RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta dissertação será disponibilizado somente a partir de 15/06/2020. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Faculdade de Ciências Farmacêuticas Câmpus de Araraquara Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas Impacto dos polimorfismos genéticos de OCT2 e OCTN1 na disposição cinética da gabapentina em pacientes com dor crônica Priscila Akemi Yamamoto Orientadora: Profa. Dra. Natália Valadares De Moraes Araraquara - SP 2018 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Faculdade de Ciências Farmacêuticas Câmpus De Araraquara Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas Impacto dos polimorfismos genéticos de OCT2 e OCTN1 na disposição cinética da gabapentina em pacientes com dor crônica Priscila Akemi Yamamoto Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Farmacêuticas, Área de Pesquisa e Desenvolvimento de Fármacos e Medicamentos, para obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientadora: Profa. Dra. Natália Valadares de Moraes Araraquara - SP 2018 Yamamoto, Priscila Akemi Y22i Impacto dos polimorfismos genéticos de OCT2 e OCTN1 na disposição cinética da gabapentina em pacientes com dor crônica / Priscila Akemi Yamamoto. – Araraquara, 2018. 134 f. : il. Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”. Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas. Área de Pesquisa e Desenvolvimento em Fármacos e Medicamentos. Orientadora: Natália Valadares de Moraes. 1. Gabapentina. 2. Farmacogenética. 3. Transportadores de fármacos. 4. Polimorfismo de nucleotídeo único. 5. SLC22A2. 6. SLC22A4. I. Moraes, Natália Valadares de, orient. II. Título. Ficha Catalográfica Elaborada por Diretoria Técnica de Biblioteca e Documentação Faculdade de Ciências Farmacêuticas UNESP – Campus de Araraquara CAPES: 40300005 PRISCILA AKEMI YAMAMOTO IMPACTO DOS POLIMORFISMOS GENÉTICOS DE OCT2 E OCTN1 NA DISPOSIÇÃO CINÉTICA DA GABAPENTINA EM PACIENTES COM DOR CRÔNICA Dissertação de mestrado apresentada à Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade Estadual Paulista – UNESP, Campus de Araraquara como requisito para obtenção do título de Mestra em Ciências Farmacêuticas Araraquara, 15 de junho de 2018. BANCA EXAMINADORA NATÁLIA VALADARES DE MORAES Orientadora ROSÂNGELA GONÇALVES PECCININI Titular FABÍOLA DACH (participante por vídeo-conferência) Titular Dedico esta, bem como todas as minhas conquistas, aos meus pais Maria e José, por sempre acreditarem em mim e me apoiarem incondicionalmente. Por serem a minha base, a minha fonte de energia e motivação para continuar lutando pelos meus sonhos. Ao tio Mitsu, o “Gordo”, que mais do que meu tio e padrinho é meu companheiro de aventuras, que sempre me incentivou e apoiou todas as minhas decisões. À “Bá”, minha avó Sutae (in memorian), que nos momentos mais difíceis me recebia com um sorriso e me dizia para seguir em frente. E hoje está comigo nos meus pensamentos e no meu coração. E ao meu anjo da guarda, meu irmão Ricardo (in memorian), não importa onde eu estiver você sempre estará comigo me protegendo e me guiando para o melhor caminho. À minha rientadora, Prof. Dr. Natália Valadares de Moraes, pela confiança depositada em mim para desenvolver esse projeto. Por toda sua dedicação, paciência, compreensão e, por fomentar meu interesse pela pesquisa incentivando meu crescimento profissional e pessoal. Aos centros coparticipantes, Hospital Estadual Américo rasiliense, Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto-USP e a Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de Araraquara, por permitirem a realização do projeto disponibilizando a infraestrutura necessária para o seu desenvolvimento. Aos profissionais do Centro de eferência Diagnóstica “Professor Doutor Antônio Longo” pela atenção e paciência ao me ensinarem os procedimentos de coleta de amostras durante o meu estágio no Programa de Aperfeiçoamento da Faculdade de Ciências Farmacêuticas do Câmpus de Araraquara da UNESP. Aos coordenadores clínicos, Prof. Dr. Fabíola Dach, Dr. Edgar anhez Júnior e Enf. Marilice Timossi, por aceitarem fazer parte desse desafio! Por auxiliarem na seleção dos pacientes, por todo tempo dedicado para retirar as dúvidas clínicas e burocráticas que surgiram, e pela preocupação com o bom andamento do projeto. Aos meus companheiros de rupo de pesquisa, Mariana e Jhohann, por terem dividido comigo todas as preocupações, alegrias e angústias durante o desenvolvimento e validação dos métodos, pela companhia diária e durante as disciplinas e pelas extensas e produtivas discussões de resultados. À equipe de farmácia e enfermagem do Hospital Estadual mérico Brasiliense, pela contribuição no rastreamento dos pacientes e auxílio durante as coletas de amostras. Ao Ambulatório de or Neuropática/Cefaleia e Enfermaria de Neurologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto-USP (médicos, residentes e equipe de enfermagem) pela compreensão da importância e dificuldade de realizar um projeto clínico, pela cooperação durante as coletas de amostras e pela troca de experiências e conhecimento durante o desenvolvimento da etapa clínica deste projeto. Ao Prof. Dr. Cleslei Fernando Zanelli por ter aceito a colaboração possibilitando a realização da genotipagem dos participantes. À Prof. Dr. Francine Johansson zeredo da Universidade Federal da Bahia (UFBA), por ter aceito participar da etapa final do projeto me ensinando a realizar a modelagem farmacocinética populacional, por toda a atenção e tempo disponibilizados durante a colaboração. Aos técnicos do Laboratório de Toxicologia da Faculdade de Ciências Farmacêuticas – UNESP pelo auxílio diário e organização do laboratório proporcionando um ambiente de trabalho seguro e dinâmico. À CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) pela concessão da bolsa de mestrado, ao PADC (Programa de Apoio ao Desenvolvimento Científico da Faculdade de Ciências Farmacêuticas do Câmpus de Araraquara da UNESP) pelo apoio financeiro que possibilitou o desenvolvimento deste projeto e a PROPG (Pró-Reitoria de Pós-Graduação) da UNESP pelo apoio financeiro com o qual foi possível realizar a modelagem populacional. Ao Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas (docentes, servidores técnico-administrativos) pela dedicação e oportunidade de fazer parte de um curso de mestrado de excelência constatada em nível internacional. À Faculdade de Ciências Farmacêuticas – UNESP pela infraestrutura e suporte acadêmico, técnico, financeiro e material oferecidos durante toda a minha formação acadêmica Scanned with CamScanner Magia de la vida A lo lejos está lloviendo las nubes se han oscurecido pero el sol no se ha cansado de brillar. En medio de la tormenta hay un arcoíris gritando al mundo que aun en la tempestad existen los sueños, sólo para recordarnos que la luz siempre está ahí, sólo falta abrir los ojos del alma para que no la cubran nuestros miedos. Los rayos del sol alumbran la oscuridad de las nubes con lluvia y al mismo tiempo se ilumina mi vida y despierta la magia que hay dentro de mi... La sabiduría de la naturaleza no nos ha rebelado sus secretos... El mejor maestro es el que nos deja descubrir las cosas por nosotros mismos. Al ver tanta vida me siento chiquita, y mis problemas a veces me dan risa, al ver que lo que de verdad vale la pena nadie nos lo quita: la luz, el amor verdadero y nuestros sueños... (Dulce Maria Espinoza Saviñón) I RESUMO A gabapentina (GAB) é um anticonvulsivante indicado para o tratamento de epilepsia e dor crônica. Possui cinética não linear relacionada a saturação do processo de absorção, não é metabolizada e é eliminada principalmente por excreção renal. Estudos sugerem a atividade dos transportadores de cátions orgânicos (OCT2 e OCTN1) na secreção renal da GAB. O objetivo do estudo foi investigar a influência dos polimorfismos genéticos de OCT2 e OCTN1 e outras possíveis covariáveis na disposição cinética da GAB em pacientes tratados com doses múltiplas. Os métodos de cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por ultravioleta (CLAE-UV) para determinação da concentração de GAB no plasma e na urina foram desenvolvidos e validados segundo a RDC nº 27/2012 da ANVISA. Foi utilizado como agente derivatizante o 1-flúor-2,4-dinitrobenzeno, e como padrão interno o anlodipino. Os métodos apresentaram linearidade na faixa de 200-14.000 ng/mL de plasma e 2- 120 µg/mL de urina. Foram investigados 66 participantes (35 mulheres e 31 homens), com idade média de 54 anos e com dor crônica tratados com GAB por pelo menos 7 dias. Os participantes foram genotipados como GG (n=58) e GT (n=8) para o polimorfismo SLC22A2 c.808G>T e CC (n=31), CT (n= 27) e TT (n=8) para o polimorfismo SLC22A4 c.1507C>T. As concentrações plasmáticas mínima de GAB no estado de equilíbrio variaram de 402,0 a 11.937,9 ng/mL durante tratamento com doses diárias que variaram de 600 a 3.600 mg. A idade e a taxa de filtração glomerular estimada apresentaram correlação significativa com a razão concentração plasmática mínima de GAB/dose diária. Outras variáveis (sexo, peso corporal e índice de massa corporal) não apresentaram correlação. A taxa de filtração glomerular estimada e a dose diária foram as covariáveis relevantes para predizer a concentração plasmática mínima de GAB no estado de equilíbrio, explicando 68% da variabilidade na concentração plasmática. A análise populacional indicou que apenas a taxa de filtração glomerular possui efeito sob o clearance de GAB. Os polimorfismos SLC22A2 c.808G>T e SLC22A4 c.1507C>T não apresentaram influência na razão concentração plasmática mínima da GAB/dose diária e nos parâmetros farmacocinéticos populacionais estimados (constante de absorção, volume de distribuição e clearance). Em conclusão, a farmacocinética clínica da GAB é fortemente influenciada pela função renal e pela saturação dos processos de absorção e não pela farmacogenética de OCT2 e OCTN1. Palavras-chave: gabapentina; farmacogenética; transportadores de fármacos; polimorfismo de nucleotídeo único; SLC22A2; SLC22A4. II ABSTRACT Gabapentin (GAB) is an anticonvulsant indicated for the treatment of epilepsy and chronic pain. It has nonlinear kinetics due to the saturation of absorption process, is not metabolized and is mainly eliminated by renal excretion. Studies suggest the activity of organic cation transporters (OCT2 and OCTN1) in the renal excretion of GAB. The aim of this study is to investigate the influence of genetic polymorphisms of OCT2 and OCTN1 and other possible covariates on the kinetic disposition of GAB in patients treated with multiple doses. High performance liquid chromatography with ultraviolet detection (HPLC-UV) methods for the determination of GAB plasma and urine concentration were developed and validated according to RDC nº 27/2012 of ANVISA. 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene was used as derivatization agent, and amlodipine as internal standard. The methods showed linearity in the range of 200- 14,000 ng/mL of plasma and 2-120 µg/mL of urine. Sixty-six participants (35 women and 31 men), with mean age of 54 years and with chronic pain treated with GAB for at least 7 days were investigated. They were genotyped as GG (n=58) and GT (n=8) for SLC22A2 c.808G>T polymorphism and as CC (n=31), CT (n=27) and TT (n=8) for SLC22A4 c.1507C>T polymorphism. GAB steady-state minimum plasma concentrations ranged from 402.0 to 11,937.9 ng/mL during the treatment with daily doses ranging from 600 to 3,600 mg. Age and estimated glomerular filtrate rate showed significant correlation with the plasma concentration of GAB/daily dose ratio. Other variables (gender, body weight and body mass index) were not correlated. The estimated glomerular filtration rate and daily dose were found as significant covariates to predict GAB minimum plasma concentration at steady-state, explained 68% of plasma concentration variability. The population pharmacokinetics showed that GAB clearance was affected only by the glomerular filtration ratio. SLC22A2 c.808G>T and SLC22A4 c.1507C>T polymorphisms did not influence the GAB minimum plasma concentration/daily dose ratio and the estimated population pharmacokinetic parameters (first-order absorption rate constant, volume of distribution and clearance). In conclusion, gabapentin clinical pharmacokinetics is strongly influenced by renal function and the absorption process saturation and not by the pharmacogenetics of OCT2 and OCTN1. Key-words: gabapentin; pharmacogenetics; drug carriers; single nucleotide polymorphism; SLC22A2; SLC22A4. III LISTA DE FIGURAS Figura 1. Estrutura química da gabapentina (GAB) (A) e do ácido g-aminobutírico (GABA) (B).. ................................................................................................................ 3 Figura 2. Transportadores envolvidos na disposição cinética da GAB. ...................... 6 Figura 3. Localização dos polimorfismos de base única (SNP) com frequência maior ou igual a 1% na estrutura secundária predita da proteína OCT2. ........................... 13 Figura 4. Localização dos polimorfismos de base única (SNP) na estrutura secundária predita da proteína OCTN1. ...................................................................................... 17 Figura 5. Protocolo de preparo de amostra de plasma para análise de GAB por CLAE- UV. ............................................................................................................................ 25 Figura 6. Protocolo de preparo de amostra de urina para análise de GAB por CLAE- UV.. ........................................................................................................................... 26 Figura 7. Amostras de urina doadas por voluntários sadios. .................................... 29 Figura 8. Estudo do tamanho amostral (grupo experimental) em relação ao poder do teste. ......................................................................................................................... 35 Figura 9. Fluxograma da seleção dos participantes e do protocolo clínico do estudo. . 37 Figura 10. Cromatogramas referentes à análise da gabapentina e do padrão interno (anlodipino) em plasma e urina humana por CLAE-UV. ........................................... 45 Figura 11. Cromatogramas obtidos para o efeito residual em plasma (superior) e urina (inferior).. ................................................................................................................... 46 Figura 12. Análise da linearidade. ............................................................................ 47 Figura 13. Gráficos da %erro vs. concentração de gabapentina, em plasma e urina, comparando a regressão linear ordinária com a regressão linear após utilizar ponderação. .............................................................................................................. 50 Figura 14. Fluxograma do recrutamento dos participantes do estudo. ..................... 53 Figura 15. Concentração plasmática mínima de gabapentina no estado de equilíbrio (n=64)........................................................................................................................ 56 Figura 16. Relação entre a porcentagem da dose excretada inalterada na urina durante o intervalo de dose no estado de equilíbrio (Ae %) e a dose diária (mg/dia) ................ 57 Figura 17. Comparação da razão da concentração plasmática mínima de gabapentina no estado de equilíbrio pela dose diária (Cpmín/DD) entre homens e mulheres (n=64). . 58 IV Figura 18. Correlação entre as variáveis (eTFG, idade, peso corporal, IMC) e a razão da concentração plasmática mínima de gabapentina no estado de equilíbrio pela dose diária (Cpmín/DD). ...................................................................................................... 59 Figura 19. Análise representativa da qualidade do gDNA extraído por eletroforese em gel de agarose 0,5%, a 70 V por 1 hora e 30 minutos (n=18). .................................. 60 Figura 20. Efeito do genótipo de OCT2 e OCTN1 na razão entre a concentração plasmática mínima de GAB e a dose diária (Cpmín/DD). ........................................... 61 Figura 21. Predição da concentração plasmática mínima de gabapentina no estado de equilíbrio (Cpmín). .................................................................................................. 63 Figura 22. Gráfico de concentração plasmática pelo tempo dos dados observados (n=53)........................................................................................................................ 64 Figura 23. Gráficos de correlação entre o efeito aleatório dos parâmetros farmacocinéticos (h) e as covariáveis investigadas. .................................................. 66 Figura 24. Correlação entre concentração plasmática observada e concentração plasmática populacional (A) e individual predita (B). ................................................. 68 Figura 25. Distribuição dos resíduos. ....................................................................... 69 Figura 26. Distribuição dos efeitos aleatórios (h). ..................................................... 70 Figura 27. Gráfico de verificação dos valores preditos (VPC, visual predictive check). 70 Figura 28. Reação de derivatização da GAB com 1-flúor-2,4-dinitrobenzeno (FDNB). . 72 V LISTA DE TABELAS Tabela 1. Substratos e inibidores dos transportadores OCT2 e OCTN1 .................. 13 Tabela 2. Polimorfismos do gene SLC22A2 e a frequência dos alelos raros em diferentes grupos étnicos .......................................................................................... 14 Tabela 3. Polimorfismos do gene SLC22A4 e a frequência dos alelos raros em diferentes grupos étnicos .......................................................................................... 17 Tabela 4. Concentrações dos controles de qualidade em plasma e urina ................ 28 Tabela 5. Reagentes e condições da reação de RT-PCR utilizados para genotipagem. 40 Tabela 6. Teste-F realizado para avaliar a homocedasticidade dos dados (n=3) ..... 48 Tabela 7. Parâmetros da regressão linear (y= ax + b) obtidos utilizando diferentes pesos (wi) e suas respectivas somatórias dos erros relativos (∑%erro) ................... 49 Tabela 8. Precisão e exatidão (intracorrida e intercorrida) da gabapentina em plasma e urina humana por CLAE-UV................................................................................... 51 Tabela 9. Estabilidade da gabapentina em matrizes biológicas (plasma e urina) e em solução (n=3) ............................................................................................................ 52 Tabela 10. Características demográficas e antropométricas dos participantes (n=66) . 54 Tabela 11. Dados clínicos dos participantes (n=66) ................................................. 54 Tabela 12. Medicamentos de uso crônico mais prescritos para os participantes (n=66) . 55 Tabela 13. Quantidade de gabapentina excretada inalterada na urina .................... 57 Tabela 14. Frequências alélicas e genotípicas para os polimorfismos SLC22A2 c.808G>T e SLC22A4 c.1507C>T. ........................................................................... 61 Tabela 15. Regressão linear múltipla para estimar a contribuição das variáveis na predição da concentração plasmática mínima de gabapentina no estado de equilíbrio, Cpmín (n=53). ............................................................................................................. 62 Tabela 16. Verossimilhança e critérios de informação de Akaike ............................. 64 Tabela 17. Correlação de Pearson e/ou ANOVA entre os efeitos aleatórios (h) e as covariáveis ................................................................................................................ 65 Tabela 18. Verossimilhança e critérios de informação de Akaike após adição de uma covariável .................................................................................................................. 67 Tabela 19. Equações do modelo populacional e parâmetros estimados .................. 67 Tabela 20. Parâmetros farmacocinéticos da gabapentina obtidos de estudos clínicos após administração em dose múltipla ..................................................................... 102 VI Tabela 21. Métodos bioanalíticos para quantificação de gabapentina descritos na literatura de 2007-2017 ........................................................................................... 104 Tabela 22. Características demográficas e antropométricas dos participantes (n=66) 107 Tabela 23. Dados clínicos dos participantes (n=66) ............................................... 109 Tabela 24. Outros medicamentos utilizados pelos participantes (n=66) ................. 112 VII LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 5q31.1 – Braço longo do cromossomo 5, na região 3, banda 1, sub-banda 1 6q25.3 – Braço longo do cromossomo 6, na região 2, banda 5, sub-banda 3 AA – Africano-americano ABCB1 - ATP-binding cassette sub-family B member 1 AIC – Akaike Information Criterion (critérios de informação de Akaike) ANOVA – Análise de variância ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária AS – Asiático-americano AVP – Ácido valpróico b0,+ – Sistema b0,+ de transporte de aminoácidos BCRP – Proteína de resistência a câncer de mama BeWo – Células trofoblásticas humanas BHE – Barreira hematoencefálica BID – Twice a day (duas vezes ao dia) BR – Brasileiros – região sudeste CA – Caucasianos Caco-2 – Células de adenocarcinoma de cólon humano cDNA – DNA complementar CEP – Comitê de Ética em Pesquisa CG – Cromatografia gasosa CHO – Chinese Hamster Ovary (células derivadas do ovário do hamster chinês) CKD-EPI – Chronic Kidney Disease Epidemiology Collaboration CLAE – Cromatografia líquida de alta eficiência CLAE-UV – Cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por ultravioleta CMT – Neuropatia hereditária de Charcot-Marie-Tooth CMV – Citomegalovírus Cpmín/DD – Razão entre concentração plasmática mínima no estado de equilíbrio pela dose diária CQ – Controle de qualidade CQA – Controle de qualidade de alta concentração CQB – Controle de qualidade de baixa concentração CQD – Controle de qualidade de diluição VIII CQM – Controle de qualidade de média concentração CssC – Cistina CV – Coeficiente de variação DD – Dose diária DNA – Deoxyribonucleic acid (ácido desoxirribonucleico) dNTPs – Desoxirribonucleotídeos trifosfatados DP – Desvio padrão DPR – Desvio padrão relativo EA – Europeu-americano EC – Eletroforese capilar EDTA – Ethylenediamine tetraacetic acid (ácido etilenodiamino tetra-acético) EFNS – European Federation of Neurological Sciences EFS – Extração em fase sólida EI/MS – Electron ionization-mass spectrometry ELL – Extração líquido-líquido EMA – European Medicines Agency ENT – Transportador de nucleosídeo equilibrativo EPR – Erro padrão relativo eTFG –Taxa de filtração glomerular estimada ETL – Etilista FCF-UNESP – Faculdade de Ciências Farmacêuticas da UNESP fd – Fator de diluição FDA – Food and Drug Administration FDNB – 1-flúor-2,4-dinitrobenzeno Fexp – Valor de F experimental Ftab – Valor de F tabelado GAB – Gabapentina GABA – Ácido g-aminobutírico GABAA – Receptor de GABA classe A GABAB – Receptor de GABA classe B gDNA – DNA genômico Gli-Glu – Dipeptídeo glicina-glutamato GLUT – Transportador de glicose IX HC-FMRP-USP – Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo HEAB – Hospital Estadual Américo Brasiliense HILIC – Hydrophilic interaction liquid chromatography (Cromatografia líquida de interação hidrofílica) HIV – Human Immunodeficiency Virus (vírus da imunodeficiência humana) IBGE – Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística IMC – Índice de Massa Corporal IWRES – Individual weighted residuals (resíduos individuais ponderados) JEG-3 – Células placentárias humanas LAT – Transportador de aminoácidos do tipo L LAT1 – Transportador de aminoácidos do tipo L 1 LAT2 – Transportador de aminoácidos do tipo L 2 LEV – Levetiracetam LIF – Laser-induced fluorescence (fluorescência induzida por laser) LIQ – Limite inferior de quantificação LSQ – Limite superior de quantificação MATE – Transportador de extrusão de múltiplos fármacos e toxinas MCT – Transportador de ácido monocarboxílico ME – Mexicano-americano ME – Microextração MPP+ – [3H]-1-metil-4-fenilpiridina MRP – Proteínas associadas à resistência a múltiplos fármacos MS/MS – Espectrometria de massas em tandem MS/SAS – Ministério da Saúde/Secretaria de Atenção à Saúde MT – Monitorização terapêutica NMDA – N-metil D-aspartato NPDE – Normalized prediction distribution errors (distribuição dos erros preditos normalizada) OAT – Transportador de ânions orgânicos OATP – Polipeptídeo transportador de ânions orgânicos OCT – Transportador de cátions orgânicos OCT2 – Transportador de cátions orgânicos 2 OCTN1 – Transportador de cátions orgânicos/ergotioneína X OCTN2 – Transportador de cátions orgânicos/carnitina P-gp – Glicoproteína-P PEPT1 – Transportador de peptídeos 1 PGB – Pregabalina PI – Padrão interno PIDC – Polineuropatia inflamatória desmielinizante crônica PP – Precipitação de proteína PWRES – Population weighted residuals (resíduos populacionais ponderados) QD – Once daily (uma vez ao dia) QID – Four times a day (quatro vezes ao dia) RDC – Resolução da Diretoria Colegiada RNA – Ribonucleic acid (ácido ribonucleico) RP – Reverse phase (fase reversa) rs – Número de referência do SNP RT-PCR – Reação de polimerase em cadeia em tempo real SBED – Sociedade Brasileira para Estudo da Dor SCA – Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de Araraquara SDCR – Síndrome de dor complexa regional SDS – Dodecil sulfato de sódio SLC22A2 – Solute carrier family 22 member 2 SLC22A4 – Solute carrier family 22 member 4 SLC7A5 – Solute carrier family 7 member 5 SNP – Single Nucleotide Polymorphism (polimorfismo de base única) SVS/MS – Secretaria de Vigilância Sanitária do Ministério da Saúde TARV – Terapia antirretroviral TBG – Tabagista TCLE – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido TE – Tampão Tris-EDTA TEA – Tetraeilamônio TID – Three times a day (três vezes ao dia) TOP – Topiramato UFBA – Universidade Federal da Bahia UHPLC – Ultra performance liquid chromatography (Cromatografia líquida de ultra pressão) XI URAT – Transportador de urato UV-VIS – Ultravioleta-visível VBG – Vigabatrina VII – Variabilidade interindividual VPC – Visual predictive check (verificação visual dos dados preditos) XII LISTA DE SÍMBOLOS -2LL – -2´log-likelihood (verossimilhança) h – Efeito aleatório dos parâmetros farmacocinéticos t – Intervalo de doses c2 – Qui-quadrado 2pq – Frequência do genótipo heterozigoto aa0 – Aminoácidos neutros Ae – Quantidade do fármaco eliminado inalterado na urina ASC0-∞ – Área sob a curva concentração plasmática vs. tempo de zero a infinito ASC0-24 – Área sob a curva concentração plasmática vs. tempo de zero a 24 horas ASC0-8 – Área sob a curva concentração plasmática vs. tempo de zero a 8 horas B – Coeficiente de regressão Cl – Clearance ClCR – Clearance de creatinina ClR – Clearance renal Cmáx – Concentração plasmática máxima Cpmín – Concentração plasmática mínima no estado de equilíbrio CrS – Valor de creatinina sérica Cu – Concentração de gabapentina na urina ka – Constante de absorção kb – Kilobase ke – Constante de eliminação p – Frequência do alelo selvagem p2 – Frequência do genótipo homozigoto para o alelo selvagem q – Frequência do alelo raro q2 – Frequência do genótipo homozigoto para o alelo raro r – Coeficiente de correlação de Spearman R2 – Coeficiente de determinação S2 – Variância t1/2 – Meia-vida tmáx – Tempo para atingir a concentração plasmática máxima V ou Vd – Volume de distribuição wi – Fator peso SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO........................................................................................................ 1 2 REVISÃO DA LITERATURA .................................................................................. 2 2.1 Gabapentina (GAB) ............................................................................................. 2 2.1.1 Mecanismo de ação .......................................................................................... 3 2.1.2 Farmacocinética ................................................................................................ 4 2.1.3 Parâmetros farmacocinéticos após administração em dose múltipla ............... 9 2.1.4 Influência de variáveis na disposição cinética da GAB ..................................... 9 2.1.4.1 Alimentação .................................................................................................... 9 2.1.4.2 Sexo e Idade ................................................................................................ 10 2.1.4.3 Regime posológico (intervalo de doses, t) ................................................... 11 2.2 Transportador de cátions orgânicos 2 (OCT2) ............................................... 12 2.3 Transportador de cátions orgânicos/ergotioneína 1 (OCTN1) ...................... 15 2.4 Métodos bioanalíticos para quantificação de GAB........................................ 19 3 OBJETIVOS ......................................................................................................... 21 3.1 Objetivos específicos ....................................................................................... 21 3.1.1 Desenvolver e validar métodos bioanalíticos para quantificação de GAB em plasma e urina humana ............................................................................................. 21 3.1.2 Investigar a influência dos polimorfismos SLC22A2 c.808G>T e SLC22A4 c.1507C>T na disposição cinética da GAB; .............................................................. 21 3.1.3 Investigar a influência de variáveis demográficas (idade, sexo), dados antropométricos (peso corporal) e variáveis clínicas (clearance de creatinina, índice de massa corporal) na disposição cinética da GAB; ................................................. 21 3.1.4 Estimar os parâmetros farmacocinéticos da GAB por análise populacional. .. 21 4 MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................... 22 4.1 Métodos bioanalíticos para análise de GAB em plasma e urina .................. 22 4.1.1 Reagentes....................................................................................................... 22 4.1.2 Soluções-padrão ............................................................................................. 22 4.1.3 Equipamento e condições cromatográficas .................................................... 23 4.1.4 Preparo das amostras ..................................................................................... 24 4.1.4.1 Plasma ......................................................................................................... 24 4.1.4.2 Urina ............................................................................................................. 25 4.1.5 Validação de métodos bioanalíticos ................................................................ 27 4.1.5.1 Preparo dos controles de qualidade (CQ) .................................................... 27 4.1.5.2 Seletividade .................................................................................................. 28 4.1.5.2.1 Plasma .................................................................................................... 28 4.1.5.2.2 Urina ........................................................................................................ 28 4.1.5.3 Curva de calibração/Linearidade .................................................................. 29 4.1.5.4 Efeito residual ............................................................................................... 30 4.1.5.5 Precisão e Exatidão...................................................................................... 30 4.1.5.6 Estabilidade .................................................................................................. 31 4.1.5.6.1 Estabilidade de curta duração ................................................................. 31 4.1.5.6.2 Estabilidade de pós-processamento ....................................................... 31 4.1.5.6.3 Estabilidade após ciclos de congelamento e descongelamento ............. 32 4.1.5.6.4 Estabilidade de longa duração ................................................................ 32 4.1.5.6.5 Estabilidade da GAB e do PI em solução ................................................ 32 4.2 Protocolo clínico ............................................................................................... 33 4.2.1 Participantes, locais de recrutamento e coordenadores clínicos .................... 33 4.2.2 Critérios de inclusão ....................................................................................... 33 4.2.3 Critérios de exclusão ...................................................................................... 34 4.2.4 Cálculo do tamanho amostral ......................................................................... 34 4.2.5 Protocolo clínico .............................................................................................. 35 4.3 Genotipagem ..................................................................................................... 38 4.3.1 Extração de DNA genômico humano .............................................................. 38 4.3.2 Reação de polimerase em cadeia em tempo real (RT-PCR) .......................... 39 4.4 Análise estatística ............................................................................................ 40 4.5 Análise farmacocinética populacional ............................................................ 41 5 RESULTADOS ..................................................................................................... 44 5.1 Análise da GAB em plasma e urina por CLAE-UV ......................................... 44 5.2 Etapa clínica ...................................................................................................... 52 5.2.1 Participantes ................................................................................................... 52 5.2.2 Determinação da concentração plasmática mínima de GAB no estado de equilíbrio e da quantidade de GAB excretada inalterada na urina ............................ 55 5.2.3 Correlação entre a concentração plasmática mínima no estado de equilíbrio e as possíveis covariáveis ........................................................................................... 57 5.2.4 Extração de DNA genômico humano .............................................................. 59 5.2.5 Genotipagem dos polimorfismos por reação de polimerase em cadeia em tempo real (RT-PCR) ........................................................................................................... 60 5.2.6 Regressão linear múltipla da GAB .................................................................. 62 5.2.7 Análise farmacocinética populacional ............................................................. 63 6 DISCUSSÃO......................................................................................................... 71 6.1 Análise da GAB em plasma e urina por CLAE-UV ......................................... 71 6.2 Farmacocinética clínica da GAB ..................................................................... 74 7 CONCLUSÕES..................................................................................................... 82 REFERÊNCIAS ........................................................................................................ 83 ANEXOS ................................................................................................................... 94 APÊNDICES ........................................................................................................... 102 Introdução | 1 1 INTRODUÇÃO A gabapentina (GAB) é um anticonvulsivante de segunda geração indicado, no Brasil, para o tratamento de epilepsia e dor neuropática. É utilizada na clínica como tratamento de primeira escolha para diversos tipos de dor neuropática (Attal e tal., 2010). Este fármaco apresenta biodisponibilidade oral variável, não é metabolizado e não se liga à proteínas plasmáticas (Stewart et al., 1993; Patsalos et al., 2008; Patsalos et al., 2017). A excreção urinária é a principal forma de eliminação da GAB e dados da literatura sugerem que o clearance renal envolve a secreção tubular via transporte mediado por transportadores de cátions orgânicos (OCT2 e OCTN1) (Urban et al., 2008; Lal et al., 2010). Os genes SLC22A2 e SLC22A4 que codificam os transportadores OCT2 e OCTN1, respectivamente, são polimórficos. O polimorfismo de base única (SNP) SLC22A4 c.1507C>T apresenta frequência de 32,9% em brasileiros da região sudeste e dados da literatura demonstram que a especificidade do transportador OCTN1 por diversos de seus substratos é alterada na presença deste SNP (Urban et al., 2008; Refargen, 2014; Bonifaz-Peña et al., 2014). Por outro lado, o polimorfismo SLC22A2 c.808G>T, com frequência de 11,9% em brasileiros está relacionado a redução da atividade de OCT2 (Choi; Song, 2008; Song et al., 2008; Wang et al., 2008; Refargen, 2014; Bonifaz-Peña et al., 2014). Tendo em vista que a GAB tem sido descrita como substrato de OCT2 e OCTN1, espera-se que o polimorfismo genético dos transportadores possa explicar, pelo menos parcialmente, a variabilidade na disposição cinética da GAB. Devido a ausência de metabolismo e ausência de ligação as proteínas plasmáticas em humanos, a GAB pode ser considerada um bom modelo para o estudo dos transportadores OCT2 e OCTN1. Este estudo clínico foi realizado em pacientes em uso contínuo da GAB para a investigação do impacto dos polimorfismos SLC22A2 c.808G>T e SLC22A4 c.1507C>T nos seus principais parâmetros farmacocinéticos. Conclusão | 82 7 CONCLUSÕES 1. Os métodos de análise da GAB em plasma e urina foram desenvolvidos e validados em CLAE-UV após derivação com 1-flúor-2,4-dinitrobenzeno (FDNB). Os métodos foram validados para as faixas de concentração de 200 a 14.000 ng/mL para o plasma e de 2 a 120 µg/mL para a urina, com limites de quantificação de 200 ng/mL e 2 µg/mL, respectivamente. A precisão, a exatidão e a estabilidade dos métodos foram compatíveis com a determinação da GAB em pacientes tratados com doses múltiplas. 2. A taxa de filtração glomerular estimada e a dose diária foram identificadas como covariáveis da concentração plasmática mínima no estado de equilíbrio (Cpmín), sendo que juntos estes fatores explicam 68% da variabilidade nas concentrações. Não houve correlação entre peso corporal, IMC, sexo ou genótipo de SLC22A2 c.808G>T e SLC22A4 c.1507C>T com a razão Cpmín/DD da GAB para os participantes investigados. 3. A análise farmacocinética populacional mostrou que embora tenha sido avaliada uma pequena quantidade de dados (n=212), os parâmetros farmacocinéticos estimados foram próximos aos descritos na literatura. Portanto, a amostragem esparsa realizada mostrou-se eficaz para a análise populacional. Além disso, a função renal foi a única covariável que mostrou influenciar no processo de eliminação e a farmacogenética de OCT2 e OCTN1 não altera a farmacocinética da GAB. Referências | 83 REFERÊNCIAS 1. Ahmed GF, Bathena SP, Brundage RC, Leppik IE, Conway JM, Schwartz JB, et al. Pharmacokinetics and saturable absorption of gabapentin in nursing home elderly patients. AAPS J. 2017 mar; 19 (2): 551-556. 2. Almeida AM, Castelo-Branco MM, Falcão AC. Linear regression for calibration lines revisited: weighting schemes for bioanalytical methods. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2002 jul; 774 (2): 215-22. 3. André P, Navy J, Decosterd LA, Buclin T, Rothuizen LE. 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