UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA Rodrigo José Pizzello Zogheib Triagem de Doença de Fabry (DF) Através de Estudo Imuno-histoquímico para Globotriaosilceramida (Gb3) em Pacientes com Lesões de Esclerose Glomerular Segmentar e Focal e Imunofluorescência Negativa para Depósitos em Biópsias Renais Por Agulha Grossa Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de Botucatu, para obtenção do título de Mestre em Ciências, Área de Patologia. Orientadora: Profa. Dra. Maria Aparecida Custodio Domingues Coorientadora: Profa. Dra. Rosa Marlene Viero Botucatu 2022 Rodrigo José Pizzello Zogheib Triagem de Doença de Fabry (DF) Através de Estudo Imuno-histoquímico para Globotriaosilceramida (Gb3) em Pacientes com Lesões de Esclerose Glomerular Segmentar e Focal e Imunofluorescência Negativa para Depósitos em Biópsias Renais Por Agulha Grossa Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de Botucatu, para obtenção do título de Mestre em Ciências, Área de Patologia. Orientadora: Profa. Dra. Maria Aparecida Custodio Domingues Coorientadora: Profa. Dra. Rosa Marlene Viero Botucatu 2022 4 AGRADECIMENTOS Agradeço às minhas orientadoras, Dra. Maria Aparecida Custodio Domingues e Dra. Rosa Marlene Viero, pelos ensinamentos e incentivo, e ao Dr. José Cândido Caldeira Xavier-Junior pelo convite a ser professor na Disciplina de Patologia no Centro Universitário Católico Salesiano Auxilium (UniSALESIANO), sendo os três os responsáveis pelo meu início na carreira acadêmica. Agradeço a Dra. Marlene Antônia dos Reis por me estimular a adentrar na área de Nefropatologia, que tanto me instiga. Agradeço ao Dr. Luís Gustavo Modelli de Andrade pela contribuição durante o delineamento do projeto da pesquisa e ao Dr. Stanley de Almeida Araújo pelo suporte à realização da técnica imuno-histoquímica. Agradeço a toda equipe do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina da UNESP de Botucatu e colegas residentes (da Patologia e Nefrologia), responsáveis pela minha formação como Médico Patologista, e de modo especial aos amigos Vinicius Cardoso Nóbrega e Marcelo Padovani Toledo de Moraes. Agradeço, ainda, às equipes do Instituto de Patologia de Araçatuba (IPAT) e Instituto de Patologia de Bauru (ANATOMED), e ao Dr. Cleverson Teixeira Soares, pelo suporte técnico, apoio e amizade durante o período de desenvolvimento deste estudo. 5 EPÍGRAFE Nossa vida é um presente de Deus e o que fazemos dela é o nosso presente a Ele. São João Bosco 6 RESUMO Contexto: A doença de Fabry (DF) é um distúrbio de armazenamento lisossomal ligado a X, causado pela atividade deficiente da enzima α-galactosidase A, resultando no acú- mulo de glicoesfingolipídios, particularmente a globotriaosilceramida (Gb3) e globotria- osilesfingosina (liso-Gb3). Esses lipídios se acumulam progressivamente na circulação e em praticamente todas as células e órgãos, resultando no desenvolvimento de uma desor- dem multissistêmica. Esses pacientes estão sob alto risco de desenvolver síndrome nefró- tica devido à deposição glomerular de Gb3, especialmente envolvendo os podócitos, po- dendo resultar em lesões glomerulares de esclerose segmentar e focal, mesmo em estágios iniciais da doença, elencando a Glomeruloesclerose Segmentar e Focal (GESF) como um importante diagnóstico diferencial. O objetivo do estudo é pesquisar depósitos de Gb3 por imunoistoquímica em biópsias renais de pacientes com lesões glomerulares de escle- rose. Método: Realizada pesquisa de Gb3 por imunoistoquímica em 27 biópsias renais analisadas no Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina de Botucatu, no pe- ríodo de 2015-2019, com diagnóstico de GESF. Resultados: Não foram detectados de- pósitos de Gb3 por meio da imunoistoquímica nas vinte e sete biópsias renais analisadas. Conclusão: A DF compromete o parênquima renal manifestando-se principalmente por síndrome nefrótica, podendo evoluir para doença renal crônica necessitando de terapia renal substitutiva. Novos estudos de triagem da DF devem ser incentivados em casos subclínicos, especialmente em pacientes com biópsias renais com lesões crônicas de eti- ologia pouco definida e pacientes com doença renal crônica em tratamento dialítico. 7 SUMMARY Background: Fabry disease (FD) is an X-linked lysosomal storage disorder caused by deficient activity of α-galactosidase A resulting in accumulation of glycosphingolipids, particularly globotriaosylceramide (Gb3) and globotriaosylsphingosine (lyso-Gb3). These lipids progressively accumulate in the circulation and in virtually all cells and or- gans, resulting in the development of a multisystemic disorder. Those patients are at high risk of developing nephrotic syndrome due to glomeruli Gb3 deposition, especially en- volving podocytes, which insult might result in focal and segmental glomerular sclerotic lesions even in early stages of the disease, leading Focal and Segmental Glomeruloescle- rosis (FSGS) as an important differential diagnosis. Methods: Immunohistochemistry for Gb3 was performed in 27 kidney biopsies from 2015 to 2019 of patients with FSGS from the Department of Pathology of the Botucatu Medical School. Results: No Gb3 deposits were detected by immunohistochemistry in the twenty-seven renal biopsies analyzed. Conclusion: FD compromises the renal parenchyma, manifesting itself mainly by ne- phrotic syndrome, and may progress to chronic kidney disease requiring renal replace- ment therapy. Further FD screening studies should be encouraged in subclinical cases, especially in patients with renal biopsies with chronic lesions of undefined etiology and patients with chronic kidney disease undergoing dialysis. 8 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS CEP Comitê de Ética em Pesquisa DAMP Padrão Molecular Associado a Dano DBS Dry Blood Sample DF Doença de Fabry DRC Doença Renal Crônica Gb3 Globotriaosilceramida liso-Gb3 Globotriasilesfingosina GESF Glomeruloesclerose Segmentar e Focal HE Hematoxilina e Eosina ISGFN International Study Group of Fabry Nephropathy KDIGO Kidney Disease Improving Global Outcomes MBG Membrana Basal Glomerular OMIM Online Mendelian Inheritance in Man TRE Terapia de Reposição Enzimática TCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido TM Tricrômio de Masson VUS Variant of Unknown Significance α-Gal A α-galactosidase A https://www.theisn.org/kidney-disease-improving-global-outcomes-kdigo 9 SUMÁRIO Capítulo I – Revisão da Literatura .............................................................................. 9 I. INTRODUÇÃO ........................................................................................... 10 1. Revisão da Doença de Fabry ............................................................................... 10 2. Prevalência de glomeruloesclerose segmentar e focal em biópsias renais de paci- entes com DF ...................................................................................................... 12 2.1. Os depósitos de Gb3 e a pseudolipidose iatrogênica .................................... 13 2.2. Viabilidade da avaliação em blocos parafinados .......................................... 14 3. Prevalência da Doença de Fabry ....................................................................... 14 4. Doença de Fabry e transplante renal ................................................................... 15 5. Doença de Fabry e o biomarcador liso-Gb3 ...................................................... 16 6. Doença de Fabry e podocitúria .......................................................................... 16 7. O papel da inflamação no microambiente glomerular na Doença de Fabry ...... 17 8. Estratégias de Triagem da Doença de Fabry ..................................................... 18 8.1. Técnicas utilizadas na triagem para Doença de Fabry ................................. 18 8.2. Triagem em recém-nascidos ........................................................................ 19 8.3. Triagem em pacientes dialisados ................................................................. 19 8.4. Triagem em pacientes de alto risco .............................................................. 20 8.5. Triagem em pacientes com síndromes glomerulares .................................... 21 9. Terapia de Reposição Enzimática ....................................................................... 24 II. JUSTIFICATIVA ......................................................................................... 24 III. OBJETIVO DO ESTUDO ............................................................................ 25 IV. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ……………………………………. 26 Capítulo II - Artigo Científico ...................................................................................... 30 10 CAPÍTULO I – Revisão da Literatura 11 I. INTRODUÇÃO 1. Revisão da Doença de Fabry A Doença de Fabry (OMIM 301500) é uma desordem de armazenamento lisossomal ligada ao X, causada por mutações no gene GLA. A ausência ou redução drástica da atividade da enzima α-galactosidase A (α-Gal A, EC 3.2.1.22) resulta no progressivo acúmulo de glicolipídeos, principalmente a globotriasilceramida (GL-3, Gb3), em várias células do organismo e de sua forma desacilada, a globotriaosilesfingosina (liso-Gb3), no plasma (Ortiz et al., 2018). O acometimento de células endoteliais vasculares, podócitos, cardiomiócitos e células musculares lisas arteriais, entre outras, como células tubulares renais e do sistema nervoso central é responsável pelas manifestações clínicas da doença (Schiffmann et al., 2017). A α-Gal A é uma glicoproteína homodimérica codificada pelo gene GLA, localizado no braço longo do cromossomo X. Várias mutações desse gene são descritas; em geral, as do tipo “nonsense”, em sítio de “splice” e “frameshift” resultam diminuição ou ausência da atividade da α-Gal A e estão associadas ao fenótipo clássico. Em contraste, uma proporção de mutações “missenses” e em sítios de “splicing” crípticos raros podem codificar enzimas com atividade residual da α-Gal A, o que explicaria os fenótipos tardios da doença (Ortiz et al., 2018). Em pacientes do sexo feminino heterozigotas, ocorre a inativação aleatória do cro- mossomo X, sendo desafiador a predição do curso da doença, podendo haver superex- pressão ou supressão da mutação. Pacientes heterozigotas que expressam preferencial- mente o alelo GLA normal podem apresentar poucos, se nenhum sintoma, enquanto as que expressam o alelo mutado podem apresentar curso clínico compatível com o fenótipo da doença em homens (clássica ou de início tardio) (Ortiz et al., 2018). 12 Durante a infância e adolescência (menos de 17 anos), acroparestesias (a sensação de queimação crônica ou episódica nas palmas das mãos ou solas dos pés, exacerbada por mudanças de temperatura, febre, estresse, exercício físico) e angioqueratomas (pequenas e elevadas manchas vermelhas escuras que se desenvolvem lentamente, encontradas nas nádegas, genitália, coxas internas, costas e cavidade oral) são comuns. Anormalidades oftalmológicas, como a córnea verticillata (opacidade em forma de “whorl”), catarata subcapsular posterior, lesões vasculares tortuosas na retina e conjuntiva e vasos dilatados na margem superior da pálpebra podem ser encontradas. Entre outras alterações, desta- cam-se perda auditiva neurossensorial, hipohidrose ou anidrose, albuminúria aumentada, história de distúrbios intestinais inespecíficos e de letargia e fadiga (Schiffmann et al, 2017). No início da idade adulta, aproximadamente entre 17 e 30 anos, podem aparecer angioqueratomas mais proeminentes, início de albuminúria (> 1g/24 horas), edema ou linfedema, febre, hipohidrose ou anidrose, sensibilidade ao calor, diarreia e dor abdomi- nal e alterações cardíacas, como bradicardia, intervalo PR curto, hipertrofia ventricular esquerda e defeitos de condução (Schiffmann et al, 2017). Na idade adulta (mais de 30 anos), apresentam-se alterações mais cronificadas, como hipertrofia ventricular fibrótica, esquerda e direita, anormalidades valvares cardía- cas e disritmias, morte súbita cardíaca, angina, insuficiência cardíaca diastólica, doença renal crônica, acidentes vasculares cerebrais ou ataques isquêmicos transitórios e surdez de início agudo ou crônico (Schiffmann et al, 2017). O rim é afetado em 55% dos pacientes com DF e a injúria renal leva à proteinúria e aumento dos níveis séricos de creatinina. A característica histológica mais característica na microscopia de luz é a vacuolização celular e depósitos hialinos (Valbuena et al., 2012), contudo, durante a evolução da doença pode-se notar desorganização da MBG e 13 glomeruloesclerose focal ou difusa e segmentar ou global, atrofia tubular e fibrose inters- ticial (Kayalar et al., 2018). A DF pode estar associada a glomerulopatias primárias, sendo uma delas a GESF (Kayalar et al., 2018). O teste de atividade da α-Gal A é diagnóstica para pacientes do sexo masculino, contudo a caracterização do tipo de mutação do GLA nesses pacientes é importante para ajudar a estabelecer o fenótipo da doença, descartando polimorfismos benignos que levam à diminuição da atividade da α-Gal A e permite pesquisá-la posteriormente em familiares. Nas pacientes do sexo feminino, a detecção da mutação do GLA é necessária, uma vez que o nível de atividade enzimática plasmática geralmente está normal (Ortiz et al., 2018). A terapêutica consiste na Terapia de Reposição Enzimática (TRE), disponível no Brasil na forma de agalsidase alfa (Rapagal®) e agalsidase beta (Fabrazyme®). Há ainda a possibilidade de uso de chaperona farmacológica, o Migalastat®, na variante amenable da doença, cuja mutação produz uma α-Gal A com erro conformacional molecular, onde a medicação atua corrigindo tal conformação, permitindo a ação da enzima. 2. Prevalência de glomeruloesclerose segmentar e focal em biópsias renais de paci- entes com DF Um relato de caso de 2005 apresenta dois pacientes, um homem e uma mulher, com associação entre a DF e lesões de esclerose segmentares e focais e vasculares, e indaga seus valores como marcadores morfológicos na progressão da doença, sugerindo a realização de biópsia renal antes do início da TRE (Svarstad et al., 2005). Em 2009, foi publicado pelo Grupo de Estudo Internacional da Nefropatia de Fabry (ISGFN) (Fogo et al., 2010) um sistema de escores para a doença renal de Fabry, sendo o achado de glomeruloesclerose comum, mesmo em pacientes com doença renal crônica estadio 1 ou 2 com discreta proteinúria. A glomeruloesclerose segmentar, discreta a intensa, foi observada em dezenove de trinta e cinco pacientes masculinos (9 DRC 14 estadio 1, 3 DRC estadio 2), e onze de vinte e quatro pacientes femininos (2 DRC estadio 1, 8 DRC estadio 2). A porcentagem média de glomeruloesclerose segmentar foi 4,7 ± 7,8% dos glomérulos com lesões discretas e intensas observadas na mesma biópsia. Esclerose global esteve presente em 14,8 ± 22,7% dos glomérulos. Dez de quinze pacientes masculinos (66,7%) com DRC estadio 1 tinham esclerose segmentar ou global em 6,2 ± 8,7% (mediana 2,9) de seus glomérulos, e sete de dez pacientes femininas com DRC estadio 1 tinham as mesmas lesões em 5,7 ± 9,0% (mediana 3,0). Kalayar et al, 2018, investigaram em 65 pacientes com GESF a possível associação com DF, através da dosagem sérica da globotriaosilesfingosina (liso-Gb3). Nenhum dos pacientes apresentavam sinais clássicos da doença. Genotipagem com sequenciamento de DNA de Sanger foi realizado nos pacientes com atividade reduzida da α-Gal A (<1.2 mol/l/h). Nesses pacientes, nenhuma mutação foi encontrada. Nesse estudo, não foi encontrada associação de DF com GESF. 2.1. Os depósitos de Gb3 e a pseudolipidose iatrogênica O Gb3 apresenta-se na análise ultraestrutural como estruturas membranosas lame- ladas intracelulares, osmiofílicas, com padrão concêntrico, denominado ‘myelin bodies’ ou com padrão de listras alongadas, denominado ‘zebra bodies’, com diâmetro de apro- ximadamente 0,3–10 μm; (Colpart & Félix, 2017) e periodicidade lamelar de 3,5-5,0 nm (Silva et al., 2021). Embora a biópsia renal seja um método diagnóstico e a microscopia eletrônica de transmissão ferramenta confiável para identificar os depósitos de Gb3, eles não são pato- gnomônicos de DF. Depósitos semelhantes são encontrados em indivíduos com nefropa- tia da sílica e pseudolipidose iatrogênica induzida por drogas tais como amiodarona, clo- roquina e hidroxicloroquina (Abensur & Reis, 2016) e na nefropatia associada ao LMX1B 15 (Lei et at., 2020; Shimohata et al., 2021). Tais depósitos também foram encontrados, por exemplo, em um caso de paciente masculino de 29 anos de idade com nefrite lúpica classe II+V, apresentando positividade para os anticorpos anti-nuclear e anti-fosfolípide, com a atividade da α-galactosidase normal e sem ter feito uso de hidroxicloroquina (Kadosawa et al., 2021). 2.2. Viabilidade da avaliação em blocos parafinados Considerando que os glicoesfingolipídeos são parcialmente extraídos durante o processo de inclusão em parafina, é importante determinar se há correlação entre a detec- ção de depósitos de Gb3 em material à fresco e em biópsias previamente fixadas incluídas em parafina ou resina. Valbuena et al (2012) demonstraram, através da análise de 8 biópsias renais de pacientes diagnosticados com DF e de uma biópsia renal de paciente do sexo feminino portadora de variante genética sem evidência da nefropatia de Fabry, que há imunomar- cação para depósitos residuais de Gb3 em biópsias processadas de rotina em parafina. 3. Prevalência da Doença de Fabry A prevalência da Doença de Fabry demonstra uma curva ascendente, observando- se as publicações que focam na triagem em pacientes recém-nascidos, em busca de Do- enças de Depósito Lisossomais. Mehta et al (2017) citam uma prevalência estimada de 1:50.000 a 1:117.000 em pacientes do sexo masculino. Em 2009, estudo taiwanês de Hwu et al rastreou 171.977 recém-nascidos de ambos os sexos, no terceiro dia de vida, para busca de deficiência de α-Gal A. Entre os 90.288 recém-nascidos do sexo masculino, 72 apresentaram mutações para α-Gal A, caracterizando uma frequência de 1:1.250, cerca de 2,5 vezes maior que a 16 demonstrada no estudo italiano de Spada et al, em 2006, quando se observou uma preva- lência de 1:3.100. Contudo, dois estudos mais recentes norte-americanos, de Burton et al em 2017, em Illinois, e Elliott et al em 2016, em Washington demonstraram prevalências menores, mas ainda significativas. Em Illinois, a prevalência foi de 1:8.454 e em Washington de 1:5.495 para Doença de Fabry. A prevalência de Doença de Fabry também vem sendo rastreada em pacientes transplantados renais. Veroux et al em 2020 avaliaram 265 pacientes transplantados por análise genética para mutações da α-Gal A, medida da atividade enzimática e níveis de liso-Gb3. Sete pacientes (2,6%) apresentaram alguma mutação do gene GLA, e dois pacientes apresentaram a forma clássica da Doença de Fabry. Entre os familiares testados dos pacientes afetados, 15 também apresentaram mutações, dois deles com nefropatia por Doença de Fabry (Veroux et al., 2020). 4. Doença de Fabry e transplante renal É importante continuar o tratamento de Terapia de Reposição Enzimática em pacientes com DF transplantados. Contudo, estudo de revisão de Suarez et al (2020) não 17 mostrou diferenças significativas na evolução do enxerto entre pacientes com DF e pacientes com outras causas de DRC. A taxa estimada de recorrência foi de 11,1% (IC95%: 3,6%-29,4%), em 424 casos analisados. As taxas estimadas de todas as causas de falha no enxerto, falha no enxerto antes da morte e rejeição foram de 32,5% (IC95%: 23,9%-42,5%), 14,5% (IC95%: 8,4%-23,7%) e 20,2% (IC95%: 15,4%-25,9%), respectivamente. 5. Doença de Fabry e o biomarcador Liso-Gb3 Como mencionado anteriormente, o diagnóstico de DF em homens dá-se através da demonstração de atividade reduzida da α-Gal A no plasma, leucócitos ou em ‘dry blood samples’ (DBS), que pode ser confirmado posteriormente pela análise da mutação GLA. Anteriormente, aumento dos níveis de plasma ou urina de Gb3 foram usados para ajudar a identificar a heterozigosidade, mas sua análise é laboriosa. Mais recentemente, a medida mais fácil é a de sua forma desacetilada, o liso-Gb3, que se tornou apreciado como uma nova ferramenta diagnóstica (Nowak et al., 2017). O estudo de Carnicer-Cáceres et at. (2021), traz uma revisão sobre os mais diver- sos potenciais novos biomarcadores de resposta inflamatória para DF, relacionados a vas- culopatia sistêmica, nefropatia e cardiopatia. 6. Doença de Fabry e podocitúria Um fator importante associado à gravidade da nefropatia da DF é a podocitúria. Um estudo publicado por Pereira et al (2016) identificou que a quantidade de podócitos na urina em pacientes com DF foi maior que nos pacientes controle, sendo, portanto, uma ferramenta adicional para avaliação da progressão da doença renal crônica nestes pacientes, principalmente naqueles que apresentam fenótipos mais agressivos. 18 Apesar da podocitúria configurar um sinal clínico precoce de dano renal e potencialmente servir como teste para avaliação do acometimento renal, em diversas doenças, como a DF, ainda não é muito utilizado na prática clínica, principalmente por ausência de métodos sistematizados e inviabilidade na maioria dos centros clínicos (Levstek et al., 2020). 7. O papel da inflamação no microambiente glomerular na Doença de Fabry Rozenfeld et al em 2017 publicaram um brilhante estudo sobre o papel da inflamação na DF. Os acúmulos de Gb3 podem se comportar como DAMPs, ou seja, moléculas endógenas sintetizadas ou liberadas pelas células lesadas ou em processo de morte, com consequente ativação de cascatas pró-inflamatórias. Isso fica comprovado pelo fato que a introdução de Gb3 em células normais induzem apoptose e secreção de citocinas. Adaptado de Rozenfeld et al, 2017 19 8. Estratégias de triagem da Doença de Fabry A DF possui ampla variabilidade fenotípica e o maior desafio é reconhecer, entre os pacientes com repercussões renais, quais são os pacientes que abrem quadro de protei- núria ou síndrome nefrótica com maior risco de portar a doença, na ausência dos sinais clássicos, citando os angioqueratomas e a córnea verticilata, como exemplos ilustrativos. Em grandes centros, ao nascimento é possível a detecção da DF em triagens de Doenças Metabólicas Hereditárias, incluindo as Doenças de Depósito Lisossomais. A triagem familiar ocorre entre os parentes até a terceira geração quando um pa- ciente é diagnosticado com DF. Outra abordagem realizada para o rastreio da DF é a triagem em pacientes com DRC dialítica, sem definição da doença de base, ou pacientes com doença de base conhe- cida apresentando quadro clínico-evolutivo desfavorável, para afastar a possibilidade de Doença de Fabry associada. Estratégias de triagem para DF A triagem para DF revela alta prevalência de pacientes com variantes genéticas de significado indeterminado (VUS) (Tol et al., 2014). 8.1. Técnicas utilizadas na triagem para DF 20 Na triagem de pacientes com DRC dialítica, os estudos realizados, incluídos nesta revisão bibliográfica, iniciam com dosagem da atividade plasmática da enzima α-Gal A. Posteriormente, os casos positivos, com diminuição da atividade da enzima, foram sub- metidos a análise genética para mutação do gene GLA. Os estudos levantados da triagem de DF estão resumidos na Tabela 1. 8.2. Triagem em recém-nascidos No estudo de Sawada et al (2020), recém-nascidos de 54 famílias apresentaram variantes patogênicas ou VUS. A frequência de DF, ou seja, a detecção de mutação pato- gênica e/ou VUS neste estudo foi estimada em 1:7683 (0,013%), enquanto apenas a de- tecção de mutações patogênicas foi de 1:11.854 (0,008%). Colon et al (2017) detectaram mutações genéticas no gene GLA em 37 pacientes (20 meninos e 17 meninas). Inoue et al (2013) detectaram sete recém-nascidos testados com baixa atividade de α-Gal A. Desta forma, a prevalência na triagem com dosagem da atividade da enzima foi de 1/3024. Análise genética subsequente revelou que seis desses recém-nascidos apre- sentavam diferentes mutações no gene GLA. Considerando que apenas V199M e IVS4þ919G4A são considerados patogênicos, a prevalência de indivíduos com mutações patogênicas foi de 1/7057, pois três recém-nascidos tinham tais mutações. Esses achados apoiam o sistema de triagem em massa pois é útil para o diagnóstico precoce da DF. A prevalência de DF neste estudo foi, portanto, de 1/7057. 8.3. Triagem em pacientes dialisados O estudo de Veroux et al (2020) demonstrou a presença de mutação do gene GLA em 7 de 265 pacientes (2,6%), sendo que dois apresentavam a forma clássica da DF. Entre 21 os familiares rastreados, 15 indíviduos apresentavam alguma mutação para o gene GLA e dois apresentavam DF com nefropatia estabelecida. No estudo de Trachoo et al (2017), não foram detectadas diminuição da atividade de α-Gal A nem mutações genéticas em 147 pacientes. O estudo de Moiseev et al (2019) detectaram 20 diagnósticos de DF em 5.572 pacientes dialíticos (0,36%) e Nishino et al (2012) detectaram três pacientes (um homem e duas mulheres) com mutações da α-Gal A em 933 dialíticos (0,32%). Na Turquia, foram também investigados, da mesma maneira, através da avaliação da atividade enzimática, 1.136 pacientes dialíticos, sendo 12 pacientes apresentando baixa atividade enzimática, sendo confirmada DF em 2 homens. Neste estudo, como consequência, uma nova mutação foi identificada (c.638C>T [p.P214S]) (Okur et al, 2013). No Brasil, foram investigados 2.583 pacientes masculinos em hemodiálise, primeiramente através da identificação da atividade enzimática (sendo identificados 72 pacientes com baixa atividade) e posteriormente análise genética (sendo identificados 3 pacientes com mutações no GLA (W204X, A368T e C52F). A mutação missense C52F era inédita e apenas o paciente com a variante W204X apresentava DF clássica. A prevalência foi de 0,12% (Silva et al. 2016). 8.4. Triagem em pacientes de alto risco Em 2020, Yoshida et al publicaram um estudo multicêntrico em todo o Japão, onde investigaram 18.135 indivíduos com manifestações renais, cardíacas ou neurológicas. A atividade da α-Gal A estava baixa em 846 pacientes, sendo que DF foi diagnosticada em 224 destes. Neste estudo, um total de 101 variantes foram detectadas, sendo que 26 não tinham sido descritas ainda na literatura. 22 8.5. Triagem em pacientes com síndromes glomerulares Destaca-se o estudo de Kalayar et al (2018), que realizou dosagem da atividade da α-Gal A em pacientes com GESF, diagnosticadas em biópsias renais. Não foi detectada alteração enzimática nos pacientes testados, neste estudo. Tabela 1 – Revisão bibliográfica de estudos abordando a prevalência de Doença de Fabry em diferentes estratégias de triagem Estratégia de triagem Estudo Método Prevalência País Triagem de Doenças de Depósito Lisos- somais em recém-nascidos Sawada et al, 2020 • Dosagem de atividade de α-Gal A • Análise gênica para mutação do GLA 1:7.683 (0,013%), Variantes patogênicas: 1:11.854 (0,008%) Japão Inoue et al, 2013 • Dosagem de atividade de α-Gal A 1:3024 Japão Colon et al, 2017 • Dosagem de atividade de α-Gal A • Análise gênica para mutação do GLA 0,013% (1:7575) Espanha Triagem em Pacientes com DRC dialí- tica Veroux et al, 2020 • Análise gênica para mutação do GLA • Dosagem de atividade de α-Gal A • Dosagem de Liso-Gb3 7/275 (2,6%) Itália Trachoo et al, 2017 • Análise gênica para mutação do GLA • Dosagem de atividade de α-Gal A 0/142 (0%) Tailândia Moiseev et al, 2019 • Dosagem de atividade de α-Gal A • Análise gênica para mutação do GLA 0,36% Rússia Nishino et al, 2012 • Dosagem de atividade de α-Gal A • Análise gênica para mutação do GLA 3/933 (0,32%) Japão Okur et al, 2013 • Dosagem de atividade de α-Gal A • Análise gênica para mutação do GLA 12/1.136 (0,17%) Turquia Silva et al, 2016 • Dosagem de atividade de α-Gal A • Análise gênica para mutação do GLA 0,12% Brasil 24 Triagem em Pacientes de Alto Risco para DF Yoshida et al, 2020 • Dosagem de atividade de α-Gal A • Análise gênica para mutação do GLA 236/18.199 (1,2%) Japão Triagem de pacientes com proteinúria isolada ou síndrome nefrótica com bióp- sia renal GESF: Kayalar et al, 2018 • Dosagem de atividade de α-Gal A • Dosagem de Liso-Gb3 0/65 (0%) Turquia 25 9. Terapia de Reposição Enzimática Como mencionado anteriormente, a terapêutica da DF consiste na Terapia de Reposição Enzimática (TRE), disponível no Brasil na forma de agalsidase alfa (Rapagal®) e agalsidase beta (Fabrazyme®). Há ainda a possibilidade de uso de chaperona farmacológica, o Migalastat®, na variante amenable da doença, cuja mutação produz uma α-Gal A com erro conformacional molecular, onde a medicação atua corrigindo tal conformação, permitindo a ação da enzima. Skrunes et al em 2017 demonstraram que, quando se trata de TRE, o ajuste da dose e tipo de enzima administrada são importantes, uma vez que os pacientes avaliados no estudo, quando houve dificuldade de fornecimento mundial de agalsidase beta, notou- se reacúmulo de Gb3 nos podócitos e aumento concomitante dos sinais clínicos. II. JUSTIFICATIVA Um dos aspectos mais importantes envolvidos na abordagem de pacientes com síndromes glomerulares, destacando-se a síndrome nefrótica, é o diagnóstico preciso e precoce da entidade nosológica, garantindo um tratamento específico e não apenas sinto- mático ou a partir da estratificação da resposta à corticoterapia, destacando a correção da proteinúria. A associação de uma ou mais entidades nosológicas está cada vez mais sendo reportada na literatura, sendo cada vez mais frequente a revisão de conceitos já consoli- dados e reclassificação de entidades. A DF é uma causa rara de síndrome nefrótica no adulto, porém se diagnosticada é tratável com TRE ou outras terapias farmacológicas, como, por exemplo, o uso de cha- perona farmacológica, na variante amenable. A pesquisa do anticorpo Gb3 nas biópsias renais dos pacientes com síndrome nefrótica e presença de lesões de esclerose glomerular segmentar e focal, e imunofluorescência negativa para depósitos de imunoglobulinas e 26 complemento, traz a possibilidade de diagnóstico em pacientes não suspeitos, assim como a avaliação da efetividade da terapia instituída, sendo uma maneira de proceder na inves- tigação diagnóstica de forma simples e efetiva. Assim, o estudo da prevalência de DF nesses pacientes representa um avanço no entendimento epidemiológico dessa doença, caracterizando uma nova estratégia de tria- gem, contribuindo para a literatura. III. OBJETIVO DO ESTUDO O objetivo é a triagem de DF, através da detecção dos depósitos de Gb3 pelo es- tudo imunoistoquímico em biópsias renais por agulha grossa de pacientes com lesões de esclerose glomerular segmentar e focal e imunofluorescência negativa, com diagnóstico inferido de GESF. 27 IV. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. 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Disponível em: https://surgexppathol.biomedcentral.com/submission-guidelines 32 Title: Immunohistochemical Gb3 deposits investigation in kidney biopsies may be a use- ful tool for screening Fabry Disease in patients with segmental and focal glomeruloscle- rosis: A 5-Year Retrospective Study in a Single Institution Short title: Immunohistochemical Gb3 deposits investigation in kidney biopsies for screening Fabry Disease in patients with segmental and focal glomerulosclerosis Rodrigo José Pizzello Zogheib1, MD, Maria Aparecida Custodio Domingues1, PhD, Rosa Marlene Viero1, PhD, Luis Gustavo Modelli de Andrade, PhD2 1Department of Pathology, Botucatu Medical School, São Paulo State University (UNESP), Botucatu-SP, Brazil 2Department of Internal Medicine, Botucatu Medical School, São Paulo State University (UNESP), Botucatu-SP, Brazil Conflict of interest: The authors declare they have no competing interests. Keywords: Fabry Disease, Segmental and Focal Glomerulosclerosis, Screening, Nephrotic Syndrome 33 Abstract Background: Fabry disease (FD) is an X-linked lysosomal storage disorder caused by deficient activity of α-galactosidase A resulting in accumulation of glycosphingolipids, particularly globotriaosylceramide (Gb3) and globotriaosylsphingosine (lyso-Gb3). These lipids progressively accumulate in the circulation and in virtually all cells and organs, leading to the development of a multisystemic disorder. Those patients are at high risk of developing nephrotic syndrome due to glomeruli Gb3 deposition, especially involving podocytes, which insult might result in focal and segmental glomerular sclerotic lesions even in early stages of the disease, leading Focal and Segmentar Glomeruloesclerosis (FSGS) as an important differential diagnosis. Methods: Immuno- histochemistry for Gb3 was performed in 27 kidney biopsies with a diagnosis of FSGS in the Department of Pathology of Botucatu Medical School from 2015 to 2019. Results: Controls were positive to Gb3 deposits through immunohistochemistry. Gb3 deposits were not found in all 27 kidney biopsies with a diagnosis of FSGS. Conclusion: In addi- tion of FD screening in newborns and patients in dialysis, further studies should be en- couraged in non-suspicious patients who underwent kidney biopsies due to glomeruli syndromes, especially nephrotic syndrome. 34 Introduction Fabry Disease (OMIM 301500) is an X-linked lysosomal storage disorder caused by mutations in the GLA gene. The absence or reduction of the activity of the enzyme α- galactosidase A, encoded by the GLA gene (α-Gal A, EC 3.2.1.22), results in the progressive accumulation of glycolipids, mainly globotriasylceramide (GL-3, Gb3) in several cells of the organism with clinical manifestations of the disease (Ortiz et al., 2018; Schiffmann et al., 2017). The kidney is affected in 55% of patients with FD and renal injury leads to proteinuria and increased serum creatinine levels. The most characteristic histological feature in light microscopy is cellular vacuolization and hyaline deposits in glomeruli, tubular cells and vessels (Valbuena et al., 2012) that progresses to glomerulosclerosis, tubular atrophy and interstitial fibrosis (Kayalar et al, 2018). Segmental or global glomerulosclerosis are a common finding in FD (Svarstad et al., 2005; Fogo et al., 2010). Ultrastructural analysis shows an intracellular lamellated and osmiophilic structures, that although not pathognomonic of FD, are a reliable tool to identify Gb3 deposits in the kidney (Colpart & Félix, 2017). Valbuena et al. (2012) demonstrated immunostaining deposits of Gb3 in paraffin-embedded renal biopsies of FD patients, with or without nephropathy, that correlated with the resin samples for electron microscopy. Newborn screening studies have shown an increase in the prevalence of FD from 1:50,000 to 1:1,250 in the period of 1999 to 2009 (Meikle et al,1999; Desnick et al,2001, Spada et al,2006; Hwu et al, 2009). Recent studies from U.S. showed lower but significant prevalence of 1:5,495 (Elliott et al, 2016) and 1:8,454 (Burton et al, 2017). Veroux et al (2020) studying 265 transplant patients found 2,6% of FD analysing genetic variants, measurement of enzymatic activity and lyso-Gb3 levels. The aim of this study was to investigate the presence of Gb3 deposits by 35 immunohistochemistry in renal biopsies of patients with previous diagnosis of FSGS. Methods A cross-sectional retrospective study included 27 native renal biopsies from 53 renal biopsies eligible for immunohistochemistry (transplant renal biopsies were ex- cluded), diagnosed as FSGS in the Department of Pathology of Botucatu Medical School from 2015 to 2019. The project was approved by the local Research Ethics Committee (CEP) (CAAE 43222721.0.0000.5411). Paraffin blocks and histological slides were recovered. Morphological evaluation of histological slides in Hematoxylin and Eosin (HE), Periodic Acid Schiff (PAS), Mas- son Trichrome and Silver Methenamine was performed to confirm the morphological di- agnosis. The medical records were reviewed, and clinical-demographic data were col- lected, in a specific form, containing information regarding gender, ethnicity, age at di- agnosis, clinical syndrome, laboratorial exams at diagnosis and in the end of the follow- up, clinical follow-up time and its outcomes (resolution of the condition, maintenance of the disease or death) (Table 1). Immunohistochemistry reactions were performed in the Bauru Institute of Pathol- ogy (ANATOMED-Bauru-SP-Brazil). The slides were prepared with 3.0 μm tissue sec- tions. The protocol involved xylol deparaffinization, then in absolute ethanol hydration, followed by endogenous peroxidase blockage in 3,0% hydrogen peroxide and antigenic recovery in sodium citrate 0.21% pH 6.0 in a pressure chamber (118°C/2’). Latter incu- bation was performed with the primary antibodies and then with secondary antibodies, using the polymer detection method (Envision Flex HRP). Finally, the chromogen 3,3- 36 diaminobenzidine was applied to Harris Hematoxylin staining and ethanol dehydration, xylol diaphanization and synthetic resin assembly. The marker used was the primary anti- Gb3 monoclonal antibody (anti-Gb3, IgG, clone BGR23; formerly sold as Seikagaku cat#370680), diluted to 1:2,000. Gb3 immunoreactivity was identified by a brown pre- cipitate. Results Twenty-seven patients (mean age 36±19.71 years, range 5 to 66 years, 13 male patients) were included. The clinical features of the 27 patients may be seen on Table 1. Seventeen patients had nephrotic syndrome. Five patients had only proteinuria and one of them hematuria. None of them had any classical symptoms of FD and no Gb3 deposits were found in the glomeruli, tubular cells, interstitium and blood vessels in all biopsies. The morphological features of kidney biopsies from 27 patients may be seen on Table 2 (as the previous microscopic descriptions were reviewed, glomerular proliferation, tubu- lar atrophy and interstitial inflammation and fibrosis were graded semi quantitatively as “+” when mild, “2+”, moderate and “3+”, severe). There was no access to clinical data of the positive control case once the paraffin blocks were obtained from another renal pathology laboratory center. The positive control case, an electron microscopy Fabry Dis- ease-confirmed biopsy, was immunoreagent for Gb3 deposits (Figure 1). Table 1 - Clinical Characteristics of 27 Patients with Focal and Segmental Glomer- ular Sclerosis (FSGS) Variables Patients n 27 At Diagnosis Gender (Male) 12 (44.44%) Race (White) 26 (96.29%) Age (Years)** 36±19.71 Nephrotic syndrome 17 (62.96%) Hypertension 10 (37.03%) Hematuria 15 (55.55%) Proteinuria (g/24h)* 1 (0.05-12.02) 37 Serum albumin (mg/dl)* 2.8 (1.9-4.3) Total cholesterol (mg/dl)* 208 (177-381) HDL (mg/dl)* 50 (45-145) Triglycerides (mg/dl)* 179 (52-468) Serum creatinine (mg/dl)* 1.1 (0.3-5.1) End of Follow-up Proteinuria (g/24h)* 0.47 (0.02- 10.38) Serum albumin (mg/dl)* 3.85 (1.7-4.4) Total cholesterol (mg/dl)* 201 (109-445) HDL (mg/dl)* 43 (23-97) Triglycerides (mg/dl)* 148 (56-433) Serum creatinine (mg/dl)* 1.1 (0.3-10.3) Follow-up (months)** 39.27±17.53 Outcome Remission CKD Lost of follow-up 15 (55.55%) 7 (25.92%) 5 (18.51%) *Median **Arithmetic mean and standard deviation Table 2 – Morphological features of kidney biopsies from 27 patients with Focal and Segmental Glomerulosclerosis (FSGS) Variables Number of Cases (n) Glomerular Proliferation (n) Absent <2+ ≥2+ 20 (74.07%) 7 (25.92%) 10 (37.03%) 10 (37.03%) Crescents (n) 0 (0%) Glomerular Sclerosis (n) Absent <25% 25-50% >50% 18 (66.66%) 9 (33.33%) 12 (44.44%) 2 (7.40%) 4 (14.81%) Tubular Atrophy (n) Absent <2+ ≥2+ 16 (59.25%) 11 (40.74%) 9 (33.33%) 7 (25.92%) Interstitial Inflammation (n) Absent <2+ 14 (51.85%) 13 (48.14%) 8 (29.62%) 6 (22.22%) 38 ≥2+ Interstitial Fibrosis (n) Absent <2+ ≥2+ 16 (59.25%) 11 (40.74%) 7 (25.92%) 9 (33.33%) Figure 1 - Renal biopsy of a patient with Fabry Disease positive for Gb3 by immunohistochemistry (con- trol case). (A) Glomeruli with vacuolated podocytes (*), at 40x magnification, hematoxilin & eosin (B) Glomerulus with Gb3 deposits in the vacuolated podocytes (*) and parietal epithelial cells (►), at 40x magnification, immunohistochemistry (C) Negative control for Gb3 deposits, at 40x magnification, immunohistochemis- try (D) Vacuolated tubular cells positive for Gb3 deposits (*), at 40x magnification, immunohistochemis- try (E) Atrophic tubule positive for Gb3 deposits (►), at 40x magnification, immunohistochemistry (F) Glomerulus and small vessels positive for Gb3 deposits (►), at 40x magnification, immunohistochemis- try A D B E C F A D B E C F * * ► * ► ► 39 Discussion The greatest challenge is to recognize which patients with proteinuria or nephrotic syndrome have FD in the absence of classical signs, citing angiokeratomas and the cornea verticilata. An approach performed for the screening of FD is among patients with dialysis ESRD, without definition of the underlying disease, or patients with known underlying disease and unfavorable clinical outcomes. Screening for FD reveals a high prevalence of patients with genetic variants of unknown significance (VUS) (Tol et al., 2014). The aim of this study was to evaluate the presence of residual Gb3 deposits in renal biopsies through immunohistochemistry of patients diagnosed with FSGS. There- fore, the study aimed to screen underdiagnosed patients with FD within this specific group of patients. Kalayar et al (2018) investigated in 65 patients with FSGS the possible association with FD, through the serum dosage of globotriaosilesfingosine (lyso-Gb3). None of the patients had classic signs of the disease. Genotyping with Sanger DNA sequencing was performed in patients with reduced activity of α-Gal A (<1.2 mol/l/h) and no mutation was found. In this study, no association of FD and FSGS was found. Even though no Gb3 deposits were found in this study, it is important to highlight the limited sampling of a single institution research in a short period of time. Kayalar et al (2018) also screened FD in FSGS patients, however, in that study, α-Gal A activity assays and molecular tests were performed instead. Further studies with larger number of patients are necessary. Considering that no deposits were found in our samples, no correlation with the clinical data were possible to be established. 40 Based on the positive controls obtained in this study, we concluded that the im- munohistochemical investigation of Gb3 in renal biopsies may be an important tool to screen FD. It is a reliable technique, but simpler and less expensive, than electron micros- copy. The screening of FD in non-suspected cases for this entity in patients submitted to renal biopsy should be valued, and more studies with larger samplings are needed. 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Acknowledgments The authors would like to acknowledge their referring medical practitioners from Hospital das Clínicas (FMB-UNESP) and their lab staff who work to make sure that renal biopsies are performed according to highest standards of quality. We also acknowledge the staff from the Institute of Pathology of Bauru (ANATOMED) concerning the immunohistochemical procedures and we thank Stanley de Almeida Araújo for providing the positive control for this study.