RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta tese será disponibilizado somente a partir de 05/02/2022. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA TRANSPLANTE DE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS ALOGÊNICAS EM CÃES COM MENINGOENCEFALOMIELITE DE ORIGEM DESCONHECIDA Giovana Boff Sánchez Botucatu - SP 2021 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA TRANSPLANTE DE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS ALOGÊNICAS EM CÃES COM MENINGOENCEFALOMIELITE DE ORIGEM DESCONHECIDA Giovana Boff Sánchez Tese apresentada junto ao Programa de Pós-graduação em Medicina Veterinária para obtenção do título de Doutor. Orientador: Prof. Dr. Rogério Martins Amorim Botucatu - SP 2021 Palavras-chave: Doenças autoimunes desmielinizantes do SNC; Intratecal; Meningoencefalite; Neuroimunomodulação; Terapia celular. Sánchez, Giovana Boff. Transplante de células-tronco mesenquimais alogênicas em cães com meningoencefalomielite de origem desconhecida / Giovana Boff Sánchez. - Botucatu, 2021 Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia Orientador: Rogério Martins Amorim Capes: 50501062 1. Cães - Doenças. 2. Transplante de células-tronco mesenquimais. 3. Doenças autoimunes. 4. Meningoencefalite. 5. Neuroimunomodulação. DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CÂMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE-CRB 8/5651 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORM. iii Nome do Autor: Giovana Boff Sánchez Título: TRANSPLANTE DE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS ALOGÊNICAS EM CÃES COM MENINGOENCEFALOMIELITE DE ORIGEM DESCONHECIDA Prof. Dr. Rogério Martins Amorim Presidente e Orientador Departamento de Clínica Veterinária, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia - UNESP/Botucatu. Profª. Drª Elenice Deffune Membro Laboratório de Engenharia Celular do Hemocentro de Botucatu. Departamento de Urologia, Faculdade de Medicina - UNESP/Botucatu. Profª. Dra Ana Liz Garcia Alves Membro Departamento de Cirurgia Veterinária e Reprodução Animal, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia - UNESP/Botucatu. Prof. Dr. Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira Membro Departamento de Biologia Estrutural e Funcional, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas. Prof. Dr Jose Ademar Villanova Junior Membro Programa de Pós-graduação em Ciência Animal, Pontifícia Universidade Católica do Paraná, Escola de Ciências da Vida. Data da Defesa: 05/02/2021. iv AGRADECIMENTOS À minha família, meus pais Eliana Boff e Celso Araujo Pinto, meu irmão Gabriel Boff Araujo Pinto e meus avós Wanda Boff e Mario João Boff pelo afeto incondicional e apoio constante em todos os momentos da minha vida. Ao meu marido, amigo e colega de trabalho Diego Noé Rodríguez Sánchez por seu afeto, apoio e colaboração e nesta jornada. Ao meu orientador, Prof. Dr. Rogério Martins Amorim pela orientação, ensinamentos, incentivo e confiança. À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo-FAPESP pelo apoio financeiro com a bolsa de Doutorado (Processo 2018/3101-8). À Profa. Dra. Elenice Deffune pela contribuição intelectual e por ceder as instalações do seu laboratório para a realização das análises in vitro. À Dra. Majorie de A. Golim e Alline Márcia M. Braz pela contribuição nas análises imunofenotípicas. Às assistentes de suporte acadêmico/UNIPEX Vickeline N. Androcioli e Ana Paula D. P. da Cruz por auxiliarem nas etapas de cultivo celular e aos técnicos Thiago-FOB-Bauru por colaborar com as análises multiplexadas e Heraldo André Catalan pela realização das imagens de Ressonância Magnética dos cães. À Profa. Dra. Clélia Akiko Hiruma Lima e por ceder as instalações e equipamentos do seu laboratório e aos seus orientados Maycon T. E. Silva e Vinicius P. Rodrigues pelo auxílio nas análises in vitro. Aos colegas Mariana Cristina Ramos, Felipe Sanchez, Ana Lívia Bovolato e César P. C. Lobo e aos residentes do Hospital Veterinário de Pequenos Animais da FMVZ pela colaboração em diferentes etapas deste trabalho. A todos professores, funcionários, colegas e amigos do laboratório de engenharia celular-LEC, da unidade de pesquisa experimental- UNIPEX e do Serviço de Neurologia da FMVZ-UNESP que contribuíram para o desenvolvimento deste estudo. Aos tutores dos cães participantes que acreditaram neste estudo permitindo a sua realização. À FMVZ-UNESP-Botucatu pela possibilidade de realizar a este Curso de pós- graduação e por ceder suas instalações e serviços para que esse trabalho pudesse ser realizado. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001. v LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS 40d Momento experimental 40 dias pós-tratamento/transplante 80d Momento experimental 80 dias pós-tratamento/transplante ACZ Acetazolamida Ad-MSCs Células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo, do inglês adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells ALT Alanino aminotransferase anti-GFAP Anticorpos contra proteína ácida fibrilar glial, do inglês anti- glial fibrillary acidic protein APCs Células apresentadoras de antígeno, do inglês antigen presenting cells Ara-C Citarabina ou arabinosídeo de citosina, do inglês arabinoside cytosine AZA Azatioprina BDNF Fator neurotrófico derivado do cérebro, do inglês brain-derived neurotrophic factor BHE Barreira hematoencefálica BM-MSCs Células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea, do inglês bone marrow mesenchymal stromal/stem cells C1-C5, C6-T2, T3-L3 Segmentos medulares C1-C5, C6-T2, T3-L3 CB Cérebro CD Grupamento de diferenciação, do inglês cluster of differentiation CD (cél.) Células dendríticas/dendritic cells (DC) CL Cerebelo cMSC (grupo) Grupo experimental de cães tratado com células-tronco mesenquimais alogênicas do tecido adiposo COX-1, 2 Ciclo-oxigenase 1, 2 (enzima) CTCN Contagem total de células nucleadas do líquido cefalorraquidiano CTL Linfócitos T citotóxicos, do inglês cytotoxic T lymphocytes DBPS Dulbecco's phosphate-buffered saline DLA-II Antígeno leucocitário canino de classe II, do inglês dog leukocyte antigen class II DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium DMTs Terapias modificadoras de doença, do inglês modifying therapies disease vi E Estimação do número de eritrócitos ou concentração de proteínas do líquido cefalorraquidiano EAE Encefalomielite autoimune experimental, do inglês experimental autoimmune encephalomyelitis ECB Esclerose concêntrica de Baló EDM Presença de edema perilesional nas imagens de ressonância magnética EDSS Escala expandida do estado de incapacidade, do inglês expanded disability status scale EFM Presença de efeito de massa nas imagens de ressonância magnética ELISA Ensaio de imunoadsorção enzimática, do inglês enzyme linked immuno sorbent assay EM Esclerose múltipla EMDA Encefalomielite disseminada aguda EMPP Esclerose múltipla primária progressiva EMPR Esclerose múltipla progressiva recorrente EMRR Esclerose múltipla remitente recorrente EMSP Esclerose múltipla secundária progressiva ER Número de eritrócitos no líquido cefalorraquidiano e hemograma EROS Espécies reativas de oxigênio/reactive oxygen species (ROS) FA Fosfatase alcalina FLAIR Sequência de recuperação de inversão atenuada por fluido, do inglês fluid attenuation inversion recovery FM Herniação no forame magno nas imagens de ressonância magnética FURO Furosemida GABAP Gabapentina GAPDH Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, do inglês glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase GDNF Fator neurotrófico derivado da glia, do inglês glial cell line-derived neurotrophic factor GFAP Proteína ácida fibrilar glial, do inglês glial fibrillary acidic protein GM-CSF Fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos, do inglês granulocyte macrophage colony-stimulating factor HER Presença de herniaçãonas imagens de ressonância magnética HGF Fator de crescimento de hepatócitos, do inglês hepatocyte growth factor vii HIPER Hiperintensidade na sequência estudada nas imagens de ressonância magnética HIPO Hipointensidade na sequência estudada nas imagens de ressonância magnética HLA-II Antígeno leucocitário humano de classe II, do inglês human leukocyte antigen class II HO Hemoxigenase, do inglês hemoxygenase HPRT Hipoxantina-guanina fosforiboxiltransferase, do inglês hypoxanthine- guanine phosphoribosyltransferase IA (via) Via intra-arterial IDO Indoleamina 2,3- dioxigenase, do inglês indoleamine 2 3-dioxygenase IFN- Interferon beta IFN-γ Interferon gama Ig Imunoglobulina IL Interleucina IL7R Receptor da interleucina -7, do inglês interleukin-7 receptor INF Líquido cefalorraquidiano inflamatório IP (via) Via intra-parenquimatosa ISCT Sociedade Internacional para Terapia Celular, do inglês International Society for Cellular Therapy ISO Isointensidade na sequência estudada nas imagens de ressonância magnética IT (via) Via intratecal IV (via) Via intravenosa KBr Brometo de potássio LCR Líquido cefalorraquidiano LEN Leucoencefalite necrosante, do inglês necrotizing leucoencephalitis LEV Levetiracetam M Momento experimental correspondente ao estudo in vivo M1 Macrófagos/micróglia anti-inflamatórios M2 Macrófagos/micróglia pró-inflamatórios MARE Meningite-arterite responsiva a esteroides MCP-1 Proteína quimioatraente de monócitos-1, do inglês monocyte chemoattractant protein-1 viii ME Meningoencefalite eosinofílica MEG Meningoencefalomielite granulomatosa MEN Meningoencefalite necrosante MERT Escala de Resposta ao Tratamento para Cães com MUO MHC-I Complexo principal de histocompatibilidade tipo I, do inglês major histocompatibility complex type I MHC-II Complexo principal de histocompatibilidade tipo II, do inglês major histocompatibility complex type II MSCs Células-tronco mesenquimais, do inglês mesenchymal stem cells MUO Meningoencefalomielite de origem desconhecida, do inglês meningoencephalomyelitis of unknown origin N-INF Líquido cefalorraquidiano não-inflamatório N/a Não se aplica N° LES Número de lesões no(s) segmento(s) das imagens de ressonância magnética NK (células) Células natural killer, do inglês natural killer cells NL Neurolocalização das lesões nas imagens de ressonância magnética OME Omeprazol ON Óxido nítrico (NO)/nitric oxide (ON) P0, P1-P3 Passagem das MSCs após o isolamento (passagem zero, 1-3) PAC (grupo) Grupo experimental de cães tratados com protocolo de citarabina e prednisona PB Fenobarbital, do inglês phenobarbital PGE2 Prostaglandina E2, do inglês prostaglandin E2 PMSCs Células-tronco mesenquimais derivadas da placenta, do inglês placental- derived mesenchymal stromal/stem cells PRAZ Prazozina Pré Momento experimental pré-transplante do estudo in vivo PRED Prednisona PT Dosagem de proteínas totais do líquido cefalorraquidiano PTGES2 Prostaglandina-endoperoxidase sintase 2, do inglês prostaglandin endoperoxide synthase-2 qPCR Reação de polimerização em cadeia em tempo real quantitativa, do inglês real-time quantitative polymerase chain reaction ix RAN Ranitidina RM Ressonância magnética RPS19 Proteína ribossomal S19 RPS5 Proteína ribossomal S5 SC (via) Via subcutânea SCF Sucralfato SFAL Herniação no subfalcina nas imagens de ressonância magnética SNC Sistema nervoso central T1-W Sequência de tempo ponderado em T1, do inglês T1-weighted sequence T1-W C+ Captação de contraste intravenoso na sequência de tempo ponderado em T1 T2-W Sequência de tempo ponderado em T2, do inglês T2-weighted sequence TAL Tálamo TAL-C Tálamo-cortical TD Tempo desde os sinais clínicos serem notados pela primeira vez pelo tutor até o diagnóstico do animal TE Tronco encefálico TGF-β Fator de transformação do crescimento beta, do inglês transforming growth factor beta Th Linfócitos T auxiliares, do inglês T helper cells TNF-α Fator de necrose tumoral alfa, do inglês tumor necrosis factor alpha TRD Tramadol Treg Linfócitos T regulatórios, do inglês regulatory T cells V/H Presença de hidrocefalia ou ventriculomegalia nas imagens de ressonância magnética VEGF Fator de crescimento endotelial vascular, do inglês vascular endothelial growth factor VO (via) Via oral x LISTA DE QUADROS QUADRO 1. Predisposições dos subtipos histopatológicos da MUO. .......................... 23 QUADRO 2. Iniciadores utilizados nas reações de qPCR. ............................................ 47 QUADRO 3. Condições de termociclagem das amplificações por qPCR. .................... 47 QUADRO 4. Via de transplante de Ad-MSCs utilizada nos cães do grupo cMSC. ...... 53 QUADRO 5. Escala de Ressonância Magnética para Cães com MUO (ERM). ........... 57 QUADRO 6. Escala de Resposta ao Tratamento para Cães com MUO (MERT). ........ 59 QUADRO 7. Resultados da Escala EDN dos grupos PAC e cMSC. ............................ 78 QUADRO 8. Resultados da Escala ERM dos grupos PAC e cMSC. ............................ 82 QUADRO 9. Avaliação da resposta ao tratamento dos grupos PAC e cMSC pela escala MERT. ............................................................................................................................ 91 QUADRO 10. Efeitos adversos manifestados após os transplantes de Ad-MSCs no grupo cMSC. ............................................................................................................................. 92 xi LISTA DE FIGURAS FIGURA 1. Mecanismo proposto de polarização dos macrófagos/micróglias na MUO. ........................................................................................................................................ 26 FIGURA 2. Potenciais efeitos imunomoduladores das MSCs. ..................................... 31 FIGURA 3. Potenciais mecanismos das MSCs na neurodegeneração. ......................... 33 FIGURA 4. Delineamento experimental do estudo in vivo. .......................................... 51 FIGURA 5. Protocolo de imunossupressão utilizado no grupo PAC. ........................... 52 FIGURA 6. Imagem representativa do transplante de Ad-MSCs do grupo cMSC pela via intratecal.......................................................................................................................... 54 FIGURA 7. Aparência microscópica das Ad-MSCs e PMSCs caninas após isolamento. ........................................................................................................................................ 63 FIGURA 8. Caracterização imunofenotípica (A) e capacidade de diferenciação (B) das Ad-MSCs caninas. .......................................................................................................... 66 FIGURA 9. Caracterização imunofenotípica (A) e capacidade de diferenciação (B) das PMSCs caninas. .............................................................................................................. 68 FIGURA 10. Ad-MSCs (A-C) e PMSCs (D-F) caninas após a estimulação in vitro com INF-γ (B, E) e INF-γ combinado com TNF-α (C, F) e controles (A, D). ....................... 69 FIGURA 11. Expressão gênica relativa de BDNF, GDNF, HGF, IL-10, IDO, e PTGES2 após a estimulação das Ad-MSCs e PMSCs caninas com INF-γ e INF-γ combinado com TNF-α. ............................................................................................................................ 72 FIGURA 12. Perfil de secreção de GM-CSF, IL-2, IL-6, IL-8, IL-10 e MCP-1 após a estimulação das Ad-MSCs e PMSCs caninas com INF-γ e INF-γ combinado com TNF- α. ..................................................................................................................................... 74 FIGURA 13. Avaliação da recuperação funcional cães dos grupos PAC e cMSC pela Escala EDN. .................................................................................................................... 77 FIGURA 14. Avaliação neurológica dos cães 4 (A, B), 7 (C, D) e 12 (E, F) do grupo PAC, no pré-tratamento (A, C, E) e 80 dias pós-tratamento (B, D, F). .......................... 79 FIGURA 15. Avaliação neurológica dos cães 5 (A, B) e 8 (C, D) e 10 (E, F) do grupo cMSC, no pré-tratamento (A, C, E) e 80 dias pós-tratamento (B, D, F). ....................... 80 xii FIGURA 16. Imagens de RM da região cervical do cão 4 do grupo PAC no momento pré-tratamento (A-C) e 80 dias pós-tratamento (D-F), nos planos sagital (A, B, D, E) e transversal (C, F)............................................................................................................. 83 FIGURA 17. Imagens de RM do encéfalo do cão 7 do grupo PAC nos momentos pré- tratamento (A-E) e 80 dias pós-tratamento (F-J) nos planos sagital (A, F) e transversal (B, C, D, E, G, H, I, J), na sequência de tempo ponderado em T2. ................................ 84 FIGURA 18. Imagens de RM do encéfalo do cão 12 do grupo PAC nos momentos pré- tratamento (A-E) e 80 dias pós-tratamento (F-J), nos planos sagital (A, E) e transversal (B, C, D, F, G, H)............................................................................................................ 85 FIGURA 19. Imagens de RM do encéfalo do cão 5 do grupo cMSC nos momentos pré- transplante (A-D) e 80 dias pós-transplante (E-H), nos cortes sagital (A, E) e transversal (B, C, D, F, G, H)............................................................................................................ 86 FIGURA 20. Imagens de RM do encéfalo do cão 8 do grupo cMSC nos momentos pré- transplante (A-C) e 80 dias pós-transplante (D-F), no corte transversal. ....................... 87 FIGURA 21. Imagens de RM do encéfalo do cão 10 do grupo cMSC nos momentos pré- transplante (A-C) e 80 dias pós-transplante (D-F), nos cortes sagital (A, B) e transversal (B, C, D, F, G, H), na sequência tempo ponderado em T2. ............................................ 88 FIGURA 22. Análise do LCR nos momentos pré-tratamento e 80 dias pós-tratamento dos grupos PAC e cMSC. ............................................................................................... 89 FIGURA 23. Parâmetros hematológicos nos momentos pré-tratamento e aos 40 dias e 80 dias pós-tratamento dos grupos PAC e cMSC. ............................................................... 93 FIGURA 24. Parâmetros bioquímicos nos momentos pré-tratamento e aos 40 dias e 80 dias pós-tratamento dos grupos PAC e cMSC. ............................................................... 94 xiii SUMÁRIO RESUMO ............................................................................................................... xvi ABSTRACT ............................................................................................................ xvii 1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 19 2 REVISÃO DA LITERATURA..................................................................................... 23 2.1 Meningoencefalomielite de Origem Desconhecida (MUO) ............................. 23 2.1.1 Etiopatogenia e Mecanismos de Neuroinflamação e Neurodegeneração.... 24 2.1.2 Tratamento e Prognóstico ............................................................................. 28 2.2 Células Tronco Mesenquimais (MSCs)............................................................ 30 2.2.1 Potencial Terapêutico para Doenças Neuroimunes ...................................... 30 2.2.2 MSCs: Fontes de obtenção, Imunoevasão e Potencialização dos Efeitos Terapêuticos ........................................................................................................... 34 3 OBJETIVOS........................................................................................................... 39 3.1 Objetivo Geral .............................................................................................. 39 3.2 Objetivos Específicos ..................................................................................... 39 4 MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................ 41 4.1 Estudo in vitro............................................................................................... 41 4.1.1 Coleta do Tecido Adiposo Canino e Isolamento das Ad-MSCs ...................... 41 4.1.2 Coleta da Placenta Canina e Isolamento das PMSCs ..................................... 42 4.1.3 Formação do Banco de Ad-MSCs e PMSCs caninas ....................................... 43 4.1.4 Diferenciação em Linhagens Mesodermais e Análise Imunofenotípica das Ad-MSCs e PMSCs Caninas ..................................................................................... 43 4.1.5 Estimulação Direta das Ad-MSCs e PMSCs in vitro com IFN-γ e IFN-γ Combinado com TNF-α ........................................................................................... 45 4.1.6 Expressão Gênica de Citocinas Anti-inflamatórias e Fatores Neurotróficos das Ad-MSCs e PMSCs Estimuladas e Controles ..................................................... 46 xiv 4.1.7 Perfil de Secreção de Fatores Solúveis do Meio Condicionado das Ad-MSCs e PMSCs Estimuladas e Controles .............................................................................. 48 4.2 Estudo in vivo ............................................................................................... 48 4.2.1 Animais e Momentos Experimentais ............................................................. 49 4.2.1.1 Grupo PAC ............................................................................................... 49 4.2.1.2 Grupo cMSC ............................................................................................ 50 4.2.2 Tratamento Imunossupressor e Terapia Celular ........................................... 51 4.2.2.1 Grupo PAC ............................................................................................... 51 4.2.2.2 Grupo cMSC ............................................................................................ 52 4.2.3 Observações Adicionais ................................................................................. 54 4.2.3 Acompanhamento: Parâmetros clínicos, Laboratoriais e de Imagem Avançada ................................................................................................................. 55 4.2.3.1 Exclusão de Doenças Infecciosas ............................................................ 55 4.2.3.2 Avaliação da Recuperação Funcional ..................................................... 55 4.2.3.3 Avaliação da Redução das Lesões por Imagem de RM ........................... 56 4.2.3.4 Análise do LCR ......................................................................................... 57 4.2.3.5 Avaliação da Resposta ao Tratamento ................................................... 59 4.2.3.6 Efeitos Adversos e Alterações Hematológicas e Bioquímicas ................ 59 4.3 Análise Estatística ......................................................................................... 60 5 RESULTADOS ....................................................................................................... 62 5.1 Estudo in vitro............................................................................................... 62 5.1.1 Isolamento das Ad-MSCs e PMSCs caninas ................................................... 62 5.1.2 Diferenciação em Linhagens Mesodermais e Análise Imunofenotípica das Ad-MSCs e PMSCs caninas ...................................................................................... 64 5.1.3 Estimulação Direta das Ad-MSCs e PMSCs com IFN-γ e IFN-γ combinado com TNF-α ....................................................................................................................... 69 5.1.3.1 Comportamento das Ad-MSCs e PMSCs após estimulação direta ......... 69 5.1.3.2 Expressão Gênica de Citocinas e Fatores Neurotróficos pelas Ad-MSCs e PMSCs após estimulação direta .......................................................................... 70 5.1.4 Perfil de secreção de fatores solúveis do meio condicionado das Ad-MSCs e PMSCs após estimulação in vitro com IFN-γ ou IFN-γ combinado com TNF-α ...... 73 xv 5.2 Estudo in vivo ............................................................................................... 75 5.2.1 Características Gerais dos Grupos Estudados................................................ 75 5.2.2 Localização Neuroanatômica e Sinais Clínicos............................................... 75 5.2.3 Avaliação da Recuperação Funcional ............................................................ 76 5.2.4 Avaliação da Redução das Lesões por Imagem de RM .................................. 81 5.2.6 Análise do LCR ................................................................................................ 89 5.2.7 Avaliação da Resposta ao Tratamento .......................................................... 90 5.2.8 Efeitos Adversos ............................................................................................. 90 5.2.9 Alterações Hematológicas e Bioquímicas ...................................................... 93 6 DISCUSSÃO .......................................................................................................... 96 7 CONCLUSÕES ..................................................................................................... 105 8 REFERÊNCIAS ..................................................................................................... 107 ANEXOS ............................................................................................................... 120 (A) Fármacos administrados nos cães dos grupos PAC e cMSC em associação com o respectivo tratamento ....................................................................................... 120 (B) Escala de Déficit Neurológico (EDN)................................................................ 121 (D) Características das imagens de ressonância magnética no pré-tratamento e aos 80 dias pós-tratamento do grupo PAC .................................................................. 124 (E) Características das imagens de ressonância magnética pré-transplante e 80 dias pós-transplante do grupo cMSC ........................................................................... 126 (F) Análise do líquido cefalorraquidiano do pré-tratamento e 80 dias pós-tratamento dos grupos PAC e cMSC. ..................................................................................... 127 9 TRABALHO CIENTÍFICO ..................................................................................... 129 xvi RESUMO PINTO, G. B. A. Transplante de Células-tronco Mesenquimais Alogênicas em Cães com Meningoencefalomielite de Origem Desconhecida. Botucatu, 2021. 168 Páginas. Tese de Doutorado. Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista. A meningoencefalomielite de origem desconhecida (MUO) canina é uma doença neuroinflamatória de provável origem imunomediada, altamente debilitante, que apresenta prognostico desfavorável e falha terapêutica com o uso de imunossupressores. As células-tronco mesenquimais (MSCs) são promissoras para o tratamento de doenças neuroimunes, porém, diferentes fontes podem apresentar variações no potencial imunomodulador e neuroprotetor. In vitro, avaliamos a expressão gênica de BDNF, GDNF, HGF, IDO, IL-10 e PTGES2 e o perfil secretório de IL-2, IL-6, IL-8, IL-10, GM- CSF e MCP-1 de MSCs caninas derivadas do tecido adiposo (Ad-MSCs) e placenta (PMSCs) após estimulação única com INF-γ e combinada com INF-γ com TNF-α. In vivo, avaliamos a resposta terapêutica ao transplante de Ad-MSCs alogênicas em cães com MUO que apresentaram falha terapêutica ao tratamento imunossupressor. Grupo PAC: 12 cães com MUO tratados com o protocolo imunossupressor de citarabina (ara-C) e prednisona. Grupo cMSC: Cinco cães que apresentaram falha terapêutica tratados com dois transplantes de 2,5x106 Ad-MSCs pela via intratecal (IT) (totalizando seis transplantes) ou intravenosa (IV) (totalizando três transplantes), com intervalo de 40 dias. Avaliamos a recuperação funcional, redução das lesões inflamatórias por ressonância magnética (RM) e líquido cefalorraquidiano (LCR). In vitro, observamos aumento significativo na expressão de BDNF, GDNF, HGF e IDO pelas Ad-MSCs após as estimulações, e na expressão de IDO pelas PMSCs após a estimulação combinada. Houve tendência a maior expressão de IL-10 nas células estimuladas de ambas fontes. Houve aumento significativo na secreção de IL-6 pelas Ad-MSCs e de IL-8 pelas PMSCs após estimulação. In vivo, houve tendência a melhora funcional e dos parâmetros inflamatórios no LCR em ambos grupos, indicando efeitos positivos. No grupo cMSC, a maioria dos cães teve remissão parcial e eventos adversos leves foram observados em 4/6 animais após transplantes IT, sendo ausentes pela via IV. Todos os cães do grupo PAC desenvolveram efeitos adversos. Não houve diferenças significativas nas variáveis de hemograma e bioquímica dentro e entre os grupos. O transplante de Ad-MSCs alogênicas em cães com MUO demonstrou efeitos benéficos. Palavras-chave: Doenças autoimunes desmielinizantes (SNC), Interleucinas, Meningoencefalite, Mielite, Neuroimunomodulação, Terapia Baseada em Células e Tecidos. xvii ABSTRACT PINTO, G. B. A. Allogeneic Mesenchymal Stem Cells Transplantation in Canine Meningoencephalomyelitis of Unknown Origin. Botucatu, 2021. 168 Pages. Doctoral Thesis. São Paulo State University (UNESP), Botucatu Campus. Canine meningoencephalomyelitis of unknown origin (MUO) is an immune-mediated neuroinflammatory disease, highly debilitating, with poor prognosis and therapeutic failure. Mesenchymal stem cells (MSCs) are promising for the treatment of neuroimmune diseases. Different sources may present differences in the immunomodulatory/neuroprotective potential. In vitro, we evaluated the gene expression of BDNF, GDNF, HGF, IDO, IL-10 and PTGES2 and the secretory profile of IL-2, IL-6, IL-18, IL-10, GM-CSF and MCP- 1 of canine MSCs derived from adipose tissue (Ad-MSCs) and placenta (PMSCs) after priming with the pro-inflammatory cytokines INF-γ alone and combined INF-γ and TNF-α. In vivo, we evaluated the clinical response to allogeneic Ad-MSCs transplantation in dogs with MUO. PAC group: 12 dogs treated with immunosuppressant cytarabine (ara-C) and prednisone. cMSC group: 5 dogs of PAC group with therapeutic failure were treated with 2.5x106/kg Ad-MSCs by intrathecal (IT) (n = 6) or intravenous (IV) (n = 3) delivery routes (40 days of interval). Functional recovery and the reduction of inflammatory lesions by magnetic resonance imaging (MR) and cerebrospinal fluid (CSF) were evaluated. In vitro, there was significant increase of BDNF, GDNF, HGF and IDO expression by Ad-MSCs after priming and expression of IDO after combined priming by PMSCs. Ad-MSCs had a significant increase in the secretion of IL-6 and PMSCs of IL-8 after priming. In vivo, a trend towards functional improvement was observed in both groups after treatment. In the cMSC group, most dogs had partial remission and mild adverse events were observed in 4/6 animals after IT transplantations, being absent by IV. Clinical and laboratory variables showed no statistical differences. Allogeneic Ad-MSCs transplantation demonstrated beneficial effects in dogs with MUO. Key-words: Cell- and Tissue-Based Therapy, Demyelinating Autoimmune Diseases (CNS), Interleukins, Meningoencephalitis, Myelitis, Neuroimmunomodulation. 1 INTRODUÇÃO 19 1 INTRODUÇÃO A meningoencefalomielite de origem desconhecida (meningoencephalomyelitis of unknown origin, MUO) é considerada uma das causas mais comuns de doença inflamatória do sistema nervoso central (SNC) de cães (COATES; JEFFERY, 2014). É caracterizada por um grupo de doenças idiopáticas e não infecciosas que apresentam sinais neurológicos semelhantes e características histopatológicas distintas (CORNELIS et al., 2019; TALARICO; SCHATZBERG, 2010). As lesões neurológicas apresentam início agudo, evolução progressiva e geram sinais clínicos de meningoencefalite, meningoencenfalomielite ou meningomielite (COATES; JEFFERY, 2014; CORNELIS et al., 2017). O diagnóstico clínico se baseia no histórico, exame neurológico, e alterações das imagens de ressonância magnética (RM) e do líquido cefalorraquidiano (LCR) (COATES; JEFFERY, 2014; GRANGER; SMITH; JEFFERY, 2010). O diagnóstico definitivo dos subtipos é obtido por histopatologia (COATES; JEFFERY, 2014; GRANGER; SMITH; JEFFERY, 2010). A etiopatogenia da MUO não é totalmente compreendida, entretanto, se hipotetiza que apresente origem autoimune pela identificação de células inflamatórias que expressam moléculas de classe II do complexo principal de histocompatibilidade (MHC- II) e devido a predominância de linfócitos T CD3+ nas lesões do SNC (COATES; JEFFERY, 2014; HIGGINS et al., 2008; KIPAR et al., 1998; PARK; UCHIDA; NAKAYAMA, 2012; SPITZBARTH; BAUMGÄRTNER; BEINEKE, 2012; SUZUKI et al., 2003). Fatores genéticos e ambientais também tem sido relacionados com o desenvolvimento da doença (HIGGINS et al., 2008; KIPAR et al., 1998; PARK; UCHIDA; NAKAYAMA, 2012; SUZUKI et al., 2003). A esclerose múltipla (EM) é uma doença autoimune, crônica e multifocal do SNC, que afeta aproximadamente 2,5 milhões de pessoas no mundo, sendo uma das principais causas de deficiência funcional em jovens adultos (DENDROU; FUGGER; FRIESE, 2015; FREEDMAN et al., 2010; HARRIS et al., 2018; MARTINO et al., 2010; PEGORETTI et al., 2018). O modelo animal de neuroinflamação mais utilizado para a EM é a encefalomielite autoimune experimental (EAE), sendo gerado ao produzir inflamação e desmielinização no SNC de murinos susceptíveis imunizados com proteínas específicas da mielina (CONSTANTINESCU et al., 2011; RAFEI et al., 2009a). Este 20 modelo contribuiu significativamente para o entendimento da EM, contudo, não abrange todas as características clínicas, patológicas e imunológicas da EM por apresentar tendência a direcionar uma resposta imune específica (CONSTANTINESCU et al., 2011; LASSMANN; BRADL, 2017). Interessantemente, a MUO tem sido correlacionada à EM em vários aspectos, visto que ambas apresentam características etiopatogênicas, histopatológicas, clínicas e radiológicas semelhantes e, desta forma, pode ser utilizada como um modelo experimental natural para a doença (DENDROU; FUGGER; FRIESE, 2015; GREER et al., 2010; JEFFERY et al., 2017; MOON et al., 2015; PARK; UCHIDA; NAKAYAMA, 2012). Para a MUO, a imunossupressão é o principal tratamento, baseando-se no uso de altas de doses de corticosteroides geralmente associados a outros imunomoduladores e imunossupressores (CORNELIS et al., 2017). Entretanto, além de ocasionarem efeitos adversos, o efeito terapêutico obtido pode ser temporário ou ineficaz a longo prazo, acarretando em progressão da lesão e óbito em > 26% dos cães nos primeiros dias após o diagnóstico (CORNELIS; VOLK; DE DECKER, 2016b; FLEGEL et al., 2011; JUNG et al., 2013; LOWRIE; SMITH; GAROSI, 2013; WONG et al., 2010; ZARFOSS et al., 2006). De modo semelhante, atualmente não existe um tratamento que seja capaz de prevenir ou reverter efetivamente os processos neuroinflamatórios e neurodegenerativos presentes na EM (SCOLDING et al., 2017; WINGERCHUK; CARTER, 2014). Neste contexto, a terapia celular baseada nas células-tronco mesenquimais (mesenchymal stem cells, MSCs) dispõe de um amplo potencial para o tratamento de doenças neuroimunes (PAUL; ANISIMOV, 2013; UCCELLI; MANCARDI, 2010). Além de apresentarem capacidade de modulação dos sistemas imunes inato e adaptativo, as MSCs estimulam o microambiente regenerativo mediadas, principalmente, pela secreção de fatores solúveis que estimulam angiogênese, neurogênese, sinaptogênese, e ativação astrocítica, e promovem efeitos anti-apoptóticos em neurônios e células da glia (ANDRZEJEWSKA; LUKOMSKA; JANOWSKI, 2019; CIERVO et al., 2017; PAUL; ANISIMOV, 2013; UCCELLI; LARONI; FREEDMAN, 2011). No ambiente inflamatório, as MSCs adquirem fenótipo imunossupressor e incrementam sua capacidade de proliferação e condições de sobrevivência (NORONHA et al., 2019). Esta ativação pode ser alcançada in vitro por meio da estimulação com citocinas pró-inflamatórias, como interferon gama (IFN-γ) e fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), citocinas predominantes no ambiente neuroinflamatório de cães com MUO e humanos com EM (KIM et al., 2018; LE BLANC et al., 2003; PARK; UCHIDA; 21 NAKAYAMA, 2013; PARK et al., 2012; PEGORETTI et al., 2018; PRASANNA et al., 2010; SOSPEDRA; MARTIN, 2016). Observações preliminares com MSCs humanas indicam que as propriedades terapêuticas das MSCs diferem entre as fontes celulares (MELIEF et al., 2013), porém, poucos estudos compararam a expressão e secreção de fatores solúveis de fontes de MSCs caninas. Neste âmbito, o estudo da expressão e secreção in vitro de fatores solúveis pelas MSCs caninas após a estimulação direta com IFN-γ e TNF-α constitui uma ferramenta em potencial para se avaliar a ação destas MSCs no ambiente similar ao da doença-alvo. Por meio de mecanismos imunomoduladores, imunossupressores, neuroprotetores e neurorregenarativos, o estudo das MSCs para o tratamento da MUO canina poderia se tratar de uma alternativa, além de fornecer informações translacionalmente relevantes para os ensaios clínicos da EM. 104 7 CONCLUSÕES 105 7 CONCLUSÕES O ambiente inflamatório incrementa a expressão gênica de IDO, BDNF, GDNF e HGF e aumenta a secreção de IL-6 pelas Ad-MSCs caninas e a expressão de IDO e secreção de IL-8 pelas PMSCs caninas. O transplante de Ad-MSCs alogênicas pelas vias IT e IV em cães com MUO demonstrou efeitos benéficos e demonstrou ser tolerável. 106 8 REFERÊNCIAS 107 8 REFERÊNCIAS ADAMO, P. F.; RYLANDER, H.; ADAMS, W. M. 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RESUMO ABSTRACT 1 INTRODUÇÃO 2 REVISÃO DA LITERATURA 2.1 Meningoencefalomielite de Origem Desconhecida (MUO) 2.1.1 Etiopatogenia e Mecanismos de Neuroinflamação e Neurodegeneração 2.1.2 Tratamento e Prognóstico 2.2 Células-tronco Mesenquimais (MSCs) 2.2.1 Potencial Terapêutico para Doenças Neuroimunes 2.2.2 MSCs: Fontes de obtenção, Imunoevasão e Potencialização dos Efeitos Terapêuticos 3 OBJETIVOS 3.1 Objetivo Geral 3.2 Objetivos Específicos 4 MATERIAL E MÉTODOS 4.1 Estudo in vitro 4.1.1 Coleta do Tecido Adiposo Canino e Isolamento das Ad-MSCs 4.1.2 Coleta da Placenta Canina e Isolamento das PMSCs 4.1.3 Formação do Banco de Ad-MSCs e PMSCs caninas 4.1.4 Diferenciação em Linhagens Mesodermais e Análise Imunofenotípica das Ad-MSCs e PMSCs Caninas 4.1.5 Estimulação Direta das Ad-MSCs e PMSCs in vitro com IFN-γ e IFN-γ Combinado com TNF-α 4.1.6 Expressão Gênica de Citocinas Anti-inflamatórias e Fatores Neurotróficos das Ad-MSCs e PMSCs Estimuladas e Controles 4.1.7 Perfil de Secreção de Fatores Solúveis do Meio Condicionado das Ad-MSCs e PMSCs Estimuladas e Controles 4.2 Estudo in vivo 4.2.1 Animais e Momentos Experimentais 4.2.1.1 Grupo PAC 4.2.1.2 Grupo cMSC 4.2.2 Tratamento Imunossupressor e Terapia Celular 4.2.2.1 Grupo PAC 4.2.2.2 Grupo cMSC 4.2.3 Observações Adicionais 4.2.3 Acompanhamento: Parâmetros clínicos, Laboratoriais e de Imagem Avançada 4.2.3.1 Exclusão de Doenças Infecciosas 4.2.3.2 Avaliação da Recuperação Funcional 4.2.3.3 Avaliação da Redução das Lesões por Imagem de RM 4.2.3.4 Análise do LCR 4.2.3.5 Avaliação da Resposta ao Tratamento 4.2.3.6 Efeitos Adversos e Alterações Hematológicas e Bioquímicas 4.3 Análise Estatística 5 RESULTADOS 5.1 Estudo in vitro 5.1.1 Isolamento das Ad-MSCs e PMSCs caninas 5.1.2 Diferenciação em Linhagens Mesodermais e Análise Imunofenotípica das Ad-MSCs e PMSCs caninas 5.1.3 Estimulação Direta das Ad-MSCs e PMSCs com IFN-γ e IFN-γ combinado com TNF-α 5.1.3.1 Comportamento das Ad-MSCs e PMSCs após estimulação direta 5.1.3.2 Expressão Gênica de Citocinas e Fatores Neurotróficos pelas Ad-MSCs e PMSCs após estimulação direta 5.1.4 Perfil de secreção de fatores solúveis do meio condicionado das Ad-MSCs e PMSCs após estimulação in vitro com IFN-γ ou IFN-γ combinado com TNF-α 5.2 Estudo in vivo 5.2.1 Características Gerais dos Grupos Estudados 5.2.2 Localização Neuroanatômica e Sinais Clínicos 5.2.3 Avaliação da Recuperação Funcional 5.2.4 Avaliação da Redução das Lesões por Imagem de RM 5.2.6 Análise do LCR 5.2.7 Avaliação da Resposta ao Tratamento 5.2.8 Efeitos Adversos 5.2.9 Alterações Hematológicas e Bioquímicas 6 DISCUSSÃO 7 CONCLUSÕES 8 REFERÊNCIAS ANEXOS (A) Fármacos administrados nos cães dos grupos PAC e cMSC em associação com o respectivo tratamento (B) Escala de Déficit Neurológico (EDN) (D) Características das imagens de ressonância magnética no pré-tratamento e aos 80 dias pós-tratamento do grupo PAC (E) Características das imagens de ressonância magnética pré-transplante e 80 dias pós-transplante do grupo cMSC (F) Análise do líquido cefalorraquidiano do pré-tratamento e 80 dias pós-tratamento dos grupos PAC e cMSC. 9 TRABALHO CIENTÍFICO