Universidade Estadual Paulista                                                
Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara 

Programa de Pós-Graduação em Análises Clínicas 
 

 
 
 

 
 

ANA CAROLINA URBACZEK 
 
 
 

  

 

 

“Burst oxidativo dos neutrófilos humanos: 

estudo da influência do polimorfism odo receptor para IgG 

FcγγγγRIIIb na cooperação com os receptores para complemento” 

 

 

 

 

 

 

Orientador: Prof. Dr. LUIZ MARCOS DA FONSECA 

Co-orientadora: Profa. Dra. CLENI MARA MARZOCCHI MACHADO 

 

Araraquara – SP 

2008 

 



 2 

ANA CAROLINA URBACZEK 
 

 

 

 

“Burst oxidativo dos neutrófilos humanos: 

estudo da influência do polimorfismo do receptor para IgG FcγγγγRIIIb   

na cooperação com os receptores para complemento” 

 

 

 

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

graduação em Análises Clínicas, da Faculdade de 

Ciências Farmacêuticas da Universidade Estadual 

Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, para a 

obtenção do título de mestre em Análises 

Clínicas. 

 

 

Orientador: Prof. Dr. Luiz Marcos da Fonseca 

Co-orientadora: Profa. Dra. Cleni Mara Marzocchi Machado 

                           

                           

 

Araraquara - SP 

2008 



 3 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 
 
 

 
 

Urbaczek, Ana Carolina 

U12b             Burst oxidativo dos neutrófilos humanos: estudo da influência do 
polimorfismo do receptor para IgG  FcγRIIIb na cooperação com os 
receptores para complemento. / Ana Carolina Urbaczek.  – Araraquara, 2008. 

 127 f. 
 

Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual Paulista. “Júlio de 
Mesquita Filho”. Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Programa de Pós 
Graduação em Análises Clínicas 

Orientador: Luiz Marcos da Fonseca 
Co-orientador: Cleni Mara Marzocchi Machado 

 
 

1.Receptores de IgG. 2.Neutrófilos. 3.Burst oxidativo. Hematologia. 
I.Fonseca, Luiz Marcos, orient.. II.Machado, Cleni Mara Marzocchi, co-
orient.. III.Título. 

 
CDD:  616.1507 

 

CAPES: 40300005 

 
Ficha Catalográfica 

Elaborada Pelo Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação 
Faculdade de Ciências Farmacêuticas 

UNESP – Campus de Araraquara 



 4 

 
COMISSÃO EXAMINADORA 

 
 
 
 
 
 
 
 

______________________________________________ 
Prof. Dr. Luiz Marcos da Fonseca 

(Orientador) 
 
 
 
 
 
 

_______________________________________________ 
Prof. Dr. Marcelo Dias Baruffi 

(Membro da banca) 
 
 
 
 
 
 

_______________________________________________ 
Prof. Dr. Paulo Inácio da Costa 

(Membro da banca) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

9 de Maio de 2008 
 
 

 



 5 

“Não importa onde você parou... 

Em que momento da vida você cansou... 

O que importa é que sempre é possível e necessário 

RECOMEÇAR. 

Recomeçar é dar uma nova chance a si mesmo... 

É renovar as esperanças na vida 

E o mais importante... 

Acreditar em você de novo. 

Sofreu muito neste período? 

Foi aprendizado... 

Chorou muito? 

Foi limpeza da alma... 

Ficou com raiva das pessoas? 

Foi para perdoá-las um dia... 

Sentiu-se só por diversas vezes? 

Foi porque fechaste a porta até para os anjos... 

Acreditou naquilo que estava perdido? 

Era o início da tua melhora... 

Onde você quer chegar? 

Ir alto? 

Sonhe alto... 

Queira o melhor do melhor... 

Se pensarmos pequeno 

Coisas pequenas teremos... 

Mas, se desejarmos fortemente o melhor... 

E, principalmente... 

Lutarmos pelo melhor... 

O melhor vai acontecer em nossa vida. 

Porque sou do tamanho daquilo que vejo, 

E não do tamanho da minha altura.” 

 

(Carlos Drummond de Andrade) 

 
 



 6 

Para meus amigos... 

 

Saudade... 

Um dia a maioria de nós irá se separar. 

Sentiremos saudades de todas as conversas jogadas fora, das descobertas que 

fizemos, dos sonhos que tivemos, dos tantos risos e momentos que compartilhamos. 

Saudades até dos momentos de lágrimas, da angústia, das vésperas  

de finais de semana, de finais de ano, enfim... do companheirismo vivido. 

Sempre pensei que as amizades continuassem para sempre. Hoje não tenho mais 

tanta certeza disso. 

Em breve cada um vai pra seu lado, seja pelo destino, ou por algum 

desentendimento, segue a sua vida, talvez 

continuemos a nos encontrar quem sabe... nos e-mails trocados. Podemos nos 

telefonar conversar algumas bobagens... 

Aí os dias vão passar, os meses... os anos... até este contato tornar-se 

cada vez mais raro. Vamos nos perder no tempo. 

Um dia nossos filhos verão aquelas fotografias e nos 

perguntarão: "Quem são essas pessoas?" 

Diremos que eram nossos amigos e isso vai doer tanto!... 

Foram meus amigos, foi com eles que vivi os melhores anos de minha vida! 

A saudade vai apertar bem dentro do peito... 

Vai dar uma vontade de ligar, ouvir aquelas vozes novamente... 

Quando o nosso grupo estiver incompleto... nos reuniremos para um último adeus 

de amigo... 

E entre lágrimas nos abraçaremos . Faremos promessas de nos encontrarmos mais 

vezes daquele dia em diante. 

Por fim, cada um vai para o seu lado para continuar a viver a sua vidinha isolada do 

passado. 

E nos perderemos no tempo... 

Por isso, fica aqui um pedido deste humilde amigo: não deixes que a vida passe em 

branco, e que pequenas adversidades sejam a causa de grandes tempestades... 

Adoro todos vocês... 

Autor desconhecido 



 7 

I CORÍNTIOS 13  

 

AINDA que eu falasse a língua dos homens e dos anjos, se não tivesse amor, seria 

como o metal que soa ou como o sino que tine. 

E ainda que tivesse o dom da profecia, e conhecesse todos os mistérios e toda a 

ciência, e ainda que tivesse toda a fé, de maneira tal que transportasse os montes, 

se não tivesse amor, nada seria. 

E ainda que distribuísse toda a minha fortuna para sustento dos pobres, e ainda que 

entregasse o meu corpo para ser queimado, se não tivesse amor, nada disso me 

aproveitaria. 

O amor é paciente, é sofredor, é benigno; o amor não é invejoso; o amor não trata 

com leviandade, não se ensoberbece. 

O amor não arde em ciúmes, não se ufana, não se conduz incovenientemente,  

Não se porta com indecência, não busca os seus interesses, não se exaspera, não 

se ressente do mal; 

Não se alegra com a injustiça, mas regozija-se com a verdade; 

Tudo sofre, tudo crê, tudo espera, tudo suporta. 

O amor nunca falha e jamais acaba... 

Se eu não tivesse amor, eu nada seria... 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

“Minha bondade é tão ilimitada quanto o mar, e tão profundo como este, é o meu 

amor. Quanto mais te dou, mais tenho, pois ambos são infinitos”. 

(Shakespeare) 



 8 

 
 

 
 
 

 
 

 
DEDICATÓRIA 

 
 
 
 
 
Esta dissertação é dedicada a todos aqueles que fazem parte da minha vida... 

àqueles que me apoiam e me incentivam..., a Deus, aos meus pais Tercilha e 

Raimundo Urbaczek, à minha família, ao meu namorado Antonio Carlos Moro, aos 

meus amigos, aos doadores das amostras, aos funcionários da universidade e aos 

meus mestres Prof. Dr. Luiz Marcos da Fonseca e Profa. Dra. Cleni Mara Marzocchi 

Machado... ou seja... todos aqueles que contribuem para que cada vez eu alcance 

vôos mais altos... 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 9 

AGRADECIMENTOS... 

Agradeço primeiramente a Deus, 

Por ter guiado meus caminhos e por ter me conduzido até aqui... 

Por sempre ter me dado fé, força e coragem e nunca ter me deixado desistir, pois só 

Ele sabe como não foi fácil chegar até onde cheguei... 

Por ter me incentivado a seguir sempre em frente, de cabeça erguida...  

Pela sua infinita bondade, me proporcionando capacidade e oportunidade de poder 

estudar até muito além do que estuda a maioria da população deste país, onde a 

educação muitas vezes é o último ítem da lista de prioridades daqueles que estão à 

frente da nação...  

Por ter me oferecido a oportunidade de pesquisar e quem sabe, algum dia, tentar 

fazer algo por aqueles que sofrem com suas enfermidades, amenizando seus 

sofrimentos, e desta forma retribuir à Ele, mesmo que de forma muito pequena e 

simples, tudo aquilo que Ele fez e faz por mim... 

Por ter colocado em meu caminho profissionais talentosos (meus mestres), pessoas 

maravilhosas! que se dedicaram imensamente a minha formação... 

Por ter me dado amigos e um namorado adorável... pessoas que sempre me 

ofereceram a mão quando precisei... 

Por ter compreendido os meus anseios e de minha família, e desta forma ter me 

dado a necessária coragem e ousadia para atingir meus objetivos... 

Por ter me colocado a frente de diversas provações, mas para que através delas eu 

aprendesse, me tornasse mais forte e capaz de superá-las... Foram muitas lições... 

Pela serenidade que me deu diante de todas as adversidades para que eu pudesse 

aceitá-las com resignação, mesmo que fosse para compreendê-las muito depois... 

Pois hoje tenho plena certeza de que tudo tem uma razão de ser... 



 10 

 

 

 

Agradeço aos meus pais, que através de muito sacrifício, incentivo e paciência, me 

ofereceram a oportunidade do conhecimento... abrindo as portas do meu futuro e me 

dando o apoio necessário para que eu caminhasse com minhas próprias pernas na 

trilha que me levaria aos meus objetivos, coisa que nunca foi muito fácil, pois a 

estrada da vida é tortuosa e cheia de pedras...  

mas ao longo dela aparecem pessoas tão maravilhosas que a tornam muito mais 

bonita e que nos fazem prosseguir.  

Agradeço, por terem me mostrado durante toda a minha existência que o caminho 

do sucesso está no trabalho, na verdade e na dedicação. 

 Agradeço também, por sempre terem acreditado em mim e por nunca terem medido 

esforços para a minha formação pessoal e profissional, deixando muitas vezes seus 

próprios sonhos de lado para viverem os meus e torná-los reais.  

Agradeço ainda, por tantas as vezes que suportaram a minha ausência e 

silenciosamente assumirem meus medos e emoções. Foi através de seus exemplos 

de vida, que aprendi a lutar com amor e perseverança pelos meus ideais.  

E por terem estado sempre presentes nos momentos bons e difíceis de minha 

caminhada posso dizer que este trabalho também é uma conquista de vocês! 

 

 

 

 

 



 11 

Agradeço a minha família, em especial, tia Edith e Penha, por todo o apoio,  

incentivo, generosidade e por acreditarem em mim, saibam que o caminho até aqui 

não foi nada fácil, mas vocês contribuíram para que ele se tornasse suportável, a 

conquista deste trabalho também é dedicada a vocês... obrigada por tudo... 

 

 

Às primas Heloísa e Thaís, pelo apoio nas horas de desânimo e por toda a torcida 

mesmo de tão longe. 

 

 

Ao meu namorado, Antonio Carlos Moro, meu amor e um grande ser humano, sinto 

muito orgulho por estar ao seu lado, sei que posso contar sempre com você pra 

tudo, muito obrigada pelo amor, carinho, compreensão, cumplicidade, apoio e 

incentivo nos momentos em que a vontade era jogar tudo pra cima e fugir, nestas 

horas você me trazia à realidade novamente e com uma simples palavra tudo 

parecia estar bem de novo. “Foi assim como ver o mar... a primeira vez que meus 

olhos... se viram no seu olhar... não tive a intenção de me apaixonar... mera 

distração e já era o momento de se gostar...” (Todo azul do mar) 

 

 

Agradeço também aos meus avós (in memoriam), que sempre torceram por mim e 

intercediam a Deus pelas minhas conquistas, acredito que hoje vocês continuam a 

interceder por mim, só que agora muito mais de perto de Deus... 

Deixo aqui minha lembrança e meu carinho... 

 



 12 

Aos meus grandes amigos conquistados ao longo da vida, Patrícia (“cabeça” – 

minha grande amiga-irmã dos anos de faculdade, saudades...), Camila Tita (amiga 

de faculdade e agora de pós), Kelin (amiga, conselheira e guia em Ribeirão Preto 

rs...), Fabiana, Ariane, Mari, Fábio, Gi, Rafa e Paty (estes últimos 5, amigos de 

churrasco, de piscina, de passeios, de comilanças... amigos pra todas as horas...). 

Vocês que sempre torceram por mim, que me deram conselhos valiosos, que me 

ofereceram uma palavra amiga quando eu mais precisava... sintam-se aqui 

lembrados com muito amor e carinho... que nossa amizade seja mais do que 

eterna... 

 

 

À Carol (ruiva), minha ”anexa”, estagiária, amiga, companheira e psicóloga rs... 

quantas foram as PCRs hein Carol??? Quantas horas de termociclador??? Quantos 

géis??? Mas entre uma coisa e outra sempre havia tempo para uma história, uma 

fofoquinha, uma brincadeira... muito obrigada pelo companheirismo... você é uma 

grande parceira!!! Obrigada!!! 

 

 

Aos amigos da Hematologia, Max, Pâmela, Débora, Karina e Marília, foi muito bom 

conviver com vocês... 

 

 

Às amigas de pós, Aline Tansini e Mariana Santoro de Camargo, pelo 

companheirismo durante as aulas, pelas conversas jogadas fora e pelas angústias 

divididas. 



 13 

Às amigas da Imuno, Dani Maia (a mais engraçada e despachada!), Marisa (aquela 

que de certa forma sempre cuidou da gente, e quem mais torceu pelo meu romance 

rs...), Paulinha (sempre sorridente), Micheli Sassá, Michelão (uma amiga muito 

querida, conselheira, muito bem humorada e companheira das saidinhas para 

comer, as “gordotes” rs... pena que hoje ela esteja longe), Ira, Djamile (minha amiga 

e companheira de rua 2, quantas foram as comprinhas hein amiga!), Camila (a 

consultora de moda do laboratório rs...), Marcela (uma amiga muito especial e um 

pouco vidente rs...), Flávia (saudades da Esquina da Esfiha!), Cleso (só você pra me 

encher com essa história de Polaka, com K), Dani Serinoli, Lucas (meu amigo de 

planos para dominar o universo!!! rs), Lívia, Alexandre, Sandra (minha amiga 

apaixonada por orquídeas), Alessandra, Maristela, Oedem, Ana Cláudia e Jú, muito 

obrigada pela convivência... apesar de oficialmente não fazer parte do laboratório de 

imuno,  foi lá ao lado de vocês que passei talvez os melhores anos da minha vida, 

muitos foram os aniversários, as brincadeiras, as palhaçadas, até de cupido vocês 

atacaram... mas valeu por tudo... jamais me esquecerei de vocês... sempre os 

levarei em um lugar muito especial no meu coração. 

 

 

À Janessa, minha amiga muito especial... a menina dos peixinhos... foi uma ótima 

parceria!!!... saiba que você poderá contar comigo sempre, tanto para as pesquisas 

como para desabafar naqueles imensos e-mails, que por sinal eu adoro ler e 

responder,... sua amizade é uma das boas coisas que a vida acadêmica me 

proporcionou... sempre fazendo parte da comunidade “as cientistas mais gatas” rs... 

 

 



 14 

À Ângela Mikawa, uma grande amiga da ciência... muito obrigada pela ajuda inicial 

com os DNAs... valiosas foram as suas dicas... foi muito bom ter te conhecido. 

 

 

Aos colegas da Micologia, Julhiany, Tati, Marcelo, Rô e Elaine, pelo auxílio durante 

os experimentos. 

 

 

Às funcionárias da Faculdade, Rosemira, Rita, Angélica e Márcia, pelo alegre “bom 

dia” de sempre, pelas brincadeiras, pelos papos e pela amizade. 

 

 

Às funcionárias do Hemonúcleo que me auxiliaram na coleta das amostras de 

sangue. 

 

 

Aos funcionários do NAC, em especial Vera Lúcia Correa e José Edson Casterete, 

pelo auxílio na coleta das amostras. 

 

 

Às funcionárias da pós-graduação, Sônia, Laura e Cláudia, pela atenção e auxílio. 

 

 

Às funcionárias da biblioteca pela correção desta dissertação. 



 15 

À Profa. Dra. Maria José Soares Mendes Giannini, por ter autorizado a utilização do 

termociclador e do capturador de imagens, sem os quais não seria possível a 

realização deste trabalho. 

 

 

À Profa. Dra. Yara e à Aninha, pelo grande auxílio para que esta pesquisa 

acontecesse, não tenho palavras para agradecer, muito obrigada por tudo. 

 

 

Aos membros da banca de qualificação, Profa. Dra. Beatriz Maria Machado de 

Medeiros e Prof. Dr. Marcelo Dias Baruffi, que gentilmente contribuíram para o 

aprimoramento deste trabalho. 

 

 

À todos os professores da minha graduação e pós-graduação pelas contribuições à 

minha formação e pelo incentivo à carreira acadêmica. Hoje acredito que o 

conhecimento seja uma das poucas coisas que se leva para sempre na vida, pois 

ele não tem preço e não pode ser tirado, por isso é a maior riqueza que podemos 

possuir. 

 

 

À todos os doadores de sangue deste trabalho, sem os quais não haveria pesquisa, 

muitos deles meus amigos, que quando me viam no corredor já correriam pois 

sabiam que iria sobrar para eles rs... obrigada por tudo... nada se faz sem amigos... 

 



 16 

Ao Prof. Dr. Roberto Passeto Falcão e a Biomédica Aglair Garcia, do laboratório de 

Hematologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto-

USP e à Fabiana Rossetto de Morais, da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de 

Ribeirão Preto-USP, pela utilização do citômetro de fluxo. 

 

À Profa. Dra. Cleni Mara Marzocchi-Machado, minha co-orientadora e um pouco 

mãe, pelo incentivo, paciência, carinho e dedicação. Muito obrigada por tudo, não 

tenho palavras para agradecer tudo o que você fez por mim durante todos estes 

anos. Foi um grande prazer e uma inesquecível lição conviver ao lado de um ser 

humano tão especial, possuidor de admirável conhecimento e competência como 

você... obrigada!!!! 

 

Ao Prof. Dr. Luiz Marcos da Fonseca, meu orientador e um pouco pai, cuja 

compreensão, sabedoria e simplicidade encerram sem dúvida, as principais 

qualidades de um grande mestre e ser humano...  muito obrigada pela orientação, 

pelo apoio e incentivo, foi muito bom poder trabalhar ao seu lado e aprender e 

também ver o carinho, atenção e respeito com os quais os alunos são tratados...  

 

Ao Prof. Dr. Paulo Inácio da Costa, pelo apoio e incentivo para que esta pesquisa 

acontecesse, obrigada pelas valiosas dicas sobre biologia molecular... 

 

 

À CAPES pela bolsa concedida. 

 

 

 

 



 17 

 

 

 

“Vivemos esperando 

Dias melhores 

Dias de paz, dias a mais 

Dias que não deixaremos 

Para trás 

 

Vivemos esperando 

O dia em que 

Seremos melhores 

Melhores no amor 

Melhores na dor 

Melhores em tudo 

 

Vivemos esperando 

O dia em que seremos 

Para sempre 

 

Vivemos esperando 

Dias melhores pra sempre 

 

Vivemos esperando...”  

 

(Rogério Flausino)�

 

 

 

 

 

 

 

 



 18 

SUMÁRIO 

 RESUMO ................................................................................ 20 

 ABSTRACT ............................................................................. 22 

 LISTA DE FIGURAS ............................................................... 24 

 LISTA DE TABELAS ............................................................... 26 

 LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS ............................ 27 

1 INTRODUÇÃO ........................................................................ 30 

2 OBJETIVOS ............................................................................ 50 

3 MATERIAL E MÉTODOS ....................................................... 52 

3.1 Amostras de sangue ............................................................... 53 

3.2 Extração e caracterização do DNA genômico ........................ 53 

3.2.1 Extração por método de salting out ........................................ 53 

3.2.2 Quantificação de DNA na amostra e avaliação qualitativa da 

pureza ..................................................................................... 

 

55 

3.2.3 Verificação da qualidade e da integridade do DNA ................ 55 

3.3 Análise dos genótipos ............................................................ 56 

3.3.1 Análise do genótipo FcγRIIA ................................................... 57 

3.3.2 Análise do genótipo FcγRIIIB .................................................. 58 

3.3.3  Análise do genótipo SH .......................................................... 60 

3.4 Eletroforese dos produtos da PCR ......................................... 62 

3.5 Determinação da expressão dos receptores para IgG 

(FcγRIIa/CD32 e FcγRIIIb/CD16) e para complemento (CR1 

e CR3) nos neutrófilos ............................................................ 

 

 

62 

3.6 Medida do burst oxidativo dos neutrófilos ............................... 64 

3.6.1 Obtenção dos neutrófilos ........................................................ 64 

3.6.2 Fonte de complemento ........................................................... 65 

3.6.3 Imunocomplexos ..................................................................... 65 

3.6.4 Medida do burst oxidativo por quimioluminescência 

dependente de luminol ............................................................ 

 

66 

3.7 Forma de análise dos resultados ............................................ 67 

3.7.1  Análises Estatísticas ............................................................... 67 

4 RESULTADOS ........................................................................ 68 



 19 

4.1 Extração e caracterização do DNA genômico ........................ 69 

4.2 Alotipagem do FcγRI ............................................................... 69 

4.3 Análise da freqüência dos alótipos NA1, NA2 e SH ............... 74 

4.4  Análise da freqüência dos genes H-131 e R-131.................... 76 

4.5 Análise das combinações dos genótipos ................................ 76 

4.6 Medida do burst oxidativo dos neutrófilos ............................... 77 

4.7 Quantificação dos FcγR (FcγRIIa/CD32 e FcγRIIIb/CD16) e 

dos receptores para complemento (CR1 e CR3) nos 

neutrófilos por citometria de fluxo ........................................... 

 

 

85 

5 CONCLUSÕES .......................................................................  98 

6 DISCUSSÃO ........................................................................... 100 

7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................ 112 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 20 

RESUMO 

Os receptores para a porção Fc das IgG (FcγR) estão amplamente expressos nas 

células do sistema imune e podem estimular uma variedade de respostas efetoras. Três 

classes de FcγR são descritas nos humanos: FcγRI, FcγRII e FcγRIII. O neutrófilo expressa 

constitutivamente as isoformas FcγRIIa (CD32) e FcγRIIIb (CD16), as quais apresentam um 

polimorfismo funcional decorrente do polimorfismo alélico. No FcγRIIa, a substituição da 

histidina (H) pela arginina (R) na posição 131 resulta nas variantes polimórficas FcγRIIa-

R131 e FcγRIIa-H131, que diferem quanto à capacidade de ligação à IgG2 humana. Quanto 

ao FcγRIIIb (CD16), o polimorfismo genético é responsável pela expressão dos antígenos de 

neutrófilo (NA)1, NA2 e SH e resulta em um maior número de sítios de glicosilação em NA2. 

O FcγRIIIb é responsável pela aproximação dos ligantes na membrana para o FcγRIIa e 

também interage com o receptor para complemento tipo 3 (CR3) na superfície celular.  

A cooperação entre os FcγRIIa/IIIb com o CR3 promove a estimulação máxima das 

respostas do neutrófilo, dentre elas o burst oxidativo. Uma vez que a interação FcγRIIIb/CR3 

ocorre via sítio de ligação lectina-sacarídeo, o objetivo deste estudo foi avaliar se o 

polimorfismo alélico do FcγRIIIb poderia afetar a cooperação entre os FcγR e os CR em 

mediar o burst oxidativo dos neutrófilos. As freqüências dos alelos H/R-131 e NA1/NA2/SH 

foram analisadas por genotipagem com oligonucleotídeos alelo-específicos e reação em 

cadeia da polimerase e a densidade de expressão dos receptores (FcγRIIa, FcγRIIIb, CR1 e 

CR3) foi determinada por citometria de fluxo. A distribuição dos genótipos para o FcγRIIIb 

(n=169) foi NA1/NA2 (52,1%), NA2 (27,8%) e NA1 (20,1%). Dentre 174 indivíduos, apenas 

6,3% apresentaram o gene SH. Quanto aos genótipos para o FcγRIIa (n=143), a distribuição 

mostrou R-131 (41,2%), H/R-131 (38,5%) e H-131 (20,3%). Os neutrófilos foram 

estimulados com imunocomplexos (IC) de IgG opsonizados ou não por complemento e o 

burst oxidativo medido por quimioluminescência. De um modo geral, a opsonização com 

complemento aumenta o burst oxidativo confirmando os dados da literatura. A cooperação 



 21 

dos CR com os FcγRIIIb em indivíduos NA2/NA2 não foi tão eficiente quanto nos outros 

genótipos para NA. O genótipo R/NA2 apresentou uma melhor cooperação entre os 

receptores para gerar o burst. Quanto à expressão de CD16, observou-se uma diferença 

significativa na expressão de CD16 entre os grupos R/NA2 e HR/NA1/2. Observou-se uma 

correlação positiva e significativa entre CR3 e CD16. A correlação entre os receptores 

estudados, em alguns casos, pode ser influenciada pelas diferentes combinações de 

genótipos. 

 

 

Palavras-chave: Receptores de IgG; neutrófilos; burst oxidativo. 

 

 

 

 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 22 

ABSTRACT 

Receptors for immunoglobulin G (FcγR) are known to be expressed on many cells of 

the immune system and they can trigger a variety of biological responses. Human FcγR 

belong to the Ig superfamily and three classes of these receptors have been recognized: 

FcγRI, FcγRII and FcγRIIl, with different affinities and specificities for IgG subclasses. 

Neutrophils express the FcγRIIa (CD32) and FcγRIIlb (CD16) isoforms, which display a 

functional polymorphism due to biallelic polymorphisms.  In the case of FcγRIIa, an arginine 

(FcγRIIa-R131) or histidine (FcγRIIa-H131) at amino acid position 131 determines receptor 

affinity for IgG2, FcγRIIa-H131 being the isoform with highest affinity. On neutrophils, the 

FcγRIIIb bears the neutrophil antigen (NA) polymorphism, NA1, NA2 and SH, NA2 being the 

more glycosylated isoform. Cooperation of FcγRIIIb with FcγRIIa and CR3 (complement 

receptor type 3) is necessary for efficient neutrophil responses, including the oxidative burst. 

Since the FcγRIIIb/CR3 cooperation occurs via lectin-sacharide-like interaction, the aim of 

this study was to evaluate whether the allelic polymorphism, NA1 and NA2, could influence 

the cooperation of FcγRIIIb with CR3 in mediating the oxidative burst of neutrophils. FcγRIIa 

and FcγRIIIb genotyping analysis were performed by polymerase chain reaction with allele-

specific primers and surface expressions of FcγRIIa, FcγRIIIb, CR1 and CR3 on neutrophils 

were determined by flow cytometry. The FcγRIIIb genotype distribution (n=169) was 

NA1/NA2 (52.1%), NA2 (27.8%) and NA1 (20.1%). SH gene was found in 11 (6.3%) 

volunteers from 174 subjects. With respect to the FcγRIIa genotype (n=143), the distribution 

observed was R131 (41.2%), H/R131 (38.5%) and H (20.3%). Neutrophils were stimulated 

with immune complexes (IC)-IgG opsonized or not with complement and the oxidative burst 

was measured by chemiluminescence. Overall the opsonization with complement increased 

the oxidative burst, as described in literature. In neutrophils homozygous for NA2, the 

cooperation of CR3 with FcγRIIIb was not efficient, in contracts with those observed in other 

genotypes for NA.  The most efficient cooperation between FcγR and CR in mediating the 



 23 

oxidative burst was observed in neutrophils with the combination of the homozygosis R and 

NA2. Analysis of combinations of the FcγRIIa (R/H) and FcγRIIIb (NA1/NA2) gene variants 

revealed that the FcγRIIIb (CD16) expression on neutrophils was significantly different 

between R/NA2 and HR/NA1/NA2 groups. In addition, overall there was a positive correlation 

between CD16 and CR3 expressions on neutrophils, but the combinations of the HR/NA 

alleles may influence the correlation between the receptors studied. 

 

Key words: Receptors for IgG; polymorphism; complement receptors; neutrophils; oxidative 

burst. 

 
 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 24 

LISTA DE FIGURAS  

Figura 1 Esquema representativo do complexo NADPH oxidase na 

membrana da célula e suas subunidades..................................... 

 

32 

Figura 2 Representação esquemática da família de receptores humanos 

para Fc de Imunoglobulina G (FcγR)............................................. 

 

39 

Figura 3 Representação esquemática das variantes polimórficas dos 

receptores humanos para Fc de imunoglobulina G 

(FcγR)............................................................................................ 

 

 

43 

Figura 4 Avaliação qualitativa das amostras de DNA extraídas pelo 

método de salting out.................................................................... 

 

69 

Figura 5 Perfil eletroforético dos produtos da PCR para amplificação do 

DNA com os oligonucleotídeos sense e anti-sense alelos-

específicos para NA1 (141pb) e NA2 (221pb) em gel de agarose 

2% em TBE pH 8,3. ...................................................................... 

 

 

 

70 

Figura 6  Perfil eletroforético dos produtos da PCR para amplificação do 

DNA com os oligonucleotídeos sense e anti-sense alelos-

específicos para SH (191pb), em gel de agarose 2% em TBE 

pH 8,3............................................................................................ 

 

 

 

72 

Figura 7 Perfil eletroforético dos produtos da PCR para amplificação do 

DNA com os oligonucleotídeos “sense” e “anti-sense” alelos-

específicos para H-131 e R-131 (253pb) em gel de agarose 2% 

em TBE pH 8,3. ............................................................................ 

 

 

 

73 

Figura 8 População de neutrófilos obtida a partir do método de gelatina. 

Lâmina preparada por citocentrifugação. Coloração de 

Leishman (microscopia de luz com aumento de 

100x).............................................................................................. 

 

 

 

78 

Figura 9 Padronização da concentração de imunocomplexos. Medida do 

burst oxidativo de neutrófilos (2x106) estimulados com 

diferentes concentrações de IC-IgG. Ensaio representativo de 3 

experimentos individuais............................................................... 

 

 

 

78 

Figura 10 Representação do perfil de QL registrado (mV) para os 

diferentes estímulos. Neutrófilos (2x106) de um indíviduo 

homozigoto para o genótipo FcγRIIIB-NA1 para 60μg de 

diferentes estímulos...................................................................... 

 

 

 

79 

 



 25 

Figura 11 Medida da QL-dependente de luminol.......................................... 80 

Figura 12 QL dos neutrófilos agrupados segundo as diferentes 

combinações dos genótipos do FcγRIIIb e do FcγRIIa.................. 

 

81 

Figura 13 Cooperação dos CR para aumentar o burst oxidativo dos 

neutrófilos. .................................................................................... 

 

82 

Figura 14 Análise da cooperação dos CR com os FcγR em mediar o burst 

oxidativo de neutrófilos, de indivíduos com genótipos NA1, NA2 

e NA1/2, mediado por FcγR (IC-IgG) e/ou FcγR/CR (IC-

IgG/SHN)....................................................................................... 

 

 

 

83 

Figura 15 Perfil de QL dentro do grupo NA2, separado de acordo com as 

combinações dos genótipos HR para FcγRIIa.............................. 

 

84 

Figura 16 Perfil de QL dentro do grupo HR, separado de acordo com as 

combinações de genótipos para NA............................................. 

 

85 

Figura 17 Histogramas representativos dos ensaios de citometria de fluxo 

para determinação da expressão dos FcγR, FcγRIIa (CD32) e 

FcγRIIIb (CD16), nos neutrófilos (PMN) humanos de 83 

amostras........................................................................................ 

 

 

 

86 

Figura 18 Histogramas representativos dos ensaios de citometria de fluxo 

para determinação da expressão dos receptores para 

complemento, CR1 (CD35) e CR3, nos neutrófilos (PMN) 

humanos de 55 amostras. ............................................................ 

 

 

 

87 

Figura 19A-B Análise da expressão de CD16 e CD32 por citometria de fluxo, 

nos neutrófilos de indivíduos com diferentes combinações dos 

genótipos para HR/NA................................................................... 

 

 

88 

Figura 20A-B Análise da expressão de CR3 e CR1, por citometria de fluxo, 

nos neutrófilos de indivíduos com diferentes combinações dos 

genótipos para HR/NA................................................................... 

 

 

89 

Figura 21A-F Análise da correlação da expressão dos receptores CD16, 

CD32, CR3 e CR1......................................................................... 

 

90 

Figura 22A-I Análise da correlação entre CD16 e CR3 nas diferentes 

combinações de genótiposHR/NA................................................. 

 

92 

Figura 23A-I Correlações entre CR1 e CD16 nas diferentes combinações de 

genótipos HR/NA........................................................................... 

 

94 

Figura 24A-I Correlações entre CD32 e CD16 nas diferentes combinações de 

genótipos HR/NA........................................................................... 

 

96 



 26 

LISTA DE TABELAS 
 
Tabela 1 Distribuição e propriedades dos FcγR humanos....................... 34 

Tabela 2 Seqüências dos oligonucleotídeos e das condições de PCR 

para a alotipagem dos FcγR...................................................... 

 

61 

Tabela 3 Distribuição dos genótipos FcγRIIIB e SH e freqüência dos 

alelos NA1/2.............................................................................. 

 

75 

Tabela 4 Freqüência das combinações dos genótipos NA1/2 e SH........ 75 

Tabela 5 Distribuição dos genótipos e freqüência dos alelos FcγRIIA..... 76 

Tabela 6 Freqüência das combinações observadas para os genótipos 

FcγR.......................................................................................... 

 

77 

Tabela 7 Comparação entre as freqüências dos genótipos para 

FcγRIIIb entre diferentes populações........................................ 

 

109 

Tabela 8 Comparação entre as freqüências dos genótipos para SH 

entre diferentes populações...................................................... 

 

109 

Tabela 9 Comparação entre as freqüências dos genótipos para FcγRIIa 

entre diferentes populações...................................................... 

 

110 

Tabela 10  Comparação entre as freqüências dos genótipos combinados 

para FcγRIIIb/SH entre diferentes populações.......................... 

 

110 

Tabela 11  Comparação entre as freqüências dos genótipos combinados 

para FcγRIIa/FcγRIIIb entre diferentes populações................... 

 

111 

 

 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 



 27 

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS 

A: Adenina 

ADCC: Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity 

Ala: Alanina 

Asp: Asparagina 

Ag: Antígeno 

BD: Becton & Dickinson 

BSA: Albumina de Soro Bovino (Bovine Serum Albumin) 

Domínio C: Domínio Citoplasmático 

C: Citosina 

ºC: Graus Celsius 

C3: Componente do Complemento 3 

C3b: Componente 3b do complemento 

C3bi: Fragmento inativado do componente C3b do complemento 

CD: Cluster of Differentiation 

cm: Centímetros 

CR: Receptor para Complemento 

CR1: Receptor para Complemento tipo 1 

CR3: Receptor para Complemento tipo 3 

DNA: Ácido desoxiribonucléico 

dNTP: Dinucleotídeo Trifosfato 

DO: Densidade Ótica 

EC: Extracelular 

EC1:  Domínio Extracelular 1 

EC2:  Domínio Extracelular 2 

EDTA.K2: Sal Dipotássico do Ácido Etilenodiaminotetracético 

EDTA.Na2 Sal Dissódico do Ácido Etilenodiaminotetracético 

ERO: Espécies Reativas de Oxigênio 

F:  Fenilalanina 

FACS: Fluorescent Activated Cell Sorter 

Fc: Fragmento cristalizável 

FcγR: Fc gamma receptors 

FcRn: Receptor Fc Neonatal para IgG 



 28 

FITC: Isotiocianato de Fluoresceína 

G: Guanina 

g: Força de aceleração da gravidade 

G-CSF: Fator Estimulador de Colônia Granulocítica 

GM-CSF: Fator Estimulador de Colônia Granulocítica Monocítica 

GN: Glomerulonefrite 

GPI: Glycosyilphosfatidylinositol 

H:  Histidina 

HGH: Hormônio do Crescimento Humano 

IC: Imunocomplexo 

IFN: Interferon 

Ig: Imunoglobulina 

IgG: Imunoglobulina da classe G 

IL: Interleucina 

ITAM: Immunoreceptor Tyrosyne-based Activation Motif 

ITIM: Immunoreceptor Tyrosyne-based Inhibitory Motif 

KCl: Cloreto de Potássio 

KDa: Kilodáltons 

LES: Lúpus Eritematoso Sistêmico 

LFA-1: Leukocyte Function-associated Antigen-1 

M: Molar 

μg: Microgramas 

μl: Microlitros 

mg: Miligramas 

MgCl2: Cloreto de Magnésio 

min.: Minutos 

mL: Mililitros 

mm: Milímetros 

mM: Milimolar 

MPO: Mieloperoxidase 

mV: Milivolts 

NA:  Neutrophil Antigen 

NA1: Neutrophil Antigen 1 



 29 

NA2: Neutrophil Antigen 2 

NAC: Núcleo de Atendimento a Comunidade 

NaCl: Cloreto de Sódio 

NADPH: Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Reduzido 

NH4Cl: Cloreto de Amônio 

ng: Nanogramas 

NK: Natural Killer 

nm: Nanômetros 

NNA: Neutropenia Neonatal Aloimune 

pb: Pares de Bases 

PBS: Salina Tamponada com Fosfato 

PCR: Reação em Cadeia da Polimerase 

PE: Ficoeritrina 

pH: Potencial Hidrogeniônico 

PMN: Polimorfonucleares 

QL: Quimioluminescência 

R:  Arginina 

RNA: Ácido Ribonucléico 

rpm: Rotações por minuto 

SBF: Soro Bovino Fetal 

SDS: Dodecil Sulfato de Sódio 

SHN: Soro Humano Normal 

SHNI: Soro Humano Normal Inativado 

SNP:  Single Nucleotide Polymorphism 

T:  Timina 

TBE: Tris-Borato-EDTA 

TEA: Trietanolamina 

TM: Transmembrana 

TNF: Fator de Necrose Tumoral 

U: Unidade 

UV: Ultra-Violeta 

V: Volts 

V:  Valina 

 



 30 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1. INTRODUÇÃO 



 31 

Neutrófilos  

Os neutrófilos são células fagocíticas extremamente importantes na defesa do 

hospedeiro contra microrganismos invasores e partículas estranhas. Nos mamíferos, a 

fagocitose de partículas estranhas é favorecida pela ligação das imunoglobulinas aos 

receptores para a porção Fc (FcR) nos fagócitos profissionais, tais como os neutrófilos e 

macrófagos, e a partícula opsonizada é, então, rapidamente internalizada. Esta 

internalização é caracterizada por uma extensão da membrana plasmática, dependente da 

actina, ao redor da partícula, e é seguida pela produção de espécies reativas de oxigênio, 

bem como pela liberação de enzimas lisossomais e de citocinas inflamatórias dos fagócitos 

(MAY; MACHESKY, 2001). 

Após estimulação o neutrófilo é capaz de produzir um metabolismo oxidativo, não 

mitocondrial, referido na literatura como burst (surto ou explosão) oxidativo ou respiratório. O 

burst oxidativo é caracterizado pela produção de espécies reativas de oxigênio (ERO), que 

são geradas por mecanismos dependentes da mieloperoxidase (MPO) liberada dos grânulos 

e por mecanismos independentes da MPO. Este metabolismo oxidativo dos neutrófilos é 

mediado por um complexo enzimático, associado às membranas citoplasmática e dos 

grânulos específicos, chamado nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzido (NADPH) 

oxidase (Figura 1). O complexo NADPH oxidase está dormente na célula não estimulada, e 

é formado por sete subunidades, sendo que no estado não ativado, duas permanecem 

associadas à membrana da célula e cinco no citoplasma. Quando os fagócitos são expostos 

a estímulos adequados, as sete subunidades se unem e o complexo rapidamente se ativa 

(BABIOR, 1988; EL-BENNA et al., 2005).  

 

 

 

 

 



 32 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 1- Esquema representativo do complexo NADPH oxidase na membrana da célula e 

suas subunidades (LICHTMAN, et al.,2006). 

 

Quando os neutrófilos são ativados, as ERO geradas podem, via oxidação, converter 

moléculas como o luminol a derivados intermediários instáveis e excitados, que quando 

retornam ao seu estado fundamental emitem luz na forma de fótons. Esta produção de luz, 

durante a reação química, é conhecida por quimioluminescência (QL) e é uma das 

características do burst oxidativo, podendo ser um indicador da ativação do metabolismo 

oxidativo. Desta forma, o luminol tem sido utilizado, como sonda quimioluminescente no 

estudo do metabolismo oxidativo dos neutrófilos. O luminol é exclusivamente oxidado pelo 

peróxido de hidrogênio (H2O2) e espécies derivadas dele sendo a enzima mieloperoxidase, 

presente nos neutrófilos, um importante catalisador da reação. (ALLEN, 1982). Assim, o 

luminol pode ser utilizado para avaliar a produção de ERO durante a estimulação dos 

neutrófilos (GASBARRINI et al., 1998). 

Os estímulos que desencadeiam o burst oxidativo, envolvem uma variedade de 

agentes solúveis e particulados, capazes de ativar os fagócitos, podendo estar ou não 

revestidos por proteínas do hospedeiro (opsoninas), tais como imunoglobulinas, formando 

complexos antígeno-anticorpo (imunocomplexos = IC) e/ou complemento, que podem 

aumentar o reconhecimento da partícula pelos fagócitos. Esta ligação é mediada por 

receptores para a porção Fc (fragmento cristalizável) da IgG (FcγR = Fc gamma receptors) 



 33 

e/ou receptores para complemento (CR) (MANTOVANI, 1975; MELAMED et al., 1982; 

OKHURO et al., 1995). 

Desta forma, a possibilidade de se estudar o metabolismo oxidativo dos neutrófilos 

por QL tem sido amplamente explorada e também utilizada para diferenciar doenças agudas 

e crônicas, o que implica na importância das alterações deste metabolismo para o 

significado clínico (ANTON et al., 1988; FONSECA et al., 1993; FONSECA et al., 1998). E 

como os neutrófilos podem ser ativados via FcγR e/ou CR, as diferenças nestes podem 

influenciar a dinâmica de ativação destas células. 

 

Receptores para IgG (FcγγγγR) 

As imunoglobulinas da classe G (IgG) exercem inúmeras e importantes funções 

biológicas pelo fato de interagirem com vários tipos celulares. A base desta interação é a 

ligação dos domínios Fc da IgG aos FcγR presentes nas membranas das células do sistema 

imune. Desta forma, os FcγR são importantes mediadores da ligação entre as respostas 

imunes celular e humoral, fazendo assim a ponte entre a imunidade inata e a adaptativa, 

com a finalidade de direcionar os imunocomplexos (IC) para as células efetoras (DAËRON, 

1997b; BIEZEVELD et al., 2006). 

A IgG constitui 70-75% do total de imunoglobulinas (Ig) do soro humano, é a classe 

mais abundante nas respostas imunes secundárias e está distribuída igualmente entre os 

espaços intra e extravasculares. Existem quatro subclasses de IgG humana (IgG1, IgG2, 

IgG3 e IgG4) e elas possuem cadeias pesadas denominadas γ1, γ2, γ3 e γ4, 

respectivamente, que diferem ligeiramente entre si na seqüência de aminoácidos. Estas 

quatro subclasses de IgG (IgG1-IgG4) ocorrem, aproximadamente em proporções de 66%, 

23%, 7% e 4%, respectivamente (MORELL et al., 1972; SCHUR, 1987). 

Inicialmente, os FcγR foram descritos há mais de 30 anos como glicoproteínas de 

membrana e, posteriormente, formas solúveis destas moléculas foram identificadas em 

alguns fluídos biológicos (DAËRON, 1997b; GALON et al., 1995). Os FcγR atuam como 



 34 

reguladores das respostas imunes (NIMMERJAHN; RAVETCH, 2008) e a ligação da IgG 

aos FcγR estimula uma variedade de respostas biológicas, as quais dependem de fatores 

como: tipo celular, tipo de receptor Fcγ e natureza do complexo de IgG como está 

apresentado na Tabela 1.  

 

Tabela 1- Distribuição e propriedades dos FcγR humanos  

Expressão FcγγγγR 
Constitutiva Induzida Modulada 

Função Especificidade 

FcγγγγRI Monócitos, 
Macrófagos, 
precursores 
mielóides CD34+ 

Neutrófilos 
(IFN-γ, G-
CSF);  

↑: G-CSF, 
IFN-γ, IL-10 

Fagocitose, ADCC, 
Endocitose, 
Internalização, 
Apresentação de 
antígeno, Produção 
de superóxido, 
Liberação de: TNF-
α, IL-1β, IL-6 

Monômeros e 
agregados de IgG1 e 
IgG3 humanas 

  Eosinófilos 
(IFN-γ) 

↓: IL-4, IL-3   

      
FcγγγγRII      

IIa Monócitos, 
Macrófagos, 
Neutrófilos, 
Eosinófilos, 
Basófilos, Células 
de Langerhans, 
Plaquetas, Células 
endoteliais da 
placenta, Linhagem 
de células 
megacariocíticas 

 ↑: IL-4 
 
↓: IFN-γ, IL-3 
(eosinófilos 
somente) 

IIa:Fagocitose, 
ADCC, Endocitose, 
Internalização, 
Burst respiratório, 
Liberação de: TNF-
α, IL-6 

IIb Monócitos, 
Macrófagos, 
Células B, 
Subpopulações de 
Células T 

  IIb1: Capping 
IIb2: Internalização 
IIb1/2: Down 
regulação de 
células B 

IIa-H131: IC de 
IgG3>IgG1=IgG2>>IgG
4 
 
 
IIa-R131: IC de 
IgG3>IgG1>>IgG2,4 
 
 
IC de IgG1 e IgG3 

      
FcγγγγRIII      

IIIa Macrófafos, 
Linfócitos grande 
granulares/células 
NK, Células T γδ, 
Subpopulações de 
monócitos 

Monócitos: 
TGF-β 

↓: IL-4 
↑: TGF-β 

Fagocitose, ADCC, 
Endocitose, 
Internalização, 
Produção de 
superóxido, 
Liberação de: IFN-
γ, TNF-α, Indução 
de apoptose 

Afinidade intermediária 
para IgG monomérica e 
IC de IgG1 e IgG3 

IIIb Neutrófilos Eosinófilos: 
IFN-γ 

↑: IFN-γ, GM-
CSF, G-CSF 

 IIIb-NA1: IC de 
IgG3>>IgG1>>IgG2,4 
IIIb-NA2: IC de 
IgG3>IgG1>>IgG2,4 

Fonte: MARZOCCHI-MACHADO; LUCISANO-VALIM, 2005 

 

Estas respostas incluem processos diretamente relacionados com a eliminação de 

antígenos tais como: fagocitose, citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC: 

antibody dependent cell-mediated cytotoxicity), geração de espécies reativas de oxigênio 

(indução do burst oxidativo), liberação de enzimas lisossomais, clearance de IC e regulação 



 35 

da produção de anticorpos. Além do fato de que os FcγR também participam da imuno-

regulação na patogênese de reações alérgicas (MALBEC; DAËRON, 2007), auto-imunes e 

inflamatórias (BIEZEVELD et al., 2006; SCHMIDT; GESSNER, 2005; TAN SARDJONO et 

al., 2003; DAËRON, 1997b). Esta diversidade funcional dos FcγR também é atribuída ao 

polimorfismo genético, que introduz variações entre os indivíduos (RASCU et al., 1997), bem 

como à geração de formas solúveis de FcγR (GALON et al., 1995) e ao sinergismo com 

outros receptores (ZHOU; BROWN, 1994). 

Nos seres humanos, todos os FcγR pertencem à superfamília das imunoglobulinas e 

são expressos em muitas células, principalmente nas de origem hematopoética, mas não 

são marcadores específicos de um clone, e uma mesma célula pode expressar mais do que 

um tipo deste receptor (DAËRON, 1997a). Sabe-se que os FcγR não reconhecem 

diretamente o antígeno, mas quando a imunoglobulina se liga ao FcγR, confere ao antígeno 

especificidade para uma grande variedade de células, sendo que a maioria das quais são 

destituídas de estruturas para o reconhecimento de antígeno (DAËRON, 1997a; 

BIEZEVELD et al., 2006), 

Os FcγR diferem em vários fatores, como: expressão e distribuição das diferentes 

classes destes receptores na superfície das células hematopoiéticas, peso molecular, 

afinidade (força e capacidade) de ligação às diferentes sub-classes de IgG e tipo de sinal 

intracelular. Sendo que a heterogeneidade destas classes de moléculas é ainda aumentada 

pelos polimorfismos genéticos e funcionais de algumas sub-classes ou isoformas destes 

receptores (FcγRIIA, FcγRIIIA e FcγRIIIB), cujos polimorfismos estão localizados nos 

domínios extracelulares, que são sítios de ligação de Ig e desta forma afetam a afinidade de 

ligação às diferentes sub-classes de IgG  (DAËRON, 1997a; GESSNER et al., 1998; 

KIMBERLY; SALMON; EDBERG, 1995; TORKILDSEN et al., 2005).  

Assim, as três principais classes de FcγR reconhecidas nas superfícies celulares são: 

um receptor de alta afinidade FcγRI (CD64) e, os de baixa afinidade, FcγRII (CD32) e FcγRIII 

(CD16), além do receptor Fc neonatal para IgG (FcRn), cada um contendo múltiplos genes 



 36 

distintos e variantes nos splicings alternativos. Além disso, os receptores FcγR exibem 

algumas isoformas: FcγRI (CD64) - FcγRIa e FcγRIb; FcγRII (CD32) - FcγRIIa, FcγRIIb e 

FcγRIIc; e FcγRIII (CD16) - FcγRIIIa e FcγRIIIb. Sendo que alguns destes genes, FcγRIIA, 

FcγRIIIA e FcγRIIIB, demonstram determinados polimorfismos genéticos (DAËRON, 1997a; 

GESSNER et al., 1998; KIMBERLY; SALMON; EDBERG, 1995; TORKILDSEN et al., 2005; 

DE HAAS et al., 1996).   

As classes de FcγR são codificadas por oito genes distintos que estão localizados no 

braço longo do cromossomo 1 (1q21-23), nas bandas 1p13 e 1q21 (FcγRI), na banda 1q22 

(FcγRII e FcγRIII) e no cromossomo 19 nas bandas 19q13 para o FcRn. Alguns destes 

genes têm múltiplos exons e a seleção entre estes, na junção do RNA mensageiro (RNA-m) 

(splicing alternativo), pode gerar proteínas diferentes. A análise da seqüência dos RNAs-m 

indica a possibilidade da ocorrência de várias isoformas das três principais classes de FcγR, 

no entanto, muitas delas ainda não foram demonstradas in vivo (DAËRON, 1997b; 

GESSNER et al., 1998; BAZÍLIO et al., 2004). 

Além disso, o polimorfismo genético é responsável por variações entre os indivíduos. 

Por exemplo, o FcγRIIa, presente em neutrófilos, possui duas variantes alotípicas, o FcγRIIa-

R131 e o FcγRIIa-H131, sendo que o FcγRIIa-R131 não liga a IgG2, ou o faz muito 

fracamente. Enquanto que o FcγRIIIb apresenta 3 alótipos, os antígenos de neutrófilo ou 

antígenos de neutrófilos humanos (NA - Neutrophil Antigen ou HNA – Human Neutrophil 

Antigens) 1 (NA1 ou HNA-1a) e 2 (NA2 ou HNA-1b)  e o SH ou HNA-1c (BUX et al., 1997; 

SALMON; EDBERG; KIMBERLY, 1990; STEFFENSEN; VARMING; VERSILD, 2000).  

Em relação à sua estrutura molecular, os FcγR podem apresentar dois ou três 

domínios extracelulares (EC) semelhantes aos das imunoglobulinas (Ig-like), que são 

altamente conservados entre as diferentes classes destes receptores. Além dos domínios 

EC, os FcγR possuem domínios transmembrana (TM) e domínios citoplasmáticos (C). 

Sendo que o sítio de ligação para a IgG encontra-se no domínio EC de uma cadeia de 

aminoácidos, denominada cadeia α, presente nos FcγR. Alguns dos FcγR são moléculas 



 37 

formadas por complexos de uma ou mais cadeias (γ, β ou ζ) associadas à cadeia α, sendo 

assim conhecidos como receptores de cadeias múltiplas, enquanto outros são apenas 

formados pela cadeia α, e por isso são conhecidos como receptores de cadeia única 

(GESSNER et al., 1998). 

Os receptores de IgG formados por cadeias múltiplas, podem ser divididos em dois 

tipos principais. O primeiro tipo é representado pelos FcγRI e FcγRIIIa, que são compostos 

de uma cadeia ou subunidade α ligante de IgG, semelhante àquela presente nos receptores 

de cadeia única. Nestes receptores, embora esta subunidade α apresente domínios EC e 

TM, o domínio citoplasmático não possui a seqüência de aminoácidos transdutora de sinal 

intracelular. No entanto, as subunidades α do FcγRI e do FcγRIIIa estão associadas a uma 

ou duas cadeias acessórias, que contêm tais seqüências de sinalização. Estas cadeias 

acessórias encontram-se na membrana celular e podem variar de acordo com o tipo celular 

onde estão expressas. Sendo assim, constituem as subunidades de transdução de sinal 

intracelular, quando há a ligação da IgG ao seu receptor (DAËRON, 1997b; GESSNER et 

al., 1998; FLESH; NEPPERT, 2000). 

O segundo tipo de receptor de IgG, formado por mais de uma cadeia, é o FcRn, e é o 

que possui alta afinidade para a IgG (ORLOFF et al., 1990). 

Já os FcγR de cadeia única que são receptores de baixa afinidade e compreendem 

as isoformas: FcγRIIb, FcγRIIa/c e FcγRIIIb. Os FcγRII apresentam uma cadeia α com um 

domínio EC, um domínio TM e um domínio C (com uma seqüência de aminoácidos 

responsável pela transdução de sinal intracelular). Entretanto, a cadeia α do FcγRIIIb não 

apresenta os domínios TM e C, portanto, a expressão deste receptor na membrana dos 

neutrófilos é mediada por uma molécula âncora de glicosil fosfatidil inositol (GPI: 

Glycosylphosphatidylinositol) (DAËRON, 1997b; SELVARAJ et al., 1988; ZHOU; BROWN, 

1994).  

De acordo com as propriedades biológicas dos FcγR de membrana, podemos dividí-

los em dois grupos principais sob o aspecto funcional: os FcγR que induzem a ativação 



 38 

celular e os FcγR que não o fazem. Assim, respectivamente, o primeiro grupo de receptores 

possui um ou mais motivos de ativação citoplasmáticos denominados ITAM 

(Immunoreceptor Tyrosyne-based Activation Motif) e incluem os receptores de cadeia única 

(FcγRIIa) e os de cadeias múltiplas (FcγRI e FcγRIIIa). O segundo grupo, o dos receptores 

sem ITAM, inclui os FcγR que não estimulam a ativação celular e podem ser divididos em: a) 

receptores de cadeia única (FcγRIIb), apresentando ITIM (Immunoreceptor Tyrosyne-based 

Inhibitory Motif)  no seu domínio C, que inibe a ativação celular mediada pelos receptores 

com ITAM, b) o FcγRIIIb, que não possui domínio C e por si só não é capaz de ativar a 

célula, mas contribui para a sinalização graças à co-expressão com outros receptores, o 

FcγRIIa e o receptor para complemento tipo 3 (CR3), e c) o FcRn, que não estimula nem 

inibe a célula, apenas medeia a transcitose da IgG em células polarizadas e recentemente 

tem sido sugerido que em neutrófilos este receptor neonatal tenha um papel importante em 

mediar a fagocitose (VIDARSSON et al., 2006; DAËRON, 1997a; DAËRON, 1997b).  

A interação entre FcγR e IgG estimula a rápida fosforilação dos resíduos de tirosina 

específicos nos motivos ITAMs dos domínios citoplasmáticos do receptor ou das moléculas 

acessórias (DAËRON, 1997a; DAËRON, 1997b). 

A Figura 2 ilustra as características estruturais da família de FcγR.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 39 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 2- Representação esquemática da família de receptores humanos para Fc de 

Imunoglobulina G (FcγR). S-S: pontes de dissulfeto; ITAM: seqüência de ativação de imuno-

receptor baseada em tirosina (Immunoreceptor Tyrosyne-based Activation Motif); ITIM: 

seqüência de inibição de imuno-receptor baseada em tirosina (Immunoreceptor Tyrosyne-

based Inhibitory Motif); GPI: glicosil fosfatidil inositol (glycosylphosphatidylinositol). Os 

domínios Ig-semelhantes (Ig-like) próximos à membrana são os domínios ligantes de IgG. 

Com exceção do FcγRIIIb, todos os FcγR são moléculas transmembrana. Os produtos dos 

genes para cada classe de FcγR e suas subunidades individuais estão indicados como: a, b, 

e c; e α, β, γ e ζ, respectivamente. Fonte: MARZOCCHI-MACHADO; LUCISANO-VALIM, 

2005. 

  

 O FcγRI é primariamente expresso em monócitos e macrófagos, e como já dito 

anteriormente, é capaz de ligar IgG monomérica com alta afinidade (GESSNER et al., 1998). 

 

Ia 

Ib2 

ITAM 

Iγγγγ 

-S-S- 

FcγγγγRI (CD64) 

+ + 

FcγγγγRII (CD32) 

-S-S- 

+ + 

IIγγγγ 

IIa IIc 

+ + 

ITIM 

IIb3 IIb1 

– – 
– 

IIb2 

-S-S- 

IIIζζζζ 

+ 

+ 

+ 

+ 

+ 

+ 

+ 

IIIζζζζ-γγγγ 

-S-S- 

+ 

+ 

+ 

+ 

IIIaββββ IIIaγγγγ 

-S-S- 

+ + 

IIIa IIIb 

Âncora de GPI 

FcγγγγRIII (CD16) FcRn 

ββββ2 microglobulina 

αααα αααα αααα αααα αααα αααα αααα 

αααα αααα αααα 



 40 

O FcγRII é a classe de receptores mais amplamente distribuída e é expresso em 

muitos tipos de células sangüíneas (leucócitos e plaquetas) (BIEZEVELD et al., 2006). Esta 

classe de receptor liga IgG na forma de IC e é predominantemente expresso em células 

mielóides. Um total de três genes, FcγRIIA, FcγRIIB e FcγRIIC, codificam respectivamente 

três isoformas: FcγRIIa, FcγRIIb e FcγRIIc. E este polimorfismo genético parece ser 

responsável por variações entre os indivíduos, além do fato de que estas isoformas 

apresentam funções divergentes, estimulatórias ou inibitórias, dependendo da presença do 

ITAM ou ITIM (Immunoreceptor Tyrosine-based Activation/Inhibition Motifs) no seu domínio 

intracitoplasmático (MARZOCCHI-MACHADO; LUCISANO-VALIM, 2005). Assim, a co-

ligação tanto ao FcγR inibitório quanto ao FcγR estimulatório, pode determinar a magnitude 

da resposta celular efetora (VAN DEN BERG et al., 2001).  

O FcγRIIa está presente nos fagócitos mononucleares, neutrófilos e plaquetas, e é 

encontrado tanto na forma transmembrana (FcγRIIa1) quanto na forma solúvel (FcγRIIa2). 

Este tipo de receptor possui um importante e funcional polimorfismo de um único 

nucleotídeo (SNP: single nucleotide polymorphism), localizado no exon 4 (A/G) que leva à 

substituição de um aminoácido, uma arginina (R) ou uma histidina (H) na posição 131, no 

domínio extracelular 2 (EC2) da molécula (BIEZEVELD et al., 2006; WARMERDAN et al., 

1990; KUWANO et al., 2000). Assim, dois alelos são expressos co-dominantemente, o 

FcγRIIa-R131 e o FcγRIIa-H131. Estas variantes polimórficas, interagem diferentemente com 

as subclasses de IgG, pois esta substituição do aminoácido influencia fortemente a sua 

capacidade para ligar principalmente a IgG2 humana. Assim, o FcγRIIa-H131 é o receptor 

de IgG que eficientemente liga IgG2 em humanos, enquanto o FcγRIIa-R131 não o faz ou o 

faz muito fracamente (BIEZEVELD et al., 2006; BAZÍLIO et al., 2004; TORKILDSEN et al., 

2005). Assim, o genótipo H/H induz os fagócitos à uma capacidade de fagocitose maior do 

que o H/R e o R/R (TORKILDSEN et al., 2005; SALMON et al., 1992). Além disso, como a 

IgG2 não é um potente ativador da via clássica do complemento, o FcγRIIa-H131 é 

essencial para uma ligação eficiente de IC de IgG2 (BAZÍLIO et al., 2004) já que esta sub-



 41 

classe de IgG é a principal responsável pela resposta contra bactérias encapsuladas. 

Variações alélicas do FcγRIIA são comuns dentro da população e podem influenciar, em 

certos contextos ambientais e genéticos, na suscetibilidade a doenças mediadas por IC 

(BAZÍLIO et al., 2004). 

Quanto aos FcγRIII (CD16) humanos, estes são proteínas altamente glicosiladas que 

possuem pesos moleculares entre 50 a 80kDa. Estes receptores são capazes de ligar IgG 

na forma de IC, com especificidade para IgG1 e IgG3 (Ka < 107M-1) e pequena ligação para 

IgG4 e IgG2 (KIMBERLY; SALMON; EDBERG, 1995; GESSNER et al., 1998). 

A diversidade molecular do FcγRIII é decorrente da existência de dois genes, FcγRIIIA 

e FcγRIIIB, altamente homólogos. O produto do gene FcγRIIIA é o FcγRIIIa, que é um 

receptor transmembrana expresso em macrófagos e em  células natural killer (NK), onde 

medeiam as funções citotóxicas e fagocíticas, sendo que nestas células dois alelos são 

expressos co-dominantemente, V158 (V: valina) e F158 (F: fenilalanina) (KOENE et al., 

1997; WU et al., 1997).  

Enquanto que o gene FcγRIIIB codifica o FcγRIIIb, exclusivamente expresso nos 

neutrófilos, ligado à sua membrana por GPI (também promove a estimulação do burst 

oxidativo), sendo o único FcγR sem domínio TM (SELVARAJ et al., 1988; ZHOU; BROWN, 

1994; TORKILDSEN et al., 2005). Mas dados experimentais, revelaram uma associação de 

proteínas ligadas à GPI dos FcγRIIIb, com domínios particulares de membrana, ricos em 

tirosina quinases (BROWN; ROSE, 1992; ZHOU; BROWN, 1994).  

O FcγRIIIb, preferencialmente, remove pequenos complexos imunes (ou 

imunocomplexos) da circulação. Além disso, o FcγRIIIb é liberado da membrana dos 

neutrófilos durante a apoptose, e na sua forma solúvel pode inibir a proliferação e a 

produção de imunoglobulinas por linfócitos B estimulados (BUX et al., 1997).   

O gene FcγRIIIB também apresenta um polimorfismo, que determina a ocorrência 

dos alótipos de antígenos específicos dos neutrófilos (NA - Neutrophil Antigen), 1 (NA1) e 2 

(NA2), sorologicamente definidos (SALMON; EDBERG; KIMBERLY, 1990; BUX et al., 1997; 



 42 

OMI et al., 2002).  

A seqüência de nucleotídeos dos genes de NA1 e NA2 codificam uma proteína 

contendo 233 resíduos de aminoácidos, entretanto, ao nível de DNA, os alelos NA1 e NA2 

diferem em cinco nucleotídeos (G/C, C/T, A/G, G/A e G/A, respectivamente nas seguintes 

posições 141, 147, 227, 277 e 349), dentro do exon três, sendo que um deles (posição 147) 

é uma mutação silenciosa. Quando estes nucleotídeos são traduzidos, resultam em quatro 

aminoácidos diferentes entre os alótipos NA (R/S-36, N/S-65, D/N-82 e V/I-106) localizados 

no domínio EC1, com mutações nas posições 65 e 82, dando origem a dois sítios extras de 

glicosilação (seis ao invés de quatro) no FcγRIIIb-NA2 (SALMON; EDBERG; KIMBERLY, 

1990; BREDIUS et al., 1994; ORY et al., 1989; KUWANO et al., 2000).   

Os alótipos NA diferem em seu peso molecular relativo: de 50 a 65 kDa para 

FcγRIIIb-NA1 e de 65 a 80 kDa para FcγRIIIb-NA2. Sendo que os diferentes pesos 

moleculares são atribuídos aos diferentes padrões de glicosilação, dois sítios de glicosilação 

a mais na isoforma NA2 do que na NA1. Além disso, os alótipos também se diferenciam 

pela capacidade de ligação aos diferentes tipos de subclasses de IgG humanas, o que 

influencia fortemente a capacidade fagocítica dos neutrófilos, demonstrando que este 

polimorfismo pode ter conseqüências significantes para as funções fisiológicas (BUX et al., 

1997; SALMON; EDBERG; KIMBERLY, 1990; KUWANO et al., 2000). 

Os neutrófilos de indivíduos com o alótipo NA2 são menos eficientes para fagocitar 

IC com IgG1 e IgG3, quando comparados com os neutrófilos de indivíduos do alótipo NA1. 

No entanto, estes alótipos não apresentam diferenças quanto à fagocitose mediada por 

IgG2 (SALMON; EDBERG; KIMBERLY, 1990; BREDIUS et al., 1994). Desta forma, o 

FcγRIIA e o FcγRIIIB podem ser simultaneamente ligados, levando à uma colaboração na 

inicialização das funções integradas da célula. O polimorfismo FcγRIIIB-NA1/NA2, apresenta 

influência sob a função do FcγRIIA de forma alelo-específica. Já o FcγRIIIB-NA2/NA2, 

apresenta uma menor ativação da fagocitose mediada por FcγRIIA, quando comparada com 

o FcγRIIIB-NA1/NA1 (OMI et al, 2002). 



 43 

Vários estudos étnicos mostram variações na distribuição dos vários genótipos de 

FcγR (TORKILDSEN et al., 2005). Aproximadamente 0,1% da população Européia, não 

expressa o receptor FcγRIIIb em seus neutrófilos e consequentemente não apresentam os 

antígenos NA1 e NA2. Este fenótipo é chamado de NA-nulo é causado por uma deficiência 

no gene FcγRIIIB (BUX et al., 1997).  

Um outro alo-antígeno ou alótipo do gene FcγRIIIB, chamado SH, foi localizado no 

FcγRIIIb e é resultante de uma mutação em um único nucleotídeo no gene FcγRIIIB-NA2, C 

(no indivíduo NA2) para A (no indivíduo SH+) na posição 266, que resulta na substituição de 

uma alanina por um ácido aspártico na posição 78 (BUX et al., 1997; KUWANO et al., 2000). 

Um estudo de famílias confirmou que esta substituição de nucleotídeos é herdada, e 

corresponde ao fenótipo SH. Existe ainda uma outra hipótese de que os indivíduos SH 

positivos, possuam uma cópia adicional do gene FcγRIIIB, o qual pode ocorrer in tandem 

com NA2-FcγRIIIB (KOENE et al., 1998). Assim, três genes são identificados: FcγRIIIB-NA1, 

FcγRIIIB-NA2 e FcγRIIIB-SH (BUX et al., 1997; KOENE et al., 1998). A Figura 3 apresenta 

as variantes polimórficas dos FcγRIIa e FcγRIIIb. 

 

 

 

 

 

 

Figura 3- Representação esquemática das variantes polimórficas dos receptores humanos 

para Fc de imunoglobulina G (FcγR): R/Arg (Arginina)-131; H/His (Histidina)-131; V/Val 

(Valina)-158; F/Fen (Fenilalanina)-158; NA: antígeno de neutrófilo (neutrophil antigen; NA1 e 

NA2). ITAM: seqüência de ativação de imuno-receptor baseada em tirosina 

(Immunoreceptor Tyrosyne-based Activation Motif); GPI: glicosil fosfatidil inositol 

(glycosylphosphatidylinositol). Fonte: MARZOCCHI-MACHADO; LUCISANO-VALIM, 2005. 

 

 

FcγγγγRIIa 

+ 

IIa-H131 

+ 

IIa-R131 

-Arg131 -His131 

IIIa-F158 IIIa-V158 

FcγγγγRIIIa 

–Fen 158 –Val 158 

FcγγγγRIIIb 

IIIb-NA1 

Sítios de Glicosilação 

< 

IIIb-NA2 

< 
< 

< 

< 



 44 

As diferenças alélicas no FcγRIIA-131 e FcγRIIIA-176 podem predispor o indivíduo às 

doenças auto-imunes com base numa incapacidade de realizar o clearence dos IC ou 

mudanças no sinal de transdução sob estímulos apropriados, e alguns autores relatam a 

ocorrência de lúpus eritematoso sistêmico (LES) em pacientes com deficiência de FcγRIIIB. 

Além disso, alguns estudos prévios em várias populações indicam uma possível 

participação ou influência dos polimorfismos de FcγRIIA, FcγRIIIA e FcγRIIIB na 

suscetibilidade ao LES, nefrite lúpica e artrite reumatóide. Fatos que demonstram a 

importância da caracterização genética dos indivíduos quanto a estes polimorfismos, para 

contribuir para a identificação dos fatores primários que possam estar associados com as 

doenças auto-imunes (GONZÁLEZ-ESCRIBAN et al., 2002). 

As formas alotípicas do FcγRIIIb (NA1 versus NA2) também apresentam diferenças 

quanto à ligação e à fagocitose e podem ter relevância clínica para a suscetibilidade à 

doenças infecciosas. Já que este polimorfismo e a deficiência deste receptor têm sido 

associados à neutropenia neonatal, quando mães são alo-imunizadas em gestações 

anteriores, e passam anticorpos IgG anti-FcγRIIIb para o feto FcγRIIIb (+) (VANCE et al., 

1993; HUIZINGA et al., 1990).  

Desta forma, os polimorfismos do FcγR podem influenciar a intensidade da resposta 

inflamatória, além de contribuir para as diferenças na suscetibilidade às doenças infecciosas 

e auto-imunes. Existem ainda, variações étnicas na freqüência de distribuição dos diferentes 

alótipos. Já que a prevalência das doenças auto-imunes e infecciosas também varia entre 

os diferentes grupos étnicos, pode ser que o polimorfismo destes receptores exerça 

importância clínica frente a estas doenças (VAN DEN BERG et al., 2001). 

 

Receptores para complemento 

Como o FcγRIIIb é incapaz de estimular a ativação celular por si só, por não possuir 

uma seqüência de sinalização citoplasmática, a sua interação com outros receptores na 

superfície celular é importante para uma resposta efetora completa, pois a cooperação do 



 45 

FcγRIIIb com o FcγRIIa e o CR3 é necessária para a fagocitose, ADCC e desgranulação 

eficientes. Além disso, a co-agregação dos FcγRIIIb nos neutrófilos leva à ativação celular 

(ZHOU; BROWN,1994; HUNDT; SCHMIDT, 1992). 

Portanto, a ativação simultânea do FcγRIIIb e CR3 leva ao burst oxidativo em 

neutrófilos, devido à fosforilação do domínio C do FcγRIIa e ao cross-linking do CR3, que 

induz a associação do FcγRIIa com o citoesqueleto (ZHOU; BROWN,1994). Uma vez que a 

expressão do FcγRIIIb é predominante nos neutrófilos, com 1-3x106 moléculas/célula, e a 

expressão de FcγRIIa é de 1-2x104 moléculas/célula (UNKLESS et al., 1995), há de 10 a 20 

vezes mais moléculas de FcγRIIIb expressas na superfície dos polimorfonucleares (PMN) do 

que FcγRIIa (HUIZINGA et al., 1990; ZHOU; BROWN, 1994). 

Assim, alguns estudos sugerem que, em neutrófilos, o FcγRIIIb, embora não possua 

domínios TM ou C, seria importante para o acúmulo de IC na membrana para ativar o 

FcγRIIa e para estimular o aumento do influxo de cálcio (Ca+2), enquanto que o FcγRIIa seria 

o responsável pelo potencial de membrana e geração de superóxido (BRUNKHORST et al., 

1992; ZHOU et al., 1993). 

Os neutrófilos expressam os receptores para complemento CR1 e CR3 em sua 

superfície e ambos estão implicados com a fagocitose. O CR1 (CD35) é uma proteína 

transmembrana e medeia a aderência de partículas, já o CR3 é uma integrina 

heterodimérica (CD11b/CD18 ou Mac-1), capaz de ligar vários ligantes através de diferentes 

sítios de reconhecimento, e a ligação de C3bi (fragmento inativado do componente 3b do 

complemento) leva à fagocitose da partícula. O CR1 e o CR3 ligam o componente 3b do 

complemento (C3b) e o C3bi com diferentes afinidades (MAY; MACHESKY, 2001). 

A cooperação entre FcγR e receptor para complemento (CR) nos neutrófilos para 

promover a fagocitose está bem estabelecida na literatura (MANTOVANI, 1975; BROWN; 

BOHNSACK; GRESHAM, 1988; ZHOU et al., 1993). Pelo fato da IgG e do componente do 

complemento 3 (C3) serem as duas principais opsoninas do soro humano, a colaboração 

entre os receptores para anticorpo e complemento possui um importante papel na defesa do 



 46 

hospedeiro, e o sinergismo entre anticorpo e complemento ativa as funções efetoras dos 

fagócitos (MANTOVANI, 1975; ZHOU; BROWN, 1994).   

Desde o trabalho de Ehlenberger e de Nussenzweig (1977) foi proposto que o papel 

da opsonização das partículas com complemento e sua interação com os CR era apenas 

aumentar a eficiência da apresentação de IgG para receptores Fc em fagócitos. Outros 

dados da literatura também apontavam para a falta de um papel para os CR na sinalização 

das funções destas células (ADEREM et al., 1985). Porém, outros estudos sugerem que os 

CR possam ter um papel direto na transdução de sinal, em funções mediadas por FcγR em 

fagócitos. Estudos bio-físicos mostraram que o CR3, um membro da família das β2 

integrinas, coopera com FcγRIII em PMN, hipotetizando-se uma interação física direta entre 

FcγRIII e CR3 (ZHOU; BROWN, 1994).  

Um mecanismo potencial para a associação física destas duas moléculas na 

superfície dos neutrófilos é a interação lectina-sacarídeo (lectin-saccharide). Esta hipótese 

parece atrativa, porque Ross et al. (1985) mostraram que os CR3 possuem atividade lectina-

semelhante e o FcγRIIIb apresentam sítios de ligação para a lectina. Portanto, para que haja 

a interação entre FcγRIIIb e outros receptores é necessário que este possua sítios para 

lectina (ZHOU et al., 1993). Além disso, os neutrófilos possuem uma outra integrina, a LFA-1 

(leukocyte function-associated antigen-1; CD11a/CD18), que é estrutural e funcionalmente 

homóloga ao CR3. Esta molécula participa na interação entre CR3 e FcγRIIIb na membrana 

dos neutrófilos. Assim, além de ligar carboidratos na superfície de partículas estranhas, o 

CR3 também pode se ligar a carboidratos expressos na superfície dos neutrófilos (ZHOU et 

al., 1993). 

Em particular, o FcγRIIIb é conhecido por possuir cadeias de oligossacarídeos, desta 

forma, a interação do CR3 com o FcγRIIIb via o sítio de ligação lectina-sacarídeo-like, 

poderia explicar a  associação destes receptores, a qual é importante para a fagocitose com 

FcγR descrita anteriormente (MANTOVANI, 1975; KIMBERLY et al, 1990; ZHOU et al., 

1993; ROSS; CAIN; LACHMANN, 1985). 



 47 

FcγγγγR e doenças 

Existem circunstâncias nas quais a interação dos IC com os neutrófilos, via FcγR 

e/ou CR, pode estar envolvida na fisiopatologia de doenças inflamatórias crônicas, 

especialmente aquelas de caráter auto-imune, tais como as doenças por imunocomplexos 

(DAVIES, 1996). Nestas doenças ocorre deposição de IC nos tecidos e conseqüentemente 

acúmulo de neutrófilos, estabelecendo-se um processo inflamatório no local. Os neutrófilos 

aderem aos IC depositados na tentativa de fagocitá-los. No entanto, o IC não é internalizado 

e em conseqüência desta fagocitose “frustrada”, há uma liberação maciça das ERO e 

enzimas lisossomais dos neutrófilos sobre as células do hospedeiro, causando lesão 

tecidual. Em circunstâncias normais, as proteinases que extravasam para o meio 

extracelular, durante a fagocitose, são rapidamente inativadas por antiproteinases, 

presentes nos fluidos intersticiais e no plasma, limitando os efeitos deletérios das 

proteinases sobre os tecidos. No entanto, estudos demonstraram que as antiproteinases 

eram sensíveis à oxidação por reagentes químicos ou produtos dos neutrófilos estimulados. 

A oxidação das antiproteinases diminui cerca de duas mil vezes a velocidade de associação 

entre estes inibidores e a elastase do neutrófilo. Assim, o ataque dos tecidos pela elastase 

não pode ser inibido. Ainda que o recrutamento dos neutrófilos para o foco inflamatório, 

inicialmente, tenha a função de defesa, em algumas circunstâncias, como nas doenças por 

IC, estas células tornam-se responsáveis pela destruição dos tecidos do hospedeiro 

(WEISS, 1989).  

Os IC formados por IgG estão envolvidos na patogênese de várias nefropatias 

incluindo a glomerulonefrite (GN) causada pelo LES. O clearance anormal de IC de IgG é 

considerado um importante fator na patogênese da GN, particularmente na nefrite causada 

pelo LES. Este clearance depende essencialmente da expressão de receptores para IgG 

(FcγR) nas células (MARZOCCHI-MACHADO; LUCISANO-VALIM, 1997). 

Existe ainda, uma alta relevância com relação aos polimorfismos das isoformas dos 

FcγR para a suscetibilidade e para o prognóstico das doenças auto-imunes (SALMON; 



 48 

PRICOP, 2001; KARASSA; TRIKALINOS; IOANNIDIS, 2004), das doenças infecciosas 

(YUAN et al., 2003; REKAND et al., 2002), das respostas biológicas aos agentes 

terapêuticos (LOUIS et al., 2004, GRUEL et al., 2004) e do risco de rejeição a aloenxertos 

(YUAN et al., 2004).  

Os antígenos NA são clinicamente importantes, pois o polimorfismo estrutural do 

FcγRIIIb resulta na formação de alo-anticorpos, os quais podem ser responsáveis pela 

ocorrência da neutropenia neonatal alo-imune (NNA) e reações transfusionais (KOENE et 

al., 1998). Por causa da alo-imunização, o SH também tem sido reportado como causa da 

NNA, pois alo-anticorpos para o antígeno SH já foram identificados no soro materno de 

casos de NNA, indicando que a alo-imunização não é um evento raro. Embora esta 

patologia não seja muito freqüente, a NNA pode levar à graves infecções, como meningite 

ou pneumonia, principalmente quando não reconhecida adequadamente logo após o 

nascimento (BUX et al., 1997). 

Assim, pelo fato dos FcγR mediarem importantes respostas biológicas, 

especialmente a ativação de neutrófilos, a ativação e a regulação das funções mediadas por 

eles podem estar envolvidas na fisiopatologia de várias doenças e processos inflamatórios 

(revisado em MARZOCCHI-MACHADO; LUCISANO-VALIM, 2005). Portanto, o estudo da 

influência do polimorfismo dos FcγR, nas funções biológicas mediadas por eles, pode 

contribuir (i) para o entendimento da fisiopatologia de doenças infecciosas, bem como 

aquelas de caráter auto-imune; e (ii) para identificar indivíduos, cujo fenótipo determinado 

pelo polimorfismo dos FcγR possa conferir suscetibilidade ou proteção para determinadas 

doenças. 

Uma vez que a isoforma NA2 do FcγRIIIb difere da NA1 nos sítios de glicosilação, e 

que a interação do CR3 com o  FcγRIIIb ocorre via o sítio de ligação lectina-sacarídeo, seria 

interessante determinar se este polimorfismo poderia afetar a cooperação entre CR3 e 

FcγRIIIb em mediar o burst oxidativo dos neutrófilos. Além disso, os estudos de 

determinação da freqüência dos alelos NA1/NA2 têm sido relacionados à avaliação da alo-



 49 

imunização pelos antígenos NA1 e NA2 durante a gravidez. Ainda não está bem 

estabelecida a freqüência desta imunização com a ocorrência da neutropenia neonatal 

(BUX; MUELLER-ECKHARDT, 1992; ZUPANSKA et al., 2001). 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 50 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2. OBJETIVOS  



 51 

2.1. Gerais 

2.1.1. Avaliar a influência do polimorfismo FcγRIIIb (NA1/NA2) na cooperação com os CR 

para mediar o burst oxidativo dos neutrófilos humanos.  

 

2.1.2. Analisar a freqüência dos genes NA1 e NA2 nos doadores de sangue do Hemonúcleo 

Regional de Araraquara do Núcleo de Atendimento à Comunidade (NAC), unidade auxiliar 

associada à Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara, Universidade Estadual 

Paulista (UNESP) “Júlio de Mesquita Filho”. 

 

2.2. Específicos 

2.2.1. Avaliar a influência do polimorfismo FcγRIIIb (NA1/NA2) na cooperação com os CR, 

em mediar o burst oxidativo dos neutrófilos utilizando como estímulos: 

(a) IC contendo IgG para avaliar a resposta dos neutrófilos mediada somente por FcγR; 

(b) IC contendo IgG e complemento do soro humano normal (SHN): IC/IgG-SHN, para 

avaliar a resposta dos neutrófilos mediada pela cooperação FcγR/CR; 

 

2.2.2. Determinar os alótipos do FcγRIIIb, NA1 e NA2, por PCR alelo-específico, para 

estabelecer os grupos de indivíduos homozigotos NA1, homozigotos NA2 e heterozigotos 

NA1/NA2. 

 

2.2.3. Determinar a densidade de expressão dos FcγR (FcγRIIa e FcγRIIIb) e dos CR (CR1 e 

CR3), por citometria de fluxo, para avaliar se existe relação do polimorfismo com a 

expressão dos receptores e com o resultado do teste funcional do burst oxidativo. 

 

 

 

 

 



 52 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

3. MATERIAL E MÉTODOS 



 53 

3.1 Amostras de sangue 

O protocolo de pesquisa foi submetido à apreciação do Comitê de Ética em Pesquisa da 

Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara (UNESP) e recebeu parecer favorável para 

a sua realização (Anexo 1).  

As amostras de sangue foram obtidas de voluntários adultos saudáveis doadores de 

sangue do Hemonúcleo Regional de Araraquara do Núcleo de Atendimento à Comunidade 

(NAC), unidade auxiliar associada à Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara, 

Universidade Estadual Paulista (UNESP) “Júlio de Mesquita Filho”.  

O doador voluntário foi esclarecido sobre a pesquisa, e após decidir participar desta, 

recebeu e assinou o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Anexo 2).  

O sangue foi colhido por punção venosa, utilizando-se sistema de coleta a vácuo, 

Vacutainer®, em tubos estéreis e descartáveis contendo o sal dipotássico do ácido 

etilenodiaminotetracético (EDTA-K2) como anticoagulante.  

Cento e setenta e cinco (175) amostras de sangue foram coletadas e os respectivos 

ácidos desoxirribonucléicos (DNA) foram extraídos e armazenados. Deste total, 169 

amostras foram genotipadas para o polimorfismo FcγRIIIb-NA1/NA2, 174 para o SH e 143 

amostras para o polimorfismo FcγRIIa-H/R-131. Oitenta e três (83) amostras foram 

analisadas quanto à expressão dos FcγR [FcγRIIa (CD32) e FcγRIIIb (CD16)] e 55 amostras 

quanto à expressão dos CR (CR1 e CR3) na membrana dos neutrófilos. E 23 amostras 

foram submetidas à avaliação funcional dos neutrófilos medida por ensaios de 

quimioluminescência dependente de luminol. 

 

3.2 Extração e caracterização do DNA genômico 

3.2.1 Extração por método de “salting out” 

A extração de DNA foi realizada pelo método de salting out descrito por Abdel-

Rahman, (1994) e Dynal, (1996) com algumas modificações. O protocolo para preparação 

das soluções consta no anexo 5. 



 54 

As amostras de DNA genômico foram obtidas a partir da camada leucocitária 

separada após a centrifugação do sangue total, colhido com anticoagulante EDTA-K2, a 

1000g por 10 minutos. Quinhentos microlitros de sangue total ou da camada leucocitária 

foram colocados em tubo tipo eppendorf e acrescidos de 1mL de tampão de lise para 

eritrócitos, que estava 5 vezes concentrado. A mistura foi cuidadosamente homogeneizada 

por inversão por 30 segundos e submetida à centrifugação a 15000g por 1 minuto. O 

sobrenadante foi desprezado e as células foram lavadas com 1mL de água destilada pura 

estéril e centrifugadas a 15000g por 1 minuto, desprezando-se o sobrenadante. 

As células foram ressuspendidas em uma mistura contendo 80μL de solução tampão 

proteinase K (5 vezes concentrado), 30μL de uma solução estoque de proteinase K 

(10mg/mL), 40μL de SDS (Dodecil Sulfato de Sódio) a 10% e 216μL de água destilada pura 

estéril. Esta suspensão foi mantida em banho a 56ºC por 30 minutos. Em seguida, a 

preparação foi resfriada à temperatura ambiente e, então, acrescida de 132μL de NaCl 5M, 

homogeneizada em vórtex por 15 segundos e submetida à centrifugação a 15000g por 6 

minutos. O sobrenadante foi transferido para outro tubo limpo e estéril e submetido à 

centrifugação a 15000g por 3 minutos. Novamente o sobrenadante foi transferido para outro 

tubo limpo e estéril e 1mL de etanol absoluto (Merck) foi acrescentado. A mistura foi 

homogeneizada, deixada em repouso à temperatura ambiente por 2 minutos e submetida à 

centrifugação a 15000g por 2 minutos. O sobrenadante foi desprezado e o precipitado 

lavado com uma solução de etanol a 70% e centrifugado a 15000g por 2 minutos. A seguir, 

a remoção do sobrenadante foi realizada cuidadosamente e o tubo foi mantido invertido 

sobre um papel de filtro absorvente durante 5 minutos ou mais até a secagem completa. 

O DNA presente no precipitado seco foi dissolvido em 100μL de água destilada pura 

estéril, homogeneizado em vórtex por 30 segundos e, então, armazenado à temperatura de 

4 a 8ºC, em tubo tipo eppendorf fechado, até o momento do uso. 

  

 



 55 

3.2.2 Quantificação de DNA na amostra e avaliação qualitativa da pureza 

As amostras de DNA foram avaliadas quanto à concentração e pureza do material 

obtido baseando-se em métodos descritos em Maniatis et al., (1989).  

Para a quantificação, as amostras foram diluídas 100 vezes (1:100) em água destilada 

pura e a leitura das absorbâncias nos comprimentos de onda de 260 e 280nm foi 

determinada em espectrofotômetro modelo Hitachi U-3000. A quantidade de DNA existente 

na amostra foi determinada pela leitura da absorbância no comprimento de onda de 260nm, 

onde 1 unidade de densidade ótica (DO) corresponde a 50μg de DNA/mL. A concentração 

de DNA foi calculada pela seguinte fórmula: 

 

 

A pureza do ácido nucléico na amostra foi estimada pela razão entre os valores das 

leituras de DO em 260nm e 280nm (DO260nm/DO280nm), como mostra a fórmula abaixo, 

sendo que esta relação deve estar entre 1,8 e 2,0. 

 

 

 

3.2.3 Verificação da qualidade e integridade do DNA 

As amostras de DNA foram submetidas à eletroforese em gel de agarose, para 

verificação da pureza da amostra e da integridade do DNA, baseando-se em métodos 

descritos em Maniatis et al., (1989). 

Cada gel foi preparado com 100 mL de agarose 0,8% em tampão Tris-Borato-EDTA 

(TBE) pH 8,3, nas dimensões de 11 x 14cm. Os poços para a aplicação das amostras foram 

confeccionados colocando-se um pente de 1mm de espessura, o qual foi retirado após a 

solidificação da agarose. Cinco microlitros de cada amostra de DNA diluídas 50 vezes foram 

acrescentados a 10μL de uma solução corante, contendo: azul de bromofenol 0,1%, SDS 

1%, glicerol 50% e EDTA-Na2 0,1 M (tampão da amostra). As amostras com a solução 

DNA na amostra (μg/mL) = DO amostra (260nm) x 50 x diluição da amostra  

Pureza da amostra = DO amostra (260nm) / DO amostra (280nm)��



 56 

corante, foram homogeneizadas em vórtex e, então, aplicadas nos poços do gel. 

Para a corrida eletroforética foram utilizadas cubas contendo eletrodo de platina e 

conectadas a uma fonte de corrente contínua. Antes de iniciar a corrida, deixou-se passar o 

tampão TBE pH 8,3 pelo gel durante 1 hora. A corrida foi acompanhada pela migração do 

azul de bromofenol, contido na solução corante da amostra, durante cerca de 40 minutos a 

100 volts (V). 

Após a migração, o gel foi corado em um recipiente contendo 200mL de água 

destilada pura e 10μL de uma solução estoque de brometo de etídeo 10mg/mL, durante 10 a 

15 minutos, para a visualização do DNA em transluminador de luz ultra-violeta (UV). Como o 

brometo de etídeo é capaz de absorver luz a 300nm e emitir luz vermelha e alaranjada a 

590nm, a quantidade de brometo de etídeo intercalado no DNA, visto através do brilho 

refringente, é proporcional à concentração de DNA na amostra. 

 

3.3. Análise dos genótipos  

A fim de esclarecer a nomenclatura apresentada, as formas “FcγRIIA” e “FcγRIIIB”, 

designam os genes para os receptores, enquanto que as formas “FcγRIIa” e “FcγRIIIb”, os 

produtos dos respectivos genes.  

Para estabelecer os grupos de indivíduos, os genótipos dos FcγR foram determinados 

tanto para o polimorfismo do FcγRIIIB (NA1/NA2 e SH), quanto para o FcγRIIA (H131/R131). 

Assim, obtivemos os seguintes grupos: a) NA1/H131/SH-; b) NA1/R131/SH-; c) 

NA2/H131/SH+; d) NA2/H131/SH-; e) NA2/R131/SH+; f) NA2/R131/SH-; g) 

NA1/NA2/H131/SH+; h) NA1/NA2/H131/SH-; i) NA1/NA2/R131/SH+; j) NA1/NA2/R131/SH-; k) 

NA1/H131/R131/SH-; l) NA2/H131/R131/SH+; m) NA2/H131/R131/SH-; n) 

NA1/NA2/H131/R131/SH+ e o) NA1/NA2/H131/R131/SH-. 

A análise do polimorfismo alélico dos FcγR foi realizada pela técnica de amplificação 

do DNA genômico auxiliada pela polimerase (PCR: Reação em Cadeia da Polimerase), 

utilizando-se oligonucleotídeos (primers) alelo-específicos. 



 57 

Um controle positivo interno para o produto da PCR foi obtido pela adição, em todos 

os tubos, de oligonucleotídeos controles, 0,5mM do sense (5’ gcc ttc cca acc att ccc tta 3’) e 

0,5mM do “anti-sense” (5’ ctc acg gat ttc tgt gtt tc 3’), para o gene HGH (Hormônio do 

Crescimento Humano), conforme descrito por Kuwano et al., (2000) e Tong et al., (2003), 

que foram adicionados a todos os tubos na concentração de 0,5mM, e visualizado no gel de 

agarose com peso molecular de 428pb. E ainda, como controle de contaminação dos 

reagentes com DNA, dois controles contendo todo o mix de reação, mas sem DNA, cada um 

contendo um dos primers alelo-específicos, também foram incluídos e submetidos às 

mesmas condições de reações dos outros tubos que continham amostras de DNA. E como 

controles da genotipagem, foram utilizadas amostras previamente genotipadas e 

seqüenciadas, adicionadas a todas as reações.  

 

3.3.1 Análise do genótipo FcγγγγRIIA 

As formas alélicas FcγRIIA-H-131 e FcγRIIA-R-131 resultam nas variantes: H-131 e R-

131. Assim, para a análise do polimorfismo alélico do FcγRIIA duas PCRs foram realizadas 

para cada amostra de DNA. As reações utilizaram oligonucleotídeos sense específicos para 

cada um dos alelos (H-131 e R-131) e anti-sense comum aos dois, a saber: para H-131, 

sense 5’ atc cca gaa att ctc cca  3’,  para R-131, sense 5’ atc cca gaa att ctc ccg 3’ e o anti-

sense em comum 5’ caa ttt tgc tgc tat ggg c 3’. As seqüências dos oligonucleotídeos para H-

131 e R-131 foram reproduzidas de acordo com aquelas descritas por Osborne et al., (1994) 

e Kuwano et al., (2000) e aneladas à seqüência de DNA disponível no genbank para a 

verificação da seqüência dos oligonucleotídeos (Anexo 3). 

O volume total de reação em cada tubo foi de 25μL, sendo 100 a 200ng de DNA 

genômico (2,0μL) e o restante de um mix de reação. Foram realizados dois tubos de mix, 

um correspondente ao H-131 e outro ao R-131. O tubo de mix do H-131 era constituído 

pelas seguintes quantidades de reagentes correspondentes a uma amostra, sendo estas 

quantidades multiplicadas de acordo com o número de amostras, assim: 2,5μL de tampão 



 58 

para PCR contendo KCl (10 vezes concentrado) (Fermentas); 2,0μL ou 2mM de solução de 

MgCl2 (25Mm) (Fermentas); 0,5μL ou 200μM de dinucleotídeo trifosfato (dNTP) (Promega); 

0,1μL ou 0,5 unidade (U) de Taq DNA polimerase recombinante (Fermentas); 1mM ou 1,0μL 

de oligonucleotídeo H-131 sense (Bioneer); 1mM ou 1,0μL de  oligonucleotídeo H/R-131 

anti-sense (Bioneer) ; 0,5μL de cada oligonucleotídeo sense e anti-sense HGH (Bioneer) e 

água destilada pura estéril em quantidade suficiente para completar 25μL. O tubo de mix do 

R-131 era constituído pelas mesmas quantidades e reagentes do tubo para H-131, sendo 

que mudava-se apenas o oligonucleotídeo alelo-específico sense correspondente ao R-131 

pois o oligonucleotídeo anti-sense (Bioneer) era comum aos dois tubos de reação. 

O tamanho dos fragmentos obtidos após a amplificação era: 253pb.  

As reações foram realizadas em um ciclador automático de temperatura Gene Amp 

PCR System 2400 (Perkin Elmer) nas condições descritas por Osborne et al., (1994) e 

Kuwano et al., (2000), com algumas modificações: 4 minutos a 95ºC para desnaturação 

inicial; 30 ciclos de amplificação de 1 minuto a 95ºC para desnaturação, 2 minutos a 57ºC 

para anelamento e 1 minuto a 72ºC para extensão, seguidos de um acréscimo de 5 minutos 

a 72ºC para completar a extensão final. Ao final da reação as amostras foram mantidas no 

ciclador a 4ºC e posteriormente foram armazenadas a -20ºC até o uso. 

 

3.3.2 Análise do genótipo FcγγγγRIIIB 

As formas alélicas FcγRIIIB-NA1 e FcγRIIIB-NA2 resultam nas variantes polimórficas: 

os alo-antígenos NA1 e NA2, respectivamente. 

Assim, para a análise do polimorfismo alélico do FcγRIIIB duas PCRs foram realizadas 

para cada amostra de DNA. As reações utilizaram oligonucleotídeos sense específicos para 

cada um dos alelos (NA1 e NA2) e anti-sense comum aos dois, a saber: para NA1, sense 5’ 

cag tgg ttt cac aat gtg aa 3’,  para NA2, “sense” 5’ ctc aat ggt aca gcg tgc tt 3’ e o anti-sense 

em comum 5’ atg gac ttc tag ctg cac 3’. As seqüências dos oligonucleotídeos para NA1 e 

NA2 foram reproduzidas de acordo com aquelas descritas por Torkildsen et al., (2005) e 



 59 

aneladas à seqüência de DNA disponível no genbank para a verificação da seqüência dos 

oligonucleotídeos (Anexo 4). 

O volume total de reação em cada tubo foi de 25μL sendo 100 a 200ng de DNA 

genômico (2,0μL) e o restante de um mix de reação. Foram realizados dois tubos de mix, 

um correspondente ao NA1 e outro ao NA2. O tubo de mix do NA1 era constituído pelas 

seguintes quantidades de reagentes correspondentes a uma amostra, sendo estas 

quantidades multiplicadas de acordo com o número de amostras, assim: 2,5μL de tampão 

para PCR contendo KCl (10 vezes concentrado) (Fermentas); 2,0μL ou 2mM de solução de 

MgCl2 (25Mm) (Fermentas); 0,5μL ou 200μM de dinucleotídeo trifosfato (dNTP) (Promega); 

0,1μL ou 0,5 unidade (U) de Taq DNA polimerase recombinante (Fermentas); 1mM ou 1,0μL 

de oligonucleotídeo sense NA1 (Bioneer); 1mM ou 1,0μL de  oligonucleotídeo anti-sense 

(Bioneer); 0,5μL de cada oligonucleotídeo sense e anti-sense HGH (Bioneer) e água 

destilada pura estéril em quantidade suficiente para completar 25μL. O tubo de mix do NA2 

era constituído pelas mesmas quantidades e reagentes do tubo para NA1, sendo que 

mudava-se apenas o oligonucleotídeo alelo-específico sense correspondente ao NA2. 

Os tamanhos dos fragmentos obtidos após a amplificação eram: 141 pb para o NA1 e 

221 pb para o NA2.  

As reações foram realizadas em um ciclador automático de temperatura Gene Amp 

PCR System 2400 (Perkin Elmer) nas condições descritas por Torkildsen et al., (2005) com 

algumas modificações: 3 minutos a 94ºC para desnaturação inicial; 30 ciclos de amplificação 

de 1 minuto a 94ºC para desnaturação, 2 minutos a 57ºC para anelamento e 1 minuto a 

72ºC para extensão, seguidos de um acréscimo de 10 minutos a 72ºC para completar a 

extensão final. Ao final da reação as amostras foram mantidas no ciclador a 4ºC e 

posteriormente foram armazenadas a -20ºC até o uso. 

 

 

 



 60 

3.3.3 Análise do genótipo SH 

O alelo SH resultante de uma mutação do gene FcγRIIIB-NA2 dá origem ao alo-

antígeno SH. 

Para a análise do alelo SH uma PCR foi realizada para cada amostra de DNA. As 

reações utilizaram os seguintes oligonucleotídeos: sense 5’ aag atc tcc caa aag gct gtg 3’, e 

o anti-sense 5’ act gtc gtt gac tgt gtc at 3’. As seqüências dos oligonucleotídeos para SH 

foram reproduzidas de acordo com aquelas descritas por Kuwano et al., (2000) e aneladas à 

seqüência de DNA disponível no genbank para a verificação da seqüência dos 

oligonucleotídeos (Anexo 4). 

O volume total de reação em cada tubo foi de 22,5μL sendo 100 a 200ng de DNA 

genômico (2,5μL) e 20μL do mix de reação. O mix de reação era constituído pelas seguintes 

quantidades de reagentes correspondentes a uma amostra, sendo estas quantidades 

multiplicadas de acordo com o número de amostras, assim: 2,25μL de tampão para PCR 

contendo KCl (10 vezes concentrado) (Fermentas); 1,125μL ou 2mM de solução de MgCl2 

(50Mm) (Fermentas); 0,45μL ou 200μM de dinucleotídeo trifosfato (dNTP) (Promega); 

0,16μL ou 0,5 unidade (U) de Taq DNA polimerase recombinante (Fermentas); 1mM ou 

0,45μL de oligonucleotídeo sense (Bioneer); 1mM ou 0,45μL de oligonucleotídeo anti-sense 

(Bioneer); 0,12μL de cada oligonucleotídeo sense e anti-sense HGH (Bioneer) e água 

destilada pura estéril em quantidade suficiente para completar 22,5μL.  

O tamanho do fragmento obtido após a amplificação era de 191pb. 

As reações foram realizadas em um ciclador automático de temperatura Gene Amp 

PCR System 2400 (Perkin Elmer) nas condições descritas por KUWANO et al. (2000) com 

algumas modificações: 5 minutos a 94ºC para desnaturação inicial; 30 ciclos de amplificação 

de 30 segundos a 95ºC para desnaturação, 1 minuto a 60ºC para anelamento e 30 

segundos a 71ºC para extensão, seguidos de um acréscimo de 5 minutos a 71ºC para 

completar a extensão final. Ao final da reação as amostras foram mantidas no ciclador a 4ºC 

e posteriormente foram armazenadas a -20ºC até o uso. 



 61 

A Tabela 2 resume todos os oligonucleotídeos e condições para a análise dos 

genótipos FcγRIIa, FcγRIIIb e SH. 

 

Tabela 2- Seqüências dos oligonucleotídeos e das condições de PCR para a alotipagem 

dos FcγR. 

Gene 

e/ou 

alelo 

 

 

Seqüências dos oligonucleotídeos* 

 

Condições de PCR 

 

Referências 

Bibliográficas 

FcγRIIA 
 

 

H-131 sense 5’ atc cca gaa att ctc cca  3’ 

R-131 sense 5’ atc cca gaa att ctc ccg 3’ 

H e R-131 anti-sense 5’ caa ttt tgc tgc tat ggg c 3’ 

  

Hot start:     4 min. a 95ºC  

30 ciclos:     1 min. a 95ºC  

                    2 min. a 57ºC  

                    1 min. a 72ºC 

Extensão:  5 min. a 72ºC 

Final:         ∞ a 4ºC 

 

 

OSBORNE et al., 

1994 

KUWANO et al., 

2000 

 

    

FcγRIIIB 
 

NA1 sense 5’ cag tgg ttt cac aat gtg aa 3’ 

NA2 sense 5’ ctc aat ggt aca gcg tgc tt 3’ 

NA1 e NA2  anti-sense 5’ atg gac ttc tag ctg cac 3’ 

 

Hot start:     3 min. a 94ºC  

30 ciclos:    1 min. a 94ºC  

                   2 min. a 57ºC  

                   1 min. a 72ºC 

Extensão: 10 min. a 72ºC 

Final:         ∞ a 4ºC 

 

 

 

TORKILDSEN et 

al., 2005 

SH sense 5’ aag atc tcc caa aag gct gtg 3’ 

 anti-sense 5’ act gtc gtt gac tgt gtc at 3’ 

 

Hot start: 5 min. a 94ºC 

30 ciclos:   30 seg. a 95ºC  

                   1 min. a 60ºC  

                  30 seg. a 71ºC 

Extensão: 5 min. a 71ºC 

Final:         ∞ a 4ºC 

 

KUWANO et al., 

2000  

 

    

HGH sense 5’ gcc ttc cca acc att ccc tta 3’ 
 

 anti-sense 5’ ctc acg gat ttc tgt gtt tc 3’ 
 

 

KUWANO et al., 

2000;  

TONG et al., 

2003 

 

 



 62 

3.4 Eletroforese dos produtos da PCR 

Os fragmentos de DNA amplificados por PCR, para as variantes polimórficas do FcγR, 

foram separados por eletroforese em gel de agarose 2% em tampão TBE pH 8,3. Uma 

amostra de 10μL do produto de cada PCR foi misturada a 2μL do tampão da amostra para 

eletroforese de DNA, contendo azul de bromofenol. Estas misturas foram homogeneizadas 

em vórtex e, então, aplicadas nos poços do gel. Amostras padrões de marcadores de 

número de pares de base, DNA ladder 50pb, também foram aplicadas nos géis 

(0,5μg/poço). 

O preparo dos géis e as condições da corrida eletroforética foram realizados como 

descrito anteriormente para as amostras de DNA genômico (item 3.2.3). A corrida foi 

acompanhada pela migração do azul de bromofenol, contido na mistura da amostra, durante 

60 a 90min a 100V. 

Após a migração, o gel foi corado em uma solução formada por 200mL de água 

destilada pura e 10μL de uma solução estoque de brometo de etídeo 10mg/mL, durante 10 a 

15 minutos. As imagens dos fragmentos de DNA corados nos géis de eletroforese foram 

capturadas em um sistema ImageMaster® VDS, Pharmacia Biotech. 

 

3.5 Determinação da expressão dos receptores para IgG (FcγγγγRIIa/CD32 e 

FcγγγγRIIIb/CD16) e para complemento (CR1 e CR3) nos neutrófilos 

Amostras de sangue total (100μL) de cada doador saudável foram utilizadas. Cada 

amostra foi incubada, à temperatura ambiente, por 20 minutos, ao abrigo da luz, com 5μL do 

anticorpo específico anti-receptor marcado com fluorocromo ou com o anticorpo isotipo 

controle como descrito por Marzocchi-Machado et al., (2002). As amostras que receberam o 

isotipo controle foram utilizadas para descontar a fluorescência causada pela ligação 

inespecífica do respectivo isotipo anti-receptor à célula. Após este período de incubação, 

todas as amostras receberam 2000μL de tampão de lise da marca Becton & Dickinson (BD), 



 63 

para lisar os eritrócitos e foram mantidas à temperatura ambiente, por 10 minutos, ao abrigo 

da luz, e, em seguida, centrifugadas a 550g, a 4ºC, por 10 minutos. As misturas foram 

lavadas em 2000μL de PBS/SBF (Soro Bovino Fetal) 2%/azida ≤ 0,1 % pH7,2 gelado, a 

550g, a 4ºC, por 10 minutos, e ressuspendidas em 500μL de PBS/formol 1%, para leitura no 

citômetro de fluxo dentro de 24 horas. 

Os anticorpos marcados com FITC (isotiocianato de fluoresceína) ou PE (ficoeritrina) 

usados foram: a) IgG1-PE de camundongo anti-FcγRIII (CD16) humano (BD PharMingen™-

30625X; clone 3G8; IgG1,κ); b) IgG1-PE de camundongo, isotipo controle para anti-CD16 

(BD PharMingen™-33815X; clone MOPC-21; IgG1,κ); c) IgG2b-FITC de camundongo anti-

FcγRII (CD32) humano (BD PharMingen™-30934X; clone FLI8.26; IgG2b,κ); d) IgG2b-FITC 

de camundongo, isotipo controle para CD32 (BD PharMingen™-33804X; clone 27-35; 

IgG2b,κ anti-Dansyl); e) IgG1-PE de camundongo anti-CD11b (CR3; Mac-1) humano (BD 

PharMingen™-30455X; clone ICRF44; IgG1,κ); f) IgG1-FITC de camundongo anti-CD35 

(CR1) humano (BD PharMingen™-30964X; clone E11; IgG1,κ); g) IgG1-PE de camundongo, 

isotipo controle para anti-CD11b (CR3; Mac-1) (BD PharMingen™-33815X; clone MOPC-21; 

IgG1,κ) e h) IgG1-FITC de camundongo, isotipo controle para anti-CD35 (CR1) (BD 

PharMingen™-33814X; clone MOPC-21; IgG1,κ). 

 As análises foram feitas em um citômetro de fluxo modelo Becton & Dickinson (BD) 

FACS (Fluorescent Activated Cell Sorter) Calibur software Cell Quest Pro, no Laboratório de 

Hematologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto-USP. 

O citograma bidirecional permitiu distingüir e selecionar a população de neutrófilos 

analisada. Os resultados foram expressos como mediana da fluorescência/célula 

determinada em um histograma em escala logaritmo e como porcentagem de células 

fluorescentes na população total.  

 

 



 64 

3.6 Medida do burst oxidativo dos neutrófilos 

3.6.1 Obtenção dos neutrófilos 

 Os neutrófilos foram obtidos a partir da mistura de sangue total com uma solução de 

gelatina, segundo metodologia descrita por Lucisano; Mantovani, (1984). O sangue total foi 

colhido por punção venosa dos indivíduos doadores, em sistema a vácuo, utilizando-se 

tubos (2 ou 3) sem anticoagulante (tubo seco) e rapidamente o sangue foi transferido para 

um tubo contendo como anticoagulante solução de Alséver (citrato de sódio) na proporção 

de volume a volume. Em seguida, o material foi centrifugado a 1000g por 10 minutos. O 

plasma e a camada leucocitária foram desprezados e acrescentou-se solução de gelatina 

2,5% em cloreto de sódio (NaCl) 0,15M na quantidade equivalente à duas vezes o volume 

de células restantes. Esta mistura foi homogeneizada e deixada em banho a 37ºC por 30 

minutos. Após este tempo o sobrenadante foi retirado e colocado em outro tubo. Ao 

sobrenadante foi acrescentado NaCl 0,15M na proporção de duas vezes o volume de 

sobrenadante. Após homogeneização e centrifugação a 650g por 10 minutos sem 

refrigeração, o sobrenadante foi desprezado e ao precipitado foi adicionado cloreto de 

amônio (NH4Cl) 0,83%, pH 7,2 (37ºC), na proporção de duas vezes o volume do precipitado. 

O material foi deixado em repouso a 37ºC por 5 minutos e submetido a centrifugação a 650g 

por 10 minutos. O sobrenadante foi desprezado e o precipitado foi lavado com NaCl 0,15M e 

então centrifugado a 650g por 10 minutos. O precipitado foi então ressuspendido com 1mL 

de solução balanceada de Hanks, pH 7,2, contendo gelatina 0,1% e mantido no gelo até o 

momento do uso. A suspensão de células foi diluída na proporção de 1:100 em Líquido de 

Lázarus e contadas em Câmara de Neubauer e depois avaliadas quanto à sua viabilidade 

pela exclusão do corante Azul de Tripan 0,04%,