RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta tese será disponibilizado somente a partir de 01/11/2020. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Júlio de Mesquita Filho” - UNESP CENTRO DE AQUICULTURA DA UNESP (CAUNESP) São Paulo State University - Aquaculture Center TESE DE DOUTORADO TÉCNICAS DE MANIPULAÇÃO CROMOSSÔMICA NO LAMBARI (Astyanax altiparanae) Nivaldo Ferreira do Nascimento Biólogo Jaboticabal São Paulo, Brasil 2018 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Júlio de Mesquita Filho” - UNESP CENTRO DE AQUICULTURA DA UNESP (CAUNESP) São Paulo State University - Aquaculture Center TESE DE DOUTORADO TÉCNICAS DE MANIPULAÇÃO CROMOSSÔMICA NO LAMBARI (Astyanax altiparanae) Nivaldo Ferreira do Nascimento Orientadora: Profa. Dra. Laura Satiko Okada Nakaghi Coorientador: Dr. George Shigueki Yasui Jaboticabal São Paulo, Brasil 2018 Tese de Doutorado apresentada ao programa de Pós-graduação em Aquicultura, do Centro de Aquicultura da UNESP, campus de Jaboticabal, como parte das exigências para obtenção do título de Doutor em Biologia de Organismos Aquáticos e Aquicultura. Nascimento, Nivaldo Ferreira do N244t Técnicas de manipulação cromossômica no lambari Astyanax altiparanae / Nivaldo Ferreira do Nascimento. – – Jaboticabal, 2018 viii, 86 p. : il. ; 29 cm Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Centro de Aquicultura, 2018 Orientadora: Laura Satiko Okada Nakaghi Coorientador: George Shigueki Yasui Banca examinadora: José Augusto Senhorini, Paulo Sérgio Monzani, Renata Guimarães Moreira Whitton, Renato Massaki Honji Bibliografia 1. Aquicultura. 2. Biotecnologia. 3. Poliploidia. 4. Tetraploidia. 5. Ginogênese. I. Título. II. Jaboticabal-Centro de Aquicultura. CDU 639.3:636.082 Ficha Catalográfica elaborada pela STATI - Biblioteca da UNESP Campus de Jaboticabal/SP - Karina Gimenes Fernandes - CRB 8/7418 “Ninguém pode ser sábio de estômago vazio” George Eliot “Aquele que ousa perder uma hora de seu tempo não sabe o valor da vida." Charles Darwin “Olho por olho, e o mundo acabará cego” Mahatma Gandhi “Se eu vi mais longe, foi por estar sobre ombros de gigantes. ” Issac Newton “A paz é a única forma de nos sentirmos realmente humanos. ” Albert Einsten “Façamos da interrupção um caminho novo. Da queda um passo de dança, do medo uma escada, do sonho uma ponte, da procura um encontro! ” Fernando Sabino “Quem estará nas trincheiras ao teu lado? ‐ E isso importa? ‐ Mais do que a própria guerra.” Ernest Hemingway Tese de Doutorado Nivaldo Ferreira do Nascimento Agradecimentos Agradeço a minha família, em especial meus pais, pelo esforço e dedicação dispensados para minha formação, e aos meus irmãos por sempre me apoiarem e acreditarem no meu sonho!! Muito obrigado!! Ao meu grande amor, Cleonice Cristina Hilbig, por todos os momentos que passamos juntos, companheirismo, amizade e por juntos, consumirmos o nosso amor através do recente nascimento de nossa filha Helena. Amo muito vocês! A minha orientadora, “segunda mãe” e amiga, Profa. Dra. Laura Satiko Okada Nakaghi pela oportunidade, amizade, ensinamentos compreensão e confiança a mim dispensadas desde a graduação. Serei sempre grato. Ao meu coorientador e amigo Dr. George Shigueki Yasui, pela amizade e principalmente, humildade ao transmitir seus ensinamentos, sendo minha inspiração na carreira científica. Ao Dr. Paulo Sérgio Monzani pela amizade e valiosa ajuda nas análises de biologia molecular. Ao amigo Dr. José Augusto Senhorini, grande mestre da reprodução de peixes e a quem devo grande parte dos meus conhecimentos nesta área. Ao Prof. Dr. Takafumi Fujimoto da Universidade de Hokkaido/Japão pela parceria e valiosas contribuições no desenvolvimento e correção dos capítulos desta Tese. Tese de Doutorado Nivaldo Ferreira do Nascimento Ao Dr. Diogo Teruo Hashimoto pela participação na minha banca de qualificação e valiosas sugestões A Dra. Francine Faustino pela participação na minha banca de qualificação e valiosas sugestões. Aos membros da minha banca de Doutorado: Profa. Dra. Renata Guimarães Moreira Whitton, Dr. Renato Massaki Honji, Dr. Paulo Sérgio Monzani e Dr. José Augusto Senhorini. Muito obrigado pelas valiosas sugestões! Aos companheiros atuais e os que já passaram pelo Laboratório de Biotecnologia de peixes do CEPTA: Talita Maria Lázaro, Matheus Pereira dos Santos, Lúcia Soarez Lopez, Lucas Henrique Piva, Mariana Machado Evangelista, Natália Alcantara Rocha, Nycolas Levy Pereira, Dilberto Ribeiro Arashiro, Rafaela Bertolini, Geovanna Coelho, Gustavo Shiguemoto, Natália Greice Matheus, DiógenesSiqueira-Silva, Bruna Machado, Lauriene Munhoz, Paulo Sérgio Monzani, Daiane Niedizieslki, Gabriel Marra, Bárbara Cristina do Nascimento, Milena Chaguri, Hatos Siqueira, Paulo Andrade André dos Santos, Matheus Tonetti, Letícia Dragone, Leonardo Luiz Calado e Regiane Cristina da Silva. Aos companheiros do Laboratório de Histologia e Embriologia do Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal: Fernanda Nogueira Valentin, Francine Faustino, Lilian Cristina Makino, Sr. Orandi Matheus, Edmar, Maria do Carmo Faria Paes, Breno Manzini, Nariane Fernandes, Marcelo Henrique Correa Assunção, Erico Luis Hoshiba Takahashi, Matheus Pereira dos Santos, Sheryll Corchuelo Chavarro. Tese de Doutorado Nivaldo Ferreira do Nascimento Ao Centro de Aquicultura da UNESP (CAUNESP) pela oportunidade de ingresso na pós- graduação. Aos amigos atuais e antigos de república, Matheus Rovere de Morais (Hector Bonilha), Samuel Carvalho e Mandela. A Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo apoio financeiro através da bolsa de doutorado (PROC. 2016/12383-0). Ao Centro Nacional de Pesquisa e Conservação de Peixes Continentais, Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade (CEPTA/ICMBio), Pirassununga-SP, especialmente na pessoa do Dr. José Augusto Senhorini e funcionários, por ter fornecido o material biológico, infraestrutura e até mesmo moradia para a realização deste trabalho. A Universidade de São Paulo (USP), câmpus de Pirassununga e Ribeirão Preto pela disponibilização de equipamentos que foram de extrema importância para a conclusão deste trabalho. As pessoas que de alguma forma me ajudaram na realização deste trabalho, que por ventura não foram citadas. Tese de Doutorado Nivaldo Ferreira do Nascimento Sumário Lista de Figuras ............................................................................................................................. 10 Lista de Tabelas ............................................................................................................................ 11 Apoio Financeiro .......................................................................................................................... 12 Resumo geral ................................................................................................................................ 13 General Abstract ........................................................................................................................... 14 1. Introdução geral ................................................................................................................. 15 2. Poliploidia e produção de peixes triploides ....................................................................... 16 3. Produção de peixes tetraploides ......................................................................................... 17 4. Produção de peixes ginogenéticos ..................................................................................... 18 5. Espécie de estudo ............................................................................................................... 20 6. Objetivos ............................................................................................................................ 21 7. Estruturação da tese ........................................................................................................... 22 8. Referências ......................................................................................................................... 23 Capítulo I: High percentages of tetraploids in the yellowtail Tetra Astyanax altiparanae induced by heat-shock: the first case of tetraploids in Neotropical characins ............................................ 31 Abstract ......................................................................................................................................... 31 1. Introduction ........................................................................................................................ 32 2. Material and Methods ........................................................................................................ 34 3. Results ................................................................................................................................ 37 4. Discussion .......................................................................................................................... 42 5. References .......................................................................................................................... 45 Capítulo II: The first case of induced gynogenesis in Neotropical fishes using the yellowtail tetra (Astyanax altiparanae) as a model organism ................................................................................ 55 Abstract ......................................................................................................................................... 55 1. Introduction ........................................................................................................................ 56 2. Materials and methods ....................................................................................................... 58 3. Results ................................................................................................................................ 64 4. Discussion .......................................................................................................................... 75 5. References .......................................................................................................................... 79 Considerações finais ..................................................................................................................... 86 Tese de Doutorado Nivaldo Ferreira do Nascimento 10 Lista de Figuras Capítulo I Figure 1: Blood smears and metaphase chromosomes of diploid (left) and tetraploid (right) individuals of yellowtail tetra Astyanax altiparanae. Erythrocytes nuclei from diploids (A) presented decreased size in comparison with tetraploids (B). The chromosome numbers are 50 (C) and 100 (D) in diploid and tetraploid, respectively. Scale: 10 µm. .............................................. 40 Capítulo II Figure 1: External morphology of Astyanax altiparanae larvae. Normal diploid larva from the diploid control group (a); haploid abnormal larva resulted from oocyte fertilized with irradiated spermatozoa (b). Scale: 500 µm. .................................................................................................. 68 Figure 2: Flow cytometry histogram showing relative DNA content of the haploid group (a), diploid control group (b), presumptive diploid ginogenetic (c) and triploid control individuals (d). 1: haploid group; 2: spermatozoa (haploid); 3: diploid control; 4: gynogenetic diploid and 5: triploid control. ............................................................................................................................. 71 Figure 3: Methaphase chromosomes of diploid control (a) and gynogenetic diploid (b) individuals of yellowtail tetra Astyanax altiparanae showing the presence of 50 chromosomes. Scale: 10 µm ....................................................................................................................................................... 73 Figure 4: Representative microsatellite electrophotogram of gynogenetic Astyanax altiparanae induced by UV-irradiated sperm and heat shock. M: DNA marker; ♀: maternal; ♂: paternal. 1-9: progenies of gynogenesis. Samples prevenient from repetition 4 (section 2.4) using the primer Asty 16 (ZAGANINI et al., 2012). ........................................................................................................ 74 file:///C:/Users/Nivaldo/Dropbox/TESE_gino_tetra/tudo%20junto/definitio/Tese_definitivo_Nivaldo.docx%23_Toc532827348 file:///C:/Users/Nivaldo/Dropbox/TESE_gino_tetra/tudo%20junto/definitio/Tese_definitivo_Nivaldo.docx%23_Toc532827348 file:///C:/Users/Nivaldo/Dropbox/TESE_gino_tetra/tudo%20junto/definitio/Tese_definitivo_Nivaldo.docx%23_Toc532827348 file:///C:/Users/Nivaldo/Dropbox/TESE_gino_tetra/tudo%20junto/definitio/Tese_definitivo_Nivaldo.docx%23_Toc532827348 file:///C:/Users/Nivaldo/Dropbox/TESE_gino_tetra/tudo%20junto/Tese_finalizando_nivaldo.docx%23_Toc526429366 file:///C:/Users/Nivaldo/Dropbox/TESE_gino_tetra/tudo%20junto/Tese_finalizando_nivaldo.docx%23_Toc526429366 file:///C:/Users/Nivaldo/Dropbox/TESE_gino_tetra/tudo%20junto/Tese_finalizando_nivaldo.docx%23_Toc526429366 file:///C:/Users/Nivaldo/Dropbox/TESE_gino_tetra/tudo%20junto/Tese_finalizando_nivaldo.docx%23_Toc526429367 file:///C:/Users/Nivaldo/Dropbox/TESE_gino_tetra/tudo%20junto/Tese_finalizando_nivaldo.docx%23_Toc526429367 file:///C:/Users/Nivaldo/Dropbox/TESE_gino_tetra/tudo%20junto/Tese_finalizando_nivaldo.docx%23_Toc526429367 file:///C:/Users/Nivaldo/Dropbox/TESE_gino_tetra/tudo%20junto/Tese_finalizando_nivaldo.docx%23_Toc526429367 file:///C:/Users/Nivaldo/Dropbox/TESE_gino_tetra/tudo%20junto/Tese_finalizando_nivaldo.docx%23_Toc526429368 file:///C:/Users/Nivaldo/Dropbox/TESE_gino_tetra/tudo%20junto/Tese_finalizando_nivaldo.docx%23_Toc526429368 file:///C:/Users/Nivaldo/Dropbox/TESE_gino_tetra/tudo%20junto/Tese_finalizando_nivaldo.docx%23_Toc526429368 file:///C:/Users/Nivaldo/Dropbox/TESE_gino_tetra/tudo%20junto/Tese_finalizando_nivaldo.docx%23_Toc526429369 file:///C:/Users/Nivaldo/Dropbox/TESE_gino_tetra/tudo%20junto/Tese_finalizando_nivaldo.docx%23_Toc526429369 file:///C:/Users/Nivaldo/Dropbox/TESE_gino_tetra/tudo%20junto/Tese_finalizando_nivaldo.docx%23_Toc526429369 file:///C:/Users/Nivaldo/Dropbox/TESE_gino_tetra/tudo%20junto/Tese_finalizando_nivaldo.docx%23_Toc526429369 Tese de Doutorado Nivaldo Ferreira do Nascimento 11 Lista de Tabelas Capítulo I Table 1: Development of yellowtail tetra, Astyanax altiparanae, after heat shock treatment for induction of tetraploid fish. ........................................................................................................... 39 Table 2: Nuclear measurements of erythrocytes from diploid and tetraploid Astyanax altiparanae. ....................................................................................................................................................... 41 Capítulo II Table 1: Development of yellowtail tetra Astyanax altiparanae after sperm uv-irradiation with 0 (control), 40, 80 and 120 mJ/cm-2. ................................................................................................ 67 Table 2: Effects of UV-irradiation on sperm parameters in Astyanax altiparanae ..................... 69 Table 3: Development of yellowtail tetra Astyanax altiparanae after heat- shock treatment for gynogenesis induction ................................................................................................................... 70 Table 4: Sex ratios of diploid control and gynogenetic diploid of Astyanax altiparanae ........... 72 file:///C:/Users/Nivaldo/Dropbox/TESE_gino_tetra/tudo%20junto/definitio/Tese_definitivo_Nivaldo.docx%23_Toc532827022 file:///C:/Users/Nivaldo/Dropbox/TESE_gino_tetra/tudo%20junto/definitio/Tese_definitivo_Nivaldo.docx%23_Toc532827022 file:///C:/Users/Nivaldo/Dropbox/TESE_gino_tetra/tudo%20junto/definitio/Tese_definitivo_Nivaldo.docx%23_Toc532827026 file:///C:/Users/Nivaldo/Dropbox/TESE_gino_tetra/tudo%20junto/definitio/Tese_definitivo_Nivaldo.docx%23_Toc532827026 file:///C:/Users/Nivaldo/Dropbox/TESE_gino_tetra/tudo%20junto/Tese_finalizando_nivaldo.docx%23_Toc526516040 file:///C:/Users/Nivaldo/Dropbox/TESE_gino_tetra/tudo%20junto/Tese_finalizando_nivaldo.docx%23_Toc526516040 file:///C:/Users/Nivaldo/Dropbox/TESE_gino_tetra/tudo%20junto/Tese_finalizando_nivaldo.docx%23_Toc526516042 file:///C:/Users/Nivaldo/Dropbox/TESE_gino_tetra/tudo%20junto/Tese_finalizando_nivaldo.docx%23_Toc526516043 file:///C:/Users/Nivaldo/Dropbox/TESE_gino_tetra/tudo%20junto/Tese_finalizando_nivaldo.docx%23_Toc526516043 file:///C:/Users/Nivaldo/Dropbox/TESE_gino_tetra/tudo%20junto/Tese_finalizando_nivaldo.docx%23_Toc526516044 Tese de Doutorado Nivaldo Ferreira do Nascimento 12 APOIO FINANCEIRO O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001 e da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), processo: n° 2016/12383-0. Tese de Doutorado Nivaldo Ferreira do Nascimento 13 Resumo geral O objetivo deste estudo foi aplicar técnicas de manipulação cromossômica para obtenção de indivíduos tetraploides e ginogenéticos de lambari (Astyanax altiparanae). Para tetraploidização, foram aplicados diferentes choques de temperatura (40°C por 2 minutos) com 16, 18, 20, 22, 24 e 26 minutos pós-fertilização (mpf) para inibição da clivagem. A análise em citometria de fluxo mostrou que o choque aplicado com 26 mpf garantiu a maior porcentagem de tetraploides (94,55%), sendo os resultados também confirmados por esfregaço sanguíneo e contagem dos cromossomos. Para indução de ginogenéticos foi primeiramente avaliada diferentes doses de irradiação UV (40, 80 e 120 mj/cm2) para inativação dos espermatozoides, sendo verificado que a dose de 80 mj/cm2 foi suficiente para assegurar a ativação dos oócitos e obtenção de larvas 100% haploides. Posteriormente, para restaurar a diploidia foi aplicado choque de temperatura (40°C por 2 minutos) para evitar a liberação do segundo corpúsculo polar. A análise molecular confirmou que os peixes ginogenéticos apresentam herança exclusivamente materna e apresentam número de cromossomos idêntico ao grupo controle. Em relação a razão sexual, a grande quantidade de fêmeas obtidas sugere que o sistema genético de determinação sexual seja homogamético para fêmeas (XX; XY). Este foi o primeiro protocolo de ginogênese em uma espécie da região Neotropical e primeiro de tetraploidização em uma espécie da família Characidae. Portanto, os resultados são inovadores e poderão ser aplicados em futuros estudos de manipulação cromossômica em espécies nativas. Palavras-chave: Aquicultura, biotecnologia, poliploidia, tetraploidia, ginogênese. Tese de Doutorado Nivaldo Ferreira do Nascimento 14 General Abstract The aim of this study was to apply techniques of chromosome set manipulation to obtain gynogenetic and tetraploid individuals in lambari (Astyanax altiparanae). For tetraploidization, it was applied different temperature shocks (40°C for 2 min) at 16, 18, 20, 22, 24 and 26 minutes post-fertilization (mpf) to inhibit the cleavage. The flow cytometric analysis showed that heat shock applied at 26 mpf enabled the highest percentage of tetraploids (94.55%), which were also confirmed by nuclear diameter of erythrocytes and chromosome counting. For gynogenetic induction, first it was evaluated the best UV-dosage for inactivation of sperm DNA (40, 80 and 120 mj/cm2) and it was verified that the dosage of 80 mj/cm2 ensure oocyte activation and 100% haploid larvae. Afterwards, to restore the diploidy it was applied a temperature shock (40° for 2 min) to avoid the extrusion of the 2nd polar body. The molecular biology confirmed that that gynogenetic fish present exclusive maternal inheritance e also showed the same number of chromosomes of the control group. Sex ratio showed increased amount of females, which suggest that the genetic system of sexual determination are homogametic for females (XX; XY). This is the first protocol of gynogenesis in a species of the Neotropical region and the first tetraploidizaiton in a species of the family Characidae. Therefore, the results are innovative and could be applied in future studies of chromosome set manipulation in native species. Keywords: Aquaculture, biotecnhology, polyploidy, tetraploidy, gynogenesis. Tese de Doutorado Nivaldo Ferreira do Nascimento 15 1. Introdução geral Nas últimas décadas, a aquicultura mundial vem apresentando um crescimento constante. No Brasil, este fato foi observado pelo recente relatório do IBGE (2016). Em 2015, o valor de produção foi de R$ 4,39 bilhões, com a maior parte oriunda da criação peixes (69,9%), seguida pela criação de camarões (20,6%). No que se refere aos peixes, a produção alcançou 483,24 mil toneladas, um aumento de 1,5% em relação ao ano anterior. No entanto, com a queda da pesca extrativista e a crescente demanda por alimentos, a produção de organismos aquáticos provenientes da aquicultura deverá aumentar ainda mais. Assim, a aquicultura terá que dobrar sua produção nas próximas décadas, o que deverá ser feito utilizando menos espaço e água, principalmente devido às pressões referentes à urbanização, aumento populacional e mudanças climáticas. Neste aspecto, o emprego da Biotecnologia aplicada é um passo imprescindível para alcançar esses objetivos e suprir a crescente demanda (GUI, 2015). Neste cenário, a biotecnologia também contribui para uma aquicultura mais sustentável (GUI, 2015). Primeiramente, pode-se aumentar a produtividade e gerar produtos de melhor qualidade, diminuindo assim a necessidade por mais espaço e o consumo de água (FLETCHER et al., 2005; RATHER et al., 2011). Também é possível produzir organismos mais resistentes a doenças, permitindo um menor uso de medicamentos e produtos químicos que são nocivos à saúde humana e ao ambiente (ELASWAD e DUNHAM, 2017). Além disso, é possível a criação de peixes estéreis (NASCIMENTO et al., 2017), os quais, caso escapem para o meio ambiente, gerarão menos impacto ambiental (PIFERRER et al., 2009). Estes são apenas alguns exemplos de como a biotecnologia pode ajudar no desenvolvimento da aquicultura de forma consistente e sustentável. Ao longo das últimas décadas, diversas tecnologias foram desenvolvidas e dentre estas, tem ganhado destaque a manipulação Tese de Doutorado Nivaldo Ferreira do Nascimento 16 cromossômica, principalmente a poliploidia através da produção de peixes triploides (ARAI, 2001). Tese de Doutorado Nivaldo Ferreira do Nascimento 23 8. Referências ADAMOV, N. S. D. M.; NASCIMENTO, N. F. D.; MACIEL, E. C. S.; PEREIRA-SANTOS, M.; SENHORINI, J. A.; CALADO, L. L.; EVANGELISTA, M. M.; NAKAGHI, L. S. O.; GUERRERO, A. H. M.; FUJIMOTO, T.; YASUI, G. S. Triploid Induction in the Yellowtail Tetra, Astyanax altiparanae, Using Temperature Shock: Tools for Conservation and Aquaculture. Journal of the World Aquaculture Society, p. n/a-n/a, 2016. ISSN 1749-7345. Disponível em: < http://dx.doi.org/10.1111/jwas.12390 >. ARAI, K. Genetic improvement of aquaculture finfish species by chromosome manipulation techniques in Japan. Aquaculture, v. 197, n. 1-4, p. 205-228, Jun 1 2001. ISSN 0044-8486. Disponível em: < ://WOS:000168775000010 >. BERTOLINI, R. M.; SENHORINI, J. A.; NASCIMENTO, N. F. D.; PEREIRA‐SANTOS, M.; NAKAGHI, L. S. O.; PERES, W. A. M.; SILVA, R. C. D.; YASUI, G. S. 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