indicated that 26 29% of the variability in the estimate can be due to the error associated with the multiple regression model used to estimate LMb. Furthermore, the magnitude of this error did not differed irrespective of whether LiMb was calculated from LMb estimated either by direct (linear or multiple regressions) or inverse models. On the other extreme, LiMb calculated from LMb estimates using solely E-index (either direct or inverse models) gave relative errors that exceeded 100% (Figure 1). 4 Discussion Like most of other validation studies (SCOTT et al., 2001 and references therein; WIRSING et al., 2002), our results attest that the TOBEC® method is accurate and precise enough to estimate LMb of G. microtarsus. However, our analysis suggests that the “classical” approach used to generate predictive equations does not offer the best results. In the “classical” approach used to estimate LMb with the TOBEC® method, simple OLS regressions were generated with E-index as the response variable and LMb as the independent variable. With this procedure, estimate of LMb is done algebraically by manipulating the resultant linear regression (inverse models – WALSBERG, 1988; CASTRO et al., 1990; VOLTURA AND WUNDER, 1998; UNANGST AND WUNDER, 2001; 2002). The “classical” approach can be justified because the variability in LMb is responsible for the variability in the E-index (SCOTT et al., 2001), and because OLS models assume that the independent variable is measured without error (ZAR, 1999). Although it is impossible to call into question the direction of the dependence between LMb and E-index, it is not so clear why measurements of E-index should have larger errors than the chemically estimation of LMb. If certain conditions are observed, specially the constancy of position inside the detection chamber, E-index can be obtained with fairly small errors (CONWAY et al., 1994; KARASOV AND PINSHOW, 1998; SCOTT et al., 2001; WIRSING et al., 2002). Moreover, quantification of body condition by chemical methods is only accurate when extreme care is observed in all the steps involved in this procedure (REYNOLDS AND KUNZ, 27 2001). Thus, at least based on the assumption of measurement errors, there is no reason a prior to adopt the “classical” approach. In our analysis, for instance, estimate of LMb directly from E-index (or Mb - i.e. the direct model) had the same precision and accuracy as those observed for the correspondent inverse model (Tables 2 and 4 – see also SKAGEN et al., 1993; CONWAY et al., 1994; BURGER, 1997). Notwithstanding this fact, and irrespective of whether direct or inverse models are used, OLS models generated using only E-index had lower resolution than the same models generated using only Mb. Besides the higher absolute and relative errors, the lower resolution of models using only E-index can be assessed by comparing the confidence and prediction intervals with those obtained from models using only Mb. Using only direct models as an example, the 95% prediction interval for the equation using only Mb shows that a prediction of LMb for a new sample of G. microtarsus would lie within 0.14 and 0.32 grams of the measured value (Table 3). This interval covers only 1.7 to 3.8% of the observed range of LMb in the sample (8.4 grams – Table 1). Prediction of LMb from this equation for a single case would lie within 0.58 e 0.63 grams of the observed value, an interval covering 6.8% to 7.5% of the observed value. On the other hand, when only E-index was used, prediction of LMb for a new sample would represent, with 95% of probability, 52 to 56%, respectively, of the observed limit of LMb. As noted by BURGER (1997), these results would not have changed had the limits been compared using inverse models. When E-index and Mb were used as independent variables, prediction of LMb for a new sample would lie within 0.13 and 0.24 grams of the measured value, with 95% probability. This interval covers 1.5 to 2.8% of the actual range of LMb in our sample. This is a rather small improvement in the predictive power of the equation when compared with results from other studies, where other morphometric measurements were used along with Mb and E-index (CONWAY et al., 1994; BURGER, 1997). Nevertheless, our results suggest that the predictive power of the equation used to predict LMb tends to increase when multiple regressions are used. Thus, this results support our suggestion that there is no reason a priori to use the “classical” approach to estimate LMb. 28 Furthermore, as pointed out by SKAGEN et al. (1993), it seems that the (small) improvement of the multiple regression in prediction LMb when E-Index is included as an independent occurs only because this variable corrects individual differences in LMB and Mb rather than because of its underlying predictive power. Even though TOBEC® method was not developed to estimate lipid mass, the widespread notion that body condition is tightly related to energy stores in the form of fat depots (POND, 1978; SCHULTE-HOSTEEDE et al., 2001; 2005) probably was the main driven force behind the studies that attempted to use this technique to estimate LiMb (SCOTT et al., 2001 and references therein). The first approach toward this goal was the so-called two- stage model, where a two-compartmental model for body condition was assumed and LiMb was estimated by the difference between Mb and TOBEC® estimated value (from inverse models) of LMb (WALSBERG, 1988; CASTRO et al., 1990; ROBY, 1991). In our study, estimating LiMb using this approach gave a relative error higher than 100%. Probably, this high error is due to two reasons: first, it reflects the higher error observed from estimates of LMb from E-Index in the inverse model and, second, the fact that LiMB is only a small portion of Mb (MORTON, 1991). Using LMb estimated from direct models did not minimize the higher error associated with the two-stage model. However, the error was substantially reduced (ca. 30%) when LiMB was estimated from Mb (either with direct and inversemodels) or from multiple regression using both Mb and E-index. Thus, we found no justification to the use of the method whereby estimate of LMb from linear regression with E-index and subsequent estimate of LiMb by subtraction from Mb is used to quantify body condition using TOBEC® (WALSBERG, 1988; CASTRO et al., 1990; ROBY, 1991). One of the drawbacks of the two-stage model to estimate LiMb from the difference between Mb and multiple-regression estimates of LMb is that it is impossible to place confidence and prediction intervals when inverse model is used. Such limits are important in that they allow the analysis of the extent by which the accuracy of body condition estimates in a given sample could be used to predict body condition for a new single case or sample (ROBY, 1991; 29 SKAGEN et al., 1993; CONWAY et al., 1994). Thus, some authors suggested that LiMb should be estimated directly from E-Index, and that the inclusion of morphometric measurements improve the predictive power of these equations (MORTON, 1991; SKAGEN et al., 1993; VOLTURA AND WUNDER, 1998; UNANGST AND WUNDER, 2001; 2002). We found that the direct estimation of LiMb from E-index and Mb using a multiple regression would lie, within a 95% limit, within 0.15 and 0.32 grams of the measured value, an interval covering 14.4 to 31% of the observed limit of LiMb, and that the prediction of LiMb for a single new case would lie around 1.07 grams of the observed value, a value more than 10% higher than the observed limit of LiMb. It is worth mention that these calculations were based on our best model to directly estimate LiMb; for the other models (see Table 5), the confidence and intervals limits increased substantially. Also, the relative error for this model did not differ from our best model derived from the two-stage approach (ca. 30%). Taken together, our results show that, despite the possibility of placing confidence and prediction intervals from direct estimates of LiMb, the best two- stage model to estimate LiMb gave exactly the same error as the direct estimate of LiMb (using LiMb as a response variable). Such a similarity was already noted in previous studies (BURGER, 1997; VOLTURA AND WUNDER 1998; SCOTT et al., 2001). More important, however, is that, irrespective of the model used, TOBEC® method is not efficient to estimate LiMb for G. microtarsus. The high error of the estimate and the wide prediction interval suggests a reduced ability of this method to predict LiMb for a single new case and, to a lesser extent, of a new sample. Albeit our best equation to estimate LiMb only included a single morphometric variable (Mb), we do not believe that inclusion of additional biometric measurements would have increased the predictive power of this equation. As noted by other authors, TOBEC® is relatively inefficient to predict LiMb for animals that had lower fat mass (in relation to Mb) and/or that shows lower variability in the amount of fat mass (SKAGEN et al., 1993; BURGER, 1997; VOLTURA AND WUNDER, 1998; UNANGST AND WUNDER, 2001; 2002). This seems to be the case for G. microtarsus: the amount of lipid mass in less than 5% of Mb and, although 30 interindividual variability was higher than 50%, the range of LiMb did not exceeded 1 gram. Furthermore, likely other marsupials (MCNAB, 1986), most of the fat depots of G. microtarsus might be restricted to a single place in the body (e.g. tail), and this uneven distribution might introduce bias in the conductivity measurement using TOBEC® (UNASGST AND MERKELY, 2002). In summary, the TOBEC® method was precise and accurate enough to estimate LMb for G. microtarsus, and its efficiency was improved when used in conjunction with other morphometric measurements, such as Mb. In this case, E-index seems to be more suitable to correct for eventual interindividual differences in Mb or in LMb rather than a predictive factor on its own. Thus, we did not find justification to the “classical” approach used to estimate LMb with this method. Judging only from comparison of the relative errors, we did not find any difference between the two-stage and the direct models to estimate LiMb. It seems that low ability of the TOBEC® method in estimate LiMb did not reflected the type of the model used but, rather, the inefficiency of the method when applied to animals that do not accumulate proportionally higher amount of fat. This lower efficiency was also observed when other methods (BIA, isotopic dilution) where used in animals with intrinsically lower amount of fat and/or when fat content showed a lowered individual variability (PARKER AND KROCKENBERGER, 2002; WIRSING et al., 2002). We are aware that this results should prevent us to give a take-home advice concerning the accuracy of the TOBEC® method to estimate LiMb. Nevertheless, the similarity in the results obtained from the two-stage and the direct estimates of LiMb (using LiMb as depedendent variable), lead us to agree with the advice made by BURGER (1997), that the two-stage models should be favored because it preserved the real relationship that exists among the body condition compartments. 5 Acknowledgments This study was financially supported by a grant from Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) awarded to Ariovaldo P. Cruz- Neto (proc. 00/09968-8) and Denis C. Briani was supported by a PhD fellowship 31 from the Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (CNPq – proc. 140245/2003-0). We acknowledge the director board of the Clube Náutico de Araraquara for the permission and logistic support during our fieldwork and to Paul F. Colas Rosa for helping us during different phases of this project. 32 6 Literature Cited ANIMAL CARE AND USE COMMITTEE. 1998. Guidelines, handling, and cares of mammals as approved by the American Society of Mammalogists. Journal of Mammalogy, 79: 1416 – 1431. BACHMAN, G. C. 1994. Food restriction effects on the body composition of free- ranging ground squirrels, Spermophilus beldingi. Physiological Zoology 67:756-770. BACHMAN, G. C. AND F. WIDEMO. 1999. Relationships between body composition, body size and alternative reproductive tactics in a lekking sandpiper, the ruff (Philomachus pugnax). Functional Ecology 13:411-416. BINTZ, G. L. 1985. Radioglucose metabolism by Richardson’s grounds squirrel in the weight-gain and weight-loss phases of circannual cycle. Journal of Comparative Physiology 156B:87-93 BURGER, M. F. 1997. Estimating lipid and lean mass in a wintering passerine: an evalution of TOBEC®. The Auk 114:762-769. CASTRO, G., B. A. WUNDER AND F. L. KNOPF. 1990. Total body electrical conductivity (TOBEC®) to estimate total body fat of free-living birds. The Condor 92:496-499. CONWAY, C. J., W. R. EDLEMAN AND K. L. SIMPSON. 1994. Evaluation of lipid indices of the wood thrush. The Condor 96:783-790. GREEN, A. J. 2001. Mass/Length residuals: measures of body condition or generators of spurious results? Ecology 82:1473-1483. HAYES, J. P. AND J. S. SHONKWILLER. 2001. Morphometric indicators of body condition: worthwhile or wishful thinking? Pp. 8-38 in Body composition analysis of animals: a handbook of non-destructive methods (J. R. Speakman, ed.). Cambridge University Press, Cambridge. KARASOV, W. H. AND B. PINSHOW. 1998. Changes in lean mass and in organs of nutrient assimilation in a long-distance passerine migrant at a springtime stopover site. Physiological Zoology 71:435-448. 33 LICHTENBELT, W. D. V. M. 2001. The use of bioelectrical impedance analysis (BIA) to estimate body composition. Pp. 161-182 in Body composition analysis of animals: a handbook of non-destructive methods (J. R. Speakman, ed.). Cambridge University Press, Cambridge. MCNAB, B. K. 1986. Food habits, energetics, and the reproduction of marsupials. Journal of Zoology London 208:595-614. MORTON, J. M., R. L. KIRKPATRICK, AND E. P. SMITH. 1991. Comments on estimating total body lipids from measures of lean mass. The Condor 93:463-465. PANGLE, K. L. AND T. M. SUTTON. 2005. Temporal changes in the relationship between condition indices and proximate composition of juvenile Coregonus artedi. Journal of Fish Biology 66:1060-1072. PARKER, A. K. AND A. K. KROCKENBERGER. 2002. Sometimes the simple way is bets: an evaluation of total body electrical conductivity (TOBEC®) and a morphological index as predictors of total body water in the northern brown bandicoot, Isoodon macrourus. Wildlife Research 29:135-140. PIERCE, B. J., S. R. MCWILLIAMS, T. P. O´CONNOR, A. R. PLACE AND C. G. GUGLIELMO. 2005. Effect of dietary fatty acid composition on depot fat and exercise performance in a migrant songbird, the red-eyed viro. Journal of Experimental Biology 208:1277-1285. POND, C. M. 1978. Morphological aspects and the ecological and mechanical consequences of fat deposition in wild vertebrates. Annual Review of Ecology and Systematics 9:519-570. REYNOLDS, D. S AND T. H. KUNZ. 2001. Standard methods for destructive body composition. Pp. 39-55 in Body composition analysis of animals: a handbook of non-destructive methods (J. R. Speakman, ed.). Cambridge University Press, Cambridge. ROBBINS, C. T. 1993. Wildlife feeding and Nutrition. Academic Press, New York. ROBY, D. D. 1991. A comparison of two noninvasive techniques to measure total body lipid in live birds. The Auk 108:509-518. 34 SCHULTE-HOSTEDDE, A. I., J. S. MILLAR AND G. J. HICKLING. 2001. Evaluation of body condition in small mammals. Canadian Journal of Zoology 79:1021- 1-29. SCHULTE-HOSTEDDE, A. I., B. ZINNER, J. S. MILLAR AND G. J. HICKLING. 2005. Restitution of mass-size residuals: validating body condition indices. Ecology 86: 155-163. SCOTT, I., C. SELMAN, P. I. MITHCELL, AND P. E. EVANS 2001. The use of total body electrical conductivity (TOBEC®) to determinate body composition in vertebrates. Pp. 127-157 in Body composition analysis of animals: a handbook of non-destructive methods. (J. R. Speakman, ed.). Cambridge University Press,Cambridge. SKAGEN, S. K., F. L. KNOPF AND B. S. CADE. 1993. Estimation of Lipids and Lean Mass of Migrating Sandpipers. The Condor 95: 944-956. UNANGST, E. T AND B. A. WUNDER. 2001. Need for species-specific models for body composition estimates of small mammals using EM-SCAN®. Journal of Mammalogy 82:527-534. UNANGST, E. T. AND L. A. MERKLEY. 2002. The effects of lipid location on non- invasive estimates of body comopistion using EM-SCAN® technology. Journal of Experimental Biology 205:3101-3105. UNANGST, E. T AND B. A. WUNDER. 2002. Effects of trap retention on body composition of live meadown voles. Physiological and Biochemical Zoology 75:627-634. VAN LOAN, M. AND P. MAYCLIN. 1987. A new TOBEC® instrument and procedure for the assessment of body composition: useof Fourier coefficients to predict lean body mass and total body water. American Journal of Clinical Nutritional 45:131-137. VOLTURA, M. B AND B. A. WUNDER. 1998. Electrical condutivity to predict body composition of mammals and the effect of gastrointestinal contents. Journal of Mammalogy 79:279-286. WALSBERG, G. E. 1988. Evaluation of a nondestructive method for determining fat stores in small birds and mammals. Physiological Zoology 61:53-159. 35 WIRSING, A. J., T. D. STEURY AND D. L. MURRAY. 2002. Noinvasive estimation of body compostion in small mammals: a comprasion of conductive and morphometric techniques. Physiological and Biochemical Zoology 75:489- 497. WOLLNOUGH, A.P., W.J. FOLEY, C.N. JOHNSON AND M. EVANS. 1997. Evaluation of techniques for indirect measurement of body composition in a free- ranging large hebirvore, the south hairy-nosed wombat. Wildlife Research 24:649-660. ZAR, J. H. 1999. Bioestastistical analysis. 4th ed. Prentice Hall, New Jersey. 36 Table 1 – Summary of biometric values and body condition parameters of Gracilinanus microtarsus. Values expressed as means ± 1 standard deviation. Number in parenthesis indicates amplitude of pooled data (males and females). CV = coefficient of variation (%). Data for % of lipid mass expressed as a function of total fresh body mass, and data for % of body water expressed as a function of lean mass. P refers to probability associated with comparisions (from a t-test) of mean values of males and females. Pooled (n = 17) Males (n = 10) Females (n = 7) P Body Mass (g) 17.8 ± 2.74 (13.5 – 22.7) (CV = 15.4) 17.9 ± 2.5 (CV = 13.9) 17.6 ± 3.2 (CV = 18.2) 0.83 Lean Mass (g) 17.1 ± 2.54 (13.2 – 21.6) (CV = 14.8) 17.2 ± 2.4 (CV = 13.9) 16.9 ± 2.9 (CV = 7.2) 0.81 Lipid Mass (g) 0.72 ± 0.34 (0.29 – 1.33) (CV = 47.2) 0.71 ± 0. 32 (CV = 45.1) 0.73 ± 0.39 (CV = 53.4) 0.92 Body Water (g) 12.4 ± 2.12 (9.34 – 16.3) (CV = 17.1) 12.4 ± 2.2 (CV = 17.7) 12.2 ± 2.2 (CV = 18) 0.85 % Lipid Mass 3.94 ± 1.56 (1.87 – 6.27) (CV = 39.3) 3.96 ± 1.61 (CV = 40.7) 3.91 ± 1.62 (CV = 41.4) 0.95 % Body Water 72.1 ± 3.13 (64.5 – 76.8) (CV = 4.3) 71.9 ± 4.1 (CV = 5.7) 62.3 ± 1.1 (CV = 18) 0.80 37 Table 2 – Equations generated to estimate lean mass (LMb) of Gracilinanus microtarsus through direct and inverse models. LMb = Lean body mass (grams). Mb = Fresh body mass (grams). E-index = TOBEC® derived measurement of conductivity. SEE = Standard error of the equation (grams). PRESS = value for the PRESS statistics. MAE = Mean absolute error (grams). 95%CL = 95% confidence limit of the equations. RE = Relative Error. (calculated accordingly to Scott et al. (2001). See text for further details. Equations SEE PRESS MAE RE (%) Direct Model 1) LMb = 0.67(±0.4) + 0.92(±0.02)Mb r2 = 0.99; P < 0.001 0.27 1.33 0.23 ±0.04 95%CL = 0,08 3.77 2) LMb = – 4.69(±2.37) + 0,17(±0.02)E-index r2 = 0,85; P < 0.001 1,02 1.84 0.90 ± 0.04 95%CL = 0.31 14.4 3) LMb = –0.24(±0.66) + 0.02(±0.01) E-index + 0.83(±0.05)Mb r2 = 0.99; P < 0.001 0.25 1.18 0.22 ±0.03 95%CL =0.07 3.57 Inverse Model 4) Mb = –0.53(±0,49)+1.07(±0.03)LMb r2 = 0.99; P < 0.001 0.28 1.38 0,23 ± 0,04 95%CL = 0.08 3.77 5) E-index = 41.6(±9.14)+4,88(±0.53)LMb r2 = 0.85; P < 0.001 1.10 24.9 1.06 ± 0..15 95%CL = 0.31 16.4 38 Table 3 – Estimated values (grams) from the direct and inverse equations used to predict lean mass. Estimations are the 95% confidence (CI) and prediction intervals (PI) for the mean and maximum values of lean mass derived from each predictive equation. Symbols as in Table 2. Equation Mean (g) ± 95% CI (95% PI) Maximum (g) ± 95% CI (95% PI) Direct Model LMb = 0.67 + 0.92*Mb 17.1 ± 0.14 (0.58) 21.61 ± 0.32 (0.63) LMb = – 4.69 + 0.17*E-index 17.1 ± 4.38 (4.71) 22.05 ± 4.18 (4.71) LMb= – 0.24+ 0.02*E-index + 0.83*Mb 17.1 ± 0.13 (0.56) 21.74 ± 0.24 (0.61) Inverse Model Mb = – 0.53 + 1.07LMb 17.1 ± 0.60 (1.2) 21.7 ± 0.70 (1.3) E-index = 41.6+4.88*LMb 17.1 ± 4.5 (4.9) 22.96 ± 4.5 (4.8) 39 Table 4 – Equations generated to estimate lipid mass (LiMb) of Gracilinanus microtarsus through direct and inverse models. Symbols as in Table 2. Equations SEE PRESS MAE RE (%) Direct Model 1) LiMb = – 0.66 (0.4) + 0.08(0.02)Mb r2 = 0.4; P=0.007 0.27 1.33 0.23 ± 0.04 95%CL = 0.08 30.3 2) LiMb = 0.25(0.66) – 0.02(0.01)E-index + 0.17(0.05) Mb r2 = 0.51; P=0.007 0.25 1.18 0.23 ± 0.03 95%CL = 0.07 29.2 Inverse Model 1) Mb = 14.13(1.28) + 5.14(1.63)LiMb r2 = 0.4; P<0.001 0.43 3.46 0.4 ± 0.06 95%CL = 0.11 49.1 40 Tabela 5 – Estimated values (grams) from the direct and inverse equations used to predict lipid mass. Estimations are the 95% confidence (CI) and prediction intervals (PI) for the mean and maximum values of lipid mass derived from each predictive equation. Symbols as in Table 2. Equation Mean (g) ± 95% CI (95% PI) Máximo(g) ± 95% CI (95% PI) Direct Model LiMb = – 0.66 + 0.08*Mb 0.72 ± 0.91 (1.07) 1.09 ± 0.89 (1.06) LiMb = 0.25 – 0.02*E-Index + 0.17* Mb 0.72 ± 0.15 (0.55) 0.97 ± 0.32 (0.63) Inverse Model Mb = 14.13 + 5.14*LiMb 0.72 ± 1.25 (1.35) 1.46 ± 0.93 (1.35) 41 Legend Figure 1 – Relative error in the estimation of lipid mass with two-stage model. Models numbers refers to OLS (linear or multiple) used to estimate lean mass from direct and inverse models. See Table 2 for the sequence of the models (equations). 42 Figure 1. Models R el at iv e Er ro r ( % ) 0 20 40 60 80 100 120 140 1 2 3 4 5 29,9 115,7 28,7 30,6 132,1 43 CAPÍTULO 2 Fatores que afetam a dinâmica da condição corpórea de Gracilinanus microtarsus (Didelphimorphia: Didelphidae). 44 Resumo Neste estudo nós analisamos e descrevemos a dinâmica da condição corpórea de uma população de Gracilinanus microtarsus (WAGNER, 1842), baseados em dados coletados entre os meses de janeiro a dezembro de 2004. A diferença encontrada na condição corpórea entre sexo depende da condição reprodutiva. Entretanto os modelos mostraram que tais interações dependem da biomassa de invertebrados. Machos reprodutivos e não reprodutivos apresentam maiores valores absolutos de massa magra (MM) e de massa de lipídeos (ML) quando comparados às fêmeas. Quando comparados em termos relativos ambos os sexos não apresentaram diferenças significativas na (%MM) e na (%ML). Em resumo, a espécie apresenta um aumento da condição corpórea, ajustados à estação úmida e ao período reprodutivo. Desta forma parece claro que estratégias de história de vida e outras variáveis e interações entre fatores climáticos, alimentares, fisiológicos e também sociais determinam direta e indiretamente a dinâmica da condição corpórea de G. microtarsus. Palavras-Chave : condição corpórea, massa magra, massa de lipideos, marsupial, Gracilinanus microtarsus 45 Abstract In this study we analyzed and we described the possible responsible factors for the variability of the corporal condition of a population of Gralinanus microtarsus (Wagner, 1842), based on data collected among the months of January to December of 2004. The difference found in the body condition between males and females depends on the reproductive condition. However the model showed that such interplay depends on the biomass of invertebrate. Reproductive males and no reproductive they present larger absolute values of lean mass (MM) and of fat mass (ML) when compared the females. When compared in relative terms the sexes didn't present significant differences in the (%MM) and (%ML). In a brief way, the species present an increase of all the components of the body condition, adjusted to the humid season and the reproductive period. This way of course strategies of life history and another variables and interplay among factors climatic, diet, physiologic and social determine direct and indirectly the dynamics of the body condition of G. microtarsus. Key words: body condition, lean mass, fat mass, marsupial, Gracilinanus microtarsus 46 1. Introdução Padrões de história de vida são considerados como um conjunto de características morfológicas, fisiológicas e comportamentais as quais, de forma direta ou indireta, influenciam a sobrevivência e o sucesso reprodutivo de um organismo (STEARNS, 1992; ROFF, 2002). Diversas destas características apresentam ciclos dinâmicos em ambientes sazonais que são considerados adaptações frente às flutuações climáticas e de disponibilidade de recursos (LINDSTEDT AND BOYCE, 1985; ROFF, 2002). A condição corpórea de um animal reflete seu estado energético e pode ser considerada um componente das estratégias de história de vida, uma vez que diversos parâmetros relacionados à reprodução e sobrevivência estão correlacionados com variações na condição corpórea (BACHMAN AND WIDEMO 1999; SCHULTE- HOSTEDDE et al., 2001; 2005). Nesse contexto o entendimento da dinâmica da condição corpórea de uma espécie é de suma importância, pois sua variabilidade pode ser um indicador de respostas frente a tais variações sazonais (LIMA et al., 1997). Em mamíferos, a massa corpórea total é usualmente utilizada como indicador da condição de um individuo, e além das variações induzidas por fatores extrínsecos ligados a sazonalidade do ambiente (clima, qualidade e disponibilidade de recursos -; MERRIT et al., 2001; PEACOCK et al., 2004; LI AND WANG, 2005; LOVEGROVE, 2005) diversos estudos demonstraram que a massa corpórea também pode variar devido a fatores intrínsecos (e.g., sexo e condição reprodutiva - KWIECINSKI et al., 1987; CAUGHTLEY AND SINCLAIR, 47 1994, HARDER et al., 1996; REYNOLDS AND KUNZ, 2000; KROCKENBERGER, 2003). A premissa de que variações na massa corpórea refletem modificações na condição corpórea baseiam-se na suposição de que estas mudanças são usualmente associadas a reservas de gordura. Além de problemas de cunho estatístico (GREEN, 2001; SCHULTE-HOSTEDDE et al. 2001; 2005), esta premissa desconsidera o fato de que, embora a densidade energética do tecido adiposo ser até 10 vezes maior do que a energia contida no tecido corpóreo magro hidratado (proteínas e carboidratos - BINTZ 1985), esta última pode, em determinadas circunstâncias, ser uma importante fonte de reserva energética (BACHMAN, 1994; KARASOV AND PINSHOW, 1998; PIERCE AND MCWILLIAMS, 2004) e, desta forma, também ser responsável pela variação na massa corpórea. Portanto, verificar a premissa de que variação na massa corpórea reflete mudanças na condição corpórea, e analisar a extensão pela qual estas variações estão associadas á ajustes adaptativos nas estratégias de história de vida requer a análise conjunta das fontes (fatores intrínsecos e extrínsecos) e dos padrões de variação na massa corpórea total, na quantidade de gordura e da massa magra (BACHMAN, 1994; BACHMAN AND WIDEMO, 1999). A distinção entre iteroparidade (múltiplos eventos reprodutivos durante o ciclo de vida) e semelparidade (um único evento reprodutivo durante o ciclo de vida, após o qual os organismos morrem) é uma das mais fundamentais dicotomias nas estratégias de história de vida (STEARNS, 1992, ROFF, 2002). Em vertebrados terrestres, a semelparidade é restrita a machos de apenas algumas espécies de marsupiais das famílias Dasyuridae e Didelphidae (BRADLEY, 1997; BOONSTRA, 2005). Afora uma provável predisposição filogenética (OAKWOOD et al., 2001), a sazonalidade do ambiente traduzida por limitações na quantidade e qualidade de recursos pode restringir as chances de sobrevivência dos machos a apenas um determinado período do ano, favorecendo assim a evolução desta estratégia (MILLS AND BENCINI 2000, WOLFE et al., 2004; BOONSTRA, 2005). Dimorfismo na massa e mudanças neste parâmetro e na condição corpórea (ao menos para machos) foram documentadas antes e durante o período reprodutivo para a maioria das 48 espécies de marsupiais semélparos estudadas (LEE AND COCKBURN, 1985; BRADLEY, 1997; OAKWOOD et al., 2001; todavia ver WOODS AND HELLGREN, 2003). Estas alterações estão usualmente associadas ao acúmulo de reservas energéticas na forma de gordura antes do início da estação reprodutiva. Todavia, em algumas espécies, especialmente pequenos dasiurídeos dos gêneros Antechinus e Phascogale, a quantidade de gordura acumulada pode não ser suficiente para atender as altas demandas energéticas associadas à reprodução (LEE AND COKBURN, 1985; BRADLEY, 1997; BOONSTRA, 2005). Esta situação é especialmente relevante para machos destas espécies que se reproduzem durante condições desfavoráveis em termos de disponibilidades e qualidade de recursos (BOONSTRA, 2005). Neste caso, a mudança na massa corpórea nos períodos que antecedem a reprodução também se dá por acúmulo de energia na forma de proteínas, a qual posteriormente é catabolizada via gluconeogênese dos tecidos magros (LEE AND COKBURN, 1985; OAKWOOD et al., 1991; BOONSTRA, 2005). Portanto, a variação na massa corpórea nestes animais está associada a variações na condição corpórea, com padrões distintos na dinâmica de acúmulo e uso de gordura e tecido magro que, aparentemente, dependem do estado reprodutivo e da disponibilidade de recursos. Em didelfídeos a existência de semelparidade foi sugerida para poucas espécies como Marmosa incana (LORINI et al., 1994), Monodelphis dimidiata (PINE, 1994), e Didelphis virginiana (WOODS AND HELGREEN, 2003). A partir de estudos de marcação e recaptura de uma população de Gracilinanus microtarsus em um ambiente sazonal (Cerrado), MARTINS (2004), verificou que a recaptura de machos diminui progressivamente ao longo do período reprodutivo e a existência de gerações discretas de machos, o que levou este autor a sugerir a existência de semelparidade para esta espécie (OAKWOOD et al., 2001). Além do mais, MARTINS (2004) verificou um rápido e repentino ganho de massa corpórea em ambos os sexos em um curto espaço de tempo. Todavia, nenhum destes estudos documentou a contribuição relativa da quantidade de gordura e de tecido magro para esta mudança, e tampouco foi documentada como esta variação é afetada por fatores intrínsecos e 49 extrínsecos. Como forma de responder a estas questões, a dinâmica de variação na massa e na condição corpórea foi estuda em Gracilinanus microtarsus. Os objetivos específicos do presente estudo foram o de verificar os efeitos do sexo, condição reprodutiva, clima e disponibilidade de recursos sobre a variação no estado energético desta espécie. 2. Material e Métodos 2.1 Categorização da área de Estudo. O presente estudo foi conduzido em um fragmento de cerradão de 307 ha localizado no município de Américo Brasiliense, (21o43’33’’S, 48o01’07’’W) entre janeiro e dezembro de 2004. A fisionomia de Cerrado do fragmento “cerradão” apresenta uma vegetação fechada do tipo floresta (GOODLAND, 1971; SILVA AND BATES, 2002), apresentando dossel predominantemente contínuo e cobertura arbórea que pode oscilar de 50% a 90%. A altura média do estrato arbóreo varia de 8 a 15 metros, proporcionando condições de luminosidade que favorecem a formação de estratos arbustivo e herbáceo diferenciados (RIBEIRO AND WALTER, 1998). O clima da região foi classificado por TOLENTINO (1967) e PRIMAVESI et al. (1999) como sendo tropical de altitude, com duas estações bem definidas, a estação seca - fria que ocorre entre os meses de abril a setembro, e a estação úmida - quente que ocorre entre os meses de outubro a março. Dados sobre temperatura e precipitação para o ano de 2004, obtidos a partir do Sistema Integrado de Gerenciamento de Recursos Hídricos de São Paulo (SIGRH) para a região de Araraquara (ca. 15km da área de estudo), indicam acentuada variação sazonal no clima da área (FIGURA 1A). A temperatura média permaneceu relativamente constante, e mais elevada, entre os meses de setembro a maio (média = 22,4 ± 1,4°C; amplitude: 20,9-23,9°C). A partir de maio, a temperatura diminui, sendo que os meses de Maio a Julho foram os mais frios (média: 13,2 ± 1,6°C; amplitude: 12-14,7°C). A precipitação basicamente esteve concentrada entre os meses de Dezembro a Fevereiro, 50 sendo que do total da precipitação anual da área (1403,25mm) cerca de 65% estiveram concentradas nestes meses. Os dados obtidos a partir do SIGRH também foram utilizados para calcular o índice de aridez (Q) da área. Este índice, além de combinar informações sobre precipitação e temperatura, é uma medida indireta do grau de produtividade da área (TIELEMAN et al., 2002). Originalmente, Q é calculado com base em dados históricos de precipitação e temperatura com base na fórmula Q= P/((Tmax+Tmin)(Tmax-Tmin)) x 1000, (TIELEMAN et al., 2002) onde P = média da precipitação anual (mm), Tmax = média da temperatura máxima do mês mais quente e Tmin = média da temperatura mínima do mês mais frio. Para ajustar esta fórmula de forma a calcular Q em bases mensais para o ano de 2004, os valores de Tmax e Tmin são, respectivamente, os maiores e os menores valores de temperatura observados durante um determinado mês. Os valores de P foram associados á média mensal obtida para o mês em questão (dados obtidos a partir do banco de dados pluviométricos). Q tendem a ser baixo nos meses mais secos e quentes e aumentam à medida que o habitat se torna mais mésico. Como este aumento ocorre de forma rápida, o que poderia acarretar peso desproporcional nas análises, os dados de Q foram transformados em logaritmo antes das análises (TIELEMAN et al., 2002). A adequação desta quantificação do clima foi analisada cotejando os dados em relação a divisão categórica sugerida por (PRIMAVESI et al., (1999) e TOLENTINO (1967) para a região. 2.2. Captura dos Animais e Determinação da Condição Reprodutiva Mensalmente, durante cinco noites consecutivas, entre os meses de janeiro a dezembro de 2004, realizamos um programa de captura-marcação- recaptura do marsupial Gracilinanus microtarsus. Os animais foram capturados em uma grade de captura de amostragem com 10 transecções com 100 metros de comprimentos eqüidistantes cerca de 10 metros entre si. Em cada transecção foram instaladas 10 estações de captura, cada uma contendo uma armadilha modelo Sherman, disposta a 2 metros de altura, totalizando 100 armadilhas/noite na grade de captura. Utilizamos óleo de fígado de bacalhau 51 (Emulsão Scott), como isca para atração dos animais. Após a coleta, os animais eram imediatamente levados para o laboratório, pesados (precisão de 0,01 g - Balança Ohaus E200D) e registrados sexo e condição reprodutiva. No tocante à condição reprodutiva, as fêmeas foram consideradas reprodutivas quando encontradas com os mamilos inchados ou produzindo leite e com a vagina perfurada (QUENTAL et al., 2001). Com relação aos machos, registramos a posição do testículo. Os testículos dessa espécie de marsupial descem da bolsa escrotal ao atingirem a maturidade sexual, permanecendo nessa posição pelo resto da vida do animal (QUENTAL et al., 2001). Após a tomada destas medidas, os animais tiveram a condição corpórea aferida através do método da condutividade elétrica corpórea total (ver abaixo), foram marcados com anilhas plásticas numeradas e soltos no mesmo local de captura. 2.3 Condição Corpórea Os protocolos existentes para análise de condição corpórea apresentam diversos problemas devido a sua natureza destrutiva, que limita o número de indivíduos analisados. Para contornar estes problemas, a condição corpórea foi analisada por meio da técnica conhecida por condutividade elétrica corpórea total (TOBEC®, no original). A TOBEC® se baseia na observação de que a condutividade de uma amostra biológica é determinada pelos eletrólitos corporais. Pelo fato dos ossos e dos lipídeos não conterem quantidades apreciáveis de água ou eletrólitos, eles não contribuem de forma significativa para a condutividade total (SCOTT et al., 2001; ver Capítulo 1). Assumindo um modelo de dois compartimentos (massa corpórea = massa magra + massa de lipídeos), a condição corpórea de cada indivíduo coletado foi estimada conforme os procedimentos descritos em detalhes no Capítulo 1. Usando as equações apropriadas, previamente descritas quando da calibração do método para esta espécie de marsupial (Capitulo 1), a quantificação da condutividade elétrica permitiu calcular a massa magra, sendo que a estimativa da quantidade de lipídeos foi feita subtraindo-se o valor da massa magra estimada da massa corpórea total do animal. Também 52 calculamos a quantidade de água corpórea pelo mesmo método, com a calibração sendo feita através da quantidade de água corpórea determinada pela secagem do homogeneizado usado na validação do método (Capítulo 1). Neste caso, a equação que melhor estima á quantidade de água corpórea (AC - em gramas) inclui o índice TOBEC® (IT) e a massa corpórea (MC) como variáveis independentes: AC = -1,8 + 0,76*MC + 0,005*IT (r2 = 0,97; F2,19 = 276,5; P < 0,001). O erro absoluto na estimativa de AC com este modelo é de apenas 0,09 gramas e o erro relativo foi de 9,5%. 2.4 Disponibilidade de Recursos: Coletas de Invertebrados e Frutas Embora G. microtarsus seja classificada como tendo hábito preferencialmente arborícola, recente estudo sobre o hábito alimentar desta espécie demonstrou a ingestão de invertebrados que pertencem a ordens exclusivamente de hábitos cursoriais (MARTINS AND BONATO, 2004). Portanto, acessamos a disponibilidade mensal de invertebrados através de amostras coletadas ao nível de solo e ao nível do sub-bosque. Á nível do solo, a disponibilidade mensal de invertebrados foi estimada através de armadilhas de queda (“pitfall”), e a disponibilidade de insetos no sub-bosque foi acessada por meio de armadilhas luminosas. Mensalmente 30 armadilhas de queda, eqüidistantes cerca de 10 metros entre si, foram montadas ao longo da grade de captura conforme procedimento descrito por BRIANI AND VIEIRA (in press). Além das armadilhas de queda, usamos armadilhas luminosas que consistiram de bandejas (40cm X 35cm) interespaçadas em 20 metros, contendo solução de água e álcool (70%) e detergente, instaladas a uma altura de 3 metros com uma luz fluorescente em cada bandeja. O fornecimento de energia para as luzes fluorescentes foi feito através de uma bateria 12v. O índice de biomassa mensal de invertebrados no solo (IBsolo) e no sub-bosque (IBsb), ajustadas em função do tamanho da área (hectare), foram calculados com base nas fórmulas fornecidas por BRIANI AND VIEIRA (in press), e expressos com kg/ha de peso seco por mês. 53 Para obtermos uma amostragem representativa da disponibilidade mensal de frutos, eram escolhidas mensalmente três estações dentro da grade de captura. Depois destas estações, nós traçamos um quadrante de 100 m2 tendo no centro de cada quadrante uma estação de captura. Amostras dos frutos presentes nessa área foram coletados e secos em estufa a 60oC e pesados. Foi calculado o valor médio de peso seco de frutas dessas três áreas como forma de se obter índice médio mensal de biomassa de frutos (peso seco), o qual também foi ajustado em função do tamanho da área (BRIANI AND VIEIRA, in press). 2.5 Manuseio e Análise dos Dados O principal objetivo do estudo foi investigar a influência, isolada e sinergística, de variáveis extrínsecas (sazonalidade do habitat, disponibilidade de recursos) e intrínsecas (sexo e condição reprodutiva) sobre a dinâmica de variação na massa corpórea de G. microtarsus. Nós elaboramos um modelo geral linear (MGL), onde a variável resposta era a massa corpórea, as variáveis preditoras categóricas eram o sexo e a condição reprodutiva e as variáveis preditoras contínuas eram a disponibilidade de recursos (invertebrados e frutas) e o índice de aridez do habitat. Apesar de termos coletado 118 indivíduos ao longo do ano (não contando as recapturas), estes modelos foram gerados a partir de valores médios mensais (obtidos em função do sexo e da condição reprodutiva), uma vez que somente foi possível coletar e analisar os dados sobre as variáveis extrínsecas em bases mensais. Em princípio o modelo deveria conter todas as variáveis principais, as quais eram analisadas em separado, e também to