RESSALVA​ ​ Atendendo a solicitação do(a) autor(a), o texto completo desse trabalho será disponibilizado no repositório a partir de 06/03/2027. 2025 MIRIAN DE FÁTIMA DA SILVA AÇÃO ANTIFÚNGICA DO PTEROSTILBENO SOBRE CEPAS DE Candida albicans, Candida dubliniensis E BIOFILMES MICROCOSMOS DE ESTOMATITE PROTÉTICA São José dos Campos 2025 MIRIAN DE FÁTIMA DA SILVA AÇÃO ANTIFÚNGICA DO PTEROSTILBENO SOBRE CEPAS DE Candida albicans, Candida dubliniensis E BIOFILMES MICROCOSMOS DE ESTOMATITE PROTÉTICA Dissertação apresentada ao Instituto de Ciência e Tecnologia, Universidade Estadual Paulista (Unesp), Campus de São José dos Campos, como parte dos requisitos para obtenção do título de MESTRE do Programa de Pós-Graduação em CIÊNCIAS APLICADAS À SAÚDE BUCAL. Área: Microbiologia e Imunologia. Linha de pesquisa: Agentes antimicrobianos e métodos de controle para infecções de interesse médico-odontológico. Orientadora: Profa. Tit. Juliana Campos Junqueira Coorientador: Prof. Dr. Paulo Henrique Fonseca do Carmo Instituto de Ciência e Tecnologia [internet]. Normalização de tese e dissertação [acesso em 2025]. Disponível em http://www.ict.unesp.br/biblioteca/normalizacao Apresentação gráfica e normalização de acordo com as normas estabelecidas pelo Serviço de Normalização de Documentos da Seção Técnica de Referência e Atendimento ao Usuário e Documentação (STRAUD). Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca Prof. Achille Bassi e Seção Técnica de Informática, ICMC/USP com adaptações - STATI, STRAUD e DTI do ICT/UNESP. Renata Aparecida Couto Martins CRB-8/8376 Silva, Mirian de Fátima Da Ação antifúngica do pterostilbeno sobre cepas de Candida albicans, Candida dubliniensis e biofilmes microcosmos de estomatite protética / Mirian de Fátima Da Silva. - São José dos Campos : [s.n.], 2025. 70 f. : il. Dissertação (Mestrado) - Pós-Graduação em Ciências Aplicadas à Saúde Bucal - Universidade Estadual Paulista (UNESP), Instituto de Ciência e Tecnologia, São José dos Campos, 2025. Orientador: Juliana Campos Junqueira Coorientador: Paulo Henrique Fonseca Do Carmo 1. Candida albicans . 2. Candida dubliniensis. 3. Polifenóis. 4. Biofilmes. 5. Estomatite protética. I. Junqueira, Juliana Campos, orient. II. Carmo, Paulo Henrique Fonseca Do, coorient. III. Universidade Estadual Paulista (UNESP), Instituto de Ciência e Tecnologia, São José dos Campos. IV. Universidade Estadual Paulista 'Júlio de Mesquita Filho' - UNESP. V. Universidade Estadual Paulista (UNESP). VI. Título. IMPACTO POTENCIAL DESTA PESQUISA Este estudo avalia a ação do pterostilbeno sobre espécies de Candida, patógenos importantes em infecções orais. O tratamento convencional dessas infecções enfrenta limitações, o que motiva a busca por novos agentes terapêuticos. O impacto científico e social desse estudo reside no fato de que o pterostilbeno é um produto natural, de baixa toxicidade e com atividade antifúngica e antibiofilme. Essas propriedades tornam o pterostilbeno um antifúngico potencial para o tratamento das infecções por Candida, principalmente associadas à biofilmes em usuários de prótese dentária. POTENTIAL IMPACT OF THIS RESEARCH This study evaluates the action of pterostilbene on Candida species, important pathogens in oral infections. The conventional treatment of these infections faces limitations, which motivates the search for new therapeutic agents. The scientific and social impact of the study lies in the fact that pterostilbene is a natural product, with low toxicity and with antifungal and antibiofilm activity. These properties make pterostilbene a potential antifungal for the treatment of Candida infections, mainly associated with biofilms in denture users. BANCA EXAMINADORA Profa. Tit. Juliana Campos Junqueira (Orientadora) Universidade Estadual Paulista (UNESP) Instituto de Ciências e Tecnologia Campus São José dos Campos Prof. Dr. Felipe de Camargo Ribeiro Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) Escola Paulista de Medicina Laboratório Especial de Micologia Profa. Dra. Maíra Terra Garcia Universidade Estadual Paulista (UNESP) Instituto de Ciências e Tecnologia Campus São José dos Campos São José dos Campos, 06 de março de 2025. DEDICATÓRIA "Dedico este trabalho à minha família, pelo apoio incondicional, e aos amigos que, me incentivaram e motivaram, tornando o caminho mais leve e significativo." AGRADECIMENTOS Agradeço a Deus por me guiar e sustentar ao longo de toda esta jornada. Sua presença constante foi meu alicerce nos momentos de dúvida e dificuldade, me concedendo força, sabedoria e perseverança para superar os desafios e chegar até aqui. Que sua luz continue iluminando meu caminho e minhas escolhas. Gratidão! Agradeço à minha orientadora, Profa. Tit. Juliana Campos Junqueira, por sua dedicação, paciência e orientação ao longo deste percurso. Sua sabedoria, experiência e entusiasmo foram fundamentais para o desenvolvimento deste trabalho. Seu exemplo de profissionalismo e paixão pela ciência será uma inspiração para mim. Agradeço ao meu coorientador, Prof. Dr. Paulo Henrique Fonseca do Carmo, por seu valioso apoio e orientação ao longo deste trabalho. Sua expertise, disponibilidade e contribuição em compartilhar seu conhecimento foram fundamentais para o desenvolvimento deste projeto. Gratidão por sua disposição em me orientar. Agradeço de coração à minha mãe, cuja força, amor e dedicação foram essenciais ao longo de toda esta jornada. Seu apoio e amor incondicional me deram coragem para seguir em frente, mesmo nos momentos mais difíceis. Obrigada por ser meu porto seguro e por acreditar nos meus sonhos tanto quanto eu. À minha família, que sempre me ofereceu amor, compreensão e apoio, dedico minha mais sincera gratidão. Á Profa. Dra. Maíra Terra Garcia e aos colegas de Laboratório, Amanda, Lilian e Patrícia, agradeço a companhia, incentivo e contribuição em cada etapa deste percurso, tornando essa jornada mais enriquecedora. Agradeço à Juliana Gonçale, pelo apoio, ajuda e companheirismo desde o início desta etapa. Sempre com palavras de incentivo e disposição para me auxiliar nos momentos mais desafiadores foram fundamentais para que eu pudesse chegar até aqui. Agradeço também aos demais professores e colaboradores, que compartilharam seus saberes e enriqueceram minha trajetória acadêmica. Agradeço ao Grupo de Saúde de São José dos Campos (FAB) por permitir o cumprimento desta jornada. Aos meus amigos e colegas de trabalho MJ Ricardo, Cap Huellington, Vanessa, Ney, Josué, Ericka e Fabiolla que me apoiaram e impulsionaram ao longo de toda esta jornada. Por fim, agradeço a todos que, direta ou indiretamente, me apoiaram. Este trabalho é fruto do esforço coletivo e do carinho que recebi ao longo desta caminhada. "Grandes conquistas são fruto de perseverança, dedicação e da coragem de acreditar nos próprios sonhos, mesmo diante dos desafios." Autor desconhecido RESUMO Silva MF. Ação antifúngica do pterostilbeno sobre cepas de Candida albicans, Candida dubliniensis e biofilmes microcosmos de estomatite protética [dissertação] São José dos Campos (SP): Universidade Estadual Paulista (Unesp), Instituto de Ciência e Tecnologia; 2025. As infecções por Candida spp. na cavidade bucal são frequentes, principalmente em indivíduos portadores de próteses dentárias. A terapia convencional com antifúngicos polienos e azóis apresenta limitações, incluindo efeitos adversos, toxicidade e surgimento de cepas resistentes. Nesse sentido, é fundamental a busca por compostos com potencial ação antifúngica. Esse estudo teve como objetivo avaliar a atividade antifúngica do pterostilbeno (PTE) sobre Candida albicans, Candida dubliniensis e biofilmes microcosmos de estomatite protética, bem como avaliar sua atividade in vivo na infecção experimental em Galleria mellonella. Inicialmente, cepas de C. albicans e C. dublinensis, isoladas da cavidade bucal de pacientes com estomatite protética, foram avaliadas quanto à susceptibilidade ao PTE por meio dos ensaios de concentração inibitória mínima (CIM), concentração fungicida mínima (CFM) e curva de morte em culturas planctônicas. A seguir, o efeito do PTE foi avaliado sobre biofilmes microcosmos provenientes de amostras clínicas de estomatite protética, por meio da contagem de células viáveis em meios de cultura seletivos para leveduras e bactérias. Além disso, a citotoxicidade do PTE, bem como seus efeitos antifúngicos e imunomodulatórios, foram analisados no modelo in vivo G. mellonella. Os resultados revelaram a atividade fungicida do PTE sobre Candida spp., exibindo valores de CIM e CFM de 32 µg/mL para todas as cepas testadas. Na curva de morte, o PTE reduziu totalmente o crescimento de Candida nos períodos de 8, 24 e 48 horas. Em biofilmes microcosmos, o PTE reduziu a viabilidade de estreptococos, estafilococos e leveduras a 20x CIM. No estudo in vivo, não foi verificada toxicidade para G. mellonella quando o PTE foi inoculado até 20x CIM. O tratamento profilático com PTE resultou em aumento da sobrevida das larvas infectadas por C. albicans ou C. dubliniensis. Na infecção com C. albicans, verificou-se também redução da carga fúngica na hemolinfa com o tratamento por PTE. Na infecção por ambas as espécies de Candida, o tratamento com PTE não alterou o número de hemócitos. Dessa forma, conclui-se que o PTE exibiu ação antifúngica contra células planctônicas de Candida spp., biofilmes microcosmos de estomatite protética e infecção experimental, sugerindo seu uso potencial para o tratamento de infecções por Candida spp. associadas ao uso de próteses dentárias. Palavras-chave: pterostilbeno; Candida albicans; Candida dubliniensis; polifenóis; biofilmes, estomatite protética ABSTRACT Silva MF. Antifungal action of pterostilbene on strains of Candida albicans, Candida dubliniensis and microcosmo biofilms from denture stomatitis [dissertation] São José dos Campos (SP): Universidade Estadual Paulista (Unesp), Instituto de Ciência e Tecnologia; 2025. Candida spp. infections in the oral cavity are frequent, especially in individuals with dental prostheses. Conventional therapy with polyene and azole antifungals has limitations, including adverse effects, toxicity and the emergence of resistant strains. In this sense, the search for compounds with potential antifungal action is essential. This study aimed to evaluate the antifungal activity of pterostilbene (PTE) on Candida albicans, Candida dubliniensis and microcosm biofilms of prosthetic stomatitis, as well as its in vivo activity in experimental infection in Galleria mellonella. Initially, strains of C. albicans and C. dublinensis, isolated from the oral cavity of patients with prosthetic stomatitis, were evaluated for their susceptibility to PTE using the minimum inhibitory concentration (MIC), minimum fungicidal concentration (MFC) and death curve assays in planktonic cultures. Next, the effect of PTE was evaluated on microcosm biofilms from clinical samples of prosthetic stomatitis, by counting viable cells in culture media selective for yeasts and bacteria. In addition, the cytotoxicity of PTE, as well as its antifungal and immunomodulatory effects, were analyzed in the in vivo G. mellonella model. The results revealed the fungicidal activity of PTE on Candida spp., exhibiting MIC and MFC values of 32 µg/mL for all the strains tested. In the kill curve, PTE completely reduced Candida growth at 8, 24 and 48 hours. In microcosm biofilms, PTE reduced the viability of streptococci, staphylococci and yeasts at 20x CIM. In the in vivo study, no toxicity was found for G. mellonella when PTE was inoculated up to 20x CIM. Prophylactic treatment with PTE resulted in increased survival of larvae infected with C. albicans or C. dubliniensis. When infected with C. albicans, there was also a reduction in the fungal load in the hemolymph with PTE treatment. In infection with both Candida species, treatment with ETP did not alter the number of hemocytes. Thus, it is concluded that PTE exhibited antifungal action against planktonic Candida spp. cells, prosthetic stomatitis microcosm biofilms and experimental infection, suggesting its potential use for the treatment of Candida spp. infections associated with the use of dental prostheses Translated with DeepL.com (free version) Keywords: pterostilbene; Candida albicans; Candida dubliniensis; polyphenols; biofilms, prosthetic stomatitis SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ................................................................................................... 11 2 REVISÃO DE LITERATURA.............................................................................. 13 2.1 Gênero Candida e espécies relacionadas................................................... 13 2.2 Infecções por Candida e espécies relacionadas........................................ 15 2.3 Candidíase oral.............................................................................................. 17 2.4. Candidíase eritematosa crônica.................................................................. 19 2.5 Terapia convencional das infecções por Candida spp.............................. 22 2.6 Estratégias terapêuticas em desenvolvimento........................................... 24 2.6.1 Polifenóis ................................................................................................... 24 2.6.2 Pterostilbeno............................................................................................... 25 2.7 Modelo de estudo...........................................................................................28 2.7.1 Modelo in vitro de biofilmes ..................................................................... 28 2.7.2 Modelo in vivo em Galleria mellonella...................................................... 30 3 PROPOSIÇÃO.................................................................................................... 32 3.1 Objetivo geral................................................................................................. 32 3.2 Objetivo específicos...................................................................................... 32 4 MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................. 33 4.1 Cepas e condições de cultivo ...................................................................... 33 4.2 Pterostilbeno e antifúngicos ....................................................................... 33 4.3 Determinação da Concentração Inibitória Mínima .................................... 34 4.4 Determinação de Concentração Fungicida Mínima ................................... 35 4.5 Análise da curva de morte em culturas planctônicas ............................... 35 4.6 Avaliação do efeito do PTE em biofilmes microcosmos ........................... 35 4.7 Estudo dos efeitos do PTE em G. mellonella ............................................. 36 4.7.1 Modelo invertebrado G. mellonella .......................................................... 36 4.7.2 Análise de toxicidade do PTE em G. mellonella ..................................... 37 4.7.3 Estudo das concentrações de C. albicans e C. dubliniensis necessárias para induzir infecção experimental em G. mellonella...................................... 37 4.7.4 Análise dos efeitos profiláticos e terapêuticos de PTE na infecção por Candida spp. em G. mellonella: análise da curva de sobrevivência.............. 38 4.7.5 Efeitos do tratamento profilático do PTE na infecção por Candida spp. em G. mellonella: análise da carga fúngica e número de hemócitos.............38 4.8 Análise estatística ....................................................................................... 39 5 RESULTADOS ................................................................................................. 40 5.1 Concentração inibitória mínima e concentração fungicida mínima do PTE sobre Candida spp. ........................................................................................... 40 5.2 Efeitos de PTE na cinética de morte de Candida spp. em culturas planctônicas ....................................................................................................... 41 5.3 Avaliação da ação do PTE em biofilmes microcosmos ........................... 42 5.3.1 Contagem de UFC do biofilme microcosmo da amostra P1 ................. 42 5.3.2 Contagem de UFC do biofilme microcosmo da amostra P2 ................. 43 5.3.3 Contagem de UFC do biofilme microcosmo da amostra P3 .................. 45 5.4 Estudo in vivo em G. mellonella ................................................................. 46 5.4.1 Teste de toxicidade de PTE em G. mellonella ....................................... . 46 5.4.2 Estudo das concentrações de Candida spp. para induzir infecção em G. mellonella ...................................................................................................... 47 5.4.3 Análise dos efeitos profiláticos e terapêuticos de PTE (20X CIM) na infecção por Candida spp. em G. mellonella: análise da curva de sobrevivência...................................................................................................... 48 5.4.4 Estudo do tratamento profilático com PTE (20X e 50X CIM) sobre a infecção em G. mellonella: análise da curva de sobrevivência ..................... 51 5.4.5 Quantificação da carga fúngica na hemolinfa de larvas de G. mellonella ........................................................................................................... 53 5.4.6 Contagem de hemócitos na hemolinfa de larvas de G. mellonella ...... 54 6 DISCUSSÃO ..................................................................................................... 56 7 CONCLUSÃO .................................................................................................. 60 REFERÊNCIAS .................................................................................................... 61 11 1 INTRODUÇÃO Candida spp. são leveduras que fazem parte da microbiota normal da cavidade oral, sendo Candida albicans a espécie do gênero com maior prevalência (Qiu et al., 2023). Entretanto, espécies relacionadas à candida como Candida parapsilosis, Candida dubliniensis, Candida tropicalis, Pichia kudriavzevii (anteriormente descrita como Candida krusei) e Nakaseomyces glabratus (anteriormente descrita como Candida glabrata) também podem estar presentes na cavidade oral e atuar como agentes de coinfecção (Rodrigues et al., 2018). Em condições de saúde, as espécies de Candida atuam como comensais. Entretanto, quando há um desequilíbrio na microbiota oral, geralmente em decorrência de alterações no sistema imunológico, essas leveduras têm potencial para atuar como agentes oportunistas de infecção (Baumgardner, 2019; Gheorghe et al., 2021). O processo que determina a transição de microrganismo comensal para patogênico é multifatorial e está relacionado a capacidade de resposta do fungo às condições adversas impostas pelo organismo do hospedeiro (Vila et al., 2020). Por isso, para causar infecção é preciso que os mecanismos de virulência do fungo sobressaiam as defesas do hospedeiro. Sobrepostos esses mecanismos, as leveduras têm potencial para se multiplicar, colonizar e invadir tecidos, e, consequentemente, resultar em quadros de candidíase oral como a estomatite protética (Witerden et al., 2017). O tratamento convencional da candidíase oral é baseado em antifúngicos tópicos e/ou sistêmicos, como nistatina e fluconazol. Entretanto, o uso prolongado desses fármacos apresenta limitações relacionadas a disponibilidade, nefrotoxicidade, hepatotoxicidade e, principalmente, ao surgimento de cepas resistentes aos antifúngicos utilizados no manejo clínico dessas infecções. Nesse cenário, há uma busca por novos agentes para o tratamento das infecções por Candida spp. (Karpiński et al., 2021), como produtos naturais. Entre esses, destaca- se o pterostilbeno, um polifenol que vêm demonstrando atividade antifúngica promissora (Hu et al., 2017). Este estudo tem como objetivo avaliar a atividade antifúngica do pterostilbeno sobre C. albicans, C. dubliniensis e biofilmes microcosmos de estomatite protética. 12 Além disso, investigou-se a atividade antifúngica e imunomodulatória do pterostilbeno na infecção experimental por Candida spp. em Galleria mellonella. 60 7 CONCLUSÃO O PTE exibiu atividade contra células planctônicas de C. albicans e C. dubliniensis, e ação antimicrobiana em biofilmes microcosmos de estomatite protética. No modelo de G. mellonella, o PTE não apresentou toxicidade e foi capaz de aumentar a sobrevida das larvas infectadas por C. albicans ou C. dubliniensis em relação ao grupo não tratado. 61 REFERÊNCIAS Abuhajar E, Ali K, Zulfiqar G, Al Ansari K, Raja HZ, Bishti S, et al. Management of Chronic Atrophic Candidiasis (Denture Stomatitis)—A Narrative Review. Int J Environ Res Public Health. 2023;20(4). doi: 10.3390/ijerph20043029. Ahmed, N., Mahmood, M. S., Ullah, M. A., Araf, Y., Rahaman, T. I., Moin, A. 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