RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta dissertação será disponibilizado somente a partir de 23/07/2018. Instituto de Biociências - Seção Técnica de Pós-Graduação Distrito de Rubião Júnior s/n CEP 18618-970 Cx Postal 510 Botucatu-SP Brasil Tel (14) 3880-0780 posgraduacao@ibb.unesp.br PG-BGA Campus de Botucatu Regulação da Osteoglicina pelo microRNA-22 durante a miogênese CARLOS AUGUSTO BARNABE ALVES Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências, Campus de Botucatu, UNESP, para obtenção do título de Mestre no Programa de Pós-Graduação em Biologia Geral e Aplicada, Área de concentração Biologia celular estrutural e funcional. Orientadora: Profa. Dra. Maeli Dal Pai BOTUCATU – SP 2016 Instituto de Biociências - Seção Técnica de Pós-Graduação Distrito de Rubião Júnior s/n CEP 18618-970 Cx Postal 510 Botucatu-SP Brasil Tel (14) 3880-0780 posgraduacao@ibb.unesp.br PG-BGA Campus de Botucatu UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Julio de Mesquita Filho” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU REGULAÇÃO DA OSTEOGLICINA PELO MICRORNA-22 DURANTE A MIOGÊNESE CARLOS AUGUSTO BARNABE ALVES ORIENTADORA: MAELI DAL PAI CO-ORIENTADOR: ROBSON FRANCISCO CARVALHO Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências, Campus de Botucatu, UNESP, para obtenção do título de Mestre no Programa de Pós-Graduação em Biologia Geral e Aplicada, Área de concentração Biologia Celular Estrutural e Funcional. Orientadora: Profa. Dra. Maeli Dal Pai BOTUCATU – SP 2016 Dedicatória À minha mãe, Rosangela e ao meu pai, José Carlos, por todo o amor e suporte dispensados. Vocês são a minha base mais forte. Obrigado por sempre acreditarem em mim. É de vocês mais essa conquista! i Agradecimento Especial Aqui agradeço de forma muito especial e emocionada, a Professora Maeli Dal Pai, que além de ter sido minha professora durante a graduação, foi minha orientadora durante todo o mestrado. Algumas vezes ultrapassando o limite profissional e me ouvindo como amiga. A senhora é um exemplo de profissionalismo e ética. Muito obrigado! ii Agradecimentos Minha irmã, Anna Kamila, por compartilharmos todos os momentos um na vida do outro. Você é muito importante para mim! Meus avos, Ana e Sebastião, já falecidos, mas que sempre foram a base da família e que nunca mediram esforços para semear o sentimento de amor e respeito entre os seus. Obrigado! Meus tios, Jadir, Ana, Jorge e Kátia. Obrigado! Meus primos, Fernando, Beatriz, Bruna (agora companheira de profissão) e Liana. Obrigado! O meu co-orientador, Professor Robson Francisco Carvalho, por me orientar na Iniciação Cientifica e oferecer a oportunidade para que eu pudesse realizar sonhos que sempre tive. Obrigado! Ao estimado Professor Antonio Carlos Cicogna, que foi o meu primeiro orientador e onde tudo começou. O senhor é meu exemplo de ética. Levarei sempre comigo os seus ensinamentos. Serei eternamente grato. Obrigado! A minha eterna companheira, Paula Paccielli Freire (Narotcha), por sermos não apenas companheiros de sala de aula e de laboratório, mas por sermos companheiros de vida. Sempre estivemos juntos nessa jornada! Daqui para frente não estaremos mais juntos no laboratório, mas tenha certeza que quero tê-la sempre ao meu lado. Obrigado! iii Aos meus amigos de infância, Antonio, Vinícius, Ellen e Daiane. Vocês são parte do que eu sou hoje. Obrigado! Ao meu amigo de faculdade, Marcos José Teixeira Caetano (Toc), pelos momentos compartilhados. Te considero um irmão. Obrigado! Ao recente amigo Armando Contin Neto (Detefon) que me ensinou que a vida pode ser mais simples. Obrigado! Aos amigos da “Sala de Estudo”, Bruno Fantinati, Geysson Fernandez, Ivan Vechetti, Juarez Ferreira, Leonardo Nazário e Tassiana Gutierrez pelas risadas, churrascos e discussões científicas que sempre ocorrem. Obrigado! Aos colegas e amigos de laboratório Ana Omoto, Bruno Duran, Bruno Martinucci, Edson Mareco, Flávia Constantino, Helga Nunes, Ketlin Colombelli, Rafaela Nunes, Rondinelle Salomão, Sérgio Alcântara dos Santos, Veridiana Carvalho. Obrigado! Aos alunos de iniciação científica Bruna Zanella, Caroline Bredariol, Francielle Mosele, Guilherme Alcarás, Jéssica Valente, Jéssica Bindo, Maria Laura Kuniyoshi e Sarah Cury. Obrigado! Aos membros da banca de qualificação e defesa, Professora Maeli Dal Pai, Professor Marcos Ferreira Minicucci, Professora Patrícia Pintor Reis, Professor Renato Ferretti, Professor Robson Francisco Carvalho e Professora iv Valéria Sandrim. Suas ideias e sugestões trouxeram questionamentos e ideias importantes para a melhora desta dissertação. A Professora Edna Kimura (USP) e seu aluno, Doutor César Fuziwara, por abrir as portas do seu laboratório para que eu pudesse realizar o Ensaio de Luciferase. Obrigado! Aos docentes do Departamento de Morfologia do Instituto de Biociências UNESP – Botucatu. Aqui, em especial, a Professora Flávia Delella por manter o laboratório de Cultura Celular sempre que ordem para que todos nós pudéssemos utilizar. Obrigado! A todos os funcionários do Departamento de Morfologia do Instituto de Biociências – UNESP – Botucatu. Obrigado! A Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (Processo nº 2014/21110-1) pelo financiamento e bolsa concedida. v Epígrafe I see trees of green, red roses too I see them bloom for me and you I see skies so blue and clouds of white The bright blessed days, the dark sacred night And I think to myself, what a wonderful world (Louis Armstrong) vi Sumário Resumo ............................................................................................................... 1 Abstract .............................................................................................................. 2 1. Introdução ....................................................................................................... 3 1.1 Eventos celulares e moleculares da miogênese ........................................ 3 1.2 Controle da Miogênese pelo Secretoma do Músculo Esquelético ........... 5 1.3 Osteoglicina (OGN) .................................................................................. 7 1.4 MicroRNAs e a Regulação da Expressão Gênica ..................................... 8 1.5 miRNAs e Miogênese ............................................................................. 12 2. Objetivos ...................................................................................................... 14 2.1. Objetivo Geral ........................................................................................ 14 2.2. Objetivos Específicos ............................................................................. 14 3. Material e Métodos ....................................................................................... 15 3.1 Cultura Celular ........................................................................................ 15 3.1.1. Delineamento Experimental ............................................................ 15 3.2. Transfecção Celular ............................................................................... 16 3.3 RT-qPCR ................................................................................................. 17 3.3.1. Extração do RNA ............................................................................. 18 3.3.2. Reação de Transcrição Reversa (cDNA para microRNA) e qPCR . 18 3.3.3 Reação de Transcrição Reversa (cDNA para mRNA) e qPCR ........ 19 3.4 Ensaio de Luciferase ............................................................................... 20 3.4.1 Predição dos alvos do miR-22 .......................................................... 20 3.4.2 Construção dos vetores pmirGLO-OGN 3’UTR-WT e -Mut .......... 20 3.4.3 Ensaio do gene reporter Luciferase .................................................. 22 3.5 Ensaio de Migração – Wound Healing ................................................... 23 3.6 Western Blot ............................................................................................ 23 3.6.1 Extração proteica .............................................................................. 23 3.6.2 Eletroforese e Immunoblotting.......................................................... 24 3.6.3 Anticorpos ......................................................................................... 25 3.7 Imunofluorescência ................................................................................. 25 3.8 Ensaio de Proliferação ............................................................................ 26 3.9 Análise estatística dos dados ................................................................... 27 4 Resultados ..................................................................................................... 28 4.1 Regulação pós-transcricional da osteoglicina pelo miR-22 .................... 28 4.2 Análise da transfecção em mioblastos e miotubos ................................. 30 4.3 Superexpressão do miR-22 altera a expressão gênica da OGN em mioblastos ..................................................................................................... 30 4.4 Superexpressão do miR-22 altera a expressão proteica da OGN em mioblastos ..................................................................................................... 32 4.5 Superexpressão do miR-22 não altera a formação dos miotubos ........... 34 4.6 Superexpressão do miR-22 aumenta a migração de mioblastos ............. 35 4.7 miR-22 aumenta a proliferação de mioblastos ....................................... 37 5. Discussão ...................................................................................................... 38 6. Conclusões ................................................................................................... 40 7. Referências ................................................................................................... 41 8. Publicações ................................................................................................... 48 8.1 Artigos publicados .................................................................................. 48 8.2 Capítulo de Livro Publicado ................................................................... 48 1 Resumo Em mamíferos, a miogênese é o processo de desenvolvimento embrionário do tecido muscular que, a nível molecular, é regulado pela interação de transdutores de sinais intracelulares e fatores de transcrição nucleares. Durante o desenvolvimento do músculo esquelético, as células dos somitos comprometem-se à linhagem miogênica e progridem através de eventos celulares de proliferação e diferenciação terminal e, posteriormente, formação das miofibras multinucleadas. Durante esses processos, há a ativação dos fatores de regulação miogênicos (MRFs), resultando na reprogramação da expressão gênica responsável pela miogênese esquelética. Os MRFs são importantes para o desenvolvimento muscular, porém não explicam por si só o sofisticado padrão gênico de expressão durante a miogênese. A Osteoglicina (OGN) é um pequeno proteoglicano secretado pela matriz extracelular e que apresenta expressão gênica alterada durante o processo de miogênese. Através de algoritmos computacionais, identificamos o miR-22 como importante candidato de regulação pós-transcricional da OGN. A hipótese do nosso estudo é que a OGN é regulada pós-transcricionalmente pelo miR-22 para controle dos processos de migração e diferenciação de células musculares durante a miogênese. Ensaio de Luciferase, RT-qPCR e Western Blot mostraram que o miR-22 inibe a tradução da OGN pela ligação na região 3’UTR da OGN. A transfecção do mimic do miR-22 promoveu aumento de expressão do marcador miogênico miogenina e da taxa de migração e proliferação em mioblastos e aumento de expressão do marcador miogênico MyoD em miotubos. Nossos resultados indicam que o miR-22 regula pos-transcricionalmente a expressão da OGN controlando os processos de migração, proliferação e diferenciação de células musculares durante a miogênese. 2 Abstract In mammals, myogenesis is the process of embryonic development of muscle tissue at the molecular level that is regulated by interaction of intracellular signal transducers and nuclear transcription factors. Somite cells are committed to the myogenic lineage and progress along the development of muscle cells and subsequently formation of multinucleated myofiber. During these processes there is the activation of Myogenic Regulatory Factors (MRFs), resulting in a reprogramming of gene expression responsible for the control of skeletal myogenesis. MRFs are important for muscle development, but they do not explain by themselves the sophisticated pattern of gene expression during myogenesis. The Osteoglycin (OGN) is part of the small proteoglycans that are secreted by the extracellular matrix and presenting gene expression changes during the myogenesis process. Although OGN has been identified as part of the muscle cell secretome, it has not been rated it role in proliferation, migration and, differentiation of muscle cells. Using computer algorithms, we found miR-22 as an important candidate for post-transcriptional regulation of OGN. Thus, the hypothesis is that the OGN is post-transcriptionally regulated by miR-22 for the control of migration and differentiation of muscle cells during myogenesis. Luciferase Assay, RT-qPCR, and Western Blot shows the miR-22 inhibiting the translation by binding to the 3'UTR region of the OGN. Transfection of miR-22 mimic increased myogenic marker expression Myogenin and migration rate in myoblasts and increased the levels of MyoD in myotubes. Our results suggest that miR-22 regulates the expression of OGN, controlling the migration, proliferation and differentiation of muscle cells during myogenesis 3 1. Introdução 1.1 Eventos celulares e moleculares da miogênese A miogênese é o processo de desenvolvimento embrionário do tecido muscular, a partir da Mesoderme, que a nível molecular, é regulada pela interação de transdutores de sinais intracelulares e fatores de transcrição nucleares1. Durante o desenvolvimento do músculo esquelético, as células dos somitos comprometem-se à linhagem miogênica, diferenciam-se em mioblastos e progridem ao longo da via miogênica através da proliferação e diferenciação e, posteriormente, formação das miofibras multinucleadas (Figura 1). Figura 1. Principais processos da miogênese. Células musculares precursoras mononucleadas, os mioblastos, proliferam e diferenciam-se para formação de fibras musculares adultas. Durante a diferenciação, os mioblastos saem do ciclo celular, migram para regiões pré-determinadas, alinham-se uns com os outros e, subsequentemente, fundem-se para finalmente formarem miotubos multinucleados. Adaptado2. Durante esses processos, há a ativação de fatores miogênicos, resultando numa reprogramação da expressão gênica responsável pela miogênese esquelética3,4. A determinação e a diferenciação terminal dos mioblastos ocorre a nível transcricional governadas pelas vias regulatórias de quatro fatores de regulação miogênica MRFs: myogenic factor 5 (MYF5), muscle-specific regulatory factor 4 (MRF4; também conhecido como MYF6), myoblast determination protein (MYOD) e miogenina (Myog) 3. 4 Os MRFs possuem dois domínios principais, um envolvido na ligação com a molécula de DNA e outro envolvido na dimerização com proteínas E (E12 ou E47)5. O heterodímero formado possui alta afinidade por uma sequência específica do DNA (5´-CANNTG-3´), conhecida como E-box5. Essa sequência está presente na região promotora de genes músculo- específicos e a ligação é responsável pela ativação da transcrição desses genes1,4. Esses MRFs são os responsáveis pela indução da proliferação dos mioblastos, células mononucleadas e à diferenciação em miotubos multinucleados1,6,7. O comprometimento das células somíticas do mesoderma com a linhagem miogênica é marcado pela expressão dos MRFs MYF5 e MYOD; 1. Embora a MYOD e o MYF5 definam a identidade dos mioblastos, as células precursoras somíticas devem ser pré- comprometidas com a linhagem miogênica antes da expressão dos MRFs. No embrião, esse pré-comprometimento é realizado pelo fator transcricional paired-box 3 (PAX3), o qual é expresso em células do mesoderma pré-somítico e dos primeiros somitos epiteliais8,9. Já no dermomiótomo, as células precursoras, que apresentam expressão de PAX3 induzida por sinais secretados pelo mesoderma da placa lateral e pelo ectoderma superficial, são mantidas como uma população não diferenciada e em proliferação, contribuindo assim para a expansão das células da linhagem miogênica10 (Figura 2). Os mioblastos que saem do ciclo celular, e que expressam MYF5 e MYOD, tornam-se miócitos diferenciados e iniciam a expressão da (Myog) e do MRF4, os quais regulam a diferenciação dessas células em fibras musculares11 5 Figura 2. Expressão gênica durante a miogênese. Células precursoras miogênicas começam a expressar PAX3 contribuindo expansão das células miogênicas. Após indução de Myf5 e/ou MyoD as células dos somitos são comprometidas com a linhagem miogênica (mioblastos) iniciando a proliferação dos mioblastos. A expressão de miogenina e MRF4 induz a diferenciação dos mioblastos em miotubos. Posteriormente, os mioblastos se fundem para formar miotubos multinucleados e, em seguida, miofibras maduras. Adaptado12. 1.2 Controle da Miogênese pelo Secretoma do Músculo Esquelético Embora os fatores intracelulares que controlam a miogênese estejam estabelecidos, o conhecimento sobre os fatores extracelulares secretados pelas células musculares que regulam o ciclo celular e induzem o processo de diferenciação ainda é escasso. No entanto, dados da literatura mostram que a miogênese é extremamente sensível ao meio extracelular13,14 e pode funcionar como órgão endócrino por secretar fatores extracelulares que regulam o desenvolvimento do músculo15. Tendo em vista essas importantes atuações dos componentes secretados pelas células musculares esqueléticas (secretoma), torna-se necessário uma melhor compreensão da regulação desses componentes para elucidar as interações entre mecanismos autócrinos e intracelulares de regulação, envolvidos na miogênese e regeneração do tecido muscular estriado esquelético. 6 Recentemente, Chan et al identificaram 34 proteínas como parte dos componentes do secretoma e, dentre elas, 30 são reguladas diferencialmente durante a miogênese16. A osteoglicina (OGN) foi a proteína que apresentou uma relevante alteração na sua expressão gênica (mais de 6 vezes) durante o processo de miogênese16. Os autores também realizaram uma análise da expressão dessa proteína em dois estágios da miogênese, mioblastos e miotubos, e encontraram uma discrepância nos níveis de expressão da OGN nessas duas fases. De modo interessante, quando realizaram o knockdown da OGN, verificaram uma diminuição de 1,6 vezes da atividade transcricional da creatina quinase creatina muscular, acompanhada de diminuição na diferenciação dos mioblastos. Esses dados indicam que a OGN é uma importante proteína secretada pelo músculo que influência os estágios iniciais da miogênese. Além disso, Tanaka et al comprovaram que a OGN apresenta uma importante função na regulação de mioblastos em co-cultura com osteoblastos15. Os autores observaram que o tratamento de osteoblastos com meio de cultivo de mioblastos com ganho e perda de função da OGN, aumenta e diminui, respectivamente, os níveis de expressão proteica da fosfatase alcalina, do colágeno do tipo 1 e da β-catenina nos osteoblastos. Esses resultados indicam que a OGN, produzida no músculo, também atua como um importante fator humoral anabólico fundamental para o desenvolvimento dos osteoblastos17. Os dados sobre a ação da OGN no músculo esquelético ainda são escassos. Entretanto, realizamos em nosso laboratório uma análise do perfil de expressão gênica da OGN utilizando a ferramenta GEO Profile18 que nos forneceu importantes informações sobre seu transcrito no músculo esquelético e em células musculares da linhagem C2C12. Essa ferramenta permitiu o acesso de dados de expressão gênica da OGN armazenados no Gene Expression Omnibus (GEO). A pesquisa inicial utilizou os seguintes parâmetros para filtro dos dados: 1) OGN no músculo esquelético (termos da busca = “skeletal 7 muscle” and OGN, ou C2C12 and OGN) e 2) OGN com expressão diferencial (filtro da busca: up/down genes). Para a busca utilizando “skeletal muscle and OGN”, encontramos 14 resultados demonstrando uma alteração da expressão da OGN e, dentre os perfis desses dados obtidos, destacam-se os relacionados com miogênese, depleção da miostatina, distrofia muscular de Duchenne e regeneração muscular. Para a busca utilizando “C2C12 and OGN”, encontramos 5 resultados demonstrando uma alteração da OGN e, dentre os perfis de dados obtidos, destacam-se os relacionados com diferenciação de miotubos in vitro, efeito da reversina em mioblastos, restrição de nutrientes no desenvolvimento dos miotubos e efeito do piruvato nas células musculares. Esses dados ainda pouco explorados sugerem que a OGN desempenha uma função ainda não descrita em processos como miogênese, regeneração e distrofias. 1.3 Osteoglicina (OGN) Os MRFs são importantes para o desenvolvimento muscular, porém, não são os únicos que controlam o padrão de expressão gênica durante a miogênese. A determinação e diferenciação dos mioblastos exigem uma ação combinada dos MRFs com outras proteínas que modulam a expressão, localização intracelular e/ou atividade transcricional dos MRFs3. A OGN, originalmente chamada de fator osteoindutivo (OIF) e, mais tarde, renomeada de mimecan/osteoglicina19,20, é o sétimo membro pertencente à família dos pequenos proteoglicanos secretados na matriz extra-celular20. Sua estrutura proteica é composta por 6-11 de repetições ricas em leucina e possui um peso molecular entre 25 a 60 kDa21. O gene da OGN está localizado no cromossomo 9q22 humano22, sua estrutura genômica é altamente conservada entre as espécies, e uma única cópia do gene dá origem a múltiplos transcritos de mRNA resultantes do splincing alternativo de poliadenilação diferencial23. No entanto, todos esses transcritos produzem uma proteína idêntica que é 8 conservada entre as espécies, indicando a sua importância funcional23,24. A principal função da OGN já descrita está relacionada com a fibrilogênese do colágeno dos tecidos conjuntivos e da matriz óssea21,25. Embora a OGN já tenha sido identificada como parte do secretoma de células musculares, poucos trabalhos avaliaram a sua função nos processos de proliferação, migração e diferenciação de células musculares. Como a OGN já foi descrita como diferencialmente expressa em mioblastos e miotubos16, é provável que existem mecanismos pós-transcricionais que regulam a expressão dessa proteína nos diferentes estágios da miogênese. Essa expressão gênica diferencial da OGN entre os estágios de mioblastos e miotubos sugere o envolvimento de uma regulação pós transcriocional mediada por micro-RNAs, os quais são elementos-chave no controle do desenvolvimento do músculo esquelético e sua desregulação está envolvida na origem e progressão de várias doenças do músculo26. Em trabalho recente realizado em nosso laboratório, utilizando células C2C12, foi demonstrado que a Ogn é um alvo direto do miR-155 possuindo importante papel nos processos de proliferação, migração e diferenciação dos mioblastos durante a miogênese. 1.4 MicroRNAs e a Regulação da Expressão Gênica Micro-RNAs (miRNA ou miR) são pequenos RNAs reguladores não codificantes com tamanho variando de 17 a 25 nucleotídeos (ver miRBase, http://microrna.sanger.ac.uk/). A definição de miRNA é baseada na sua formação pela ação da enzima RNase III (Dicer), uma RNase que processa precursores com estrutura de hairpin (conhecidos como pré-miRNA) originando o miRNA maduro27. Os miRNAs reprimem pós-transcricionalmente a expressão gênica pelo reconhecimento de locais complementares na região 3’ não traduzida (3’ UTR) de seus RNAs mensageiros alvos. 9 Atualmente, mais de 28.645 miRNAs de 223 espécies estão registrados no banco de dados miRBase (v. 21.0); são conhecidos atualmente 2.588 miRNAs humanos (atualizado em abril de 2016). Os miRNAs são nomeados como miR- mais números (ex: miR-133), entretanto, existem algumas exceções. Os miRNAs de sequências similares são geralmente distinguidos por uma letra adicional seguida do número do miRNA (ex: miR- 133a). Um miRNA com uma sequência madura idêntica pode aparecer em diferentes loci genômicos com diferentes sequências precursoras. Nesses casos, os diferentes genes de miRNA são usualmente distinguidos por outro número adicional no final da sequência (ex: miR-133a-1). A biogênese de um miRNA começa com a síntese de um longo transcrito primário conhecido como pri-miRNA. Os pri-miRNAs são preferencialmente transcritos pela RNA polimerase II e mantém características tais como estrutura de cap na sua região 5’ e cauda de poli (A) na sua região 3’28–30. Entretanto, outras vias geram um conjunto menor de microRNAs, especialmente a partir de repetições genômicas. Por exemplo, a RNA polimerase III é responsável pela transcrição de microRNAs em repetições Alu3331. No núcleo, o pri-miRNA é processado para pre-miRNA pela enzima RNAse III (Drosha), a qual requer um cofator, a proteína DGCR8 (DiGeorge Syndrome critical region gene 8) em humanos (Pasha em D. Melagonaster e C. Elegans)32–35. A DGCR8 forma com a Drosha um grande complexo conhecido como complexo microprocessador, que em humanos possui ~650 kDa33–35. Esse complexo microprocessador reconhece e cliva o pri-microRNA, originando uma molécula com estrutura de hairpin de aproximadamente 70 pb, o pré-microRNA36,37. Um subconjunto de miRNAs, conhecidos como miRtrons utiliza uma via alternativa, na qual os pré-miRNA são derivados como produto secundário de um evento de splicing, sem a necessidade de processamento pela Drosha38–40. Após o processamento nuclear, cada pre-miRNAs é exportado para o 10 citoplasma pela exportina-5 (EXP5), membro da família de receptores de transporte sendo convertido para miRNAs maduro e funcional pela Dicer nuclear41–43. Após a clivagem pela Dicer, a molécula de dupla fita de RNA com aproximadamente 22 nucleotídeos associa-se à proteína Argonauta (Ago) para formar o complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC)44. Uma das fitas de aproximadamente 22 nucleotídeos do RNA dupla fita permanece na proteína Argonauta como o miRNA maduro (fita guia ou miRNA), enquanto a outra fita (fita passageiro ou miRNA) é degradada (Figura 3). Da mesma maneira como ocorre a seleção de um siRNA45,46, a fita que possui sua extremidade 5’ formando o duplex mais instável com sua fita parceira parece preferencialmente sobreviver como o miRNA no RISC37,45,46. O complexo miRNA-RISC interage com sítios ligantes da região 3' UTR do RNA mensageiro alvo inibindo a expressão ou degradando o RNA mensageiro alvo47,48. A interação entre o RNA mensageiro alvo e o complexo miRNA-RISC ocorre devido à complementaridade total ou parcial de uma sequência de 5-7 nucleotídeos do miRNA e do RNA mensageiro alvo47,49. 11 Figura 3. Vias de processamento e mecanismo de ação dos microRNAs. A via de canônica inclui a transcrição de um produto primário (pri-miRNA) pela RNA polimerase II/III e clivagem da molécula pelo complexo Drosha-DGCR8. O hairpin precursor resultante, o pre-miRNA, é exportado a partir do núcleo pela exportina-5. No citoplasma, o pre-miRNA é clivado pelo complexo Dicer, perdendo a configuração em hairpin. Forma-se uma molécula de miRNA de fita dupla que se associa à proteína Argonauta 2: uma das fitas é integrada ao complexo de proteínas que reprime a expressão do gene alvo (RISC), enquanto a outra é degradada. O complexo RISC e miRNA promove a degradação ou repressão da tradução do mRNA alvo. Adaptado50. Estima-se que cada miRNA possa se ligar a muitos RNAs mensageiros, e que os RNAs mensageiros podem ter sua estabilidade ou tradução regulada por mais de um miRNA51. Os miRNAs trabalham de forma orquestrada para controlar uma via ou função biológica comum52,53; essa característica única dos miRNAs os tornam ferramentas eficientes para determinação de vias específicas envolvidas em doenças ou processos biológicos. 12 1.5 miRNAs e Miogênese A modulação da expressão gênica por miRNAs surgiu como elemento de transcrição adicional para o controle da miogênese54. A função dos miRNAs na regulação miogênica foi inicialmente descrita pela expressão dos miRNAs músculo-específico miR- 1, miR-133a e miR-20655–57. Estudos subsequentes demonstraram que a superexpressão do miR- 1, em células da linhagem HeLa, diminuía a regulação direta ou indireta de mais de 100 mRNAs, além de alterar o perfil de expressão global dessas células47. Nos mioblastos da linhagem celular C2C12, os miRNAs miR-1, miR-133a, miR-206, miR-214 e miR-186 influenciam a diferenciação miogênica58–62. Esses resultados mostram os miRNAs como importantes reguladores dos diferentes estágios da miogênese. Os primeiros estudos com miRNAs e seus respectivos alvos baseavam-se, exclusivamente, em experimentos laboratoriais, de modo que os primeiros foram identificados por meio de técnicas de genética clássica63. Diante disso, estudos de bioinformática surgiram da necessidade dos cientistas de desenvolver novas ferramentas e abordagens que pudessem facilitar e dinamizar o estudo dessas moléculas64. Atualmente, análises computacionais são indispensáveis na identificação e compreensão do papel biológico desses RNAs, para a expansão de banco de dados, predição e validação de alvos64–66. Através de algoritmos computacionais do miRWalk database67, identificamos o RNA mensageiro da OGN como um alvo de regulação pós-transcricional pelo miR-22. Este miRNA foi primeiramente identificado na linhagem celular Hela e, posteriormente, demonstrado ser expresso em vários tecidos, atuando também na miogênese do tecido cardíaco, fator de supressão tumoral e oncogênico68–71. Análises filogenéticas mostram que no decorrer do processo evolutivo a sequência de nucleotídeos do miR-22 é altamente conservada nos vertebrados, o que indica a importância biológica neste grupo71. Além 13 disso, Chen et al mostraram que o miR-22 é diferencialmente expresso em células C2C12 durante o processo de diferenciação de mioblastos72. Portanto, a hipótese é que a OGN é regulada pós-transcricionalmente pelo miR- 22, participando dos processos de migração, proliferação e diferenciação de células musculares esqueléticas durante a miogênese. 40 6. Conclusões O miR-22 regula pos-transcricionalmente a expressão da osteoglicina, controlando os processos de migração, proliferação e diferenciação de células musculares durante a miogênese. 41 7. Referências 1. Bentzinger, C. F., Wang, Y. X. & Rudnicki, M. a. Building muscle: molecular regulation of myogenesis. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, (2012). 2. Salvatore, D., Simonides, W. S., Dentice, M., Zavacki, A. M. & Larsen, P. R. Thyroid hormones and skeletal muscle-new insights and potential implications. Nat. Rev. Endocrinol. 10, 206–14 (2014). 3. Braun, T. & Gautel, M. 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