UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JULIO DE MESQUITA FILHO 

INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS 

CÂMPUS DE BOTUCATU 

 

 

 

 

ESTUDO HODOLÓGICO DAS AFERÊNCIAS AO PRIMEIRO NÚCLEO DO CIRCUITO NEURAL DO 

REFLEXO AUDITIVO DE SOBRESSALTO: NÚCLEO DA RAIZ COCLEAR 

 

 

 

 

 

 

Nicole Orsi Barioni 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

BOTUCATU – SP 

2012 

  

Monografia apresentada ao 
Instituto de Biociências, Campus 
de Botucatu, para obtenção do 
título de Bacharel em Ciências 
Biomédicas 



 
 

 

 

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JULIO DE MESQUITA FILHO 

INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS 

CÂMPUS DE BOTUCATU 

 

 

 

 

ESTUDO HODOLÓGICO DAS AFERÊNCIAS AO PRIMEIRO NÚCLEO DO CIRCUITO NEURAL DO 

REFLEXO AUDITIVO DE SOBRESSALTO: NÚCLEO DA RAIZ COCLEAR 

 

 

 

 

 

Discente: Nicole Orsi Barioni 

 

 

Orientador: José de Anchieta de Castro e Horta Júnior 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

BOTUCATU – SP 

2012

Monografia apresentada ao 
Instituto de Biociências, Campus 
de Botucatu, para obtenção do 
título de Bacharel em Ciências 
Biomédicas 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORM. 

DIVISÃO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP 

BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE 

Barioni, Nicole Orsi.  

      Estudo hodológico das aferências ao primeiro núcleo do circuito 

neural do reflexo auditivo de sobressalto : núcleo da raiz coclear / Nicole Orsi 

Barioni. – Botucatu : [s.n.], 2012 

   

    Trabalho de conclusão de curso (bacharelado - Ciências Biomédicas) - 

Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências de Botucatu  

      Orientador: José de Anchieta de Castro e Horta Júnior 

      Capes: 20604009 

        

      1. Neurônios.  2. Rato.  3. Circuitos neurais.  4. Tronco encefálico.                                  

          

Palavras-chave: Fluoro-Gold; Integração Sensoriomotora; Núcleo da Raiz 

Coclear; Startle; Traçadores Neurais. 



Estudo hodológico das aferências aos CRN – Nicole Orsi Barioni                                                            I 
 

 
 

 

 

DEDICATÓRIA 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Dedico este trabalho aos meus pais, pois sem eles nada disso seria possível.  

 À minha vó Concha (in memorian), que infelizmente não pode estar presente 

neste momento de grande conquista da minha vida. 

  



Estudo hodológico das aferências aos CRN – Nicole Orsi Barioni                                                            II 
 

 
 

AGRADECIMENTOS 

 

Agradeço aos meus pais, Thelma e Edson, pela confiança em mim, pelo apoio em 

minhas decisões e pela oportunidade em realizar meus sonhos. Por acreditarem em quem 

eu sou e me darem confiança para ir mais longe.  

Ao meu namorado Felipe, por toda paciência, ajuda, compreensão e carinho, por estar 

junto a mim, me dando força e coragem, mesmo quando estivemos separados por um 

oceano. 

Eu agradeço ao meu orientador e amigo, Prof. Dr. José de Anchieta de Castro e Horta 

Júnior por toda paciência, dedicação e esforço pelo meu aprendizado e crescimento 

científico, e pelos bons momentos que passamos juntos. 

Agradeço aos meus amigos do Laboratório de Neuromorfologia do Departamento de 

Anatomia IBB – UNESP, André, Rian e Marina, os quais colaboraram com os experimentos 

contidos neste trabalho, que juntamente a Fernanda e Carla, criaram um ambiente saudável 

no laboratório. 

Agradeço também à Profa. Dra. Maria Dolores Estilita López García pela oportunidade 

que me foi concedida para realização de parte de meu estágio obrigatório em seu 

Laboratório de Transtornos Audiomotores do Instituto de Neurociências de Castilla y León 

em Salamanca, na Espanha e pela revisão e orientação em meu trabalho de conclusão de 

curso. Fico muito agradecida aos colaboradores deste laboratório que me auxiliaram e 

acolheram durante este período maravilhoso que passei na Espanha: Richard, Orlando, 

Sonia, David, Biviana, Sebastian, Lymarie e Consuelo. Também não poderia deixar de 

agradecer às pessoas com quem morei em Salamanca: Prosper, Vincenzo, Artur, Carmen e 

Marco, que criaram um ambiente fraterno, fazendo com que minhas saudades de casa 

fossem amenizadas. 

Aos meus amigos, Micaela e Rafael, que me apoiaram e que sempre estiveram ao meu 

lado durante esta longa caminhada, agradeço pelos momentos de risada que me fizeram 

esquecer minhas ansiedades e angústias. 

Ao departamento de anatomia, onde realizei toda a minha iniciação científica, 

agradeço também ao técnico de laboratório (auxiliar acadêmico) deste departamento, 

Gelson, por todo apoio dado durante o desenvolvimento dos experimentos que realizei. À 

pró-reitoria de pesquisa e ao CNPq (PIBIC) pelo apoio financeiro durante minha iniciação 

científica, à FAPESP que financia o projeto ao qual estou vinculada e ao Instituto de 

Biociências da UNESP de Botucatu, todos os professores e funcionários por terem auxiliado 

em minha formação profissional. 

E a todas as outras pessoas que estiveram presentes em pequenos momentos, mas 

que fizeram uma grande diferença nesta etapa da minha vida. 

 

  



Estudo hodológico das aferências aos CRN – Nicole Orsi Barioni                                                            III 
 

 
 

EPÍGRAFE 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

“Foi o tempo que dedicastes à tua rosa que a fez tão importante” 
Antonie de Saint-Exupéry 

 
 

  



Estudo hodológico das aferências aos CRN – Nicole Orsi Barioni                                                            IV 
 

 
 

RESUMO 

Os neurônios da raiz coclear são os primeiros neurônios do sistema nervoso central a receber a 
informação auditiva proveniente da cóclea e conectam-se com centros de integração sensoriomotora 
do tronco encefálico, especialmente com o núcleo reticular caudal da ponte. Funcionalmente os 
neurônios da raiz coclear estão envolvidos no circuito elementar do reflexo auditivo de sobressalto 
juntamente com as células ganglionares do órgão de Corti, o núcleo reticular caudal da ponte e os 
motoneurônios da medula espinal. O reflexo auditivo de sobressalto apresenta uma série de 
modulações como a habituação, a sensibilização, a inibição por estímulo prévio e a potenciação por 
um estímulo adverso. As alterações na reação reflexa de sobressalto em suas diferentes modulações 
possuem valor diagnóstico na clinica médica de enfermidades neurodegenerativas e psiquiátricas 
como Parkinson e Esquizofrenia. As modulações do reflexo auditivo de sobressalto ocorrem 
mediante a influência de diversos núcleos sobre os componentes do circuito elementar deste reflexo. 
O núcleo menos estudado do circuito neural do reflexo auditivo de sobressalto é o núcleo da raiz 
coclear. O padrão de conectividade eferente dos neurônios da raiz coclear é bem conhecido, porém 
pouco se conhece sobre as origens de suas aferências e a identidade neuroquímica das mesmas. 
Estudos prévios demonstraram que o soma e os dendritos dos neurônios da raiz coclear estão 
cobertos por botões sinápticos de quatro tipos, sugerindo que existam diversas origens para estes 
terminais axônicos, com características neuroquímicas próprias. O conhecimento das aferências aos 
neurônios da raiz coclear é relevante para compreender qual o papel do núcleo da raiz coclear nas 
modulações do reflexo auditivo de sobressalto. Portanto, o objetivo deste trabalho foi estudar quais 
são as origens das aferências aos neurônios da raiz coclear com técnicas de mapeamento de vias 
nervosas. Para isto, foi utilizada uma abordagem estereotáxica para injetar um neurotraçador 
retrógrado na raiz coclear de 22 ratos wistar fêmea pesando entre 250g e 300g. Após este 
procedimento, os animais foram sacrificados, o encéfalo retirado do crânio, cortado em secções de 
30um e dividido em 10 séries. Para cada caso foram utilizadas 4 séries para processamento 
imunohistoquímico e revelação do neurotraçador. Após isto, os cortes foram montados em lâminas 
para posterior fotodocumentação e mapeamento. A análise do material permitiu a realização de um 
estudo semi-quantitativo dos perfis neuronais marcados em cada caso. A partir dos dados obtidos, 
foi montada uma tabela para visualização e discussão dos resultados. As fontes de aferências comuns 
a todos os casos foram 8 núcleos: O lócus coeruleus (bilateralmente), núcleo subcoeruleus 
(contralateralmente), núcleo lateral superior da oliva (bilateralmente), núcleo ventral do corpo 
trapezoide (bilateralmente), núcleo noradrenérgico A5 (ipsilateralmente), núcleo paragigantocelular 
lateral (bilateralmente), núcleo reticular parvicelular (bilateralmente) e núcleo reticular intermédio 
(bilateralmente). Estes núcleos observados são os possíveis alvos de estudo anterógrados futuros 
para confirmação destas aferências aos neurônios da raiz coclear, juntamente a estudos 
neuroquímicos e comportamentais, para verificar sua influência sobre estes neurônios e seu papel 
nas modulações do reflexo acústico de sobressalto. 

 

Palavras chave: Integração Sensoriomotora; Núcleo da Raiz Coclear; Startle; Traçadores 

Neurais, Fluoro-Gold 

 

  



Estudo hodológico das aferências aos CRN – Nicole Orsi Barioni                                                            V 
 

 
 

RESUMEN 

Las neuronas de la raíz coclear son las primeras neuronas del sistema nervioso central a recibir 
la información auditiva proveniente de la cóclea y se conectan con centros de integración 
sensoriomotora del tronco encefálico, especialmente con el núcleo reticular caudal del puente. 
Funcionalmente las neuronas de la raíz coclear están envueltos en el circuito elemental del reflejo 
auditivo de sobresalto juntamente con las células ganglionares del órgano de Corti, el núcleo 
reticular caudal del puente y las motoneuronas de la médula espinal. El reflejo auditivo de sobresalto 
presenta una serie de modulaciones como la habituación, la sensibilización, la inhibición por estímulo 
previo y la potenciación por un estímulo adverso. Las alteraciones en la reacción refleja de sobresalto 
y sus diferentes modulaciones poseen valor diagnóstico en la clínica médica de enfermedades 
neurodegenerativas y psiquiátricas como Parkinson y Esquizofrenia. Las modulaciones del reflejo 
auditivo de sobresalto ocurren mediante la influencia de diversos núcleos sobre los componentes del 
circuito elemental de este reflejo. El núcleo menos estudiado del circuito neural del reflejo auditivo 
de sobresalto es el núcleo de la raíz coclear. El patrón de conectividad eferente de las neuronas de la 
raíz coclear es bien conocido, sin embargo poco se conoce sobre los orígenes de sus aferencias y la 
identidad neuroquímica de las mismas. Estudios previos demostraron que el soma y en las dendritas 
de las neuronas de la raíz coclear están cubiertos por botones sinápticos de cuatro tipos, sugiriendo 
que existan diversos orígenes para estos terminales axonales, con características neuroquímicas 
propias. El conocimiento de las aferencias a las neuronas de la raíz coclear es relevante para 
comprender cual el papel del núcleo de la raíz coclear en las modulaciones del reflejo auditivo de 
sobresalto. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo fue estudiar cuáles son los orígenes de las 
aferencias a las neuronas de la raíz coclear con técnicas de trazado de vías nerviosas. Para esto, fue 
utilizado un abordaje estereotáxico para inyectar un neurotrazador retrógrado en la raíz coclear de 
22 ratas Wistar hembra pesando entre 250g y 300g. Después de este procedimiento, los animales 
fueron sacrificados, el encéfalo retirado del cráneo, cortado en secciones de 30µm y dividido en 10 
series. Para cada caso inmunohistoquímico y revelación del neurotrazador. Después de esto, los 
cortes fueron montados en porta objetos para posterior fotodocumentación y estudio. El análisis del 
material permitió la realización de un estudio semi-cuantitativo de los perfiles neuronales marcados 
en cada caso. A partir de los datos obtenidos, fue montada una tabla para visualización y discusión de 
los resultados. Las fuentes de aferencias comunes a todos los casos fueron 8 núcleos: El lócus 
coeruleus (bilateralmente), núcleo subcoeruleus (contralateralmente), núcleo lateral superior de la 
oliva (bilateralmente), núcleo ventral del cuerpo trapezoide (bilateralmente), núcleo noradrenérgico 
A5 (ipsilateralmente), núcleo paragigantocelular lateral (bilateralmente), núcleo reticular parvicelular 
(bilateralmente) y núcleo reticular intermédio (bilateralmente). Estos núcleos observados son los 
posibles blancos de estudios anterógrados futuros para confirmación de estas aferencias a las 
neuronas de la raíz coclear, juntamente a estudios neuroquímicos y comportamentales, para verificar 
su influencia sobre estas neuronas y su papel en las modulaciones del reflejo auditivo de sobresalto. 

 
Palabras clave: Integración Sensoriomotora; Núcleo de la Raiz Coclear; Startle; Trazadores 

Neuronales, Fluoro-Gold 

 
  



Estudo hodológico das aferências aos CRN – Nicole Orsi Barioni                                                            VI 
 

 
 

LISTA DE FIGURAS E QUADROS 

FIGURA 1 – Foto macroscópica do encéfalo do rato. O círculo vermelho indica a localização da parte 

inicial do nervo vestíbulococlear. ....................................................................................................... 1 

FIGURA 2 - CR e os CRN ............................................................................................................................ 2 

FIGURA 3 – Esquema das eferências dos CRN. Elaborado com base nos trabalhos de López et al. 

(1999) e Horta-Júnior et al. (2008). ..................................................................................................... 3 

FIGURA 4 – Representação esquemática do RAS.. ................................................................................... 3 

FIGURA 5 – Representação esquemática do RAS desencadeado por estímulo acústico de alta 

intensidade em um rato. ..................................................................................................................... 4 

FIGURA 6 – Demonstração dos procedimentos de injeção intraperitoneal (à esquerda) e subcutânea 

(à direita).. ........................................................................................................................................... 9 

FIGURA 7 – Representação gráfica do procedimento de cirurgía estereotáxica. .................................. 10 

FIGURA 8 – Representação gráfica do crânio de um rato, indicando os parâmetros de referência 

utilizados na cirurgia estereotáxica: Labda, Bregma e linha interaural. ........................................... 11 

FIGURA 9 – Fotomicrografias de alguns núcleos para demonstração do critério utilizado no estudo 

semi-quantitativo dos casos ............................................................................................................. 14 

FIGURA 10 – Locais de injeção de FG na CR (casos N13, N15, N17, N18). ............................................. 17 

FIGURA 11 – Locais de injeção de FG na CR (casos N20, N25, N30, N32) .............................................. 18 

FIGURA 12 – Locais de injeção de FG na CR (casos N74 e N84) ............................................................. 19 

Quadro 1 – Sistematização das aferências observadas nos casos experimentais em que a injeção de 

FG foi considerada efetiva (casos N13, N15, N17, N18 e N20) ......................................................... 20 

Quadro 2 – Sistematização das aferências observadas nos casos experimentais em que a injeção de 

FG foi considerada efetiva (casos N25, N30, N32, N74 e N84) ......................................................... 21 

FIGURA 13 – Representação esquemática do mapeamento dos perfis neuronais retrogradamente 

marcados com FG após a injeção na CR do caso experimental N15 desde o nivel I.A. -5,76 a I.A. -

1,44.. ................................................................................................................................................. 22 

FIGURA 14 – Representação esquemática do mapeamento dos perfis neuronais retrogradamente 

marcados com FG após a injeção na CR do caso experimental N15 desde o nivel I.A. -1,32 a I.A. 

+0,24.................................................................................................................................................. 23 

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Estudo hodológico das aferências aos CRN – Nicole Orsi Barioni                                                            VII 
 

 
 

FIGURA 15 – Fotomicrografias dos núcleos com perfis neuronais retrogradamente marcados após a 

injeção de FG na CR.. ......................................................................................................................... 24 

FIGURA 16 – Fotomicrografias dos núcleos com perfis neuronais retrogradamente marcados após a 

injeção de FG na CR. .......................................................................................................................... 25 

FIGURA 17 – Fotomicrografias dos núcleos com perfis neuronais retrogradamente marcados após a 

injeção de de FG na CR. ..................................................................................................................... 26 

FIGURA 18 – Fotomicrografias dos núcleos com perfis neuronais retrogradamente marcados após a 

injeção de FG na CR. .......................................................................................................................... 27 

FIGURA 19 – Representação esquemática dos núcleos identificados como aferências consistentes aos 

CRN neste trabalho ........................................................................................................................... 28 

FIGURA 20 - Identificação das aferências noradrenérgicas da região do A5 aos CRN. .......................... 33 

FIGURA 21 - Fotomicrografias do sitio de injeção de BDA em VNTB à esquerda e respectiva 

representação esquemática à direita ............................................................................................... 34 

FIGURA 22 - Fotomicrografias do sitio de injeção de BDA em VNTB à esquerda e respectiva 

representação esquemática à direita. .............................................................................................. 35 

FIGURA 23 – Fotomicrografias da CR após injeção de BDA em VNTB e imunohistoquímica para 

calbindina .......................................................................................................................................... 36 

FIGURA 24 – Fotomicrografia e esquema do sistema olivococlear ....................................................... 37 

  

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Estudo hodológico das aferências aos CRN – Nicole Orsi Barioni                                                            VIII 
 

 
 

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 

 

Abreviatura Significado 
4V 
6N 
7n 

A 

Quarto ventrículo 
Nervo abducente 
Nervo facial 
Microampere 

l Microlitro 

m Micrometro 
A5 Grupo noradrenérgico A5 
ABC 
Aq 

Complexo avidina biotina peroxidase 
Aqueduto do mesencéfalo 

Amb 
Au1 

Núcleo ambíguo 
Córtex auditivo primário 

BDA Dextrano biotinilado 
oC Graus centígrados 
CIC Núcleo central do colículo inferior 
Cm Centímetro 
CR Raiz coclear do nervo vestíbulo-coclear 
CRN Neurônios da raiz coclear  
Cu 
CuR 
CY2 
CY3 

Núcleo cuneiforme 
Núcleo cuneiforme, parte rotunda 
CY2 bis-NHS ester Amax = 492nm; Emax = 510nm 
CY3 bis-NHS ester Amax = 550nm; Emax = 570nm 

DAB 
DAB-Ni 

3,3´ diaminobenzidina tetrahidrocloreto 
DAB reforçado com níquel amônio sulfato 

dB 
DBH 

Decibel 
Dopamina Beta Hidroxilase 

DC 
DCIC 

Núcleo coclear dorsal 
Córtex dorsal do coliculo inferior 

Dk Núcleo de Darkschewitsch 
DRV 
DRD 

Núcleo dorsal da rafe ventral 
Núcleo dorsal da rafe dorsal 

ECu 
EVe 
ECIC 

Núcleo cuneiforme externo 
Núcleo eferente vestibular 
Córtex externo do colículo inferior 

FG Fluro-Gold 

g Grama 
g7 
Gi 

Joelho do nervo facial 
Núcleo gigantocelular 

h Horas 
HRP Peroxidase do rábano-silvestre (raiz-forte) 
Hz 
IC 
icp 

Hertz 
Colículo inferior 
Pedúnculo cerebelar inferior 

IOn Núcleo olivar inferior 
IRt Núcleo reticular intermédio 
kHz Quilohertz 
LC Locus cerúleus 



Estudo hodológico das aferências aos CRN – Nicole Orsi Barioni                                                            IX 
 

 
 

LOC 
LPGi 

Sistema olivococlear lateral 
Núcleo paragigantocelular lateral 

LSO 
LtR 

Oliva superior lateral 
Núcleo reticular lateral 

LVe 
MdD 

Núcleo vestibular lateral 
Núcleo medular reticular 

mg 
ml 

Miligrama 
Lâmina medular interna 

mm Milímetro 
MOC 
Mot7 

Sistema olivococlear medial 
Núcleo motor do nervo facial 

MS Milisegundo 
MSO Oliva superior medial 
MNTB Núcleo medial do corpo trapezóide 
MVe 
MVeMC 
MVePC 

Núcleo vestibular medial 
Núcleo vestibular medial parte magnocelular 
Núcleo vestibular medial parte parvicelular 

NaCl Cloreto de sódio 
nm Nanômetro 
NMDA 
PAG 

N-Metil-D-Aspartato 
Substância cinzenta periaquedutal 

PCRt 
PDTg 

Núcleo reticular parvicelular 
Núcleo tegmental posterodorsal 

Pn Núcleo pontino 
PnC 
PnO 
PPI 
Pr 
Pr5VL 
py 

Núcleo reticular caudal da ponte 
Núcleo reticular caudal da ponte, parte oral 
Inibição por estímulo prévio 
Núcleo prepósito 
Nucleo ventrolateral principal do trigêmio 
Trato piramidal 

RAS 
RtTg 
scp 

Reflexo auditivo de sobressalto 
Núcleo reticulotegmental da ponte 
Pedúnculo cerebelar superio 

SOC Complexo olivar superior 
sp5 
Sp5C 

Trato espinal do nervo trigêmio 
Núcleo espinal do trigêmio, parte caudal 

Sp5I 
Sp5O 

Núcleo espinal interpolar do trigêmeo 
Núcleo espinal do trigêmio, parte oral 

SPL Sound pressure level – nível de pressão de som 
SpVe Núcleo vestibular espinal 
SuVe 
SubC 

Núcleo vestibular superior 
Núcleo subcoeruleus 

tz Corpo trapezóide 
VC Núcleo coclear ventral 
VCA Núcleo coclear ventral anterior 
VCP Núcleo coclear ventral posterior 
VNTB Núcleo ventral do corpo trapezóide 
  

 

  



Estudo hodológico das aferências aos CRN – Nicole Orsi Barioni                                                            X 
 

 
 

SUMÁRIO 

DEDICATÓRIA ............................................................................................................................................ I 

AGRADECIMENTOS................................................................................................................................... II 

EPÍGRAFE ................................................................................................................................................. III 

RESUMO ................................................................................................................................................. IV 

RESUMEN ................................................................................................................................................ V 

LISTA DE FIGURAS E QUADROS .............................................................................................................. VI 

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ....................................................................................................... VIII 

1. INTRODUÇÃO ....................................................................................................................................... 1 

2. OBJETIVO E DESENHO EXPERIMENTAL ................................................................................................ 7 

3. MATERIAIS E MÉTODOS ....................................................................................................................... 8 

3.1. Animais de experimentação e seu manuseio .............................................................. 8 

3.2. Procedimentos experimentais .................................................................................... 9 

3.2.1 Injeção de traçador retrógrado na raiz coclear ........................................................... 9 

3.2.2 Perfusão e coleta do material .................................................................................... 12 

3.2.3 Processamento........................................................................................................... 12 

3.2.4 Análise do material e fotodocumentação.................................................................. 13 

3.2.4 Normatização técnica ................................................................................................ 15 

4. RESULTADOS ...................................................................................................................................... 16 

5. DISCUSSÃO ......................................................................................................................................... 28 

6. PERSPECTIVAS FUTURAS .................................................................................................................... 32 

7. BIBLIOGRAFIA ..................................................................................................................................... 38 

APÊNDICE ............................................................................................................................................... 43 

 

 



Estudo hodológico das aferências aos CRN – Nicole Orsi Barioni                                                            1 
 

 
 

1. INTRODUÇÃO 

O nervo coclear está localizado medialmente ao paraflóculo do cerebelo, juntamente ao nervo 

vestibular com o qual se dirige ao meato acústico interno, posicionando-se lateralmente, 

dorsalmente e caudalmente (ANGULO et al., 1990), para formar o nervo vestíbulococlear, VIII par de 

nervos cranianos. A parte inicial do nervo vestíbulococlear emerge do tronco encefálico na porção 

lateral do sulco bulbopontino, caudalmente a raíz do nervo trigêmeo (Figura 1), está formada pela 

união da raiz do nervo coclear e do nervo vestibular e ocupa o meato acústico interno juntamente ao 

nervo facial.  

 

 

 

O nervo coclear é constituído pelos axônios dos neurônios do gânglio espiral, os quais 

conduzem impulsos nervosos associados à audição procedentes do Órgão de Corti, situado na cóclea 

(HEBEL e STROMBERG, 1976; MACHADO, 2001), além disso, também é constituído de fibras 

eferentes oriundas do complexo olivar superior: o feixe olivococlear (GUINAN et al., 1983; VETTER e 

MUGNAINI, 1992; WARR, 1992; WHITE e WARR, 1983) 

No rato, como em outros mamíferos, as fibras do nervo coclear terminam no complexo 

nuclear coclear (LORENTE DE NÓ, 1933), e assim o fazem em um padrão tonotópico. Cada fibra 

bifurca em um ramo ascendente, que supre o núcleo coclear ventral anterior (VCA), e um ramo 

descendente, que supre os núcleos coclear ventral posterior (VCP) e dorsal (DC) (HARRISON, J. M. e 

FELDMAN, 1970). 

A raíz coclear (CR) compreende a parte do nervo que está entre o núcleo coclear ventral (VC) e 

a borda de células de Schwann do VIII par (MERCHÁN et al., 1988). Nela está situado um grupo de 

aproximadamente cinquenta células (de 30 a 38 m de diâmetro) de cada lado (Figura 2), facilmente 

identificadas em secções histológicas do tronco encefálico de roedores e marsupiais (AITKIN, 

1995;1996; LÓPEZ et al., 1993), as quais constituem os primeiros neurônios do sistema nervoso 

FIGURA 1 – Foto macroscópica do encéfalo do rato. O circulo vermelho indica a localização 
da parte inicial do nervo vestíbulococlear. Em A,vista ventral. Em B, vista lateral. 



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central a receber informação auditiva através de colaterais axônicos originários das fibras nervosas 

do nervo coclear: os neurônios da raiz coclear (CRN) (HARRISON, J. et al., 1962; OSEN et al., 1991). 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Cada CRN conecta-se com uma grande quantidade de colaterais provenientes de fibras 

nervosas de praticamente toda extensão do órgão de Corti (OSEN et al., 1991) e isto é possível 

devido ao seu padrão de ramificação dendrítica, com dendritos longos dispostos em duas direções: 

paralelamente e perpendicularmente às fibras aferentes cocleares primárias (MERCHÁN et al., 1988). 

Os dendritos perpendiculares são especialmente extensos e cruzam transversalmente praticamente 

toda CR, o que permite que os CRNs estejam sujeitos a estimulação por um amplo espectro de 

freqüências acústicas, embora possuam o limiar de excitação mais baixo para freqüências ao redor 

de 30 kHz (SINEX et al., 2001b).  

Apesar de serem os primeiros neurônios a receber aferências auditivas, os CRN relacionam-se 

com estruturas não auditivas (LOPEZ et al., 1999; NODAL e LÓPEZ, 2003), como os núcleos de 

integração sensoriomotora da formação reticular (Figura 3) , especialmente o núcleo reticular caudal 

da ponte (PnC) ou diretamente com o núcleo motor do nervo facial (Mot7) (HORTA-JUNIOR et al., 

2008). 

FIGURA 2 - CR e os CRN. Em A, um esquema de 
um corte coronal do tronco encefálico e parte da 
espira basal da cóclea.As cabeças de seta 
indicam a borda glial que delimita a raiz coclear. 
Em B, fotomicrografia de corte coronal da raiz 
coclear submetido a técnica imunoistoquímica 
para neurofilamentos SMI-32 evidenciando os 
neurônios da raiz coclear. Modificado a partir de 
Horta-Junior e López (2008). Abreviaturas: BC, 
espira basal da cóclea; sp5, trato espinhal do 
nervo trigêmeo; Sp5, núcleo do trato espinhal do 
nervo trigêmeo; VC, núcleo coclear ventral. 



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FIGURA 3 – Esquema das eferências dos CRN. Elaborado com base nos trabalhos de López et al. 

(1999) e Horta-Júnior et al. (2008). 

Devido a sua posição e padrão de conectividade, os CRN foram relacionados funcionalmente 

com o circuito do RAS (Figura 4), hipótese que foi confirmada por Lee et al. (1996). Portanto, no rato, 

o circuito neural elementar do RAS é constituído pelas células ganglionares do órgão de Corti, os 

CRN, os neurônios do PnC e os motoneurônios espinais (KOCH, 1999; LEE et al., 1996). 

   

 

 

 

FIGURA 4 – Representação esquemática do circuito do RAS. A Figura representa um corte 
sagital mediano do encéfalo no qual se evidenciam as estruturas que constituem o circuito 
elementar do RAS. 



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O RAS é caracterizado por uma reação motora rápida e intensa que implica na contração de 

um grande número de grupos musculares de todo o corpo em resposta a um estímulo acústico 

intenso e inesperado. Apresenta um componente vegetativo mediado pelo sistema nervoso 

autônomo que se manifesta por um aumento da pressão arterial e da freqüência cardíaca (BAUDRIE 

et al., 1997; KOCH, 1999; LANDIS e HUNT, 1939). Trata-se de um reflexo acústico-motor do tronco 

encefálico que está presente em muitas espécies de mamíferos, incluído o homem. Possui caráter 

defensivo frente a uma possível agressão ou de alerta frente a acontecimentos não esperados (KEAY 

et al., 1988). No rato, a manifestação física do RAS é demonstrada com a contração dos membros, 

flexão do pescoço e encurtamento do comprimento total do animal (KOCH, 1999; YEOMANS e 

FRANKLAND, 1996), o que resulta em uma postura defensiva e na proteção de partes importantes do 

seu corpo como a face, o pescoço e o ventre (Figura 5).  

 

 

 

 

 

 

 

 

Tanto no homem como em animais de experimentação, os estímulos que desencadeiam mais 

facilmente o RAS são sons compostos por um amplo espectro de freqüências (ruído branco), de alta 

intensidade, normalmente acima de 80 dB SPL (GRILLON et al., 1994; KOCH, 1999; PILZ e 

SCHNITZLER, 1996). A latência deste reflexo é muito curta: 8ms no rato (DAVIS, M. et al., 1982) e de 5 

a 10 ms no homem (KOCH, 1999). Esta curta latência está de acordo com o fato de os axônios dos 

CRN serem extremamente grossos (5-7μm), permitindo uma rápida transmissão neural, necessária 

para o desencadeamento do RAS (SINEX et al., 2001a). 

Além do valor etológico dos reflexos acústico-motores para a sobrevivência do indivíduo, 

existe um enorme interesse nestes reflexos tanto na clínica médica como na pesquisa básica 

relacionada com a integração sensório-motora (HOFFMAN e ISON, 1980; SWERDLOW et al., 2000; 

VALLS-SOLÉ, 1998; WILKINS et al., 1986). A localização das estruturas que compõe o circuito do RAS 

em nível do tronco encefálico permite reconhecer o estado funcional desta importante parte do 

encéfalo a partir da avaliação clínica do RAS. Esta estratégia é utilizada em pediatria perinatal, na 

qual a observação dos reflexos acústico-motores, juntamente com a realização de potenciais 

evocados, são as principais ferramentas que nos permitem conhecer o estado de desenvolvimento e 

FIGURA 5 – Representação esquemática do RAS desencadeado por estímulo acústico de 
alta intensidade em um rato (imagem fornecida por Beduschi, R.S.) 



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funcionalidade do sistema nervoso. Em otorrinolaringologia, a avaliação destes reflexos nos 

proporciona informação sobre a funcionalidade da porção baixa da via auditiva, até o nível da ponte 

e principalmente do nervo coclear. O RAS constitui um modelo experimental interessante já que é 

um comportamento bastante simples, facilmente avaliado sem provas invasivas.  

O RAS pode ser modificado quantitativamente ou qualitativamente por uma série de 

condições naturais ou experimentais (BELL et al., 2003; SWERDLOW et al., 2000), consideradas como 

modulações e que demonstram a plasticidade deste reflexo. O reflexo pode estar diminuído por 

habituação ao estímulo (GONZALEZ-LIMA et al., 1989; PILZ e SCHNITZLER, 1996), por um estímulo 

prévio de menor intensidade (BRAFF et al., 2001; FENDT et al., 2001; HOFFMAN e FLESHLER, 1963; 

SWERDLOW et al., 2007) e por administração de drogas (BAKSHI et al., 1994; GEYER et al., 2001; 

SWERDLOW et al., 1993). Por outro lado, o reflexo pode estar aumentado em condições de 

potenciação por medo(ANISMAN et al., 2000; DAVIS, G. W., 2006; WINSLOW et al., 2007), ansiedade 

(KAVIANI et al., 2004; PREHN et al., 2006), e estresse (ANDRESKI et al., 1998; STAM, 2007). Em geral 

as modulações mostram-se mais sensíveis do que o próprio reflexo e apresentam alterações 

significativas em situações em que o reflexo propriamente dito não está alterado (HOFFMAN e ISON, 

1980; JUSTUS e FINN, 2007). Por esta razão as provas comportamentais envolvendo as modulações 

do RAS tem despertado interesse no diagnóstico clínico (WILKINS et al., 1986). Na clínica neurológica 

e psiquiátrica, estão documentadas alterações nas respostas às modulações provocadas por doenças 

neurodegenerativas, esquizofrenia, hiperreflexia, depressão e estados de dependência de drogas 

como opiáceos e álcool (BOROWSKI e KOKKINIDIS, 1994; BROWN, P., 1995; GRILLON et al., 1994; 

KOCH, 1999; MANSBACH et al., 1992).  

A avaliação das modulações do RAS em animais de experimentação tem sido proposta como 

modelo equivalente para situações que podem ocorrer na espécie humana, convertendo-se em uma 

potencial ferramenta para pesquisa de novos fármacos. A potenciação do RAS por estímulo adverso, 

tem sido equiparada ao estado de ansiedade no homem (COOK et al., 1992), podendo ser utilizada 

para avaliar o efeito de fármacos em patologias psiquiátricas relacionadas com estados de ansiedade. 

As modulações próprias do RAS e suas alterações farmacológicas estão relacionadas com 

estruturas do sistema nervoso central que atuam sobre algum dos sistemas descendentes e 

terminam por influenciar a atividade dos núcleos do circuito elementar do reflexo. Dentre eles o 

núcleo mais estudado é o PnC, sobre o qual se conhecem as características eletrofisiológicas 

(LINGENHÖHL e FRIAUF, 1994; WAGNER e MACK, 1998), de conectividade (YEOMANS e FRANKLAND, 

1996)e as respostas à manipulação farmacológica (CAICEDO et al., 1998; EBERT e KOCH, 1992; KRASE 

et al., 1993; MISERENDINO e DAVIS, 1993). Por ser parte da formação reticular, o PnC atua como 



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centro integrador de aferências de diversas origens com distintos neurotransmissores, fato que está 

relacionado com o grande número de modulações do RAS (KOCH, 1999). 

Por outro lado, o núcleo da CR foi o menos estudado até o momento. A origem das aferências 

aos CRN que não provenham da cóclea ainda são pouco conhecidas. Estudos realizados por Merchán 

et al. (1988), confirmaram a existência de pelo menos quatro tipos diferentes de aferências aos CRN, 

o que corrobora com o fato de estes neurônios estarem relacionados com as possíveis modulações 

do RAS, porém ainda não foram investigadas com detalhes quais modulações do RAS poderiam 

relacionar-se com os CRN e seus aferentes diretos ou indiretos.  

  



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2. OBJETIVO E DESENHO EXPERIMENTAL 

 

De acordo com as informações obtidas na literatura, entre os núcleos participantes do circuito 

do RAS, o CRN foi o menos estudado até o momento. Portanto, o conhecimento da origem das 

aferências ao CRN poderia ampliar o que se sabe hoje sobre os circuitos neurais que medeiam as 

modulações do RAS e por isso, este é o objetivo fundamental deste trabalho. 

Para atingir este objetivo, foi injetado um neurotraçador retrógrado, na CR através de 

abordagem estereotáxica. Após o tempo de sobrevivência necessário para captação, transporte 

axonal retrógrado e acúmulo do traçador nos somas dos neurôrios aferentes à zona de injeção, os 

animais foram perfundidos e o encéfalo retirado, cortado e processado. Após imunohistoquímica 

para revelação do neurotraçador, os cortes foram montados em lâminas, contracorados para 

identificação da citoarquitetura e analisados em microscópio para mapeamento dos somas 

retrogradamente marcados. 

  



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3. MATERIAIS E MÉTODOS 

3.1. Animais de experimentação e seu manuseio 

Todos os experimentos realizados necessitaram da utilização de animais de experimentação, 

não existindo método alternativo. Portanto, tratamos de tomar o maior cuidado possível no 

planejamento, preparação e execução dos experimentos para incrementar ao máximo as 

possibilidades de êxito, o que supõe uma redução do número de animais utilizados. Este preceito foi 

seguido na elaboração dos protocolos experimentais que foram aprovados pela Comissão de Ética na 

Experimentação Animal do Instituto de Biociências de Botucatu – UNESP (protocolo nº17/08). 

Foi utilizado como modelo experimental o rato albino adulto fêmea (Rattus norvergicus), da 

linhagem Wistar, por volta de 100 dias de idade, pesando entre 250g e 300g. Esta espécie é 

representativa dos mamíferos roedores, os quais apresentam um ótimo funcionamento dos reflexos 

acústico-motores para sobrevivência em um habitat terrestre, principalmente noturno, e por isso é 

amplamente utilizada para o estudo do RAS (KOCH, 1999; YEOMANS e FRANKLAND, 1996). Os 

animais foram alojados em gaiolas (41x34x17cm) com livre acesso à água e ração, em biotério com 

temperatura controlada (22 a 24oC) e ciclo claro/escuro de 12/12 horas (luzes acesas às 7:00h). Para 

evitar o estresse por isolamento, em cada gaiola foram alocados dois animais. As intervenções 

cirúrgicas para injeção de traçadores e a eutanásia dos animais foram realizadas sob anestesia 

profunda, a qual foi comprovada com a ausência de reflexo palpebral, ausência de tônus muscular no 

pescoço e de reflexo de retirada dos membros como sinal de anestesia eficaz (LAPCHIK VBV, 2009). 

Como anestésicos, utilizamos drogas de uso comum em experimentação animal, cuja eficácia da 

dose utilizada foi constatada repetidamente em vários laboratórios de pesquisa(DAMY et al.). Foram 

empregadas as seguintes soluções anestésicas: 

- Para injeção de traçadores neurais foi utilizada uma solução anestésica composta por uma 

mistura de xilasina a 2% (concentração final = 0,5mg/ml), Ketamina a 10% (concentração final = 

25mg/ml) e acepromazina a 1% (concentração final = 1mg/ml), diluídos em água purificada, por via 

subcutânea (Figura 6), na dose de 0,2ml para cada 100g de peso corporal do animal. Além disso, foi 

administrado paracetamol® (100μl/animal) por via oral após cirurgia.  

 - Para o sacrifício por perfusão transcardíaca foi utilizada uma solução anestésica de hidrato 

de cloral a 10%, por via intraperitoneal (Figura 6), na dose 1ml para cada 250g de peso corporal 

(aproximadamente 400 mg/kg). 



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3.2. Procedimentos experimentais 

3.2.1 Injeção de traçador retrógrado na raiz coclear 

Para estudar a origem das aferências aos neurônios da raiz coclear foi usado o neurotraçador 

retrógrado Fluoro-Gold (FG - Fluorochrome, Denver, CO, USA). O FG é um traçador que pode ser 

captado pelos axônios dos neurônios, transportado por meio do fluxo axonal retrógrado e 

acumulado no pericário (SCHMUED e FALLON, 1986). Embora o FG seja um traçador 

autofluorescente e não careça de tratamento para ser observado em secções do encéfalo, existem 

anticorpos comerciais contra FG que permitem a realização de um protocolo de imunoistoquímica 

para sua detecção. Este processamento adicional justifica-se pelo aumento da sensibilidade e da 

estabilização da marcação retrógrada obtida, além de permitir o estudo do material no microscópio 

óptico convencional por tempo indeterminado (CHANG et al., 1990; NODAL e LÓPEZ, 2003). Neste 

trabalho o FG foi utilizado a 4%, diluído em soro fisiológico, em 22 casos experimentais, por meio de 

abordagem estereotáxica da CR (Figura 7). 

FIGURA 6 – Demonstração dos procedimentos de injeção intraperitoneal (à esquerda) e 
subcutânea (à direita)(REMIE, 2000). 



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 As coordenadas empregadas foram determinadas com auxílio do atlas estereotáxico do 

encéfalo do rato (PAXINOS e WATSON, 2005) e de trabalhos prévios que utilizaram esta abordagem 

(HORTA-JUNIOR et al., 2008; LOPEZ et al., 1999), através de craniotomia dorsal, visando evitar o 

trajeto através do seio venoso transverso e a lesão de estruturas nobres que possam interferir de 

alguma maneira no experimento. As coordenas utilizadas foram: no eixo ântero-posterior, 1,0mm 

caudal em relação à linha interaural; no eixo látero-lateral, 4,3mm em direção ao lado esquerdo; no 

eixo dorsoventral, 0,3mm superiormente à linha interaural e um ângulo de 20° com relação ao plano 

frontal, em direção caudal (Figura 8).  

FIGURA 7 – Representação gráfica do procedimento de cirurgia estereotáxica (REMIE, 
2000) 



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O neurotraçador foi injetado na CR, por iontoforese com uma micropipeta de vidro (30 

micrômetros de calibre interno na ponta), aplicando uma corrente contínua positiva de 3mA, em 

pulsos intermitentes de 7 segundos (ligado/desligado), durante 15 minutos. Além disso, também 

foram feitos experimentos de injeção por pressão na CR, com as mesmas coordenadas das injeções 

por iontoforese. Este procedimento foi realizado em 2 casos para pesquisar possíveis diferenças 

qualitativas quanto a localização dos neurônios retrogradamente marcados devido à diferença do 

método de injeção. Para as injeções por pressão foi utilizada uma bomba de injeção (Micro4tm, 

MicroSyringe Controller, World Precision Instruments) conectada a uma seringa (Syringe 10um 

gastight, World Precision instruments) a qual foi acoplada uma micropipeta na ponta para maior 

precisão da injeção. A bomba foi ajustada para injetar 100nl a 10nl/min, totalizando 10min. Em 

ambos os tipos de injeção, após a cirurgia os animais ficaram em recuperação durante 14 dias. 

 

FIGURA 8 – Representação gráfica do crânio de um rato, indicando os parâmetros de 
referência utilizados na cirurgia estereotáxica: Lambda, Bregma e linha interaural. A área 
circundada em vermelho indica o local onde foi realizada a craniotomia (REMIE, 2000). 



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3.2.2 Perfusão e coleta do material 

Após o período de recuperação, os animais foram sacrificados por perfusão transcardíaca, 

utilizando uma bomba peristáltica durante 30 minutos. Para lavagem do leito vascular empregaram-

se 150ml de soro de Ringer sem cálcio (NaCl 0,85%, KCl 0,025%, NaHCO3 0,02%, pH 6,9) com 0,5ml 

de heparina (Liquemine®, 5.000 U.I.), seguido de 1000 ml de uma solução fixadora constituída de 

formaldeído a 4%, recém preparado a partir de paraformaldeido e glutaraldeído a 0,125% em 

tampão fosfato 0,1 M, pH 7,3. Terminada a perfusão, o animal permaneceu em repouso por 

aproximadamente uma hora, no intuito de otimizar a fixação do encéfalo. Este foi exposto por 

craniotomia e remoção da dura-máter. Para preservar a raiz do nervo vestíbulo-coclear unida ao 

tronco encefálico, o osso temporal foi tracionado lateralmente até o rompimento do nervo 

vestíbulococlear no interior do meato acústico interno. Em seguida, os demais nervos cranianos 

foram cortados e o encéfalo foi removido. 

O material coletado foi reduzido, com o auxílio de uma matriz para encéfalos (Insigth Ltda), a 

um bloco que se estendeu desde o núcleo do nervo hipoglosso até o hipotálamo. O bloco de tecido 

foi crioprotegido por imersão em uma solução de sacarose a 30% em tampão fosfato 0,1M pH 7,4, 

em agitação a 4oC durante 48h.  

 

3.2.3 Processamento  

Após a crioproteção o material foi cortado em secções seriadas de 30μm, paralelamente ao 

plano coronal, em micrótomo de deslizamento (SM2010R, Leica) equipado com platina congeladora 

(BFS-30MP, Phisiotemp Inc.). Os cortes foram recolhidos seqüencialmente, em uma série de 10 

frascos: frascos 1,2,6 e 7 preenchidos com tampão fosfato 0,1M pH 7,4 para protocolo de 

imunoistoquímica e o restante com solução anticongelante (solução aquosa constituída por: 6,25% 

de tampão fosfato 0,4M; 0,25% de NaCl; 15%de sacarose; 35% de etilenoglicol) para armazenamento 

e posterior processamento. Desta maneira, o intervalo entre os cortes consecutivos de cada frasco 

foi de 300μm. 

 Para o protocolo de imunoistoquímica optamos pelo processamento em cortes flutuantes 

(free-floating). Inicialmente os cortes foram lavados em tampão TBS-TX composto por Tris (Trisma 

Base, Sigma #T-6066) 0,05 M pH 7,6 com 0,85% de NaCl e 0,5% de Triton X-100 (Merck #11869) para 

retirada da sacarose infiltrada no tecido. Para visualizar o FG, foi utilizado protocolo baseado no 

método do complexo avidina biotina peroxidase (ABC, Vectastain Standard®, Vector Labs, #PK-4000). 

Este método utiliza a grande afinidade (constante de dissociação 10-15) que a molécula de avidina 

apresenta pela molécula de biotina (HSU et al., 1981). Antes de iniciar as incubações com anticorpos 



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realizou-se a inibição da peroxidase endógena com uma solução de água oxigenada P.A. a 10%, em 

agitação, durante 20 minutos a temperatura ambiente. Esta etapa do protocolo visa eliminar a 

marcação inespecífica que poderia se formar devido à peroxidase do próprio tecido. Posteriormente 

os cortes foram incubados em anticorpo primário anti-FluoroGold (Chemicon, #AB 153), obtido em 

coelho na concentração de 1:10.000 durante 48 horas em agitação a 4 °C. Após cuidadosa lavagem 

dos cortes com tampão TBS-TX, os mesmos foram incubados em anticorpo secundário biotinilado 

(Vector Labs, #BA-1000) anti-IgG de coelho produzido em cabra, na concentração de 1:200 durante 2 

horas, em agitação, à temperatura ambiente. O anticorpo secundário, conjugado a biotina, foi 

detectado mediante incubação dos cortes com complexo ABC em TBS-TX durante 2 horas à 

temperatura ambiente ou durante a noite à 4ºC. Posteriormente, a peroxidase unida ao complexo foi 

evidenciada mediante a ação da água oxigenada, usando como cromógeno a 3,3´ 

diaminobenzidinatetrahidrocloreto (DAB), que gera um produto de reação estável de cor marrom. 

Para tanto os cortes foram incubados em uma solução de tampão Tris 0,05 M, pH 7,6 com 0,07% de 

DAB e 0,003% de água oxigenada, sob controle visual e microscópico. Após a evidenciação da 

marcação, a reação de revelação foi interrompida por três lavagens com tampão Tris 0,05 M, pH 7,6. 

 Após imunoistoquímica, os cortes foram transferidos para uma solução de gelatina a 0,4% em 

tampão Tris 0,05M e montados em lâminas de vidro, de maneira sequencial de caudal para rostral. 

Os frascos 1, 2, 6 e 7 de cada caso foram preenchidos com tampão fosfato, sendo que os cortes dos 

frascos 2 e 7 foram contracorados com tionina, pelo método de Nissl para referência 

citoarquitetônica. O método de Nissl consiste em realizar a desidratação dos cortes montados em 

lâminas com alcoóis de concentração crescente (etanol de 50% a 100%), dissolução dos lipídeos (com 

dois banhos de xilol), re-hidratação dos cortes por meio alcoóis de concentração decrescente (etanol 

de 100% à 50%), coloração com tionina (Fisher #T-409), nova desidratação com alcoóis e diafanização 

com xilol e montagem da lamínula com Permont® (Fisher Scientific). Nas séries sem contracoloração, 

os cortes foram desidratados e cobertos com lamínula utilizando Permont® como meio de 

montagem. 

 

3.2.4 Análise do material e fotodocumentação 

 As lâminas preparadas foram estudadas no microscópio óptico (Scope.A1 ou Axioplan2, Carl 

Zeiss) em campo claro. 

Os perfis celulares retrogradamente marcados foram mapeados em uma prancha 

confeccionada a partir de figuras retiradas do atlas estereotáxico do encéfalo do rato (PAXINOS e 

WATSON, 2005) e manipuladas no programa Canvas X (ACD Systems Inc.). A nomenclatura e as 



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abreviaturas utilizadas na descrição dos resultados foram baseadas no atlas estereotáxico do 

encéfalo do rato (PAXINOS e WATSON, 2005). A documentação fotográfica foi realizada com câmera 

digital (AxioCamHRc ou AxioCam MRc, Zeiss). As imagens capturadas foram organizadas em figuras e 

trabalhadas com os programas Photoshop CS2 (Adobe Systems Inc.) e Canvas X, ajustando o brilho, 

contraste e balanço de cores e removendo artefatos localizados externamente aos cortes, de acordo 

com o preconizado por Schenk et al. (1999) e Saper (1999) para preparação de imagens digitais para 

publicação científica. As barras de calibração das fotomicrografias foram confeccionadas 

fotografando, com os mesmos equipamentos e aumentos, uma lâmina com escala micrométrica 

calibrada (Leica, LeitzWetzlar), cuja menor divisão é de 100μm. 

Em cada caso foi realizado um estudo semi-quantitativo a partir de duas séries de cortes. Para 

melhor visualização e discussão, os resultados do mapeamento dos perfis neuronais 

retrogradamente marcados foram tabulados e representados através de símbolos obedecendo a 

seguinte escala: 1 ou 2 perfis neuronais = (+), de 3 a 8 perfis neuronais = (++), de 9 a 14 perfis 

neuronais = (+++) e mais de 15 perfis neuronais = (++++) (Figura 9).  

 

 

 

 

FIGURA 9 – Fotomicrografias de alguns núcleos para demonstração do critério utilizado no 
estudo semi-quantitativo dos casos. Na Figura A, há 1 perfil neuronal apenas no núcleo 
pontino (+); na Figura B há 5 perfis neuronais no núcleo cuneiforme (++). Na Figura C há 12 
perfis neuronais no núcleo eferente vestibular (+++) e na Figura D, há 16 perfis neuronais no 
núcleo A5 (++++). 



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3.2.4 Normatização técnica 

Para redação deste trabalho foram utilizadas as seguintes normas técnicas, formuladas pela 

Associação Brasileira de Normas Técnicas: ABNT NBR 14724:2011: para formatação e estruturação 

dos componentes do trabalho; ABNT NBR 6023:2002, para elaboração das referências bibliográficas; 

ABNT NBR 6024:2002, para numeração das seções do trabalho; ABNT NBR 6027:2002, para 

elaboração do sumário; e ABNT NBR 10520:2002, para citação das referências no texto. 

  



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4. RESULTADOS 

Após a análise dos 22 experimentos de injeção de FG na CR, foram selecionados 10 casos 

experimentais: 8 nos quais foi injetado o neurotraçador por iontoforese e 2 por pressão, nos quais os 

locais de injeção foram considerados corretos. Os casos selecionados foram: N74, N84 (Figura 10) 

N13, N15, N17, N18 (Figura 11), N20, N25, N30, N32 (Figura 12). 

A análise da injeção de neurotraçador demonstrou que no caso N13 houve contaminação no 

VC e um pouco no flóculo do cerebelo; no caso N15, a injeção foi a mais restrita à raiz, sem 

contaminação no cerebelo e pouca contaminação nos núcleos cocleares; no caso N17, observamos 

muita contaminação nos núcleos cocleares e no cerebelo; no caso N18, verificamos que houve pouca 

contaminação nos núcleos cocleares e no cerebelo (Figura 10); no caso N20, a injeção se localizou na 

parte mais rostral da raiz, o traçador extravasou para o líquor e contaminou o nervo facial, além da 

contaminação no cerebelo; no caso N25, a injeção também se localizou mais rostralmente, houve 

pouca contaminação no cerebelo e difusão para o VCP; no caso N30, o sitio de injeção foi localizado 

na parte mais rostral da CR, houve contaminação no cerebelo e no VCP; no N32, o sítio de injeção 

localizou-se na parte mais medial da raiz, o traçador extravasou para o líquor e contaminou o nervo 

facial, além da contaminação no núcleo coclear ventral anterior (VCA)e pouca contaminação no 

cerebelo (Figura 11); no caso N74, houve muita contaminação no cerebelo e VCP; enquanto que o 

caso N84 apresentou mais contaminação no cerebelo, porém sem contaminação nos núcleos 

cocleares (Figura 12). 

Para análise e comparação dos resultados obtidos nos casos experimentais, os núcleos onde 

foram encontrados perfis neuronais retrogradamente marcados foram listados e dispostos em 

quadros onde, por meio de um critério semi-quantitativo (Figura 9), indica-se a quantidade de somas 

marcados (Quadros 1 e 2). Os núcleos retrogradamente marcados foram agrupados como: aferências 

consistentes a CR, nas quais foram englobados os núcleos com marcação em todos os casos ou em 

pelo menos 80% deles; aferências provavelmente originadas por contaminação no cerebelo; 

aferências provavelmente originadas por contaminação nos núcleos cocleares e aferências 

provavelmente originadas por contaminação no nervo facial. Um caso representativo do 

mapeamento realizado está ilustrado nas Figuras 13 e 14.  

 



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FIGURA 10 – Locais de injeção de FG na CR (casos N13, N15, N17, N18). Fotomicrografias de 
cortes coronais do tronco encefálico evidenciando o depósito de traçador FG (marrom) na CR 
nos casos N13 em A, N15 em B, N17 em C e N18 em D. Ao lado das fotomicrografias está a 
representação gráfica do sítio de injeção e das contaminações observadas em áreas próximas e 
no trajeto da micropipeta através do cerebelo (pontos negros). 

 



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 FIGURA 11 – Locais de injeção de FG na CR (casos N20, N25, N30, N32). Fotomicrografias de 
cortes coronais do tronco encefálico evidenciando o depósito de traçador FG (marrom) na CR nos 
casos N20 em A, N25 em B, N30 em C e N32 em D. Ao lado das fotomicrografias está a 
representação gráfica do sitio de injeção e das contaminações observadas em áreas próximas e no 
trajeto da micropipeta através do cerebelo (pontos negros). 



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Os núcleos aferentes a raiz coclear foram: Oliva superior lateral (LSO) (ipsilateral e bilateral), 

Núcleo ventral do corpo rapezóide (VNTB) (bilateral), células adrenérgicas A5 (A5) (ipsilateral), 

Núcleo eferente vestibular (EVe) (bilateral), Lócus coeruleus (LC) (ipsilateral e bilateral), Núcleo 

subcoeruleus (SubC) (contralateral); Núcleo reticular intermédio (IRt) (ipsilateral, contralateral e 

bilateral); Núcleo reticular parvicelular (PCRt) (ipsilateral e bilateral) e Núcleo paragigantocelular 

lateral (LPGi) (bilateral e ipsilateral). Alguns núcleos apresentaram perfis neuronais retrogradamente 

marcados de forma ocasional dependendo do tamanho do sitio de injeção, da contaminação de 

estruturas nas áreas vizinhas ou de estruturas atravessadas pela micropipeta no trajeto em direção a 

CR. (Figuras 15, 16, 17 e 18) 

 

 

 

 

FIGURA 12 – Locais de injeção de FG na CR (casos N74 e N84). Fotomicrografias de cortes 
coronais do tronco encefálico evidenciando o depósito de traçador FG (marrom) na CR nos 
casos N74 em A e N84 em B. Ao lado das fotomicrografias está a representação gráfica do sitio 
de injeção e das contaminações observadas em áreas próximas e no trajeto da micropipeta 
através do cerebelo (pontos negros). 



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Quadro 1 – Sistematização das aferências observadas nos casos experimentais em que a injeção de 
FG foi considerada efetiva (casos N13, N15, N17, N18 e N20). Os dados obtidos em cada caso estão 
dispostos em colunas e as regiões observadas como aferentes em linhas. A análise semi-quantitativa 
dos núcleos aferentes está representada pelos símbolos (+) e segue o critério da legenda. As regiões 
aferentes foram agrupadas segundo o código de cores da legenda. 

 

legenda: verde: aferências consistentes a raiz coclear

1-2 perfis neuronais ( + ) vermelho: aferências provavelmente originadas por contaminação no cerebelo

3-8 perfis neuronais ( ++ ) azul: aferências provavelmente originadas por contaminação nos núcleos cocleares

9-14 perfis neuronais ( +++ ) laranja :aferências provavelmente originadas por contaminação no nervo facial

mais de 15 perfis neuronais ( ++++ )

REGIÕES                 /                       CASOS N13 - iontoforese N15 - iontoforese N17 - iontoforese N18 - iontoforese N20 - iontoforese

análise do sitio de injeção

contaminação no nucleo coclear 

ventral e um pouco de 

contaminação no flóculo do 

cerebelo no trajeto da 

micropipeta em direção á raiz 

coclear

restrito à raiz, sem 

contaminação no cerebelo e 

pouca contaminação dos 

núcleos cocleares

muita contaminação nos 

núcleos cocleares além de 

contaminação no cerebelo

pouca contaminação nos 

nucleos cocleares e pouca 

contaminação no cerebelo

injeção na parte mais rostral da 

raiz, o traçador extravasou para 

o líquido encéfaloraquidiano e 

contaminou o nervo facial, além 

da contaminação no cerebelo 

núcleo pontino (Pn) (++) contralateral (+) contralateral (++) contralateral

núcleo prepósito (Pr) (+) bilateral

núcleo lateral superior da oliva (LSO) (+++) ipsilateral (++++) ipsilateral (+++) ipsilateral (+++) bilateral (++) bilateral

nucleo ventral do corpo trapezoide (VNTB = MVPO + 

LVPO)
(++++)  bilateral (++++) bilateral (++++) bilateral (++++) bilateral (++++) bilateral

células adrenérgicas A5 (A5) (++) ipsilateral (++++) ipsilateral (+++) ipsilateral (+++) ipsilateral (+++) ipsilateral

núcleo medial do corpo trapezóide (MNTB ou Tz) (++++) bilateral (+++) ipsilateral (++) ipsilateral

região periolivar (++) ipsilateral (++) bilateral (++) bilateral

núcleo superior paraolivar (SPON)

núcleo medial da oliva (MSO)

núcleo eferente vestibular (Eve) (++++) bilateral (++++) bilateral (++++) bilateral (+++) bilateral (++++) bilateral

núcleo coclear ventral posterior (VCP) (+++) ipsilateral (++++) ipsilateral (++) ipsilateral (+++) ipsilateral

núcleo coclear ventral anterior (VCA) (++++) ipsilateral (++) ipsilateral (++++) ipsilateral (++) ipsilateral

núcleo coclear dorsal (DC)  (+) ipsilateral (++) ipsilateral (+) ipsilateral

sub coeruleus (SuBC) (+++) fraca contralateral (++++) fraca contralateral (+++) fraca contralateral

locus coeruleus (LC) (+) ipsilateral (+) ipsilateral (+++) bilateral (+) bilateral (+) ipsilateral

giganto celular lateral (LPGi) (++) bilateral (++++) bilateral (+) bilateral (++) ipsilateral

núcleo olivar inferior (IOn) (++) contralateral

núcleo reticular parvicelular (PCRt) (++++) ipsilateral (++++) ipsilateral (+) ipsilateral (+++) ipsilateral

núcleo reticular intermédio (IRt) (+++) bilateral (+++) bilateral (++) bilateral (+) contralateral (+++) bilateral

núcleo vestibular lateral (Lve)

núcleo vestibular espinal (SpVe ) (+++) fraca ipsilateral (+++) fraca ipsilateral (++++) fraca ipsilateral (++++) fraca ipsilateral (+++) fraca ipsilateral

núcleo vestibular medial parte magnocelular (MVeMC) (+) contralateral (++) bilateral

núcleo vestibular medial parte parvicelular (MVePC) (+) ipsilateral

núcleo central do colículo inferior (CIC) (++++) bilateral (++++) bilateral

nucleo trigeminal espinal interpolar (Sp5I) (+) ipsilateral (+) ipsilateral (++) ipsilateral

núcleo ventrolateral principal do trigêmio (Pr5VL) (+++) bilateral

núcleo reticular lateral (LRt) (+) contralateral

núcleo cuneiforme (Cu) (+) ipsilateral (+) ipsilateral (++) ipsilateral

núcleo grácil (Gr)

núcleo motor do nervo facial (mot7) (++) fraca ipsilateral (+++) fraca ipsilateral (++++) fraca ipsilateral

zona perifacial (++) fraca ipsilateral (++) fraca ipsilateral (+) contralateral (++) fraca ipsilateral

córtex auditivo primário (Au1) (++) 

núcleo dorsal da rafe ventral (DRV) (++)

núcleo paralemniscal ventral (PLV)

substancia cinzenta periaquedutal (PAG)

núcleo reticular medular parte dorsal (MdD)

núcleo pontino reticulotegmental (RTTg)

núcleo paratrigeminal (Pa5)

núcleo para-abducente (Pa6)

núcleo motor do trigêmio tensor do tímpano (5TT)

núcleo de Roller (Ro)



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Quadro 2 – Sistematização das aferências observadas nos casos experimentais em que a injeção de 
FG foi considerada efetiva (casos N25, N30, N32, N74 e N84). Os dados obtidos em cada caso estão 
dispostos em colunas e as regiões observadas como aferentes em linhas. A análise semi-quantitativa 
dos núcleos aferentes está representada pelos símbolos (+) e segue o critério da legenda. As regiões 
aferentes foram agrupadas segundo o código de cores da legenda. 

REGIÕES                   /                        CASOS N25 - iontoforese N30 - iontoforese N32 - iontoforese N74 - pressão N84 - pressão

análise do sitio de injeção

injeção na parte mais rostral da 

raiz, pouca contaminação no 

cerebelo e halo em VCP

injeção na parte mais rostral da 

raiz, com contaminação no 

cerebelo e em VCP

injeção na parte mais medial da 

raiz, traçador extravasou para o 

líquido encéfaloraquidiano e 

contaminou o nervo facial. Além 

de contaminação em VCA e 

pouca contaminação no 

cerebelo.

muita contaminação no 

cerebelo e no flóculo, formando 

um trato no trajeto da 

micropipeta. Muita 

contaminação em VCA e VCP, e 

no nervo facial

muita contaminação no flóculo 

do cerebelo e em VCA e VCP 

(parte mais anterior), além da 

contaminação na parte mais 

superficial do cerebelo

núcleo pontino (Pn) (+++) contralateral (+++) contralateral (++++) bilateral (+++) bilateral

núcleo prepósito (Pr) (++) bilateral (++) bilateral

núcleo lateral superior da oliva (LSO) (+++) ipsilateral (+++) ipsilateral (++++) bilateral (++++) bilateral (+++) bilateral

nucleo ventral do corpo trapezoide (VNTB = MVPO + 

LVPO)
(++++) bilateral (++++) blateral (++++) bilateral (++++) bilateral (++++) bilateral

células adrenérgicas A5 (A5) (+++) ipsilateral (+++) ipsilateral (++++) ipsilateral (++++) ipsilateral (+++) ipsilateral

núcleo medial do corpo trapezóide (MNTB ou Tz) (++) ipsilateral (+++) ipsilateral (++++) ipsilateral (++++) bilateral

região periolivar (++) bilateral (++) ipsilateral (++) ipsilateral

núcleo superior paraolivar (SPON) (++) ipsilateral

núcleo medial da oliva (MSO) (+) ipsilateral

núcleo eferente vestibular (Eve) (++++) bilateral (++++) bilateral (++++) bilateral (++++) bilateral (++++) bilateral

núcleo coclear ventral posterior (VCP) (++++) ipsilateral (++++) ipsilateral (+++) ipsilateral (++++) ipsilateral (++++) bilateral

núcleo coclear ventral anterior (VCA) (+++) ipsilateral (++++) ipsilateral (++++) ipsilateral (+++) ipsilateral

núcleo coclear dorsal (DC) (++) ipsilateral (++) ipsilateral (++++) bilateral (++++) bilateral

sub coeruleus (SuBC) (+++) contralateral (+++) contralateral (++) bilateral (++) contralateral

locus coeruleus (LC) (++) contralateral (++) bilateral (+++) bilateral (++) bilateral

giganto celular lateral (LPGi) (+) ipsilateral (++) bilateral *Gi (+) contralat. (++) bilateral (+++) bilateral

núcleo olivar inferior (IOn) (+) contralateral (++++) contralateral (++++) contralateral

núcleo reticular parvicelular (PCRt) (++) ipsilateral (+++) bilateral (+++) ipsilateral (+++) bilateral (++) bilateral

núcleo reticular intermédio (IRt) (++) bilateral (+++) bilateral (+++) bilateral (+++) bilateral (++) ipsilateral

núcleo vestibular lateral (Lve) (++) ipsilateral (+++) ipsilateral

núcleo vestibular espinal (SpVe ) (+++) fraca ipsilateral (++++) ipsilateral (++++) ipsilateral (+) ipsilateral

núcleo vestibular medial parte magnocelular (MVeMC) (++++) fraca ipsilateral (++++) ipsilateral (++++) ipsilateral (++) bilateral

núcleo vestibular medial parte parvicelular (MVePC) (+++) ipsilateral (+++) ipsilateral (++) ipsilateral (++) bilateral
núcleo central do colículo inferior (CIC) (+++) bilateral (+++) bilateral (++++) bilateral (+++) bilateral

nucleo trigeminal espinal interpolar (Sp5I) (+) ipsilateral (+++) ipsilateral (++) ipsilateral

núcleo ventrolateral principal do trigêmio (Pr5VL) (+) ipsilateral (++) contralateral

núcleo reticular lateral (LRt) (+) ipsilateral (++++) bilateral (++) bilateral

núcleo cuneiforme (Cu) *Ecu - (++) ipsilateral (++) ipsilateral (++) bilateral (++) ipsilateral

núcleo grácil (Gr) (+) contralateral (++) bilateral (+++) contralateral

núcleo motor do nervo facial (mot7) (+++) fraca ipsilateral (+++) fraca ipsilateral (++) ipsilateral

zona perifacial (++) fraca ipsilateral

córtex auditivo primário (Au1)

núcleo dorsal da rafe ventral (DRV)

núcleo paralemniscal ventral (PLV) (+) ipsilateral

substancia cinzenta periaquedutal (PAG) (++) ipsilateral (+) bilateral

núcleo reticular medular parte dorsal (MdD) (+) ipsilateral

núcleo pontino reticulotegmental (RTTg) (++++) bilateral (++++) bilateral

núcleo paratrigeminal (Pa5) (++) ipsilateral

núcleo para-abducente (Pa6) (++) bilateral

núcleo motor do trigêmio tensor do tímpano (5TT) (++) ipsilateral (++) bilateral

núcleo de Roller (Ro) (++) bilateral

legenda: verde: aferências consistentes a raiz coclear

1-2 perfis neuronais ( + ) vermelho: aferências provavelmente originadas por contaminação no cerebelo

3-8 perfis neuronais ( ++ ) azul: aferências provavelmente originadas por contaminação nos núcleos cocleares

9-14 perfis neuronais ( +++ ) laranja :aferências provavelmente originadas por contaminação no nervo facial

mais de 15 perfis neuronais ( ++++ )



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FIGURA 13 – Representação esquemática do mapeamento dos perfis neuronais 
retrogradamente marcados com FG após a injeção na CR do caso experimental N15 desde o 
nível I.A. -5,76 a I.A. -1,44. Os perfis neuronais estão representados pelos círculos pretos. Os 
esquemas foram confeccionados com base nos desenhos de Paxinos e Watson (2005). As 
setas de orientação e a barra de calibração são válidas para todos os esquemas. 

 



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FIGURA 14 – Representação esquemática do mapeamento dos perfis neuronais 
retrogradamente marcados com FG após a injeção na CR do caso experimental N15 desde o 
nível I.A. -1,32 a I.A. +0,24. Os perfis neuronais estão representados pelos círculos pretos. Os 
esquemas foram confeccionados com base nos desenhos de Paxinos e Watson (2005). As 
setas de orientação e a barra de calibração são válidas para todos os esquemas. 



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FIGURA 15 – Fotomicrografias dos núcleos com perfis neuronais retrogradamente marcados 
após a injeção de FG na CR. Em A o núcleo EVe do caso N15, com a área em destaque 
representada em B. Em C o núcleo LC do caso N17, com a área em destaque representada em 
D. Em E o núcleo SubC do caso N17, com a área em destaque representada em F. Em G o 
núcleo DRV do caso N17, com a área em destaque representada em H. 



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FIGURA 16 – Fotomicrografias dos núcleos com perfis neuronais retrogradamente marcados 
após a injeção de FG na CR. Em A o núcleo Cu do caso N17, cuja área em destaque está 
representada em B. Em C o núcleo LPGi do caso N17, cuja área em destaque está 
representada em D. Em E o núcleo CIC do caso N13, cuja área em destaque esta representada 
em F. Em G o núcleo SpVe do caso N17, cuja área em destaque está representada em H 



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FIGURA 17 – Fotomicrografias dos núcleos com perfis neuronais retrogradamente marcados 
após a injeção de FG na CR. Em A o núcleo IRT e A5 do caso N13 com as áreas em destaque 
representadas em B e C. Em D o núcleo LSO e MNTB do caso N13, com as áreas em destaque 
representadas em E e F. Em G o núcleo VNTB do caso N18 com a área em destaque 
representada em G. 



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FIGURA 18 – Fotomicrografias dos núcleos com perfis neuronais retrogradamente marcados 
após a injeção de FG na CR. Em A o núcleo VCA do caso N30, com a área em destaque 
representada em B. Em C o núcleo VCP do caso N15, com a área em destaque representada 
em D. Em E o núcleo DCN do caso N17 com a área em destaque representada em F e em G o 
núcleo Pn do caso N74, com a área em destaque representada em H. 



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5. DISCUSSÃO 

Após análise dos resultados e pesquisa bibliográfica, comparamos as informações obtidas em 

nossos experimentos com estudos prévios com intuito de melhor interpreta-las e com isto eliminar 

possíveis aferências originadas devido a difusão de traçador fora da CR. Os núcleos identificados 

como aferências consistentes aos CRN foram representados esquematicamente na Figura 19. 

 

FIGURA 19 – Representação esquemática dos núcleos identificados como aferências consistentes 
aos CRN neste trabalho 

 

Na maioria dos casos analisados observamos marcação no VC e especulamos que pode ser 

devida a 4 possíveis situações. Aferências diretas do VC aos CRN. Contaminação no VC por depósito 

de neurotraçador no trajeto da micropipeta em direção à CR, o que gera marcações em núcleos 

aferentes ao VCN como: o CIC (bilateralmente) dado que este núcleo inerva o VC (HUFFMAN e 

HENSON, 1990), no Au1 (WEEDMAN et al., 1996; WEEDMAN e RYUGO, 1996a;1996b) e no DC, o qual 

possui conexão recíproca com o VC (HARRISON, J. M. e FELDMAN, 1970) Contaminação do corpo 

trapezoide (tz), devido a eferências do próprio VC ((HARRISON, J. M. e FELDMAN, 1970), o que 

também resulta em marcação no IC ipsilateral (FAYE-LUND, 1986). Contaminação por halo de difusão 



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gerado a partir da dispersão do neurotraçador depositado na CR, o que não é capaz de gerar 

marcação em núcleos com aferência ao VC.  

Nos estudos de Li et al. (1998) foi evidenciado que o IC é responsável pelo processamento da 

informação acústica e pela localização da fonte sonora. Acreditamos ainda que este núcleo possa 

influenciar a atividade dos CRN de maneira indireta, pois, o IC faz conexão com os neurônios do 

VNTB (GOMEZ-NIETO et al., 2008b), e a via IC-VNTB-CRNs teria um papel importante na modulação 

do RAS 

Nossos resultados evidenciaram que o VNTB inerva os neurônios da CR, o que corrobora com 

os estudos de Gómez-Nieto (2008b), os quais indicam a existência de uma projeção direta bilateral, 

porém majoritariamente contralateral, do VNTB para o núcleo da CR além da presença de receptores 

muscarínicos M2 e M4 no corpo celular e dendritos. Sabendo-se que a identidade neuroquímica do 

VNTB é colinérgica, há a possibilidade deste núcleo ser um dos moduladores do RAS, dado que a 

inibição da neurotransmissão glutamatérgica por fibras colinérgicas foi demonstrada em outras áreas 

do cérebro (BUNO et al., 2006). Da mesma maneira, os terminais colinérgicos do VNTB podem 

regular a força da transmissão sináptica glutamatérgica dos CRNs ao PnC (NODAL e LÓPEZ, 2003). 

Também não podemos descartar a possível contaminação do feixe olivococlear medial e 

lateral no momento da injeção do neurotraçador na CR, o que poderia gerar marcação nos núcleos 

do sistema olivococlear, tanto medial, quanto lateral. Os neurônios do sistema olivococlear medial 

(MOC) estão localizadas no VNTB e projetam principalmente à cóclea contralateral, enquanto que os 

neurônios do sistema olivococlear lateral (LOC) estão localizados no LSO e região periolivar (concha) 

e projetam à cóclea ipsilateral (VETTER e MUGNAINI, 1992; WARR, 1992). Para diferenciação das 

projeções ao CRN desta marcação, é necessária uma análise morfométrica dos neurônios marcados, 

dado que os neurônios do MOC possuem geralmente um corpo grande, com formato estrelado ou 

triangular. 

Também foram verificadas marcações majoritariamente na parte medial do LSO, o qual possui 

um importante papel na via auditiva relacionado com a localização sonora (HARNISCHFEGER et al., 

1985). O núcleo LSO é constituído de neurônios multipolares formando um S tonotopicamente 

organizado, com baixas frequências representadas lateralmente e altas frequências representadas 

medialmente (RIETZEL e FRIAUF, 1998), o que o torna um importante componente da via auditiva no 

que se trata da localização da fonte sonora, podendo modular a via essencial do RAS. Ainda não 

foram comprovadas suas aferências para os CRN, porém, já se sabe de sua inervação diferencial para 

outras estruturas do tronco encefálico, tais como os IC, para os quais há uma projeção bilateral, 

sendo a ipsilateral glicinérgica (inibitória) e a contralateral glutamatérgica (excitatória) (SAINT MARIE 



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et al., 1989). Portanto, ainda são necessários mais estudos sobre o LSO para identificação de suas 

aferências e identidades neuroquímicas para melhor associação com o RAS.  

A inibição do LSO pelo MNTB é necessária para o processamento das diferenças interaurais de 

intensidade, essencial para a localização da fonte sonora (MALMIERCA e MERCHÁN, 2004). Durante 

muitos anos, o MNTB tem sido considerado como um centro de retransmissão passiva, convertendo 

aferências excitatórias provenientes do VCN em eferências inibitórias ao LSO (KOPP-SCHEINPFLUG et 

al., 2008). Marcações encontradas neste núcleo nos sugere que o MNTB possa ser uma fonte 

glicinérgica de projeção ipsilateral ao CRN, dado que em estudos realizados por Gómez-Nieto et al 

(2008a) demonstraram a presença de botões com esta mesma característica neuroquímica no corpo 

celular e dendritos do CRN. No entanto estudos prévios de conectividade do MNTB (THOMPSON e 

SCHOFIELD, 2000) não descreveram conexões com os CRN 

Foi verificada também marcação no LC. Este núcleo é a maior fonte de norepinefrina (GOMEZ-

NIETO et al., 2008a) no cérebro do rato e inerva diversas áreas encefálicas, entre elas os CRN, 

podendo indicar uma possível fonte de modulação noradrenérgica do sobressalto. Além do LC, 

também foi verificada, em uma porção mais rostral do encéfalo, do lado contralateral ao sitio de 

injeção, uma leve marcação no SubC, que também possui identidade neuroquímica noradrenérgica 

(TSURUOKA et al., 2010). Estudos recentes demonstraram que o LC e o SubC estão relacionados ao 

reflexo de sobressalto desencadeado por estímulo tátil, influenciando na duração do tempo em que 

o rato mantém uma postura imóvel (freezing) após a apresentação do estímulo, durante o qual o 

rato provavelmente foca sua atenção no julgamento da situação, dessa forma, informação sensorial 

desnecessária pode ser descartada para extrair outras informações sensoriais essenciais para a 

sobrevivência do animal (TSURUOKA et al., 2011)  

O RAS também possui um componente do sistema nervoso autônomo, neste contexto, nossos 

resultados indicam a presença de os neurônios retrogradamente marcados no A5, o qual está 

relacionado com a regulação cardiovascular do baroreflexo, além de ser fonte noradrenérgica para o 

VC como descrito por Byrum e Guyenet (1987). Isto pode indicar que o núcleo A5 tem papel 

importante na regulação autonômica do reflexo, pois estudos recentes também concluíram que o A5 

serve de conexão entre a medula caudal ventrolateral e a medula espinal (COBOS et al., 2003), o que 

demonstra um caminho pelo qual a medula caudal ventrolateral exerce efeito sobre a pressão 

sanguínea e a função respiratória. Estes dados demonstram que o A5 possui uma função análoga à 

do LC, o qual inerva vastas áreas do encéfalo relacionadas com a integração sensóriomotora. Isto 

sugere que os dois grupos noradrenérgicos representam duas partes de um único sistema funcional, 

influenciando porções diferentes do encéfalo (BYRUM e GUYENET, 1987) que entretanto atuariam de 

maneira complementar sobre os CRN.   



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A possível contaminação no trajeto da micropipeta através do cerebelo em direção à CR pode 

ter originado algumas marcações em núcleos aferentes ao córtex cerebelar e ao paraflóculo, tais 

como: o Pn (MIHAILOFF, 1994), cuja projeção se dá através do pedúnculo cerebelar médio a uma 

extensa camada de células granulares do córtex cerebelar e ao paraflóculo principalmente 

contralateral; o SpVe, o qual projeta através de fibras vestibulocerebelares ao córtex cerebelar 

ipsilateral (BARMACK, 2003); o IOn, o qual envia projeções olivocerebelares ao córtex cerebelar 

(BRODAL, A. et al., 1980; DESCLIN, 1974); o MVe, tanto magnocelular, quanto parvocelular, que por 

sua vez possui uma projeção bilateral e recíproca com o verme caudal e o núcleo medial do cerebelo 

(VOOGD et al., 1996); McCrea and Horn (2006) também demonstraram uma projeção bilateral do Pr, 

parte magnocelular, ao cerebelo; também foi demonstrado uma fonte de aferências ao cerebelo 

derivadas da medula: o núcleo cuneiforme acessório (ECu) (ALISKY e TOLBERT, 1997), no qual 

também verificamos marcação. O LRt representa uma importante fonte de fibras ao córtex 

cerebelar, passando através do pedúnculo cerebelar inferior (icp) e terminando na camada de células 

granulares (BRODAL, P., 1975). Foram observadas poucas, mas consistentes marcações no Sp5I, o 

qual, de acordo com vários autores, também projeta ao cerebelo (WATSON e SWITZER, 1978). Outros 

núcleos observados com marcação retrógrada que são de origem possivelmente da contaminação no 

cerebelo são: Pr5VL (WATSON e SWITZER, 1978); RTTg (GERRITS e VOOGD, 1987); e MdD (LEITE-

ALMEIDA et al., 2006). Além destes núcleos, marcações retrógradas observadas no EVe, também 

podem ser de origem da contaminação cerebelar peo neurotraçador, uma vez que este núcleo 

projeta bilateralmente ao flóculo do cerebelo (SHINDER et al., 2001). 

Em alguns casos foram observados perfis neuronais fracamente marcados ipsilaterais no Mot7 

e na zona perifacial, que podem ser causadas por contaminação do nervo facial devido à proximidade 

anatômica ao VIII par, dado que ambos compartilham espaço no meato acústico interno, e aos 

ocasionais extravasamentos de traçador no líquor.  

Para confirmar as aferências consistentes aos CRN descritas neste trabalho serão necessários 

estudos de controle com traçadores anterógrados nestes núcleos. Estes experimentos fogem do 

escopo deste trabalho de conclusão de curso embora já estejam em andamento no laboratório e 

alguns resultados preliminares serão apresentados no capítulo de perspectivas futuras. Desta forma 

este trabalho foi fundamental para discernir quais núcleos deverão receber as injeções de traçador 

anterógrado, o que permitirá também a identificação neuroquímica destas aferências.  



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6. PERSPECTIVAS FUTURAS 

 

Ainda não há conhecimento da origem das aferências responsáveis pela inervação gabaérgica 

aos CRN, embora tenham sido observados receptores de GABA na CR (GOMEZ-NIETO et al., 2008a) e 

botões sinápticos gabaérgicos na superfície somática e nos dendritos dos CRNs (OSEN et al., 1991). 

Por outro lado, também foram encontrados receptores de glicina na CR e botões sinápticos 

glicinérgicos na superfície somática dos CRNs (OSEN et al., 1991). Com o intuito de buscar as fontes 

de inervação gabaérgica queremos realizar novos experimentos de co-localização de neurônios 

retrogradamente marcados com FG e enzimas precursoras da síntese de GABA  

No intuito de confirmar as aferências do A5 verificadas após injeção de neurotraçador 

retrógrado na raiz, foram realizados experimentos de injeção estereotáxica de neurotraçador 

anterógrado neste núcleo. O neurotraçador utilizado foi o dextrano amino biotinilado (BDA, 

MolecularProbes # D-1956, PM 10.000), a uma concentração de 10% em soro fisiológico. Este 

neurotraçador é essencialmente anterógrado, portanto é captado pelos somas e dendritos dos 

neurônios e transportado por seus axônios até as terminações axonais onde se acumula. Para tal, 

usamos como referencia para determinação das coordenadas o atlas estereotáxico paxinos (2005), 

com o qual obtivemos as seguintes coordenadas: no eixo ântero-posterior, 1,9 mm caudal em 

relação à linha interaural; no eixo látero-lateral, 2,5mm em direção ao lado esquerdo; no eixo 

dorsoventral, 0,1mm inferiormente à linha interaural. 

 Como resultados prévios, observamos, fibras e botões sinápticos marcados com o 

neurotraçador na região da CR. Além disso, foram realizados experimentos de co-localização nos 

casos de injeção de FG na CR, onde foram encontrados neurônios retrogradamente marcados na 

região do A5, para verificar se estes também eram imunorreativos para a enzima dopamina beta 

hidroxilase (DBH), enzima que participa especificamente da síntese de noradrenalina e adrenalina. 

Após processamento imunoistoquímico para observação em fluorescência de DBH e FG, foi possível 

estudar se havia co-localização de ambas as marcações. Observou-se que na região do A5 alguns 

neurônios estavam duplamente marcados, indicando que inervam os CRN e possuem como 

identidade neuroquímica a noradrenalina (Figura 20). Além disso, verificamos que muitos neurônios 

marcados com FG não apresentavam imunoreatividade para DBH, portanto, sua identidade 

neuroquímica ainda precisa ser investigada. 



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500 m 

TH

FG

200 m

FG

DBH

 

 

 

 

Além disso, realizamos procedimentos de injeção de BDA em VNTB, no intuito de confirmar as 

projeções deste núcleo aos CRNs, observadas no caso de injeção de neurotraçador retrógrado na 

região dos CRN (Figuras 21 e 22). Para tal, usamos como referência para determinação das 

coordenadas o atlas estereotáxico paxinos (2005), com o qual obtivemos as seguintes coordenadas: 

no eixo ântero-posterior, 0,78 mm caudal em relação à linha interaural; no eixo látero-lateral, 2,3mm 

em direção ao lado esquerdo; no eixo dorsoventral, 0,4mm inferiormente à linha interaural, e ângulo 

de 20o em direção caudal. 

Os sítios de injeção observados foram satisfatórios, uma vez que se localizaram em diferentes 

porções do VNTB. No caso N91 é possível observar que a injeção se localizou na porção mais medial 

do VNTB, com contaminação do tz. No caso N93, o sitio de injeção se localizou na parte mais lateral 

do VNTB, com pouca contaminação do LSO e contaminação do tz. Já no caso N93, o sitio de injeção 

também se localizou na parte mais lateral do VNTB, porém é possível observar a presença de um 

trato no trajeto da micropipeta, que se estende desde a parte mais lateral do núcleo motor do 

trigêmio até o VNTB, além da grande contaminação no corpo trapezoide. No caso N96, também é 

possível verificar a presença de trato, com o sitio de injeção localizado na parte mais lateral do VNTB, 

com contaminação do tz e do LSO. No caso N97, a injeção se localizou na parte mais medial e ventral 

FIGURA 20 - Identificação das aferências noradrenérgicas da região do A5 aos CRN 
Fotomicrografias da região do A5, marcado após injeção de FG na raiz coclear, com reação 
imunohistoquímica para detecção tirosina hidroxilase (TH) e, Dopamina Beta Hidroxilase (DBH). 

 



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do VNTB, com contaminação do tz. Já no caso N101, a injeção se localizou na parte mais lateral e 

rostral do VNTB, com pouca contaminação do tz.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

FIGURA 21 - Fotomicrografias do sitio de injeção de BDA em VNTB à esquerda e respectiva 
representação esquemática à direita. Em A, B e C estão representados o sitio de injeção de uma 
série de cada caso após revelação para BDA e contracoradas em Nissl. Em A, esta representado o 
caso N91. Em B, o caso N93 e em C, o caso N95. 

 



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Após revelação do neurotraçador BDA, realizamos uma imunohistoquímica para calbindina, no 

intuito de observar as projeções do VNTB aos CRN, dado que estes neurônios contém uma grande 

quantidade desta proteína ligadora de cálcio (LÓPEZ et al., 1993). Como resultados preliminares, 

confirmamos as projeções já demonstradas por Gómez-Nieto (2008b) e estabelecemos os 

parâmetros para realização de lesões seletivas no VNTB para pesquisar seu papel funcional no RAS e 

na inibição por estímulo prévio (PPI) (Figura 23) 

FIGURA 22 - Fotomicrografias do sitio de injeção de BDA em VNTB à esquerda e respectiva 
representação esquemática à direita. Em A, B e C estão representados o sitio de injeção de uma 
série de cada caso após revelação para BDA e contracoradas em Nissl. Em A, esta representado 
o caso N96. Em B, o caso N97 e em C, o caso N101. 

 



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.  

 

 

 

 

Futuramente, após estabelecimento das coordenadas para VNTB, cogitamos realizar análises 

morfométricas para discriminar os neurônios do sistema olivococlear medial dos neurônios do VNTB 

que projetam aos CRN (Figura 24).  

FIGURA 23 – Fotomicrografias da raiz coclear após injeção de BDA em VNTB e 
imunohistoquímica para calbindina. Em A, uma fotomicrografia da RC esquerda do caso N96, 
com 3 regiões destacadas, que são representadas em B, C e D com maior aumento. Em B, C 
e D fotomicrografias evidenciando a presença de aposições sinápticas entre os botões 
sinápticos corados em preto pela revelação do BDA e os perfis neuronais e dendritos dos CRN 
corados em marrom pela revelação da calbindina. 

 



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Além disso, visamos realizar experimentos de lesão neurotóxica deste núcleo, através de 

injeção de um neurotóxico específico para neurônios colinérgicos, a 192-IgG Saporina (BOTLY e DE 

ROSA, 2009), e posterior análise comportamental, para avaliar a influência deste núcleo em uma das 

modulações mais interessantes do reflexo acústico de sobressalto: a PPI. 

FIGURA 24 – Fotomicrografia e esquema do sistema olivococlear. Em A, uma 
fotomicrografia do complexo olivar superior, com os neurônios pertencentes aos sistemas 
MOC e LOC indicados pelas setas. Em B, um esquema das projeções destes neurônios 
para as cócleas (BROWN, M. C., 2011)  



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