UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS CÂMPUS DE JABOTICABAL DETECÇÃO SOROLÓGICA E CARACTERIZAÇÃO MOLECULARES DE AGENTES ANAPLASMATACEAE, MICOPLASMAS HEMOTRÓFICOS, PIROPLASMAS E Hepatozoon sp. EM CARNÍVOROS SELVAGENS MANTIDOS EM CATIVEIRO NO BRASIL Marcos Rogério André Médico Veterinário JABOTICABAL – SÃO PAULO - BRASIL Janeiro de 2012 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS CÂMPUS DE JABOTICABAL DETECÇÃO SOROLÓGICA E CARACTERIZAÇÃO MOLECULARES DE AGENTES ANAPLASMATACEAE, MICOPLASMAS HEMOTRÓFICOS, PIROPLASMAS E Hepatozoon sp. EM CANÍDEOS E FELÍDEOS SELVAGENS MANTIDOS EM CATIVEIRO NO BRASIL Marcos Rogério André Orientadora: Profa. Dra. Rosangela Zacarias Machado Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Unesp, Câmpus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do título de Doutor em Medicina Veterinária (Medicina Veterinária Preventiva) JABOTICABAL – SÃO PAULO - BRASIL Janeiro de 2012 André, Marcos Rogério A555d Detecção sorológica e caracterização moleculares de agentes Anaplasmataceae, micoplasmas hemotróficos, piroplasmas e Hepatozoon sp. em carnívoros selvagens mantidos em cativeiro no Brasil. – Jaboticabal, 2012 xvi, 209 f. : il. ; 28 cm Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, 2012 Orientador: Rosangela Zacarias Machado Banca examinadora: José Maurício Barbanti Duarte, Karin Werther, Nádia Regina Pereira Almosny, Natalino Hajime Yoshinari Bibliografia 1. carnívoros selvagens. 2. Hepatozoon sp. 3. micoplasmas hemotróficos. 4. piroplasmas. 5. Rickettsiales. I. Título. II. Jaboticabal- Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias. CDU 619.616.993:639.11 Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação – Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - UNESP, Câmpus de Jaboticabal. DADOS CURRICULARES DO AUTOR MARCOS ROGÉRIO ANDRÉ – solteiro, nascido na cidade de Sertãozinho, São Paulo, em 4 de fevereiro de 1982. É Médico Veterinário formado pela Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Unesp, Jaboticabal, em 2004. Durante o curso de graduação foi bolsista de Iniciação Científica do CNPq, trabalhando com pesquisas na área de Imunoparasitologia. Recebeu o “Prêmio Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da Universidade Estadual Paulista, Campus de Jaboticabal”, por ter obtido a maior média entre as disciplinas ministradas durante o curso de Medicina Veterinária, “Prêmio Mário D’ Ápice”, outorgado pelo Conselho Regional de Medicina Veterinária de São Paulo, ao formando em Medicina Veterinária, melhor classificado no conjunto de disciplinas profissionalizantes e o “Prêmio Conselho Regional de Medicina Veterinária do Estado de São Paulo 1° Colocado no Curso de Medicina Veterinária 2004”. Ingressou no Curso de Pós-graduação em Medicina Veterinária, Área de Concentração Patologia Animal, na Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Unesp, Jaboticabal – SP, em março de 2006, sob orientação da Profa. Dra. Rosangela Zacarias Machado com bolsa FAPESP. Mestre em Medicina Veterinária em fevereiro de 2008. Em março de 2008, ingressou no Curso de Doutorado em Medicina Veterinária (Área de Concentração Medicina Veterinária Preventiva) com bolsa concedida pela FAPESP, sob orientação da Profa. Dra. Rosangela Zacarias Machado. Entre julho de 2010 e fevereiro de 2011 realizou Estágio de Doutorado Sanduíche na Johns Hopkins School of Medicine, Baltimore, Maryland, Estados Unidos, sob orientação do Prof. Dr. John Stephen Dumler, com bolsa da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). DEDICO Aos meus queridos pais, João Mauro e Marli, pelo amor, incentivo e apoio em todas as decisões na minha vida. Obrigado por tornar um sonho uma realidade! OFEREÇO Aos meus sobrinhos João Pedro e Valentina pelo amor incondicional "A ciência nos traz conhecimento; a vida, sabedoria." (Will Durant) AGRADECIMENTO ESPECIAL À Professora Rosangela Zacarias Machado, pelos ensinamentos, amizade, lições de entusiasmo e, acima de tudo, por ser responsável por semear a paixão pela ciência. “Não há dificuldade que não traga aprendizado, não há aprendizado sem mudanças e muito menos felicidade sem conquistas" (Fábio Lima) AGRADECIMENTOS A Deus, pelo dom da vida e presença constante. Aos meus pais, João Mauro André e Marli André, pelo amor incondicional. Aos meus irmãos, Mauro Rodrigo André e Melina Daiane André, pelo companheirismo e apoio. A todos os meus familiares pelo incentivo e palavras de apoio, em especial Helena P. André, Sônia Volpe, Tiago Mari Lopes da Silva, Celi André, José Carlos Volpe Júnior, Iago Volpe, Elaine André, Ana Paula André, Francisco André e Rosemeire Volpe. Aos meus sobrinhos João Pedro L. da Silva e Valentina L. da Silva, pelo carinho. Ao meu amigo-irmão, Arthur de Oliveira Galloro, pelo companheirismo, confiança e amizade. À Professora Rosangela Zacarias Machado, pela orientação, oportunidade concedida e amizade durante todos os anos de graduação e pós-graduação. Aos meus amigos Karina Perticarrari, Marco Antônio de Castro Nardelli, Gabriel Funichello, Henrique Bighetti, Eduardo Lopes, Eduardo Toniello, Thiago Menechelli, Lívia Pivetta, Amanda Bonini, Liz Maraucci, Luma Borelli, Gabriela Toniello Galon, Fernanda Toniello, Raíssa Magro, Alessandro Franzo, Marília Monteiro, Maria Eduarda Barbieri, Viviane Pinto, Gustavo S. Sanches, Vanessa Magro, Natália Sisdeli, Carolina Brustello, Lecyana Galloro, Virgínia Lopes, Tamiê Tsugi, Pedro Martelli, Pedro Nardelli, Murilo Mossin e a todos aqueles que compartilharam comigo os melhores momentos de minha vida e, muitas vezes, compreenderam momentos de ausência. Aos amigos do Laboratório de Imunoparasitologia Veterinária: Andréa C. Higa Nakaghi, Ana Sílvia Dagnone, Trícia M. Oliveira, Patrícia I. Furuta, Ana Carolina Silveira, Tiago Mineo, Adriano Carrasco, Meire Seki, Cristiane Divan Baldani, Mayra Araguaia, Fernando Antônio Gavioli, Luiz Ricardo Gonçalvez, Natasha Micelli, Keyla Carstens, Paulo Sampaio, Tamiris Tejerina, Giovanni Vargas, Maria do Socorro Braga, Arvelino Jacinto e Vivian Boter pela amizade, colaboração e ensinamentos durante o tempo de convivência no Laboratório. Aos amigos Márcia Jusi, Carla Freschi e Rafaela Beraldo, pela convivência diária e amizade desenvolvida durante os anos de pós-graduação. Ao Professor Aramis Augusto Pinto, pelos valiosos ensinamentos, amizade e palavras de incentivo. Aos Professores John Stephen Dumler e Dennis Grab, da Johns Hopkins School of Medicine, pela oportunidade, ensinamentos e amizade. À Diana G. Scorpio, pelo companheirismo em Baltimore e amizade. Aos meus amigos da Johns Hopkins School of Medicine, especialmente à Meg Lichay, Sara Gilmore, Emily Clemens, Cindy Chen, Kristen Bankert e Olga Nikolskaia pela ajuda e bons momentos na Johns Hopkins. Aos meus amigos de Baltimore, Valério Baraúna, Gabriela Scáta, Luiza Barros, Rogério Faustino, Diogo Cunha, Vanessa Lindholz, Michelle, Viviane Cáceres e Michelle Zaleski pelos bons momentos em Baltimore. À Marty King pela estadia em Baltimore. Aos funcionários do Departamento de Patologia Veterinária, principalmente à Moema Ogassavara. À Professora Silmara M. Allegretti, pela parceria, apoio e amizade. Aos amigos Mariluce Nepomuceno, Maria Letícia Meloni, Lucas Zena, Rodrigo Savegnago, Natália Meloni e Rodrigo Milan pela companhia nas viagens diárias de Sertãozinho a Jaboticabal. Aos meus cães Capitu, Toquinho, Lilica e Huguinho pelo companheirismo diário. À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pela bolsa de Doutorado (Processo 07/59889-6) e Auxílio-pesquisa (Processo 08/55570-8) concedidos para a realização deste trabalho. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela bolsa de Doutorado Sanduíche concedida. À Coordenação do Programa de Pós-graduação em Medicina Veterinária. Ao Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis (IBAMA) pela concessão de licença de colheita e transporte de material biológico. Aos funcionários do Departamento de Patologia Veterinária, especialmente à Moema Ogassavara. À direção e funcionários da Fundação Parque Zoológico de São Paulo, Zoológico Municipal Bosque dos Jequitibás de Campinas, Bosque/Zoológico Municipal de Pedreira, Bosque Municipal Fábio Barreto de Ribeirão Preto e Zoológicos de Cuiabá, Brasília, Itatiba, Bauru, Sorocaba, Americana, Ilha Solteira, São Carlos, Nova Odessa, Catanduva, Mogi Mirim e Piracicaba. À coordenação, equipe de funcionários e estagiários da Associação Mata Ciliar de Jundiaí, e em especial, Cristina H. Adania. Aos Professores membros da banca de Doutorado, Natalino Yoshinari, José Maurício Barbanti Duarte, Karin Werther e Nádia Almosny pelas sugestões e contribuição para melhoria do trabalho. "Toda a nossa ciência, comparada com a realidade, é primitiva e infantil - e, no entanto, é a coisa mais preciosa que temos." (Albert Einstein) i SUMÁRIO Página LISTA DE TABELAS........................................................................................... v LISTA DE FIGURAS........................................................................................... vii RESUMO............................................................................................................. xv SUMMARY ......................................................................................................... xvi I. INTRODUÇÃO............................................................................................... 1 II. REVISÃO DE LITERATURA......................................................................... 4 III. OBJETIVOS................................................................................................... 42 3.1. Objetivo geral.............................................................................................. 42 3.2. Objetivos específicos.................................................................................. 42 IV. MATERIAL E MÉTODOS.............................................................................. 44 4.1. Espécies amostradas e áreas de estudo.................................................. 44 4.2. Colheita das amostras.............................................................................. 46 4.2.1. Imobilizações química e física............................................................. 46 4.2.2. Obtenção das amostras de sangue e soro.......................................... 46 4.3. Confecção de esfregaços sanguíneos........................................................ 47 4.4. Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI)......................................... 47 4.4.1. Reação de Imunofluorescência Indireta para agentes Anaplasmataceae............................................................................................... 47 4.4.1.1. Obtenção de antígeno para confecção de lâminas de E. canis....... 47 4.4.1.2. Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) para Ehrlichia canis, E. chaffeensis, Anaplasma phagocytophilum e Neorickettsia risticii.................. 48 4.4.2. Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) para Babesia canis.... 48 4.4.2.1. Obtenção de antígeno para confecção de lâminas de Babesia canis vogeli......................................................................................................... 48 4.4.2.1. Descrição da Reação....................................................................... 50 4.5. Detecção de anticorpos para FIV (vírus da imunodeficiência felina) e do antígeno p27 de FeLV (vírus da leucemia felina).......................................... 50 4.6. Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR)............................................... 51 4.6.1. Extração de DNA…………………………………………………………… 51 4.6.2. Reações de Amplificação para agentes da Ordem Rickettsiales......... 51 4.6.2.1. Reações de Amplificação para agentes da Família Anaplasmataceae baseada no gene 16S rRNA................................................. 51 4.6.2.2. Reação de Amplificação do tipo nested PCR para Ehrlichia sp. baseada no gene omp-1…………………………………………………………….. 55 4.6.2.3. Reação de Amplificação para Ehrlichia sp. baseada no gene dissulfito oxidoredutase (dsb)............................................................................. 55 ii Página 4.6.2.4. Reação de Amplificação para Ehrlichia sp. e Anaplasma sp. baseada no gene ftsZ......................................................................................... 56 4.6.2.5. Reação de Amplificação para Ehrlichia sp. e Anaplasma sp. baseada no gene da β-subunidade da RNA polimerase (rpoB)......................... 56 4.6.2.6. Reação de Amplificação para Ehrlichia sp. e Anaplasma sp. baseada no gene citrato sintase (gltA)................................................................ 57 4.6.2.7. Reação de Amplificação para Ehrlichia sp. e Anaplasma sp. baseada no gene groESL (“heat shock operon”)................................................ 57 4.6.2.8. Reação de Amplificação para Anaplasma phagocytophilum baseada no gene msp-2..................................................................................... 58 4.6.2.9. Reação de Amplificação para Anaplasma phagocytophilum baseada no gene ankA....................................................................................... 59 4.6.2.10. Padronização de uma Multiplex PCR para amplificação de DNA de Ehrlichia spp., Anaplasma spp. e Bartonella spp........................................... 59 4.6.2.10.1. Seleção de genes-alvo…………………………………………… 59 4.6.2.10.2. Seleção de oligonucleotídeos iniciadores e sondas de hidrólise .............................................................................................................. 60 4.6.2.10.3. Teste de especificidade de oligonucleotídeos iniciadores ....... 60 4.6.2.10.4. Teste de especificidade das sondas de hidrólise...................... 61 4.6.2.10.5. Aquisição de sequências não disponíveis no GenBank........... 61 4.6.2.10.6. Teste de sensibilidade dos ensaios “singleplex” e multiplex..... 61 4.6.2.11. PCR em tempo real para Ehrlichia chaffeensis baseada no gene vlpt.............................................................................................................. 62 4.6.2.12. PCR em tempo real para Anaplasma phagocytophilum baseada no gene msp-2..................................................................................... 63 4.6.2.13. PCR multiplex em tempo real para riquétsias do “Grupo da Febre Maculosa” e do “Grupo do Tifo” e Orientia tsutsugamushi....................... 63 4.6.3. Reações de Amplificação para hemoplasmas.................................... 64 4.6.3.1. Reação de Amplificação para Mycoplasma haemofelis/M. haemocanis e Candidatus Mycoplasma haemominutum/M. haematoparvum baseada no gene 16S rRNA............................................................................... 64 4.6.3.2. Reação de Amplificação para Mycoplasma haemofelis e M. haemocanis baseada no gene 16S rRNA........................................................... 65 4.6.3.3. Reação de Amplificação para Candidatus Mycoplasma haemominutum e Candidatus Mycoplasma haematoparvum baseada no gene 16S rRNA............................................................................................................ 65 4.6.3.4. Reação de Amplificação para Mycoplasma turicensis baseada no gene 16S rRNA.............................................................................................. 66 4.6.3.5. Reação de Amplificação para Mycoplasma sp. baseada no gene 16S rRNA (fragmento de 600 pb)....................................................................... 67 4.6.3.6. Reação de Amplificação para Mycoplasma sp. baseada no gene 16S rRNA (fragmento de 1475 pb)..................................................................... 67 4.6.3.7. Reação de Amplificação para Mycoplasma sp. baseada no gene rnpB .................................................................................................................... 68 iii Página 4.6.4. Reações de Amplificação para piroplasmas....................................... 68 4.6.4.1. Reação de Amplificação para Babesia sp. (gene 18S rRNA)........ 68 4.6.4.2. Reação de Amplificação do tipo nested PCR para Babesia sp. (gene 18S rRNA)................................................................................................. 69 4.6.4.3. Reação de Amplificação do gene 18S rRNA de Babesia sp......... 69 4.6.4.4. Reação de Amplificação do gene da β-tubulina de Babesia sp..... 70 4.6.4.5. Reação de Amplificação para Cytauxzoon sp. baseada no gene 18SrRNA ............................................................................................................ 70 4.6.4.6. Reação de Amplificação para Cytauxzoon sp. baseada nas regiões intergênicas 1 e 2 (ITS-1 e ITS-2) ......................................................... 71 4.6.7. Reações de Amplificação para Hepatozoon spp.............................. 72 4.6.7.1. Reação de Amplificação para Hepatozoon sp. (fragmento de 650pb do gene 18S rRNA)................................................................................ 72 4.6.7.2. Reação de Amplificação para Hepatozoon sp. (fragmento de 1750pb do gene 18S rRNA)................................................................................ 72 4.6.8. Eletroforese de DNA em gel de agarose............................................... 73 4.7. Reações de Clonagem e Seqüenciamento................................................ 73 4.7.1. Extração dos Amplímeros do Gel de Agarose...................................... 73 4.7.2. Quantificação de DNA dos amplímeros................................................ 73 4.7.3. Reação de ligação do produto amplificado com o vetor pGEM-T Easy 74 4.7.4. Transformação das células competentes de Escherichia coli DH10B . 75 4.7.5. Mini-preparação de DNA Plasmidial..................................................... 75 4.7.6. Seqüenciamento………………………………………………………….... 75 4.7.7. Análise das Seqüências…………………………………………………... 76 V. RESULTADOS…………………………………………………………………….. 78 5.1. Esfregaços sanguíneos ............................................................................. 78 5.2. Ectoparasitas ............................................................................................ 79 5.3. Sorologia e PCR para E. canis.................................................................. 79 5.4. Sorologia e PCR para E. chaffeensis......................................................... 82 5.5. Sorologia e PCR para Anaplasma sp. ...................................................... 84 5.6. Sorologia e PCR para Neorickettsia risticii................................................ 86 5.7. PCR para E. ewingii, Anaplasma platys e N. helminthoeca....................... 86 5.8. PCR multiplex para os gêneros Ehrlichia, Anaplasma e Bartonella.......... 87 5.8.1. Especificidade…………………………………………………………….... 87 5.8.2. Sensibilidade……………………………………………………………… 88 5.8.3. Resultados da PCR multiplex em tempo real das amostras de canídeos e felídeos para Ehrlichia sp., Anaplasma sp. e Bartonella sp......................................................................................................................... 88 5.9. Resultados da PCR em tempo real das amostras de canídeos e felídeos para E. chaffeensis (vlpt), A. phagocytophilum (msp-2), Rickettsia spp. e Orientia tsutsugamushi..................................................................................................... 89 5.10. PCR para Mycoplasma sp....................................................................... 89 5.11. Sorologia e PCR para Babesia sp………………………………………….. 93 iv Página 5.12. PCR para Cytauxzoon sp......................................................................... 95 5.13. PCR para Hepatozoon sp........................................................................ 98 5.14. Análise da similaridade das sequências pelo BLAST.............................. 100 5.14.1. Análise das sequências de Ehrlichia sp.............................................. 100 5.14.2. Análise das sequências de Anaplasma sp.......................................... 101 5.14.3. Análise das sequências de Mycoplasma sp....................................... 102 5.14.4. Análise das sequências de Babesia sp............................................... 103 5.14.5. Análise das sequências de Cytauxzoon sp......................................... 104 5.14.6. Análise das sequências de Hepatozoon sp....................................... 104 5.15. Filogenia……………………………………………………………………..... 105 5.16. Detecção de anticorpos para FIV (vírus da imunodeficiência felina) e do antígeno p27 de FeLV (vírus da leucemia felina............................................ 119 5.17. Co-positividade na PCR........................................................................... 119 VI. DISCUSSÃO.................................................................................................. 120 VII. CONCLUSÃO............................................................................................... 140 VIII. REFERËNCIAS........................................................................................... 142 v LISTA DE TABELAS Página Tabela 1 Número, espécies e respectivas instituições de origem dos canídeos e felídeos selvagens amostrados..................................... 45 Tabela 2 Dosagens anestésicas utilizadas para a imobilização química de felídeos e canídeos selvagens mantidos em cativeiro..................... 46 Tabela 3 Descrição dos oligonucleotídeos iniciadores utilizados para as reações de PCR e nested PCR, tamanhos dos amplímeros e referências utilizadas para detecção molecular de agentes da Família Anaplasmataceae baseadas no gene 16S rRNA................ 53 Tabela 4 Descrição das seqüências térmicas e de tempo para as reações de PCR e nested PCR para agentes da Família Anaplasmataceae baseadas no gene 16S rRNA........................................................... 54 Tabela 5 Plasmídeos utilizados para avaliar a sensibilidade da PCR multiplex para os gêneros Ehrlichia, Anaplasma e Bartonella......... 62 Tabela 6 Oligonucleotídeos iniciadores e sondas de hidrólise (sondas de hidrólise TaqMan) utilizados na PCR multiplex em tempo real para amplificação de Rickettsia spp. (Grupos da Febre Maculosa e Tifo) e Orientia tsutsugamushi.......................................................... 64 Tabela 7 Resultados da sorologia e PCR convencional para Ehrlichia sp. de acordo com as espécies de carnívoros selvagens amostradas....... 84 Tabela 8 Resultados da sorologia e PCR convencional para Anaplasma sp. de acordo com as espécies de carnívoros selvagens amostradas.. 86 Tabela 9 Oligonucleotídeos iniciadores e sondas de hidrólise (probe TaqMan) utilizados na PCR multiplex em tempo real para os gêneros Ehrlichia sp., Anaplasma sp. e Bartonella sp..................... 87 Tabela 10 Características da PCR “singleplex” e multiplex para os gêneros Ehrlichia sp., Anaplasma sp. e Bartonella sp................................... 88 Tabela 11 Títulos de anticorpos anti-B. canis vogeli em canídeos e felídeos selvagens amostrados mantidos em cativeiro.................................. 94 Tabela 12 Correlação entre os resultados da PCR para Cytauxzoon sp. (baseada no gene 18S rRNA) e sorologia para B. canis vogeli para os felídeos selvagens em cativeiro amostrados....................... 97 vi Página Tabela 13 Máxima similaridade de amplicons obtida pelo BLAST® para amostras positivas nas PCRs para agentes Anaplasmataceae....... 102 Tabela 14 Identidade verificada pelo programa BLAST® para as amostras de canídeos e felídeos selvagens positivas para Mycoplasma sp........ 103 Tabela 15 Identidade verificada pelo programa BLAST® para as amostras de canídeos e felídeos selvagens positivas na PCR para Hepatozoon sp. .................................................................................................... 104 Tabela 16 Co-infecção por hemoparasitas nas amostras de sangue de canídeos e felídeos selvagens mantidos em cativeiro associada à exposição a agentes retrovirais........................................................ 119 vii LISTA DE FIGURAS Página Figura 1 Mapa do vetor de clonagem pGEM-T Easy (Promega®)................ 74 Figura 2 Fotomicrografia evidenciando gametócito de Hepatozoon sp. em neutrófilo presente em esfregaço sanguíneo corado pelo Giemsa de um gato-do-mato-pequeno da AMC, Jundiaí, SP (Aumento de 1000x). ........................................................................................... 78 Figura 3 Fotografia de eletroforese em gel de agarose 1,3% corado com Brometo de Etídeo. Os amplímeros mostrados na foto são relativos à nPCR para E. canis obtidos com os oligonucleotídeos iniciadores ECAN5/HE3. Canaleta M: marcador de tamanho molecular em escala de 100 pares de bases (Invitrogen®); Canaleta 1: controle positivo (amostra Jaboticabal); Canaleta 2 até 3: amostradas de jaguatirica positivas; Canaleta 4: gato- maracajá negativo; Canaleta 5 até 6: amostras positivas de jaguatirica; Canaleta 7 até 8: amostras positivas de gato-do- mato-pequeno; Canaleta 9: amostra positiva de puma; Canaleta 10: branco; Canaleta 11: amostra positiva de onça-pintada .......... 80 Figura 4 Fotografia de eletroforese em gel de agarose 1,3% corado com Brometo de Etídeo. Os amplímeros mostrados na foto são relativos à nPCR para Ehrlichia sp. obtidos com os oligonucleotídeos iniciadores conP28-F2/conP28-R2. Canaleta M: marcador de tamanho molecular em escala de 100 pares de bases (Invitrogen®); Canaleta 1: controle positivo (amostra Jaboticabal); Canaleta 2: amostra positiva de onça-pintada (Zoológico de Pedreira); Canaletas 3 a 5: amostras de felídeos negativos; Canaleta 6: amostra positiva de jaguatirica (Jundiaí); Canaleta 7: amostra negativa de felídeo; Canaletas 8 e 9: amostras positivas de jaguatiricas (Jundiaí); Canaletas 10 a 15: amostras negativas de felídeos; Canaleta 16: branco (água ultra- pura esterilizada) ............................................................................ 81 viii Página Figura 5 Fotografia de eletroforese em gel de agarose 1,3% corado com Brometo de Etídeo. Os amplímeros mostrados na foto são relativos à PCR para Ehrlichia sp. obtidos com os oligonucleotídeos iniciadores dsb-330/dsb-728. Canaleta M: marcador de tamanho molecular em escala de 100 pares de bases (Invitrogen®); Canaleta 1: controle positivo (amostra Jaboticabal); Canaleta 7: amostra de canídeo selvagem positiva para Ehrlichia sp. pelo gene dsb; Demais canaletas: amostras anteriormente positivas na nPCR para o o gene 16SrRNA e negativas na PCR para o gene dsb; Canaleta 20: branco (água ultra-pura esterilizada) ................................................................... 82 Figura 6 Fotografia de eletroforese em gel de agarose 1,3% corado com Brometo de Etídeo. Os amplímeros mostrados na foto são relativos à nPCR para E. chaffeensis obtidos com os oligonucleotídeos iniciadores CHAFF/GA1UR. Canaleta M: marcador de tamanho molecular em escala de 100 pares de bases (Invitrogen®); Canaleta 1: controle positivo; Canaletas 2: amostra de gato-do-mato-pequeno positivo (Zoológico de Ilha Solteira); Canaleta 3: amostra de felídeo negativa; Canaleta 4: amostra de cachorro-do-mato positiva (Zoológico de Americana); Canaletas 5 a 10: amostras de felídeos negativas; Canaleta 11: amostra de suçuarana positiva (Zoológico de Sorocaba); Canaleta 12: amostra de felídeos negativa; Canaletas 13 e 14: amostras positivas de gatos-do-mato-pequeno (Zoológico de Sorocaba); Canaleta 15: branco (água ultra-pura esterilizada). ... 83 Figura 7 Fotografia de eletroforese em gel de agarose 1,3% corado com Brometo de Etídeo. Os amplímeros mostrados na foto são relativos à nPCR para Anaplasma sp. obtidos com os oligonucleotídeos iniciadores gE2/gE9f. Canaleta M: marcador de tamanho molecular em escala de 100 pares de bases (Invitrogen®); Canaleta 1: controle positivo; Canaletas 2 a 5: amostras de gatos-do-mato-pequeno positivas; Canaleta 6: branco (água ultra-pura esterilizada). ............................................ 85 ix Página Figura 8 Fotografia de eletroforese em gel de agarose 1,3% corado com Brometo de Etídeo. Os amplímeros mostrados na foto são relativos à PCR para o gene groESL para as amostras positivas para Ehrlichia sp. e Anaplasma sp. pelo gene 16S rRNA. Canaleta M: marcador de tamanho molecular em escala de 100 pares de bases (Invitrogen®); Canaleta 1: controle positivo E. canis; Canaletas 3 a 27: amostras positivas para Ehrlichia sp. e Anaplasma sp. pelo gene 16S rRNA e negativas na PCR para o gene groESL; Canaleta 28: amostra de canídeo selvagem positivo para Anaplasma sp. na nPCR para o gene groESL; Canaleta 29: branco (água ultra-pura esterilizada). ....................... 85 Figura 9 Fotografia de eletroforese em gel de agarose 1,3% corado com Brometo de Etídeo. Os amplímeros mostrados na foto são relativos à PCR para Mycoplasma sp. (gene 16S rRNA). Canaleta M: marcador de tamanho molecular em escala de 100 pares de bases (Invitrogen®); Canaleta 1: controle positivo; Canaletas 2 a 27: amostras de canídeos e felídeos selvagens positivas; Canaleta 28: branco (água ultra pura esterilizada). ....... 90 Figura 10 Fotografia de eletroforese em gel de agarose 1,3% corado com Brometo de Etídeo. Os amplímeros mostrados na foto são relativos à PCR para Mycoplasma haemofelis/M. haemocanis (gene 16S rRNA). Canaleta M: marcador de tamanho molecular em escala de 100 pares de bases (Invitrogen®); Canaleta 1: controle positivo; Canaletas 7: amostra de gato-do-mato- pequeno da AMC de Jundiaí positiva para M. haemofelis; Demais canaletas: amostras de canídeos e felídeos selvagens negativas para M. haemofelis; Canaleta 13: branco (água ultra-pura esterilizada). ................................................................................... 91 Figura 11 Fotografia de eletroforese em gel de agarose 1,3% corado com Brometo de Etídeo. Os amplímeros mostrados na foto são relativos à PCR para Candidatus Mycoplasma haemominutum/M. haematoparvum (16S rRNA). Canaleta M: marcador de tamanho molecular em escala de 100 pares de bases (Invitrogen®); Canaleta 1: controle positivo Candidatus Mycoplasma haemominutum; Canaleta 2: amostra de gato-do-mato-pequeno da AMC de Jundiaí positiva para M. haemominutum; Canaleta 3: amostra de lobo-europeu do Zoológico de São Paulo positiva para M. haemominutum; Canaleta 4: amostra de felídeo selvagem negativa; Canaleta 5: branco (água ultra-pura esterilizada). ................................................................................... 91 x Página Figura 12 Fotografia de eletroforese em gel de agarose 1,3% corado com Brometo de Etídeo. Os amplímeros mostrados na foto são relativos à PCR para Mycoplasma sp. (gene 16S rRNA) obtidos com os oligonucleotídeos iniciadores HBT-F e HBT-R. Canaleta M: marcador de tamanho molecular em escala de 100 pares de bases (Invitrogen®); Canaletas 1 e 2: amostras de felídeos selvagens positivas para Candidatus Mycoplasma haemominutum (CMhm); Canaletas 3, 17 e 21: amostras de felídeos positivas para CMhm, porém negativas na PCR em questão; Canaletas 4 a 16 e 18 a 20: amostras de felídeos selvagens positivas para Candidatus Mycoplasma haemominutum (CMhm); Canaleta 22: amostra de felídeo positiva para M. haemofelis.; Canaletas 23 e 24: amostras de canídeos positivas para Mycoplasma sp; Canaletas 25 a 27. amostras de canídeos selvagens positivas para Mycoplasma sp., porém negativas na PCR em questão; Canaleta 28: branco (água ultra-pura esterilizada). .................................................................. 92 Figura 13 Fotografia de eletroforese em gel de agarose 1,3% corado com Brometo de Etídeo. Os amplímeros mostrados na foto são relativos à PCR para Mycoplasma sp. baseada no gene 16S rRNA que amplifica um fragmento de 1750 pb. Canaleta M: marcador de tamanho molecular em escala de 100 pares de bases (Invitrogen®); Canaleta 1, 3, 4, 5 e 6: amostras de felídeos positivas para Mycoplasma sp.; Canaleta 2: amostra negativa; Canaleta 7: água ultra-pura esterilizada. ....................................... 92 Figura 14 Fotografia de eletroforese em gel de agarose 1,3% corado com Brometo de Etídeo. Os amplímeros mostrados na foto são relativos à PCR para Mycoplasma sp. baseada no gene rnpb. Canaleta M: marcador de tamanho molecular em escala de 100 pares de bases (Invitrogen®); Canaleta 1: controle positivo; Canaleta 4: amostra positiva para o gene rnpb; Demais canaletas: amostras de felídeos e canídeos positivas para o Mycoplasma sp. baseada no gene 16S rRNA e negativas na PCR baseada no gene rnpb. .......................................................... 93 xi Página Figura 15 Fotografia de eletroforese em gel de agarose 1,3% corado com Brometo de Etídeo. Os amplímeros mostrados na foto são relativos à nPCR para Babesia sp. obtidos com os oligonucleotídeos iniciadores BTF2/BTR2. Canaleta M: marcador de tamanho molecular em escala de 100 pares de bases (Invitrogen®); Canaleta 1: controle positivo B. canis; Canaleta 2: amostra de gato-palheiro positivo; Canaleta 3: amostra de geneta postiva; Canaleta 4: branco (água ultra-pura esterilizada). .......... 94 Figura 16 Fotografia de eletroforese em gel de agarose 1,3% corado com Brometo de Etídeo. Os amplímeros mostrados na foto são relativos à PCR para Babesia sp (gene da β-tubulina) utilizando- se os oligonucleotídeos iniciadores Tubu-3 e Tubu-63F. Canaleta M: marcador de tamanho molecular em escala de 1kb pares de bases (Invitrogen®); Canaleta 1: amostra de sangue de gato- palheiro positiva para Babesia sp.; Canaleta 2: branco (água ultra-pura esterilizada); Canaleta 3: amostra de sangue de geneta positiva para Babesia sp. ................................................... 95 Figura 17 Fotografia de eletroforese em gel de agarose 1,3% corado com Brometo de Etídeo. Os amplímeros mostrados na foto são relativos à PCR para Cytauxzoon sp. (gene 18SrRNA). Canaleta M: marcador de tamanho molecular em escala de 100 pares de bases (Invitrogen®); Canaletas 1 a 7: amostras de jaguatiricas positivas. Canaletas 8 e 9: amostras de suçuaranas positivas. Canaleta 10: branco (água ultra-pura esterilizada). ....................... 96 Figura 18 Fotografia de eletroforese em gel de agarose 1,3% corado com Brometo de Etídeo. Os amplímeros mostrados na foto são relativos à PCR para Cytauxzoon sp. obtidos com os oligonucleotídeos iniciadores ITS1-F; ITS1-R, ITS2-F e ITS-2R. Canaleta M: marcador de tamanho molecular em escala de 100 pares de bases (Invitrogen®); Canaletas 1 a 10: amostras de felídeos positivas na PCR para o gene 18S rRNA de Cytauxzoon sp. e também positivas na PCR para a região intergênica-1. Canaleta 11: branco: água ultra-pura esterilizada; Canaletas 12 a 19: amostras de felídeos positivas na PCR para o gene 18S rRNA de Cytauxzoon sp. e negativas na PCR para Cytauxzoon sp. baseada na região intergênica-2; Canaletas 20 e 21: amostras de felídeos positivas na PCR para o gene 18SrRNA de Cytauxzoon sp. e também positivas na PCR baseada na região intergênica-2; Canaleta 22: branco (água ultra-pura esterilizada). 97 xii Página Figura 19 Fotografia de eletroforese em gel de agarose 1,3% corado com Brometo de Etídeo. Os amplímeros mostrados na foto são relativos à PCR para Hepatozoon sp. (gene 18S rRNA) obtidos com os oligonucleotídeos iniciadores HEP-F e HEP-R. Canaleta M: marcador de tamanho molecular em escala de 100 pares de bases (Invitrogen®); Canaletas 1: controle positivo (Hepatozoon canis); Canaleta 2: amostra positiva de um gato-do-mato- pequeno do Zoológico de Brasília; Canaletas 3 a 5: amostras positivas de gatos-do-mato-pequeno de Jundiaí; Canaleta 6: amostra negativa de felino; Canaleta 7: amostra positiva de gato mourisco do Zoológico de Ilha Solteira; Canaleta 8: amostra positiva de suçuarana do Zoológico de Sorocaba. Canaleta 9: branco (água ultra pura esterilizada). ............................................ 99 Figura 20 Fotografia de eletroforese em gel de agarose 1,3% corado com Brometo de Etídeo. Os amplímeros mostrados na foto são relativos à PCR para Hepatozoon sp. (gene 18S rRNA) obtidos com os oligonucleotídeos iniciadores HAM-1 e HPF-2R. Canaleta M: marcador de tamanho molecular em escala de 100 pares de bases (Invitrogen®); Canaleta 1: branco; Canaletas 2 a 11: amostras de canídeos e felídeos selvagens positivas para Hepatozoon sp.; Canaleta 12: controle positivo (Hepatozoon canis). ............................................................................................. 99 Figura 21 Posição filogenética de isolados de Ehrlichia spp. de canídeos e felídeos selvagens baseada na análise de sequências de DNA do gene 16S rRNA (350pb). Os números em cada ramificação da árvore representam o valor de bootstrap. Os números de acesso das sequências se encontram entre parênteses. .......................... 107 Figura 22 Posição filogenética de isolados de Ehrlichia spp. de felídeos selvagens baseada na análise de sequências de DNA do gene omp-1 (309pb). Os números em cada ramificação da árvore representam o valor de bootstrap (100 replicações). Os números de acesso das sequências se encontram entre parênteses. ......... 108 Figura 23 Posição filogenética de isolados de Ehrlichia spp. de canídeos e felídeos selvagens baseada na análise de sequências de DNA do gene dsb (409pb). Os números em cada ramificação da árvore representam o valor de bootstrap. Os números de acesso das sequências encontram-se entre parênteses. .......................... 109 xiii Página Figura 24 Posição filogenética de isolados de Ehrlichia spp. de canídeos selvagens baseada na análise de sequências de DNA do gene groESL (1297pb). Os números em cada ramificação da árvore representam o valor de bootstrap. Os números de acesso das sequências encontram-se entre parênteses................................... 110 Figura 25 Posição filogenética de isolados de Mycoplasma spp. de canídeos e felídeos selvagens baseada na análise de sequências de DNA do gene 16S rRNA(1475pb). Os números em cada ramificação da árvore representam o valor de bootstrap. Os números de acesso das sequências estão indicados. ............. 111 Figura 26 Posição filogenética de isolados de Mycoplasma spp. de felídeos selvagens baseada na análise de sequências de DNA do gene rnpB (200pb). Os números em cada ramificação da árvore representam o valor de bootstrap. Os números de acesso das sequências estão indicados. .......................................................... 112 Figura 27 Posição filogenética de isolados de Babesia sp. de um gato- palheiro e uma geneta baseada na análise de sequências de DNA do gene 18S rRNA (900pb). Os números em cada ramificação da árvore representam o valor de bootstrap. .............. 113 Figura 28 Posição filogenética de isolados de Babesia sp. de um gato- palheiro e uma geneta baseada na análise de sequências de DNA do gene da β-tubulina (1198 pb). Os números em cada ramificação da árvore representam o valor de bootstrap. .............. 114 Figura 29 Posição filogenética de isolados de Cytauxzoon sp. de felídeos selvagens baseada na análise de sequências de DNA do gene 18S rRNA (651pb). Os números em cada ramificação da árvore representam o valor de bootstrap. ................................................. 115 Figura 30 Posição filogenética de isolados de Cytauxzoon sp. de felídeos selvagens baseada na análise de sequências de DNA do região de espaçamento intergênica 1 (ITS-1) (431pb). Os números em cada ramificação da árvore representam o valor de bootstrap. ..... 116 Figura 31 Posição filogenética de isolados de Cytauxzoon sp. de felídeos selvagens baseada na análise de sequências de DNA do região de espaçamento intergênica 2 (ITS-2) (800pb). Os números em cada ramificação da árvore representam o valor de bootstrap. ..... 117 xiv Página Figura 32 Posição filogenética de isolados de Hepatozoon spp. de canídeos e felídeos selvagens baseada na análise de sequências de DNA do gene 18S rRNA (1750pb). Os números em cada ramificação da árvore representam o valor de bootstrap. 118 xv DETECÇÃO SOROLÓGICA E CARACTERIZAÇÃO MOLECULARES DE AGENTES ANAPLASMATACEAE, MICOPLASMAS HEMOTRÓFICOS, PIROPLASMAS E Hepatozoon sp. EM CARNÍVOROS SELVAGENS MANTIDOS EM CATIVEIRO NO BRASIL RESUMO - Doenças transmitidas por vetores artrópodes são mundialmente importantes para a saúde humana e animal. Recentemente, diversos estudos têm sido realizados a fim de investigar o possível papel dos animais selvagens na epidemiologia destas enfermidades. A identificação de reservatórios selvagens para estes hemoparasitas ajudaria no entendimento da epi enfermidades por eles causadas, principalmente aquelas de caráter zoonótico. O presente estudo teve como objetivo pesquisar em amostras de sangue de carnívoros selvagens mantidos em cativeiro a presença de infecção ou exposição a agentes Anaplasmataceae (Ehrlichia canis, E. chaffeensis, E. ewingii, Neorickettsia risticii, N. helminthoeca, Anaplasma platys e A. phagocytophilum), Rickettsiaceae (Orientia tsutsugamushi e Rickettsia sp. dos Grupos da Febre Maculosa e do Tifo), Babesia sp., Cytauxzoon sp. (somente para os felídeos), micoplasmas hemotróficos (Mycoplasma haemofelis, Candidatus M. haemominutum, Candidatus M. turicensis, M. haemocanis e Candidatus M. haematoparvum) e Hepatozoon sp., utilizando métodos sorológicos e moleculares. Para tal, foram amostrados 167 felídeos e 100 canídeos selvagens mantidos em cativeiro nos estados de São Paulo, Mato Grosso e Distrito Federal. Doze felídeos (7,2%) e três (3%) canídeos mostraram-se soropositivos frente ao antígeno de E. canis. Apenas um canídeo (1%) mostrou-se soropositivo para A. phagocytophilum. Nenhum animal mostrou-se soropositivo para E. chaffeensis ou N. risticii. A análise filogenética baseada em um fragmento de 350 pb do gene 16S rRNA não foi suficientemente robusta para diferenciar entre as espécies de Ehrlichia spp. Os fragmentos de DNA de Ehrlichia spp. encontrados em quatro felídeos foram posicionados em um ramo distinto daquela de E. canis e E. chaffeensis, com base na análise filogenética do gene omp-1. Ainda, a análise filogenética baseada no gene dsb confirmou a infecção por E. canis em uma cachorro-do-mato. Dezessete felídeos (10%) e 10 canídeos (10%) mostraram-se positivos para Anaplasma spp., o qual foi posicionado no mesmo ramo que A. phagocytophilum e A. platys na árvore filogenética baseada no gene 16S rRNA e no mesmo ramo que A. bovis e A. phagocytophilum quando baseada no gene groESL. Vinte e sete (16%) carnívoros selvagens mostraram-se positivos para Mycoplasma spp. (16S rRNA): 22 felídeos para Candidatus Mycoplasma haemominutum, 1 para M. haemofelis, dois canídeos para Candidatus M. haematoparvum e dois para Candidatus M. haemominutum. Cinquenta e quatro felídeos (31%) e 10 canídeos (10%) mostraram-se soropositivos frente ao antígeno de B. vogeli. Um gato-palheiro e uma geneta mostraram-se positivos para Babesia sp., filogeneticamente relacionada a Babesia leo (98% de identidade pelo gene 18S rRNA). Vinte e um felídeos (12,5%) foram positivos para Cytauxzoon sp. (98% de identidade com C. felis pelo gene 18S rRNA). Seis canídeos e seis felídeos selvagens mostraram-se positivos para Hepatozoon sp. filogeneticamente distinto de outros isolados já conhecidos (com exceção de dois canídeos parasitados com Hepatozoon sp. filogeneticamente relacionado a H. americanum pelo gene 18S rRNA). O presente trabalho mostra, portanto, a ocorrência de agentes transmitidos por artrópodes vetores em carnívoros selvagens no Brasil. Palavras-chave: carnívoros selvagens, Hepatozoon sp., micoplasmas hemotróficos, piroplasmas, Rickettsiales xvi SEROLOGICAL DETECTION AND MOLECULAR CHARACTERIZATION OF ANAPLASMATACEAE AGENTS, HEMOTROPHIC MYCOPLASMAS, PIROPLASMS, AND Hepatozoon sp. IN WILD CARNIVORES MAINTAINED IN CAPTIVITY IN BRAZIL ABSTRACT – Vector-borne diseases are worldwide important to human and animal health. Recently, several studies have been done aiming to investigate the role of wild animals in the epidemiology of these diseases. The identification of wild reservoirs for these hemoparasites would help in a better understanding of the epidemiology of these diseases, mainly that with zoonotic character. The present work aimed to investigate the presence of infection or exposure to Anaplasmataceae (Ehrlichia canis, E. chaffeensis, E. ewingii, Neorickettsia risticii, N. helminthoeca, Anaplasma platys e A. phagocytophilum) and Rickettsiaceae (Orientia tsutsugamushi and Spotted Fever and Typhus Group Rickettsia sp.), Babesia sp., Cytauxzoon sp., hemotrophic hemoplasmas (Mycoplasma haemofelis, Candidatus M. haemominutum, Candidatus M. turicensis, M. haemocanis e Candidatus M. haematoparvum) and Hepatozoon sp. in captive wild carnivores blood samples by molecular and serological methods. Blood samples were collected from 167 wild felids and 100 wild canids, maintained in captivity in zoos from São Paulo and Mato Grosso states, and Distrito Federal. Twelve felids (7.2%) and three canids (3%) were seropositive to E. canis. Only one canid (1%) was seropositive to A. phagocytophilum. None was seropositive to E. chaffeensis neither N. risticii. The phylogenetic analysis of 350bp of 16S rRNA gene was not sufficiently robust to support the differentiation of Ehrlichia species. The Ehrlichia spp. DNA found in four felids was in a distinct clade from E. chaffeensis and E. canis by omp-1 phylogenetic analysis. The phylogenetic analysis of dsb gene showed the infection by E. canis in one sampled crab-eating fox. Seventeen felids (10%) and ten canids (10%) was positive to Anaplasma spp. PCR, which was in the same clade than A. phagocytophilum and A. platys by 16S rRNA analysis, and in the same clade that A. phagocytophilum and A. bovis in groESL analysis. Twenty-seven (16%) wild carnivores were positive for Mycoplasma spp. DNA (16S rRNA): 22 wild felids for Candidatus Mycoplasma haemominutum, one felid for M. haemofelis, two canids for Candidatus Mycoplasma haematoparvum, and two canids for Candidatus Mycoplasma haemominutum. Fifty-four felids (31%) and 10 canids (10%) were seropositive to B. canis vogeli. One pampas cat and one genet were positive to Babesia sp. PCR, closely related to B. leo (98% identity by 18S RNA gene). Twenty-one felids were positive to Cytauxzoon sp. (98% identity to C. felis by 18S rRNA). Six canids and six felids were positive to Hepatozoon sp., phylogenetically distinct from other Hepatozoon isolates (except two canids parasitized by Hepatozoon sp. closely related to H. americanum by 18S rRNA). The present work shows the occurrence of vector-borne agents in wild carnivores in Brazil. KeyWords: hemotrophic mycoplasmas, Hepatozoon sp., piroplasmas, Rickettsiales, wild carnivores 1 I. INTRODUÇÃO Doenças transmitidas por vetores artrópodes são mundialmente importantes para a saúde humana e animal. Diversos agentes infecciosos, hospedeiros e vetores estão envolvidos na epidemiologia destas enfermidades (HARRUS e BANETH, 2006). A emergência destas doenças representa novos desafios para a medicina humana e veterinária. Tais enfermidades estão ampliando sua distribuição geográfica, devido a mudanças climáticas e acesso a outros nichos ecológicos que não os habituais. A presença de animais domésticos em ambientes selvagens tem resultado em uma associação cada vez mais íntima entre reservatórios selvagens e vetores com o homem e animais domésticos. Tais fatos associados com o advento da biologia molecular, em particular o uso da Reação em Cadeia pela Polimerase, propiciaram o reconhecimento de enfermidades transmitidas por artrópodes (SHAW et al., 2001). Recentemente, diversos estudos têm sido realizados a fim de investigar o papel dos animais selvagens na epidemiologia das doenças causadas por agentes Anaplasmataceae. A identificação de reservatórios selvagens para estes hemoparasitas ajudaria no entendimento da epidemiologia das enfermidades por eles causadas, principalmente aquelas de caráter zoonótico. Ainda que anticorpos anti-Ehrlichia chaffeensis tenham sido detectados em amostras de soro de cães e humanos no Estado de Minas Gerais (COSTA et al., 2006), o agente até o momento só foi detectado, por meio de métodos moleculares, em amostras de sangue de cervos-do- Pantanal (Blastocerus dichotomus) (MACHADO et al., 2006). Recentemente, anticorpos anti-A. phagocytophilum foram detectados em eqüinos no Estado de São Paulo (SALVAGNI et al., 2010), sendo que a presença deste agente foi também confirmada molecularmente em amostras de sangue de cães no Rio de Janeiro (SANTOS et al., 2011) e aves carnívoras no Estado de São Paulo1. Esses achados ressaltam a necessidade de estudos mais aprofundados no que diz respeito à epidemiologia dos vetores, reservatórios e agentes envolvidos nestas enfermidades no Brasil, a fim de aumentar a efetividade do diagnóstico. A detecção molecular de Neorickettsia risticii em 1 MACHADO, R.Z. (Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, UNESP – Campus de Jaboticabal. Comunicação pessoal, 2011. 2 eqüinos, trematódeos e moluscos no Rio Grande do Sul (COIMBRA et al., 2005; 2006) e de Neorickettsia helminthoeca em cães no Paraná (HEADLEY et al., 2006) colocam em evidência a existência de ciclos epidemiológicos complexos envolvendo agentes Anaplasmataceae e vetores não-artrópodes no Brasil. A recente detecção molecular de Ehrlichia spp. em felídeos selvagens brasileiros mantidos em cativeiro em zoológicos do estado de São Paulo e Brasília abriu num novo campo de investigação a respeito de enfermidades transmitidas por carrapatos entre a fauna selvagem brasileira (ANDRÉ et al., 2010a). No que diz respeito à piroplasmas transmitidos por carrapatos, é de real importância a caracterização molecular destes agentes entre os animais selvagens, em função da similaridade morfológica verificada entre os mesmos e o potencial risco de introdução destes agentes em zoológicos, tendo em vista o transporte, importação e transferência destes animais. A ocorrência de óbitos em leões devido à infecção por Cytauxzoon sp. em um zoológico no Estado do Rio de Janeiro (PEIXOTO et al., 2007), demonstra a necessidade de se diagnosticar este agente em outros felídeos selvagens, os quais poderiam atuar como reservatórios deste hemoparasita ou serem susceptíveis à infecção. Protozoários do gênero Hepatozoon sp. diferenciam-se dos outros hemoparasitas uma vez que sua transmissão envolve a ingestão dos artrópodes vetores contendo oocistos. O significado primário da infecção por Hepatozoon sp. entre os carnívoros selvagens é desconhecido e sugere-se que tais animais possam atuar como reservatórios. No entanto, ainda é desconhecido se a doença é debilitante para estes animais e tampouco se aumenta a susceptibilidade dos mesmos a outras doenças. Ainda que hemoplasmas venham sendo detectados em felídeos selvagens da África, América do Norte, Europa e América do Sul (Brasil), atuando como possíveis reservatórios destes agentes, os micoplasmas hemotróficos ainda não foram detectados em canídeos selvagens. Embora as implicações da infecção por hemoparasitas sobre a conservação dos canídeos e felídeos selvagens sejam difíceis de serem estimadas, o presente trabalho mostra-se valioso uma vez que a maioria das espécies sob estudo encontra-se 3 atualmente ameaçada de extinção e, por este motivo, fazem parte de programas de reprodução em cativeiro no Brasil e no exterior. Carnívoros podem atuar como sentinelas para agentes transmitidos por artrópodes, uma vez que podem ser hospedeiros tanto para os agentes patogênicos quanto para os carrapatos vetores, além de possuir maior atividade e dispersão que outros hospedeiros de carrapatos. Por conseguinte, a identificação de agentes transmitidos por artrópodes em carnívoros selvagens poderá contribuir no futuro para o estabelecimento de áreas de risco para as enfermidades transmitidas por artrópodes para o homem e animais domésticos. Assim, o atual estudo propõe verificar se agentes transmitidos por artrópodes em animais domésticos circulam em populações de canídeos e felídeos selvagens mantidos em cativeiro no Brasil. Desta forma, permitirá a identificação de patógenos que, por ventura, deverão ser investigados em procedimentos de translocação, quarentena, manutenção e monitoramento destes animais selvagens, auxiliando na adoção de medidas de caráter preventivo para doenças transmitidas por vetores artrópodes. 4 II. REVISÃO DE LITERATURA 2.1. Infecções por agentes Anaplasmataceae 2.1.1. Agentes etiológicos Agentes Anaplasmataceae são bactérias gram-negativas, imóveis, intracelulares obrigatórias, cocóides a elipsoidais, residentes em fagossomos e que pertencem à Ordem Rickettsiales, Família Anaplasmataceae, subdivisão α das Proteobactérias, que causam doenças no homem e animais (WALKER e DUMLER, 1996; DUMLER et al., 2001; PADDOCK e CHILDS, 2003). São organismos que se mantém na natureza por interações complexas entre vetores invertebrados e hospedeiros vertebrados (DUMLER et al., 2001; PADDOCK e CHILDS, 2003). Compreendem espécies filogeneticamente relacionadas, porém genética e antigenicamente diferentes (YU et al., 2006). Dumler et al. (2001) propuseram uma reclassificação que divide os membros da ordem Rickettsiales em duas famílias: Rickettsiaceae (organismos intracitoplasmáticos pertencentes aos gêneros Rickettsia e Orientia) e Anaplasmataceae (organismos que ocupam vacúolos intracitoplasmáticos pertencentes aos gêneros Anaplasma, Ehrlichia, Neorickettsia e Wolbachia). As espécies Ehrlichia phagocytophila, Ehrlichia equi, o agente da HGE (Erliquiose Granulocítica Humana), Ehrlichia platys e Ehrlichia bovis foram agrupadas no gênero Anaplasma; E. canis, E. chaffeensis, E. ewingii, E. muris e Cowdria ruminantium no gênero Ehrlichia; E. sennetsu e E. risticii no gênero Neorickettsia; e Wolbachia pipientis no gênero Wolbachia. 2.1.2. Transmissão e Ciclo Biológico A E. canis, agente mais comum e patogênico da erliquiose canina, infecta leucócitos mononucleares, formando inclusões citoplasmáticas, chamadas mórulas. Estas inclusões, de aspecto compacto, são formadas por agrupados de pequenas estruturas que variam de forma cocóide a elipsoidal (RISTIC e HUXSOLL, 1984). Dentro do monócito, o desenvolvimento das mórulas inicia-se num único corpúsculo elementar dentro do monócito, que se multiplica formando inclusões citoplasmáticas imaturas, denominados corpúsculos iniciais, os quais se desenvolvem após 7 a 12 dias 5 de incubação, formando as mórulas. Neste estágio, muitos monócitos estão três a quatro vezes maiores que o seu tamanho original (NYINDO et al., 1971). O ciclo de desenvolvimento de Ehrlichia sp na célula hospedeira inicia-se com a adesão de pequenas células densamente coradas (CD), as quais acabam por penetrar na célula. Dentro de um vacúolo na célula hospedeira, as células-densas rapidamente se transformam em células reticuladas (CR), as quais se multiplicam por divisão binária por aproximadamente 48 horas e, então, após 72 horas de infecção, maturam e se transformam em células-densas novamente. Estas, por sua vez, são liberadas da célula hospedeira e recomeçam um novo ciclo de infecção (ZHANG et al., 2006). Em cães, o principal mecanismo de transmissão natural é pela picada do carrapato Rhipicephalus sanguineus que, ao se alimentar, inocula a bactéria, juntamente com a saliva, nos animais susceptíveis (EWING, 1969). O carrapato se infecta ao ingerir sangue contendo a bactéria, que é capaz de se multiplicar nos hemócitos, nas células das glândulas salivares e do intestino (SMITH et al., 1976). A transmissão ocorre de forma transestadial e não transovariana (GROVES et al., 1975; SMITH et al., 1976). Embora se acredite que a erliquiose felina seja transmitida por carrapatos, o vetor ainda não foi identificado. Ehrlichia chafeensis, agente etiológico da erliquiose monocítica humana, tem como seus principais vetores os carrapatos Amblyomma americanum, Dermacentor variabilis e Ixodes pacificus (WALKER et al., 2008). É encontrada parasitando cervos- de-cauda-branca (Odocoileus virginianus), cães, coiotes e cabras nas regiões sudeste e central-sul dos EUA e Califórnia (WALKER et al., 2008). No Brasil foi detectada em cervos-do-Pantanal (Blastocerus dichotomus) MACHADO et al., 2006) e aves carnívoras (MACHADO et al., 2012). Ehrlichia ewingii é transmitida pela picada do carrapato A. americanum, sendo encontrada parasitando cervos-de-cauda-branca e cães nas regiões sudeste e central- sul dos EUA e Califórnia (WALKER et al., 2008). Anaplasma phagocytophilum, agente etiológico da anaplasmose granulocítica humana, é transmitido pelo carrapato Ixodes scapularis na região norte dos EUA, tendo como principais hospedeiros o veado-de-cauda-branca, cães, eqüinos, esquilos e roedores. Na região da costa do Pacífico dos EUA, o agente é transmitido pelo 6 carrapato Ixodes pacificus, tendo como principais hospedeiros esquilos, roedores, eqüinos e alces. Na Europa, o carrapato Ixodes ricinus é o carrapato vetor do A. phagocytophilum, o qual pode ser encontrado em cervos, eqüinos, bovinos, gatos, ovelhas e roedores (WALKER et al., 2008). No Brasil, o agente foi detectado recentemente em cães no estado do Rio de Janeiro (SANTOS et al., 2011) e aves carnívoras (MACHADO et al., 2012). Neorickettsia helminthoeca, agente etiológico da doença do envenenamento pelo salmão, ocorre na região noroeste dos EUA e sul do Brasil (HEADLEY et al., 2011). Nos EUA, a doença é transmitida pela ingestão de salmão contendo metacercárias do trematódeo Nanophytes salmincola infectadas com N. helminthoeca. O caramujo Oxytrema silicula é o primeiro hospedeiro intermediário do trematódeo, onde ocorre os estágios de rédias e cercárias (HEADLEY et al., 2011). Neorickettsia risticii, agente etiológico da Febre do Rio Potomac, é transmitida pela ingestão de insetos contendo metacercárias de um trematódeo infectado. Gibson et al. (2005) verificaram que o trematódeo Acanthatrium oregonense é o vetor e reservatório da N. risticii. Cercárias deste trematódeo são encontradas parasitando caramujos da família Pleuroceridae, larvas de insetos e intestinos de morcegos (GIBSON et al., 2005). No Brasil, Coimbra et al. (2006) detectaram N. risticii em eqüinos no Rio Grande do Sul, apresentando sinais clínicos compatíveis com Febre do Rio Potomac. Nesta região, caramujos do gênero Heliobia sp. e cercárias Parapleurolophocecous cercariae foram positivas na PCR para N. risticii, indicando a possível participação de moluscos e trematódeos no ciclo biológico do parasita no Brasil (COIMBRA et al., 2005). 2.1.3. Epizootiologia da erliquiose e anaplasmose em carnívoros selvagens Quando raposas vermelhas (Vulpes fulva) e cinzas (Urocyon cinereoargenteus) foram experimentalmente infectadas com E. canis, não foram observados sinais clínicos de erliquiose. Por outro lado, sinais hematológicos (anemia moderada, trombocitopenia e leucopenia) foram observados na fase aguda da doença tanto em raposas vermelhas quanto cinzas experimentalmente infectadas com o agente da erliquiose monocítica canina. O parasita foi subsequentemente transmitido para cães por meio de 7 Rhipicephalus sanguineus alimentados em raposas infectadas experimentalmente (AMYX e HUXSOLL, 1973). Utilizando isolamento em cultura celular, Price e Karstad detectaram E. canis em 8/16 (50%) chacais (Canis mesomelas) de vida-livre no Kenia. Filhotes de cães, quando inoculados com sangue de chacais infectados, desenvolveram doença clínica, e E. canis foi isolada destes animais. Os chacais infectados se encontravam parasitados por carrapatos dos gêneros Rhipicephalus, Amblyomma e Haemaphysalis (PRICE e KARSTAD, 1980). Davidson et al. (1999) verificaram que raposas vermelhas (Vulpes vulpes), mas não raposas cinzas (Urocyon cinereoargenteus) são reservatórios potenciais para E. chaffeensis. Enquanto raposas cinzas mostraram-se refratárias à infecção experimental por E. chaffeensis, raposas vermelhas mostraram-se susceptíveis, sendo que o parasita foi isolado do sangue entre 7 e 14 dias pós-infecção, soroconverteram no 7º dia pós- infecção, e positivaram na PCR no 28º dia pós-infecção. As raposas permaneceram assintomáticas (DAVIDSON et al., 1999). Buoro et al. (1994) observaram em um leão adulto, em seu hábitat natural, a presença de carrapatos do gênero Haemaphysalis. O animal apresentava sintomatologia compatível com erliquiose e presença de mórulas características de Ehrlichia sp. em monócitos sangüíneos e em células mononucleares a partir de impressão de órgãos. Alexander et al. (1994) detectaram anticorpos anti-E. canis em apenas um (2%) chacal (Canis mesomelas) no Kenia, dentre uma amostra de 76 chacais de vida-livre. A partir de uma amostra de 53 chacais (Canis aureus syriacus) de vida livre de Israel, Waner et al. (1999) conduziram uma levantamento sorológico para agentes Anaplasmataceae. Anticorpos anti-E. canis foram detectados em 35,8% das amostras de soro. Vinte e seis por cento (26%) dos animais foram soropositivos para E. chafeensis, representando provavelmente reação cruzada com o antígeno de E. canis. Anticorpos anti-A. phagocytophilum foram detectados em 26% dos chacais, sendo que 5,7% mostraram-se soropositivos somente para o agente em questão (WANER et al., 1999). 8 Anticorpos anti-Anaplasma phagocytophilum foram detectados em 46/1550 (2,8%) raposas vermelhas (Vulpes vulpes) na Suíça (PUSTERLA et al., 1999). Com o objetivo de determinar o papel dos coiotes na epidemiologia da erliquiose monocítica e granulocítica na Califórnia, EUA, Pusterla et al. (2000) testaram 149 amostras de soro por meio da Reação de Imunofluorescência Indireta para agentes Anaplasmataceae. Sessenta e cinco coiotes (46%) foram soropositivos para A. phagocytophilum, dois (1%) para N. risticii; nenhum animal mostrou-se soropositivo para E. canis. Dois coiotes mostraram-se positivos na PCR para N. risticii. Um único animal mostrou-se positivo na PCR para o genogrupo A. phagocytophilum (PUSTERLA et al., 2000). Utilizando uma nested PCR, DNA de E. chaffeensis foi detectado em 15 (71%) coiotes (Canis latrans) das regiões central e norte do estado de Oklahoma, EUA (KOCAN et al., 2000b). Uma soroprevalência de 54,3% (25/46) frente ao antígeno de E. canis foi encontrada entre chacais (Canis aureus) em Israel (SHAMIR et al., 2001). Na Holanda, anticorpos anti-Ehrlichia sp. foram detectados em 13% de raposas vermelhas (Vulpes vulpes) (GROEN et al., 2002). Em Israel, a partir de uma amostra de 84 raposas vermelhas, 36% mostraram-se soropositivas para E. canis (FISHMAN et al., 2004). Na Califórnia, a distribuição geográfica de raposas cinzas sobrepõem a área de distribuição da anaplasmose granulocítica em humanos e animais domésticos (GABRIEL et al., 2009). Em uma amostragem de 70 raposas, 51% apresentaram-se soropositivas frente ao antígeno de A. phagocytophilum; seis raposas foram positivas na PCR para este agente. Raposas cinzas podem atuar como sentinelas da infecção por A. phagocytophilum na Califórnia (GABRIEL et al., 2009). Uma soroprevalência de aproximadamente 4% foi encontrada em linces (Lynx lynx) da Suíça frente ao antígeno de A. phagocytophilum, sugerindo que estes animais são expostos ao agente da erliquiose granulocítica humana (RYSER-DIGIORGIS et al., 2005). Filoni et al. (2006) detectaram alto título de anticorpos anti-E. canis (20480) em uma suçuarana brasileira (Puma concolor) de vida livre. 9 Recentemente, DNA de Ehrlichia sp., filogeneticamente relacionada (99%) à amostras encontradas no Japão e Rússia e também à E. ruminantium (98,7%), foi detectado em duas onças de vida-livre no Pantanal Mato-Grossense (WIDMER et al., 2011). Ainda neste estudo, anticorpos anti-E. canis foram encontradas em 4 das 10 onças amostradas. A presença de DNA de A. phagocytophilum foi detectada em oito pumas na Califórnia. Dos 47 animais analisados, 16% mostraram-se soropositivos frente ao antígeno de A. phagocytophilum. Dezenove por cento (19%) dos "pools" de carrapatos ingurgitados coletados desses animais foram positivos na PCR (FOLEY et al., 1999). 2.1.4. Sinais clínicos, laboratoriais e achados patológicos Após um período de incubação de 8 a 20 dias, na fase aguda da erliquiose canina por E. canis, são observados febre, descarga oculonasal, anorexia, depressão, perda de peso e linfadenopatia, anemia, trombocitopenia e contagem leucocitária variável (CASTRO et al., 2004; NAKAGHI et al., 2008). Na fase subclínica (com duração variando entre 40 e 120 dias), ocorre ausência de sinais clínicos, porém as alterações laboratoriais persistem, principalmente trombocitopenia e hipergamaglobulinemia. A fase crônica é caracterizada por perda de peso, pobre condição corporal, supressão da medula óssea, levando à anemia crônica, leucopenia e trombocitopenia, tendências hemorrágicas (epistaxe, melena, petéquias, equimoses, hifema, hemorragia retiniana e hematúria), uveíte anterior (ORIÁ et al., 2004) e alterações neurológicas (ataxia, paraparesia, déficit proprioceptivo, nistagmo, convulsão) (COHN, 2003). Na erliquiose por E. ewingii, claudicação, dores e edemas articulares são observados (COHN, 2003). Na erliquiose por E. chaffeensis e A. phagocytophilum, doença clínica moderada é a forma mais frquentemente observada. Trombocitopenia cíclica moderada a severa é encontrada na infecção por A. platys em cães (WOODY e HOSKINS, 1991; COHN, 2003). Cães infectados com N. helminthoeca apresentam febre, depressão, perda de peso, desidratação, anorexia, polidpsia, vômitos, diarréia sanguinolenta e linfadenopatia (HEADLEY et al., 2011). Felídeos infectados por E. canis apresentam febre, apatia, anorexia, perda de peso, palidez de mucosas, linfadenomegalia, esplenomegalia, anemia normocítica e 10 normocrômica, trombocitopenia, leucopenia, aumento da atividade sérica das transaminases e fosfatase alcalina e hiperglobulinemia (BUORO et al., 1989; BUORO et al., 1994; BOULOY et al., 1994; PEAVY et al., 1997; ALMOSNY et al., 1998; ALMOSNY e MASSARD, 1999; STUBBS et al., 2000; SHAW, 2001; BREITSCHWERDT et al., 2002). Gatos experimentalmente infectados por N. risticii apresentam diarréia intermitente, linfadenopatia, depressão aguda e anorexia entre 20 e 24 dias após inoculação (DAWSON et al., 1988). Já a infecção por A. phagocytophilum em felinos é caracterizada por hiperestesia, mialgias, artralgias, rigidez de pescoço, claudicação, incoordenação, neutrofilia com desvio a esquerda, linfopenia, além dos outros sinais clínico-laboratoriais comuns à erliquiose canina (BJOERSDORFF et al., 1999; TARELLO, 2005). 2.1.5. Achados patológicos Os principais achados patológicos na erliquiose canina são caracterizados por hemorragias petequiais e hemorrágicas, hiperplasia reticuloendotelial generalizada, edema, infiltração plasmocítica em diversos órgãos, lesões renais (vasculite) e pneumonia intersticial (WOODY e HOSKINS, 1991; CASTRO et al., 2004). Poucos são os relatos de achados de necropsia em felinos portadores de erliquiose clínica. Sinais de caquexia, emaciação, diarréia, distúrbio congestivo hemorrágico, notavelmente nos pulmões, foram achados anátomo-patológicos em gatos jovens inoculados experimentalmente com E. canis (ALMOSNY e MASSARD, 2002). Observações a partir de biópsias de linfonodos mesentéricos revelaram um infiltrado inflamatório (neutrófilos e macrófagos), caracterizando uma linfadenite piogranulomatosa (BOULOY et al., 1994). 2.1.6. Diagnóstico O uso de esfregaços citológicos a partir da camada leucocitária e linfonodos podem levar a um diagnóstico definitivo de infecções por agentes Anaplasmataceae, em sua fase aguda. Mórulas devem ser diferenciadas de estruturas intra e extracelulares semelhantes a elas, a fim de evitar diagnósticos falso-positivos, tais como: plaquetas, material nuclear fagocitado em monócitos, grânulos azurófilos em 11 linfócitos e corpos linfoglandulares (MYLONAKIS et al., 2003; DAGNONE et al., 2009). A detecção direta por meio de esfregaços sangüíneos é uma técnica rápida e confirmatória, porém de baixa sensibilidade; além do baixo número de células com mórulas, a sensibilidade é afetada pela experiência do microscopista e pelo baixo número de esfregaços e células examinadas (PADDOCK e CHILDS, 2003; MYLONAKIS et al., 2003; PASSOS et al., 2005; DAGNONE et al., 2009). Embora os testes sorológicos sejam os mais freqüentemente utilizados para o diagnóstico da erliquiose e anaplasmose, sabe-se que as várias espécies da família Anaplasmataceae dividem antígenos em comum, gerando reações cruzadas. Dessa forma, são requeridas interpretação cuidadosa e correlação dos testes diagnósticos com achados clínicos e epidemiológicos para evitar designação incorreta do agente em questão. A sorologia pode resultar em resultados negativos durante a primeira semana de infecção (WALKER e DUMLER, 1996; WANER et al., 2001; PADDOCK e CHILDS, 2003) e não distingue uma infecção corrente de uma exposição sem estabelecimento de infecção ou infecção prévia (SHAW, 2001). Existe ainda uma considerável variação entre laboratórios em relação à interpretação de títulos sorológicos (SHAW et al., 2001). A PCR em combinação com a RIFI traz um diagnóstico rápido e coerente da erliquiose (IQBAL et al., 1994; NAKAGHI et al., 2008; FARIA et al., 2010). A realização de uma PCR, amplificando DNA de todas as espécies Anaplasmataceae seguida por seqüenciamento, é uma ferramenta útil para o estudo epidemiológico da infecção por esses agentes em carrapatos e vertebrados (INOKUMA et al., 2001b). Sempre que possível, fragmentos amplificados pela PCR devem ser seqüenciados para confirmar a validade dos resultados da PCR quando o ensaio está sendo feito para diferenciar espécies Anaplasmataceae, particularmente quando a PCR é aplicada a amostras derivadas de várias espécies animais (HANCOCK et al., 2001; MASSUNG e SLATER, 2003; DAGNONE et al., 2009). 2.1.7. Tratamento Tetraciclina e doxiciclina são drogas de escolha para o tratamento da erliquiose canina e felina (WOODY e HOSKINS, 1991; COHN, 2003; BREITSCHWERDT et al., 2002; LAPPIN et al., 2004). 12 2.1.8. Erliquiose humana A erliquiose humana vem ganhando especial atenção como um problema de saúde pública e é causada por E. chaffeensis, E. canis, E. ewingii, N. sennetsu e A. phagocytophilum (WALKER e DUMLER, 1996; DUMLER et al., 2001; UNVER et al., 2001; PADDOCK e CHILDS, 2003; TAMÍ e TAMÍ-MAURY, 2004; PAROLA et al., 2005; WORMSER et al., 2006). No Brasil, os primeiros casos suspeitos de erliquiose humana foram descritos no estado de Minas Gerais, por meio de sintomatologia clínica compatível e sorologia positiva para E. chaffeensis (CALIC et al., 2004; COSTA et al., 2005; COSTA et al., 2006). 2.2. Infecções por micoplasmas hemotróficos (hemoplasmas) 2.2.1. Agentes etiológicos Micoplasmas hemotróficos são bactérias fastidiosas, de reduzido tamanho e genoma, com ausência de parede celular e flagelo, resistentes à penicilina e susceptíveis à tetraciclina e que infectam eritrócitos, permanecendo ligadas à superfície destas células. Felinos podem ser parasitados por Mycoplasma haemofelis, Candidatus Mycoplasma haemominutum e Candidatus Mycoplasma turicensis. Canídeos, por sua vez, podem ser parasitados por Mycoplasma haemocanis e Candidatus Mycoplasma haematoparvum. Hemoplasmas felinos mostram uma relação filogenética muito próxima com hemoplasmas de canídeos e roedores. Sequências derivadas do gene 16S rRNA de Candidatus M. turicensis mostram alto grau de identidade com M. cocoides (92%) e M. haemomuris (90%) (WILLI et al., 2005). Mycoplasma haemofelis e Candidatus M. haemominutum mostram 99% e 94% de identidade com M. haemocanis e M. haematoparvum, respectivamente (BIRKENHEUER et al., 2002; SYKES et al., 2005). 2.2.2. Transmissão Felinos machos, com acesso à rua e de idade mais avançada são considerados fatores de risco para hemoplasmoses. O contato social é também considerado, por muitos autores, como um fator de risco. Candidatus Mycoplasma haemominutum e 13 Candidatus Mycoplasma turicensis já foram detectados em saliva de gatos, embora a transmissão por meio da inoculação de saliva infectada subcutaneamente em gatos não tenha surtido efeito (DEAN et al., 2008; MUSEAUX et al., 2009). Assim, o contato social pode ser considerado uma forma de transmissão dos hemoplasmas se interações agressivas (brigas) são observadas, e ainda, se ocorrer inoculação de sangue infectado (por meio de mordidas, por exemplo) (MUSEAUX et al., 2009). Candidatus Mycoplasma haemominutum e M. haemofelis foram detectados em Ctenocephalides felis coletadas de gatos e em fezes destas pulgas (LAPPIN et al., 2006; SHAW et al., 2004; WOODS et al., 2005). Embora a pulga Ctenocephalides felis seja incriminada como vetor dos hemoplasmas, estudos experimentais conduzidos não trouxeram resultados consistentes, onde se verificou que somente um de seis gatos tornaram-se PCR positivos após serem expostos a pulgas positivas na PCR para M. haemofelis (WOODS et al., 2005). A ingestão de pulgas infectadas com M. haemofelis ou Candidatus M. haemominutum ou de seus produtos (fezes, ovos ou larvas) não transmitiu os parasitas para gatos (WOODS et al., 2006). DNA de Candidatus M. haemominutum foi detectado em carrapatos Ixodes ovatus no Japão (TAROURA et al., 2005). DNA de M. haemofelis e Candidatus M. haemominutum foi detectado em Rhipicephalus sanguineus parasitando leões na Tanzânia (FYUMAGWA et al., 2008). O carrapato R. sanguineus além de transmitir experimentalmente M. haemocanis, também atua como reservatório do parasita, uma vez que é observada transmissão transovariana e transestadial nesta espécie de artrópode (SENEVIRATNA et al., 1973). Ainda, a associação entre presença de ectoparasitas, acesso ao ambiente peridomiciliar e infecção por hemoplasmas reforça a hipótese de que tais agentes sejam transmitidos por artrópodes vetores (MESSICK, 2003; WILLI et al., 2007a; SYKES, 2010; TASKER, 2010). Outras formas de transmissão da hemoplasmose incluem: transfusão sanguínea; transmissão vertical durante a prenhez e horizontal durante o nascimento ou lactação; e transmissão iatrogênica (MESSICK, 2003; WILLI et al., 2007a; SYKES, 2010; TASKER, 2010). 14 2.2.3. Epizootiologia da hemoplasmose em carnívoros selvagens Infecções por hemoplasmas têm sido reportadas em felinos no mundo todo. Por outro lado, micoplasmas hemotróficos têm sido detectados em felídeos selvagens de vida-livre e de cativeiro da América do Norte (tigres), Europa (linces ibéricos e gatos- selvagens europeus), África (leões) e América do Sul (jaguatiricas, gatos-maracajá, leões, gatos-do-mato-grande, gatos-do-mato-pequeno e suçuaranas) (HAEFNER et al., 2003; GUIMARÃES et al., 2007; WILLI et al., 2007b). Co-infecção com mais de uma espécie de hemoplasma tem sido reportada entre felídeos selvagens (WILLI et al., 2007b). Hemoplasmas são mais frequentemente encontrados em felídeos selvagens de vida livre, quando comparados àqueles de cativeiro. Felídeos selvagens de vida livre apresentam maior chance de exposição a artrópodes vetores hematófagos e maior atividade em brigas, favorecendo desta forma a transmissão dos micoplasmas hemotróficos (WILLI et al., 2007b). 2.2.4. Sinais Clínicos Os sinais clínicos da hemoplasmose estão na dependência do agente etiológico, estágio da doença e da presença de doença concomitante (MESSICK, 2003; WILLI et al., 2007a; SYKES, 2010; TASKER, 2010). Infecções agudas com M. haemofelis são caracterizadas por crises hemolíticas fatais, inclusive em felinos domésticos imunocompetentes. Sinais clínicos típicos incluem: palidez, letargia, fraqueza, taquicardia, taquipnéia, esplenomegalia, linfadenopatia e ocasionalmente icterícia. Pico de parasitemia e mínimo volume corpuscular médio (VCM) são observados 2 semanas após a infecção, sendo que alguns gatos mostram rápidas flutuações na bacteremia ao longo do tempo. Essa flutuação no número de parasitas é devido a alterações antigênicas que promovem o destacamento do parasito da superfície do eritrócito (MESSICK, 2003; WILLI et al., 2007a; SYKES, 2010; TASKER, 2010). Candidatus M. haemominutum usualmente não provoca diminuição significativa do VCM, sendo que a queda no VCM é reportada em gatos co-infectados com retrovírus ou sob quimioterapia. Máxima bacteremia é observada 4-5 semanas após 15 infecção, sendo que flutuações na contagem de parasitas não é verificada ao longo do tempo (MESSICK, 2003; WILLI et al., 2007a; SYKES, 2010; TASKER, 2010). O potencial patogênico de Candidatus M. turicensis parece depender de co- fatores, tais como imunossupressão ou co-infecção com outros hemoplasmas. A anemia geralmente é moderada. O pico de bacteremia se dá entre 14 e 18 dias pós- infecção e flutuação na quantidade de hemoplasmas não é verificada (MESSICK, 2003; WILLI et al., 2007a; SYKES, 2010; TASKER, 2010). Felinos infectados com hemoplasmas podem permanecer como carreadores crônicos por meses a anos, mesmo quando tratados com antibióticos. Estes carreadores aparentemente saudáveis podem atuar como fonte de infecção para outros gatos, sendo que a reativação da doença tem sido raramente documentada. O estado de carreador é comumente encontrado com Candidatus M. haemominutum, porém é menos freqüente em infecções por M. haemofelis. Por outro lado, “clearance” da infecção por Candidatus M. turicensis tem sido reportada (MESSICK, 2003; WILLI et al., 2007a; SYKES, 2010; TASKER, 2010). Em cães, infecções por M. haemocanis são caracterizadas pela presença de grande número de eritrócitos parasitados e rápido desenvolvimento de anemia, a qual é mais frequentemente encontrada em cães imunocomprometidos, esplenectomizados ou com infecções intercorrentes (erliquiose, babesiose, etc). Os sinais clínicos incluem anorexia, letargia, perda de peso e febre. O VCM pode chegar a 11%. Geralmente, cães se recuperam da infecção, porém permanecem cronicamente infectados. Na forma crônica da infecção, os parasitas são encontrados raramente na circulação e em baixos números. Anemia moderada, leucopenia e pica são sinais que podem ser observados na fase crônica da infecção (MESSICK, 2003; WILLI et al., 2007a; SYKES, 2010; TASKER, 2010). 2.2.5. Achados laboratoriais Hemoplasmoses são caracterizadas por hemólise extravascular, gerando uma anemia regenerativa, macrocítica e hipocrômica, reticulocitose, anisocitose, policromasia, corpúsculos de Howell-Jolly e algumas vezes aumento do número de células vernelhas nucleadas. Alguns gatos mostram discreto grau de regeneração 16 devido à fase inicial da anemia ou infecção retroviral concomitante (MESSICK, 2003; WILLI et al., 2007a; SYKES, 2010; TASKER, 2010). Vários mecanismos têm sido propostos para explicar a origem da anemia e hemólise na hemoplasmose. A simples presença dos hemoplasmas na superfície das hemácias por si só gera danos à membrana destas células. Anticorpos anti- hemoplasmas podem atingir as hemácias, ou ainda, podem ser direcionados para a superfície destas próprias células, devido a uma modificação antigênica induzida pela presença dos parasitas (MESSICK, 2003; WILLI et al., 2007a; SYKES, 2010; TASKER, 2010) Bioquímica sérica revela hiperbilirrubinemia, hiperproteinemia e aumento dos níveis séricos de enzimas hepáticas (decorrente do dano hipóxico). Positividade nos testes de aglutinação em solução salina e de Coomb´s também são reportados (MESSICK, 2003; WILLI et al., 2007a; SYKES, 2010; TASKER, 2010). 2.2.6. Diagnóstico O método mais comumente utilizado para diagnóstico da hemoplasmose é a demonstração de organismos na superfície dos eritrócitos por meio da microscopia de luz de esfregaços sanguíneos. As colorações do tipo Romanowsky (Giemsa, May- Grunwald-Giemsa, Wright e Wright-Giemsa) são as mais frequentemente utilizadas. Os organismos são tipicamente encontrados na periferia das hemácias, podendo ser encontrados na forma única, em pares, ou em cadeias em severas infestações. Ocasionalmente, podem ser vistos livre dos eritrócitos. Mycoplasma haemocanis, por sua vez, pode aparecer também na forma de cadeias divididas (forma de “Y” ou de violino) (TASKER e LAPPIN, 2002; MESSICK, 2003; WILLI et al., 2007a; SYKES, 2010; TASKER, 2010). Diagnóstico diferencial deve ser feito com anemia hemolítica imunomediada, outras causas de anemia (peritonite infecciosa felina, cytauxzoonose e infecções retrovirais), anemia hemolítica por corpúsculos de Heinz, desordens eritrocíticas tais como deficiência de piruvato quinase, e desordem de fragilidade eritrocítica de gatos abissímios e somali (TASKER e LAPPIN, 2002; MESSICK, 2003; WILLI et al., 2007a; SYKES, 2010; TASKER, 2010). 17 A detecção citológica por meio de esfregaços sanguíneos apresenta pobre sensibilidade. Mycoplasma hemofelis é visibilizado em menos de 50% das vezes em gatos em fase aguda da doença, considerando o fato que os parasitas podem desaparecer por vários dias antes de reaparecer nos esfregaços sanguíneos durante o curso da infecção. A escolha por esfregaços sanguíneos frescos é imperativa, uma vez que os parasitas se destacam das hemácias na presença de EDTA. Candidatus M. turicensis nunca foi observado em esfregaços sanguíneos. Candidatus M. haemominutum geralmente não é visível em esfregaços sanguíneos de gatos cronicamente infectados e, embora de tamanho menor que M. haemofelis, a diferenciação morfológica entre ambos é difícil (TASKER e LAPPIN, 2002; MESSICK, 2003; WILLI et al., 2007a; SYKES, 2010; TASKER, 2010). Resultados falso-positivos podem ocorrer com precipitados de corante, corpúsculos de Howell-Jolly (remanescentes nucleares com 1-2μm), corpúsculos de Pappenheimer (agregados de acumulação de ferro) e artefatos refráteis (umidade aderente às células) (TASKER e LAPPIN, 2002; MESSICK, 2003; WILLI et al., 2007a; SYKES, 2010; TASKER, 2010). A coloração pelo orange de acridina e a Imunofluorescência Direta são métodos mais sensíveis que a coloração pelo Romanowsky. O corante orange de acridina se combina especificamente com ácidos nucléicos, corando os micoplasmas em laranja brilhante. Corpúsculos de Howell-Jolly também se coram pelo orange de acridina (TASKER e LAPPIN, 2002; MESSICK, 2003; WILLI et al., 2007a; SYKES, 2010; TASKER, 2010). Atualmente, a PCR é o método de escolha para o diagnóstico de infecções por hemoplasmas. As PCRs descritas na literatura amplificam os gene 16S rRNA (BERENT et al., 1998) e rnpB (subunidade β da RNA polimerase) (BIRKENHEUER et al., 2002). A PCR em tempo real permite a quantificação do DNA de hemoplasmas no sangue de animais, facilita a verificação da resposta ao tratamento e previne riscos de contaminação por produtos de PCR (TASKER e LAPPIN, 2002; MESSICK, 2003; WILLI et al., 2007a; SYKES, 2010; TASKER, 2010). Felinos domésticos que recebem antibioticoterapia apresentam resultados negativos na PCR dentro de poucos dias após tratamento, porém resultados positivos 18 são verificados novamente uma semana após o término do tratamento (FOLEY et al., 1998). Desta forma, amostras de sangue direcionadas à PCR para hemoplasmas devem ser coletadas antes de iniciada a antibioticoterapia (WILLI et al., 2007a). Considerando o fato de que os hemoplasmas ainda não foram cultivados in vitro, testes sorológicos baseados em proteínas do parasita ainda não fazem parte da rotina de diagnóstico desta enfermidade. Experimentalmente, anticorpos anti-M. haemofelis foram detectados 21 dias pós-infecção pela imunofluorescência indireta e persistiram seis meses após a cura clínica (FOLEY et al., 1998). Recentemente, tentativas de expressão de antígenos recombinantes vem sendo desenvolvidas a fim de permitir o diagnóstico sorológico destes agentes (MESSICK e SANTOS, 2011). 2.2.7. Tratamento O tratamento é indicado para animais com sinais clínicos e laboratoriais compatíveis com hemoplasmose. O tratamento de animais positivos na PCR, porém assintomáticos, não é recomendado, já que os tratamentos existentes não eliminam totalmente os parasitas. O protocolo de tratamento para hemoplasmose é doxiciclina (10mg/kg/dia PO) durante, no mínimo, duas semanas, acompanhado de transfusão sanguínea quando necessário. Para gatos, em função do potencial de esofagite causado pelo uso de doxiciclina, a ingestão do antibiótico deve ser seguida pela ingestão de grande quantidade de água. O uso de doses imunossupressivas de glicocorticóides para supressão de uma anemia hemolítica imunomediada é controverso, uma vez que glicocorticóides podem causar a reativação de uma infecção latente, porém é indicado em casos de gatos que falham em responder somente à antibioticoterapia, ou em casos nos quais o diagnóstico é incerto (TASKER e LAPPIN, 2002; MESSICK, 2003; WILLI et al., 2007a; SYKES, 2010; TASKER, 2010). 2.2.8. Hemoplasmose em humanos No Brasil, Mycoplasma haemofelis e Bartonella henselae foram detectados no sangue de um paciente humano HIV-positivo hospitalizado (DOS SANTOS et al., 2008). Dois dos cinco gatos pertencentes ao paciente foram também positivos para M. haemofelis; os cinco gatos estavam infectados por B. henselae. Hemoplasmas podem, 19 possivelmente, atuar como um agravante em pacientes imunocomprometidos (DOS SANTOS et al., 2008). 2.3. Infecções por Babesia sp. 2.3.1. Agentes etiológicos A babesiose, causada pela infecção de protozoários parasitas apicomplexos intra-eritrocíticos pertencentes ao gênero Babesia, é uma das infecções mais comuns de animais de vida livre em todo o mundo. Embora capaz de infectar uma grande variedade de vertebrados, as babesias requerem hospedeiros vertebrados e invertebrados para a manutenção do seu ciclo de transmissão. Os parasitas replicam-se nas hemácias dos hospedeiros vertebrados e são chamadas de piroplasmas devido à sua aparência de dupla pêra (HOMER et al., 2000). Grandes e pequenos piroplasmas têm sido reportados em vários carnívoros selvagens e domésticos (PENZHORN, 2006; UILENBERG, 2006). Freqüentemente, os relatos são uma mera documentação de organismos vistos em esfregaços sangüíneos realizados randomicamente em animais sadios e, em uma minoria de casos, são incriminados como agentes causadores de doenças em seus hospedeiros. A nomenclatura e descrição dos hematozoários são inadequadas aos padrões atuais e a maioria dos parasitos tem sido nomeada de acordo com seu hospedeiro (UILEMBERG, 2006). Em contraste com essas descrições informais do passado, a definição e identificação atual de espécies têm se tornado muito mais rigorosas, sendo suportada principalmente por caracterizações moleculares (PENZHORN, 2006), uma vez que a mera evidência sorológica também seja insuficiente (LOPEZ-REBOLLAR et al., 1999). Felídeos domésticos podem ser parasitados por Babesia felis (DAVIS, 1929), B. cati (MUDALIAR et al., 1950), B. canis canis (CRIADO-FORNELIO et al., 2003a,b) e B. canis presentii (BANETH et al., 2004). Já os felídeos selvagens podem ser parasitados por B. felis (DAVIS, 1929), B. herpailuri (DENNIG, 1967), B. pantherae (DENNIG e BROCKLESBY, 1972), B. leo (LOPEZ-REBOLLAR et al., 1999; PENZHORN et al., 2001) e por piroplasmas não identificados encontrados em chitas (Acinonyx jubatus) (AVERBECK et al., 1990) e pumas (YABSLEY et al., 2006). 20 Morfologicamente, as babesias são classificadas em pequenos piroplasmas (< 1,5 μm) e grandes piroplasmas (>2,5 μm). Pequenos piroplasmas encontrados em felinos incluem B. felis e B. leo. Babesia cati, B. pantherae, B. canis canis, B. canis presentii e B. herpailuri são exemplos de grandes piroplasmas encontrados em felinos (YABSLEY et al., 2006). Baseado em análises moleculares, os piroplasmas são classificados em quatro grandes grupos: 1) Babesia sensu stricto (as “verdadeiras” babesias); 2) Theileria e Cytauxzoon; 3) piroplasmas de humanos e de animais selvagens; e 4) B. microti e pequenas babesias (KJEMTRUP et al., 2000). As duas subespécies de B. canis encontradas em felinos domésticos são posicionadas no grupo das verdadeiras babesias (grupo 1) (CRIADO-FORNELIO et al., 2003b; BANETH et al., 2004). Já os piroplasmas de felídeos africanos (B. leo e B. felis) e a espécie relacionada à B. microti (referida como T. annae) encontrada em Portugal, são inclusas no grupo das pequenas babesias/ B. microti (PENZHORN et al., 2001). A relação filogenética entre B. pantherae e B. herpailuri com outros piroplasmas ainda é desconhecida (YABSLEY et al., 2006). 2.3.2. Babesia canis Em cães, é muito comum a infecção concomitante por E. canis e B. canis (TROY e FORRESTER, 1990; TABOADA, 1998; OLIVEIRA et al., 2008). A babesiose canina, uma doença hemolítica com distribuição mundial e com significância global, é causada por grandes piroplasmas descritos como B. canis e por pequenos parasitas agrupados sob a denominação de B. gibsoni (BOOZER e MACINTIRE, 2003). A Babesia canis é um grande piroplasma (3-5 μm), com formato piriforme e que geralmente ocorre aos pares dentro dos eritrócitos dos hospedeiros (LOBETTI, 1998; BOOZER e MACINTIRE, 2003). Três subespécies de B. canis têm sido descritas com base em diferenças nas síndromes clínica e patológica causadas por cada subespécie, propriedades antigênicas, transmissão por diferentes carrapatos vetores e caracterização genética. Babesia canis rossi, descrita na África do Sul, é transmitida pelo carrapato Haemaphysalis leachi e causa uma doença hemolítica severa e freqüentemente fatal em cães. Babesia canis vogeli é encontrada no Oriente Médio, Norte da África, Europa, Ásia, Austrália e América do Sul e é transmitida pelo 21 Rhipicephalus sanguineus, induzindo normalmente uma doença de sinais clínicos moderados em cães. Babesia canis canis, descrita na Europa, é transmitida pelo carrapato Dermacentor reticulatus e causa anemia hemolítica com variados graus de severidade e anormalidades da coagulação (UILENBERG et al., 1989; ZAHLER et al., 1998; CARRET et al., 1999; BOOZER e MACINTIRE, 2003; PASSOS et al., 2005). No Brasil, confirmou-se molecularmente que cães podem ser parasitados por B. canis vogeli (PASSOS et al., 2005; SPOLIDORIO et al., 2011) e B. gibsoni (TRAPP et al., 2006). 2.3.3. Ciclo Biológico da Babesia canis Em cães, a Babesia canis, assim como a Ehrlichia canis, é transmitida pelo carrapato Rhipicephalus sanguineus, o qual é considerado reservatório para B. canis vogeli, mas não para E. canis. A presença de cães infectados é necessária para a manutenção da E. canis em uma população de carrapatos já que não ocorre transmissão vertical nestes artrópodes (NEER, 1998). B. canis vogeli, entretanto, pode ser transmitida por via transovariana e ser passada para a próxima geração de carrapatos na ausência de cães infectados (LOBETTI, 1998; TABOADA, 1998; BOOZER e MACINTIRE, 2003). Embora se acredite que a babesiose felina seja transmitida por carrapatos, o vetor ainda não foi identificado (PENZHORN et al., 2004). No momento do repasto sangüíneo, o carrapato infectado inocula no cão, esporozoítas presentes nas glândulas salivares. Estes se aderem à membrana do eritrócito e, por endocitose, penetram na hemácia multiplicando-se por divisão binária, resultando na formação de merozoítas. Podem-se encontrar hemácias com até dezesseis merozoítas, mas o mais comum é que se observe um ou um par dos mesmos. Para que outras hemácias sejam parasitadas, os merozoítas deixam as células hospedeiras, encontrando-se livres na corrente sangüínea, por um curto período, e invadem outros eritrócitos (LOBETTI, 1998; TABOADA, 1998). Ao ingerir o sangue de um cão parasitado, o carrapato infecta-se com eritrócitos contendo diferentes estágios evolutivos da B. canis. Nas células intestinais do carrapato, as formas não assexuadas se degeneram, e os gametócitos transformam-se em gametas e, então, em corpos raiados. Após a fusão dos gametas masculino e feminino, os 22 zigotos assim formados se transformam em cinetos móveis. Essas formas evolutivas atravessam a parede intestinal, caem na cavidade geral do artrópode e, por esporogonia, transformam-se em esporocinetos, infectando vários órgãos do carrapato, incluindo as glândulas salivares e ovários. A esporogonia continua nas glândulas salivares e nas larvas oriundas de ovos infectados, dando origem a milhares de esporozoítas, que serão transmitidos a outros hospedeiros por ocasião do repasto sangüíneo (KAKOMA e MEHLHORN, 1994; BORDEAU e GUELFI, 1995; TABOADA, 1998; MARQUARDT et al., 2000). 2.3.4. Epizootiologia da babesiose em carnívoros selvagens DAVIS (1929) descreveu, pela primeira vez, a presença de um pequeno piroplasma, nomeado Babesia felis, parasitando um gato selvagem africano (Felis silvestris) do Sudan. O parasita foi então transmitido a felinos domésticos, embora não tenha causado doença clínica (DAVIS, 1929). Posteriormente, o mesmo agente foi incriminado como o agente causador de um quadro clínico severo em felinos domésticos na África do Sul (FUTTER e BELONJE, 1980a). Babesia herpailuri, uma grande babesia, foi isolada de uma espécie sul- americana, o gato-mourisco (Herpailurus yagouaroundi) (DENNIG, 1967). Uma Babesia não identificada, com formas simples, pareadas ou agrupadas, geralmente com ângulos agudos, foi observada em esfregaços sangüíneos de um gato do Zimbábue com anemia. A morfologia do referido parasita aproximou-se, dentre todas as demais espécies de Babesia encontradas em felídeos, com a de B. herpailuri (STEWART et al., 1980). Averbeck et al. (1990) encontraram um piroplasma morfologicamente semelhante à Theileria felis em 123 leões e oito chitas da Tanzânia. No Parque Nacional Kruger, na África do Sul, por meio de um programa de monitoramento de cães selvagens (Lycaon pictus), trofozoítos de B. canis foram encontrados em esfregaços sanguíneos de dois animais (VAN HEERDEN et al., 1995). Ainda, um caso de babesiose fatal foi reportado em um filhote de cão selvagem (Lycaon pictus) na África do Sul. O animal apresentava palidez de mucosas, icterícia, respiração laboriosa, esplenomegalia, anemia e hemoglobinúria. O diagnóstico foi confirmado por 23 meio da presença da observação de Babesia sp. em esfregaços sanguíneos do animal. A despeito do tratamento, o animal veio a óbito (COLLY e NESBIT, 1992). Um pequeno piroplasma foi detectado em esfregaços sangüíneos de 47 leões (Panthera leo) da África do Sul, cujos soros foram negativos frente ao antígeno de Babesia felis. A partir do sangue desses animais, reproduziu-se a infecção em um leão, em um gato e um leopardo, sendo que nos dois últimos foram encontrados piroplasmas nos esfregaços sangüíneos. Os autores acreditaram tratar-se de uma nova espécie de Babesia, morfologicamente similar a B. felis e C. felis, mas antigenicamente distinta (LOPEZ-REBOLLAR et al., 1999). PENZHORN et al. (2001), através de análises filogenéticas, nomearam de Babesia leo este novo piroplasma isolado dos leões. Coiotes (Canis latrans), quando experimentalmente infectados com B. gibsoni, mostraram sinais clínico-laboratoriais característicos de babesiose, tais como palidez de membranas mucosas, depressão, inapetência, anemia regenerativa, trombocitopenia e neutropenia. A presença de sinais clínicos moderados associada à alta parasitemia (1- 11%) de longa duração (detectável até 20 semanas pós-infecção) sugere que os coiotes possam ser reservatórios para B. gibsoni (EVERS et al., 2003). Yabsley et al. (2006) utilizaram uma nested PCR baseada na porção 18S rRNA