UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA COMPARAÇÃO DE TÉCNICAS NO DIAGNÓSTICO DA INFECÇÃO LEPTOSPÍRICA EM OVINOS E IMPLICAÇÕES NA SAÚDE PÚBLICA FELIPE FORNAZARI Botucatu-SP Fevereiro de 2012 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA COMPARAÇÃO DE TÉCNICAS NO DIAGNÓSTICO DA INFECÇÃO LEPTOSPÍRICA EM OVINOS E IMPLICAÇÕES NA SAÚDE PÚBLICA FELIPE FORNAZARI Dissertação apresentada junto ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária para obtenção do título de Mestre Orientador: Prof. Titular Helio Langoni Botucatu-SP Fevereiro de 2012 i Felipe Fornazari. Comparação de técnicas no diagnóstico da infecção leptospírica em ovinos e implicações na saúde pública. Defesa: 27/02/2012. Local: FMVZ/UNESP – Campus de Botucatu/SP. COMISSÃO EXAMINADORA Prof. Titular Helio Langoni Presidente e Orientador Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – UNESP – Botucatu/SP Profa. Titular Jane Megid Membro Titular Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – UNESP – Botucatu/SP Profa. Assistente Dra. Márcia Marinho Membro Titular Departamento de Apoio, Produção e Saúde Animal Faculdade de Medicina Veterinária de Araçatuba – UNESP – Araçatuba/SP Prof. Paulo Francisco Dominguez Membro Suplente Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – UNESP – Botucatu/SP Fabio Hiroto Shimabukuro Membro Suplente Laboratório de Hepatites Virais e Leptospirose Instituto Adolfo Lutz ii DEDICATÓRIA Aos meus pais: Claribel Ortelan Fornazari, meu maior exemplo de dedicação aos estudos e porto seguro nos momentos de maior dificuldade. Sérgio Fornazari Jr: desenhista, músico, arquiteto, engenheiro, fotógrafo e fonte inesgotável de conhecimento que me inspirou durante toda a minha vida. Vocês são os melhores pais do mundo À minha falecida avó, Dalva de Oliveira Ortelan, que durante minha infância sempre me acolheu em seu sítio, no qual despertei grande parte do meu amor pela natureza e pelos animais. Amo muito vocês iii AGRADECIMENTOS Primeiramente ao professor Helio Langoni. Desde a graduação o senhor foi muito importante para a minha formação profissional. Muito obrigado por todos os ensinamentos e oportunidades. Ao professor e grande amigo Carlos Roberto Teixeira (Carlinhos). Muito obrigado pela liberdade para trabalhar com animais selvagens do CEMPAS, e à confiança em mim depositada. Ao amigo Rodrigo Costa da Silva, por todos os ensinamentos, ajuda nas coletas, análise estatística, e por ajudar nos exames de PCR durante o feriado. À professora Maria Cecília Rui Luvizotto e ao amigo Hugo Enrique Orsini Beserra, pela realização das técnicas histopatológicas. À amiga Lucilene Granuzzio Camossi “Ducetinha da minha vida”. Exemplo de dedicação ao trabalho e grande parceira de projetos. Obrigado por me ajudar nas coletas, pela companhia, e por todas as demais atividades realizadas na zoonoses. Àqueles que acordaram de madrugada para me ajudar nas coletas do abatedouro: Leila, Ana, Benedito, Diego (Mogle), e estagiários da zoonoses. À amiga Virginia (Virjaina), por aturar minha impaciência e humor negro e, principalmente, por ajudar na PCR em tempo real. Ao meu melhor amigo Felipe de Freitas Guimarães (Filão) e à minha melhor amiga Eliana Paladino (Rorosa). Vocês são os irmãos que eu nunca tive. Embora não tenham me ajudado diretamente neste trabalho, nossa amizade foi muito importante nos últimos anos, e espero que vocês sempre estejam presentes em minha vida. À amiga Luisa Martelli Soares (Pão), pela amizade e pelas maravilhosas refeições que me ajudaram muito nas minhas noites de estudo. À grande amiga Pamela Marson (PamÉla), fonte inesgotável de ajuda nas horas de maior necessidade. Muito obrigado pelas dicas de biomol e pelas fotos do abatedouro. “Very nice ...” À pessoa mais discreta do departamento: Selene Babboni (Zuli, Zuli Zuli). Muito obrigado pela ajuda com os animais selvagens. Sua amizade me rendeu muitos momentos de alegria e diversão. E viva a Copavet !!! iv À professora Sheila Canevese Rahal, pela amizade e ajuda nos trabalhos realizados com animais selvagens. À Fapesp, pelo suporte financeiro mensal e pelo auxílio pesquisa, sem o qual esse trabalho não seria possível. À Fundação “Prof. Martin Tielen” e à pró-reitoria da UNESP, por financiarem minha participação no XV Congresso Internacional de Higiene Veterinária, em Viena, no qual foi possível apresentar dados parciais deste trabalho. v Lista de Tabelas TABELA 1: Resultado da SAM, PCR, qPCR, cultivo bacteriano e técnica de WS de ovinos soropositivos para leptospirose, provenientes de abatedouro do município de São Manuel. Botucatu, 2011 ............................................................ 34 TABELA 2: Associação entre os resultados da SAM e do cultivo bacteriano, técnica de WS, PCR e qPCR para a detecção de Leptospira spp. em amostras de rim e fígado de ovinos soropositivos para leptospirose, provenientes de abatedouro do município de São Manuel, SP. Botucatu, 2011 ........................... 35 TABELA 3: Associação entre a qPCR e cultivo bacteriano, técnica de WS e PCR para a detecção de Leptospira spp. em amostras de rim e fígado de ovinos soropositivos para leptospirose, provenientes de abatedouro do município de São Manuel, SP. Botucatu, 2011 ..................................................... 36 TABELA 4: Correlação entre os títulos da SAM, independente do sorovar, específico para o sorovar, e específico para a sorovariante mais frequente, e o resultado da PCR quantitativa para a detecção de DNA de Leptospira spp. em amostras de rim e fígado de ovinos provenientes de abatedouro do município de São Manuel, SP. Botucatu, 2011....................................................................... 37 TABELA 5: Mediana (Md), percentil 25% (P25) e 75% (P75) da carga bacteriana (bactérias/μL) aferidas pela qPCR em amostras de rim e fígado de ovinos soropositivos para leptospirose provenientes de abatedouro do município de São Manuel, SP. Botucatu, 2011 ..................................................... 38 vi Lista de Figuras FIGURA 1: Fluxograma ilustrando as amostras biológicas utilizadas, a sequência dos procedimentos, e as análises realizadas para a detecção de Leptospira spp. em ovinos. Botucatu, 2011 ........................................................... 28 FIGURA 2: Coleta de sangue após sangria de ovinos proveniente de abatedouro localizado em São Manuel, SP. Botucatu, 2011. .............................. 29 FIGURA 3: Etapa de evisceração de carcaças de ovinos em abatedouro localizado em São Manuel, SP. Botucatu, 2011 ................................................... 29 FIGURAS 4 e 5: Coleta de rim e fragmento de fígado durante processo de evisceração de ovino em abatedouro localizado em São Manuel, SP. Botucatu, 2011 ........................................................................................................................... 29 FIGURA 6: Eletroforese horizontal de amostras renais e hepáticas de ovinos submetidas à PCR, ilustrando as bandas de amostras positivas (setas verdes), controles positivos (setas azuis), controles negativos (setas vermelhas) e os marcadores moleculares (ladder) (setas brancas). Botucatu, 2011 .................... 38 FIGURA 7: Gráfico ilustrando a intensidade de fluorescência emitida por duas amostras renais de ovinos positivas (setas verdes) pela PCR quantitativa, de acordo com o ciclo de amplificação. As demais amostras são referentes à curva padrão. Botucatu, 2011 ............................................................................................ 39 FIGURA 8: Imagem de microscopia óptica comum (100x) de tecido renal de ovino soropositivo para leptospirose, corado pela técnica de Warthin Starry, ilustrando estrutura compatível com leptospira (seta azul). Botucatu, 2011 ...... 40 vii Lista de abreviaturas bact/μL: bactérias/μL DNA: ácido desoxirribonucléico E: especificidade ELISA: ensaio imunoenzimático EMJH: Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris IC: intervalo de confiança Md: Mediana OMS: Organização Mundial da Saúde PCR: reação em cadeia pela polimerase qPCR: PCR quantitativo rpm: rotações por minuto S: sensibilidade SAM: soroaglutinação microscópica SP: São Paulo SST: solução salina tamponada Técnica de WS: técnica de Warthin Starry VPN: valor preditivo negativo VPP: valor preditivo positivo viii Sumário RESUMO ....................................................................................................................ix ABSTRACT................................................................................................................xi Introdução .................................................................................................................. 1 Revisão de literatura ................................................................................................ 4 2.1 Etiologia ........................................................................................................... 5 2.2 Aspectos gerais da leptospirose nos animais ......................................... 6 2.2.1 Epidemiologia .......................................................................................... 6 2.2.1.1 Distribuição ....................................................................................... 6 2.2.1.2 Transmissão ...................................................................................... 6 2.2.1.3 Reservatórios .................................................................................... 7 2.2.2 Patogenia .................................................................................................. 9 2.2.3 Sinais clínicos .......................................................................................... 9 2.2.4 Diagnóstico ............................................................................................ 10 2.2.5 Tratamento ............................................................................................. 12 2.2.6 Prevenção ............................................................................................... 13 2.3 Particularidades da leptospirose ovina ................................................... 14 2.4 Aspectos de saúde pública ........................................................................ 15 Objetivos .................................................................................................................. 17 Material e métodos ................................................................................................. 19 4.1 Delineamento experimental ....................................................................... 20 4.2 Animais .......................................................................................................... 20 4.3 Colheita e preparação das amostras ....................................................... 21 4.4 Sorologia ........................................................................................................ 22 4.5 Cultivo bacteriano ........................................................................................ 23 4.6 Extração de DNA .......................................................................................... 24 4.7 PCR (convencional) ..................................................................................... 25 4.8 Eletroforese ................................................................................................... 25 4.9 PCR quantitativa ........................................................................................... 26 4.10 Técnica de Warthin Starry ........................................................................ 26 4.11 Análise estatística ...................................................................................... 27 Resultados ............................................................................................................... 30 5.1 Sorologia ........................................................................................................ 31 5.2 Cultivo bacteriano ........................................................................................ 31 5.3 Técnica de Warthin Starry .......................................................................... 31 5.4 PCR ................................................................................................................. 32 5.5 qPCR ............................................................................................................... 32 Discussão ................................................................................................................ 41 Conclusões .............................................................................................................. 53 Referências bibliográficas .................................................................................... 55 Artigo científico ...................................................................................................... 71 ix FORNAZARI, F. Comparação de técnicas no diagnóstico da infecção leptospírica em ovinos e implicações na saúde pública. Botucatu, 2012. 100p. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”. Botucatu, São Paulo. RESUMO A leptospirose é uma enfermidade infecto-contagiosa, de caráter zoonótico, que possui grande importância mundial. É causada por diversas espécies de bactérias patogênicas do gênero Leptospira, ocorrendo com maior frequência em regiões tropicais com condições sanitárias precárias. A infecção ocorre pelo contato direto ou indireto com a urina de animais infectados, e pode variar de assintomática até quadros clínicos graves que causam a morte. A leptospirose em ovinos é responsável por queda na produção animal, e por riscos para a saúde pública. O desenvolvimento de técnicas de diagnóstico permite identificar animais doentes, auxiliando no tratamento precoce, controle de reservatórios, e na prevenção da enfermidade. O presente estudo teve como objetivo principal comparar diferentes técnicas de diagnóstico na leptospirose em ovinos. Amostras de rim, fígado e sangue foram coletadas de 465 animais provenientes de um abatedouro. O soro foi submetido à Soroaglutinação Microscópica (SAM), e as amostras de rim e fígado dos animais soropositivos foram individualmente analisadas por quatro técnicas: cultivo bacteriano, técnica de Warthin Starry (WS), PCR convencional (PCR) e PCR quantitativa (qPCR). Amostras teciduais de 15 ovinos soronegativos, escolhidos aleatoriamente, foram utilizadas como controles negativos. No exame sorológico 21 animais foram positivos (4,5%) para os sorovares Hardjo (n=12), Hebdomadis (n=5), Sentot (n=2), Wolfii (n=1) e Shermani (n=1). Os títulos apresentados foram 100 (n=10), 200 (n=2), 400 (n=6) e 1600 (n=3). No cultivo bacteriano nenhum animal apresentou resultado positivo; na técnica de WS quatro animais foram positivos em amostras de rim, e nenhum de fígado; na PCR seis animais foram positivos em amostras de rim, e nenhum de fígado; e na qPCR 11 animais foram positivos, 8 em amostras de rim e três em amostras de fígado. A quantificação bacteriana resultante da qPCR revelou mediana de x 4,32 bactérias/μL em amostras de fígado e 36,67 bactérias/μL em amostras de rim. A qPCR apresentou a maior sensibilidade entre as técnicas, seguida da PCR, técnica de WS e cultivo bacteriano. Houve correlação positiva entre os títulos obtidos na SAM e a carga de leptospiras em rim de animais soropositivos para as sorovariantes Hardjo C.T.G. e Hardjo prajitno. A maior frequência de animais soropositivos para o sorovar Hardjo corrobora com dados presentes na literatura, onde leptospiras pertencentes ao sorogrupo Sejroe são as mais comuns na espécie ovina. Diversos estudos têm comprovado a eficiência das técnicas de PCR para a detecção de leptospiras tanto nos animais como no homem, assim como em vários tipos de amostras biológicas. São escassos os trabalhos envolvendo estas técnicas em ovinos, e não há registro da utilização da qPCR para a pesquisa de leptospiras nesta espécie. Os resultados do presente estudo indicam a presença de Leptospira spp. em amostras teciduais de ovinos, especialmente às pertencentes ao sorogrupo Sejroe; e a qPCR é uma técnica eficiente para a detecção de Leptospira spp. em amostras de fígado e rim de ovinos. Palavras-chave: leptospirose, diagnóstico, PCR, ovinos, saúde pública xi FORNAZARI, F. Comparison of techniques in the diagnosis of leptospiral infection in sheep and implications for public health. Botucatu, 2012. 100p. Dissertation (Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”. Botucatu, São Paulo. ABSTRACT Leptospirosis is an infectious disease, of zoonotic character, which has great importance worldwide. It is caused by several species of pathogenic bacteria of Leptospira genera, occurring more frequently in tropical regions with poor sanitary conditions. The infection occurs by direct or indirect contact with urine of infected animals, and can vary from asymptomatic to severe clinical pictures that lead to death. Leptospirosis in sheep is responsible for decrease in animal production, and for risks in public health. The development of diagnostic techniques allows to identifying sick animals, assisting in early treatment, reservoirs control, and disease prevention. The present study had as main objective to compare different techniques of leptospirosis diagnostic in sheep. Samples of kidney, liver and blood were collected from 465 animals originated from a slaughterhouse. The sera were submitted to Microscopic Agglutination Test (MAT), and kidney and liver samples of seropositive animals were individually analyzed by four techniques: bacteriological culture, Warthin Starry (WS) technique, conventional PCR (PCR), and quantitative PCR (qPCR). Tissue samples from 15 seronegative sheep, chosen randomly, were used as negative controls. In serologic exam 21 animals were positive (4.5%) to serovars Hardjo (n=12), Hebdomadis (n=5), Sentot (n=2), Wolfii (n=1) and Shermani (n=1). The titers presented were 100 (n=10), 200 (n=2), 400 (n=6) and 1600 (n=3). In bacteriologic culture no animal presented positive result; in WS technique four animals were positive in kidney samples, and none in liver; in PCR six animals were positive in kidney samples, and none in liver; and in qPCR 11 animals were positive, 8 in kidney samples and three in liver samples. The bacterial quantification resulting from qPCR revealed median of 4.32 bacteria/μL in liver samples and 36.67 bacteria/μL in kidney samples. qPCR presented the higher sensitivity among the techniques, followed by PCR, WS xii technique and bacteriologic culture. There was a positive correlation between MAT titers and leptospiral load in kidney from seropositive animals to serovariants Hardjo C.T.G. and Hardjo prajitno. The highest frequency of animals seropositive to serovar Hardjo corroborates with data present in literature, where leptospires belonging to Sejroe serogroup are the most common in sheep. Several studies have proven the efficiency of PCR techniques to detect leptospires in both animals and men, as well as in many types of biologic samples. The studies involving these techniques in sheep are scarce, and there is no data regarding the use of qPCR to detect leptospires in that species. The results of the present study indicates the presence of Leptospira spp. in tissue samples of sheep, specially those from Sejroe serogroup; and the qPCR is an efficient technique to detect Leptospira spp. in liver and kidney samples from sheep. Key-words: leptospirosis, diagnostic, PCR, sheep, public health. 1 Introdução 2 1. INTRODUÇÃO A leptospirose é uma zoonose que possui grande importância no contexto de saúde animal e saúde pública. Animais domésticos podem apresentar queda na produção e, dessa forma, causar prejuízos econômicos. Além disso, a leptospirose pode ser responsável por uma elevada mortalidade, não somente nos animais de produção, mas também nos animais de companhia e no homem (LEVETT, 2001). A leptospirose em ovinos é pouco estudada (SILVA et al., 2007), porém, sabe-se que estes animais são importantes reservatórios em algumas regiões (LILENBAUM et al., 2009), e podem representar importantes fontes de infecção para o homem e para outras espécies domésticas (GERRITSEN et al., 1994). O desenvolvimento e aprimoramento das técnicas de diagnóstico são fundamentais no controle e prevenção da leptospirose. Alta sensibilidade, custo acessível, e mão de obra disponível são características necessárias para a implementação de um método de diagnóstico que possa ser utilizado em larga escala. Estudos voltados para este assunto são realizados com maior frequência para o diagnóstico da leptospirose humana (MERIEN et al., 2005; SEGURA et al., 2005; OOTEMAN et al., 2006; BOURHY et al., 2011; THAIPADUNPANIT et al., 2011). Devido aos riscos de transmissão que os ovinos oferecem para o homem, o aperfeiçoamento das técnicas de diagnóstico nesta espécie é de grande importância em saúde pública. Existem diversas técnicas para o diagnóstico de leptospirose, sendo a soroaglutinação microscópica (SAM) a mais utilizada (WHO, 2003). O campo escuro e o cultivo bacteriano também são métodos empregados com frequência, porém, assim com a SAM, são técnicas muito antigas, que apresentam algumas desvantagens em relação à sensibilidade e praticidade no diagnóstico. A partir do início da década de 1990 as técnicas biomoleculares começaram a ser empregadas para o diagnóstico de diversas enfermidades infecciosas, entre elas a leptospirose (CARVALHO et al., 2010). A reação em cadeia pela polimerase (PCR) é uma das mais utilizadas. Esta técnica consiste em pesquisar moléculas de DNA de um determinado organismo, e reproduzi-la 3 várias vezes para que seja possível sua detecção. As principais vantagens apresentadas pela PCR são sua alta sensibilidade e resultado rápido, tornando esta técnica muito útil para o diagnóstico de enfermidades infecciosas, tanto nos animais como no homem. Com o propósito de contribuir para o diagnóstico de leptospirose, o presente trabalho teve como objetivo principal comparar diferentes técnicas empregadas na detecção de Leptospira spp. na espécie ovina. 4 Revisão de literatura 5 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Etiologia A leptospirose é causada por diversas espécies de bactérias do gênero Leptospira, família Leptospiraceae, ordem Spirochaetales. Sua nomenclatura e taxonomia são complexas. Até 1989 se conheciam somente duas espécies: L. interrogans, que agrupava as bactérias patogênicas; e L. biflexa, que incluía bactérias saprófitas, não-patogênicas, e presentes no ambiente (LEVETT, 2001; GREENE et al., 2006). Recentemente, na reunião do Subcomitê de Taxonomia da Leptospiraceae, realizada em Quito, Equador, em 2007, a espécie L. interrogans foi reclassificada em 13 novas espécies patogênicas: L. alexanderi, L. alstonii, L. borgpeterseni, L. inadai, L. interrogans, L. fainei, L. kirschneri, L. licerasiae, L. noguchi, L. santarosai, L. terpstrae, L. weilii e L. wolfii (ADLER e DE LA PEÑA MOCTEZUMA, 2010). Estudos envolvendo a hibridização de DNA sugerem que o gênero Leptospira deveria ser dividido em 20 espécies (CERQUEIRA e PICARDEAU, 2009). As leptospiras podem ainda ser divididas de acordo com suas diferenças fenotípicas (ou antigênicas), denominados sorovares. Portanto, um determinado sorovar pode compreender mais de uma espécie de Leptospira spp.. Aproximadamente 260 diferentes sorovares patogênicos são reconhecidos atualmente, agrupados em 23 sorogrupos (ADLER e DE LA PEÑA MOCTEZUMA, 2010). Leptospiras são bactérias flexíveis, com alta motilidade, que apresentam movimentos giratórios ao longo de seu próprio eixo. Suas características morfológicas incluem formato alongado, helicoidal, comprimento de 10 a 20 μm, diâmetro de 0,1 a 0,2 μm, dois endoflagelos periplasmáticos ao longo de sua extensão, e extremidades com formato de “gancho” (QUINN et al., 2005; GREENE et al., 2006; SLAMTI et al., 2011). Sua membrana plasmática dupla apresenta algumas particularidades em relação às outras espiroquetas invasivas, como a presença de lipopolissacarídeos e uma grande diversidade de proteínas transmembrana (HAAKE e MATSUNAGA, 2010). Umidade e temperatura elevadas são condições essenciais para a sobrevivência da Leptospira spp. no ambiente. Temperatura de 28 a 30°C e pH 6 7,6, sob aerobiose, são condições ideais para seu crescimento e multiplicação (LEVETT, 2001). Sua membrana citoplasmática é muito sensível ao ressecamento, ocorrendo morte bacteriana em poucos minutos na ausência de água. No entanto, não é necessária a presença de corpos d’água para sua sobrevivência, pois substratos úmidos favorecem um ambiente adequado para sua manutenção (QUINN et al.,2005). 2.2 Aspectos gerais da leptospirose nos animais 2.2.1 Epidemiologia 2.2.1.1 Distribuição A leptospirose é considerada uma enfermidade de distribuição mundial, ocorrendo com maior frequência nas regiões tropicais, onde as condições de umidade e temperatura contribuem para a sobrevivência da bactéria no ambiente (LEVETT, 2001). A enfermidade também é comum em países subdesenvolvidos e/ou em desenvolvimento, os quais possuem estrutura sanitária deficiente. No Brasil a leptospirose é considerada uma doença endêmica, e está presente em todo o território nacional. 2.2.1.2 Transmissão A leptospirose apresenta uma característica sazonal, ocorrendo com maior frequência no verão, quando os índice pluviométricos e a temperatura são mais elevados, favorecendo a dispersão e a sobrevivência da Leptospira spp. no ambiente (ADLER e DE LA PEÑA MOCTEZUMA, 2010). A infecção ocorre principalmente de duas formas: contato direto com a urina ou tecidos de animais infectados, durante a sua manipulação; ou indiretamente pelo contato com água ou solo úmido previamente contaminados pela urina de um animal infectado (LEVETT, 2001). Outras formas de infecção incluem a via transplacentária (FELT et al., 2011), a transmissão venérea (HARRISON e FITZGERALD, 1988), e a inalação de aerossóis contendo gotículas de água 7 contaminada (LEVETT, 2001). Na leptospirose humana há evidencias da eliminação de leptospiras pelo leite de mães lactantes (CHUNG et al., 1963; BOLIN e KOELLNER, 1988). A bactéria penetra ativamente ao entrar em contato com mucosas (principalmente oral e ocular) ou soluções de continuidade. Também pode ocorrer a penetração de leptospiras pela pele íntegra quando há exposição prolongada (LEVETT, 2001), como por exemplo, durante banhos em rios ou lagos. 2.2.1.3 Reservatórios Os reservatórios de leptospirose incluem os animais susceptíveis à infecção pela Leptospira spp., capazes de eliminar a bactéria pela urina após o período de incubação. Diversas espécies, tanto domésticas como selvagens, podem atuar como reservatórios. Estes podem ser classificados como primários (ou de manutenção) e secundários (ou acidentais) (LEVETT, 2001; QUINN et al., 2005). Um reservatório primário é considerado altamente susceptível à infecção, sendo esta endêmica, ocorrendo principalmente pelo contato direto entre os animais durante a fase inicial da vida. Os sinais clínicos geralmente são brandos, e a prevalência da excreção renal aumenta com a idade. Os reservatórios primários são eficazes em manter a infecção renal e eliminar leptospiras pela urina, sendo os maiores responsáveis pela contaminação ambiental. Uma determinada espécie pode ser reservatório primário para um sorovar, mas acidental para outros. Neste caso, a infecção não é tão comum, e o aparecimento de lesões e sinais clínicos é mais frequente. As espécies de hospedeiros acidentais exibem baixa susceptibilidade à infecção, desenvolvem quadros clínicos mais graves, e são transmissores pouco eficientes. A classe dos mamíferos é a mais importante e a mais estudada. Todas as espécies pertencentes a este grupo são consideradas potenciais reservatórios (FELT et al., 2011). Os répteis e anfíbios também podem se infectar e desenvolver a infecção renal (MINETTE, 1983; GRAVEKAMP et al., 1991; BISCOLA et al., 2011), mas os estudos direcionados para este grupo de animais são muito escassos. Pouco se sabe sobre o impacto da leptospirose 8 nos répteis e anfíbios, bem como a importância dos mesmos como fontes de infecção. Os roedores de hábito sinantrópico são considerados os reservatórios mais importantes de Leptospira spp.. A espécie Rattus norvegicus, popularmente chamada de ratazana, é o reservatório primário de leptospiras pertencentes ao sorogrupo Icterohaemorrhagiae e Ballum (LEVETT, 2001; RAHELINIRINA et al., 2010), capaz de manter a infecção e eliminar leptospiras pela urina por longo tempo. Outras espécies de roedores consideradas importantes reservatórios incluem o rato-de-telhado, também conhecido como rato-preto (Rattus rattus) e o camundongo (Mus musculus) (FAINE et al., 1999a; MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2002; RAHELINIRINA et al., 2010). Apesar do amplo conhecimento de que os roedores são transmissores da leptospirose em todo o mundo (WHO, 2003), ainda são escassos os estudos nessa área. Pouco se sabe sobre a importância das demais espécies de roedores, os sorovares mais frequentes, suas implicações na saúde pública, entre muitos outros aspectos. Muitas espécies domésticas podem atuar como fontes de infecção, como os suínos, bovinos, ovinos, caprinos, equinos e cães. Diversos estudos realizados em vários países têm demonstrado a presença de leptospiras em tecidos e urina destes animais (LANGONI et al., 1999; ROCHA et al., 2004; SILVA et al., 2007; SOTO et al., 2007; BOMFIM et al., 2008; LILENBAUM et al., 2009; ROJAS et al., 2010). Os gatos domésticos são pouco susceptíveis à infecção, e possuem pouca importância como reservatórios de leptospirose. Em bovinos, ovinos e caprinos, o sorovar Hardjo é o mais comum, ocorrendo também com relativa frequência infecções pelos sorovares Pomona e Grippotyphosa (FAINE et al., 1999a; LEVETT, 2001; OLIVEIRA et al., 2001; QUINN et al., 2005; LILENBAUM et al., 2009; MARTINS et al., 2010; MELO et al., 2010; SEIXAS et al., 2011). Em equinos os sorovares Bratislava e Icterohaemorrhagiae são os mais comuns (LEES e GALES, 1994; WILLIAMS et al., 1994; LANGONI et al., 2004; ODONTSETSEG et al., 2005), enquanto que nos cães são os sorovares Canicola e Icterohaemorrhagiae (LEVETT, 2001; GREENE et al., 2006; ROACH et al., 2010). Há uma grande diversidade de sorovares importantes na infecção em suínos, como Pomona, Tarassovi, 9 Bratislava, Grippotyphosa, Icterohaemorrhagiae e Canicola (FAINE et al., 1999a; LEVETT, 2001; SHIMABUKURO et al., 2003; SOTO et al., 2007). É importante levar em consideração que a condição de reservatório (primário ou secundário) pode variar dependendo da região, assim como os sorovares que ocorrem nos mesmos. O estudo dos fatores que causam essas variações, as espécies mais importantes como reservatórios, e seus sorovares mais prevalentes são de grande importância para o conhecimento da epidemiologia da leptospirose em uma determinada região. 2.2.2 Patogenia A infecção é basicamente dividida em duas fases: aguda e crônica (ou convalescente). Ao penetrar no organismo, as leptospiras atingem a corrente sanguínea, e se multiplicam em diversos tecidos, principalmente pulmões, fígado e baço. A fase aguda, também chamada de leptospiremia, dura em média de uma a duas semanas, e se caracteriza pelo aparecimento de sinais clínicos. Após esta fase, os mecanismos imunológicos diminuem a quantidade de leptospiras no organismo, havendo uma maior concentração nos tecidos onde a resposta inflamatória é menos acentuada, principalmente nos túbulos renais (LEVETT, 2001). Em seguida os sinais clínicos diminuem ou desaparecem, e a produção de anticorpos coincide com a soroconversão do animal (QUINN et al. 2005). Se a resposta imune não é suficiente para debelar a infecção, o quadro clínico é mais grave, havendo manifestações sistêmicas que podem levar a morte. Durante a fase crônica as leptospiras permanecem principalmente nos rins, se aderem no epitélio dos túbulos renais (LEVETT, 2001), se multiplicam e são eliminadas pela urina. 2.2.3 Sinais clínicos A infecção por Leptospira spp. pode apresentar comportamentos distintos (MARINHO et al., 2003) variando de assintomática até quadros clínicos graves, chegando à morte (FELT et al., 2011). Os roedores sinantrópicos, considerados os maiores reservatórios de Leptospira spp., não adoecem. As manifestações 10 clínicas geralmente estão associadas à lesões pulmonares, cardíacas, hepáticas e renais (MARINHO, 2008). Os sintomas mais comuns são febre, letargia, anorexia, pneumonia, icterícia, hematúria, hemorragias generalizadas e dores musculares (FAINE et al., 1999a; FELT et al., 2011). Nos equinos são comuns lesões no globo ocular, principalmente uveíte (WADA et al., 2003; BRANDES et al., 2007). Nos animais de produção, como bovinos, ovinos, caprinos e suínos, são muito comuns alterações relacionadas ao sistema reprodutor (LANGONI et al., 1999; QUINN et al., 2005), como aborto, nascimentos prematuros, nascimento de filhotes fracos, retenção de placenta, infertilidade, orquite, agalactia e mastite. Nestes animais se observa queda da produção, havendo diminuição da taxa de crescimento, do número de gestações, número de filhotes, e produção de leite. 2.2.4 Diagnóstico O diagnostico laboratorial de leptospirose pode ser realizado por métodos diretos, que identificam a presença do agente etiológico, ou indiretos, que detectam anticorpos específicos contra leptospiras. Geralmente os métodos indiretos são mais utilizados, por serem rápidos, de baixo custo, e menos laboriosos (GROOMS e BOLIN, 2005). No caso da leptospirose, nos últimos anos as técnicas bio-moleculares têm sido cada vez mais recomendadas para o diagnóstico nos animais, e principalmente no homem. Entre os métodos indiretos, também chamados de sorológicos, os mais utilizados são aqueles baseados na aglutinação de leptospiras. Seu uso teve início pouco depois da descoberta da doença, (MARTIN e PETTIT, 1918) e até hoje são amplamente utilizados (LEVETT, 2001). A Soroaglutinação Microscópica (SAM) é o método de referência para o diagnóstico de leptospirose (WHO, 2003), e consiste em adicionar ao soro uma suspensão de leptospiras vivas mantidas em meio de cultura. Se houver anticorpos anti- Leptospira spp. no soro testado, as bactérias se aglutinarão, formando complexos que podem ser observados em microscopia de campo escuro. Na maioria das vezes não ocorrem reações cruzadas entre diferentes sorovares, 11 havendo a necessidade de se utilizar baterias com diferentes sorovares para cada análise. O ensaio imunoenzimático (ELISA) é outra técnica sorológica utilizada com frequência (MELO et al., 2010). Sua execução é mais fácil que a SAM, pois existem kits comerciais disponíveis. Em um estudo realizado por Cumberland et al. (2010) observou-se uma maior sensibilidade do ELISA em relação à SAM em diferentes fases da infecção no homem. Porém, esta técnica não é capaz de determinar qual o sorovar ou sorogrupo infectante. O ELISA não é recomendado como método exclusivo de diagnóstico para leptospirose, capaz de substituir a SAM (ADLER e DE LA PEÑA MOCTEZUMA, 2010). Além da SAM e do ELISA, poucos testes sorológicos têm sido empregados para o diagnóstico de leptospirose. Existem vários métodos diretos para o diagnóstico de leptospirose. Um dos mais antigos é a pesquisa em campo escuro em fluidos corporais, como sangue, urina, derrames cavitários e fluido cerebroespinhal. Esse material é submetido à microscopia de campo escuro, permitindo a visualização das leptospiras (GREENE et al., 2006). Porém, esta técnica apresenta pouca sensibilidade e especificidade (LEVETT, 2001), devido à intermitência com que as leptospiras são eliminadas pela urina, e à pequena carga bacteriana presente nos demais fluidos do organismo. Resultados negativos não significam ausência de Leptospira spp. no animal, e a análise de amostras pareadas é necessária. O cultivo bacteriano é outra técnica muito utilizada, que consiste na inoculação de sangue ou tecido renal macerado em um tubo com meio de cultura (Fletcher ou EMJH) para que ocorra a multiplicação bacteriana (GREENE et al., 2006). Após incubação a 28°C, o material é observado em microscopia de campo escuro para a visualização de leptospiras. O período de incubação, segundo a literatura, é muito variável (de quatro semanas a seis meses). O cultivo bacteriano é uma técnica de baixa sensibilidade, laboriosa e demorada (BOQVIST et al., 2003; FEARNLEY et al., 2008; LILENBAUM et al., 2009), e tem sido cada vez menos utilizada para o diagnóstico de leptospirose. Tanto a pesquisa em campo escuro como o cultivo bacteriano se baseiam na morfologia das bactérias isoladas. Portanto, em casos de resultados positivos, 12 deve-se considerar a ocorrência de outros agentes da ordem Spirochaetales, não pertencentes ao gênero Leptospira. Outros métodos diretos para o diagnóstico de leptospirose podem ser realizados pela coloração das leptospiras. Dessa forma é possível sua visualização em microscopia comum (LEVETT, 2001). A técnica de Warthin Starry e a técnica de Levaditti são as mais utilizadas, e utilizam nitrato de prata para corar leptospiras em amostras teciduais fixadas em formol. Outros métodos de coloração utilizados com menor frequência incluem a imunoistoquímica e a imunfluorescência. As técnicas bio-moleculares, principalmente a PCR (reação em cadeia pela polimerase), têm sido muito utilizadas nos últimos anos para o diagnóstico de leptospirose (HERNÁNDEZ-RODRÍGUEZ et al., 2011; MAYER-SCHOOL et al., 2011). Estas técnicas consistem basicamente na pesquisa do DNA bacteriano, que pode ser feita tanto em amostras biológicas, como em amostras de solo, água, entre outros. Um fragmento do DNA é amplificado muitas vezes por meio de reações específicas, e em seguida é submetido à eletroforese e visualizado macroscopicamente sob luz ultravioleta (CARVALHO et al., 2010). Embora as técnicas de PCR ainda sejam relativamente caras, seu resultado rápido e alta sensibilidade representam um fator importante para o diagnóstico de rotina na medicina veterinária. 2.2.5 Tratamento O tratamento específico pode ser realizado por meio de antibióticos. A estreptomicina foi um dos primeiros medicamentos a ser utilizado (GIRIO et al., 2005). Atualmente os antimicrobianos empregados com maior frequência para o tratamento de leptospirose são a penicilina G cristalina, a ceftriaxona, a doxiciclina e a ampicilina (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2009). Outros antibióticos incluem os aminoglicosídeos e macrolídeos (TRUCCOLO et al., 2002). Tratamento de suporte também deve ser realizado, de acordo com cada caso. 13 2.2.6 Prevenção A prevenção da leptospirose deve se basear no controle de roedores, qualidade da água que os animais têm acesso, controle da aquisição de animais, na vacinação e na eliminação e/ou tratamento dos animais infectados (BARTHI et al., 2003; WHO, 2003; VIJAYACHARI, et al., 2008). Para evitar a presença de roedores, deve-se armazenar adequadamente os alimentos; evitar o acúmulo de lixo, o qual pode fornecer alimento e abrigo para estes animais; e utilizar ratoeiras. O uso de gatos para o controle de roedores não é recomendado, pois essa prática aumenta os riscos de transmissão de toxoplasmose. A água fornecida para o consumo dos animais deve ser limpa e de fonte segura. Água de lagos e rios são consideradas potenciais vias de transmissão da leptospirose. Deve-se drenar as áreas alagadas, ou evitar a formação das mesmas, pois podem transmitir a doença não somente pelo consumo, mas pelo contato com mucosas e soluções de continuidade. A aquisição de animais é uma prática comum na criação de diversas espécies domésticas, como bovinos, ovinos, caprinos e equinos. A inclusão de um animal infectado em um rebanho saudável pode contribuir para a disseminação da enfermidade rapidamente, e tem sido considerada um importante fator para a ocorrência da leptospirose. O controle da procedência do animal, bem como a realização de exames antes de sua aquisição, são medidas que contribuem para a prevenção da leptospirose (MELO et al., 2010). Os animais identificados como portadores de Leptospira spp. devem ser eliminados ou tratados, evitando a transmissão para outros animais. Produtos de aborto, como fetos e placentas, devem ser removidos e preferencialmente incinerados, pois este material pode representar uma via de transmissão no caso de abortos por leptospirose. A vacina para leptospirose está disponível para algumas espécies domésticas, e seu uso contribui significativamente para a redução de animais soropositivos (GERRITSEN et al., 1994). Geralmente sua aplicação é feita anualmente. A imunização contra leptospiras é sorovar específica (LEVETT, 2001), havendo a necessidade da inclusão de diversos sorovares na 14 formulação da vacina, garantindo assim uma proteção eficaz. Isso nem sempre ocorre, pois muitos países em desenvolvimento não produzem vacinas, sendo necessária a utilização de produtos fabricados em outros países, os quais nem sempre possuem os mesmos sorovares como prioridade. Ao adquirir uma vacina, é importante se certificar quais sorovares estão inclusos em sua formulação, e se os mesmos ocorrem nos animais naquela região. Outro problema da vacinação é sua resposta imunológica fraca para alguns sorovares, apresentando pouca eficiência em alguns casos (FAINE, 1999b). Portanto a vacinação não deve ser adotada como única medida de prevenção (MELO et al., 2010). 2.3 Particularidades da leptospirose ovina A infecção por Leptospira spp. em ovinos é muito comum em todo o mundo (MOTIE e MYERS, 1986; VERMUNT et al., 1994; LEON-VIZCAINO et al., 1997; ZAMORA et al., 1999; CICERONI et al., 2000; GIRIO et al., 2004) e, assim como os caprinos, estão entre as espécies domésticas menos susceptíveis à leptospirose (LEON-VIZCAINO et al., 1987). Alguns estudos têm apontado esta espécie como importantes reservatórios, capazes de manter a infecção e eliminar a bactéria no ambiente (SILVA et al., 2007; LILENBAUM et al.., 2009). Em muitos casos, a infecção em rebanhos ovinos esta possivelmente associada à presença de bovinos, os quais são criados conjuntamente, e podem atuar como fontes de infecção para os ovinos (MELO et al., 2010). Assim como na maioria das espécies, a infecção é subclínica. A ocorrência de sinais clínicos possui características específicas em dois grupos de animais: em indivíduos jovens a doença pode se manifestar de forma aguda e grave, apresentando icterícia, hematúria, hemoglobinúria, meningite e morte; e em fêmeas lactantes ou prenhes pode ocorrer agalactia e problemas reprodutivos (ELLIS, 1994; QUINN et al., 2005). O aborto é comum, principalmente nas duas últimas semanas de gestação (LEON-VIZCAINO et al., 1997; MELO et al., 2010). Outros sinais clínicos característicos da leptospirose ovina incluem febre alta, anemia hemolítica, irritabilidade, 15 eriçamento de pelos, diarréia e olhos vermelhos (DAVIDSON e HIRSH, 1980; VERMUNT et al., 1994). Segundo Melo et al. (2010), os sorovares mais associados à ocorrência de sinais clínicos em ovinos são Pomona, Ballum, Grippotyphosa, Icterohaemorrhagiae, Sejroe e Hardjo. 2.4 Aspectos de saúde pública A leptospirose possui grande importância no contexto de saúde pública. A infecção com frequência esta associada às condições precárias de higiene e infra-estrutura. O contato com água contaminada é principal via de transmissão da leptospirose humana (MERIEN et al., 2005), havendo um aumento do número de casos durante períodos de alto índice pluviométrico. A ocorrência de inundações, que obrigam as pessoas a se exporem por um longo período à água contaminada, é um fator importante e está frequentemente associada à ocorrência de surtos (GREENE et al., 2006). A leptospirose também apresenta um caráter ocupacional (QUINN et al., 2005), pois profissionais que possuem frequente contato com animais apresentam maior risco de se infectarem, como por exemplo veterinários, zootecnistas, fazendeiros, funcionários de abatedouros, entre outros. Nestes casos a infecção ocorre geralmente de forma direta, ou seja, pelo contato com a urina e/ou tecidos de animais infectados. Por outro lado, a transmissão indireta é mais comum em profissionais que trabalham em redes de esgotos, mineradores, pescadores, soldados, agricultores, atletas de esportes aquáticos, entre outros. Nestes casos, o contato com água ou solo úmido contaminado é a principal via de transmissão (LEVETT, 2001; SEJVAR et al., 2003; RADL et al., 2011). Atividades de recreação e o ecoturismo, quando praticados na água, representam um importante fator que predispõe a infecção por Leptospira spp.. Diversos surtos já foram relatados envolvendo estas atividades (LAU et al., 2010). Assim como nos animais, o homem pode apresentar quadros clínicos graves quando infectado por Leptospira spp.. Porém, a maioria das infecções são auto-limitantes, e os sinais clínicos brandos (LEVETT, 2001), não havendo 16 necessidade de tratamento. Os sinais clínicos observados na leptospirose humana incluem febre, dores musculares (principalmente em panturrilhas), calafrios, icterícia, dificuldade respiratória, dores abdominais, sufusões em mucosas, dores de cabeça intensas, dores retro-orbitais, e fotofobia. Em casos mais graves podem ocorrer complicações como hemorragias generalizadas, falência renal e meningite asséptica (LEVETT, 2001). Ao contrário do que ocorre nos animais de produção, alterações relacionadas ao sistema reprodutor são raras. Poucos casos de aborto e morte fetal já foram documentados na leptospirose humana (CHUNG et al., 1963; COGHLAN e BAIN, 1969; FAINE et al., 1984) O homem não é considerado uma importante fonte de infecção devido à pouca frequência com que são detectadas leptospiras em sua urina. Uma das hipóteses mais aceitas é que o baixo pH da urina humana limita a sobrevivência das leptospiras após sua excreção renal. Portanto, a transmissão direta entre pessoas, embora tenha sido documentada, é pouco frequente (LEVETT, 2001). 17 Objetivos 18 3. OBJETIVOS 3.1 Determinar a prevalência de anticorpos anti-Leptospira spp., seus títulos e sorovares mais frequentes em amostras de sangue de ovinos destinados ao abate; 3.2 Pesquisar a infecção por Leptospira spp. em amostras de fígado e rim de ovinos soropositivos para leptospirose; 3.3 Comparar o cultivo bacteriano, a técnica de Warthin Starry, a PCR convencional e a PCR quantitativa para a detecção de Leptospira spp. em amostras teciduais de ovinos soropositivos para leptospirose; 3.4 Quantificar a carga bacteriana em amostras de tecidos que apresentarem resultado positivo na PCR quantitativa. 19 Material e métodos 20 4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1 Delineamento experimental Para determinar o número mínimo de animais que seriam necessários para o experimento (n) utilizou-se o programa Epi Info 3.5.1 (CDC, 2002). Considerou-se como referência uma soroprevalência de 18,68% em rebanhos ovinos no estado de São Paulo, segundo Da Silva et al. (2012), uma população de 253500 ovinos abatidos no Brasil, sendo 8300 no estado de São Paulo, nível de significância α = 5%, nível de confiança de 95% e margem de erro de 4%. Dessa forma obteve-se um “n” de 365 animais, ajustando-se o número final para 465 animais. A colheita de material biológico foi feita em um abatedouro localizado no município de São Manuel, SP (22° 43’ 51” S 48° 34’ 15” O), que conta com Serviço de Inspeção Estadual – SISP, e que trabalha respeitando as normas vigentes no Serviço de Inspeção de acordo com a IN3-2000, pelo método de eletronarcose de abate. As análises laboratoriais e estatísticas foram realizadas no Núcleo de Pesquisas em Zoonoses – NUPEZO, do Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ), Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (UNESP), Campus de Botucatu, SP. Uma das técnicas de diagnóstico empregadas no estudo foi realizada pelo Serviço de Patologia do Departamento de Clínica, Cirurgia e Reprodução Animal, da Faculdade de Medicina Veterinária de Araçatuba (FMVA), Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (UNESP), Campus de Araçatuba, SP. As amostras biológicas utilizadas, a sequência dos procedimentos, e as análises realizadas estão sintetizadas no fluxograma da figura 1. 4.2 Animais Foram utilizados 465 animais da espécie ovina (Ovis aries), machos e fêmeas, de diferentes raças, sendo a grande maioria mestiça. As propriedades 21 de origem dos animais eram do estado de São Paulo (73,1%, n=340), Rio Grande do Sul (13,9%, n=65), Goiás (6,4%, n=30) e Mato Grosso do Sul (6,4%, n=30). Não foi possível determinar a procedência exata dos animais, pois em muitos casos a propriedade de origem não era a mesma da qual o animal havia sido encaminhado. Nestes casos, os animais eram adquiridos de vários locais, e permaneciam na propriedade por pouco tempo até serem vendidos, ou até mesmo eram revendidos diretamente, sem permanecerem na propriedade. Outro problema para identificar a procedência dos animais foi a falta de interesse dos proprietários em fornecer informações referentes à sua aquisição. Portanto, a procedência dos animais se limitou ao estado de origem. 4.3 Colheita e preparação das amostras Foram realizadas 16 visitas ao abatedouro, durante o período de Novembro de 2009 a Outubro de 2010. Em cada visita, amostras de sangue e tecidos de aproximadamente 30 animais foram colhidas durante o processo de abate e limpeza das carcaças. Após a sangria, aproximadamente 5 mL de sangue foram coletados diretamente do animal (Figura 2), acondicionados em tubos de ensaio de vidro (10 mL) sem anticoagulante, devidamente identificados, e fechados com tampas de borracha. Em seguida, durante a evisceração, fragmentos de fígado e um dos rins foram coletados (Figura 3 a 5), armazenados em sacos plásticos e identificados. As amostras foram transportadas em caixa térmica para o NUPEZO. O sangue foi centrifugado a 3000 rpm por 10 minutos, o soro acondicionado em microtubos de plástico (INLAB®), e imediatamente submetidos à triagem sorológica. As amostras de fígado e rim permaneceram armazenadas em sacos plásticos refrigeradas a -4°C até o momento do cultivo bacteriano. Foram selecionados aleatoriamente 15 animais soronegativos para serem utilizados como controles negativos das técnicas de diagnóstico realizadas. As demais amostras de rim e fígado de animais soronegativos foram descartadas. 22 4.4 Sorologia As amostras de soro foram testadas para anticorpos anti-Leptospira spp. pela técnica de Soroaglutinação Microscópica (SAM), segundo as normas do Ministério da Saúde (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 1995). A análise sorológica foi utilizada como teste de triagem, e os animais soropositivos foram submetidos às demais técnicas de diagnóstico. Foi utilizada uma bateria de antígenos vivos, mantidas e repicadas semanalmente em meio Ellinghausen-McCullough- Johnson-Harris (EMJH) (DIFCO Laboratories®, Detroit, USA), a 28°C, constituída de 25 sorovares e quatro sorovariantes do sorovar Hardjo: Australis, Bratislava, Autumnalis, Butembo, Castellonis, Bataviae, Canicola, Whitcombi, Cynopteri, Djasiman, Sentot, Gryppotyphosa, Hebdomadis, Copenhageni, Icterohaemorrhagiae, Javanica, Panama, Pomona, Pyrogenes, Wolffi, Shermani, Tarassovi, Andamana, Patoc, Hardjo prajitno, Hardjo miniswajezak, Hardjo C.T.G. e Hardjo bovis. Cada amostra foi inicialmente diluída em solução salina tamponada de fosfatos (SST) pH 7,6 na diluição 1:50, adicionando-se 100 μL do soro a 4,9 mL da solução em tubos de ensaio de 10 mL. As mesmas foram transferidas utilizando-se uma micropipeta para uma microplaca de fundo chato, e dispostas horizontalmente em 29 orifícios contendo 50 μL de amostra cada. Em seguida 50 μL de cada um dos 29 antígenos foram adicionados na posição vertical às amostras de soro, totalizando 100 μL de material em cada orifício. SST pH 7,6 foi utilizado como controle negativo. As placas foram tampadas, levemente agitadas por 20 segundos e incubadas em estufa seca a 28°C durante uma hora. Após a incubação, uma gota de cada orifício foi transferida para uma lâmina lisa de vidro utilizando-se uma alça bacteriológica, e a leitura realizada em microscopia ótica de campo escuro (Carl Zeiss®, Alemanha), com aumento de 100X. Foram consideradas positivas amostras que apresentaram 50% ou mais de leptospiras aglutinadas. Posteriormente foi realizada uma nova análise das amostras positivas, com o objetivo de identificar seu título de anticorpos para o sorovar reagente. Para tanto, 100 μL das amostras previamente diluídas a 1:50 foram transferidas novamente para uma microplaca de fundo chato, e adicionados 50 μL de SST pH 7,6 em outros cinco orifícios dispostos 23 horizontalmente ao lado da amostra. Foi realizada a diluição na razão de dois, transferindo-se 50μL do primeiro orifício para o segundo, homogeneizando-se com micropipeta, e transferindo 50 μL do segundo para o terceiro orifício, procedendo-se assim por diante, obtendo-se as diluições 1:100, 1:200, 1:400, 1:800 e 1:1600. Em seguida foi adicionado somente o sorovar que apresentou reação positiva na diluição 1:100, transferindo-se 50 μL do mesmo para cada um dos seis orifícios contendo as amostras diluídas. O título final foi correspondente à maior diluição que apresentou resultado positivo, conforme descrito anteriormente (100, 200, 400, 800 ou 1600). No caso de amostras que apresentaram reação para mais de um sorovar, foi considerado como reagente somente aquele que apresentou maior título. Amostras positivas para uma ou mais das sorovariantes Hardjo bovis, Hardjo prajitno, Hardjo C.T.G. e Hardjo miniswajezak foram consideradas como reagentes para o sorovar Hardjo. 4.5 Cultivo bacteriano Imediatamente após a triagem sorológica, amostras de rim e fígado de animais com título maior ou igual a 100, independente do sorovar reagente, foram submetidos ao cultivo bacteriano. A técnica foi realizada utilizando o método de diluição seriada, no qual as amostras são preparadas em diferentes diluições com o objetivo de aumentar as chances de isolamento (SULZER e JONES, 1978). O procedimento foi realizado em capela de fluxo laminar (Veco®, VLFS-18). As superfícies dos tecidos foram esterilizadas com álcool iodado 70%, e em seguida mantidos sob luz ultravioleta durante 20 minutos, assim como o restante dos materiais e reagentes utilizados durante o procedimento, que foram todos processados sob condições de esterilidade. Foram realizados cortes na superfície de ambos os tecidos, utilizando-se tesoura e pinças diferentes para cada órgão, e fragmentos do interior de cada tecido, com aproximadamente 1 grama, foram utilizados para o cultivo. Os fragmentos foram individualmente macerados em gral com pistilo, e em seguida adicionou-se 4 mL de solução diluente para leptospiras (500 mL de água, 12,5 mg de neomicina Vansil® e 12,5 mg de nitrofurazona Rioquímica®). Após homogeneização com pistilo, uma fração dessa mistura (1 mL) foi 24 armazenada em microtubos estéreis (Microtubes Axygen, INC. USA) a -80°C para posterior análise pela PCR, enquanto que o restante foi submetida ao cultivo bacteriano. Inoculou-se 0,5 mL da mistura em 4,5 mL de SST pH 7,6 estéril utilizando-se uma pipeta de vidro (2 mL) acoplada a um pipetador automático. Após homogeneização, 0,5 mL foram novamente transferidos para outro tubo contendo 4,5 mL de SST pH 7,6, homogeneizados e repetido o processo para um terceiro tubo. Dessa forma obtiveram-se as diluições 100, 10- 1, 10-2 e 10-3 da mistura inicial de cada órgão. Cada diluição foi individualmente inoculada em tubos de vidro contendo 5 mL do meio semi-sólido Fletcher (DIFCO Laboratories®, Detroit, USA) enriquecido com soro de coelho inativado (55°C por 40 minutos) a 10%, e em seguida incubadas em estufa bacteriológica, a 28°C, durante 60 dias. Foi feita avaliação macroscópica semanal dos tubos para pesquisa de anel de Dinger. Em casos onde o mesmo foi observado, foi realizada uma avaliação em microscopia de campo escuro, analisando uma gota do meio de cultura entre lâmina e lamínula, com aumento de 400X, para confirmar a presença de leptospiras. Independente da presença ou não de anel de Dinger, a mesma análise microscópica foi feita aos 30 e 60 dias de incubação. 4.6 Extração de DNA Para a extração de DNA foi utilizada a mistura previamente armazenada a -80°C. Esta apresentava uma consistência semi-sólida, e foi novamente macerada utilizando um triturador Bio Vortex (biospec). Em seguida 125 μL foram submetidos à extração e purificação de DNA, utilizando-se o kit de extração llustra Tissue & Cells genomic Prep Mini Spin® kit, GE Healthcare, pelo método proporcional (scalable method), conforme instrução do fabricante. Após a extração, os tubos foram mantidos em refrigeração (4°C) por 24 horas para a estabilização do DNA, e analisados em NanoVue (GE-healthcare®). Como controle positivo da extração utilizou-se uma cepa de Leptospira interrogans sorovar Hardjo, mantida em meio EMJH, previamente centrifugada (3000 rpm por 10 minutos) e ressuspendida 2 vezes em SST pH 7,6 estéril. Água Miliq foi utilizada como controle negativo. 25 4.7 PCR (convencional) A PCR (ou PCR convencional) foi realizada em microtubos livres de DNAses e RNAses (AXYGEN, INC. USA). Foram utilizados os primers Lep1 e Lep2, descritos por Merien et al. (1992), que correspondem a sequência de oligonucleotídeos 38-57 (5’GGCGGCGCGTCTTAAACATG3’) e 348-368 (5’TTCCCCCCATTGAGCAAGATT3’), da estrutura primária do gene 16 S rRNA da Leptospira interrogans sorovar Canicola. A amplificação do DNA foi realizada segundo Merien et al. (1992), com algumas modificações. Cada tubo de reação de 0,2 mL recebeu 2,5 μL de tampão de PCR (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,0), 0,75 μL de MgCl2 (1,5 mM), 0,5 μL de Taq platinum polimerase (5U/μL) (Invitrogen), 0,5 μL de solução de dNTP (200μM) (Invitrogen), 0,5 μL de cada oligonucleotídeo (10 ρmol) (IDT), 17,5 μL de água ultra pura (Gibco) e 2 μL de DNA obtido na extração. Os controles positivos e negativos utilizados foram os mesmos descritos na etapa de extração e purificação de DNA. A amplificação foi realizada no termociclador Mastercycler ep (Eppendorf), com ciclo consistindo de uma denaturação inicial a 94°C por 3 minutos, seguido por 30 ciclos de 94°C por 1 minuto, anelamento a 63°C por 1,5 minutos, e uma extensão final a 72°C por 2 minutos para completar a extensão dos amplicons. Amostras positivas resultaram em um produto de 331 pares de bases. 4.8 Eletroforese Para a visualização dos produtos obtidos, os mesmos foram submetidos à eletroforese horizontal. Uma alíquota de 10 μL de cada produto amplificado foram adicionados a 2 μL de BlueJuice™ (Invitrogen). Após homogeneização, esta solução foi submetida à eletroforese em gel de agarose 2,0% corado com Brometo de Etídio 10mg/mL (Gibco) em solução tampão TBE 1x (0,09 M Tris- HCl, 0,09 M de ácido bórico, 2 mM EDTA, pH 8,3), com corrida a 90 volts por aproximadamente 60 minutos (Electrophoresis Power Supply Model EPS 301, GE Healthcare). A visualização das bandas foi feita sob luz ultravioleta (296 nm) em transiluminador, e em seguida fotografadas e registradas utilizando o 26 sistema de fotodocumentação GelDOC®it, UVP, GelDoc-IT™ (Imaging System), e o programa Vision Works® LS Software. A definição de resultados positivos foi baseada na presença de bandas no gel de agarose, tomando-se como referência o controle positivo. 4.9 PCR quantitativa O DNA extraído das amostras foi submetido à PCR quantitativa (qPCR), para a determinação da carga bacteriana utilizando os mesmos primers direcionados para a região alvo descrita no item anterior, utilizando o sistema SYBR®Green, por meio do equipamento StepOne™ Plus Real Time PCR System (Applied Biosystems). Para a realização da curva-padrão foi utilizado o controle positivo da etapa de extração e purificação, em concentrações decrescentes na razão de 5 (100, 2x10-1, 4x10-2, 8x10-3, 1,6x10-3, 3,2x10-4 e 6,4x10-5), partindo-se de uma concentração inicial de 40000 bactérias/μL, previamente calculada em microscopia de campo escuro. Para o ensaio foi utilizado como volume final de reação 25 μL, sendo 12,5 μL de Power SYBR®Green PCR Master Mix (Applied Biosystems), 1 μL de cada primer (5 μM), 2 μL de DNA e 8,5 μL de água MilliQ estéril. As seguintes condições foram utilizadas: 95oC por 10 minutos, seguido de 40 ciclos de 95°C por 15 s, 60°C por 1minuto e uma etapa para a curva de dissociação de 95°C por 15 s, 60°C por 1minuto e 95ºC por 15 s. O sinal de fluorescência foi adquirido nos passos de extensão do ciclo de amplificação. Todas as amostras foram processadas em duplicata. A quantidade de DNA presente nas amostras foi expressa em relação à curva-padrão que foi adicionada em cada ensaio, sendo os valores analisados pelo software do equipamento. A quantificação bacteriana foi correspondente à quantificação do DNA. 4.10 Técnica de Warthin Starry Após a triagem sorológica, fragmentos representativos de fígado e rim foram submetidos à fixação em formalina tamponada a 10% por 48 horas, em seguida lavadas em água corrente por uma hora e armazenadas em álcool 27 etílico (70%) até o momento do processamento histológico. As amostras foram processadas segundo protocolo histotécnico padrão, em séries crescentes de álcool etílico e xileno e após, incluídas em parafina histológica. Os blocos foram cortados em micrótomo automático (Leica®), produzindo secções com espessura de 4 μm. Os cortes foram desparafinizados, reidratados e corados pela técnica de Warthin Starry (WS), segundo Prophet et al. (1992). Inicialmente as lâminas foram imersas em solução acidulada de nitrato de prata a 1% e incubadas em estufa aquecida a 43°C por 30 minutos. Em seguida a revelação da coloração ocorreu utilizando-se solução gelatinosa de nitrato de prata 2% e pirocatecol, até que o tecido atingisse a tonalidade amarronzada. As lâminas foram então lavadas em água corrente por 5 minutos, desidratadas em séries crescentes de álcool etílico e xileno, e montadas com resina sintética (Permount®) e lamínula. A visualização das leptospiras ocorreu sob objetiva 100X, utilizando-se imersão em óleo. Foram consideradas positivas amostras onde se observou estruturas helicoidais coradas em marrom escuro. 4.11 Análise estatística A associação entre os resultados da SAM, PCRc, qPCR, cultivo microbiológico e a técnica de WS foi verificada pelo teste de McNemar. O tratamento estatístico relacionado à performance dos resultados obtidos pela PCR, qPCR, cultivo bacteriano e a técnica de WS foram calculados tendo a detecção de anticorpos como padrão-ouro, utilizando-se a planilha descrita por Mackinnon (2000). O mesmo teste foi realizado separadamente para avaliar a performance da PCR, cultivo bacteriano e técnica de WS utilizando a qPCR como padrão-ouro. As correlações entre os títulos de anticorpos na SAM (independente do sorovar reagente, específico para os sorovares mais frequentes, e específico para as sorovariantes mais frequentes) e as concentrações de DNA de Leptospira spp. determinadas pela qPCR em amostras de rim e fígado, foram analisadas pelo de teste Spearman (r). Para as outras análises estatísticas foram utilizados os programas Epi Info 3.5.1 e BioEstat 5.0, utilizando-se α = 5% (AYRES et al., 2007). 28 FIGURA 1. Fluxograma ilustrando as amostras biológicas utilizadas, a sequência dos procedimentos, e as análises realizadas para a detecção de Leptospira spp. em ovinos. Botucatu, 2011. 29 FIGURA 2. Coleta de sangue após sangria de ovino proveniente de abatedouro localizado em São Manuel, SP. Botucatu, 2011. FIGURA 3. Etapa de evisceração de carcaças de ovinos em abatedouro localizado em São Manuel, SP. Botucatu, 2011. FIGURAS 4 e 5. Coleta de rim e fragmento de fígado durante processo de evisceração de ovino em abatedouro localizado em São Manuel, SP. Botucatu, 2011. 30 Resultados 31 5. RESULTADOS 5.1 Sorologia No exame sorológico (SAM) 21 animais foram positivos, correspondente a uma soroprevalência de 4,5% (IC 95% 3,0-6,8%). Os sorovares reagentes foram Hardjo (n=12), Hebdomadis (n=5), Sentot (n=2), Wolfii (n=1) e Shermani (n=1). Os títulos apresentados foram 100 (n=10), 200 (n=2), 400 (n=6) e 1600 (n=3). Entre os 11 animais que apresentaram títulos maiores que 100, 10 reagiram para o sorovar Hardjo. Estes resultados estão sumarizados na tabela 1. 5.2 Cultivo bacteriano No cultivo bacteriano nenhum animal apresentou resultado positivo, tanto em amostras de fígado como de rins (Tabela 1). Quando a SAM foi considerada a prova-padrão ouro, a análise estatística revelou os seguintes resultados: χ2 = 19,05; P = 0,0000; κ = 0,0000 (0,0000-0,0000); sensibilidade = 0,0%; especificidade = 100,0%; VPP = indeterminado; VPN = 41,7% (Tabela 2). Quando a qPCR foi considerada a prova-padrão ouro, a análise estatística revelou os seguintes resultados: χ2 = 9,09; P = 0,0026; κ = 0,0000 (0,0000- 0,0000); sensibilidade = 0,0%; especificidade = 100,0%; VPP = indeterminado; VPN = 69,4% (Tabela 3). 5.3 Técnica de Warthin Starry Na técnica de WS foram positivas amostras renais de quatro animais. Nenhum animal apresentou resultado positivo em amostras de fígado pela técnica de WS. Estes animais apresentaram sorologia positiva para o sorovar Hardjo com os títulos 400 (n=3) e 1600 (n=1). Nenhum animal com sorologia negativa foi positivo na técnica de WS. Estes quatro animais também apresentaram resultado positivo na PCR e na qPCR em amostra de rim (Tabela 1). 32 Quando a SAM foi considerada a prova-padrão ouro, a análise estatística revelou os seguintes resultados: χ2 = 15,06; P = 0,0001; κ = 0,1639 (0,0055- 0,3223); sensibilidade = 19,1%; especificidade = 100,0%; VPP = 100,0%; VPN = 46,9% (Tabela 2). Quando a qPCR foi considerada a prova-padrão ouro, a análise estatística revelou os seguintes resultados: χ2 = 5,14; P = 0,0233; κ = 0,4425 (0,1347-0,7502); sensibilidade = 36,4%; especificidade = 100,0%; VPP = 100,0%; VPN = 78,1% (Tabela 3). 5.4 PCR Na PCR convencional foram positivas amostras renais de seis animais. Nenhum animal apresentou resultado positivo em amostras de fígado pela PCR. Estes animais apresentaram sorologia positiva para o sorovar Hardjo com os seguintes títulos: 200 (n=1), 400 (n=4) e 1600 (n=1). Nenhum animal com sorologia negativa foi positivo na PCR. Estes seis animais também apresentaram resultado positivo na qPCR em amostras de rim (Tabela 1). Quando a SAM foi considerada a prova-padrão ouro, a análise estatística revelou os seguintes resultados: χ2 = 13,07; P = 0,0003; κ = 0,0025 (0,0978- 0,5830); sensibilidade = 28,6%; especificidade = 100,0%; VPP = 100,0%; VPN = 50,0% (Tabela 2). Quando a qPCR foi considerada a prova-padrão ouro, a análise estatística revelou os seguintes resultados: χ2 = 3,2; P = 0,0736; κ = 0,6250 (0,3422-0,9078); sensibilidade = 54,6%; especificidade = 100,0%; VPP = 100,0%; VPN = 83,3% (Tabela 3). 5.5 qPCR Na qPCR foram positivos 11 animais, 9 soropositivos e 2 soronegativos. Entre os soropositivos, 3 animais apresentaram resultado positivo em amostras de fígado, enquanto que o restante dos animais foi positivo na qPCR em amostras de rim (n=8). Nenhum animal foi positivo para ambas as amostras teciduais. Os animais soropositivos foram reagentes para os sorovares Hardjo (n=8) com títulos 200 (n=2), 400 (n=5) e 1600 (n=1), e para o sorovar 33 Hebdomadis (n=1) com título 100 UI. O único animal reagente para o sorovar Hebdomadis foi positivo na qPCR na amostra de fígado (Tabela 1). Quando a SAM foi considerada a prova-padrão ouro, a análise estatística revelou os seguintes resultados: χ2 = 5,79; P = 0,0162; κ = 0,2696 (0,0096- 0,5295); sensibilidade = 42,9%; especificidade = 85,7%; VPP = 81,8%; VPN = 52,0% (Tabela 2). Os valores da qPCR obtidas de amostras de rim apresentaram correlação positiva com os títulos da SAM em animais reagentes para as sorovariantes, Hardjo Prajitno e Hardjo C.T.G. (Tabela 4). A quantificação bacteriana das amostras positivas na qPCR variou de 1,7 a 8,2 bacterias/μL (bact/ μL) em amostras de fígado, resultando em uma mediana (Md) de 4,32 bact/μL, enquanto que no rim variou de e de 5,2 a 98,3 bact/μL (Md de 36,67 bact/μL). As amostras de rim provenientes dos dois animais soronegativos apresentaram altas concentrações quando comparadas com as amostras de animais soropositivos (39,5 e 98,3 bact/μL) (Tabela 1 e 5). 34 TABELA 1. Resultado da SAM, PCR, qPCR, cultivo bacteriano e técnica de WS de ovinos soropositivos para leptospirose, provenientes de abatedouro do município de São Manuel, SP. Botucatu, 2011. Animal Título / Sorovara PCRb qPCRc (bact/μL)* Cultivo bacteriano Técnica de WSd A-112 100 - Hardjo (C.T.G.) - - - - A-150 1600 - Hardjo (C.T.G.) + R + R (33,7) - + R A-171 400 - Hardjo (pra.) + R + R (61,9) - + R A-173 400 - Hardjo (C.T.G. e pra.) + R + R (13,5) - + R A-174 400 - Hardjo (C.T.G.) + R + R (61,8) - + R A-213 1600 - Hardjo (pra.) - - - - A-215 400 - Hardjo (C.T.G.) + R + R (28,8) - - A-229 200 - Hardjo (C.T.G.) - + F (4,3) - - A-237 100 - Hardjo (pra.) - - - - A-245 400 - Hardjo (C.T.G.) - + F (8,2) - - A-247 200 - Hardjo (C.T.G. e pra.) + R + R (5,2) - - A-256 100 - Hebdomadis - - - - A-259 100 - Shermani - - - - A-323 100 - Hebdomadis - + F (1,7) - - A-344 100 - Hebdomadis - - - - A-346 100 - Wolfii - - - - A-350 100 - Hebdomadis - - - - A-414 400 - Hebdomadis - - - - A-460 100 - Sentot - - - - A-461 100 - Sentot - - - - A-467 1600 - Hardjo (C.T.G. e pra.) - - - - a Soroaglutinação microscópica (SAM) b PCR convencional c qPCR d Técnica de Warthin Starry C.T.G.: Hardjo C.T.G. pra.: Hardjo prajitno R: amostra de rim F: amostra de fígado *bacteria/μL 35 TA B EL A 2. A ss oc ia çã o en tre o s re su lta do s da S AM e d o cu lti vo b ac te ria no , t éc ni ca d e W S, P C R e q PC R p ar a a de te cç ão de L ep to sp ira s pp . e m a m os tra s de r im e fí ga do d e ov in os s or op os iti vo s pa ra le pt os pi ro se , p ro ve ni en te s de a ba te do ur o do m un ic íp io d e Sã o M an ue l, SP . B ot uc at u, 2 01 1. SA M C ul tiv o ba ct er ia no a Té cn ic a de W S b PC R c qP C R d N eg at iv o Po si tiv o To ta l N eg at iv o Po si tiv o To ta l N eg at iv o Po si tiv o To ta l N eg at iv o Po si tiv o To ta l N ão re ag en te 15 0 1 5 15 0 1 5 15 0 1 5 1 3 2 1 5 R ea ge nt e 21 0 2 1 17 4 2 1 15 6 2 1 1 2 9 2 1 To ta l 36 0 3 6 32 4 3 6 30 6 3 6 2 5 11 3 6 Te st e de M cN em ar a χ 2 = 1 9, 05 ; v al or d e P = 0, 00 00 ; κ = 0 ,0 00 0 (0 ,0 00 0- 0, 00 00 ); S = 0, 0% ; E = 1 00 ,0 % ; V PP = in de te rm in ad o; V PN = 41 ,7 % b χ 2 = 1 5, 06 ; v al or d e P = 0, 00 01 ; κ = 0 ,1 63 9 (0 ,0 05 5- 0, 32 23 ); S = 19 ,1 % ; E = 1 00 ,0 % ; V PP = 1 00 ,0 % ; V PN = 4 6, 9% c χ 2 = 1 3, 07 ; v al or d e P = 0, 00 03 ; κ = 0 ,2 50 0 (0 ,0 97 8- 0, 58 30 ); S = 28 ,6 % ; E = 1 00 ,0 % ; V PP = 1 00 ,0 % ; V PN = 5 0, 0% d χ 2 = 5 ,7 9; v al or d e P = 0, 01 62 ; κ = 0 ,2 69 6 (0 ,0 09 6- 0, 52 95 ); S = 42 ,9 % ; E = 8 5, 7% ; V PP = 8 1, 8% ; V PN = 5 2, 0% S: s en si bi lid ad e E: e sp ec ifi ci da de VP P: v al or p re di tiv o po si tiv o VP N : v al or p re di tiv o ne ga tiv o 36 TA B EL A 3. A ss oc ia çã o en tre a q PC R e c ul tiv o ba ct er ia no , t éc ni ca d e W S e PC R p ar a a de te cç ão d e Le pt os pi ra s pp . e m am os tra s de r im e f íg ad o de o vi no s so ro po si tiv os p ar a le pt os pi ro se , pr ov en ie nt es d e ab at ed ou ro d o m un ic íp io d e Sã o M an ue l, SP . B ot uc at u, 2 01 1. qP C R C ul tiv o ba ct er ia no a Té cn ic a de W Sb PC R c N eg at iv o Po si tiv o To ta l N eg at iv o Po si tiv o To ta l N eg at iv o Po si tiv o To ta l N eg at iv o 25 0 2 5 2 5 0 25 25 0 25 Po si tiv o 11 0 1 1 7 4 11 5 6 11 To ta l 36 0 3 6 3 2 4 36 30 6 36 Te st e de M cN em ar a χ 2 = 9 ,0 9; v al or d e P = 0, 00 26 ; κ = 0 ,0 00 0 (0 ,0 00 0- 0, 00 00 ); S = 0, 0% ; E = 10 0, 0% ; VP P = in de te rm in ad o; V PN = 69 ,4 % b χ 2 = 5 ,1 4; v al or d e P = 0, 02 33 ; κ = 0 ,4 42 5 (0 ,1 34 7- 0, 75 02 ); S = 36 ,4 % ; E = 1 00 ,0 % ; V PP = 1 00 ,0 % ; V PN = 7 8, 1% c χ 2 = 3 ,2 0; v al or d e P = 0, 07 36 ; κ = 0 ,6 25 0 (0 ,3 42 2- 0, 90 78 ); S = 54 ,6 % ; E = 1 00 ,0 % ; V PP = 1 00 ,0 % ; V PN = 8 3, 3% S: s en si bi lid ad e E: e sp ec ifi ci da de VP P: v al or p re di tiv o po si tiv o VP N : v al or p re di tiv o ne ga tiv o 37 TABELA 4. Correlação entre os títulos da SAM, independente do sorovar, específico para o sorovar, e específico para a sorovariante mais frequente, e os resultados da PCR quantitativa para a detecção de DNA de Leptospira spp. em amostras de rim e fígado de ovinos provenientes de abatedouro do município de São Manuel, SP. Botucatu, 2011. Par de variáveis Coeficiente r Valor de P (α=5%) Interpretação SAM x qPCR – rim 0,3162 0,0602 Correlação moderada SAM x qPCR – fígado 0,2296 0,1779 Correlação fraca SAM (Hardjo) x qPCR – fígado 0,1809 0,2910 Correlação fraca SAM (Hardjo) x qPCR – rim 0,4367 0,0077 Correlação moderada SAM (CTG) x qPCR – rim 0,5228 0,0104 Correlação moderada SAM (CTG) x qPCR – fígado 0,3214 0,1347 Correlação moderada SAM (PRA) x qPCR – rim 0,3042 0,1799 Correlação moderada SAM (PRA) x qPCR – fígado - - - SAM: soroaglutinação microscópica qPCR: PCR quantitativo SAM (CTG): amostras reagentes para a sorovariante Hardjo C.T.G, excluindo- se as demais amostras reagentes SAM (PRA): amostras reagentes para a sorovariante Hardjo prajitno, excluindo- se as demais amostras reagentes qPCR - rim: resultados das amostras de rim pela qPCR qPCR - fígado: resultados das amostras de fígado pela qPCR 38 TABELA 5. Mediana (Md), percentil 25% (P25) e 75% (P75) da carga bacteriana (bactérias/μL) aferida pela qPCR em amostras de rim e fígado de ovinos soropositivos para leptospirose provenientes de abatedouro do município de São Manuel, SP. Botucatu, 2011. Orgão Mediana Percentil 25% Percentil 75% Rim 36,67 25,04 61,89 Fígado 4,32 3,05 6,29 FIGURA 6. Eletroforese horizontal de amostras renais e hepáticas de ovinos submetidas à PCR, ilustrando as bandas de amostras positivas (setas verdes), controles positivos (setas azuis), controles negativos (setas vermelhas) e os marcadores moleculares (ladder) (setas brancas). Botucatu, 2011. 39 FIGURA 7. Gráfico ilustrando a intensidade de fluorescência emitida por duas amostras renais de ovinos positivas (setas verdes) pela PCR quantitativa, de acordo com o ciclo de amplificação. As demais amostras são referentes à curva-padrão. Botucatu, 2011. 40 FIGURA 8. Imagem de microscopia óptica comum (100x) de tecido renal de ovino soropositivo pra leptospirose, corado pela técnica de Warthin Starry, ilustrando estrutura compatível com leptospira (seta azul). Botucatu, 2011. 41 Discussão 42 6. DISCUSSÃO A prevalência de anticorpos anti-Leptospira spp. nos animais estudados pode ser considerada baixa. No Brasil a infecção em ovinos foi descrita pela primeira vez por Santa Rosa e Pestana de Castro (1963), no estado de São Paulo. Os autores verificaram uma soroprevalência de 34%, onde os sorovares prevalentes foram Canicola e Icterohaemorrhagiae. Desde então, diversos inquéritos sorológicos têm demonstrado a ampla distribuição de leptospiras em rebanhos ovinos em várias regiões do Brasil. Um estudo realizado em 846 ovinos no estado de São Paulo revelou uma soroprevalência de 8,6% (BARBUDO FILHO et al., 1999). No entanto, estudos realizados no Brasil indicam resultado de prevalência superiores às encontradas no presente estudo e por Barbudo et al. (1999). Outro estudo realizado no estado de São Paulo avaliou a presença de anticorpos anti-Leptospira spp. em amostras de sangue de 356 ovinos, obtendo-se prevalência de 44,65% pela SAM (LANGONI et al., 1995). No Piauí, Carvalho et al. (2011) estudaram amostras de sangue de 119 ovinos provenientes de um abatedouro, e obtiveram soroprevalência de 28,6%. No estado do Rio de Janeiro, Martins et al. (2011) estudaram diferentes rebanhos de ovinos, totalizando 308 animais, os quais apresentaram soroprevalência de 47,4%. Nas regiões Sudeste e Sudoeste do Estado do Rio Grande do Sul, Herrmann et al. (2004) observaram uma soroprevalência de 34,26% em 1360 ovinos provenientes de 136 fazendas. Porém, prevalências baixas também são descritas, inclusive em outros países. No Chile Zamora et al. (1999) detectaram 5,7% de ovinos soropositivos entre os 629 estudados, provenientes de 11 propriedades. Na Itália Ciceroni et al. (2000) estudaram amostras de sangue de 313 ovinos, e obtiveram 6,1% de positividade, utilizando uma grande quantidade (28) de sorovares na SAM, assim como o presente estudo. No Distrito Federal, Brasil, Seixas et al. (2011) obtiveram soroprevalência de 3,0% em 157 ovinos estudados. Em Trinidad e Tobago, um estudo com 222 ovinos detectou 5,0% de animais soropositivos (SUEPAUL et al., 2011). Portanto, rebanhos ovinos podem apresentar taxas de infecção extremamente diferentes, dependendo da região e das condições em que cada estudo foi realizado. 43 A comparação de prevalências de diferentes estudos envolvendo inquéritos sorológicos não é conveniente, pois diversos fatores estão relacionados com a ocorrência da enfermidade em cada local, com as técnicas utilizadas e, principalmente, porque a soroprevalência depende da quantidade de sorovares utilizados na SAM. No presente estudo não foi possível determinar os fatores envolvidos na baixa soroprevalência apresentada. Embora a maioria dos animais tenha apresentado reação positiva para o sorovar Hardjo, não se pode afirmar que este foi o sorovar infectante, pois reações cruzadas podem ocorrer, especialmente com sorovares pertencentes ao mesmo sorogrupo (GROOMS e BOLIN, 2005). Portanto, pode-se dizer que a maioria dos animais estudados, em algum momento, se infectou com leptospiras pertencentes ao sorogrupo Sejroe, no qual o sorovar Hardjo está incluso. Diversos estudos têm apontado este sorogrupo como o mais prevalente em rebanhos ovinos (MOTIE e MYERS, 1986; HERRMANN et al., 2004; LILENBAUM et al., 2009; SEIXAS et al., 2011), bem como sua relação com problemas reprodutivos (CLARK, 1994; MARTINS et al., 2011). Cousins et al. (1989) observaram que ovinos sem contato prévio com bovinos eram capazes de manter a infecção pelo sorovar Hardjo por mais de 11 meses, demonstrando a importância da espécie ovina como reservatório para este sorovar. Segundo Lilenbaum et al. (2009), o sorogrupo Sejroe é responsável por um grande número de infecções em rebanhos de ovinos, causando desordens reprodutivas e infecção renal crônica. No presente estudo, os animais reagentes para o sorogrupo Sejroe, bem como seu rebanho de origem, apresentavam risco de desenvolver leptospirose. Os sorogrupos Pomona, Icterohamorrhagiae e Autumnalis também são descritos com frequência na espécie ovina (ZAMORA et al., 1999; FAVERO et al., 2002; GIRIO et al., 2004; SUEPAUL et al., 2011), mas não foram detectados no presente estudo. O segundo sorogrupo mais frequente nos animais estudados foi o Hebdomadis (n=5). Este sorogrupo raramente é descrito em ovinos no Brasil, e pouco se sabe sobre seu impacto nesta espécie. Hathaway et al. (1982) estudaram amostras de sangue de 3722 ovinos provenientes da Inglaterra e do País de Gales, e observaram que 2,0% dos animais apresentavam reação positiva para o sorovar Hebdomadis. Ellis et al. (1983) associaram a infecção por este sorogrupo à nascimentos 44 prematuros, abortos e morte em ovinos. No presente estudo os cinco animais reagentes eram provenientes de três propriedades diferentes, indicando que não se trata de um determinado rebanho que apresentou esta particularidade, mas sim que existe uma pequena proporção de animais em diferentes regiões que tiveram contato com este sorogrupo. Embora a SAM ainda seja considerada o método de diagnóstico de eleição para leptospirose (WHO, 2003), assim como qualquer método sorológico, ela não é capaz de detectar a presença de leptospiras. Animais com sorologia positiva possuem anticorpos, indicando que em algum momento de sua vida tiveram contato com o agente etiológico da enfermidade. Portanto, deve-se analisar e interpretar com cuidado a análise estatística quando a SAM for considerada como prova padrão ouro, e não subestimar os valores de sensibilidade e VPP, uma vez que as demais técnicas de diagnóstico analisadas consistem em métodos diretos, que dependem da presença do DNA bacteriano. Estes valores devem ser analisados conjuntamente, e não como valores absolutos de cada técnica, uma vez que o objetivo do trabalho foi comparar diferentes métodos diagnósticos. Por outro lado, quando a qPCR foi considerada a prova padrão ouro, os valores de sensibilidade, VPP e VPN foram mais elevados, pois esta se comparando uma técnica direta (qPCR) com outras que também são diretas (cultivo bacteriano, PCR e técnica de WS). O motivo pelo qual a qPCR também foi utilizada como prova padrão ouro na análise estatística é pela sua alta sensibilidade, não somente para o diagnóstico de leptospirose no homem (MERIEN et al., 2005), mas de diversas enfermidades de caráter infeccioso e parasitário (BELANGERO, 2010). O cultivo bacteriano não apresentou resultado positivo para os animais estudados. Diversos estudos demonstram resultados similares, onde a taxa de isolamento é muito baixa ou nula. Azevedo et al. (2004) estudaram 80 ovinos provenientes de um abatedouro localizado na região Nordeste do Brasil, e obtiveram quatro animais positivos no cultivo bacteriano de amostras de rins. Na Espanha Leon-Vizcaino et al. (1987) isolaram leptospiras em seis surtos de abortos entre os 25 estudados, utilizando tecidos e fluidos de fetos ovinos e caprinos. No estado do Rio de Janeiro, Lilenbaum et al. (2009) realizaram cultivo bacteriano em amostras de urina de 40 ovinos soropositivos, 45 redundando todos negativos. Estudos em outras espécies animais demonstram resultados semelhantes. Fearnley et al. (2008) pesquisaram amostras de rim de 204 suínos com histórico de problemas reprodutivos, sendo 180 soropositivos pela SAM e 25 pela qPCR, e não obtiveram resultado positivo pelo cultivo bacteriano. Harkin et al. (2003) estudaram amostras de urina de 500 cães, e obtiveram resultados positivos em 41 casos pela PCR e nenhum pelo cultivo bacteriano. Estes estudos demonstram a baixa taxa de isolamento de leptospiras pelo cultivo bacteriano, bem como sua inferioridade em relação a PCR. O cultivo de leptospiras é considerado uma técnica de baixa sensibilidade, laboriosa e demorada (BOQVIST et al., 2003; GROOMS e BOLIN, 2005; FEARNLEY et al., 2008; LILENBAUM et al., 2009). Quando isoladas in vivo, leptospiras apresentam uma baixa taxa de crescimento (HEALTH et al., 1965), e até mesmo baixos níveis de contaminação por outras bactérias podem comprometer sua multiplicação. Adler et al. (1986) constaram que o maior problema no cultivo de leptospiras é a contaminação por outros micro- organismos, especialmente quando se utilizam tecidos que não foram coletados de forma asséptica. Outros fatores, ainda não esclarecidos, estão envolvidos na dificuldade em se obter cultivos positivos. Amostras de urina positivas em campo escuro, demonstrando a presença de espiroquetídeos no material, podem apresentar resultado negativo no cultivo bacteriano (LILENBAUM et a., 2008; LILENBAUM et al., 2009). Portanto, esta técnica não é recomendada para diagnóstico rápido ou estudos epidemiológicos (BOQVIST et al., 2003; AHMED et al., 2009). Os resultados confirmam a baixa sensibilidade do cultivo bacteriano para a detecção de leptospiras, corroborando com dados presentes na literatura. Com frequência se utiliza o antimicrobiano 5-fluorouracil para o cultivo de leptospiras, com o objetivo de reduzir os riscos de contaminação. No presente estudo esta droga não foi utilizada porque, segundo Ris (1974), no meio Fletcher o 5-fluorouracil perde seu efeito inibidor. Segundo o autor, seu uso é recomendado quando se utilizam outros meio de cultura. São escassos os estudos relacionados à eficiência de antimicrobianos no cultivo de leptospiras, e não se pode afirmar que o uso do 5-fluorouracil poderia resultar em cultivos positivos no presente estudo. Outro fator a ser considerado é a presença de 46 leptospiras mortas no tecido, pois neste caso o cultivo resultaria negativo, e as análises de PCR positivas. Porém, a técnica de WS revelou a presença de espiroquetas íntegras no tecido renal de quatro animais, indicando que, pelo menos nestes casos, é pouco provável que as leptospiras estivessem mortas. Os resultados obtidos indicam que o cultivo bacteriano apresenta boa especificidade e VPN moderado, mas baixa sensibilidade para a detecção de Leptospira spp. em amostras teciduais de ovinos. Esta técnica deve ser recomendada para estudos focados no isolamento in vitro de leptospiras vivas e, segundo Wuthiekanun et al. (2007), possui papel importante em estudos epidemiológicos, pois permite estudar a patogênese da leptospira isolada. O cultivo bacteriano não é recomendado para o diagnóstico rápido de leptospirose na prática veterinária, pois além da sua baixa sensibilidade, é longo o tempo necessário para obter seu resultado. A técnica de WS apresentou resultados superiores ao cultivo bacteriano, mas inferiores aos demais métodos. Quatro animais foram positivos em amostras de rim, demonstrando que esta técnica é capaz de detectar leptospiras em amostras teciduais de ovinos. Poucos estudos foram realizados utilizando esta técnica para a pesquisa de Leptospira spp., especialmente em ovinos, e seu uso é mais frequente para a detecção de Helicobacer pylori (KIM et al., 2009), uma espiroqueta semelhante à Leptospira spp.. Um importante estudo foi realizado recentemente por Carvalho et al. (2011) no Piauí. Os autores estudaram 119 ovinos provenientes de um abatedouro, e obtiveram 8 animais positivos pela técnica de WS em amostras de rins. A proporção de animais positivos pela técnica de WS e positivos na sorologia (8/43, 18,9%) foi semelhante aos descritos no presente trabalho (4/21, 19,0%). Em equinos a técnica de WS já foi utilizada em diversos tipos de tecidos, como rim, placenta, fígado e cordão umbilical, obtendo-se resultados positivos (HODGIN et al., 1989; POONACHA et al., 1993; WADA et al., 2003; SEBASTIAN et al., 2005; LÉON et al., 2006). A pesquisa em amostras de rins de cães também já foi realizada com sucesso em estudos descrevendo lesões renais por Leptospira spp. (SCANZIANI et al., 1995; ORTEGA-PACHECO et al., 2008). No homem, a detecção de leptospiras pela técnica de WS já foi 47 realizada em amostras do epitélio intestinal de um paciente com diagnóstico de colite crônica (DE BRITO et al., 1996). Chappel et al. (1992) compararam diferentes técnicas de diagnóstico para leptospirose em amostras de rim de 368 suínos, e encontraram resultados positivos em 9 animais pela técnica de WS e 27 positivos pelo cultivo. Neste estudo os autores descreveram a baixa sensibilidade da técnica de WS (20%) em relação aos demais métodos utilizados. Hunter et al. (1987) obtiveram resultados similares aos de Chappel et al. (1992) em um estudo com suínos na África do Sul. Em 20 amostras de rim positivas pelo cultivo bacteriano, nenhuma foi positiva pela técnica de WS. Estes resultados indicam que novos estudos devem ser realizados para se determinar a eficiência da técnica de WS em relação ao cultivo bacteriano, considerando-se os resultados conflitantes de acordo com a literatura consultada. A técnica de WS apresenta como principal vantagem a visualização direta do agente, permitindo determinar sua distribuição e localização no tecido estudado (GROOMS e BOLIN, 2005). Por outro lado, sua realização é laboriosa, os procedimentos e a leitura das lâminas devem ser feitos por pessoas treinadas e experientes, e são necessários tecidos do animal, o que dificulta sua aplicação no diagnóstico ante morten, bem como sua utilização em larga escala. Quando a SAM foi considerada como prova-padrão ouro, a sensibilidade da técnica de WS foi baixa (19,1%). Mas quando comparada com a qPCR, sua sensibilidade foi mais elevada (36,4%). Os resultados indicam que a técnica de WS apresenta alta especificidade (100,0%), alto VPP (100,0%), e VPN de moderado (46,9%) a alto (78,1%), dependendo da análise, podendo ser utilizada para a detecção de leptospiras em amostras de rim de ovinos. Devido às desvantagens já mencionadas, seu uso é recomendado para o diagnóstico post morten, especialmente quando se deseja visualizar a bactéria no tecido estudado. No presente estudo a PCR apresentou resultados superiores ao cultivo bacteriano e a técnica de WS, mas sensibilidade inferior à qPCR. A PCR vem sendo utilizada para o diagnóstico de enfermidades infecciosas há alguns anos, apresentando muitas vantagens em relação a outros métodos tradicionais. Sua eficiência em detectar DNA de Leptospira spp. em urina de animais infectados 48 é comprovada desde 1989 (VAN EYES et al., 1989). Segundo Hernández- Rodríguez et al. (2011), o diagnóstico de leptospirose pela PCR é rápido, preciso e confiável. Vários protocolos já foram testados em diferentes espécies de animais (WOODWARD, 2001), como bovinos, cães, suínos, roedores e morcegos (COX et al., 2005; FEARNLEY et al., 2008; ROJAS et al., 2010; FELT et al., 2011; MAYER-SCHOOL et al., 2011). Apesar das diferentes técnicas utilizadas, e das diferentes espécies animais estudadas, a PCR tem demonstrado alta sensibilidade na detecção de DNA de Leptospira spp. em diversos tipos de amostras biológicas, como sangue, plasma, soro, urina, rim, humor aquoso, derrames cavitários e sêmen (MERIEN et al., 1993; MERIEN et al., 1995; HEINEMANN et al., 2000; LEVETT et al., 2005; FEARNLEY et al., 2008; LILENBAUM et al., 2009; BOURHY et al., 2011; PINNA et al., 2011). Alguns estudos compararam a PCR com outras técnicas tradicionais para o diagnóstico de leptospirose, como o campo escuro e o cultivo bacteriano, e, na grande maioria dos casos, a PCR apresenta resultados superiores. (WAGENAAR et al., 2000; HARKIN et al., 2003; LILENBAUM et al., 2008; LILEMBAUM et al., 2009; HERNÁNDEZ-RODRÍGUEZ et al., 2011). O uso da PCR para pesquisa de DNA de leptospiras em amostras teciduais de ovinos é muito rara. Alguns autores, em estudos semelhantes, descreveram a importância desta espécie como reservatórios de Leptospira spp.. Um importante trabalho foi realizado por Lilenbaum et al. (2009) no estado do Rio de Janeiro. Utilizando a técnica de PCR, cultivo bacteriano e campo escuro em amostras de urina, os autores identificaram a infecção por Leptospira spp. em 6 ovinos entre os 40 soropositivos amostrados, obtendo maior positividade pela técnica de PCR. Os mesmos autores encontraram resultados similares ao utilizar sêmen e secreções vaginais ao invés de urina, confirmando a maior sensibilidade da PCR em relação ao cultivo e ao campo escuro (LILENBAUM et al., 2008). Na região Sul do Brasil, Silva et al. (2007) estudaram 44 ovinos provenientes de um abatedouro, e analisaram amostras de rins de 10 animais, obtendo resultado positivo em uma amostra pela PCR e pela cultura bacteriana. Felt et al. (2011) estudaram amostras de rim de 25 ovelhas no Egito pela PCR e cultivo bacteriano, mas não encontraram resultado positivo. 49 O custo relativamente elevado e a necessidade de técnicos experientes é um obstáculo para a implementação da PCR na maioria dos laboratórios de diagnóstico. Nos últimos anos seu uso tem se tornado mais frequente, e sua popularização demonstra que no futuro seu custo será mais acessível, assim como mais profissionais estarão especializados nesta técnica. Outro problema apresentado pelas técnicas de PCR é que não identificam microorganismos vivos, podendo apresentar resultado positivo em amostras contendo somente o DNA do agente etiológico estudado. Assim como na técnica de WS, a PCR apresentou melhor sensibilidade quando a qPCR foi utilizada como padrão ouro (54,6%), alta especificidade (100,0%), VPP alto (100,0%) e VPN de moderado a alto (50,0 e 83,3%), demonstrando a eficiência desta técnica na detecção de Leptospira spp. em amostras de rim de ovinos. Seu uso é recomendado para estudos epidemiológicos direcionados para a identificação de animais infectados, bem como para o diagnóstico de leptospirose em ovinos. A qPCR apresentou a maior sensibilidade em relação aos demais métodos utilizados. Seu uso é mais recente no diagnóstico de leptospirose do que a PCR convencional. É considerada uma técnica de alta sensibilidade e especificidade, que possibilita também a quantificação do DNA na amostra estudada (KALTENBOECK e WANG, 2005). Diversos estudos têm comprovado sua alta eficiência na detecção de leptospiras (LEVETT et al., 2005; AHMED et al., 2009; STODDARD et al., 2009; BEDIR et al., 2010). A qPCR é mais utilizada para o diagnóstico de leptospirose em humanos (MERIEN et al., 2005; SEGURA et al., 2005; BOURHY et al., 2011; THAIPADUNPANIT et al., 2011), sendo os estudos em animais escassos. Não há descrições sobre o uso da qPCR para a detecção de leptospiras em ovinos. Trabalhos conduzidos em diversas espécies domésticas têm comprovado sua alta sensibilidade em relação a outras técnicas. Um estudo realizado em 204 suínos utilizou o cultivo bacteriano e a qPCR para a pesquisa de leptospiras em amostras de rim, obtendo-se resultado positivo em 25 animais pela qPCR e nenhum pelo cultivo bacteriano (FEARNLEY et al., 2008). Rojas et al. (2010) pesquisaram leptospiras na urina de 525 cães em Dublin, Irlanda, e obtiveram resultados positivos em 37 (7,05%) animais pela qPCR. A pesquisa de leptospiras pela qPCR também têm sido realizada em diferentes 50 espécies de animais selvagens, como roedores e morcegos (COX et al., 2005; RAHELINIRINA et al., 2010). No presente estudo três animais soropositivos, cujas amostras de fígado apresentaram baixa carga bacteriana (1,7, 8,2 e 4,3 bact/μL), foram positivos somente na qPCR. Além disso, amostras de rim de dois animais soronegativos apresentaram resultado positivo por esta técnica, o que pode ser justificado pela fase aguda da infecção nas quais os animais se encontravam. Durante esta fase é comum o resultado sorológico negativo, pois o organismo ainda não produziu anticorpos (MERIEN et al., 1995; LEVETT, 2001; MERIEN et al., 2005). Além disso, a fase aguda